JP2004512313A - 血友病ｂを治療する遺伝子薬及びその調剤する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は血友病Ｂを治療する遺伝子薬及びその調剤する方法まで及んでいる。その薬は人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕上に肝心な生理機能のないＤＮＡ配列、或いは該ＤＮＡ配列と相同性のあるＤＮＡ配列を治療遺伝子の引導配列として構造した遺伝子ベクター−ＦＩＸ組替え体を含んでいる。また、本発明は該遺伝子薬を調剤する方法を提供した。その血友病Ｂを治療する遺伝子薬は、遺伝子を治療すると、表現が安定で、安全性がよく、表現の効率が高く、更に免疫原性がないのである。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は血友病Ｂを治療する遺伝子薬及びその調剤する方法まで及んでいる。
【０００２】
【従来の技術】
血友病ＢはＢ型血友病とも呼び、一種凝血ＩＸ因子（ＦＩＸ）の欠陥によるＸ連鎖劣性遺伝の出血性疾病であり、男性の中に発病率が１／３００００である。人類ＦＩＸ蛋白の分子量は５６ＫＤで、４１５個のアミノ酸残基を含める一本鎖糖タンパク質である。Ｎ−端のチロシンから、四つ異なっている構造区が分けられる：Ｇｌａ区（γ―カルボキシル基グルタミン酸区）、成長因子区、活性化ペプチド区と触媒区（或いはセリン蛋白区）。人類ＦＩＸは主に肝臓で合成され、そのはじめての訳物がＮ−端の４６個のアミノ酸の前導配列を含む。前導ペプチドを除去し、糖基化及びビタミンＫをあてにするγ−カルボキシ等の修飾作用をした後、血液での成熟なＦＩＸになる。ＦＩＸは血液の中でプロエンチ―マの形で存在する。ＦＸＩａ或いはＦＶＩＩ−組織因子の複合物に活性化された後、プロテイン活性がある活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）になる。正常な人のプラスマの中のＦＩＸの含量は５μｇ／ｍｌで、その活性の半衰期が２４時間である。（Ｃｈｕａｈ ＭＫＬ，ＤｅｓｉｒｅＣｏｌｌｅｎ ＆ Ｔ．ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００１；３：３−２０に参照）。
【０００３】
ＦＩＸは内源性凝血級聯反応の過程になくてはならない蛋白因子である。ＦＩＸがコントロール蛋白ＦＶＩＩＩと複合物を形成した後、内源性凝血級聯反応のスピードを１０００倍以上増加させるため、凝血過程はわずかの何分間で完成できることになった。したがって、人体内にＦＩＸが不足であれば、自発性或いは小さな怪我をしたら、血をとめることができなくなり、ひどい場合は関節の出血による関節の形が変ること及び身体障害、或いは、内臓か頭内の出血による死亡を及ぼすことになる。コードＦＩＸ蛋白の遺伝子は１９８２年にクローンされ、Ｘｑ２７．１帯にあり、合わせて８個のエキソンがある。コード区のサイズは１．３８３ｋｂで、コード４１５個のアミノ酸がある。（Ｃｈｏｏ ＫＨ， Ｇｏｕｌｄ ＫＧ， Ｒｅｅｓ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９８２；２９９：１７８−１８０； Ｋｕｒａｃｈｉ Ｋ， Ｄａｖｉｅ ＥＷ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔ１ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８２；７９：６４６１−６４６４．） 成人のＦＩＸ蛋白分子量は５６ＫＤで、正常なプラスマの中での含量は５μｇ／ｍｌ（Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９９；１０：２０９１−２１０７．）である。血友病Ｂの臨床治療は蛋白の置換治療即ち輸血、或いはＦＩＸ濃縮製剤の補充に限る。ＦＩＸは人体内の半衰期が２４時間しかないため、患者はふりかえして血或いは血液製品の輸入によって命を維持することになる。重い経済負担になるだけでなく、エイズ、肝炎Ｂ及び狂牛病のウイルスを感染する恐れもある。
【０００４】
血友病Ｂの遺伝子治療にとって一番肝心な問題は、欠陥のＦＩＸ遺伝子のかわりに、どのように正常なＦＩＸ遺伝子を患者の体内に導入することである。目下、ＦＩＸ遺伝子治療についての研究に用いられているベクターは主にウイルスベクターである。例えば、レトロウイルスベクター、腺のウイルスベクター及び腺の相関ウイルスベクターがある。
【０００５】
１． Ｋａｙ等はＲＶベクターで一匹血友病Ｂのある犬に遺伝子治療の実験を行う（ Ｋａｙ ＭＡ， Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ Ｓ， Ｌａｎｄｅｎ ＣＮ ，ｅｔ ａｌ． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ： ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｏｇｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３；２６２：１１７−１１９に参照）。研究によってＲＶで大型の動物の肝臓細胞の中に遺伝子をリレーして輸送したら、相対的に長期の表現を達成するかもしれないが、表現量が少ないということが表明された。小鼠についての研究でもその肝臓細胞が０．１％−１％しか転化されなかったことを発見した（Ｋａｙ ＭＡ， Ｌｉ ＱＴ， Ｌｉｕ ＪＪ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９２；３：６４１−６４７に参照）。その主な原因はＲＶが非分裂細胞を組込むことができないのである。それゆえ、肝細胞を標的細胞として遺伝子治療を行う時、残りの肝組織の細胞分裂を誘導するために、部分の肝臓を切除するのは必要である。しかし、ＲＶの体内の転化効率が比較的低く、ｉｎｖｉｔｒｏ培養細胞の再移植率も高くないから、レベルの低いＦＩＸの表現が完全に血友病Ｂの表現型を直せないことになる。（Ｌｉｅｂｅｒ Ａ． Ｐｅｔｅｒｓ ＭＪ， Ｇｏｗｎ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｂｌｅｅｄｉｎｇ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９５； ６：１０２９−１０３７； Ｂｏｗｌｅｓ ＮＥ， Ｅｉｓｅｎｓｍｉｔｈ Ｒ， Ｍｏｈｕｉｄｄｉｎ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９６；７：１７３５−１７４２； Ｂｏｓｃｈ Ａ， ＭｃＣｒａｙ ＰＢ， Ｊｒ．Ｃｈａｎｇ ＳＭＷ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：２６８３−２６８７に参照）。 レトロウイルスは安全的に標的細胞の遺伝子組に組込めるが、分裂細胞を感染することしかできないため、挿入突然変異誘発などの安全な内密欠点が存在するものである。
【０００６】
２． 腺の相関ウイルス（ｒＡＡＶ）のベクターを組換えることは血友病Ｂの遺伝子治療の面においては比較的に有効である。ＦＩＸ ｃＤＮＡを受体の中に有効的且つ安定的に表現させ、またベクターの中にウイルス遺伝子を含んでいなく、一般的には細胞毒性Ｔリンパ細胞の反応を誘発しないため、研究者から黒い眼で見られるものである（Ｊｏｏｓｓ Ｋ， Ｙａｎｇ Ｙ， Ｆｉｓｈｅｒ ＫＪ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＤＮＡ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｉｒｅｃｔｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９８；７２： ４２１２−４２２３に参照）。小鼠及び血友病Ｂにかかる犬についてのＫａｙ達の臨床の研究（ Ｋａｙ ＭＡ ， Ｍａｎｎｏ ＣＳ， Ｒａｇｎｉ ＭＶ， ｅｔ ａｌ ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＩＣ ｉｎ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２０００；２４：２５７−２６１に参照）。しかし、ＡＡＶ滴度が低く、調剤も複雑であるため、大いに発展させることはできない。人類の遺伝子治療に用いることはまだより多くの研究が必要である。
【０００７】
近年来、非ウイルスベクター（例えばリポソーム、マイクロカプセルなど）も開発、利用されるようになった。（Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ Ｇ， Ｘｕ Ｎ， Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｉｎ ｍｉｃｅ ： ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ｕｓｉｎｇ ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９；１０（８）：１２８１−１２８８．に参照）。
【０００８】
【発明が解決する課題】
したがって、近十年来、血友病Ｂについての遺伝子治療はいろいろな方面において改善の措置を取ったが、いまでにまだ安全的、安定的な一次性の遺伝子を治療する薬物が見つからないのである。その肝心な問題は一種安全性のよい、免疫原性もない、標的細胞を転換する効率の高い、標的細胞の中で長期的、安定的に遺伝子治療を表現するベクターがまだ見つからないことにある。
【０００９】
本発明の目的は一種安全な、治療遺伝子を安定的に標的細胞中に表現させ、血友病Ｂを治療する遺伝子薬を提供することである。
本発明のもう一つの目的は上述の遺伝子薬を調剤する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の提供した血友病Ｂを治療する遺伝子薬は人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕上に肝心な生理機能のない遺伝子ＤＮＡ配列、或いは該ＤＮＡ配列と相同性のあるＤＮＡ配列を治療遺伝子の引導配列として、構造された遺伝子ベクター−ＦＩＸの組換え体を含んでいる。
【００１１】
本申請人は特別な双随体小染色体（ＢＭ）を携帯し、表現型が正常な族を二つ発見した。該小染色体はそれぞれ二つの家系の二世代と三世代の間で安定に遺伝でき、且つ人体にどんな危害もない。したがって、本発明人は該小染色体のエレメントを分離し、人源遺伝子のベクターを組み立てようという構想を提出した。国内外は今までこういう報道が１７あるが、該小染色体を遺伝子ベクターとするという構想を提出する人は一人もいない。研究の中、ＦＩＳＨ技術で、該小染色体が人間のＤ、Ｇ組染色体即ち１３、１４、１５、２１、２２号の染色体短腕から来たことは明らかになった。Ｄ、Ｇ組の染色体の短腕は核小体組織区域であるから、核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）が豊富である。該区域は群衆の中に長さによる（即ちｒＤＮＡの含有量による）多型あって、且つ細胞分裂期に該区域の遺伝子の転写が非常に活躍である。したがって、当提案者はＢＭから特異性のあるＤＮＡチップをクローンしたものを目的遺伝子の引導配列として、治療遺伝子を人体Ｄ、Ｇ組染色体短腕の組織区域に定点導入すれば、比較的高く、安定的、無害的表現があるべきであると推測した。後続いてくる実施例はこれに対しての力強い証明である。
【００１２】
【課題を解決する手段】
当発明人はまず第一に顕微分割の方法で、小染色体の特異性を持っているｐＵＣ１９ライブラリーを構造し、その中からシングルコピーのチップを選び出した。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を通じて、該チップが小染色体及びＤ、Ｇ組染色の短腕からきたことは明らかになった。また、このシングルコピーのチップをプローブとして、人類のＰＡＣ遺伝子組のＤＮＡライブラリーを篩い分け、小染色体の特異性があるＤＮＡチップ（ＢＭＳＦ）約１２０ｋｂを取得した。それにＦＩＳＨで小染色体及びＤ、Ｇ組染色体の短腕からきたことが証明された（図１）。配列を測定し、ＢＭＳＦの配列の特性を分析したところ、肝心な生理機能とかかわっている遺伝子を発見することはない。それゆえ、これを標的部位としては安全である。本発明は更に１２０ｋｂを利用し、或いは中からもっと小さく、特異性を持っているＤＮＡチップを選び、遺伝子ベクターを構造する。
【００１３】
したがって、当申請人は下記のように考えている：遺伝子引導配列は人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕上に肝心な生理機能がない関係遺伝子のＤＮＡ 配列、或いは該ＤＮＡ 配列と５０％及び５０％以上の相同性があるＤＮＡ 配列を目的遺伝子の引導配列とするのは発明の目的にかなっている。それによって構造された遺伝子ベクターは特異性があり、治療遺伝子を定点に人類のＤ、Ｇ組染色体の短腕に導入することができ、また効率が高く、安定に表現できるものである。
【００１４】
調剤された薬の中に、治療遺伝子を宿主細胞に導入することに有利な補助成分を含んでもいい。例えば、、リポソーム、宿主細胞にとって特異性があるタンパク質等である。
【００１５】
治療遺伝子の引導配列を取得した後、現有の技術によって各種のベクターを構造できる。ベクターを構造する方法と治療遺伝子をベクターに入れる方法は通常な方法である。
【００１６】
本発明の実施例の中に具体的に配列表１に示されたベクター−ＦＩＸ組換ナスの篩い分け遺伝子として、プラスの篩い分け遺伝子――Ｎｅｏ遺伝子を治療遺伝子配列の１５００位まで挿入し、それに１．５ｋｂと２．３ｋｂの両腕に分けさせる。ＦＩＸ治療遺伝子の挿入部位は５９１０位である。治療遺伝子の挿入は正方向と逆方向の差異がある。本発明の実施例には逆方向の挿入である。図２は該ベクター−ＦＩＸ組換え体の構造図である。
【００１７】
本発明の実施例の中に人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕上からクローンして得られた特異性がある３．８ｋｂのＤＮＡ配列を治療遺伝子の引導配列として、ベクターを構造する過程を具体的にあげた。得られた遺伝子ベクター−ＦＩＸ組換え体の菌株は２０００年９月２９日にすでに中国典型養成物センター（中国・武漢・武漢大学・郵便番号４３００７２）に保存することを提出した。その保存号：ＣＣＴＣＣ Ｍ２０００３１。指定された分類名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ＪＨ−４／ｐＮＳ−ＦＩＸ。
【００１８】
上記の治療遺伝子のベクターを取得した後、さらにそれを人間のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞に導入する。皮膚の腺維芽細胞、造血幹細胞などは同じく血友病Ｂの遺伝子薬としてもよい。その方法は現有技術である。本発明の実施例は例証した。
【００１９】
したがって、上記の転化された後の人類ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞、或いは治療遺伝子のベクターを含んでいる遺伝子薬物を下皮包埋、エレクトロポレーションまたは静脈注射等の方式で患者の体内に導入し、或いは、ベクター−ＦＩＸの組換え体をリポソ−ムで包んで直接患者の体内に注入し、治療遺伝子えを患者の体内に長期的且つ安定的に表現させ、遺伝子の欠陥による臨床症状を改正するのである。
【００２０】
【発明の実施の態様】
遺伝子治療の有効性試験：
（一） 体外（インビトロ）実験：
人類の凝血因子ＩＸ（ＦＩＸ）組換え体ベクターを線性化させ、エレクトロポレションの方法でＨＴ１０８０細胞に導入し、プラスとマイナスの篩い分けによって陽性の細胞株を得た。ＦＩＸでイントロンプライマーＰＣＲに乗ることによって外源性遺伝子を含むことを確認した。プライマーｐＮＳＮｅｏと８７６―７ＲでＦＩＸ陽性クローン細胞のｇＤＮＡを増幅すると、例外なく２．３ｋｂの特異性増幅断片が見える。配列を測定した後、定点の組込みを確認した。ＦＩＳＨでの検査と測定によって、ＦＩＸ遺伝子に導入された二つの陽性細胞株は１３、２１号の染色体の短腕に蛍光信号があり、定点の組込みであることが表明された。陽性のトランスフェクション細胞の培地の中に、ＦＩＸ活性の測定した結果：ＦＩＸ活性は３．５６μｇ／１０６細胞／２４時間であり、細胞は体外（インビトロ）培養伝代４４９日後、表現が非常に安定である。表現産物はＷｅｓｔｅｒｎ交雑に証明された。
（二） 体内試験：
構造された標的ベクターは人源ベクターである。人類と動物の間に種属の差があり、特に遺伝子薬にとってはそうである。動物の体内に標的実験をすると、予期された定点組込みが必ずあるとは限らないため、該ベクターの有効性と安定性を評価することは適しない。したがって、動物体内の実験は必要がないのである。
【００２１】
本発明の提供した遺伝子薬に毒性実験を行う：小鼠の尾の静脈に薬を与える。４５０μｇ／Ｋｇ、体重によって計ると、臨床の成人に一回の薬量（４．５μｇ／Ｋｇ）の百倍に相当する。実験の結果は該薬が静脈に与えるのが安全で、無毒性であることを証明した。
【００２２】
本発明の提供した血友病Ｂを治療する遺伝子薬は人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕上に肝心な生理機能のない遺伝子のＤＮＡ配列、或いは該ＤＮＡ配列と相同性のあるＤＮＡ配列を治療遺伝子の引導配列として、遺伝子ベクターを構造するものである。それゆえ、それに構造された遺伝子ベクターが治療遺伝子を定点に宿主細胞の特定の標的部位に導入できるのはいうまでもない。また該特定の標的部位のＤＮＡチップには重要な生理機能と関わっている遺伝子がないため、治療遺伝子の導入は安全である。
【００２３】
総じて言えば、本発明の提供した血友病Ｂを治療する遺伝子薬は人源遺伝子の引導配列を採用し、治療遺伝子のベクターを構造する。したがって：
▲１▼ 遺伝子治療の表現が安定する。治療遺伝子のベクターがその遺伝子を定点に人体細胞のＤ、Ｇ組染色体の短腕に導入できるため、治療の遺伝子は染色体によって安定に遺伝することができる。
▲２▼ 安全性がよい。治療の遺伝子に導入された標的部位に肝心な生理機能と関わっている遺伝子がないため、該標的部位が安全であることは証明された。同時に、ＦＩＳＨでベクターが治療遺伝子を定点に細胞の安全な標的部位に挿入することを証明し（図３）、無作為な突然変異を排除し、野生型ウイルスの危害も存在しない。したがって、治療遺伝子の標的部位での表現は安全である。本発明は遺伝子治療の臨床証明を提供しなかったが、申請人及び国内外の研究者によって発見された実例は他の角度からその安全性を証明したものである。
▲３▼ 表現の効率が高い。
第一：本発明の治療遺伝子のベクターにＤ、Ｇ組染色体の短腕からの引導配列を含んでいるため、対応的に人体細胞の中に１０個の標的部位があり、挿入の効率は他のベクターより少なくとも５〜１０倍高いものである。
第二：引導配列が遺伝子の転写が活躍なＤ、Ｇ組染色体の短腕からきたもので、治療遺伝子を標的部位に導入すると、効率の高い表現が得られる。
▲４▼ 免疫原性がない。該ベクターが人源性的なものであるため、人体に用いられると免疫原性を生じない。
【００２４】
本発明の提供した実施例はただ一種の実現方法であり、本発明の制限とは考えられない。
【００２５】
実施例１：
本発明が提供した遺伝子引導配列の調剤：
１． 遺伝子引導配列ＰＡＣクローンの取得
１．１ 顕微分割、ＰＣＲ、マイクロクローンでＢＭ特異性のあるｐＵＣ１９ライブラリーを構造する（Ｄｅｎｇ Ｈ−Ｘ、Ｙｏｓｈｉｕｒａ Ｋ、Ｄｉｒｋｓ ＲＷ、ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９２、８９：１３）
１．２ ＢＭ特異性のあるシングルコピーＤＮＡの取得及び鑑定
【００２６】
（１） コロニーラチス膜の調剤：二枚のナイロン膜の上に１４×１４の格子模様を書き、それぞれＡ、Ｂと表記し、二つ固体ＬＢのある平皿に置く。そして、ライブラリー皿から無作為に白いクローンを１４×１２個選び、それぞれ二枚座標が同じ膜にさす。第１３行点の１００ｎｇシングルコピーＤＮＡは陽性対照し、第１４行点の１００ｎｇ ｇＤＮＡは陰性対照し、二つの皿はそれぞれ３７℃の状態で１０〜１２時間養成する。その中、Ｂ膜が４℃で保存され、Ａ膜を皿から取り出し、それぞれ以下の溶液でびしょぬれた濾紙で処理する。１０％ＳＤＳ、５分間、０．５ＮＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ、３分間、１．５Ｍ ＮａＣ１／０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ 、３分間、２×ＳＳＣ／０．２Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０分間、 ８０℃真空の状態で２時間乾燥し、３７℃で保存する。
【００２７】
（２）ｇＤＮＡプローブの調剤
ｇＤＮＡ を５０〜７５ｎｇ取って、無菌の水を１１ｍｌまでに付け加え、１００℃で１０分間沸騰、変質させる。下記の体系で無作為プライマー表記反応する。
均一に混ぜて、３７℃の状態で３０分浴びる。Ｓｔｏｐｍｉｘｔｕｒｅ を８ｌ付け加え、Ｇ−５０柱の純化プローブにパスし、１／１００取って、液内値定する。
【００２８】
（３）交雑：
コロニーラチス膜を２×ＳＳＣの中に１０分間浸して、軽く表面のコロニー破片をふき取る。そして、６５℃の状態で５ｍｌの交雑液を３０分以上予め交雑する。液内値って、交雑液１．２×１０６ ｃｐｍ／ｍｌと同じような量でプローブ液を取って、１００℃の状態で１０分間沸騰、変性させる。それから、新鮮な交雑液５ｍｌを付け加え、６５℃の状態で、コロニーラチス膜と１２時間以上交雑する。以下の条件で膜を洗う：２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、室温１０分間、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃の状態で１０分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃の状態で１０分間、−７０℃でオートラジオグラフィ―する。もし交雑の信号がない、或いは弱いとしたら、初歩的にシングルコピーだと思われる。
【００２９】
（４）配列の測定およびＳｏｕｔｈｅｒｎ交雑の鑑定：
Ｂ膜の相応位置から交雑信号のないクローンを選び出し、少しずつ増やし、ＤＮＡプラスミドを抜粋して配列を測定する。それにＧｅｎＢａｎｋデータベースと比べて、類似性がないならシングルコピーだと思われる。最後に、ＥｃｏＲＩ酵素で挿入子ＤＮＡを切って分離し、また無作為なプライマー法で、ａ−３２ Ｐ−ｄＡＴＰと表記して、ＥｃｏＲＩが消化したｇＤＮＡとナイロン膜を移転して交雑する。方法は上記のと同じように、交雑帯が１本か２本あるなら、シングルコピーである。
１．３ ＢＭ及びＤ、Ｇ組染色体短腕の特異性ＰＡＣのあるクローンの取得と鑑定：
（１）人類ＰＡＣｇＤＮＡのライブラリーを篩い分けし、陽性クローンの番号を取得する。
ａ−３２ Ｐ−ｄＡＴＰ無作為プライマー法で表記された２６０ｂｐのシングルコピーのプローブ Ｐ８−７→Ｇ−５０柱（等級づけは中）純化させる→４℃で保つ→七枚のＰＡＣ膜を２×ＳＳＣの中に１０分間浸す→５５℃で、３時間で予めの交雑をする→プローブで１００℃で１０分間変性させる。→４．６×１０５ｃｐｍ／ｍｌの量で買ってきた５０ｍｌの交雑液に入れ、ＰＡＣ膜と６５℃で一時間交雑する→膜を洗うこと：２×ＳＳＣ、室温で１０分間は一回で、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃で１０分間２回洗う→線片をいれ、−７０℃の状態で１２時間オートラジオグラフィーする→Ｘ線片を現像する→取り扱い説明書によって陽性のクローンの番号を読み取る。
（２）五つ異なっている板から無作為に陽性のクローンの番号を選び出し、ＰＡＣクローンを買う。
１．４ ＰＡＣ ＤＮＡ が中期相細胞とＦＩＳＨ交雑させ、Ｄ、Ｇ組染色体短腕から得たことが証明できる。図１に参照。
【００３０】
上記の実験の方法は《分子クローン実験のガイドブック》（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９８９）に参考できる。
２、遺伝子引導配列ＤＮＡの取得
主要材料：β−ａｇａｒｏｓｅ（Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ） ＮｏｔＩ Ａｇａｒｏｓｅ
▲１▼ Ｎｏｔ Ｉ酵素でＰＡＣ１６９プラスミドを切る。
▲２▼ ＰＦＧＥを通じて約１２０Ｋｂの挿入子ＤＮＡを分離する。
バルス電気泳動の条件：電極の緩衝液：０．５×ＴＢＥ、Ｈｉｇｈ ｓｔｒｅｇｔｈ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ａｇａｒｏｓｅ： （Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｌｏｗ Ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ Ａｇａｒｏｓｅ ＬＭＰ）１％、Ｓｗｉｔｃｈ Ｔｉｍｅ：２〜１５秒；電気泳動の時間：１８時間；電圧：６Ｖ／ｃｍ；角度：１２０°温度：１４℃
▲３▼ 電気泳動が終わった後、ＥＢで３０分間染色させる（０．２ ｇ／ｍｌ）。Ｍａｒｋｅｒの指示に基づいて、無菌の安全かみそりで約１２０ｋｂのコロイドを切り取る。
▲４▼ 取られたコロイドをβ−ａｇａｒａｓｅで処理し、エチル・アルコールで沈殿する。
【００３１】
実施例２
本発明が提供した遺伝子ベクター−ＦＩＸ組替え体、即ち血友病Ｂを治療する遺伝子薬物の調剤：
１．遺伝子ベクターの構造及び目的遺伝子の導入
１．１ ベクターの構造
１．１．１ ＮｓｉＩとＳｔｕＩ（平末端酵素）でＰＡＣ ＤＮＡを切る。普通のアガロースゲルで３．８ｋｂの ＤＮＡチップを回収する。電気で溶出し純化する。
１．１．２ ＨｉｎｄＩＩＩ酵素でｐＧＥＭ−ＴＫのベクターＤＮＡを切る。Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平らにする。一つのブラント末端が現れた。
１．１．３ さらにｐＧＥＭ−ＴＫ／ＨｉｎｄＩＩＩの平らになった産物をＮｓｉＩ酵素で切る。
１．１．４ ３．８ｋｂ／ＮｓｉＩ＋ＳｔｕＩの純化した産物をｐＧＥＭ−ＴＫ／ＨＫ＋ＮｓｉＩ酵素の切られた産物と１６℃で１７時間連接させる。
１．１．５ 連接された産物はＪＭ１０９コンピテント細菌に転化され、アンピシリン皿で３７℃、１８時間養成する。
１．１．６ 無作為にシングルクローンを選び、ＮｓｉＩ及びＮｈｅＩ二つの酵素に切られ、陽性のクローンを鑑定する。
１．１．７ ＸｂａＩとＮｈｅＩ二つの酵素でｐＣＤＮ−ＧＰＲプラスミドを切る。Ｎｅｏ／ＸｂａＩ＋ＮｈｅＩを取得する。
１．１．８ Ｎｅｏ／ＸｂａＩ＋ＮｈｅＩをｐＧＥＭ−ＴＫ−３．８ｋｂ／ＮｈｅＩと連接させ、ＰＮＳ２遺伝子のベクターに構造する。
１．２ ＦＩＸの導入：
１．２．１ ＦＩＸ（ＣＤＳ）をｐｃＤＮＡ３．１（−）までクローンする。
１．２．２ プライマーＴＰＣＦとＴＰＣＲを設計し、ＦＩＸ遺伝子及び表現エレメント（ＣＭＶプロモーターとＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａ信号） を広げ、両脇にＡｖｒＩＩ酵素の切る部位が導入できるようにする。プライマーの配列は：
１．２．３ ＡｖｒＩＩ酵素で遺伝子ＦＩＸ及びその表現エレメント（ＣＭＶプロモーターとＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａ 信号）を切る。それにＮｈｅＩ酵素に切られたｐＮＳ２ベクターと連接する。
１．２．４ 連接の産物でＪＭ１０９大腸菌を転化し、ベクター−ＦＩＸの組替え体を含んでいる菌株を得た。（保存号：ＣＣＴＣＣ Ｍ２０００３１）
上記の実験の方法は《分子クローン実験のガイドブック》（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９８９）に参考できる。
【００３２】
２． 遺伝子ベクターＤＮＡの抽出：
２．１ 材料：
２．１．１ ＱＩＡＧＥ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ
２．１．２ 培地：液体ＬＢ
２．１．３ アンピシリン（ＡＭＰ）：１００ｍｇ／ｍｌ （１０００×）
２．２ 方法：
［１］ 陽性シングルクローンを選び、３ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋）３７℃、２５０ｒｐｍで１時間養成する。
［２］ 上記の初代培養物を１００μｌ取って１００ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋）の中に入れ、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間養成する。
［３］ ４℃で、６０００ｇ１５分間遠心させ、細菌を取得する。
［４］ １０ｍｌ Ｂｕｆｆｅｒ Ｐ１で菌体を再び下げる。
［５］ １０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ｐ２ を入れ、軽くて６回を反転し、均一に混合させる。室温で五分間置く。
［６］ 氷上に前置冷却されたＢｕｆｆｅｒ Ｐ３を１０ｍｌ入れ、軽くて６回反転し、均一に混合させる。氷上で２０分間。
［７］ ４℃の状態で、２００００ｇを３０ 分間遠心する。
［８］ 速やかに上澄み液をもう一つの４０ｍｌの高速遠心試管に移し、４℃で２００００ｘｇを再び遠心する。
［９］ １０ｍｌの Ｂｕｆｆｅｒ ＱＢＴ でＱＩＧＥＮ ｔｉｐ ５００を均衡する。
［１０］上澄み液をＱＩＧＡＥ ｔｉｐ５００に移し、柱にパスする。
［１１］ ２×３０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＣで柱を洗う。
［１２］ １５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＦで溶出し、（溶出の）液を集める。
［１３］ 溶出の液に（０．７倍の容積の）１０．７ｍｌのイソプロパノ−ルを入り、均一に混合させる。
［１４］ １５０００ｇを４℃で３０分間遠心する。
［１５］ 澄み液を取り除いて、ＤＮＡ沈殿物に５ｍｌ ７０％のエチン・アルコールを入れ、クリーニングする。１５０００ｇを４℃で１０分間遠心する。
［１６］ ７０％のエチル・アルコールを取り除いて、空気の中に１０分間乾燥された後、
適量のＴＥでＤＮＡ沈殿を溶解する。
それによって取られた遺伝子ベクターの組替え体は２０００年９月２９日にすでに中国典型養成物センター（中国・武漢・武漢大学・郵便番号４３００７２）に保存された。その保存号：ＣＣＴＣＣ Ｍ２０００３１。該保存物の名称：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ＪＨ−４／ＰＮＳ−ＦＩＸ。
【００３３】
実施例３
実施例２から得た遺伝子ベクター− ＦＩＸ組替え体を利用して、ＦＩＸ治療遺伝子を宿主細胞に導入し、そして宿主細胞に表現する。導入したＨＴ１０８０細胞株は２０００年８月１８日にすでに中国典型養成物センター（中国・武漢・武漢大学・郵便番号４３００７２）に保存することを提出した。その保存号：ＣＣＴＣＣ Ｃ２００００５。指定された分類名は類肉腫症細胞系で、人の転遺伝子細胞である。保存人は保存物に指定した分類名は類肉腫症細胞系／ＪＨ−１／ＦＩＸである。
１．材料：
１．１ 細胞：ＨＴ１０８０
培地：高糖ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ＨＴ１０８０）ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
１．２ 電気穿孔機：Ｂｉｏ−Ｒａｄ会社
【００３４】
２．方法：
１） 細胞を７５ｃｍ２の培養瓶の内に７０％〜８０％まで底が覆われるように増殖させる。
２）細胞を取り出した後ＨｅＢｓの緩衝液で２回洗う。そして細胞の数を計算する。
３） １５０００ ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心する。
４） 適量のＨｅＢｓを再び下げ、細胞の濃度は１０６〜１０７／ｍｌになること。
５） ０．４ｍｌの感電杯に細胞の下げた液を０．８ｍｌずつ入れ、ベクターＤＮＡは約１０μｇであること。
６） 電気穿孔機で電気ショックする。電圧２６０Ｖ、電気容量５５０μＦ、時間１１〜１３ｍｓという電撃条件を設定する。
７） 電撃された細胞を７５ ｃｍ２の培養瓶の内に転入し、双抗体を含んでいる培地を１４ｍｌ入れ、３７℃で、５％ＣＯ２の中に２４〜４８時間培養する。
８） 培地に最終濃度３００μｌのＧ４１８を入れて篩い分ける。２〜３日経ってから液を取り替える。そして再度Ｇ４１８を入れる。同時に正常の細胞と対照する。
９） 約７〜１０日を経って全部の正常の細胞はなくなった。トランスフェクション細胞内残っているクローンの数を計算する。そして維持量Ｇ４１８ １５０μｇ／ｍｌを使い直す。
１０）続いて最終濃度５００ｎｇ／ｍｌのＧＣＶでトランスフェクション細胞を篩い分ける。
１１）７〜１０日を経って大部分の正常細胞はなくなり、残っている細胞はＧＣＶ ２５０μｇ／ｍｌの維持量を使い直す。或いは、篩い分けされなかった細胞を底の７０〜８０％まで覆うように増殖させ、移転遺伝子の表現活性を測定する。
【００３５】
３、結果：
該ベクターを利用し、エレクトロポレーションの方法で、ＦＩＸ遺伝子をＨＴ１０８０細胞に導入する。プラス篩い分けとマイナス篩い分けによって、陽性細胞株を取得した。定点に挿入することをＦＩＳＨで確認した（図３）。
ＦＩＸ活性は陰性対照のより低い０．１μｇ／ｍｌから４．２７μｇ／ｍｌまで高くなる。それに転化された後の１４４日にも表現量は３．１５μｇ／ｍｌである。表１に参照する。その表現産物はＷｅｓｔｅｒｎ交雑によって証明された（図４）。
【００３６】
安全性証明
一、 人の群に存在する安全性の実例：
申請人は１９７３年から人類と医学細胞遺伝学についての研究をして以来、以下のものを発見、鑑定した：全国から１８９軒の実験室の４７０人の臨床細胞遺伝学の操作員が申告した７３２種の世界で初めて報道された核型の中に、４１種の核型がＤ、Ｇ組の染色体の短腕と関わっているが、Ｄ、Ｇ組染色体の短腕に部位を交換するチップが１−２２号のどの染色体からきたにもかかわらず、また同号の染色体チップのサイズが違い、含まれた遺伝子が一つから千以上であるにもかかわらず、携帯者本人の表型は正常である。それはＤ、Ｇ組染色体の短腕に部位を交換した遺伝子が正常に表現できることを説明した。したがって、Ｄ、Ｇ組染色体の短腕を遺伝子治療の標的部位としては安全である。
１、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１；１２；２２；１５；１１；８）（１ｑｔｅｒ→１ｐ１１：：８ｐ２３→８ｐｔｅｒ；１２ｐｔｅｒ→１２ｑｌｌ：：１ｐ１１→１ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１：：１２ｑ１１→１２ｑｔｅｒ；１５ｐｔｅｒ→１５ｑ１５：：２２ｐ１１→２２ｐｔｅｒ；１１ｐｔｅｒ→１１ｑ２１：：１５ｑ１５→１５ｑｔｅｒ；８ｑｔｅｒ→８ｐ２３：：１１ｑ２１→１１ｑｔｅｒ）．
表現型： 女、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者： 呉素彬、広東省広州市、中山医科大学付属一院産婦人科
の細胞遺伝室、郵便番号：５１００８０
２、核型：４６、ＸＹ、ｔ（１；１３）（１ｐｔｅｒ→１ｑ３２：：１３ｐ１１→１３ｐｔｅｒ；１３ｑｔｅｒ→
１３ｐ１１：：１ｑ３２→１ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２４歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者： 肖晟、ハルビン医科大学生物教研室、郵便番号：１５００８６
３、核型：４６、ＸＸ、ｔ（２；１５）（２ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１５ｑｔｅｒ； ２ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１５ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：郭裕萍等、江西省南昌市、江西省産婦人科病院の細胞遺伝室
郵便番号：３３０００６
４、核型：４６、ＸＹ、ｔ（２；２１）（２ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｐｔｅｒ； ２ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３２歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者： 康過秦等、山西省太原市、山西医学院付属二院遺伝研究室
、郵便番号：０３０００１
５、核型：４６、ＸＹ、ｔ（３；２２）（３ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｐｔｅｒ； ３ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｐｔｅｒ）．
表現型：男、２６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者： 高永、山東省濱州市医学院毒理室、郵便番号：２５６６０３
６、核型：４６、ＸＹ、ｔ（３；２２）（３ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｑｔｅｒ； ３ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｐｔｅｒ）．
表現型：男、２９歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人幼児の病院遺伝室、郵便番号：１２１０００
７、核型：４６、ＸＸ、ｔ（４；１５）（４ｑｔｅｒ→４Ｐ１３：：１５ｐ１３→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１３：：４ｐ１３→４ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：周玲など、湖北省武漢市、武漢市児童病院遺伝実験室、郵便
番号：４３００１６
８、核型：４６、ＸＹ、ｔ（４；２１）（４ｑｔｅｒ→４Ｐ１５：：２１ｐ１１→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１１：：４ｐ１５→４ｐｔｅｒ）．
表現型：男、２５歳、表現型が正常な携帯者
資料提供者： 徐競芳等、上海市第六人民病院遺伝室、郵便番号：２０００００
９、核型：４６、ＸＹ、ｔ（４；１４）（４ｐｔｅｒ→４ｑ３１：：１４ｐ１１→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１１：：４ｑ３１→４ｑｔｅｒ）．
表現型：男、表現型が正常な携帯者
資料提供者： 周明君等、河志省許昌市中心病院、郵便番号：１６１０００
１０、核型：４６、ＸＹ、ｔ（４；１４）（４ｐｔｅｒ→４ｑ３５：：１４ｐ１１→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１１：：４ｑ３５→４ｑｔｅｒ）．
表現型：男、２７歳、表現型が正常な携帯者
資料提供者：張秀泉等、広東省佛山市、佛山市婦人幼児保健院、郵便番号：５２８０００
１１、核型：４６、ＸＸ、ｔ（５；２２）（５ｐｔｅｒ→５ｑ１３：：２２ｐ１１→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１：：５ｑ１３→５ｑｔｅｒ）．
表現型：女、３２歳、表現型が正常な携帯者
資料提供者：曹建萍 、河南省安陽市婦人児童保健院遺伝室、郵便番号：４５５０００
１２、核型：４６、ＸＹ、ｔ（６；２２）（６ｐｔｅｒ→ｃｅｎ６→２２ｑｔｅｒ；６ｑｔｅｒ→ｃｅｎ２２→２２ｐｔｅｒ）
表現型：男、２５歳、表現型が正常な携帯者
資料提供者：祝新霞等、山東省泰安市、山東第８８病院産婦人科細胞遺伝室、
郵便番号：２７１０００
１３、核型：４６、ＸＹ、ｔ（６；２２）（６ ｑｔｅｒ→６ｐ２１ ：：２２ｐ１１．２→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１．２：：６ｐ２１→６ｐｔｅｒ）
表現型：男、３３歳、表現型が正常な携帯者
資料提供者：楊蘭青、山東省濱州市濱州医学院付属病院産婦人科、
郵便番号：２５６６０３
１４、核型：４５、ＸＸ、ｔ（７；２１）（７ｑｔｅｒ→７ｐ２２：：２１ｐ１２→２１ｑｔｅｒ）
表現型：女、２３歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：孫吉慶等、湖北省武漢市、湖北省武漢市児童病院遺伝実験市
室、郵便番号：４３００１６
１５、核型：４６、ＸＹ／４６、ＸＹ、ｔ（７；１４）（７ｐｔｅｒ→７ｑ１１：：１４ｐ１１→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１１：：７ｑ１１→７ｑｔｅｒ）
表現型：男、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学
研究室 郵便番号：４１００７８
１６、核型：４６、ＸＹ、ｔ（８；１４）（８ｑｔｅｒ→８Ｐ２１：：１４Ｐ１２→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１２：：８ｐ２１→８ｐｔｅｒ）
表現型：男、２７歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人幼児病院遺伝室、
郵便番号：１２１０００
１７、核型：４６、ＸＹ、ｔ（９；１４）（９ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｐｔｅｒ；９ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｑｔｅｒ）
表現型：男、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：程秋雲等、衡陽医学院附一生殖医学研究室、
郵便番号：４２１００１
１８、核型：４６，ＸＹ，ｔ（９；２２）（９ｐｔｅｒ→９ｐ１３：：２２ｐ１２→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１２：：９ｐ１３→９ｐｔｅｒ）ｍａｔ
表現型：女、３１歳、その母、妹一人、弟一人、息子一人も同じ核型が有し
、同じく表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学研
究室 郵便番号：４１００７８
１９、核型：４６，ＸＹ，ｔ（９；１４）（９ｐｔｅｒ→９ｑ１２：：１４ｐ１２→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１２：：９ｑ１２→９ｑｔｅｒ）
表現型：女、３２歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：孫艶陽等、黒龍江省ハルビン市、ハルビン医科大学生物教研
室、郵便番号：１５００８６
２０、核型：４６，ＸＹ，ｔ（９；１５）（９ｐｔｅｒ→９ｑ２１：：１５ｐ１２→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１２：；９ｑ２１→９ｑｔｅｒ）ｍａｔ
表現型：女、３６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：朱桂珍等、山東省泰安市、山東第８８病院産婦人科細胞遺伝
室、郵便番号：２７１０００
２１、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１０；１３）（１０ｐｔｅｒ→１０ｑ２４：：１３ｐ１１→１３ｐｔｅｒ； １３ｑｔｅｒ→１３ｐ１１：：１０ｑ２４→１０ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：厳敦清、青島医学院付属病院産婦人科研究室、
郵便番号：２６６０３３
２２、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１０；１３）（１０ｐｔｅｒ→１０ｑ２４：：１３ｐ１２→１３ｐｔｅｒ； １３ｑｔｅｒ→１３ｐ１２：：１０ｑ２４→１０ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２９歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：張影如等、広東省広州市、中山医科大学付属一院神経科、
郵便番号：５１００８０
２３、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１１；１４）（１１ｐｔｅｒ→ｃｅｎ →１４ｐｔｅｒ；１１ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：王志勇、河南省 柘城県、柘城県人民病院遺伝室、
郵便番号：４７６２００
２４、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１１；２１）（１１ｐｔｅｒ→１１ｐ１１：：２１ｐ１１→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１１：：１１ｐ１１→１１ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：鄭軍等、陜西省西安市、陜西省婦人児童保健院医学遺伝実験室
、郵便番号：７１０００３
２５、核型：４６，ＸＹ，ｔ（１１；１５）（１１ｐｔｅｒ→１１ｑ１３：：１５ｐ１２→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１２：：１１ｑ１３→１１ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２３歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：楊瑞芳等、山東医科大学付属病院囲産医学センター 、
郵便番号：２５００１２
２６、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１２；１４）（１２ｐｔｅｒ→ｃｅｎ →１４ｐｔｅｒ；１２ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：韓維田等、遼寧省計画生育科研所優生研究室、
郵便番号：１１００３１
２７、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１３；１６）（１３ｑｔｅｒ→１３ｐ１１：：１６ｐ１１．２→１６ｐｔｅｒ；１６ｑｔｅｒ→１６ｐ１１．２：：１３ｐ１１→１３ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２７歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者： 安松蘭、遼寧省大連市、大連市産婦人科病院遺伝室、郵便番
号：１１００７８
２８、核型：４６，ＸＹ／４５，ＸＹ，ｔ（１３；１３）（１３ｑｔｅｒ→１３ｐ１２：：１３ｐ１２→１３ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３９歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学
研究室 郵便番号：４１００７８
２９、核型：４６，ＸＹ，ｔ（１４；１８）（１４ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３０歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：王素桂等、北京計画生育技術指導所、郵便番号：１００００６
３０．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１４；１５）（１４Ｐｔｅｒ→１４ｑ１３：：１５ｐ１３→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１３：：１４ｑ１３→１４ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学
研究室 郵便番号：４１００７８
３１、核型：４５，ＸＸ，ｔ（１５ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２７歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室
郵便番号：４１００７８
３２、核型：４６，ＸＹ，ｔ（１５；１８）（１５ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３０歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：任国慶等、北京市計画生育技術指導所、郵便番号：１００００６
３３、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１５；２０）（１５ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：王新等、湖南医科大学付属二病院産婦人科遺伝科室、
郵便番号：４１００１１
３４、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１５；２２）（１５ｐｔｅｒ→１５ｑ１１：：２２ｐ１３→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１３：：１５ｑ１１→１５ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２７歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：符生苗、海南省海口市、海南省人民病院遺伝室、
郵便番号：５７００１１
３５、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１５；２２）（１５ｐｔｅｒ→１５ｑ２２：：２２ｐ１１→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１：：１５ｑ２２→ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２９歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李牧尭等、新疆ウルムチ、新疆医学院医学遺伝室、
郵便番号：８３００５４
３６、核型：：４６，ＸＹ，ｔ（１６；２１）（１６ｐｔｅｒ→１６ｑ２１：：２１ｐ１１→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１１：：１６ｑ１２→１６ｑｔｅｒ）．
表現型：男、２９歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：張恵芳等、広東省計画生育科学技術研究所、
郵便番号：５１００８０
３７、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１８；２１）（１８ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｑｔｅｒ；１８ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｐｔｅｒ）．
表現型：女、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人児童病院遺伝室、
郵便番号：１２１０００
３８、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１８；２１）（１８ｐｔｅｒ→１８ｑ１１：：２１ｐ１２→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１２：：１８ｑ１１→１８ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李修林等、遼寧省沈陽市、中国医科大学付属一院小児科遺伝室
、郵便番号：１１０００１
３９、核型：４５ ，Ｘ，ｄｉｃ（Ｙ；１３）（Ｙｐｔｅｒ→Ｙｑ１２００：：１３ｐ１１→ｃｅｎ→１３ｑｔｅｒ）
表現型：男、４歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室
郵便番号：４１００７８
４０、核型：４６，ＸＹ，ｔ（Ｙ；１５）（１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１２：：Ｙｑ１２→Ｙｐｔｅｒ）ｐａｔ．
表現型：男、新生児、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室
郵便番号：４１００７８
４１、核型：４５，Ｘ，ｐｓｕｄｉｃ（Ｙ，２２）（Ｙｐｔｅｒ→Ｙｑ１２０９：：２２ｐ１２→ｃｅｎ→２２ｑｔｅｒ）
表現型：男、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：劉希賢等、湖北省武漢同済医科大学医学遺伝学研究室
郵便番号：４３００３０
上述の実例は核仁の組織区域が外源遺伝子を受け取れることだけでなく、外源遺伝子を正常に表現させることも証明されている。これも本発明の提供した遺伝子薬が血友病Ｂを治療する可能性を証明している。
【００３７】
二、毒性の試験
本発明の遺伝子薬の急性毒性の研究
一）、実験の目的
本発明が提供した遺伝子薬物の一次に静脈に与える薬による急性毒性の反応及び死亡状況を研究すること。
二）、実験の材料
ｉ． 動物
昆明種小鼠（ｎ＝４０）、体重：２０．４±１．１、雄雌が半分半分。すべての実験用動物及び飼料が中南大学湘雅医学院実験動物センターに提供された。該種の小鼠は湖南省医学実験動物管理委員会からの医学実験動物の合格証書を持っている。
ｉｉ． 薬物
本発明が提供した遺伝子薬。実験の前に無菌の水で１１．２５ｕｇ／ｍｌの濃度の注射液に調剤する。
三）、実験の方法
予試験：
実験用白い小鼠１０個、雄と雌が半分半分、尾の静脈から本発明が提供した遺伝子薬を注射する。この試験は人の薬量の１００倍、即ち４５０ｕｇ／ｍｌを用いても、何の毒性反応も発見しない。
正式試験：
遺伝子治療薬物の特徴によって、予試験に用いられた量で正式試験を行う。試験は二の組、即ち給薬組と空白対照組に分ける。試験組は本発明の提供した遺伝子薬を用い、量が４５０ｕｇ／ｋｇである（体重によると、成人の臨床日用量の１００倍である）。対照組は等量の蒸瑠水で尾の静脈に注射する（０．４ｍｌ／１０ｇ／回）。二つの組とも薬を与えてから動物の薬に対する反応を観察し、続いて１４日、動物の大小便、普段の活動の状況及び死亡の数を記録し、第１４日目に、全部の小鼠を解剖し、胸腔と腹腔の状況を観察する。
四） 、実験の結果
小鼠の急性毒性試験：
対照組の小鼠（ｎ＝２０）を１４日続いて観察し、異常な活動及び動物の死亡が発見されなかった。本発明が提供した遺伝子薬に処理された小鼠（ｎ＝２０）は二回薬を与えされたら、３０分後、疲労で寝る、さらに動かなくなるのである。続いて１４日観察すると、動物の摂食、大小便及び普段の活動にも異常なこと、死亡などが発見されなかった。生きるまま検査すると、実験組と対照組には著しい異常と差異がないものである。結果は表２に参照。
表２ 人源遺伝子ベクターＦＩＸの急性毒性実験の結果
【００３８】
四、 実験のまとめ
小鼠の人源遺伝子ベクターＦＩＸの静脈給薬量が体重による成人の日用量の１００倍であっても、死亡を及ぼさないことから、その急性毒性が非常に低く、静脈に薬を与えるのが安全で、臨床の応用に用いられることは表明されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は１２０ｋｂのＢＭＳＦのＦＩＳＨ定位図である。
【図２】図２は本発明が提供した一種の遺伝子ベクター−ＦＩＸ組換え体の構造図である（遺伝子ベクター配列のサイズ：１３９２８ｂｐ）；その中ｐＧＥＭ−７（１１０３３−１３９２８）：ベクターのコピーしたエレメント及び原核の篩い分けシステムである；ＴＫ（１−２８４０）：真核細胞のマイナスの篩い分け遺伝子、該遺伝子はＴＫプロモーターとＴＫｐｏｌｙＡ信号を用いる；Ｎｅｏ（４３４２−５９１０）：真核細胞のプラスの篩い分け遺伝子であり、該遺伝子はｓｖ４０プロモーターとｓｖ４０ ｐｏｌｙＡ 信号を用いる；ＦＩＸ（５９１１−８６７７）：該遺伝子はＣＭＶプロモーターとＢＧＨｐｏｌｙＡ信号を用いる；ＧＬＳ（２８４１−４３４１，８６７８−１１０３２）：治療遺伝子の引導配列；Ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ （５９１０）：目的遺伝子の挿入部位である。
【図３】図３は外源性ＦＩＸ治療遺伝子が陽性細胞のクロー二ングの中のＦＩＳＨ定位であり、該ベクターを通じて、ＦＩＸをＤ、Ｇ組染色体の短腕に定点に導入することは証明される。
【図４】図４は外源性ＦＩＸ陽性細胞のＷｅｓｔｅｒｎ結果であり、Ｆ３〜Ｆ２３が六つの別の陽性細胞株で、“−”が陰性対照である。
【発明の属する技術分野】
本発明は血友病Ｂを治療する遺伝子薬及びその調剤する方法まで及んでいる。
【０００２】
【従来の技術】
血友病ＢはＢ型血友病とも呼び、一種凝血ＩＸ因子（ＦＩＸ）の欠陥によるＸ連鎖劣性遺伝の出血性疾病であり、男性の中に発病率が１／３００００である。人類ＦＩＸ蛋白の分子量は５６ＫＤで、４１５個のアミノ酸残基を含める一本鎖糖タンパク質である。Ｎ−端のチロシンから、四つ異なっている構造区が分けられる：Ｇｌａ区（γ―カルボキシル基グルタミン酸区）、成長因子区、活性化ペプチド区と触媒区（或いはセリン蛋白区）。人類ＦＩＸは主に肝臓で合成され、そのはじめての訳物がＮ−端の４６個のアミノ酸の前導配列を含む。前導ペプチドを除去し、糖基化及びビタミンＫをあてにするγ−カルボキシ等の修飾作用をした後、血液での成熟なＦＩＸになる。ＦＩＸは血液の中でプロエンチ―マの形で存在する。ＦＸＩａ或いはＦＶＩＩ−組織因子の複合物に活性化された後、プロテイン活性がある活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）になる。正常な人のプラスマの中のＦＩＸの含量は５μｇ／ｍｌで、その活性の半衰期が２４時間である。（Ｃｈｕａｈ ＭＫＬ，ＤｅｓｉｒｅＣｏｌｌｅｎ ＆ Ｔ．ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００１；３：３−２０に参照）。
【０００３】
ＦＩＸは内源性凝血級聯反応の過程になくてはならない蛋白因子である。ＦＩＸがコントロール蛋白ＦＶＩＩＩと複合物を形成した後、内源性凝血級聯反応のスピードを１０００倍以上増加させるため、凝血過程はわずかの何分間で完成できることになった。したがって、人体内にＦＩＸが不足であれば、自発性或いは小さな怪我をしたら、血をとめることができなくなり、ひどい場合は関節の出血による関節の形が変ること及び身体障害、或いは、内臓か頭内の出血による死亡を及ぼすことになる。コードＦＩＸ蛋白の遺伝子は１９８２年にクローンされ、Ｘｑ２７．１帯にあり、合わせて８個のエキソンがある。コード区のサイズは１．３８３ｋｂで、コード４１５個のアミノ酸がある。（Ｃｈｏｏ ＫＨ， Ｇｏｕｌｄ ＫＧ， Ｒｅｅｓ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９８２；２９９：１７８−１８０； Ｋｕｒａｃｈｉ Ｋ， Ｄａｖｉｅ ＥＷ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔ１ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８２；７９：６４６１−６４６４．） 成人のＦＩＸ蛋白分子量は５６ＫＤで、正常なプラスマの中での含量は５μｇ／ｍｌ（Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９９；１０：２０９１−２１０７．）である。血友病Ｂの臨床治療は蛋白の置換治療即ち輸血、或いはＦＩＸ濃縮製剤の補充に限る。ＦＩＸは人体内の半衰期が２４時間しかないため、患者はふりかえして血或いは血液製品の輸入によって命を維持することになる。重い経済負担になるだけでなく、エイズ、肝炎Ｂ及び狂牛病のウイルスを感染する恐れもある。
【０００４】
血友病Ｂの遺伝子治療にとって一番肝心な問題は、欠陥のＦＩＸ遺伝子のかわりに、どのように正常なＦＩＸ遺伝子を患者の体内に導入することである。目下、ＦＩＸ遺伝子治療についての研究に用いられているベクターは主にウイルスベクターである。例えば、レトロウイルスベクター、腺のウイルスベクター及び腺の相関ウイルスベクターがある。
【０００５】
１． Ｋａｙ等はＲＶベクターで一匹血友病Ｂのある犬に遺伝子治療の実験を行う（ Ｋａｙ ＭＡ， Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ Ｓ， Ｌａｎｄｅｎ ＣＮ ，ｅｔ ａｌ． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ： ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｏｇｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３；２６２：１１７−１１９に参照）。研究によってＲＶで大型の動物の肝臓細胞の中に遺伝子をリレーして輸送したら、相対的に長期の表現を達成するかもしれないが、表現量が少ないということが表明された。小鼠についての研究でもその肝臓細胞が０．１％−１％しか転化されなかったことを発見した（Ｋａｙ ＭＡ， Ｌｉ ＱＴ， Ｌｉｕ ＪＪ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９２；３：６４１−６４７に参照）。その主な原因はＲＶが非分裂細胞を組込むことができないのである。それゆえ、肝細胞を標的細胞として遺伝子治療を行う時、残りの肝組織の細胞分裂を誘導するために、部分の肝臓を切除するのは必要である。しかし、ＲＶの体内の転化効率が比較的低く、ｉｎｖｉｔｒｏ培養細胞の再移植率も高くないから、レベルの低いＦＩＸの表現が完全に血友病Ｂの表現型を直せないことになる。（Ｌｉｅｂｅｒ Ａ． Ｐｅｔｅｒｓ ＭＪ， Ｇｏｗｎ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｂｌｅｅｄｉｎｇ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９５； ６：１０２９−１０３７； Ｂｏｗｌｅｓ ＮＥ， Ｅｉｓｅｎｓｍｉｔｈ Ｒ， Ｍｏｈｕｉｄｄｉｎ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９６；７：１７３５−１７４２； Ｂｏｓｃｈ Ａ， ＭｃＣｒａｙ ＰＢ， Ｊｒ．Ｃｈａｎｇ ＳＭＷ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ ｉｎｖｅｓｔ １９９６；９８：２６８３−２６８７に参照）。 レトロウイルスは安全的に標的細胞の遺伝子組に組込めるが、分裂細胞を感染することしかできないため、挿入突然変異誘発などの安全な内密欠点が存在するものである。
【０００６】
２． 腺の相関ウイルス（ｒＡＡＶ）のベクターを組換えることは血友病Ｂの遺伝子治療の面においては比較的に有効である。ＦＩＸ ｃＤＮＡを受体の中に有効的且つ安定的に表現させ、またベクターの中にウイルス遺伝子を含んでいなく、一般的には細胞毒性Ｔリンパ細胞の反応を誘発しないため、研究者から黒い眼で見られるものである（Ｊｏｏｓｓ Ｋ， Ｙａｎｇ Ｙ， Ｆｉｓｈｅｒ ＫＪ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＤＮＡ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｉｒｅｃｔｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９８；７２： ４２１２−４２２３に参照）。小鼠及び血友病Ｂにかかる犬についてのＫａｙ達の臨床の研究（ Ｋａｙ ＭＡ ， Ｍａｎｎｏ ＣＳ， Ｒａｇｎｉ ＭＶ， ｅｔ ａｌ ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＩＣ ｉｎ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２０００；２４：２５７−２６１に参照）。しかし、ＡＡＶ滴度が低く、調剤も複雑であるため、大いに発展させることはできない。人類の遺伝子治療に用いることはまだより多くの研究が必要である。
【０００７】
近年来、非ウイルスベクター（例えばリポソーム、マイクロカプセルなど）も開発、利用されるようになった。（Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ Ｇ， Ｘｕ Ｎ， Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｉｎ ｍｉｃｅ ： ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ｕｓｉｎｇ ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９９；１０（８）：１２８１−１２８８．に参照）。
【０００８】
【発明が解決する課題】
したがって、近十年来、血友病Ｂについての遺伝子治療はいろいろな方面において改善の措置を取ったが、いまでにまだ安全的、安定的な一次性の遺伝子を治療する薬物が見つからないのである。その肝心な問題は一種安全性のよい、免疫原性もない、標的細胞を転換する効率の高い、標的細胞の中で長期的、安定的に遺伝子治療を表現するベクターがまだ見つからないことにある。
【０００９】
本発明の目的は一種安全な、治療遺伝子を安定的に標的細胞中に表現させ、血友病Ｂを治療する遺伝子薬を提供することである。
本発明のもう一つの目的は上述の遺伝子薬を調剤する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の提供した血友病Ｂを治療する遺伝子薬は人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕上に肝心な生理機能のない遺伝子ＤＮＡ配列、或いは該ＤＮＡ配列と相同性のあるＤＮＡ配列を治療遺伝子の引導配列として、構造された遺伝子ベクター−ＦＩＸの組換え体を含んでいる。
【００１１】
本申請人は特別な双随体小染色体（ＢＭ）を携帯し、表現型が正常な族を二つ発見した。該小染色体はそれぞれ二つの家系の二世代と三世代の間で安定に遺伝でき、且つ人体にどんな危害もない。したがって、本発明人は該小染色体のエレメントを分離し、人源遺伝子のベクターを組み立てようという構想を提出した。国内外は今までこういう報道が１７あるが、該小染色体を遺伝子ベクターとするという構想を提出する人は一人もいない。研究の中、ＦＩＳＨ技術で、該小染色体が人間のＤ、Ｇ組染色体即ち１３、１４、１５、２１、２２号の染色体短腕から来たことは明らかになった。Ｄ、Ｇ組の染色体の短腕は核小体組織区域であるから、核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）が豊富である。該区域は群衆の中に長さによる（即ちｒＤＮＡの含有量による）多型あって、且つ細胞分裂期に該区域の遺伝子の転写が非常に活躍である。したがって、当提案者はＢＭから特異性のあるＤＮＡチップをクローンしたものを目的遺伝子の引導配列として、治療遺伝子を人体Ｄ、Ｇ組染色体短腕の組織区域に定点導入すれば、比較的高く、安定的、無害的表現があるべきであると推測した。後続いてくる実施例はこれに対しての力強い証明である。
【００１２】
【課題を解決する手段】
当発明人はまず第一に顕微分割の方法で、小染色体の特異性を持っているｐＵＣ１９ライブラリーを構造し、その中からシングルコピーのチップを選び出した。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を通じて、該チップが小染色体及びＤ、Ｇ組染色の短腕からきたことは明らかになった。また、このシングルコピーのチップをプローブとして、人類のＰＡＣ遺伝子組のＤＮＡライブラリーを篩い分け、小染色体の特異性があるＤＮＡチップ（ＢＭＳＦ）約１２０ｋｂを取得した。それにＦＩＳＨで小染色体及びＤ、Ｇ組染色体の短腕からきたことが証明された（図１）。配列を測定し、ＢＭＳＦの配列の特性を分析したところ、肝心な生理機能とかかわっている遺伝子を発見することはない。それゆえ、これを標的部位としては安全である。本発明は更に１２０ｋｂを利用し、或いは中からもっと小さく、特異性を持っているＤＮＡチップを選び、遺伝子ベクターを構造する。
【００１３】
したがって、当申請人は下記のように考えている：遺伝子引導配列は人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕上に肝心な生理機能がない関係遺伝子のＤＮＡ 配列、或いは該ＤＮＡ 配列と５０％及び５０％以上の相同性があるＤＮＡ 配列を目的遺伝子の引導配列とするのは発明の目的にかなっている。それによって構造された遺伝子ベクターは特異性があり、治療遺伝子を定点に人類のＤ、Ｇ組染色体の短腕に導入することができ、また効率が高く、安定に表現できるものである。
【００１４】
調剤された薬の中に、治療遺伝子を宿主細胞に導入することに有利な補助成分を含んでもいい。例えば、、リポソーム、宿主細胞にとって特異性があるタンパク質等である。
【００１５】
治療遺伝子の引導配列を取得した後、現有の技術によって各種のベクターを構造できる。ベクターを構造する方法と治療遺伝子をベクターに入れる方法は通常な方法である。
【００１６】
本発明の実施例の中に具体的に配列表１に示されたベクター−ＦＩＸ組換ナスの篩い分け遺伝子として、プラスの篩い分け遺伝子――Ｎｅｏ遺伝子を治療遺伝子配列の１５００位まで挿入し、それに１．５ｋｂと２．３ｋｂの両腕に分けさせる。ＦＩＸ治療遺伝子の挿入部位は５９１０位である。治療遺伝子の挿入は正方向と逆方向の差異がある。本発明の実施例には逆方向の挿入である。図２は該ベクター−ＦＩＸ組換え体の構造図である。
【００１７】
本発明の実施例の中に人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕上からクローンして得られた特異性がある３．８ｋｂのＤＮＡ配列を治療遺伝子の引導配列として、ベクターを構造する過程を具体的にあげた。得られた遺伝子ベクター−ＦＩＸ組換え体の菌株は２０００年９月２９日にすでに中国典型養成物センター（中国・武漢・武漢大学・郵便番号４３００７２）に保存することを提出した。その保存号：ＣＣＴＣＣ Ｍ２０００３１。指定された分類名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ＪＨ−４／ｐＮＳ−ＦＩＸ。
【００１８】
上記の治療遺伝子のベクターを取得した後、さらにそれを人間のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞に導入する。皮膚の腺維芽細胞、造血幹細胞などは同じく血友病Ｂの遺伝子薬としてもよい。その方法は現有技術である。本発明の実施例は例証した。
【００１９】
したがって、上記の転化された後の人類ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞、或いは治療遺伝子のベクターを含んでいる遺伝子薬物を下皮包埋、エレクトロポレーションまたは静脈注射等の方式で患者の体内に導入し、或いは、ベクター−ＦＩＸの組換え体をリポソ−ムで包んで直接患者の体内に注入し、治療遺伝子えを患者の体内に長期的且つ安定的に表現させ、遺伝子の欠陥による臨床症状を改正するのである。
【００２０】
【発明の実施の態様】
遺伝子治療の有効性試験：
（一） 体外（インビトロ）実験：
人類の凝血因子ＩＸ（ＦＩＸ）組換え体ベクターを線性化させ、エレクトロポレションの方法でＨＴ１０８０細胞に導入し、プラスとマイナスの篩い分けによって陽性の細胞株を得た。ＦＩＸでイントロンプライマーＰＣＲに乗ることによって外源性遺伝子を含むことを確認した。プライマーｐＮＳＮｅｏと８７６―７ＲでＦＩＸ陽性クローン細胞のｇＤＮＡを増幅すると、例外なく２．３ｋｂの特異性増幅断片が見える。配列を測定した後、定点の組込みを確認した。ＦＩＳＨでの検査と測定によって、ＦＩＸ遺伝子に導入された二つの陽性細胞株は１３、２１号の染色体の短腕に蛍光信号があり、定点の組込みであることが表明された。陽性のトランスフェクション細胞の培地の中に、ＦＩＸ活性の測定した結果：ＦＩＸ活性は３．５６μｇ／１０６細胞／２４時間であり、細胞は体外（インビトロ）培養伝代４４９日後、表現が非常に安定である。表現産物はＷｅｓｔｅｒｎ交雑に証明された。
（二） 体内試験：
構造された標的ベクターは人源ベクターである。人類と動物の間に種属の差があり、特に遺伝子薬にとってはそうである。動物の体内に標的実験をすると、予期された定点組込みが必ずあるとは限らないため、該ベクターの有効性と安定性を評価することは適しない。したがって、動物体内の実験は必要がないのである。
【００２１】
本発明の提供した遺伝子薬に毒性実験を行う：小鼠の尾の静脈に薬を与える。４５０μｇ／Ｋｇ、体重によって計ると、臨床の成人に一回の薬量（４．５μｇ／Ｋｇ）の百倍に相当する。実験の結果は該薬が静脈に与えるのが安全で、無毒性であることを証明した。
【００２２】
本発明の提供した血友病Ｂを治療する遺伝子薬は人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕上に肝心な生理機能のない遺伝子のＤＮＡ配列、或いは該ＤＮＡ配列と相同性のあるＤＮＡ配列を治療遺伝子の引導配列として、遺伝子ベクターを構造するものである。それゆえ、それに構造された遺伝子ベクターが治療遺伝子を定点に宿主細胞の特定の標的部位に導入できるのはいうまでもない。また該特定の標的部位のＤＮＡチップには重要な生理機能と関わっている遺伝子がないため、治療遺伝子の導入は安全である。
【００２３】
総じて言えば、本発明の提供した血友病Ｂを治療する遺伝子薬は人源遺伝子の引導配列を採用し、治療遺伝子のベクターを構造する。したがって：
▲１▼ 遺伝子治療の表現が安定する。治療遺伝子のベクターがその遺伝子を定点に人体細胞のＤ、Ｇ組染色体の短腕に導入できるため、治療の遺伝子は染色体によって安定に遺伝することができる。
▲２▼ 安全性がよい。治療の遺伝子に導入された標的部位に肝心な生理機能と関わっている遺伝子がないため、該標的部位が安全であることは証明された。同時に、ＦＩＳＨでベクターが治療遺伝子を定点に細胞の安全な標的部位に挿入することを証明し（図３）、無作為な突然変異を排除し、野生型ウイルスの危害も存在しない。したがって、治療遺伝子の標的部位での表現は安全である。本発明は遺伝子治療の臨床証明を提供しなかったが、申請人及び国内外の研究者によって発見された実例は他の角度からその安全性を証明したものである。
▲３▼ 表現の効率が高い。
第一：本発明の治療遺伝子のベクターにＤ、Ｇ組染色体の短腕からの引導配列を含んでいるため、対応的に人体細胞の中に１０個の標的部位があり、挿入の効率は他のベクターより少なくとも５〜１０倍高いものである。
第二：引導配列が遺伝子の転写が活躍なＤ、Ｇ組染色体の短腕からきたもので、治療遺伝子を標的部位に導入すると、効率の高い表現が得られる。
▲４▼ 免疫原性がない。該ベクターが人源性的なものであるため、人体に用いられると免疫原性を生じない。
【００２４】
本発明の提供した実施例はただ一種の実現方法であり、本発明の制限とは考えられない。
【００２５】
実施例１：
本発明が提供した遺伝子引導配列の調剤：
１． 遺伝子引導配列ＰＡＣクローンの取得
１．１ 顕微分割、ＰＣＲ、マイクロクローンでＢＭ特異性のあるｐＵＣ１９ライブラリーを構造する（Ｄｅｎｇ Ｈ−Ｘ、Ｙｏｓｈｉｕｒａ Ｋ、Ｄｉｒｋｓ ＲＷ、ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９２、８９：１３）
１．２ ＢＭ特異性のあるシングルコピーＤＮＡの取得及び鑑定
【００２６】
（１） コロニーラチス膜の調剤：二枚のナイロン膜の上に１４×１４の格子模様を書き、それぞれＡ、Ｂと表記し、二つ固体ＬＢのある平皿に置く。そして、ライブラリー皿から無作為に白いクローンを１４×１２個選び、それぞれ二枚座標が同じ膜にさす。第１３行点の１００ｎｇシングルコピーＤＮＡは陽性対照し、第１４行点の１００ｎｇ ｇＤＮＡは陰性対照し、二つの皿はそれぞれ３７℃の状態で１０〜１２時間養成する。その中、Ｂ膜が４℃で保存され、Ａ膜を皿から取り出し、それぞれ以下の溶液でびしょぬれた濾紙で処理する。１０％ＳＤＳ、５分間、０．５ＮＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ、３分間、１．５Ｍ ＮａＣ１／０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ 、３分間、２×ＳＳＣ／０．２Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０分間、 ８０℃真空の状態で２時間乾燥し、３７℃で保存する。
【００２７】
（２）ｇＤＮＡプローブの調剤
ｇＤＮＡ を５０〜７５ｎｇ取って、無菌の水を１１ｍｌまでに付け加え、１００℃で１０分間沸騰、変質させる。下記の体系で無作為プライマー表記反応する。
【００２８】
（３）交雑：
コロニーラチス膜を２×ＳＳＣの中に１０分間浸して、軽く表面のコロニー破片をふき取る。そして、６５℃の状態で５ｍｌの交雑液を３０分以上予め交雑する。液内値って、交雑液１．２×１０６ ｃｐｍ／ｍｌと同じような量でプローブ液を取って、１００℃の状態で１０分間沸騰、変性させる。それから、新鮮な交雑液５ｍｌを付け加え、６５℃の状態で、コロニーラチス膜と１２時間以上交雑する。以下の条件で膜を洗う：２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、室温１０分間、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃の状態で１０分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃の状態で１０分間、−７０℃でオートラジオグラフィ―する。もし交雑の信号がない、或いは弱いとしたら、初歩的にシングルコピーだと思われる。
【００２９】
（４）配列の測定およびＳｏｕｔｈｅｒｎ交雑の鑑定：
Ｂ膜の相応位置から交雑信号のないクローンを選び出し、少しずつ増やし、ＤＮＡプラスミドを抜粋して配列を測定する。それにＧｅｎＢａｎｋデータベースと比べて、類似性がないならシングルコピーだと思われる。最後に、ＥｃｏＲＩ酵素で挿入子ＤＮＡを切って分離し、また無作為なプライマー法で、ａ−３２ Ｐ−ｄＡＴＰと表記して、ＥｃｏＲＩが消化したｇＤＮＡとナイロン膜を移転して交雑する。方法は上記のと同じように、交雑帯が１本か２本あるなら、シングルコピーである。
１．３ ＢＭ及びＤ、Ｇ組染色体短腕の特異性ＰＡＣのあるクローンの取得と鑑定：
（１）人類ＰＡＣｇＤＮＡのライブラリーを篩い分けし、陽性クローンの番号を取得する。
ａ−３２ Ｐ−ｄＡＴＰ無作為プライマー法で表記された２６０ｂｐのシングルコピーのプローブ Ｐ８−７→Ｇ−５０柱（等級づけは中）純化させる→４℃で保つ→七枚のＰＡＣ膜を２×ＳＳＣの中に１０分間浸す→５５℃で、３時間で予めの交雑をする→プローブで１００℃で１０分間変性させる。→４．６×１０５ｃｐｍ／ｍｌの量で買ってきた５０ｍｌの交雑液に入れ、ＰＡＣ膜と６５℃で一時間交雑する→膜を洗うこと：２×ＳＳＣ、室温で１０分間は一回で、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃で１０分間２回洗う→線片をいれ、−７０℃の状態で１２時間オートラジオグラフィーする→Ｘ線片を現像する→取り扱い説明書によって陽性のクローンの番号を読み取る。
（２）五つ異なっている板から無作為に陽性のクローンの番号を選び出し、ＰＡＣクローンを買う。
１．４ ＰＡＣ ＤＮＡ が中期相細胞とＦＩＳＨ交雑させ、Ｄ、Ｇ組染色体短腕から得たことが証明できる。図１に参照。
【００３０】
上記の実験の方法は《分子クローン実験のガイドブック》（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９８９）に参考できる。
２、遺伝子引導配列ＤＮＡの取得
主要材料：β−ａｇａｒｏｓｅ（Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ） ＮｏｔＩ Ａｇａｒｏｓｅ
▲１▼ Ｎｏｔ Ｉ酵素でＰＡＣ１６９プラスミドを切る。
▲２▼ ＰＦＧＥを通じて約１２０Ｋｂの挿入子ＤＮＡを分離する。
バルス電気泳動の条件：電極の緩衝液：０．５×ＴＢＥ、Ｈｉｇｈ ｓｔｒｅｇｔｈ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ａｇａｒｏｓｅ： （Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｌｏｗ Ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ Ａｇａｒｏｓｅ ＬＭＰ）１％、Ｓｗｉｔｃｈ Ｔｉｍｅ：２〜１５秒；電気泳動の時間：１８時間；電圧：６Ｖ／ｃｍ；角度：１２０°温度：１４℃
▲３▼ 電気泳動が終わった後、ＥＢで３０分間染色させる（０．２ ｇ／ｍｌ）。Ｍａｒｋｅｒの指示に基づいて、無菌の安全かみそりで約１２０ｋｂのコロイドを切り取る。
▲４▼ 取られたコロイドをβ−ａｇａｒａｓｅで処理し、エチル・アルコールで沈殿する。
【００３１】
実施例２
本発明が提供した遺伝子ベクター−ＦＩＸ組替え体、即ち血友病Ｂを治療する遺伝子薬物の調剤：
１．遺伝子ベクターの構造及び目的遺伝子の導入
１．１ ベクターの構造
１．１．１ ＮｓｉＩとＳｔｕＩ（平末端酵素）でＰＡＣ ＤＮＡを切る。普通のアガロースゲルで３．８ｋｂの ＤＮＡチップを回収する。電気で溶出し純化する。
１．１．２ ＨｉｎｄＩＩＩ酵素でｐＧＥＭ−ＴＫのベクターＤＮＡを切る。Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平らにする。一つのブラント末端が現れた。
１．１．３ さらにｐＧＥＭ−ＴＫ／ＨｉｎｄＩＩＩの平らになった産物をＮｓｉＩ酵素で切る。
１．１．４ ３．８ｋｂ／ＮｓｉＩ＋ＳｔｕＩの純化した産物をｐＧＥＭ−ＴＫ／ＨＫ＋ＮｓｉＩ酵素の切られた産物と１６℃で１７時間連接させる。
１．１．５ 連接された産物はＪＭ１０９コンピテント細菌に転化され、アンピシリン皿で３７℃、１８時間養成する。
１．１．６ 無作為にシングルクローンを選び、ＮｓｉＩ及びＮｈｅＩ二つの酵素に切られ、陽性のクローンを鑑定する。
１．１．７ ＸｂａＩとＮｈｅＩ二つの酵素でｐＣＤＮ−ＧＰＲプラスミドを切る。Ｎｅｏ／ＸｂａＩ＋ＮｈｅＩを取得する。
１．１．８ Ｎｅｏ／ＸｂａＩ＋ＮｈｅＩをｐＧＥＭ−ＴＫ−３．８ｋｂ／ＮｈｅＩと連接させ、ＰＮＳ２遺伝子のベクターに構造する。
１．２ ＦＩＸの導入：
１．２．１ ＦＩＸ（ＣＤＳ）をｐｃＤＮＡ３．１（−）までクローンする。
１．２．２ プライマーＴＰＣＦとＴＰＣＲを設計し、ＦＩＸ遺伝子及び表現エレメント（ＣＭＶプロモーターとＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａ信号） を広げ、両脇にＡｖｒＩＩ酵素の切る部位が導入できるようにする。プライマーの配列は：
１．２．４ 連接の産物でＪＭ１０９大腸菌を転化し、ベクター−ＦＩＸの組替え体を含んでいる菌株を得た。（保存号：ＣＣＴＣＣ Ｍ２０００３１）
上記の実験の方法は《分子クローン実験のガイドブック》（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９８９）に参考できる。
【００３２】
２． 遺伝子ベクターＤＮＡの抽出：
２．１ 材料：
２．１．１ ＱＩＡＧＥ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ
２．１．２ 培地：液体ＬＢ
２．２ 方法：
［１］ 陽性シングルクローンを選び、３ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋）３７℃、２５０ｒｐｍで１時間養成する。
［２］ 上記の初代培養物を１００μｌ取って１００ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋）の中に入れ、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間養成する。
［３］ ４℃で、６０００ｇ１５分間遠心させ、細菌を取得する。
［４］ １０ｍｌ Ｂｕｆｆｅｒ Ｐ１で菌体を再び下げる。
［５］ １０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ｐ２ を入れ、軽くて６回を反転し、均一に混合させる。室温で五分間置く。
［６］ 氷上に前置冷却されたＢｕｆｆｅｒ Ｐ３を１０ｍｌ入れ、軽くて６回反転し、均一に混合させる。氷上で２０分間。
［７］ ４℃の状態で、２００００ｇを３０ 分間遠心する。
［８］ 速やかに上澄み液をもう一つの４０ｍｌの高速遠心試管に移し、４℃で２００００ｘｇを再び遠心する。
［９］ １０ｍｌの Ｂｕｆｆｅｒ ＱＢＴ でＱＩＧＥＮ ｔｉｐ ５００を均衡する。
［１０］上澄み液をＱＩＧＡＥ ｔｉｐ５００に移し、柱にパスする。
［１１］ ２×３０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＣで柱を洗う。
［１２］ １５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＦで溶出し、（溶出の）液を集める。
［１３］ 溶出の液に（０．７倍の容積の）１０．７ｍｌのイソプロパノ−ルを入り、均一に混合させる。
［１４］ １５０００ｇを４℃で３０分間遠心する。
［１５］ 澄み液を取り除いて、ＤＮＡ沈殿物に５ｍｌ ７０％のエチン・アルコールを入れ、クリーニングする。１５０００ｇを４℃で１０分間遠心する。
［１６］ ７０％のエチル・アルコールを取り除いて、空気の中に１０分間乾燥された後、
適量のＴＥでＤＮＡ沈殿を溶解する。
それによって取られた遺伝子ベクターの組替え体は２０００年９月２９日にすでに中国典型養成物センター（中国・武漢・武漢大学・郵便番号４３００７２）に保存された。その保存号：ＣＣＴＣＣ Ｍ２０００３１。該保存物の名称：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ＪＨ−４／ＰＮＳ−ＦＩＸ。
【００３３】
実施例３
実施例２から得た遺伝子ベクター− ＦＩＸ組替え体を利用して、ＦＩＸ治療遺伝子を宿主細胞に導入し、そして宿主細胞に表現する。導入したＨＴ１０８０細胞株は２０００年８月１８日にすでに中国典型養成物センター（中国・武漢・武漢大学・郵便番号４３００７２）に保存することを提出した。その保存号：ＣＣＴＣＣ Ｃ２００００５。指定された分類名は類肉腫症細胞系で、人の転遺伝子細胞である。保存人は保存物に指定した分類名は類肉腫症細胞系／ＪＨ−１／ＦＩＸである。
１．材料：
１．１ 細胞：ＨＴ１０８０
培地：高糖ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ＨＴ１０８０）ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
１．２ 電気穿孔機：Ｂｉｏ−Ｒａｄ会社
【００３４】
２．方法：
１） 細胞を７５ｃｍ２の培養瓶の内に７０％〜８０％まで底が覆われるように増殖させる。
２）細胞を取り出した後ＨｅＢｓの緩衝液で２回洗う。そして細胞の数を計算する。
３） １５０００ ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心する。
４） 適量のＨｅＢｓを再び下げ、細胞の濃度は１０６〜１０７／ｍｌになること。
５） ０．４ｍｌの感電杯に細胞の下げた液を０．８ｍｌずつ入れ、ベクターＤＮＡは約１０μｇであること。
６） 電気穿孔機で電気ショックする。電圧２６０Ｖ、電気容量５５０μＦ、時間１１〜１３ｍｓという電撃条件を設定する。
７） 電撃された細胞を７５ ｃｍ２の培養瓶の内に転入し、双抗体を含んでいる培地を１４ｍｌ入れ、３７℃で、５％ＣＯ２の中に２４〜４８時間培養する。
８） 培地に最終濃度３００μｌのＧ４１８を入れて篩い分ける。２〜３日経ってから液を取り替える。そして再度Ｇ４１８を入れる。同時に正常の細胞と対照する。
９） 約７〜１０日を経って全部の正常の細胞はなくなった。トランスフェクション細胞内残っているクローンの数を計算する。そして維持量Ｇ４１８ １５０μｇ／ｍｌを使い直す。
１０）続いて最終濃度５００ｎｇ／ｍｌのＧＣＶでトランスフェクション細胞を篩い分ける。
１１）７〜１０日を経って大部分の正常細胞はなくなり、残っている細胞はＧＣＶ ２５０μｇ／ｍｌの維持量を使い直す。或いは、篩い分けされなかった細胞を底の７０〜８０％まで覆うように増殖させ、移転遺伝子の表現活性を測定する。
【００３５】
３、結果：
該ベクターを利用し、エレクトロポレーションの方法で、ＦＩＸ遺伝子をＨＴ１０８０細胞に導入する。プラス篩い分けとマイナス篩い分けによって、陽性細胞株を取得した。定点に挿入することをＦＩＳＨで確認した（図３）。
ＦＩＸ活性は陰性対照のより低い０．１μｇ／ｍｌから４．２７μｇ／ｍｌまで高くなる。それに転化された後の１４４日にも表現量は３．１５μｇ／ｍｌである。表１に参照する。その表現産物はＷｅｓｔｅｒｎ交雑によって証明された（図４）。
安全性証明
一、 人の群に存在する安全性の実例：
申請人は１９７３年から人類と医学細胞遺伝学についての研究をして以来、以下のものを発見、鑑定した：全国から１８９軒の実験室の４７０人の臨床細胞遺伝学の操作員が申告した７３２種の世界で初めて報道された核型の中に、４１種の核型がＤ、Ｇ組の染色体の短腕と関わっているが、Ｄ、Ｇ組染色体の短腕に部位を交換するチップが１−２２号のどの染色体からきたにもかかわらず、また同号の染色体チップのサイズが違い、含まれた遺伝子が一つから千以上であるにもかかわらず、携帯者本人の表型は正常である。それはＤ、Ｇ組染色体の短腕に部位を交換した遺伝子が正常に表現できることを説明した。したがって、Ｄ、Ｇ組染色体の短腕を遺伝子治療の標的部位としては安全である。
１、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１；１２；２２；１５；１１；８）（１ｑｔｅｒ→１ｐ１１：：８ｐ２３→８ｐｔｅｒ；１２ｐｔｅｒ→１２ｑｌｌ：：１ｐ１１→１ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１：：１２ｑ１１→１２ｑｔｅｒ；１５ｐｔｅｒ→１５ｑ１５：：２２ｐ１１→２２ｐｔｅｒ；１１ｐｔｅｒ→１１ｑ２１：：１５ｑ１５→１５ｑｔｅｒ；８ｑｔｅｒ→８ｐ２３：：１１ｑ２１→１１ｑｔｅｒ）．
表現型： 女、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者： 呉素彬、広東省広州市、中山医科大学付属一院産婦人科
の細胞遺伝室、郵便番号：５１００８０
２、核型：４６、ＸＹ、ｔ（１；１３）（１ｐｔｅｒ→１ｑ３２：：１３ｐ１１→１３ｐｔｅｒ；１３ｑｔｅｒ→
１３ｐ１１：：１ｑ３２→１ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２４歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者： 肖晟、ハルビン医科大学生物教研室、郵便番号：１５００８６
３、核型：４６、ＸＸ、ｔ（２；１５）（２ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１５ｑｔｅｒ； ２ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１５ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：郭裕萍等、江西省南昌市、江西省産婦人科病院の細胞遺伝室
郵便番号：３３０００６
４、核型：４６、ＸＹ、ｔ（２；２１）（２ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｐｔｅｒ； ２ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３２歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者： 康過秦等、山西省太原市、山西医学院付属二院遺伝研究室
、郵便番号：０３０００１
５、核型：４６、ＸＹ、ｔ（３；２２）（３ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｐｔｅｒ； ３ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｐｔｅｒ）．
表現型：男、２６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者： 高永、山東省濱州市医学院毒理室、郵便番号：２５６６０３
６、核型：４６、ＸＹ、ｔ（３；２２）（３ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｑｔｅｒ； ３ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｐｔｅｒ）．
表現型：男、２９歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人幼児の病院遺伝室、郵便番号：１２１０００
７、核型：４６、ＸＸ、ｔ（４；１５）（４ｑｔｅｒ→４Ｐ１３：：１５ｐ１３→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１３：：４ｐ１３→４ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：周玲など、湖北省武漢市、武漢市児童病院遺伝実験室、郵便
番号：４３００１６
８、核型：４６、ＸＹ、ｔ（４；２１）（４ｑｔｅｒ→４Ｐ１５：：２１ｐ１１→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１１：：４ｐ１５→４ｐｔｅｒ）．
表現型：男、２５歳、表現型が正常な携帯者
資料提供者： 徐競芳等、上海市第六人民病院遺伝室、郵便番号：２０００００
９、核型：４６、ＸＹ、ｔ（４；１４）（４ｐｔｅｒ→４ｑ３１：：１４ｐ１１→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１１：：４ｑ３１→４ｑｔｅｒ）．
表現型：男、表現型が正常な携帯者
資料提供者： 周明君等、河志省許昌市中心病院、郵便番号：１６１０００
１０、核型：４６、ＸＹ、ｔ（４；１４）（４ｐｔｅｒ→４ｑ３５：：１４ｐ１１→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１１：：４ｑ３５→４ｑｔｅｒ）．
表現型：男、２７歳、表現型が正常な携帯者
資料提供者：張秀泉等、広東省佛山市、佛山市婦人幼児保健院、郵便番号：５２８０００
１１、核型：４６、ＸＸ、ｔ（５；２２）（５ｐｔｅｒ→５ｑ１３：：２２ｐ１１→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１：：５ｑ１３→５ｑｔｅｒ）．
表現型：女、３２歳、表現型が正常な携帯者
資料提供者：曹建萍 、河南省安陽市婦人児童保健院遺伝室、郵便番号：４５５０００
１２、核型：４６、ＸＹ、ｔ（６；２２）（６ｐｔｅｒ→ｃｅｎ６→２２ｑｔｅｒ；６ｑｔｅｒ→ｃｅｎ２２→２２ｐｔｅｒ）
表現型：男、２５歳、表現型が正常な携帯者
資料提供者：祝新霞等、山東省泰安市、山東第８８病院産婦人科細胞遺伝室、
郵便番号：２７１０００
１３、核型：４６、ＸＹ、ｔ（６；２２）（６ ｑｔｅｒ→６ｐ２１ ：：２２ｐ１１．２→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１．２：：６ｐ２１→６ｐｔｅｒ）
表現型：男、３３歳、表現型が正常な携帯者
資料提供者：楊蘭青、山東省濱州市濱州医学院付属病院産婦人科、
郵便番号：２５６６０３
１４、核型：４５、ＸＸ、ｔ（７；２１）（７ｑｔｅｒ→７ｐ２２：：２１ｐ１２→２１ｑｔｅｒ）
表現型：女、２３歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：孫吉慶等、湖北省武漢市、湖北省武漢市児童病院遺伝実験市
室、郵便番号：４３００１６
１５、核型：４６、ＸＹ／４６、ＸＹ、ｔ（７；１４）（７ｐｔｅｒ→７ｑ１１：：１４ｐ１１→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１１：：７ｑ１１→７ｑｔｅｒ）
表現型：男、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学
研究室 郵便番号：４１００７８
１６、核型：４６、ＸＹ、ｔ（８；１４）（８ｑｔｅｒ→８Ｐ２１：：１４Ｐ１２→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１２：：８ｐ２１→８ｐｔｅｒ）
表現型：男、２７歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人幼児病院遺伝室、
郵便番号：１２１０００
１７、核型：４６、ＸＹ、ｔ（９；１４）（９ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｐｔｅｒ；９ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｑｔｅｒ）
表現型：男、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：程秋雲等、衡陽医学院附一生殖医学研究室、
郵便番号：４２１００１
１８、核型：４６，ＸＹ，ｔ（９；２２）（９ｐｔｅｒ→９ｐ１３：：２２ｐ１２→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１２：：９ｐ１３→９ｐｔｅｒ）ｍａｔ
表現型：女、３１歳、その母、妹一人、弟一人、息子一人も同じ核型が有し
、同じく表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学研
究室 郵便番号：４１００７８
１９、核型：４６，ＸＹ，ｔ（９；１４）（９ｐｔｅｒ→９ｑ１２：：１４ｐ１２→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１２：：９ｑ１２→９ｑｔｅｒ）
表現型：女、３２歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：孫艶陽等、黒龍江省ハルビン市、ハルビン医科大学生物教研
室、郵便番号：１５００８６
２０、核型：４６，ＸＹ，ｔ（９；１５）（９ｐｔｅｒ→９ｑ２１：：１５ｐ１２→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１２：；９ｑ２１→９ｑｔｅｒ）ｍａｔ
表現型：女、３６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：朱桂珍等、山東省泰安市、山東第８８病院産婦人科細胞遺伝
室、郵便番号：２７１０００
２１、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１０；１３）（１０ｐｔｅｒ→１０ｑ２４：：１３ｐ１１→１３ｐｔｅｒ； １３ｑｔｅｒ→１３ｐ１１：：１０ｑ２４→１０ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：厳敦清、青島医学院付属病院産婦人科研究室、
郵便番号：２６６０３３
２２、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１０；１３）（１０ｐｔｅｒ→１０ｑ２４：：１３ｐ１２→１３ｐｔｅｒ； １３ｑｔｅｒ→１３ｐ１２：：１０ｑ２４→１０ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２９歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：張影如等、広東省広州市、中山医科大学付属一院神経科、
郵便番号：５１００８０
２３、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１１；１４）（１１ｐｔｅｒ→ｃｅｎ →１４ｐｔｅｒ；１１ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：王志勇、河南省 柘城県、柘城県人民病院遺伝室、
郵便番号：４７６２００
２４、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１１；２１）（１１ｐｔｅｒ→１１ｐ１１：：２１ｐ１１→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１１：：１１ｐ１１→１１ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：鄭軍等、陜西省西安市、陜西省婦人児童保健院医学遺伝実験室
、郵便番号：７１０００３
２５、核型：４６，ＸＹ，ｔ（１１；１５）（１１ｐｔｅｒ→１１ｑ１３：：１５ｐ１２→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１２：：１１ｑ１３→１１ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２３歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：楊瑞芳等、山東医科大学付属病院囲産医学センター 、
郵便番号：２５００１２
２６、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１２；１４）（１２ｐｔｅｒ→ｃｅｎ →１４ｐｔｅｒ；１２ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：韓維田等、遼寧省計画生育科研所優生研究室、
郵便番号：１１００３１
２７、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１３；１６）（１３ｑｔｅｒ→１３ｐ１１：：１６ｐ１１．２→１６ｐｔｅｒ；１６ｑｔｅｒ→１６ｐ１１．２：：１３ｐ１１→１３ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２７歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者： 安松蘭、遼寧省大連市、大連市産婦人科病院遺伝室、郵便番
号：１１００７８
２８、核型：４６，ＸＹ／４５，ＸＹ，ｔ（１３；１３）（１３ｑｔｅｒ→１３ｐ１２：：１３ｐ１２→１３ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３９歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学
研究室 郵便番号：４１００７８
２９、核型：４６，ＸＹ，ｔ（１４；１８）（１４ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３０歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：王素桂等、北京計画生育技術指導所、郵便番号：１００００６
３０．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１４；１５）（１４Ｐｔｅｒ→１４ｑ１３：：１５ｐ１３→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１３：：１４ｑ１３→１４ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学
研究室 郵便番号：４１００７８
３１、核型：４５，ＸＸ，ｔ（１５ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２７歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室
郵便番号：４１００７８
３２、核型：４６，ＸＹ，ｔ（１５；１８）（１５ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３０歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：任国慶等、北京市計画生育技術指導所、郵便番号：１００００６
３３、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１５；２０）（１５ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：王新等、湖南医科大学付属二病院産婦人科遺伝科室、
郵便番号：４１００１１
３４、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１５；２２）（１５ｐｔｅｒ→１５ｑ１１：：２２ｐ１３→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１３：：１５ｑ１１→１５ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２７歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：符生苗、海南省海口市、海南省人民病院遺伝室、
郵便番号：５７００１１
３５、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１５；２２）（１５ｐｔｅｒ→１５ｑ２２：：２２ｐ１１→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１：：１５ｑ２２→ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２９歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李牧尭等、新疆ウルムチ、新疆医学院医学遺伝室、
郵便番号：８３００５４
３６、核型：：４６，ＸＹ，ｔ（１６；２１）（１６ｐｔｅｒ→１６ｑ２１：：２１ｐ１１→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１１：：１６ｑ１２→１６ｑｔｅｒ）．
表現型：男、２９歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：張恵芳等、広東省計画生育科学技術研究所、
郵便番号：５１００８０
３７、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１８；２１）（１８ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｑｔｅｒ；１８ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｐｔｅｒ）．
表現型：女、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人児童病院遺伝室、
郵便番号：１２１０００
３８、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１８；２１）（１８ｐｔｅｒ→１８ｑ１１：：２１ｐ１２→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１２：：１８ｑ１１→１８ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：李修林等、遼寧省沈陽市、中国医科大学付属一院小児科遺伝室
、郵便番号：１１０００１
３９、核型：４５ ，Ｘ，ｄｉｃ（Ｙ；１３）（Ｙｐｔｅｒ→Ｙｑ１２００：：１３ｐ１１→ｃｅｎ→１３ｑｔｅｒ）
表現型：男、４歳、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室
郵便番号：４１００７８
４０、核型：４６，ＸＹ，ｔ（Ｙ；１５）（１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１２：：Ｙｑ１２→Ｙｐｔｅｒ）ｐａｔ．
表現型：男、新生児、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室
郵便番号：４１００７８
４１、核型：４５，Ｘ，ｐｓｕｄｉｃ（Ｙ，２２）（Ｙｐｔｅｒ→Ｙｑ１２０９：：２２ｐ１２→ｃｅｎ→２２ｑｔｅｒ）
表現型：男、表現型が正常な携帯者
資料の提供者：劉希賢等、湖北省武漢同済医科大学医学遺伝学研究室
郵便番号：４３００３０
上述の実例は核仁の組織区域が外源遺伝子を受け取れることだけでなく、外源遺伝子を正常に表現させることも証明されている。これも本発明の提供した遺伝子薬が血友病Ｂを治療する可能性を証明している。
【００３７】
二、毒性の試験
本発明の遺伝子薬の急性毒性の研究
一）、実験の目的
本発明が提供した遺伝子薬物の一次に静脈に与える薬による急性毒性の反応及び死亡状況を研究すること。
二）、実験の材料
ｉ． 動物
昆明種小鼠（ｎ＝４０）、体重：２０．４±１．１、雄雌が半分半分。すべての実験用動物及び飼料が中南大学湘雅医学院実験動物センターに提供された。該種の小鼠は湖南省医学実験動物管理委員会からの医学実験動物の合格証書を持っている。
ｉｉ． 薬物
本発明が提供した遺伝子薬。実験の前に無菌の水で１１．２５ｕｇ／ｍｌの濃度の注射液に調剤する。
三）、実験の方法
予試験：
実験用白い小鼠１０個、雄と雌が半分半分、尾の静脈から本発明が提供した遺伝子薬を注射する。この試験は人の薬量の１００倍、即ち４５０ｕｇ／ｍｌを用いても、何の毒性反応も発見しない。
正式試験：
遺伝子治療薬物の特徴によって、予試験に用いられた量で正式試験を行う。試験は二の組、即ち給薬組と空白対照組に分ける。試験組は本発明の提供した遺伝子薬を用い、量が４５０ｕｇ／ｋｇである（体重によると、成人の臨床日用量の１００倍である）。対照組は等量の蒸瑠水で尾の静脈に注射する（０．４ｍｌ／１０ｇ／回）。二つの組とも薬を与えてから動物の薬に対する反応を観察し、続いて１４日、動物の大小便、普段の活動の状況及び死亡の数を記録し、第１４日目に、全部の小鼠を解剖し、胸腔と腹腔の状況を観察する。
四） 、実験の結果
小鼠の急性毒性試験：
対照組の小鼠（ｎ＝２０）を１４日続いて観察し、異常な活動及び動物の死亡が発見されなかった。本発明が提供した遺伝子薬に処理された小鼠（ｎ＝２０）は二回薬を与えされたら、３０分後、疲労で寝る、さらに動かなくなるのである。続いて１４日観察すると、動物の摂食、大小便及び普段の活動にも異常なこと、死亡などが発見されなかった。生きるまま検査すると、実験組と対照組には著しい異常と差異がないものである。結果は表２に参照。
表２ 人源遺伝子ベクターＦＩＸの急性毒性実験の結果
四、 実験のまとめ
小鼠の人源遺伝子ベクターＦＩＸの静脈給薬量が体重による成人の日用量の１００倍であっても、死亡を及ぼさないことから、その急性毒性が非常に低く、静脈に薬を与えるのが安全で、臨床の応用に用いられることは表明されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は１２０ｋｂのＢＭＳＦのＦＩＳＨ定位図である。
【図２】図２は本発明が提供した一種の遺伝子ベクター−ＦＩＸ組換え体の構造図である（遺伝子ベクター配列のサイズ：１３９２８ｂｐ）；その中ｐＧＥＭ−７（１１０３３−１３９２８）：ベクターのコピーしたエレメント及び原核の篩い分けシステムである；ＴＫ（１−２８４０）：真核細胞のマイナスの篩い分け遺伝子、該遺伝子はＴＫプロモーターとＴＫｐｏｌｙＡ信号を用いる；Ｎｅｏ（４３４２−５９１０）：真核細胞のプラスの篩い分け遺伝子であり、該遺伝子はｓｖ４０プロモーターとｓｖ４０ ｐｏｌｙＡ 信号を用いる；ＦＩＸ（５９１１−８６７７）：該遺伝子はＣＭＶプロモーターとＢＧＨｐｏｌｙＡ信号を用いる；ＧＬＳ（２８４１−４３４１，８６７８−１１０３２）：治療遺伝子の引導配列；Ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ （５９１０）：目的遺伝子の挿入部位である。
【図３】図３は外源性ＦＩＸ治療遺伝子が陽性細胞のクロー二ングの中のＦＩＳＨ定位であり、該ベクターを通じて、ＦＩＸをＤ、Ｇ組染色体の短腕に定点に導入することは証明される。
【図４】図４は外源性ＦＩＸ陽性細胞のＷｅｓｔｅｒｎ結果であり、Ｆ３〜Ｆ２３が六つの別の陽性細胞株で、“−”が陰性対照である。
Claims (6)
- 血友病を治療する遺伝子薬は人類のＤ、Ｇ組染色体の短腕に肝心な生理機能のない相関遺伝子のＤＮＡ配列、或いは、該ＤＮＡ配列と相同性のあるＤＮＡ配列を治療遺伝子の引導配列の構造した遺伝子ベクター−ＦＩＸの組替え体を含む。
- 請求項１に記載の血友病Ｂを治療する遺伝子薬の特徴は、そのベクター−ＦＩＸ組替え体に配列表１の表したＤＮＡ配列があることにある。ＦＩＸ治療遺伝子の挿入部位は５９１０位である。
- 請求項１或いは２に記載の遺伝子薬の特徴は、その遺伝子薬の中に人体ｉｎ ｖｉｔｒｏ 細胞を含むことにある。該ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞には請求項１或いは２に述べた遺伝子ベクター−ＦＩＸ組替え体がある。
- 請求項１に記載の血友病Ｂを治療する遺伝子薬の調剤方法の特徴は下記の手順を含むことにある。
（１）人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕の上に肝心な生理機能と関わっていないＤＮＡ配列或いは該ＤＮＡ配列と相同性があるＤＮＡ配列を目的遺伝子の引導配列とし、遺伝子ベクターを構造する；
（２）ＦＩＸ治療遺伝子を上記の遺伝子ベクターに入れ、ベクター−ＦＩＸの組替え体を得る。 - 請求項４に記載の血友病Ｂを治療する遺伝子薬の調剤する方法は、その特徴が以下のことにある：
（１）治療遺伝子の引導配列が人類Ｄ、Ｇ組染色体の短腕に肝心な生理機能と関わっていない遺伝子のＤＮＡ配列からきた。その長さは３．８ｋｂであり、ＴＫをマイナスの篩い分け遺伝子とし、プラスの篩い分け遺伝子――Ｎｅｏ遺伝子を治療遺伝子の引導配列の１５００位に挿入し、それを１．５ｋｂと２．３ｋｂの両腕に分けさせ、遺伝子ベクターを構造する。
（２）ＦＩＸ治療遺伝子の挿入部位は５９１０である。 - 請求項４或いは５に記載の血友病Ｂを治療する遺伝子薬の調剤する方法は、その特徴が取られたベクター−ＦＩＸの組替え体を人体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞に入れることにある。
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