治疗血友病B的基因药物及其制备方法
本发明涉及治疗血友病B的基因药物及其制备方法。
血友病B又称乙型血友病,是一种凝血IX因子(FIX)缺陷引起的X连锁隐性遗传的出血性疾病,在男性中发病率为1/30000。
FIX是内源性凝血级联反应过程中必需的蛋白因子,当FIX与调控蛋白FVIII形成复合物后,使内源性凝血级联反应速度成千倍增加,至使凝血过程仅在几分钟内即可完成。因此,当人体内缺乏FIX时,便表现为自发性或微外伤后出血不止,严重者可因关节出血而导致关节变形和残废或因内脏或颅内出血而死亡。编码FIX蛋白的基因于1982年被克隆,它位于Xq27.1带,共8个外显子,编码区全长1.383kb,编码415个氨基酸。(Choo KH,Gould KG,ReesDJ,et al.Nature 1982;299:178-180;Kurachi K,Davie EW.ProcNatl Acad Sci USA 1982;79:6461-6464.)成人的FIX蛋白分子量为56KD,在正常血浆中含量为5μg/ml(Kaufman RJ.Human GeneTherapy 1999;10:2091-2107.)。血友病B的临床治疗仅限于蛋白替代治疗即靠输血,或补充FIX浓缩制剂。但由于FIX在人体内半衰期仅24小时,患者需要反复输血或血液制品来维持生命,不仅要承受沉重的经济负担,而且还面临艾滋病病毒、乙肝病毒和疯牛朊病毒感染的威胁。
如何将正常FIX基因导入患者体内以替代缺陷的FIX基因是血友病B基因治疗中遇到的最关键的问题。目前用于FIX基因治疗研究的载体主要为病毒性载体,如逆转录病毒载体,腺病毒载体及腺相关病毒载体。逆转录病毒载体虽能稳定地整合到靶细胞的基因组中,但其只能感染分裂细胞,且存在插入诱变等安全隐患;腺病毒载体体内外感染效率高,而且能感染非分裂细胞,但其受到免疫原性的影响使导入的基因不能长期表达;腺相关病毒载体能有效感染体内各种细胞,也能使导入的基因长期表达,但它仍未能解决插入诱变的安全性问题。因此近十年来,尽管在血友病B的基因治疗方面采取了许多改进措施,但至今仍未得到安全的、稳定的、一次性治疗的基因药物,关键问题就在于还没找到一种安全性好、无免疫原性、能高效转化靶细胞并在靶细胞中长期稳定表达治疗基因的载体。
本发明的目的是提供一种安全、能使治疗基因在靶细胞中稳定表达的治疗血友病B的基因药物。
本发明的另一目的是提供一种制备上述基因药物的方法。
本发明提供的治疗血友病B的基因药物,含有以人类D、G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的DNA序列或与该DNA序列具有50%及50%以上同源性的DNA序列作为治疗基因的引导序列所构建的基因载体-FIX重组体,含基因载体-FIX重组体的菌株已于2000年9月29日(2000.9.29)向中国典型培养物保藏中心提出保藏(中国.武汉武汉大学校内,邮政编码:430072),其保藏号是:CCTCCM200031。保藏人对保藏物指定的分类命名为Escherichia coli JM109/JH-4/pNS-FIX。
本申请人发现2个携带额外双随体小染色体(BM)而表型正常的家系,该小染色体分别在2个家系的2代人和3代人之间稳定遗传,且对人体无任何危害。因此本发明人提出了分离该小染色体原件、组装人源基因载体的方案。国内外至今已报导这类家系17个,但没有人提出利用该小染色体作为基因载体的类似设想。在研究中申请人用FISH技术查明,该小染色体来源于人的D、G组染色体短臂即13、14、15、21、22号染色体短臂,由于D、G组染色体短臂为核仁组织区,富含核糖体DNA(rDNA),该区域不但在人群中存在着长度不同的各种多态(即含rDNA的量有多有少),而且在细胞分裂间期该区域基因转录十分活跃,因此,本发明人推测如果能从BM克隆出具有特异性的DNA片段,并以其作为治疗基因的引导序列,将治疗基因定点导入人体D、G组染色体短臂核仁组织区,应该有较高的、稳定的和无害的表达。后续的实施例对此作出了有力的证明。
本发明人首先利用显微切割的方法,构建了小染色体特异性的pUC19文库并从中筛选得到单拷贝片段,该片段经荧光原位杂交(FISH)证实来源于小染色体和D、G组染色体短臂,进一步以此单拷贝片段为探针筛选人PAC基因组DNA文库,获得了约120kb的小染色体特异性DNA片段(BMSF),并经FISH证实来源于小染色体和D、G组染色体短臂(图1)。测序分析BMSF的序列特性,未发现与重要生理功能相关的基因,因此证明,以此为靶位点是安全的。本发明进一步利用120kb或从中选择更小的具有特异性的DNA片段,构建基因载体。
因此本申请人认为基因引导序列选自人类D、G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的DNA序列或与该DNA序列具有50%及50%以上同源性的DNA序列作为治疗基因的引导序列是符合发明目的的。由此构建的基因载体具有特异性,能将治疗基因定点导入到人D、G组染色体短臂上,并高效稳定表达。
在所制备的药物中,还可含有有利于治疗基因导入宿主细胞的辅助成份,如脂质体、对宿主细胞有特异性的蛋白质。
本发明实施例中具体给出了序列表1表示的载体-FIX重组体,其中3.8kb引导序列来源于BMSF,利用TK作为负筛选基因,将正筛选基因Neo基因插入治疗基因引导序列中的1500位,使其分为1.5kb和2.3kb两臂,FIX治疗基因的插入位点为5910位。治疗基因的插入有正反向之分,本发明实施例中为反向插入。
在获得治疗基因引导序列的基础上,按现有技术可构建各种形式的载体。构建载体和将治疗基因装入载体的方法是通常的方法。
本发明实施例中具体给出了从人D、G组染色体短臂上克隆得到的具有特异性的3.8kb DNA序列作为治疗基因引导序列,并构建载体的过程。
得到上述携带治疗基因的载体后,可进一步将其导入人离体细胞中,同样可作为治疗血友病B的基因药物。
这样,将含上述转化后的人离体细胞或含有承载有治疗基因的载体的基因药物通过皮下包埋、电穿孔或静脉注射等方式导入患者体内或将载体-FIX重组体用脂质体包裹直接注入患者体内,使治疗基因能在患者体内长期稳定表达,以纠正缺陷基因导致的临床症状。
由于本发明提供的治疗血友病B的基因药物中,以人类D、G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的DNA序列或与该DNA序列具有50%及50%以上同源性的DNA序列作为治疗基因的引导序列,来构建基因载体。毫无疑问,由其构建的基因载体能将其上承载的治疗基因定点导入宿主细胞中特定靶位,并且由于该特定靶位的DNA片段不具有重要的生理功能相关的基因,因此治疗基因的导入是安全的。
综上所述,本发明提供的治疗血友病B的基因药物中由于采用了人源基因引导序列来构建承载治疗基因的载体,因而
(1)治疗基因表达稳定性好:由于承载治疗基因的载体能将治疗基因定点插入到人体细胞的D组和G组染色体短臂上,所以使治疗基因随染色体而稳定遗传;
(2)安全性好:由于在治疗基因导入的靶位点不含有与重要生理功能相关的基因,证明该靶位点安全,同时FISH证实载体能将治疗基因定点插入细胞中安全的靶位点(图3),排除了随机插入突变,也不存在野生型病毒的危害。所以治疗基因在靶位点的表达是安全的。虽然本发明没有提供基因治疗的临床证明,但申请人及国内外研究者发现的实例从另一角度证明了其安全性(实施例4);
(3)表达效率高:第一,由于本发明承载治疗基因的载体含有来源于D、G组染色体短臂的引导序列,因此对应地在人体细胞中存在10个靶位点,插入效率比其它载体至少高5-10倍;第二,由于引导序列来自于基因转录活跃的D、G组染色体短臂,引导进入靶位点的治疗基因能得到高效表达;
(4)无免疫原性:由于该载体为人源性的,因此用于人体不会产生免疫原性。
图1是120kb BMSF的FISH定位图;
图2是本发明提供的一种基因载体-FIX重组体的结构图(基因载体序列全长:13928bp);其中pGEM-7(11033-13928):载体复制元件及原核筛选系统;TK(1-2840):真核细胞负筛选基因,该基因使用TK启动子和TK polyA信号;Neo(4342-5910):真核细胞正筛选基因,该基因使用sv40启动子和sv40 polyA信号;FIX(5911-8677):FIX治疗基因,该基因使用CMV启动子和BGHpolyA信号;GLS(2841-4341,8678-11032):治疗基因引导序列;Cloning site(5910):治疗基因插入位点。
图3是外源性FIX治疗基因在阳性细胞克隆中的FISH定位,证明该载体能将FIX定点导入D、G组染色体短臂;
图4是FIX阳性细胞Western结果,F3~F23为6个不同阳性细胞株,“-”示阴性对照。
本发明提供的实施例只是实现本发明的一种方式,不能视为对本发明的限制。
实施例1
本发明提供的基因引导序列的制备:
1.基因引导序列PAC克隆的获得
1.1显微切割、PCR、微克隆构建BM特异性pUC19文库(DengH-X,Yoshiura K,Dirks RW,et al.Hum Genet 1992,89:13.)
1.2 BM特异性单拷贝DNA的获得及鉴定
(1)菌落点阵膜的制备:在两张尼龙膜上划好14×14个方格,标记为A、B,分别置于2个有固体LB的平皿中,从文库皿中随机挑取白色克隆分别点到两张膜坐标相同的方格内,共挑14×12个,第13行点100ng单拷贝DNA做阳性对照,第14行点100ng gDNA做为阴性对照,两个皿分别置37℃培养10~12小时,其中B膜置4℃保存,将A膜从皿中取出,分别在用以下溶液浸湿的滤纸上处理,10%SDS,5分钟,0.5N NaOH/1.5M NaCl,3分钟,1.5M NaCl/0.5MTris·HCl,3分钟,2×SSC/0.2M Tris·HCl,10分钟,80℃真空干燥2小时,37℃保存待用。
(2)gDNA探针的制备
取50~75ng gDNA加无菌水至11ml,100℃煮沸变性10分钟,以下列体系做随机引物标记反应:
2mM dNTP(dATP-) 3μl
primer mixture 2μl
Klenow酶 1μl
α-32P-dATP 3μl
点离混匀,37℃浮浴30分钟。加8μl stopmixture,过G-50柱纯化探针,取1/100测液闪值。
(3)杂交:菌落点阵膜置于2×SSC中浸泡10分钟,轻轻拭去膜表面的菌落碎片,65℃,5ml杂交液预杂交,30分钟以上。根据液闪值,按1.2×106cpm/ml杂交液的量取探针液于100℃煮沸变性10分钟,加入5ml新鲜杂交液,与菌落点阵膜65℃杂交12小时以上。按以下条件洗膜:2×SSC/0.1%SDS,室温10分钟,2×SSC/0.1%SDS,65℃10分钟,0.1×SSC/0.1%SDS,65℃10分钟,-70℃放射自显影,杂交信号无或弱的初步认为是单拷贝。
(4)测序,Southern杂交鉴定:在B膜上相应位置挑取无杂交信号的克隆,小量扩增,抽提质粒DNA测序,与GenBank数据库比较,无相似性的为单拷贝。最后EcoRI酶切分离插入子DNA,并以随机引物法,用α-32P-dATP标记并与EcoRI消化的gDNA转移尼龙膜杂交,方法同上,1条或2条杂交带的为单拷贝。
1.3 BM及D、G组染色体短臂特异性PAC克隆的获得及鉴定
(1)筛选人PAC gDNA文库获得阳性克隆编号
利用α-32P-dATP随机引物法标记260bp的单拷贝探针P8-7→G-50柱(中等粒度)纯化→4℃待用→PAC膜7张用2×SSC浸泡10分钟→55℃预杂交3小时→探针100℃变性10分钟→以4.6×105cpm/ml的量加入50ml购买的杂交液中,与PAC膜于65℃杂交1小时→洗膜:2×SSC,室温10分钟一次,2×SSC/0.1%SDS 65℃10分钟洗2次→上X光片,-70℃放射自显影12小时→冲洗X光片→按说明书方法读取阳性克隆编号。
(2)从5个不同的板上随机挑选阳性克隆编号,购买PAC克隆。
1.4 PAC DNA与中期相细胞FISH杂交,证实来源于D、G组染色体短臂,如图1所示。
上述实验方法参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克等,第2版,1989冷泉港实验室出版。(J.Sambrook et al.Molecular Cloning.Second Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)
2.基因引导序列DNA的获得
主要材料:β-agarose(Bio-Labs)NotI Agarose
①NotI酶切PAC169质粒;
②通过PFGE分离约120Kb大小的插入子DNA;
脉冲电泳条件:电极缓冲液:0.5×TBE、High stregth AnalyticalGrade Agarose:(Bio-Rad,Low Melting point Agarose LMP)1%、SwitchTime:2秒→15秒电泳时间:18小时,电压:6V/cm,角度:120°温度:14℃
③电泳结束后,用EB染色(0.2μg/ml)30分钟,根据Marker指示,用无菌小刀片切下约3.8kb(120kb)的条带。
④切下的胶块用β-agarase处理,乙醇沉淀。
实施例2
本发明提供的基因载体-FIX重组体,即治疗血友病B的基因药物的制备:
1.基因载体的构建及治疗基因的导入
1.1载体的构建
1.1.1用NsiI和StuI(平端酶)酶切PAC DNA,普通琼脂糖凝胶回收3.8kbDNA片段,电洗脱纯化;
1.1.2用HindIII酶切pGEM-TK载体DNA,Klenow酶补平,产生一平头末端;
1.1.3 pGEM-TK/HindIII补平产物进一步用NsiI酶切;
1.1.4 3.8kb/NsiI+StuI纯化产物与pGEM-TK/HK+NsiI酶切产物于16℃连接17小时;
1.1.5连接产物转化JM109感受态细菌,氨苄皿37℃培养18小时;
1.1.6随机挑取单克隆,用NsiI及NheI双酶切鉴定阳性克隆。
1.1.7用XbaI和NheI双酶切pCDN-GPR质粒获得Neo/XbaI+NheI
1.1.8将Neo/XbaI+NheI与pGEM-TK-3.8kb/NheI连接,构建成pNS2基因载体.
1.2 FIX的导入
1.2.1将FIX(CDS)克隆至pcDNA 3.1(-);
1.2.2设计引物TPCF和TPCR扩增FIX基因及表达元件(CMV启动子和BGH poly A信号),使其两端装上AvrII酶切位点;引物序列为:
TpcF:ATgCAT
CCTAggggAggTCgCTgAgTAgTg
AvrII
TpcR:TgCATg
CCTAggTACCCCCTAgAgCCCAg
AvrII
1.2.3用AvrII酶切FIX基因及表达元件(CMV启动子和BGH polyA信号)并与NheI酶切的pNS2载体连接。
1.2.4连接产物转化JM109大肠杆菌,获得含载体-FIX重组体的菌株(保藏号为CCTCC M200031)。
上述实验方法详见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克等,第2版,1989冷泉港实验室出版。(J.Sambrook et al.Molecular Cloning.Second Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)
2.基因载体DNA的抽提
2.1材料:
2.1.1QIAGE Plasmid Maxi Kit
2.1.2培养基:液体LB
Trypton 5g
Yeast extract 2.5g
Nacl 2.5g
ddH2O 定量至500ml
高压蒸汽灭菌
2.1.3氨苄青霉素(Amp):100mg/ml(1000×)
2.2方法:
1)挑取阳性单克隆至3ml LB(Amp+)37℃,250rpm培养1小时
2)取100μl上述初级培养物置100ml LB(Amp+)中,37℃,250rpm培养16小时
3)于4℃,6000g离心15分钟收获细菌
4)10ml Buffer P1重悬菌体
5)加入10ml Buffer P2,轻柔地倒转6次混匀,室温5分钟。
6)加入10ml冰上预冷Buffer P3,轻柔倒转6次混匀,冰上20分钟。
7)4℃,20000g离心30分钟。
8)迅速将上清转移至另一40ml高速离心管,4℃,20000xg再次离心15分钟
9)10ml Buffer QBT平衡QIGEN tip 500
10)将上清转移至QIGAE tip 500过柱
11)2×30ml Buffer QC洗柱
12)15ml Buffer QF洗脱,收集洗脱液
13)洗脱液加(0.7倍体积)10.7ml异丙醇,混匀
14)15000g,4℃,离心30分钟
15)去上清,DNA沉淀加入5ml 70%乙醇洗涤,15000g,4℃离心10分钟
16)去70%乙醇,空气中干燥10分钟适量TE溶解DNA沉淀
实施例3
利用实施例2得到的基因载体-FIX重组体,将FIX治疗基因导入宿主细胞,并在宿主细胞中表达,导入的HT1080细胞株已于2000年8月18日向中国典型培养物保藏中心提出保藏(中国.武汉武汉大学校内,邮政编码:430072),其保藏号是:CCTCC C200005。该保藏物的名称是:人纤维肉瘤细胞系,为人的转基因细胞。保藏人对保藏物指定的分类命名为:人纤维肉瘤细胞系/JH-1/FIX。
1.材料:
1.1细胞:HT1080
培养基:高糖DMEM+10%FBS(HT1080)EMEM+10%FBS
1.2电穿孔仪:Bio-Rad公司
2.方法:
1)细胞于75cm2培养瓶内传代后长至70%~80%满底
2)收获细胞,用HeBs缓冲液洗2次,计数细胞
3)15000rpm,4℃离心10分钟
4)适量HeBS重悬,使细胞浓度为106~107/ml
5)取0.4ml电击杯,每杯加细胞悬液0.8ml,载体DNA 10μg左右
6)用电穿孔仪进行电击,电击条件设定为电压260V,电容550μF,电击时间一般为11~13毫秒。
7)电击细胞转入75cm2培养瓶中,加14ml含双抗的培养基,37℃,5%CO2中培养,24~48小时。
8)培养基内加入终浓度300μl的G418进行筛选,2~3天换液一次,换液时重新加G418,同时用正常细胞做对照
9)约7~10天后正常细胞全部死亡,计数转染细胞内存活克隆数,改用维持量G418 150μg/ml
10)转染细胞继续用终浓度为500ng/ml的GCV进行筛选
11)7~10天大部分克隆死亡,剩余存活细胞改用维持量GCV250μg/ml或不加经过筛的细胞长至70~80%满底后,测定转移基因的表达活性。
3.结果
利用该载体将FIX基因用电穿孔的方法导入HT1080细胞,经正、负筛选得到阳性细胞株,FISH证实为定点插入(图3)。
FIX活性由阴性对照的低于0.1μg/ml升高到4.27μg/ml,而且转化后144天表达量仍为3.15μg/ml,见表1。其表达产物通过Western杂交证实(图4)。
表1 FIX活性测定:(μg/ml/105细胞/24小时)
转化后天数 克隆F23
35天 4.27
72天 4.39
100天 4.6
111天 3.95
139天 4.0
144天 3.15
实施例4
在人群中存在的安全性实例:
从1973年夏家辉从事人类与医学细胞遗传学研究以来,所发现和鉴定的来自全国189个实验室的470位临床细胞遗传学工作者所申报的732种世界首报核型中,有41种核型涉及D、G组染色体短臂,但不论易位到D、G染色体短臂的片段来源于1-22号哪一号染色体,或源于同一号染色体的片段长短各异,所含基因从1个到上千个,而携带者本人的表型都是正常的,说明易位到D、G染色体短臂的基因能正常表达,据此,我们将D、G组染色体短臂作为基因治疗的靶位点应该是安全的。
1、核型:46,XX,t(1;12;22;15;11;8)(1qter→1p11∷8p23→8pter;12pter→12q11∷1p11→1pter;22qter→22p11∷12q11→12qter;15pter→15q15∷22p11→22pter;11pter→11q21∷15q15→15qter;8qter→8p23∷11q21→11qter).
表型:女,28岁,为表型正常的携带者
资料提供者:吴素彬,广东省广州市,中山医科大学附一院妇产科细胞遗传室,邮政编码:510080
2、核型:46,XY,t(1;13)(1pter→1q32∷13p11→13pter;13qter→13p11∷1q32→1qter).
表型:女,24岁,为表型正常的携带者
资料提供者:肖晟,哈尔滨医科大学生物教研室,邮政编码:150086
3、核型:46,XX,t(2;15)(2pter→cen→15qter;2qter→cen→15pter).
表型:女,26岁,为表型正常的携带者
资料提供者:郭裕萍等,江西省南昌市,江西省妇产科医院细胞遗传室,邮政编码:330006
4、核型:46,XY,t(2;21)(2pter→cen→21pter;2qter→cen→21qter).
表型:男,32岁,为表型正常的携带者
资料提供者:康过秦等,山西省太原市,山西医学院附二院遗传研究室,邮政编码:030001
5、核型:46,XY,t(3;22)(3qter→cen→22pter;3pter→cen→22pter).
表型:男,26岁,为表型正常的携带者
资料提供者:高永,山东省滨州市医学院毒理室,邮政编码:256603
6、核型:46,XY,t(3;22)(3pter→cen→22qter;3qter→cen→22pter).
表型:男,29岁,为表型正常的携带者
资料提供者:石化金等,辽宁锦州市妇婴医院遗传室,邮政编码:121000
7、核型:46,XX,t(4;15)(4qter→4p13∷15p13→15pter;15qter→15p13∷4p13→4pter).
表型:女,28岁,为表型正常的携带者
资料提供者:周玲等,湖北省武汉市,武汉市儿童医院遗传实验室,邮政编码:430016
8、核型:46,XY,t(4;21)(4qter→4p15∷21p11→21pter;21qter→21p11∷4p15→4pter).
表型:男,25岁,为表型正常的携带者
资料提供者:徐竞芳等,上海市第六人民医院遗传室,邮政编码:200000
9、核型:46,XY,t(4;14)(4pter→4q31∷14p11→14pter;14qter→14p11∷4q31→4qter).
表型:男,为表型正常的携带者
资料提供者:周明君等,河志省许昌市中心医院,邮政编码:161000
10、核型:46,XY,t(4;14)(4pter→4q35∷14p11→14pter;14qter→14p11∷4q35→4qter).
表型:男,27岁,为表型正常的携带者
资料提供者:张秀泉等,广东省佛山市,佛山市妇幼保健院,邮政编码:528000
11、核型:46,XX,t(5;22)(5pter→5q13∷22p11→22pter;22qter→22p11∷5q13→5qter).
表型:女,32岁,为表型正常的携带者
资料提供者:曹建萍,河南安阳市妇幼保健院遗传室,邮政编码:455000
12、核型:46,XY,t(6;22)(6pter→cen6→22qter;6qter→ceh22→22pter)
表型:男,25岁,为表型正常的携带者
资料提供者:祝新霞等,山东省泰安市,山东泰安第88医院妇产科细胞遗传室,邮政编码:271000
13、核型:46,XY,t(6;22)(6qter→6p21∷22p11.2→22pter;22qter→22p11.2∷6p21→6pter).
表型:男,33岁,为表型正常的携带者
资料提供者:杨兰青,山东省滨州市滨州医学院附属医院妇产科,邮政编码:256603
14、核型:45,XX,t(7;21)(7qter→7p22∷21p12→21qter).
表型:女,23岁,为表型正常的携带者
资料提供者:孙吉庆等,湖北省武汉市,湖北省武汉市儿童医院医学遗传实验室,邮政编码:430016
15、核型:46,XY/46,XY,t(7;14)(7pter→7q11∷14p11→14pter;14qter→14p11∷7q11→7qter)
表型:男,28岁,为表型正常的携带者
资料提供者:李麓芸、夏家辉等,湖南省长沙市,湖南医科大学医学遗传学研究室,邮政编码:410078
16、核型:46,XY,t(8;14)(8qter→8p21∷14p12→14pter;14qter→14p12∷8p21→8pter)
表型:男,27岁,为表型正常的携带者
资料提供者:石化金等,辽宁锦州市妇婴医院遗传室,邮政编码:121000
17、核型:46,XY,t(9;14)(9pter→cen→14pter;9qter→cen→14qter)
表型:男,28岁,为表型正常的携带者
资料提供者:程秋云等,衡阳医学院附一生殖医学研究室,邮政编码:421001
18、核型:46,XX,t(9;22)(9pter→9p13∷22p12→22pter;22qter→22p12∷9p13→9pter)mat
表型:女,31岁,其母、1妹、1弟、1子具有相同核型,同为表型正常的携带者
资料提供者:李麓芸,夏家辉等,湖南医科大学医学遗传学研究室,邮政编码:410078
19、核型:46,XX,t(9;14)(9pter→9q12∷14p12→14pter;14qter→14p12∷9q12→9qter)
表型:女,32岁,为表型正常的携带者
资料提供者:孙艳阳等,黑龙江省哈尔滨市,哈尔滨医科大学生物教研室,邮政编码:150086
20、核型:46,XX,t(9;15)(9pter→9q21∷15p12→15pter;15qter→15p12∷9q21→9qter)mat.
表型:女,36岁,为表型正常的携带者
资料提供者:朱桂珍等,山东省泰安市,山东泰安第88医院妇产科细胞遗传室,邮政编码:271000
21、核型:46,XX,t(10;13)(10pter→10q24∷13p11→13pter;13qter→13p11∷10q24→10qter).
表型:女,28岁,为表型正常的携带者
资料提供者:严敦清,青岛医学院附属医院妇产科研究室,邮政编码:266003
22、核型:46,XX,t(10;13)(10pter→10q24∷13p12→13pter;13qter→13p12∷10q24→10qter).
表型:女,29岁,为表型正常的携带者
资料提供者:张影如等,广东省广州市,中山医科大学附一院神经科,邮政编码:510080
23、核型:46,XX,t(11;14)(11pter→cen→14pter;11qter→cen→14qter)
表型:女,2岁,为表型正常的携带者
资料提供者:王志勇,河南省柘城县,柘城县人民医院遗传室,邮政编码:476200
24、核型:46,XX,t(11;21)(11pter→11p11∷21p11→21pter;21qter→21p11∷11p11→11pter).
表型:女,26岁,为表型正常的携带者
资料提供者:郑军等,陕西省西安市,陕西省妇幼保健院医学遗传实验室,邮政编码:710003
25、核型:46,XY,t(11;15)(11pter→11q13∷15p12→15pter;15qter→15p12∷11q13→11qter)
表型:男,23岁,为表型正常的携带者
资料提供者:杨瑞芳等,山东医科大学附属医院围产医学中心,邮政编码:250012
26、核型:46,XX,t(12;14)(12pter→cen→14pter;12qter→cen→14qter)
表型:女,28岁,为表型正常的携带者
资料提供者:韩维田等,辽宁省计划生育科研所优生研究室,邮政编码:110031
27、核型:46,XX,t(13;16)(13qter→13p11∷16p11.2→16pter;16qter→16p11.2∷13p11→13pter).
表型:女,27岁,为表型正常的携带者
资料提供者:安松兰,辽宁省大连市,大连市妇产医院遗传室,邮政编码:110078
28、核型:46,XY/45,XY,t(13;13)(13qter→13p12∷13p12→13qter).
表型:男,39岁,为表型正常的携带者
资料提供者:李麓芸、夏家辉等,湖南省长沙市,湖南医科大学医学遗传学研究室,邮政编码:410078
29、核型:46,XY,t(14;18)(14pter→cen→18pter;14qter→cen→18qter)
表型:男,30岁,为表型正常的携带者
资料提供者:王素桂等,北京市计划生育技术指导所,邮政编码:100006
30、核型:46,XX,t(14;15)(14pter→14q13∷15p13→15pter;15qter→15p13∷14q13→14qter)
表型:女,28岁,为表型正常的携带者
资料提供者:李麓芸,夏家辉等,湖南省长沙市,湖南医科大学医学遗传学研究室,邮政编码:410078
31、核型:45,XX,t(15qter→cen→22qter).
表型:女,27岁,为表型正常的携带者
资料提供者:夏家辉等,湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室,邮政编码:410078
32、核型:46,XY,t(15;18)(15pter→cen→18pter;15qter→cen→18qter).
表型:男,30岁,为表型正常的携带者
资料提供者:任国庆等,北京市计划生育技术指导所,邮政编码:100006
33、核型:46,XX,t(15;20)(15pter→cen→2pter;15qter→cen→2qter)
表型:女,26岁,为表型正常的携带者
资料提供者:王新等,湖南医科大学附二医院妇产科遗传室,邮政编码:410011
34、核型:46,XX,t(15;22)(15pter→15q11∷22p13→22pter;22qter→22p13∷15q11→15qter)。
表型:女,27岁,为表型正常的携带者
资料提供者:符生苗,海南省海口市,海南省人民医院遗传室,邮政编码:570011
35、核型:46,XX,t(15;22)(15pter→15q22∷22p11→22pter;22qter→22p11∷15q22→qter)
表型:女,29岁,为表型正常的携带者
资料提供者:李牧尧等,新疆乌鲁木齐,新疆医学院医学遗传室,邮政编码:830054
36、核型:46,XY,t(16;21)(16pter→16q2 1∷21p11→21pter;21qter→21p11∷16q12→16qter).
表型:男,29岁,为表型正常的携带者
资料提供者:张惠芳等,广东省计划生育科学技术研究所,邮政编码:510080
37、核型:46,XX,t(18;21)(18qter→cen→21qter;18pter→cen→21pter)
表型:女,为表型正常的携带者
资料提供者:石化金等,辽宁锦州市妇婴医院遗传室,邮政编码:121000
38、核型:46,XX,t(18;21)(18pter→18q11∷21p12→21pter;21qter→21p12∷18q11→18qter)
表型:女,26岁,为表型正常的携带者
资料提供者:李修林等,辽宁省沈阳市,中国医科大学附一院小儿科遗传室,邮政编码:110001
39、核型:45,X,dic(Y;13)(Ypter→Yq1200∷13p11→cen→13qter)
表型:男,4岁,为表型正常的携带者
资料提供者:夏家辉等,湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室,邮政编码:410078
40、核型:46,XY,t(Y;15)(15qter→15p12∷Yq12→Ypter)pat.
表型:男,新生儿,为表型正常的携带者
资料提供者:夏家辉等,湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室,邮政编码:410078
41、核型:45,X,psu dic(Y;22)(Ypter→Yq1209∷22p12→cen→22qter)
表型:男,为表型正常的携带者
资料提供者:刘希贤等,湖北武汉同济医科大学医学遗传学研究室,邮政编码:430030
上述实例说明在核仁组织区不但可接受外源基因,而且能让外源基因正常表达。这也证明了本发明提供的基因药物治疗血友病B的可行性。
序列表
<110>夏家辉
<120>治疗血友病B的基因药物
<160>1
<211>13928bp
<212>DNA
<213>基因载体-FIX重组体
<400>
1 GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC TCTAGACTCG AGGAATTCTA
51 CCGGGTAGGG GAGGCGCTTT TCCCAAGGCA GTCTGGAGCA TGCGCTTAAG
101 CAGCCCCGCT GGGCACTTGG CGCTACACAA GTGGCCTCTG GCCTCGCACA
151 CATTCCACAT CCACCGGTAG GCGCCAACCG GCTCCGTTCT TTGGTGGCCC
201 CTTCGCGCCA CCTTCTACTC CTCCCCTAGT CAGGAAGTTC CCCCCCGCCC
251 CGCAGCTCGC GTCGTGCAGG ACGTGACAAA TGGAAGTAGC ACGTCTCACT
301 AGTCTCGTGC AGATGGACAG CACCGCTGAG CAATGGAAGC GGGTAGGCCT
351 TTGGGGCAGC GGCCAATAGC AGCTTTGCTC CTTCGCTTTC TGGGCTCAGA
401 GGCTGGGAAG GGGTGGGTCC GGGGGCGGGC TCAGGGGCGG GCTCAGGGGC
451 GGGGCGGGCG CCCGAAGGTC CTCCGGAGGC CCGGCATTCT GACGCTTCAA
501 AAGCGCACGT CTGCCGCGCT GTTCTCCTCT TCCTCATCTC CGGCCTTTCG
551 ACCTGCAGCG ACCCGCTTAA CAGCGTCAAC AGCGTGCCGC AGATCTTGGT
601 GGCGTGAAAC TCCCGCACCT CTTCGGCAAG CGCCTTGTAG AAGCGCGTAT
651 GGCTTCGTAC CCCTGCCATC AACACGCGTC TGCGTTCGAC CAGGCTGCGC
701 GTTCTCGCGG CCATAGCAAC CGACGTACGG CGTTGCGCCC TCGCCGGCAG
751 CAAGAAGCCA CGGAAGTCCG CCTGGAGCAG AAAATGCCCA CGCTACTGCG
801 GGTTTATATA GACGGTCCTC ACGGGATGGG GAAAACCACC ACCACGCAAC
851 TGCTGGTGGC CCTGGGTTCG CGCGACGATA TCGTCTACGT ACCCGAGCCC
901 GATGACTTAC TGGCAGGTGC TGGGGGCTTC CGAGACAATC GCGAACATCT
951 ACACCACACA ACACCGCCTC GACCAGGGTG AGATATCGGC CGGGGACGCG
1001 GCGGTGGTAA TGACAAGCGC CCAGATAACA ATGGGCATGC CTTATGCCGT
1051 GACCGACGCC GTTCTGGCTC CTCATATCGG GGGGGAGGCT GGGAGCTCAC
1101 ATGCCCCGCC CCCGGCCCTC ACCCTCATCT TCGACCGCCA TCCCATCGCC
1151 GCCCTCCTGT GCTACCCGGC CGCGCGATAC CTTATGGGCA GCATGACCCC
1201 CCAGGCCGTG CTGGCGTTCG TGGCCCTCAT CCCGCCGACC TTGCCCGGCA
1251 CAAACATCGT GTTGGGGGCC CTTCCGGAGG ACAGACACAT CGACCGCCTG
1301 GCCAAACGCC AGCGCCCCGG CGAGCGGCTT GACCTGGCTA TGCTGGCCGC
1351 GATTCGCCGC GTTTACGGGC TGCTTGCCAA TACGGTGCGG TATCTGCAGG
1401 GCGGCGGGTC GTGGCGGGAG GATTGGGGAC AGCTTTCGGG GACGGCCGTG
1451 CCCGCCCCAG GGTGCCGAGC CCCAGAGCAA CGCGGGCCCA CGACCCCATA
1501 TCGGGGACAC GTTATTTACC CTGTTTCGGG CCCCCGAGTT GCTGGCCCCC
1551 AACGGCGACC TGTACAACGT GTTTGCCTGG GCCTTGGACG TCTTGGCCAA
1601 ACGCCTCCGT CCCATGCACG TCTTTATCCT GGATTACGAC CAATCGCCCG
1651 CCGGCTGCCG GGACGCCCTG CTGCAACTTA CCTCCGGGAT GGTCCAGACC
1701 CACGTCACCA CCCCCGGCTC CATACCGACG ATCTGCGACC TGGCGCGCAC
1751 GTTTGCCCGG GAGATGGGGG AGGCTAACTG AAACACGGAA GGAGACAATA
1801 CCGGAAGGAA CCCGCGCTAT GACGGCAATA AAAAGACAGA ATAAAACGCA
1851 CGGGTGTTGG GTCGTTTGTT CATAAACGCG GGGTTCGGTC CCAGGGCTGG
1901 CACTCTGTCG ATACCCCACC GAGACCCCAT TGGGGCCAAT ACGCCCGCGT
1951 TTCTTCCTTT TCCCCACCCC ACCCCCCAAG TTCGGGTGAA GGCCCAGGGC
2001 TCGCAGCCAA CGTCGGGGCG GCAAGCCCTG CCATAGCCAC GGGCCCCGTG
2051 GGTTAGGGAC GGGGTCCCCC ATGGGGAATG GTTTATGGTT CGTGGGGGTT
2101 ATTATTTTGG GCGTTGCGTG GGGTCAGGTC CACGACTGGA CTGAGCAGAC
2151 AGACCCATGG TTTTTGGATG GCCTGGGCAT GGACCGCATG TACTGGCGCG
2201 ACACGAACAC CGGGCGTCTG TGGCTGCCAA ACACCCCCGA CCCCCAAAAA
2251 CCACCGCGCG GATTTCTGGC GCCGCCGGAC GAACTAAACC TGACTACGGC
2301 ATCTCTGCCC CTTCTTCGCT GGTACGAGGA GCGCTTTTGT TTTGTATTGG
2351 TCACCACGGC CGAGTTTCCG CGGGACCCCG GCCAGGACCT GCAGAAATTG
2401 ATGATCTATT AAACAATAAA GATGTCCACT AAAATGGAAG TTTTTCCTGT
2451 CATACTTTGT TAAGAAGGGT GAGAACAGAG TACCTACATT TTGAATGGAA
2501 GGATTGGAGC TACGGGGGTG GGGGTGGGGT GGGATTAGAT AAATGCCTGC
2551 TCTTTACTGA AGGCTCTTTA CTATTGCTTT ATGATAATGT TTCATAGTTG
2601 GATATCATAA TTTAAACAAG CAAAACCAAA TTAAGGGCCA GCTCATTCCT
2651 CCCACTCATG ATCTATAGAT CTATAGATCT CTCGTGGGAT CATTGTTTTT
2701 CTCTTGATTC CCACTTTGTG GTTCTAAGTA CTGTGGTTTC CAAATGTGTC
2751 AGTTTCATAG CCTGAAGAAC GAGATCAGCA GCCTCTGTTC CACATACACT
2801 TCATTCTCAG TATTGTTTTG CCAAGTTCTA ATTCCATCAG AAGCTCCTTA
2851 ATTTTATACC ACTGACTTAT TTTGAAGGCT GCTATAAGAA ACAGCCCTAT
2901 GAAACTGGTA TTTTCCTACT GCAAGGTGGC TACTTTAAGA CAATTTTTCA
2951 TTGCATTCTA TCAAGGGATG TCTTATTATT ATATCATTAT ATCAAGTGAT
3001 GTTATAAATA GTAAGAATCA GATTAAGGGC TCATATGTCC TTCTTTGTAT
3051 TGACTGTTGA AAAGGTATGG GGCCAAATTT GTAGTTTGTC TGGAATTACA
3101 TATTTTTGGG GGTCTCTATT ATCTTCATAC TTATCCTATC TAAATTTTCC
3151 ATTGCCAAAT TTCCTTACTT ATTTTTAGTT TTATCCTATT GCTCATGTAT
3201 TTTTATGTCT CCATAAGTCT ATTTTGGAAA AAGGCAGAGT ACTCATAATT
3251 TTAGTATATC TTTTAGCTTT ATGTTGCCAT AAACCTTTCA TTATATACAT
3301 GATCAACAAC AGCAAATTAT CTCACTTCAG TATTTAGTTT ATTATTTTAC
3351 AAACTGATTT ATGATTGCTA ACATGTAACT GAAGGTATAC ACTATTAGAA
3401 CACAGTTTTC AGTAGAAAGT AGCACTGCCA TTGAGTAAAA AAATGTTCTA
3451 ACATTAGAGC AACATTCTTA TACAAGTTTG CATGTTGTTT ACTGAGGTCT
3501 AAAGCATGAC TACACAAAAG GCTGAATAAA ATTCAGATTC TTACATACAC
3551 ATAAAATTGT TTTATTGAGA TGACAAAGTA TATTTATTAT GCCACCCAGA
3601 ATATAATCCA CTCTGATAAC TGCCAGTGTA TGCACTTGCT GAAGTAACTC
3651 AGTACATAAA TGGTAGCCAC AACAGTTGCT GTGCATGAAA GTTCTTCTCT
3701 TCCAGATTGA AGAGTGTACA ATCTAAAGCA TTTTAAAACT TTAAATCCGT
3751 TATTAGCTTA AATATAATTT AAAATTTTAG TTTGCCGTAC CTATAATTTG
3801 TCTGTACACT AGGTTACTAA GGGTGATATG ATTACATATG TGGATACAAA
3851 ATAATTTTAA TGGAAAATGA AATTAGGGTA CTCAACAAAG ATAAAGGGTA
3901 ATGATCATGT ACACTAACCG TATTTGAGAT TAGTTTAAGC CTGGGGTAGC
3951 TATACTTATG TTTCACAGAC CTTGAGAAGA TAGGGAAAAA AAGCTTTTAT
4001 CAACATTGCT AAGGAACAGG TAAAAGCTAA CATTAGGTAA CTAAGAGGTG
4051 ACATAAAAAA GACTGAATAA AATATCATGG AGGTTTCATA ATAAGATTGG
4101 AAATTCCATA GACTAGGAGA GAAAAGATCC CAAAATATAC ATGCTCATTG
4151 GGAAAACAGC TAGTAAGAAC AAGGAGAGAT CTCTATTTAA TGATACAATA
4201 GTAGAGTTAT AATTTCCTGT ATATTGTAAA TTTCAAGCAT TTAAACATTT
4251 TCATTGAATT ATAAAATATT ATTTGTAAAA GAAAGAAAAA CAGCACAACT
4301 GCAGATTACA GATGACTAAG ATAGATGAAT CATGAAAAGG TGCTAGATTG
4351 TGAGCGGATA ACAATTTCAC ACAGGAAACA GCTATGACCA TGATTACGCC
4401 AAGCTCTCGA CGGGATCGCG GCCGCGATCC AGACATGATA AGATACATTG
4451 ATGAGTTTGG ACAAACCACA ACTAGAATGC AGTGAAAAAA ATGCTTTATT
4501 TGTGAAATTT GTGATGCTAT TGCTTTATTT GTAACCATTA TAAGCTGCAA
4551 TAAACAAGTT GGGGTGGGCG AAGAACTCCA GCATGAGATC CCCGCGCTGG
4601 AGGATCATCC AGCCGGCGTC CCGGAAAACG ATTCCGAAGC CCAACCTTTC
4651 ATAGAAGGCG GCGGTGGAAT CGAAATCTCG TGATGGCAGG TTGGGCGTCG
4701 CTTGGTCGGT CATTTCGAAC CCCAGAGTCC CGCTCAGAAG AACTCGTCAA
4751 GAAGGCGATA GAAGGCGATG CGCTGCGAAT CGGGAGCGGC GATACCGTAA
4801 AGCACGAGGA AGCGGTCAGC CCATTCGCCG CCAAGCTCTT CAGCAATATC
4851 ACGGGTAGCC AACACTATGT CCTGATAGCG GTCCGCCACA CCCAGCCGGC
4901 CACAGTCGAT GAATCCAGAA AAGCGGCCAT TTTCCACCAT GATATTCGGC
4951 AAGCAGGCAT CGCCATGGGT CACGACGAGA TCCTCGCCGT CGGGCATGCT
5001 CGCCTTGAGC CTGGCGAACA GTTCGGCTGG CGCGAGCCCC TGATGCTCTT
5051 CGTCCAGATC ATCCTGATCG ACAAGACCGG CTTCCATCCG AGTACGTGCT
5101 CGCTCGATGC GATGTTTCGC TTGGTGGTCG AATGGGCAGG TAGCCGGATC
5151 AAGCGTATGC AGCCGCCGCA TTGCATCAGC CATGATGGAT ACTTTCTCGG
5201 CAGGAGCAAG GTGAGATGAC AGGAGATCCT GCCCCGGCAC TTCGCCCAAT
5251 AGCAGCCAGT CCCTTCCCGC TTCAGTGACA ACGTCGAGCA CAGCTGCGCA
5301 AGGAACGCCC GTCGTGGCCA GCCACGATAG CCGCGCTGCC TCGTCTTGCA
5351 GTTCATTCAG GGCACCGGAC AGGTCGGTCT TGACAAAAAG AACCGGGCGC
5401 CCCTGCGCTG ACAGCCGGAA CACGGCGGCA TCAGAGCAGC CGATTGTCTG
5451 TTGTGCCCAG TCATAGCCGA ATAGCCTCTC CACCCAAGCG GCCGGAGAAC
5501 CTGCGTGCAA TCCATCTTGT TCAACCATGG TGGATCGATC CAAGCTCCCA
5551 ACACAACTAT GTCAGAAGCA AATGTGAGGA GCAACTGATC CTACCTCACC
5601 TTATATGCTC TGCCCTGGCT CCTGCCCTCT CTATCCTGTG TGAGCAGATT
5651 GGCCCTTACC AAGGTGTGGC TCTACGGAAT CAGGCTTCGG TGATGACAAG
5701 CATATTTCTC CCTAGAATGC TGTGCCACTC ACTGGCTTAG GAGTCTCAGC
5751 TCTGGGTACT CCCTCTGAAT AATGTTTGTC CTTATCTGTG CAGAGAACAC
5801 TGTCTCTAAA GCATCCTTTT TGGCAACGCA TTTGCTCAAT CAACTACTGA
5851 ATTGGTGTTA AAATTAATTT TCCTTTTTTT CTCATTATGC AAATAAGAAA
5901 TTGAGAAGCA AAGCTAGGTA CCCCCTAGAG CCCCAGCTGG TTCTTTCCGC
5951 CTCAGAAGCC ATAGAGCCCA CCGCATCCCC AGCATGCCTG CTATTGTCTT
6001 CCCAATCCTC CCCCTTGCTG TCCTGCCCCA CCCCACCCCC CAGAATAGAA
6051 TGACACCTAC TCAGACAATG CGATGCAATT TCCTCATTTT ATTAGGAAAG
6101 GACAGTGGGA GTGGCACCTT CCAGGGTCAA GGAAGGCACG GGGGAGGGGC
6151 AAACAACAGA TGGCTGGCAA CTAGAAGGCA CAGTCGAGGC TGATCAGCGG
6201 TTTAAACTTA AGCTTCAGCT CAGGTAAAAT ATGAAATTCT CCCCTGTAAA
6251 GAGAAAAAGC AATGATCATA GAATGTATAT ATTCAAATCT AACAAAAGAT
6301 GGGAAAGTGA TTAGTTAGTG AGAGGCCCTG TTAATTTTCA ATTCCAATGA
6351 ATTAACCTTG GAAATCCATC TTTCATTAAG TGAGCTTTGT TTTTTCCTTA
6401 ATCCAGTTGA CATACCGGGA TACCTTGGTA TATATTCCAT ATTTGCCTTT
6451 CATTGCACAC TCTTCACCCC AGCTAATAAT TCCAGTTAAG AAACTGGTCC
6501 CTTCCACTTC AGTAACATGG GGTCCCCCAC TATCTCCTTG ACATGAATCT
6551 CTACCTCCTT CATGGAAGCC AGCACAGAAC ATGTTGTTAT AGATGGTGAA
6601 CTTTGTAGAT CGAAGACATG TGGCTCGGTC AACAAGTGGA ACTCTAAGGT
6651 ACTGAAGAAC TAAAGCTGAT CTCCCTTTGT GGAAGACTCT TCCCCAGCCA
6701 CTTACATAGC CAGATCCAAA TTTGAGGAAG ATGTTCGTGT ATTCCTTGTC
6751 AGCAATGCAA ATAGGTGTAA CGTAGCTGTT TAGCACTAAG GGTTCGTCCA
6801 GTTCCAGAAG GGCAATGTCA TGGTTGTACT TATTAATAGC TGCATTGTAG
6851 TTGTGGTGAG GAATAATTCG AATCACATTT CGCTTTTGCT CTGTATGTTC
6901 TGTCTCCTCA ATATTATGTT CACCTGCGAC AACTGTAATT TTAACACCAG
6951 TTTCAACACA GTGGGCAGCA GTTACAATCC ATTTTTCATT AACGATAGAG
7001 CCTCCACAGA ATGCATCAAC TTTACCATTC AAAACAACCT GCCAAGGGAA
7051 TTGACCTGGT TTGGCATCTT CTCCACCAAC AACCCGAGTG AAGTCATTAA
7101 ATGATTGGGT GCTTTGAGTG ATGTTATCCA AAATGGTTTC AGCTTCAGTA
7151 GAATTTACAT AGTCCACATC AGGAAAAACA GCCTCAGCAC GGGTGAGCTT
7201 AGAAGTTTGT GAAACAGAAA CTCTTCCACA TGGAAATGGC ACTGCTGGTT
7251 CACAGGACTT CTGGTTTTCT GCAAGTCGAT ATCCCTCAGT ACAGGAGCAA
7301 ACCACCTTGT TATCAGCACT ATTTTTACAA AACTGCTCGC ATCTGCCATT
7351 CTTAATGTTA CATGTTACAT CTAATTCACA GTTCTTTCCT TCAAATCCAA
7401 AGGGACACCA ACATTCATAG GAATTAATGT CATCCTTGCA ACTGCCGCCA
7451 TTTAAACATG GATTGGACTC ACACTGATCT CCATCAACAT ACTGCTTCCA
7501 AAATTCAGTT GTTCTTTCAG TGTTTTCAAA AACTTCTCGT GCTTCTTCAA
7551 AACTACACTT TTCTTCCATA CATTCTCTCT CAAGGTTCCC TTGAACAAAC
7601 TCTTCCAATT TACCTGAATT ATACCTCTTT GGCCGATTCA GAATTTTGTT
7651 GGCGTTTTCA TGATCAAGAA AAACTGTACA TTCAGCACTG AGTAGATATC
7701 CTAAAAGGCA GATGGTGATG AGGCCTGGTG ATTCTGCCAT GATCATGTTC
7751 ACGCGCTGCA TAACCTTTGC TAGCAGATTG TGAAAGTGGT AAGGTCGGAT
7801 CCACTAGTCC AGTGTGGTGG AATTCTGCAG ATATCCAGCA CAGTGGCGGC
7851 CGCTCGAGTC TAGAGGGCCC GTTTAAACGC TAGCCAGCTT GGGTCTCCCT
7901 ATAGTGAGTC GTATTAATTT CGATAAGCCA GTAAGCAGTG GGTTCTCTAG
7951 TTAGCCAGAG AGCTCTGCTT ATATAGACCT CCCACCGTAC ACGCCTACCG
8001 CCCATTTGCG TCAATGGGGC GGAGTTGTTA CGACATTTTG GAAAGTCCCG
8051 TTGATTTTGG TGCCAAAACA AACTCCCATT GACGTCAATG GGGTGGAGAC
8101 TTGGAAATCC CCGTGAGTCA AACCGCTATC CACGCCCATT GATGTACTGC
8151 CAAAACCGCA TCACCATGGT AATAGCGATG ACTAATACGT AGATGTACTG
8201 CCAAGTAGGA AAGTCCCATA AGGTCATGTA CTGGGCATAA TGCCAGGCGG
8251 GCCATTTACC GTCATTGACG TCAATAGGGG GCGTACTTGG CATATGATAC
8301 ACTTGATGTA CTGCCAAGTG GGCAGTTTAC CGTAAATACT CCACCCATTG
8351 ACGTCAATGG AAAGTCCCTA TTGGCGTTAC TATGGGAACA TACGTCATTA
8401 TTGACGTCAA TGGGCGGGGG TCGTTGGGCG GTCAGCCAGG CGGGCCATTT
8451 ACCGTAAGTT ATGTAACGCG GAACTCCATA TATGGGCTAT GAACTAATGA
8501 CCCCGTAATT GATTACTATT AATAACTAGT CAATAATCAA TGTCAACGCG
8551 TATATCTGGC CCGTACATCG CGAAGCAGCG CAAAACGCCT AACCCTAAGC
8601 AGATTCTTCA TGCAATTGTC GGTCAAGCCT TGCCTTGTTG TAGCTTAAAT
8651 TTTGCTCGCG CACTACTCAG CGACCTCCCC TAGCAGAGAT TTCTATCACA
8701 CCTATCAGGG ATACACAATT TCCAAGAATT TCAGAAGTGT TTGGTGTTCC
8751 TATTAACATA AATCCGGAAA TAACACCTGA GTGAACTGTC TTCTAATTCT
8801 TCAACTGGAT GGCTTTTTAG TGTAAAAGAT GTTGAATACT GATTGACTTT
8851 TTAATAATTT TATAGTATAT GTCAGAAATA TTGCACAGTC CCTATTTACA
8901 TCATTCTACA GTGGTTTTTA AAATGTTTTA AGAATAAAAA ACATGAAAAC
8951 TTTATTTGAT TTTTCTGAGG AAATAACTTT TTGGATTTAA TTTCAATGAA
9001 ACCGTTGATA ACATTTCCCT CCCCAACAAT CTCTGGCAAC GATCCCTCAG
9051 ATTTTAATGA TTATGTATTA TTACCTTTTA ATACAAGTAG AATAACACTC
9101 AGGGAATTTA CAACATTTGT TATTTTCAGT AAATACATTG GTTGAAGTTT
9151 AAAAGTCTAT CCGTAGTAAA CTTACATCTT TCAGGAGCTT GGTCAATGTG
9201 TTCTGGACAA AGCAGGAAGA TGTGACTGAA ATCCTGAAAG GAGCCGGCTC
9251 CTGCAGCACA AGGATAATGA TACATCTGGG TACATTTCTC TTCACAGCAT
9301 TTGATAGTGG CTCCAAAGTG CTTACAAAAT GCACATTGCT GAAAGGGGTA
9351 AAGGAGAGAA ATCTCTTTAT AAAACCTTGA AAAGGAATAT TTAAATATAA
9401 GCTGGGAAGG TATAAAAAAC TCTCTGTAAC ATCACAAGTA AACAAATTGA
9451 ACCTGCAAAA TATTAAACAA AGGATTCATT AAAAATAATA AAATCTACAT
9501 TACTCAATTT AGTGCTTTGT GTGCTACCAA CTCATCCTTC CATTCAAATT
9551 AGAAAGTTAG AATTTCATTC CTTATATTTT CAAAAATAAA TTGTGAAGCA
9601 TTTTAGAAAC AAAACCTAAA ATTTTTTTTT AAAAGCAAAT AGTAATATGG
9651 TTAAAGGGGC AGGTTTCTAT ATTGAGGATT ATTATAAAGT TTTTAAATCC
9701 TACCAAAACT AGTAATAGGA ACATATATTA TTTATGAGAC ATATTACTAT
9751 TTTTTACCCT GCCTAAAAAT AAATACAAAT AAATTCATCA ATTATAAGTT
9801 AACAGGGACA CAAATGGTTA AAGACTCACA CACAAAAAAA ACAAAACTAC
9851 ATACTTCAAT GTAGCAATCA ACTTCAAATT TCTTAACAAA AGATGGAAAT
9901 GTTGGGGAAA AAATTAGTCA TCTGGTATCT TTCCCATTTC AACCTGCCTC
9951 CATTATCTTG CAAGTGGTAA AATGCACAGA AATAAGCCTC AAACAAGAGG
10001 GGCAGTCTAG GGCAAGTGAA CACATAAGTC GGAAGAAATT ATGTAAAATG
10051 TTGCATTTAC TTATTCAGTT TTCCCTTAGA ATGATTCACA AACTCTTCCT
10101 CATTCTCCCA AGTCCATTTT GAGTATCATT TTCTTTGAAG AGAGTCTGAT
10151 GGGCCCTGTA CTATACAGTA TGAAATCTCT CTGTGGGAAA TGACTATCTA
10201 ACATAAATTT TTGTTTACAC CGTTACATGG TACCTACTTG CTTATGCCAT
10251 TACATGATCA GTTTACCTTT TTCTCAACCT AATCCAAGAT CCTTCAATTG
10301 AGGCACTATA CTATCTTTGT ATCCAAAGCA CCAAAAATGC TGCTTCAAAC
10351 AGGCCCTAAT AGATAGGTGT TCCTATACAT ATACCAAAAA GACTTAACTT
10401 TTGGTGATCT TGTTTGTGAG TGTGGCTCAT AAACAGCTTA GTTGAGATAA
10451 CTGGAGCCTC ATGTAGCAGA GACAGTTGGA CCCTGCTAAC ATTACTGTGG
10501 ATATCTTCAC ATGTTACTAC ATTGACTTTA TATTCTGCTA ATTAACCAGG
10551 GACTACAGTA GTTAAAATTA TAATTGTTTT CAATGTTTTA TGTGTAAATC
10601 TGTATCTCAC ATACTATCAA ACTCTTCCTC ACTGTCATCA GTCTACTGCA
10651 TTGAATCCAA CATAACAAAG CTAAATGACT CCTGAGGGCT GAATCAGAAA
10701 GAAGAAAAGA AAGAGATACA AAACTTTAGT CGGCCCGGTG GCTCACACCT
10751 GTAATCCCAG CACTTTGGAA GGCCAAGGCG GGCGGATCAC GAGGTCAGGA
10801 GATCGAGACC ATCCTGGCTG ATACAGTGAA ACTCCATCTC TACTGAAAAT
10851 ACAAAAAATT AGCTGGACGT GGTGGTGGGC ACCTGTAGTC CCAGCTACTC
10901 AGGAGGCTGA AGCAGGAGAA GCTTCTAAAT AACTCATAAA CACTAATTAC
10951 TGTTGTGACA CTTTAATTTT ATACAATATT TATAAGTATA CAGAATAACA
11001 TTTCAGTGCT ATTTTGGCAC TCAAGGGTAT TAATGCATAG CTTGAGTATT
11051 CTATAGTGTC ACCTAAATAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC
11101 TGTGTGAAAT TGTTATCCGC TCACAATTCC ACACAACATA CGAGCCGGAA
11151 GCATAAAGTG TAAAGCCTGG GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA
11201 ATTGCGTTGC GCTCACTGCC CGCTTTCCAG TCGGGAAACC TGTCGTGCCA
11251 GCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT TTGCGTATTG
11301 GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG
11351 CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC
11401 AGAATCAGGG GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA
11451 AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CGATAGGCTC
11501 CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG
11551 AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC
11601 TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC
11651 TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA
11701 TCTCAGTTCG GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC
11751 CCCCCGTTCA GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG
11801 TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA
11851 CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT
11901 GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGGA CAGTATTTGG TATCTGCGCT
11951 CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG
12001 CAAACAAACC ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA
12051 TTACGCGCAG AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG
12101 GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT
12151 GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT TAAAAATGAA
12201 GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC
12251 CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC
12301 ATCCATAGTT GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG
12351 GCTTACCATC TGGCCCCAGT GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA
12401 CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG
12451 CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT ATTAATTGTT
12501 GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT
12551 GTTGGCATTG CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC
12601 TTCATTCAGC TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA
12651 TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA
12701 AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG GTTATGGCAG CACTGCATAA
12751 TTCTCTTACT GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG ACTGGTGAGT
12801 ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATACCGCG CCCGGCGACC GAGTTGCTCT
12851 TGCCCGGCGT CAATACGGGA TAATAGTGTA TGACATAGCA GAACTTTAAA
12901 AGTGCTCATC ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT
12951 TACCGCTGTT GAGATCCAGT TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA
13001 TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT TCTGGGTGAG CAAAAACAGG
13051 AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG AAATGTTGAA
13101 TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT
13151 TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT
13201 AGGGGTTCCG CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGTA TGCGGTGTGA
13251 AATACCGCAC AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGACGCGCCC
13301 TGTAGCGGCG CATTAAGCGC GGCGGGTGTG GTGGTTACGC GCAGCGTGAC
13351 CGCTACACTT GCCAGCGCCC TAGCGCCCGC TCCTTTCGCT TTCTTCCCTT
13401 CCTTTCTCGC CACGTTCGCC GGCTTTCCCC GTCAAGCTCT AAATCGGGGG
13451 CTCCCTTTAG GGTTCCGATT TAGAGCTTTA CGGCACCTCG ACCGCAAAAA
13501 ACTTGATTTG GGTGATGGTT CACGTAGTGG GCCATCGCCC TGATAGACGG
13551 TTTTTCGCCC TTTGACGTTG GAGTCCACGT TCTTTAATAG TGGACTCTTG
13601 TTCCAAACTG GAACAACACT CAACCCTATC TCGGTCTATT CTTTTGATTT
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13751 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC
13801 TCTTCGCTAT TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT
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