CN102257389A - 鉴定面临不良肝病事件风险的患者的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过评估患者样品中载脂蛋白的水平并将其与参考值比较，鉴定面临患上药物特别是抗氧化剂药物诱发肝损害的风险的患者，或者鉴定患有早期肝病的患者的方法和试剂盒。通过鉴定人群样品和确定正常值上限预定参考值。然后将该数值用作参考点以比较患者样品的载脂蛋白水平。在一个实施方案中，将载脂蛋白水平与ATL和/或总胆红素水平组合用于预测给药后的肝损伤、肝毒性或肝脏事件。

Description

鉴定面临不良肝病事件风险的患者的筛选方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2008年8月28日提交的美国临时申请号61/092,686的权益，其通过引用以其全文结合到本文中。

发明领域

本发明提供用于鉴定面临肝损害风险、特别是给予药物后显示肝毒性风险增加的患者的筛选方法和试剂盒。所述方法和试剂盒可用于鉴定面临药物诱发肝损害风险的患者，以便将此类患者从某些治疗方案中排除出去。

发明背景

药物有时导致患者肝脏的严重损害，肝功能的丧失导致疾病、残疾、住院治疗，甚至威胁生命的肝衰竭和死亡或者需要肝移植。随着世界人口老龄化，越来越多的药物被作为处方开出，并通常与自行开出的非处方药所谓″膳食补充剂″、特殊膳食和酒精组合。对环境化学剂的暴露也增加。肝脏是所有这些毒素的代谢、灭活和清除的主要器官。它们的代谢物可损害肝细胞，且复杂的药物-药物相互作用使这种情况恶化。所有这些危险因素的组合已增加肝损害的发病率。

在美国，由处方和非处方药物引起的肝损害是日益增加的医学、科学和公共卫生问题。在美国，药物诱发的肝损害(DILI)现在是急性肝衰竭(ALF)的主要原因，超过所有其它原因的组合(见WM Lee，et al.Acute Liver Failure Study Group)。DILI是食品与药品管理局关于药物的调节行动的最常见单一原因，所述行动包括不批准上市、从市场撤出，和限制处方适应症。在全世界，DILI的估计的全球年发病率是每100,000居民13.9-24.0，而DILI在所有向卫生部门报告的不良药物反应中占约3％-9％(见Aithal GP，et al.(1999)Br Med J 319：1541-5；Friisand Andreasen(1992)J Intern Med 232：133-138；和Dossing andAnderson(1982)Scan J Gastroenterol 17：205-211)。

肝毒性一直是将药物撤出和标识限制使用或者拒绝批准它们的最重要的单一原因。在二十世纪五十年代(1950′s)，异丙烟肼(Marsilid)可能是曾经推向市场的最大肝毒性的药物，但在同一时期，已发现异烟肼在约0.1％接受者中导致严重肝毒性。苯

洛芬(Oraflex)、替尼酸(Selacryn)、溴芬酸(Duract)和曲格列酮(troglitizone)(Rezulin)全部因为肝毒性撤出，而异丁芬酸、哌克昔林和地来洛尔(全部在国外销售)因为这个问题在美国从未获得批准。肝毒性还导致许多药物使用的重要限制，包括异烟肼、拉贝洛尔、丹曲林、非尔氨酯、匹莫林、托卡朋和曲伐沙星。

然而在大多数情况下，很迟才认识到肝毒性，因为发病率通常低，或者取决于其它情况，在市场得到识别肝毒性潜在信号之前没有动物或人经历过。现在市场后监督在几个月内检测到严重的肝毒素(溴芬酸，托卡朋，曲格列酮，曲伐沙星)，与过去延迟几年明显相反(异丙烟肼，异烟肼)，但在销售它们之前发现明显较好。

在西方国家，补充剂和替代药物的使用也在不断增加，在动物模型和人中都有大量来自此类产品的肝毒性的报道(见Zimmerman HJ.(1999)Hepatotoxicity：the Adverse Effects of Drugs and other Chemicalson the Liver(药物及其它化学剂对肝脏的不良作用)，2nd ed.LippincottWilliams & Wilkins，Philadelphia，PA，1999，pp.731)。已充分确定导致肝损害的替代产品的实例包括吡咯联啶生物碱(Comfrey)、查帕拉尔叶(chaparral leaf)、石蚕属植物、唇萼薄荷(pennyroyal)(除蚤薄荷油(squawmint oil))、槲寄生、醉椒根和含有松萝酸的重量减轻制剂(Favreau JT，et al.(2002)Ann Intern Med 136：590-5)。

业已清楚某些个体比其他人更容易患药物诱发的肝损伤，不常见但严重的特应性(idiosyncratic)肝损伤需要作为安全问题特别加以考虑。人们不仅在遗传上不同，这影响他们代谢药物及其它化学剂的方式，而且每个人的生活经历不同。在美国肝移植中心供评估的患者中药物诱发的肝损害是急性肝衰竭的主要原因，且是必须从市场撤出被批准的药物的主要单一原因。

已提出某些信号鉴定患DILI的患者的能力，特别是不同程度(3倍，5倍等)和频率(2％，3％等)的转氨酶提高和伴随胆红素提高的血清转氨酶提高(见Zimmerman(1978)Drugs 16：25-45)。通常，患者在规律间隔提供血清样品用于测试丙氨酸转氨酶(ALT，也称为SGPT)、天冬氨酸转氨酶(AST，也称为SGOT)、碱性磷酸酶(ALP)的活性、总胆红素(Bt)、血清白蛋白，更不常见的是测试血液凝血酶原时间。但是，虽然这些标记物可有助于鉴定不应被批准或应密切监测的药物，这些信号不可用于在患者面临不良事件的风险之前预测应排除那些患者接受潜在的肝毒性药物。

临床前研究通常不能预测肝脏毒性水平，特别是发病率低或严重度较小的那些。动物研究，虽然有助于鉴定严重毒性，但不能预测这些罕见的肝脏事件。导致个体对DILI的危险增加的情况可能是由于在实验室不可能重建的环境因素的组合，例如药物顺应性、附加或替代药物组合、环境暴露和遗传倾向。已反复显示动物模型不能简单解释这些变量。

虽然药物开发的预批准临床期代表鉴定肝毒性可能的关键场所(arena)，如果测试人群太小、太有限，或者通常不代表最终暴露于药物的受试者人群，临床试验不能提供肝脏毒性的任何证据。在这个阶段，很容易鉴定具有明显毒性可能的药物，但毒性可能低的那些药物可能较不容易被识别。作为通用惯例，如果每1000人中发生1起明显的不良事件，研究必须包括至少3000人，这是典型的预批准大小。在预批准设定时可能从未出现每1000小于1的发病率。而且，如果不良反应延迟，临床试验可能已经包括数量很少的暴露个体面临足够持续时间的危险。而且，测试频率和停止药物的惯例可能混淆显著信号的鉴定。

公认预存在的肝病可能是DILI的危险因素。但是，缺乏可预测受试者有危险的可靠的肝病指标。临床研究通常排除具有严重肝病的受试者，但通常包括生物标记物例如血清丙氨酸转氨酶(ALT)轻度提高的受试者(在正常上限2-3倍范围，即患有轻度肝病的受试者)。ALT值并非提示DILI的指标，因为通常此类患者患特发性药物反应的危险不增加，但它们对特异反应的肝脏应答可能扩大。FDA已强调在未治疗和安慰剂治疗的受试者中常见小于3×ULN的转氨酶异常，不能提供关于出现严重DILI的可能性的信息。因此，观察较大偏差例如大于3×、大于5×或大于10×正常上限(ULN)的转氨酶数值已成为标准操作。因为这些异常可出现在安慰剂-处理组，所以比较其在药物暴露受试者组相对于对照组中的比率，寻找整体研究人群与对照相比转氨酶提高的比率增加是重要的″(见FDA关于DILI的指导文件)。

大多数重要的肝毒素主要导致表现为在没有明显肝胆管阻塞迹象的情况下从受损肝细胞漏出ALT的肝细胞损害。导致一些肝细胞损害的能力不是药物可能导致严重DILI的可靠预报因子。许多导致血清转氨酶活性暂时升高的药物不导致进行性或严重DILI，即使继续给予药物。许多药物显示ALT信号增加，没有严重损害的危险(如他克林、他汀类、阿司匹林、肝素)，提示单独转氨酶提高过量的特异性低。只有导致广泛肝细胞损害足以影响肝脏清除血浆中的胆红素或者合成凝血酶原及其它凝血因子的功能的那些药物导致严重DILI。

仍然需要一种可以很容易在给予潜在毒性药物之前预测有患DILI、特别是低严重度或频率DILI风险的患者的试验。

本发明的目的是提供用于鉴定面临DILI风险的患者和用于提供结合此类信息的治疗方案的方法和试剂盒。

发明概述

本发明是建立在这样的共识之上，即在患者中某些脂蛋白的水平可用于预测在给予药物后患者将发生药物诱发的肝损害的风险。具体来讲，血清中载脂蛋白A1(ApoA1)水平与这种风险有关。氧化还原信号转导途径在包括肝脏在内的组织中在正常和病理细胞功能中都发挥重要作用。大量研究提示这些信号的调节可成为导致临床肝病的分子和生物化学发病机理的基础。虽然肝脏具有显著的贮备能力，随着时间推移，这种贮备能力可被各种应激状态削弱，包括潜在的疾病例如2型糖尿病或动脉粥样硬化，以及暴露于药物和环境毒素两者。这些因素各自单独可能对肝脏没有明显的不良作用。但是，同时出现的应激因素的组合可能超过肝贮备能力而导致肝细胞损害。

本说明书提供即使在缺乏通常伴随肝损害的临床上确定的实验室异常的情况下，有肝损害危险的患者表现代偿性肝反应、特别是对氧化剂信号代偿性反应的证据。其它实验室数值正常，ApoA1表达适度提高至大于正常上限的浓度可反映代偿性肝应激反应，这种代偿性肝应激反应可鉴定面临对药物响应有进展至肝异常的风险的个体患者。

因此，在一个实施方案中，提供鉴定面临肝损害，且特别是药物诱发肝损害风险的患者的方法，包括1)测量患者体液中ApoA1的水平；和2)将样品中ApoA1的测量水平与人群的参考测量值比较。在某些情况下，其中一个或多个样品中ApoA1的测量水平大于参考人群正常上限(ULN)的患者被视为肝损害风险增加，特别是药物诱发肝损害的风险更大。在一些实施方案中，药物诱发的肝损害来自抗氧化剂药物。在某些其它情况下，药物诱发的肝损害来自增加PPAR活性的药物。在具体实施方案中，如果体液中ApoA1的测量水平小于或等于ULN，则将药物给予患者，而如果ApoA1的测量水平大于ULN，则不给予药物。

在某些实施方案中，ApoA1测量或ApoA1结构修饰与氧化还原相关疾病、且特别是炎性疾病有关。在某些情况下，测量涉及疾病例如糖尿病。在一些实施方案中，测量的是ApoA1水平。在其它实施方案中，测量的是ApoA1结构修饰例如脂质修饰。在一些实施方案中，超过ULN的ApoA1测量提示患者需要治疗疾病。

在一些实施方案中，所述方法还包括测量来自患者的样品中ALT的水平并与人群参考ALT水平比较。在这些情况下，测量超过ULN的ALT也用于将患者归类为不良肝损害的危险增加。在某些情况下，在给予任何药物之前测量ALT。在这些情况下，可将ALT水平作为进一步排除标准用于鉴定面临药物诱发肝损害的增大风险的患者。在一些情况下，鉴定大于ULN的ALT水平，但在其它情况下提供至少1.5或至少2.0或更大ULN的ALT水平作为排除标准。在某些情况下，在开始治疗方案后一段时间，例如1周、2周、3周、4周、5周或更久，在接受药物的患者中测量ALT水平。测量ALT水平超过ULN的患者可被视为发展、具有或患有肝毒性的危险增加。在具体实施方案中，如果测量的ALT水平小于或等于ULN，则将药物给予患者，而如果测量的ALT水平大于ULN，则不给予药物。

其中一个或多个样品测量的ApoA1水平超过参考值例如人群ULN的患者也可视为具有增加的炎症活性。可考虑此类患者面临有其它疾病的风险，包括炎性疾病例如类风湿性关节炎。在某些情况下，患者面临葡萄糖代谢紊乱的危险或患葡萄糖代谢紊乱。此类紊乱可能是糖尿病，且特别可能是2型糖尿病。

在某些情况下，将根据ApoA1测量的结果设计治疗方案。该治疗方案可要求不将抗氧化剂药物给予测量ApoA1超过参考值例如ULN的患者，或者可能是密切监测对患者的肝毒性。此外，治疗方案可要求调节外部因素，例如饮食或运动，以减少另外暴露于可能加重肝损害的环境毒素。

在另一个实施方案中，提供鉴定用于药物治疗的患者的方法，包括测量体液的ApoA1水平；将测量值与人群ApoA1水平的参考测量值比较；并且只有当体液中ApoA1水平小于或等于参考值时才提供药物治疗。在某些情况下，参考值是在参考人群的ULN。

在具体实施方案中，患者样品是血清样品。在其它实施方案中，样品是血浆样品。

在一些实施方案中，ULN是样品中ApoA1的约165mg/dL。在其它实施方案中，其是150-200mg/dL，155-195mg/dL，160-190mg/dL，165-185mg/dL。在一些实施方案中，如果ApoA1的测量水平大于150mg/dL或大于155mg/dL或大于160mg/dL或大于165mg/dL或大于170mg/dL，则考虑患者有面临肝损害的风险。

在又一个实施方案中，提供用于鉴定有药物诱发肝损害危险的患者的试剂盒，包含测量患者样品中ApoA1水平的检测系统和比较测量水平与人群正常水平的系统。

在一些实施方案中，检测系统可以是抗ApoA1的标记抗体或者包含抗ApoA1的测量抗体和标记的第二抗体的ELISA试剂盒。在其它实施方案中，检测系统可以是非抗ApoA1抗体的结合伴侣(partner)。在另外的其它实施方案中，检测系统可以例如通过RT-PCR检测ApoA1基因产物的水平。比较系统可以是单独的检测试剂盒，其中将ApoA1水平标化至对应于正常上限。可以在色度标尺上或者可根据直接比较检测系统中的信号水平读数。在其它实施方案中，试剂盒包括图表，以便比较样品中测量的ApoA1水平与人群正常上限。在某些情况下，包括视觉读数，如果样品中ApoA1水平大于正常上限1.0倍则提供标记物。在具体实施方案中，试剂盒包括检测装置，其在样品中测量的ApoA1水平大于165mg/dl时则提供标记物。

本发明的方法和试剂盒还可用于监测和诊断各种肝病，包括早期组织损害/器官排斥、某些形式的病毒感染、药物毒性和肝功能变化。所述方法提供目前在临床场合上没有的信息，快速且可重现。所述方法和试剂盒特别可用于评估治疗剂和药物在肝损伤方面的毒性。通过本发明方法早期检测肝病可在不良反应出现时还允许更早的临床干预。

一方面，本发明提供通过测量来自受试者的样品中ApoA1水平并将该水平与正常水平比较，检测受试者肝损伤或肝损伤可能性的方法。如果ApoA1水平超过正常上限(ULN)，则考虑患者患肝损伤的可能性较大或者面临患肝损伤的危险。此类早期诊断可用于提供早期干预的动机和提供分析任何提出的医疗方案的信息。

附图简述

图1是作为患者群体ApoA1水平函数的肝损害风险率的曲线图，并显示用Cox比例风险模型对后续肝脏事件进行基线ApoA1的5th-95th百分位数范围的年龄校正作用。作为参考点，本试验ApoA1的ULN是165mg/dL。实线和虚线分别代表AGI-1067和安慰剂数据。

发明详述

本发明提供可用于例如临床筛选、诊断和预测哺乳动物受试者的肝反应，监测肝反应疗法的结果，鉴定对具体治疗性治疗最可能产生不良反应的患者，和药物筛选和药物开发的方法和组合物。在具体实施方案中，本发明提供用于确定面临发生药物诱发肝毒性风险的患者的方法。为了公开的清楚性，并且不以限制的方式，将就血液或肝组织样品的分析描述本发明。但是，如本领域技术人员将理解的，根据本说明书，本文描述的测定和技术可适用于其它类型的含脂蛋白的样品，包括体液(如血液或包含血清或血浆或两者的血液流分、脊髓液、尿液或唾液)、来自面临具有或出现肝反应风险的受试者的组织样品(如活组织检查例如肝活检)或其匀浆。

用于本文时，短语″不良肝病事件″等包括肝毒性、肝损伤和肝病。

在某些实施方案中，本发明的方法和试剂盒可用于鉴定对抗氧化剂反应有不良事件危险的患者。

血浆脂蛋白是将脂质从合成部位和吸收部位运送至贮存和/或利用部位的载体。脂蛋白是球形颗粒，所述颗粒在其核心具有甘油三酯和胆固醇酯，而在其表面为一层磷脂、非酯化胆固醇和载脂蛋白。根据其水合密度将其分为五大类，非常大、富含甘油三酯的颗粒称为乳糜微粒(小于0.95g/ml)、极低密度脂蛋白(VLDL，0.95-1.006g/ml)、中密度脂蛋白(IDL，1.006-1.019g/ml)、低密度脂蛋白(LDL，1.019-1.063g/ml)和高密度脂蛋白(HDL，1.063-1.210g/ml)。血浆脂蛋白也可根据其电泳迁移率分类。HDL与α-球蛋白共迁移，LDL与β-球蛋白共迁移，α和β-球蛋白之间的VLDL与所谓前-β球蛋白共迁移，而乳糜微粒保持在加样点。(Osborne，J.D.and Brewer，B.Jr.Adv.Prot.Chem.31：253-337(1977)；Smith，L C.et al.Ann.Rev.Biochem.，47：751-777(1978))。

载脂蛋白是具有三种主要功能的脂蛋白的蛋白质组分：(1)维持脂蛋白颗粒的稳定性，(2)充当作用于脂蛋白的酶的辅因子，和(3)通过受体介导机制除去循环中的脂蛋白。四组载脂蛋白是载脂蛋白A(ApoA)、B(Apo B)、C(Apo C)和E(Apo E)。A、B和C三组各自由两种或更多种不同的蛋白质组成。这些蛋白质对于Apo A是：Apo A-I、Apo A-II和Apo A-IV，对于Apo B是：Apo B-100和Apo B-48；以及对于Apo C是：Apo C-I、Apo C-II和Apo C-III。Apo E包括几种同工型(isoforms)。考虑将这些载脂蛋白用于本文描述的方法。

Apo A-I是在高密度范围中脂蛋白的主要蛋白质组分。Apo A-I还可以是与提出的肝受体结合以除去HDL的配体。大量研究支持ApoA-I作为动脉粥样硬化阴性危险因子的临床敏感性和特异性(Avogaro，P.et al.，Lancet，1：901-903(1979)；Maciejko，J.J.et al.，N.Engl.J.Med.，309：385-389(1983))。一些研究人员也已描述Apo A-I/Apo B比率作为动脉粥样硬化危险的有用指标(Kwiterovich，P.O.et al.，Am.J.Cardiol，69：1015-1021(1992)；Kuyl，J.M.and Mendelsohn，D.，Clin.Biochem.，25：313-316(1992))。

ApoA1包含高密度脂蛋白(HDL)的65％载脂蛋白，为其形成提供结构支架。它也是卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的辅因子，为胆固醇酯化为胆固醇酯(cholesteryl esters)所必需。HDL-胆固醇参与胆固醇从外周组织向肝脏的逆向转运，它可从肝中排出。因此ApoA1缺乏增加冠状动脉和外周血管疾病的危险，即使不存在其它冠脉危险因素。患有明显动脉硬化的患者通常具有低于正常人群的血浆ApoA1浓度。ApoA1基因的特异性遗传异常可能与ApoA1和HDL水平降低有关。ApoA1值降低也与吸烟、富含碳水化合物和/或多不饱和脂肪的饮食、异常脂蛋白血症(如家族性低α脂蛋白血症)、不受控制的糖尿病、肝病、慢性肾衰竭和一些疗法(β-阻滞剂、利尿剂、黄体酮、雄激素也有关。

ApoA1浓度上升与妊娠、家族性高α脂蛋白血症有关，与药物例如卡马西平、苯妥英、苯巴比妥、雌激素、口服避孕药、乙醇、烟酸、贝特类和他汀类药物有关。大多数遗传性低α脂蛋白血症由参与逆向胆固醇转运的酶和转运蛋白的突变引起。ApoA1的突变罕见，且与淀粉样变性病、外周神经病变和增加和降低的动脉粥样硬化危险有关。

过氧化物酶体增生物(proliferator)激活受体α(PPAR-α)上调ApoA1的转录调节。在细胞内，PPAR-α由配体例如氧化的游离脂肪酸激活，游离脂肪酸不仅介导细胞氧化还原信号传导，而且还代表对应激的肝细胞反应。ApoA1具有建立完善的体外和体内抗氧化剂和抗炎活性，可用于抑制驱动其肝脏表达的氧化还原敏感信号。现在已认识到适当提高的ApoA1水平的存在限定患者亚群，特别是2型糖尿病，其特征在于对与低水平炎性、氧化剂和/或药理学激发有关的肝脏应激的内源性抗氧化剂和抗炎性代偿。产生用肝脏不能进一步代偿的其它氧化剂样应激的药物因此可导致肝细胞损害，或者增加内源性直接和间接抗氧化剂机制的药物可导致过度代偿。

ApoB-100是四种主要的致动脉粥样化脂蛋白的整体组分：VLDL、IDL、LDL和Lp(a)。Apo B-100与Apo B-48不同，只见于肠源性脂蛋白例如乳糜微粒和乳糜微粒残迹中。在体循环中通常检测不到Apo B-48，除了I、III或V型高脂血症的稀有受试者之外。在VLDL和IDL中Apo B的最初功能似乎是结构性的；但是，在暴露于LDL的结合域之后，它变成与细胞表面上的高亲和力LDL受体相互作用的原因，这导致LDL从循环中摄取和清除。几项研究已显示血液中ApoB水平增加是冠状动脉粥样硬化的可靠标志(Sniderman，A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：604-608(1980)；Kwiterovich，P.O.et al.，Am.J.Cardiol，71：631-639(1993)；McGill et al.Coron.Artery Dis.，4：261-270(1993)；Tornvall，P.et al.，Circulation，88：2180-2189(1993))。

用于Apo A-I和B的技术包括使用直接抗Apo A-I或B的抗体的免疫操作，并包括放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(ELISA)、竞争或捕获系统、荧光免疫测定、放射免疫扩散、比浊法(nephelometry)、比浊法(turbidimetry)和电免疫测定。

利用与特异性载脂蛋白免疫反应的抗体的试剂盒和方法被用于确定人血、血清或血浆样品中载脂蛋白例如ApoA1的浓度，以确定在给予药物后个体出现不良肝脏事件的危险。可用于这些试剂盒和方法的有用的单克隆抗体(MAbs)描述于例如美国专利号7,098,036中，所述抗体与存在于载脂蛋白和脂蛋白中的表位特异性结合，能够快速和可靠地测定特异性血液脂蛋白水平和/或载脂蛋白水平，包括ApoB-100、Apo A-I、Apo A-II、Apo C-III和Apo E。

越来越认识到血清ApoA1(和ApoB)水平是比单独胆固醇和甘油三酯更好的动脉粥样硬化危险的指标。通过发现血浆ApoB增加或血浆ApoA1降低比通过LDL-升高和低HDL-胆固醇更好地区分动脉粥样硬化患者与正常个体。与各数值相比，ApoA1与ApoB的比值被认为提供特别好的心血管危险的指标。

方法

本发明包括确定或预测用于治疗疾病或其它医学病症的药物、化合物或其它治疗剂是否将可能在体内产生肝毒性作用如特应性肝毒性的方法。理想地，在将药物(或药物组合)给予患者或患者群体之前实施此类方法。

一方面，本发明提供通过测量来自受试者的样品中载脂蛋白水平如ApoA1水平并将该水平与正常水平比较检测受试者肝损伤的方法。如果载脂蛋白水平超过正常水平上限，则考虑患者患肝损伤的可能性较大或者面临患肝损伤的风险。此类早期诊断可用于提供早期干预的动机，和提供信息以分析任何提出的医疗方案。如果证实某些受试者面临肝损伤的风险，这还可将他们从药物治疗中排除。

在某些实施方案中，通过测量ALT和总胆红素补充测量载脂蛋白如ApoA1，以鉴定目前患肝脏事件的患者。用于本文时，术语ULN指从人群中正常个体鉴定的预定载脂蛋白水平。在相关实施方案中，可从地理区域、种族人群个体的样品测量或者通过其它标准限定ULN。然后将人群用于鉴定阈值ULN，用于稍后与测试患者的载脂蛋白水平比较。ULN是其中95％健康正常人群落在该范围内的阈值，如此将数值限定为5％或5％以下正常人群超过该数值。

如本文提到的，术语″群体″或″患者群体″指两个或多个患者组成的一组。患者群体可以是几个患者、几十个患者、几百个患者，或者几千个患者。群体可以限定为需要治疗特定疾病例如糖尿病或动脉粥样硬化的患者。群体可以是例如参与研究的人群，其中对一些患者给予治疗剂，而其他患者给予安慰剂。术语″患者群体″并非是限制性的。例如，该术语还包括不经历治疗疾病的″参考人群″或者两个或更多个人。

在某些情况下，ALT提高超过1.5倍ULN、超过2倍ULN、超过2.5倍ULN、超过3倍ULN、超过3.5倍ULN、超过4倍ULN、超过4.5倍ULN或者超过5倍ULN时被诊断为肝脏事件。在某些其它情况下，大于1倍ULN、大于1.5倍ULN和特别是大于2倍ULN的总胆红素水平(TBL)也诊断为肝脏事件。具体来讲，超过ULN的ALT和TBL组合诊断为肝脏事件。

在某些实施方案中，如果测量的载脂蛋白水平超过1.0人群正常上限(ULN)，或者超过人群1.1ULN，或1.2ULN，或1.3ULN，或1.4ULN，或1.5ULN，则将患者归为危险类别。在某些实施方案中，测量地理人群的ULN。在某些其它实施方案中，测量患病个体样品的ULN。具体来讲，在某些实施方案中，根据患有糖尿病的个体的测量值测量ULN。在某些实施方案中，根据血糖(glycemic)参数例如超过7.0mmol/L的葡萄糖水平或者大于7％的血红蛋白A1c(HbA1c)值诊断这些患者。

在其它实施方案中，如果测量的载脂蛋白水平超过正常至少1个标准差，则诊断患者为面临风险。在某些情况下，这可以是至少1或至少1.5或至少2或更多个标准差。可根据至少100或至少500或至少1000个个体的样品计算标准差。

根据其正常血清浓度，不同的载脂蛋白具有不同的参考水平。在具体实施方案中，ApoA1的参考水平(也即ULN)为约150mg/dL，约155mg/dL，约160mg/dL，约165mg/dL，约170mg/dL，约175mg/dL，约180mg/dL，约185mg/dL或约190mg/dL。在其它实施方案中，参考水平是150-200mg/dL，155-195mg/dL，160-190mg/dL，165-185mg/dL，大于150mg/dL或大于155mg/dL或大于160mg/dL或大于165mg/dL或大于170mg/dL。

在具体实施方案中，Apo-A-II的参考水平为约30mg/dL，约35mg/dL，约40mg/dL，约45mg/dL，或约50mg/dL。在其它实施方案中，参考水平是10-50mg/dL，20-40mg/dL或大于50mg/dL。

在具体实施方案中，Apo-A-IV的参考水平为约30mg/dL，约35mg/dL，约40mg/dL，约45mg/dL，或约50mg/dL。在其它实施方案中，参考水平是10-50mg/dL，20-40mg/dL或大于50mg/dL。

在具体实施方案中，Apo-B的参考水平为约120mg/dL，约125mg/dL，约130mg/dL，约135mg/dL，或约145mg/dL。在其它实施方案中，参考水平是100-150mg/dL，120-140mg/dL或大于150mg/dL。

在具体实施方案中，Apo-C-II的参考水平为约5mg/dL，约7mg/dL，约8mg/dL，约10mg/dL，或约15mg/dL。在其它实施方案中，参考水平是3-8mg/dL，4-6mg/dL或大于10mg/dL。

在具体实施方案中，Apo-C-III的参考水平为约10mg/dL，约12mg/dL，约15mg/dL，约17mg/dL，或约20mg/dL。在其它实施方案中，参考水平是5-15mg/dL，8-12mg/dL或大于20mg/dL。

在具体实施方案中，Apo-E的参考水平为约5mg/dL，约7mg/dL，约8mg/dL，约10mg/dL，或约15mg/dL。在其它实施方案中，参考水平是3-8mg/dL，4-6mg/dL或大于10mg/dL。

检测方法

在某些实施方案中，可在来自患者的血清或血浆或其它体液样品中测量载脂蛋白的水平。载脂蛋白水平可用任何合适方法测量，例如可用抗载脂蛋白表位的抗体测量。在一些实施方案中，用抗体测定法例如ELISA测量载脂蛋白的水平。用于定量测定血浆或血清样品中天然和重组人载脂蛋白的ELISA试剂盒可市售获得，例如购自MabtechAB。此类试剂盒可包含捕获Ab如单克隆抗体、标记的检测mAb、抗生蛋白链菌素-酶轭合物HRP和纯化的载脂蛋白作为标准品。

在其它实施方案中，用例如RT-PCR测量载脂蛋白基因表达。在某些情况下，通过潜在的疾病可改变ApoA1转录，个体样品的mRNA水平可预测个体DILI的危险。

在一个实施方案中，提供鉴定有肝损害，且特别是药物诱发肝损害危险的患者的方法，包括1)测量来自患者的体液中载脂蛋白的水平；和2)将样品中测量的载脂蛋白水平与患者群体的ULN比较。大于ULN的数值是预定的载脂蛋白水平，作为参考水平用于确定将药物给予患者后出现肝损害的风险。在一个实施方案中，载脂蛋白是ApoA1。其他载脂蛋白考虑在本文描述的方法之内。

在一个实施方案中，药物是普罗布考的单酯，例如普罗布考的单琥珀酸酯。

在另一个实施方案中，提供鉴定面临肝损害，且特别是药物诱发肝损害风险的患者的方法，包括1)测量来自患者的体液中ApoA1的水平；和2)将样品中测量的ApoA1水平与ApoA1参考水平比较。如果测量的ApoA1水平高于参考水平，患者出现肝损害的危险可能大于ApoA1水平小于或等于参考水平的患者。然后可以用该信息排除患者接受药物治疗。

还提供用于评估或筛选人的肝损害、损伤或疾病的方法，该方法通过1)测量来自患者的体液中载脂蛋白如ApoA1的水平；和2)将样品中测量的载脂蛋白水平与患者群体的ULN比较来进行，其中高于ULN的载脂蛋白水平提示肝损害、损伤或疾病。

在另一个实施方案中，提供用于评估或筛选人的肝损害、损伤或疾病的方法，该方法通过1)测量来自患者的体液中载脂蛋白如ApoA1的水平；和2)将样品中测量的载脂蛋白水平与预定的载脂蛋白参考水平比较来进行，其中高于ULN的载脂蛋白水平提示肝损害、损伤或疾病。

在一个实施方案中，提供用于诊断人的肝脏事件的方法，该方法通过1)测量来自患者的体液中载脂蛋白的水平；和2)将样品中测量的载脂蛋白水平与患者群体的ULN比较来进行，其中高于ULN的载脂蛋白提示肝脏事件。

在另一个实施方案中，提供用于评估或筛选人的肝损害、损伤或疾病的方法，该方法通过1)测量来自患者的体液中载脂蛋白的水平；和2)将样品中测量的ApoA1水平与预定的载脂蛋白参考水平比较来进行，其中高于ULN的载脂蛋白水平提示肝损害、损伤或疾病。

在某些情况下，其中一个或多个样品测量的载脂蛋白如ApoA1水平高于ULN的患者被视为肝损害的危险增加，特别是药物诱发的肝损害的危险较大。

其中一个或多个样品测量的载脂蛋白如ApoA1水平超过ULN的患者还可考虑具有增加的炎症活性。此类患者可考虑面临其他疾病的风险，包括炎性疾病例如类风湿性关节炎。在某些情况下，患者面临葡萄糖代谢紊乱的风险或患有葡萄糖代谢紊乱。此类紊乱可以是糖尿病，且尤其可能是2型糖尿病。

在某些情况下，将根据ApoA1测量的结果设计治疗方案。该治疗方案可要求不将抗氧化剂药物给予其ApoA1测量值超过ULN的患者，或者可要求密切监测对患者的肝毒性。此外，治疗方案可要求调节外部因素，例如饮食或运动，以减少另外暴露于可加重肝损害的环境毒素。

在另一个实施方案中，提供鉴定用于药物治疗的患者的方法，包括测量体液中ApoA1水平；将测量值与人群ApoA1水平的ULN比较；并且只有当体液中ApoA1水平小于或等于ULN时才提供药物治疗。

在具体实施方案中，患者样品是血清样品。在其它实施方案中，样品是血浆样品。

在一些实施方案中，所述方法还包括测量来自患者的样品中ALT的水平并将其与人群参考ALT水平比较。在这些情况下，测量超过ULN的ALT还用于将患者归类为不良肝损害的危险增加。在某些情况下，在给予任何药物之前测量ALT。在这些情况下，ALT水平可作为进一步的排除标准用于鉴定药物诱发肝损害危险增加的患者。在一些情况下，鉴定大于ULN的ALT水平，但在其它情况下提供至少1.5或至少2.0或更大ULN的ALT水平作为排除标准。在某些情况下，在开始治疗方案后一段时间例如1周、2周、3周、4周、5周或更久，在接受药物的患者中测量ALT水平。其ALT水平经测量超过ULN的患者可被视为面临肝毒性的风险增加或者患有肝毒性。

药物诱发的肝损害可发生在用一种或多种药物治疗的患者中。广泛种类的药物可诱发肝损害或损伤，包括但不限于PPAR激动剂、抗炎药、HIV蛋白酶抑制剂、神经药物、雌激素和抗雌激素药、抗心绞痛药、肌肉松弛剂、抗精神病药、抗组胺药，及其它药物、化合物和治疗剂。在某些实施方案中，所述药物是抗癌剂、抗菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗高血压剂、抗抑郁剂、抗焦虑剂和抗关节炎剂。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗过敏、糖尿病、高胆固醇血症、骨质疏松症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和/或其它神经变性疾病，和肥胖症。

PPAR激动剂的非限制性实例包括匹格列酮、罗格列酮、替格列扎、拉格列扎、曲格列酮、法格立他扎、环格列酮、壬二酰PAF(AzelaoylPAF)、2-溴代十六酸、氯贝丁酯、15-脱氧-d12、14-前列腺素、非诺贝特、Fmoc-Leu-OH、GW1929、GW7647、8(S)-羟基-(5Z，9E，11Z，14Z)-二十碳四烯酸(8(S)-HETE)、白三烯B4、LY-171,883(托鲁司特)、前列腺素A2、前列腺素J2、十四烷基硫代乙酸(TTA)、WY-14643(匹立尼酸)和NN622(Novo Nordisk，A/S)，和相关物质。

抗焦虑药和抗精神病药的非限制性实例包括盐酸羟嗪、氯羟安定、盐酸丁螺旋酮、Pazepam、氯氮

甲丙氨酯、奥沙西泮、三氟拉嗪、氯氮

二钾、地西泮、氯氮平、丙氯拉嗪、氟哌啶醇、硫利达嗪、替沃噻吨、利培酮、盐酸三氟拉嗪、氯丙嗪和相关物质。HIV蛋白酶抑制剂的非限制性实例包括沙奎那韦、氨普奈韦、利托那韦、奈非那韦、印地那韦、阿扎那韦(BMS232632；Bristol-Myers Squibb)、膦沙那韦(GW433908；GlaxoSmithKline)、L-756,423(Merck)、莫折那韦(Mozenavir)(DMP450；Triangle Pharmaceuticals)、替拉那韦(PNU-140690；Boehringer Ingelheim)、R0033-4649(Roche)TMC 114(Tibotec Virco)，和相关物质。

抗炎药的非限制性实例包括双氯芬酸、双氟尼酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸酯、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、丙嗪、吡罗昔康、舒林酸、托美汀，和相关物质。抗组胺药的非限制性实例包括氮斯汀(Astelin)、非索非那定(如Allegra)、西替利嗪(如Zyrtec)、地氯雷他定(如Clarinex)、氯雷他定(如Claritin、Alavert)、阿司咪唑、阿扎他定、溴苯那敏、氯苯那敏、氯马斯汀、赛庚啶、右氯苯那敏、茶苯海明、苯海拉明、多西拉敏、羟嗪、苯茚胺、吡拉明、特非那定、曲吡那敏、曲普利啶、甲地嗪、异丙嗪、异丁嗪、苯海拉明液，和相关物质。肌肉松弛剂的非限制性实例包括丹曲林(如Dantrium)、巴氯芬(如Lioresal)、卡立普多(如Soma)、氯苯甘醚(如Maolate)、氯唑沙宗(如Paraflex)、顺阿曲库胺、环苯扎林(如Flexerilt)、丹曲林、地西泮(如Valium)、美他沙酮(如Skelaxin)、加拉明(Gallamine)、美索巴莫(如Robaxin)、美维库铵(Mivacurium)、奥芬那君(如Norflex)、泮库溴铵、罗库溴铵、替扎尼定、琥珀胆碱、维库溴铵，和相关药物。

雌激素和抗雌激素的非限制性实例包括共轭雌激素(如倍美力)、酯化雌激素(如酯化雌二醇类片剂、酯化雌激素片剂(Menestg)、爱斯替)、合成的共轭雌激素(如Cenestin)、硫酸哌嗪雌酮(如Ogen，Ortho-Est)、乙炔雌二醇(如Estinyl)、去氧孕烯、己烯雌酚(如Stilphostrol)、己二烯雌酚(如Ortho Dienestrol)、氯烯雌醚(Tace)，雌二醇(如Estrace，Alora，Climara，Vivelle)、环戊丙酸雌二醇(如Depo-Estradiolg，Depogens，Dura-Estring，Estra-De，Estro-Cyp，Estroject-LA，Estronol-LA)、硫酸哌嗪雌酮、依他尼酸、二乙酸炔诺醇、左炔诺孕酮、甲羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、美雌醇、炔诺酮、诺孕酯、炔诺孕酮、他莫昔芬(如Nolvadex)、托瑞米芬(如Fareston)、雷洛昔芬(如Evista)、乙酸甲地孕酮(Megace)、氨鲁米特(如Cytadren)、阿那曲唑(如Arimidex)、来曲唑(如Femara)、依西美坦(如Aromasin)、戈舍瑞林(如Zoladex)、乙酸亮丙瑞林(如Lupron)，和相关物质。

抗心绞痛药的非限制性实例包括缓释卡兰、异搏定、缓释异搏定、维拉帕米、盐酸尼卡地平、盐酸地尔硫纳多洛尔、单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、酒石酸美托洛尔、硝酸甘油、苯磺酸氨氯地平、硝苯地平、阿替洛尔，和相关药物。

在一些实施方案中，药物诱发的肝损害来自抗氧化剂药物。在某些其它情况下，药物诱发的肝损害来自增加PPAR活性的药物。

这些方法可用于鉴定当给予药物以治疗疾病时，面临不良肝脏事件风险或者目前有不良肝脏事件的患者。疾病不是本文所述方法的关键，可将给予药物的疾病分组为三种主要类型：肿瘤性疾病、炎性疾病和变性疾病。

疾病的实例包括但不限于代谢性疾病(如肥胖症、恶病质、糖尿病、厌食症等)、心血管疾病(如动脉粥样硬化、缺血/再灌注、高血压、心肌梗死、再狭窄、心肌病、动脉炎症、心绞痛等)、免疫紊乱(如慢性炎性疾病和紊乱，例如克罗恩氏病、炎性肠病、反应性关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎包括莱姆病(Lyme disease)、胰岛素依赖性糖尿病，器官特异性自身免疫，包括多发性硬化、桥本甲状腺炎和格雷夫斯病、接触性皮炎、银屑病、移植物排斥、移植物抗宿主病、肉样瘤病，特应性疾病，例如哮喘和过敏，包括过敏性鼻炎、胃肠道过敏，包括食物过敏、嗜酸性粒细胞增多症、结膜炎、肾小球肾炎，某些病原体敏感例如蠕虫(如利什曼病)和某些病毒感染，包括HIV，和细菌感染，包括结核病和瘤型麻风等)，肌病(如多发性肌炎、肌营养不良、中央核疾病、中央核(肌管)肌病、先天性肌强直病、纤维状肌病、先天性肌强直病、周期性麻痹、线粒体肌病等)，神经系统疾病(如神经病变、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、肌萎缩性侧索硬化、运动神经元病、外伤性神经损伤、多发性硬化、急性弥散性脑脊髓炎、急性坏死性出血性白质脑炎、髓鞘形成障碍疾病、线粒体病、偏头痛、细菌感染、真菌感染、中风、衰老、痴呆、外周神经系统疾病和精神障碍例如抑郁症和精神分裂症等)，肿瘤疾病(如白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、喉癌、乳腺癌、皮肤癌、黑素瘤、肺癌、肉瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食管癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、垂体癌、肾癌等)和眼病(如视网膜色素变性和黄斑变性)。该术语还包括因氧化应激、遗传性癌综合征和代谢性疾病引起的紊乱。

本发明的方法和试剂盒还可用于监测和诊断各种肝病，包括早期组织损伤/器官排斥、某些形式的病毒感染、药物毒性和肝功能变化。所述方法提供目前在临床场合上没有的信息，且是快速和可重现的。所述方法和试剂盒特别可用于评估治疗剂和药物在肝损伤方面的毒性。用本发明方法早期检测肝病可在出现不良反应时，还允许早期的临床干预。

药剂盒

本发明还提供用于在给予药物、化合物或其它治疗剂之前或过程中确定或预测患者或患者群体内肝毒性的试剂盒。此类试剂盒可用于临床或临床前情况，可同时用于患者试验的不同时期。

在一个实施方案中，提供用于鉴定有药物诱发肝损害危险的患者的试剂盒，包含测量患者样品中载脂蛋白如ApoA1水平的检测系统和将测量水平与人群正常水平比较的检测系统。患者样品可为体液形式，例如血液和血浆、粘液、唾液、血清或尿。在一些实施方案中，试剂盒中的检测系统可以是抗ApoA1的标记抗体或者包含抗ApoA1的测量抗体和标记第二抗体的ELISA试剂盒。在另外的实施方案中，检测系统可以是非抗载脂蛋白抗体的结合伴侣。在还有其它实施方案中，检测系统可以例如通过RT-PCR检测载脂蛋白基因产物的水平。比较系统可以是单独的检测试剂盒，其中将ApoA1的水平标化至对应于正常上限。可以在色度标尺上或者可根据直接比较来自检测系统的信号水平读数。在其它实施方案中，试剂盒包括图表，以便比较样品中测量的ApoA1水平与人群的正常上限。

在某些情况下，包括视觉读数，如果样品中ApoA1水平大于正常上限1.0倍则提供标记信号。在具体实施方案中，试剂盒包括检测装置，如果样品中测量的ApoA1水平大于165mg/dl，则提供标记信号。在一个实施方案中，预定水平是试剂盒的一部分，以致试剂盒需要最小浓度的载脂蛋白以鉴定阳性结果。当使用试剂盒时，只有载脂蛋白浓度大于预定水平的个体才显示阳性结果。

在一个实施方案中，试剂盒包含用一种或多种抗体包被的固相材料的条带组合物，在本文称为″浸渍条(dipsticks)″。当浸入蛋白质样品时，浸渍条与载脂蛋白特异性结合。用合适方法例如通过用脂类染料染色或者与第二标记抗体反应对结合在浸渍条上的载脂蛋白的量进行定量。在浸渍条上的染料强度与血液循环中的载脂蛋白浓度成正比，并可通过与含有已知量脂质的标准品比较定量。可单独提供浸渍条或将其提供在试剂盒中，使非专业人员不需要医生或专门实验室就能够进行测定。在一个实施方案中，在浸渍条上抗载脂蛋白抗体或其它结合元件的浓度只足够检测大于预定水平的载脂蛋白浓度。在这点上，只有当测试样品中载脂蛋白的浓度超过预定水平时将在浸渍条上出现阳性结果。

抗载脂蛋白的单克隆抗体不仅可用作浸渍条的组分，还可用于多种其它诊断试剂盒中，包括酶免疫测定、放射免疫测定以及荧光和化学发光免疫测定，以确定在生物样品中为免疫反应性的载脂蛋白。

抗体可与固相材料结合用于本文所述测定法。各种类型的吸附材料例如硝基纤维素，Immobilon^TM，聚二氟乙烯(polyvinyldiene difluoride)(全部来自BioRad，Hercules，Calif.)可作为固相材料用于结合抗脂蛋白抗体。还可使用其它固相材料，包括树脂和多孔板或者由聚苯乙烯、聚丙烯或其它合成聚合材料组成的其它材料。在测定载脂蛋白浓度的优选实施方案中，将这些材料的碎片或条带用一种或多种直接抗载脂蛋白特异性表位的抗体或其功能片段包被用于患者样品。浸渍条还可与较长的固体支持材料例如塑料带的一端连接，后者可充当手柄用于将浸渍条浸入溶液或样品例如全血、血浆或血清样品内。塑料手柄还可充当系链以便可将多个浸渍条连接在共用支持物上。此类多条带设计特别可用于同时测试多种载脂蛋白的装置。

虽然浸渍条的大小可能不同，在一个实施方案中，用抗体包被的固相材料碎片具有0.5cm×0.5cm的通用尺寸，可与通用尺寸为0.5cm×5cm的较长固体支持条带连接。这样的尺寸允许在小至100μL血液中精确地测定载脂蛋白水平。

用于要求保护的方法的浸渍条包含一个或多个含有对载脂蛋白或脂蛋白上特定表位呈特异性的固定抗体的区域。抗体共轭的诊断浸渍条的实例描述于例如但不限于美国专利号7,098,036、6,808,889和6,087,185中。

浸渍条可包含不止一种抗体以便单个浸渍条可用于检测一种以上的载脂蛋白。例如，两片或多片单独的固相材料，各自用直接抗特定载脂蛋白或脂蛋白的抗体包被，可连接至较长的固体支持物条带以产生具有两个或更多个单独区域的浸渍条，各自对特定载脂蛋白具有特异性。将固相材料与固体支持物连接的工具不应削弱包被在固相材料上的分子的功能，且必须足够安全以经受浸泡在全血、血清、血浆和用于洗涤、染色和保存浸渍条的本文所述其它溶液中。将抗体包被的固相材料与较长的固体支持条带连接的优选方法是使用胶水或粘结剂例如丙烯酸酯粘合剂(如SUPER GLUE^TM，Super Glue Corporation，Hollis，N.Y.；DURO^TM，Loctite Corporation，Cleveland，Ohio)。

可将浸渍条设计用于定量测试患者样品中的一种或多种载脂蛋白。在一个实施方案中，设计用于载脂蛋白定量的浸渍条包含单个抗原结合区，将其浸入样品内，染色用于结合脂质脂蛋白或载脂蛋白，并与一组打印的彩色标准品进行目测比较，以确定特定脂蛋白或载脂蛋白的浓度。

此外，可将浸渍条设计用于检测样品中具体载脂蛋白相对水平的变化。可将浸渍条设计用于检测特异性载脂蛋白相对水平的变化，其包含两个抗原结合区，各自用不同的抗体包被。在处理浸渍条以检测每种抗体结合的载脂蛋白抗原之后，将浸渍条两个区域颜色的相对强度相比，作为血液中两种抗原相对浓度的指标。

也可通过同时用两个单独的浸渍条确定特定载脂蛋白的相对水平。但是，具有两个抗原结合区的单个浸渍条通常更容易使用，特别是对于非专业人员，即使对于未经训练的观察者而言，评估单个浸渍条上紧密靠近的两个区域的相对颜色强度也相对容易。

在另一个实施方案中，制备包含已知量分子(其水平将由浸渍条决定)的不同区域或斑点的浸渍条。例如，利用方法例如上述用于连接抗体与固相材料的那些方法将已知量的脂质、脂蛋白和/或载脂蛋白置于浸渍条上。存在于浸渍条上的此类已知量的脂质、脂蛋白和载脂蛋白充当″内标物″，可将其染色强度与浸渍条的抗原结合区的相比以评估浸渍条上被抗体结合的抗原量。

在这些方法中的重要试剂包括抗体或抗体的功能片段，其特异性识别和结合特定脂蛋白，将其它脂蛋白留在未吸附的样品中。为了测定全血、血清或血浆样品的载脂蛋白，将浸渍条与EDTA处理或肝素化血液在室温下温育2-5分钟。温育之后，洗涤各条带以除去未结合的血液(例如在不超过40C的温度下用自来水洗涤0.5-1分钟)。然后将浸渍条染色，例如在室温下通过将浸渍条浸在染色溶液例如苏丹红(Sudan Red)7B中2-5分钟使存在于结合脂蛋白颗粒中的脂质染色。接着通过再次洗涤除去过量染料。可用吸收毛巾接触浸渍条边缘除去残留水分或染料。浸渍条的″面部″，也就是浸渍条的含固定抗体侧，不应沾上污渍，这可能干扰固定抗体和/或结合抗原。在干燥后，可将染色的强度与标化彩色条带相比以确定血液中的脂蛋白浓度。

许多其它脂质染料例如Oil Red O(油红O)或Sudan Black B(苏丹黑B)也可用于浸渍条的染色。但是，在优选实施方案中，使用溶于甲醇和NaOH混合物中的苏丹红(Sudan Red)7B，也称为Fat Red 7B(Sigma，St.Louis，Mo.)，因为其颜色强度高。在另一个实施方案中，利用溶于丙二醇中的上述任何脂质染料，在脂蛋白与抗体例如浸渍条上的抗体结合之前将其染色(″预染色″)(Wollenweber，J.and Kahlke，W.，Clin.Chim.Acta，29：411-420(1970))。然后将预染色的血液、血浆或血清样品与例如抗-LDL或抗-HDL浸渍条一起温育。在洗涤和干燥后，根据颜色的强度，例如通过与一组打印的彩色标准品相比，经肉眼目测确定浸渍条捕获的预染色脂蛋白的量。

许多可检测的标记物、指示剂(reporters)、部分为本领域已知，并可用于本发明。例如，可检测的部分可以发色、发荧光或发光，或者可以是特异性结合对的成员，一种可用任何已知的免疫测定方法被抗体检测的物质。本领域普通技术人员已知许多不同的标记物和标记方法。可用于本发明的标记物类型的实例包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物、发磷光化合物和生物发光化合物。本领域普通技术人员将知道与载脂蛋白例如ApoA1结合的其它合适标记物、与载脂蛋白结合的化合物或与载脂蛋白结合的抗体，或者将能够用常规实验确定这样的物质。

本发明的修饰和变更对本领域技术人员而言将是显而易见的。所有这些实施方案都视为落在本发明范围内。

实施例

在普罗布考单琥珀酸酯(AGI-1067)的临床研究中进行分析以鉴定药物诱发肝毒性的潜在危险因素。AGI-1067代表靶向某些慢性疾病例如II型糖尿病和动脉粥样硬化的一类新型疗法。AGI-1067既有直接抗氧化剂的功能，也有内源性抗氧化剂过程例如血红素加氧酶-1和硫氧还蛋白诱导剂的功能。

在大型临床研究(大于6000名患者，平均暴露2年)中，显示AGI-1067在先前存在冠状动脉病的治疗良好的患者中可减少有害的心血管终点(心血管死亡、非致死性心肌梗死(MI)和非致死性中风的复症(composite))，在这些患有2型糖尿病的患者的大亚组中降低HbA1c水平。在相同研究中，随机用AGI-1067治疗的3078名患者中有少数在肝功能试验中表现可逆性升高，与安慰剂组的4名患者比较，其中8名患者显示升高的ALT和胆红素。

实施例1：单独ALT提高预测肝毒性差

在糖尿病患者的合并数据组中有36名患者具有3×至≤5×ULN之间的升高的ATL峰。治疗组的数据概括显示于表1中。AGI-1067和安慰剂处理组患者在该范围内ALT升高的发病率具有可比性。因此ALT水平在评估潜在肝毒性方面的价值有限。

表1.

实施例2：ALT升高结合总胆红素水平是有用的肝脏事件指标

当使用ALT＞5X ULN加TBL＜2X ULN标准或ALT＞3X ULN加TBL＞2X ULN标准时在具有肝脏事件的合并数据组中有24名糖尿病患者。表2概括治疗组和给予AGI-1067的患者。随机取样，57％患者在AGI-1067组，43％在安慰剂组，导致AGI-1067与安慰剂的比率为1.3。在24个肝脏事件中，17个发生在AGI-1067治疗的患者，7个发生在安慰剂处理的患者中。

表2.

在使用风险鉴定工具之前

实施例3：ApoA1水平与不良肝脏事件直接相关.

ApoA1测量对于鉴定后续肝脏事件既敏感也具有特异性。当测量ALT＞5X ULN且TBL＜2X ULN或者ALT＞3X ULN且TBL＞2X ULN时确定事件。图1用Cox比例风险模型由2型糖尿病患者数据产生，显示基线ApoA1的5th-95th百分位数范围对后续肝脏事件的年龄校正作用。作为参考点，本试验ApoA1的ULN是165mg/dL。实线和虚线分别代表AGI-1067和安慰剂数据。

实施例4：测量ApoA1为鉴定有药物诱发肝毒性风险的患者提供有用的工具.

如实施例2指出，在样品人群中肝脏事件占AGI-1067治疗患者的71％(17/24)，占接受安慰剂患者的29％(7/24)，导致AGI-1067与安慰剂的比率为2.4。当从样品中排除在给予任何药物之前测量的ApoA1超过ULN(这里，165mg/dl)的患者时，在AGI-1067和安慰剂治疗组获得同等肝脏事件数。

使用ALT＞5X ULN加TBL＜2X ULN或ALT＞3X ULN加TBL＞2X ULN标准时在具有肝脏事件的合并数据组中有14名患者。表3概括治疗组和给予AGI-1067的患者。如实施例2指出，随机取样AGI-1067与安慰剂患者的比率是1.3，与AGI-1067与安慰剂相比的随机比率的数值相同。

当排除升高的ApoA1水平或ALT水平大于2.0倍ULN的患者时，消除10个肝脏事件。其中，90％在AGI-1067治疗组。在剩余14个肝脏事件中，8个在AGI-1067治疗的患者，而6个为安慰剂处理的患者。这些肝脏事件占AGI-1067患者的57％(8/14)，占接受安慰剂患者的43％(6/14)。这导致AGI-1067与安慰剂的比率为1.3。

表3.

使用风险鉴定工具

因此，应用排除标准导致肝脏事件的比率非常低，AGI-1067(8/1851)和安慰剂(6/1419)组的发病率都为0.4％。

表4概括排除标准(主要是ApoA1升高)对数据组中包含的3270位2型糖尿病患者的AGI-1067和安慰剂组肝脏事件的数量、频率分布和比率的影响。

表4.

表5显示用基线ApoA1作为″预测性生物标记″将导致对AGI-1067患者的排除的肝脏事件为安慰剂患者的排除的肝脏事件的7倍。ALT＞2X ULN还可作为第二指标用于排除患者。

表5.

排除的肝脏事件数

生物标记	AGI-1067	安慰剂
			ApoA1＞165mg/dl	7	1
基线ALT＞2X ULN	1	0
			第1月ALT＞2X ULN	1	0
合计	9	1

Claims (20)

1.一种用可诱发肝毒性的药物治疗患者的方法，其包括：

a)测量来自患者的体液中载脂蛋白的水平；和

b)将测量的样品中载脂蛋白的水平与患者群体的参考值比较；

c)其中如果测量值小于或等于参考值，则给予患者药物。

2.权利要求1的方法，其中所述药物给予有需要的患者以治疗糖尿病。

3.权利要求1的方法，其中所述药物给予有需要的患者以治疗心血管疾病。

4.权利要求3的方法，其中所述药物是普罗布考的单酯。

5.权利要求1的方法，其中的载脂蛋白选自Apo A-I、Apo A-II、Apo A-IV、Apo B-100、Apo B-48、Apo C-I、Apo C-II、Apo C-III或Apo E。

6.权利要求5的方法，其中的载脂蛋白是Apo-A1。

7.权利要求6的方法，其中Apo-A1的参考值在约155-195mg/dL之间。

8.权利要求7的方法，其中Apo-A1的参考值是165mg/dL。

9.权利要求1的方法，其还包括测量患者的ALT水平和患者的总胆红素水平的至少一种，并将测量的水平与人群的ALT参考值或总胆红素参考水平相比。

10.权利要求9的方法，其中只有当测量的ALT水平是参考值的至少2倍或者当测量的总胆红素水平至少超过参考值1倍时才将药物给予患者。

11.权利要求1的方法，其中的体液选自血液、血浆、粘液、唾液、血清或尿。

12.一种用于鉴定面临药物诱发肝损害风险的患者的试剂盒，其包含：a)测量患者样品中载脂蛋白水平的检测系统；和b)将测量的水平与人群中预定正常上限(ULN)比较的系统。

13.权利要求12的试剂盒，其中检测系统固定在固体支持物上。

14.权利要求13的试剂盒，其中检测系统包含抗载脂蛋白抗体。

15.权利要求12的试剂盒，其中试剂盒包含如果样品中载脂蛋白水平大于ULN 1.0倍时的视觉读出信号。

16.权利要求12的试剂盒，其中的载脂蛋白是ApoA1。

17.权利要求12的试剂盒，其还包含一种系统，所述系统用于测量选自样品中ALT水平、样品中总胆红素水平和样品中ALT和总胆红素的组合的水平，并将测量的水平与人群中ALT或总胆红素的ULN比较。

18.权利要求17的试剂盒，其包含如果ALT水平大于ALT的ULN约2倍或者如果总胆红素水平大于总胆红素的ULN约1倍时的视觉读出信号。

19.权利要求16的试剂盒，其中Apo-A1的ULN为约155-195mg/dL。

20.权利要求16的试剂盒，其中ApoA1的ULN是165mg/dl。