WO2002034296A1

WO2002034296A1 - Nouvel agent de therapie genique permettant de traiter l'hemophilie b et son procede de preparation

Info

Publication number: WO2002034296A1
Application number: PCT/CN2001/001291
Authority: WO
Inventors: Jiahui Xia
Original assignee: Jiahui Xia
Priority date: 2000-08-30
Filing date: 2001-08-29
Publication date: 2002-05-02
Also published as: JP2004512313A; EP1316319A1; EP1316319B1; AU2002223402A1; CN1302664A; US7361639B2; ATE453401T1; CN1148228C; US20040038919A1; EP1316319A4; DE60140950D1

Description

治疗血友病 B的基因药物及其制备方法本发明涉及治疗血友病 B的基因药物及其制备方法。

血友病 B又称乙型血友病，是一种凝血 IX因子（FIX)缺陷引起的 X连锁隐性遗传的出血性疾病，在男性中发病率为 1/30000。人 FIX蛋白的分子量为 56KD, 为包括 415个氨基酸残基的单链糖蛋白，从 N -端的酪氨酸开始，可分为 4个不同的结构区： Gla区（T -羧基谷氨酸区）、生长因子区、激活肽区和催化区（或丝氨酸蛋白区）。人 FIX主要在肝脏合成，其初始翻译产物含有 N-端的 46个氨基酸的前导序列，经去前导肽、糖基化和依赖维生素 K的 T -羧化等修饰作用后成为出现在血液中的成熟 FIX。 FIX在血液中以酶原的形式存在，经 FXIa或 FVII-组织因子复合物激活后形成具有蛋白酶活性的活化 FIX (FIXa) 。正常人血浆中 FIX含量为 5 g/ml，其活性的半衰期为 24小时 (参见 Chuah MKL, DesireCollen & T. VandenDriessche. Gene therapy for hemophilia. J Gene Med 2001 ; 3 :3-20)。

FIX是内源性凝血级联反应过程中必需的蛋白因子，当 FIX与调控蛋白 FVIII形成复合物后，使内源性凝血级联反应速度成千倍增加，至使凝血过程仅在几分钟内即可完成。因此，当人体内缺乏 FIX时，便表现为自发性或微外伤后出血不止，严重者可因关节出血而导致关节变形和残废或因内脏或颅内出血而死亡。编码 FIX蛋白的基因于 1982年被克隆，它位于 Xq27. 1带，共 8个外显子，编码区全长 1. 383kb,编码 415 个氨基酸。（Choo H, Gould KG, Rees DJ， et al. Nature 1982 ; 299 : 178-180； Kurachi K, Davie EW. Proc Natl Acad Sci USA 1982 ; 79 :6461-6464. ) 成人的 FIX蛋白分子量为 56KD，在正常血桨中含量为 5 g/ml ( Kaufman RJ. Human Gene Therapy 1999 ; 10 : 2091- 2107. ) 。血友病 B 的临床治疗仅限于蛋白替代治疗即靠输血，或补充 FIX浓缩制剂。但由于 FIX在人体内半衰期仅 24小时，患者需要反复输血或血液制品来维持生命，不仅要承受沉重的经济负担，而且还面临艾滋病病毒、乙肝病毒和疯牛朊病毒感染的威胁。

如何将正常 FIX基因导入患者体内以替代缺陷的 FIX基因是血友病

B基因治疗中遇到的最关键的问题。目前用于 FIX基因治疗研究的载体主要为病毒性载体，如逆转录病毒载体，腺病毒载体及腺相关病毒载体。 1. Kay等用 RV载体对一只血友病 B狗进行了基因治疗实验。（参见 Kay MA, Rothenberg S， Landen CN， et al. In vivo gene therapy of hemophilia B: sustained partial correction in factor IX deficient dogs. Science 1993 ; 262 : 117-119)研究表明用 RV转运基因在大型动物的肝细胞中有可能相对地长期表达，但表达量低。在小鼠的研究中也发现小鼠的肝细胞仅 0. 被 RV转化，（参见 Kay MA, Li QT, Liu JJ， et al. Hepatic Gene Therapy： Persistent expression of human a 1 -antitrypsin in mice after direct gene delivery in vivo. Hum Gene Ther 1992 ; 3 : 641-647 )这主要是因为 RV不能整合非分裂细胞。因此在以肝细胞为靶细胞进行基因治疗时，必须实施部分肝脏切除手术以诱导剩余肝组织的细胞分裂；而 RV 的体内转化效率较低，体外培养细胞再移植效率也不高，致使低水平的 FIX表达不能完全纠正血友病 B的表型。 (参见 Lieber A. Peters MJ， Gown A, et al. A modified urokinase plasminogen activator induces liver regeneration without bleeding. Hum Gene Ther 1995 ; 6 : 1029-1037 ; Bowles NE， Eisensmith RC, Mohuiddin , et al. A simple and efficient method for the concentration and purification of recombinant retrovirus for increased hepatocyte transduction in vivo. Hum Gene Ther 1996 ; 7 : 1735-1742 ； Bosch A, McCray PB， Jr. Chang S顯， et al. Proliferation induced by keratinocyte growth factor enhances in vivo retroviral— mediated gene transfer to mouse hepatocytes. J Clin invest 1996 ; 98 : 2683-2687 ) 逆转录病毒载体虽能稳定地整合到靶细胞的基因组中，但其只能感染分裂细胞，且存在插入诱变等安全隐患；

2. 重组腺相关病毒（rMV)载体在血友病 B 的基因治疗方面是病毒载体中比较有效的，它不仅能使 FIX cDNA在受体中有效并稳定表达，而且由于载体中不含病毒基因，不易引起细胞毒性 T淋巴细胞反应而受到许多研究者的青睐（参见 Jooss K, Yang Y, Fisher KJ, et al. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J Virol 1998 ; 72 : 4212-4223) 。 Kay及同事对小鼠及患血友病 B狗的临床前研究 (参见 Kay MA, Manno CS， Ragni MV, et al . Evidence for gene transfer and expression of factor IX in haemophilia B patients treated with an AAV vector. Nat Genet 2000 ; 24: 257-261 ) 。但 MV滴度低，制备复杂，不能大量扩增，要用于人类基因治疗，尚有待进一步研究。

近年来非病毒载体如脂质体、微胶囊等也得到了开发和利用。（参考 Hortelano G， Xu N， Vandenberg A, et al. Persistent delivery of factor IX in mice : gene therapy for hemophilia using implantable microcapsules. Hum Gene Ther 1999 ; 10 (8) : 1281— 1288.

因此近十年来，尽管在血友病 B 的基因治疗方面采取了许多改进措施，但至今仍未得到安全的、稳定的、一次性治疗的基因药物，关键问题就在于还没找到一种安全性好、无免疫原性、能高效转化靶细胞并在靶细胞中长期稳定表达治疗基因的载体。

本发明的目的是提供一种安全、能使治疗基因在靶细胞中稳定表达的治疗血友病 B的基因药物。

本发明的另一目的是提供一种制备上述基因药物的方法。

本发明提供的治疗血友病 B的基因药物，含有以人类 D、 G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的 DNA序列或与该 DNA序列具有同源性的 DNA序列作为治疗基因的引导序列所构建的基因载体 -FIX重组体。

本申请人发现 2个携带额外双随体小染色体（BM) 而表型正常的家系，该小染色体分别在 2个家系的 2代人和 3代人之间稳定遗传，且对人体无任何危害。因此本发明人提出了分离该小染色体原件、组装人源基因载体的方案。国内外至今已报导这类家系 17个，但没有人提出利用该小染色体作为基因载体的类似设想。在研究中申请人用 FISH技术査明，该小染色体来源于人的0、 G组染色体短臂即 13、 14、 15、 21、 22号染色体短臂，由于 D、 G组染色体短臂为核仁组织区，富含核糖体 DNA(rDNA), 该区域不但在人群中存在着长度不同的各种多态（即含 rDNA的量有多有少），而且在细胞分裂间期该区域基因转录十分活跃，因此，本发明人推测如果能从 BM克隆出具有特异性的 DNA片段，并以其作为治疗基因的引导序列，将治疗基因定点导入人体 D、 G组染色体短臂核仁组织区，应该有较高的、稳定的和无害的表达。后续的实施例对此作出了有力的证明。

本发明人首先利用显微切割的方法，构建了小染色体特异性的 _PUC19 文库并从中筛选得到单拷贝片段，该片段经荧光原位杂交 (FISH)证实来源于小染色体和0、 G组染色体短臂，进一步以此单拷贝片段为探针筛选人 PAC基因组 DNA文库，获得了约 120kb的小染色体特异性 DNA片段（BMSF) ，并经 FISH证实来源于小染色体和 D、 G组染色体短臂（图 1 ) 。测序分析 BMSF的序列特性，未发现与重要生理功能相关的基因，因此证明，以此为靶位点是安全的。本发明进一步利用 120 kb或从中选择更小的具有特异性的 DNA片段，构建基因载体。

因此本申请人认为基因引导序列选自人类 D、 G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的 DNA序列或与该 DNA序列具有同源性的 DNA 序列作为治疗基因的引导序列是符合发明目的的。由此构建的基因载体具有特异性，能将治疗基因定点导入到人 D、 G组染色体短臂上，并高效稳定表达。

在所制备的药物中，还可含有有利于治疗基因导入宿主细胞的辅助成份，如脂质体、对宿主细胞有特异性的蛋白质。

在获得治疗基因引导序列的基础上，按现有技术可构建各种形式的载体。构建载体和将治疗基因装入载体的方法是通常的方法。

本发明实施例中具体给出了序列表 1 表示的载体 -FIX重组体，其中 3.8kb引导序列来源于 BMS ，利用 TK作为负筛选基因，将正筛选基因 Neo基因插入治疗基因引导序列中的 1500位，使其分为 1.5kb和 2.3kb两臂， FIX治疗基因的插入位点为 5910位。治疗基因的插入有正反向之分，本发明实施例中为反向插入。图 2表示了该载体 -FIX重组体的结构图。

本发明实施例中具体给出了从人 D、 G组染色体短臂上克隆得到的具有特异性的 3.8kb DNA序列作为治疗基因引导序列，并构建载体的过程。所得到基因载体 -FIX重组体篮直已于 2000年 9月 29日向中国典型培养物保藏中心提出保藏（中国.武汉武汉大学校内，邮政编码: 430072),其保藏号是： CCTCC M20003 保藏人对保藏物指定的分类命名为 Escherichia coli JM109 /JH-4/pNS-FIX。

得到上述携带治疗基因的载体后，可进一步将其导入人离体细胞中，，如皮肤成纤维细胞，造血干细胞等，同样可作为治疗血友病 B的基因药物。所用的导入方法是现有的技术，本发明实施例进行了举例说明。

这样，将含上述转化后的人离体细胞或含有承载有治疗基因的载体的基因药物通过皮下包埋、电穿孔或静脉注射等方式导入患者体内或将载体 -FIX重组体用脂质体包裹直接注入患者体内，使治疗基因能在患者体内长期稳定表达，以纠正缺陷基因导致的临床症状。

基因治疗的有效性试验-

(一）体外实验

我们将人凝血因子 IX (FIX)重组载体线性化并以电穿孔的方法导入 HT1080细胞，经正、负筛选得到阳性细胞株，以 FIX跨内含子引物 PCR 证实含外源性基因，用引物 pNSNeo和 876-7R扩增 FIX阳性克隆细胞的 gDNA, 均可见 2. 3Kb的特异性扩增片段，测序证实为定点整合。经 FISH 检测， FIX基因导入的 2个阳性细胞株在 13、 21号染色体短臂有荧光信号，表明为定点插入。阳性转染细胞培养基中 FIX活性测定结果显示： FK 活性为 3. 56μ_β/10⁶细胞 /24小时，细胞经体外培养传代 449天后表达十分稳定。表达产物经 Western杂交证实。

(二）体内试验

我们构建的打靶载体是人源载体，人和动物存在种属差异，特别对于基因药物来说更加如此。如果在动物体内进行打靶实验，不一定出现预期的定点整合，不适宜评价该载体的有效性和稳定性。所以不必进行动物的体内实验。

对本发明提供的基因药物进行毒性实验：小鼠尾静脉给药， 450ug / Kg, 按体重计算相当临床成人一次静脉给药量（4.5ug / Kg) 的 100倍。实验结果表明该药静脉给药安全，该药物毒性。

由于本发明提供的治疗血友病 B的基因药物中，以人类 D、 G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的 DNA序列或与该 DNA序列具有同源性的 DNA序列作为治疗基因的引导序列，来构建基因载体。毫无疑问，由其构建的基因载体能将其上承载的治疗基因定点导入宿主细胞中特定靶位，并且由于该特定靶位的 DNA片段不具有重要的生理功能相关的基因，因此治疗基因的导入是安全的。

综上所述，本发明提供的治疗血友病 B 的基因药物中由于采用了人源基因引导序列来构建承载治疗基因的载体，因而

( 1 ) 治疗基因表达稳定性好：由于承载治疗基因的载体能将治疗基因定点插入到人体细胞的 D组和 G组染色体短臂上，所以使治疗基因随染色体而稳定遗传；

(2) 安全性好：由于在治疗基因导入的靶位点不含有与重要生理功能相关的基因，证明该靶位点安全，同时 FISH证实载体能将治疗基因定点插入细胞中安全的靶位点（图 3 ) ，排除了随机插入突变，也不存在野生型病毒的危害。所以治疗基因在靶位点的表达是安全的。虽然本发明没有提供基因治疗的临床证明，但申请人及国内外研究者发现的实例从另一角度证明了其安全性；

(3 ) 表达效率高：第一，由于本发明承载治疗基因的载体含有来源于 D、 G组染色体短臂的引导序列，因此对应地在人体细胞中存在 10个靶位点，插入效率比其它载体至少高 5-10倍；第二，由于引导序列来自于基因转录活跃的 D、 G组染色体短臂，引导进入靶位点的治疗基因能得到高效表达；

(4) 无免疫原性：由于该载体为人源性的，因此用于人体不会产生免疫原性。图 1是 120kb BMSF的 FISH定位图；

图 2是本发明提供的一种基因载体 -FIX重组体的结构图（基因载体序列全长： 13928bp) ；其中 pGEM -7 ( 11033—13928) ：载体复制元件及原核筛选系统； TK ( 1—2840) ：真核细胞负筛选基因，该基因使用 TK启动子和 TK polyA信号； Neo (4342— 5910) ：真核细胞正筛选基因，该基因使用 sv40启动子和 sv40 polyA信号； FIX(5911— 8677): FIX治疗基因，该基因使用 CMV启动子和 BGH polyA信号； GLS (2841 —4341 , 8678—11032) ：治疗基因引导序列； Cloning site (5910) ：治疗基因插入位点。

图 3是外源性 FIX治疗基因在阳性细胞克隆中的 FISH定位，证明该载体能将 FIX定点导 A D、 G组染色体短臂；

图 4是 FIX阳性细胞 Western结果， F3〜F23为 6个不同阳性细胞株， "一"示阴性对照。

本发明提供的实施例只是实现本发明的一种方式，不能视为对本发明的限制。实施例 1

本发明提供的基因引导序列的制备：

1.基因引导序列 PAC克隆的获得

1.1显微切割、 PCR、微克隆构建 BM特异性 pUC19文库（Deng H-

X, Yoshiura K， Dirks RW, et al. Hum Genet 1992, 89:13.)

1.2 BM特异性单拷贝 DNA的获得及鉴定

(1)菌落点阵膜的制备：在两张尼龙膜上划好 14X14个方格，标记为 A、 B, 分别置于 2个有固体 LB的平皿中，从文库皿中随机挑取白色克隆分别点到两张膜坐标相同的方格内，共挑 14X12个，第 13行点 lOOng 单拷贝 DNA做阳性对照，第 14行点 lOOng gDNA做为阴性对照，两个皿分别置 37°C培养 10〜12小时，其中 B膜置 4°C保存，将 A膜从皿中取出，分别在用以下溶液浸湿的滤纸上处理， 10%SDS， 5 分钟， 0.5N NaOH/1.5M NaCl, 3 分钟， 1.5M NaCl/0.5M Tris · HC1, 3 分钟， 2X SSC/0.2MTris - HCl, 10分钟， 80°C真空干燥 2小时， 37°C保存待用。

(2) gDNA探针的制备

取 50~75ng gDNA加无菌水至 llml， 100°C煮沸变性 10分钟，以下列体系做随机引物标记反应：

2mMdNTP(dATP~) 3μ1

primer mixture 2μ1

Klenow酶 Ιμΐ

-³²P-dATP 3μ1

点离混匀， 37°C浮浴 30分钟。加 8μ1 stopmixture, 过 G-50柱纯化探针，取 1/100测液闪值。

(3)杂交：菌落点阵膜置于 2XSSC中浸泡 10分钟，轻轻拭去膜表面的菌落碎片， 65°C， 5ml杂交液预杂交， 30分钟以上。根据液闪值，按 1.2X10⁶cpm/ml杂交液的量取探针液于 100°C煮沸变性 10分钟，加入 5ml 新鲜杂交液，与菌落点阵膜 65 杂交 12小时以上。按以下条件洗膜： 2XSSC/0.1% SDS, 室温 10分钟， 2XSSC/0.1% SDS， 65°C10分钟， 0.1XSSC/0.1% SDS, 65°C10分钟， -70°C放射自显影，杂交信号无或弱的初步认为是单拷贝。

(4)测序， Southern杂交鉴定：在 B膜上相应位置挑取无杂交信号的克隆，小量扩增，抽提质粒 DNA测序，与 GenBank数据库比较，无相似性的为单拷贝。最后 EcoRI酶切分离插入子 DNA, 并以随机引物法，用 a -³²P-dATP标记并与 EcoRI消化的 gDNA转移尼龙膜杂交，方法同上， 1条或 2条杂交带的为单拷贝。

1.3 BM及 D、 G组染色体短臂特异性 PAC克隆的获得及鉴定

(1)筛选人 PAC gDNA文库获得阳性克隆编号

利用 a -³²P-dATP随机引物法标记 260bp的单拷贝探针 P8-7—G-50 柱（中等粒度）纯化→4°C待用一PAC膜 7张用 2 X SSC浸泡 10分钟一 55°C预杂交 3小时→探针 100°C变性 10分钟一以 4.6 X 10⁵cpm/ml的量加入 50ml购买的杂交液中，与 PAC膜于 65 °C杂交 1小时一洗膜： 2 X SSC, 室温 10分钟一次， 2 X SSC/0.1% SDS 65 °C 10分钟洗 2次―上 X 光片， -70°C放射自显影 12小时一冲洗 X光片一按说明书方法读取阳性克隆编号。

(2)从 5个不同的板上随机挑选阳性克隆编号，购买 PAC克隆。

1.4 PAC DNA与中期相细胞 FISH杂交，证实来源于 D、 G组染色体短臂，如图 1所示。 '

上述实验方法参见《分子克隆实验指南》 J.萨姆布鲁克等，第 2版, 1989 冷泉港实验室出版。（J. Sambrook et al Molecular Cloning . Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)

2. 基因引导序列 DNA的获得

主要材料： β -agarose(Bio-Labs) Notl Agarose

① Not I酶切 PAC169质粒；

②通过 PFGE分离约 120Kb大小的插入子 DNA;

脉冲电泳条件：电极缓冲液： 0.5 X TBE, High stregth Analytical Grade Agarose: (Bio-Rad, Low Melting point Agarose LMP) 1%、 Switch Time: 2 秒→15秒电泳时间： 18小时，电压： 6V/cm，角度： 120。温度： 14°C

③电泳结束后，用 EB染色（0.2 g/ml) 30分钟，根据 Marker指示，用无菌小刀片切下约 3.8kb(120kb)的条带。

④切下的胶块用 β -agarase处理，乙醇沉淀。

实施例 2

本发明提供的基因载体 -FIX重组体，即治疗血友病 B的基因药物的制备： 1. 基因载体的构建及治疗基因的导入

1.1载体的构建

1.1.1用 Nsil和 Stul (平端酶）酶切 PAC DNA，普通琼脂糖凝胶回收 3.8kbDNA片段，电洗脱纯化；

1.1.2用 Hindlll酶切 pGEM-TK载体 DNA， Klenow酶补平，产生一平头末端；

1.1.3 pGEM-TK/Hindlll补平产物进一步用 Nsil酶切；

1.1.4 3.8kb/NsiI+StuI纯化产物与 pGEM-TK/HK+Nsil酶切产物于 16°C 连接 17小时；

1.1.5连接产物转化 JM109感受态细菌，氨苄皿 37°C培养 18小时；

1.1.6随机挑取单克隆，用 Nsil及 N el双酶切鉴定阳性克隆。

1.1.7用 Xbal和 hel双酶切 _PCDN-GPR质粒获得 Neo/Xbal+Nhel 1.1.8将 Neo/Xbal+Nhel与 pGEM-TK-3.8kb/NheI连接,构建成 pNS2 基因载体.

1.2 FIX的导入

1.2.1将 FIX (CDS)克隆至 pcDNA 3.1(-);

1.2.2设计引物 TPCF和 TPCR扩增 FIX基因及表达元件（CMV启动子和 BGH poly A信号），使其两端装上 Avrll酶切位点;引物序列为：

TpcF: ATgCATCCTAggggAggTCgCTgAgTAgTg

Avrll

TpcR: TgCATgCCTAggTACCCCCTAgAgCCCAg

Avrll

1.2.3用 Avrll酶切 FIX基因及表达元件（CMV启动子和 BGH poly A 信号）并与 Nhel酶切的 pNS2载体连接。

1.2.4连接产物转化 JM109大肠杆菌,获得含载体 -FIX重组体的董旌

(保藏号为 CCTCC M200031)。

上述实验方法详见《分子克隆实验指南》 J.萨姆布鲁克等，第 2版， 1989 冷泉港实验室出版。（J. Sambrook et al. Molecular Cloning . Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)

2.基因载体 DNA的抽提

2.1 材料：

2.1.1QIAGE Plasmid Maxi Kit 2.1.2培养基：液体 LB

Trypton 5g

Yeast extract 2.5g

Nacl 2.5g

ddH20 定量至 500ml

高压蒸汽灭菌

2.1.3氨苄青霉素（Amp) ： lOOmg/ml ( 1000 X )

2.2方法：

I) 挑取阳性单克隆至 3ml LB(Amp+) 37°C， 250rpm培养 1小时 2) 取 ΙΟΟμΙ上述初级培养物置 100ml LB (Amp+)中， 37°C， 250rpm 培养 16小时

3) 于 4°C， 6000g离心 15分钟收获细菌

4) 10ml Buffer PI重悬菌体

5) 加入 10ml Buffer P2，轻柔地倒转 6次混匀，室温 5分钟。

6) 加入 10ml冰上预冷 Buffer P3,轻柔倒转 6次混匀，冰上 20分钟。

7) 4°C， 20000g离心 30分钟。

8) 迅速将上清转移至另一 40ml高速离心管， 4°C， 20000xg再次离心 15分钟

9) 10ml Buffer QBT平衡 QIGEN tip 500

10)将上清转移至 QIGAE tip 500过柱

I I) 2 X 30ml Buffer QC洗柱

12) 15ml Buffer QF洗脱，收集洗脱液

13)洗脱液加（0.7倍体积） 10.7ml异丙醇，混匀

14) 15000g, 4°C,离心 30分钟

15)去上清， DNA沉淀加入 5ml 70%乙醇洗涤， 15000g， 4"C 离心 10 分钟.

16)去 70%乙醇，空气中干燥 10分钟适量 TE溶解 DNA沉淀所得到的基因载体 -FIX重组体已于 2000年 9月 29日向中国典型培养物保藏中心提出保藏 (中国.武汉武汉大学校内,邮政编码: 430072), 其保藏号是： CCTCC M200031 c 该保藏物的名称是： Escherichia coli

实施例 3 利用实施例 2得到的基因载体 -FIX重组体，将 FIX治疗基因导入宿主细胞，并在宿主细胞中表达，导入的 HT1080细胞株已于 2000年 8月 18日向中国典型培养物保藏中心提出保藏 (中国 .武汉武汉大学校内 ,邮政编码: 430072),其保藏号是： CCTCC C200005。该保藏物的名称是:人纤维肉瘤细胞系，为人的转基因细胞。保藏人对保藏物指定的分类命名为: 人纤维肉瘤细胞系 /JH-1/FIX。

1.材料：

1.1细胞： HT1080

培养基：高糖 DMEM+10% FBS (HT1080) EMEM+10%FBS 1.2电穿孔仪： Bio-Rad公司

2.方法： '

1) 细胞于 75cm²培养瓶内传代后长至 70%~80%满底

2) 收获细胞，用 HeBs缓冲液洗 2次，计数细胞

3) 15000rpm, 4°C离心 10分钟

4) 适量 HeBS重悬，使细胞浓度为 10⁶~10⁷/ml

5) 取 0.4ml电击杯，每杯加细胞悬液 0.8ml，载体 DNA lO g左右

6) 用电穿孔仪进行电击，电击条件设定为电压 260V, 电容 550μΡ, 电击时间一般为 11〜13毫秒。

7) 电击细胞转入 75cm²培养瓶中，加 14ml含双抗的培养基， 37°C， 5% C02中培养， 24〜48小时。

8) 培养基内加入终浓度 300μ1的 G418进行筛选， 2~3天换液一次，换液时重新加 G418, 同时用正常细胞做对照

9) 约 7〜10天后正常细胞全部死亡，计数转染细胞内存活克隆数，改用维持量 G418 15 μ^πύ

10)转染细胞继续用终浓度为 500ng/ml的 GCV进行筛选

1 1) 7〜10天大部分克隆死亡，剩余存活细胞改用维持量 GCV 250μ_β/ιη1 或不加经过筛的细胞长至 70〜80%满底后，测定转移基因的表达活性。

3. 结果

利用该载体将 FIX基因用电穿孔的方法导入 HT1080细胞，经正、负筛选得到阳性细胞株， FISH证实为定点插入（图 3 ) 。

FIX活性由阴性对照的低于 0.1_μδ/πι1升高到 4.27 g/ml，而且转化后 144天表达量仍为 3.15 g/ml，见表 1。其表达产物通过 Western杂交证实（图 4) 。

表 1 FIX活性测定：（ g/10⁶细胞 /24小时)

转化后天数克隆 F23

35天 4.27

72天 4.39

100天 4.6

111天 3.95

139天 4.0

144天 3.15

449天 3.56 安全性证明一、在人群中存在的安全性实例：

从 1973年申请人从事人类与医学细胞遗传学研究以来，所发现和鉴定的来自全国 189个实验室的 470位临床细胞遗传学工作者所申报的 732 种世界首报核型中，有 41种核型涉及 D、 G组染色体短臂，但不论易位到 D、 G染色体短臂的片段来源于 1-22号哪一号染色体，或源于同一号染色体的片段长短各异，所含基因从 1个到上千个，而携带者本人的表型都是正常的，说明易位到 D、 G染色体短臂的基因能正常表达，据此，我们将 D、 G组染色体短臂作为基因治疗的靶位点应该是安全的。

1、核型： 46, XX, t(l;12;22;15;ll;8) (lqter- lpll： :8p23→8pter； 12pter→ 12qll::lpll→ lpter; 22qter→ 22pll: :12qll→ 12qter; 15pter→ 15ql5: :22pll - 22pter; llpter - llq21 : : 15ql5→ 15qter ; 8qter→8p23:： llq21— llqter) ·

表型：女， 28岁，为表型正常的携带者

资料提供者：吴素彬，广东省广州市，中山医科大学附一院妇产科细胞遗传室，邮政编码： 510080

2、核型： 46， XY, t (1； 13) (lpter→ lq32：： 13pll→ 13pter； 13qter→ 13pll: :lq32→lqter).

表型: 女， 24岁，为表型正常的携带者

资料提供者：肖晟，哈尔滨医科大学生物教研室，邮政编码： 150086 3、核型： 46， XX， t(2;15) (2pter→cen→15qter; 2qter→cen→15pter) . 表型：女， 26岁，为表型正常的携带者

资料提供者：郭裕萍等，江西省南昌市，江西省妇产科医院细胞遗传室，邮政编码： 330006

4、核型： 46， XY, t(2;21) (2pter→cen- 21pter; 2qter→cen— 21qter) . 表型：男， 32岁，为表型正常的携带者

资料提供者：康过秦等，山西省太原市，山西医学院附二院遗传研究室，邮政编码： 030001

5、核型： 46， XY， t(3;22) (3qter→cen→22pter； 3pter→cen→22pter) . 表型：男， 26岁，为表型正常的携带者

资料提供者：高永，山东省滨州市医学院毒理室，邮政编码： 256603

6、核型: 46， XY, t(3;22) (3pter→cen→22qter； 3qter→cen→22pter) . 表型：男， 29岁，为表型正常的携带者

资料提供者：石化金等，辽宁锦州市妇婴医院遗传室，邮政编码： 121000 7、核型： 46， XX, t(4;15) (4qter→4pl3:： 15pl3→15pter； 15qter— 15pl3: :4pl3→4pter).

表型：女， 28岁，为表型正常的携带者

资料提供者：周玲等，湖北省武汉市，武汉市儿童医院遗传实验室，邮政编码： 430016

8、核型： 6, XY, t(4;21) (4qter→4pl5::21pll— 21pter;21qter— 21pll: :4pl5→4pter).

表型：男， 25岁，为表型正常的携带者

资料提供者：徐竞芳等，上海市第六人民医院遗传室，邮政编码： 200000

9、核型： 46, XY, t (4； 14) (4pt er→ 4q31：： 14pl 1→ 14pter； 14qter→ 14pll: :4q31→4qter).

表型：男，为表型正常的携带者

资料提供者：周明君等，河志省许昌市中心医院，邮政编码： 161000

10、核型： 46， XY, t(4;14) (4pter→4q35: :14pll→14pter; 14qter→ 14pll: :4q35→4qter).

表型：男， 27岁，为表型正常的携带者

资料提供者：张秀泉等，广东省佛山市，佛山市妇幼保健院，邮政编码: 528000

11、核型： 46， XX, ΐ (5； 22) (5pt er - 5ql3： : 22pl 1→ 22pt er； 22qt er→ 22pll : : 5ql3→5qter) .

表型：女， 32岁，为表型正常的携带者

资料提供者：曹建萍，河南安阳市妇幼保健院遗传室，邮政编码： 455000

12、核型： 46， XY, t (6 ; 22) (6pter- cen6→22qter； 6qter→cen22→ 22pter)

表型：男， 25岁，为表型正常的携带者

资料提供者：祝新霞等，山东省泰安市，山东泰安第 88 医院妇产科细胞遗传室，邮政编码： 271000

13、核型: 46 , XY, t (6； 22) (6qter→6p21：： 22pl 1. 2→22pter； 22qter →22pll. 2 : : 6p21— 6pter) .

表型：男， 33岁，为表型正常的携带者

资料提供者：杨兰青，山东省滨州市滨州医学院附属医院妇产科，邮政编码： 256603 14、核型： 45, XX, t (7； 21) (7qter→7p22：： 21pl2→21qter) .

表型：女， 23岁，为表型正常的携带者

资料提供者：孙吉庆等，湖北省武汉市，湖北省武汉市儿童医院医学遗传实验室，邮政编码： 430016 15、核型： 46， XY/46, XY, t (7； 14) (7pter→ 7ql 1：： 14pl 1→ 14pter； 14qter→14pll : : 7qll→7qter)

表型：男， 28岁，为表型正常的携带者

资料提供者：李麓芸、夏家辉等，湖南省长沙市，湖南医科大学医学遗传学研究室，邮政编码： 410078

16、核型： 46， XY, t (8； 14) (8qter→8p21：： 14pl2- 14pter； 14qter→ 14pl2 : : 8p21→8pter)

表型：男， 27岁，为表型正常的携带者

资料提供者：石化金等，辽宁锦州市妇婴医院遗传室，邮政编码： 121000

17、核型： 46, XY, t (9 ; 14) (9pter→cen→14pter； 9qter→cen→14qter) 表型：男， 28岁，为表型正常的携带者

资料提供者：程秋云等，衡阳医学院附一生殖医学研究室，邮政编码： 421001 18、核型： 46， XX, t(9;22) (9pter- 9pl3: :22pl2→22pter ; 22qter→ 22pl2：： 9pl3→9pter) mat

表型：女， 31 岁，其母、 1妹、 1弟、 1子具有相同核型，同为表型正常的携带者

资料提供者：李麓芸，夏家辉等，湖南医科大学医学遗传学研究室，邮政编码： 410078

19、核型： 46， XX， t(9;14) (9pter^9ql2:： 14pl2→14pter; 14qter→ 14pl2: :9ql2→9qter)

表型：女， 32岁，为表型正常的携带者

资料提供者：孙艳阳等，黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学生物教研室，邮政编码： 150086 20、核型： 46, XX， t(9;15) (9pter→9q21：： 15pl2→15pter； 15qter— 15pl2: :9q21— 9qter)mat.

表型：女， 36岁，为表型正常的携带者

资料提供者：朱桂珍等，山东省泰安市，山东泰安第 88 医院妇产科细胞遗传室，邮政编码： 271000

21、核型： 46， XX, t(10;13) (10pter→10q24:： 13pll→13pter； 13qter →13pll::10q24→10qter).

表型：女， 28岁，为表型正常的携带者

资料提供者：严敦清，青岛医学院附属医院妇产科研究室，邮政编码： 266003

22、核型： 46， XX, t(10;13) (10pter→10q24:： 13pl2→13pter； 13qter →13pl2: :10q24→10qter).

表型：女， 29岁，为表型正常的携带者

资料提供者：张影如等，广东省广州市，中山医科大学附一院神经科，邮政编码： 510080

23、核型： 46， XX， t(ll;14) (llpter→cen→ 14pter； llqter→cen→ 14qter)

表型：女， 2岁，为表型正常的携带者

资料提供者：王志勇，河南省柘城县，柘城县人民医院遗传室，邮政编码： 476200

24、核型： 46， XX, t(ll;21) (llpter-llpll： :21pll-21pter； 21qter →21pll::llpll— llpter).

表型：女， 26岁，为表型正常的携带者

资料提供者：郑军等，陕西省西安市，陕西省妇幼保健院医学遗传实验室，邮政编码： 710003

25、核型： 46， XY, t (11； 15) (llpter→llql3:： 15pl2-15pter； 15qter →15pl2::llql3— llqter)

表型：男， 23岁，为表型正常的携带者

资料提供者：杨瑞芳等，山东医科大学附属医院围产医学中心，邮政编码： 250012

26、核型： 46， XX， t(12;14) (12pter→cen→14pter; 12qter→cen— 14qter) ,

表型：女， 28岁，为表型正常的携带者

资料提供者：韩维田等，辽宁省计划生育科研所优生研究室，邮政编码： 110031

27、核型： 46， XX， t(13;16) (13qter→13pll： :16pll.2→16pter; 16qter — 16pll.2:: 13pll→13pter).

表型：女， 27岁，为表型正常的携带者

资料提供者：安松兰，辽宁省大连市，大连市妇产医院遗传室，邮政编码： 110078

28、核型： 46, XY/45, XY, t (13； 13) (13qter→13pl2：： 13pl2→13qter) . 表型：男， 39岁，为表型正常的携带者

29、核型： 46， XY, t(14;18) (14pter→cen- 18pter； 14qter→cen→ 18qter)

表型：男， 30岁，为表型正常的携带者

资料提供者：王素桂等，北京市计划生育技术指导所，邮政编码： 100006

30、核型： 46， XX， t(14;15) (14pter→14ql3: :15pl3→15pter; 15qter — 15pl3::14ql3→14qter)

表型：女， 28岁，为表型正常的携带者

资料提供者：李麓芸，夏家辉等，湖南省长沙市，湖南医科大学医学遗传学研究室，邮政编码： 410078 31、核型： 45， XX, t(15qter- cen→22qter).

表型：女， 27岁，为表型正常的携带者

资料提供者：夏家辉等，湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室，邮政编码： 410078

32、核型： 46， XY, t(15;18) (15pter→cen→18pter; 15qter→cen→ 18qter) .

表型：男， 30岁，为表型正常的携带者

资料提供者：任国庆等，北京市计划生育技术指导所，邮政编码： 100006

33、核型：46， XX， t(15;20) (15pter→cen→2pter； 15qter→cen→2qter) 表型：女， 26岁，为表型正常的携带者

资料提供者：王新等，湖南医科大学附二医院妇产科遗传室，邮政编码: 410011

34、核型： 46, XX, t(15;22) (15pter→15qll： :22pl3^22pter ;22qter — 22pl3: :15qll— 15qter)。

表型：女， 27岁，为表型正常的携带者

资料提供者： '符生苗，海南省海口市，海南省人民医院遗传室，邮政编码： 570011

35、核型： 46, XX， t (15； 22) (I5pter→15q22：： 22pl l→22pter； 22qter →22pll: :15q22→qter)

表型：女， 29岁，为表型正常的携带者

资料提供者：李牧尧等，新疆乌鲁木齐，新疆医学院医学遗传室，邮政编码： 830054

36、核型： 46， XY, t (16； 21) (16pter- 16q21：： 21pll→21pter； 21qter →21pll::16ql2→16qter).

表型：男， 29岁，为表型正常的携带者

资料提供者：张惠芳等，广东省计划生育科学技术研究所，邮政编码： 510080

37、核型： 46， XX， t(18;21) (18qter→cen— 21qter； 18pter— cen— 21pter)

表型：女，为表型正常的携带者

38、核型： 46, XX， t(18;21) (18pter→18qll： :21pl2→21pter； 21qter — 21pl2 : : 18qll→18qter)

表型：女， 26岁，为表型正常的携带者

资料提供者：李修林等，辽宁省沈阳市，中国医科大学附一院小儿科遗传室，邮政编码： 110001

39、核型： 45， X， die (Y; 13) (Ypter→Yql200 :： 13pll→cen→13qter) 表型：男， 4岁，为表型正常的携带者

40、核型： 46， XY, t (Y ; 15) (15qter→15pl2 :： Yql2→Ypter) pat.

表型：男，新生儿，为表型正常的携带者

41、核型：45， X， psu dic (Y; 22) (Ypter→Yql209：： 22pl2→cen— 22qter) 表型：男，为表型正常的携带者

资料提供者：刘希贤等，湖北武汉同济医科大学医学遗传学研究室，邮政编码： 430030

上述实例说明在核仁组织区不但可接受外源基因，而且能让外源基因正常表达。这也证明了本发明提供的基因药物治疗血友病 B 的可行性。

本发明基因药物的急性毒性研究

(一）、实验目的

研究本发明提供的基因药物一次静脉给药所产生的急性毒性反应和死亡情况。

(二）、实验材料

( 1 )、动物

昆明种小鼠 (η=40) , 体重 20. 4± 1. lg, 雌雄各半。所有实验动物和词料均由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供。该种小鼠具有湖南省医学实验动物管理委员会颁发的医学实验动物合格证书。

( 2)、药物

本发明提供的基因药物。实验前将其用无菌水配制成 11. 25ug/ml浓度的注射液。

(三）、实验方法预试验：实验小白鼠 10只，雌雄各半均从尾静脉注射本发明提供的基因药物。预备实验用人的剂量 100倍即 450ug/kg，未发现毒性反应。

正式试验：根据基因治疗药物的特点，就用预试验用的剂量进行正式试验。试验分为二个组，即给药组和空白对照组。试验组用本发明提供的基因药物，剂量为 450ug / kg (按体重计算，相当成人临床日用量的 100倍）。对照组用等量蒸馏水尾静脉注射（0. 4ml 1 10g I次）。两组实验给药后均立即观察动物对药物的反应，连续观察 14天，记录动物大小便及一般活动情况和死亡数，第 14天时，全部小鼠解剖观察胸腔腹腔的情况。

(四）、实验结果

小鼠急性毒性实验：对照组小鼠 (n二 20)连续观察 14天，未发现异常活动及动物死亡。本发明提供的基因药物处理小鼠 (n = 20)两次给药后 30分钟内均出现倦卧，少动，以后恢复正常。连续观察 14天，动物的摄食，大小便及一般活动情况未见异常，也未见动物死亡，活检，实验组与对照组无明显异常和差异。结果见表 2。

表 2 人源基因载体 FIX急性毒性实验结果组别 n 浓度静脉注射相当临死亡一般情况床用量只数

(ml / 10g I次）倍数

20 0. 4

20 11. 25ug/ml 0. 4 (五）、实验小结

小鼠人源基因载体 FIX静脉给药剂量达到按体重计算为成人日一次静脉剂量的 100倍，不引起死亡，表明它的急性毒性甚小，静脉给药安全，可以提供临床应用。

Claims

杈利要求

1、治疗血友病 B 的基因药物，含有以人类 D、 G组染色体短臂上' 无重要生理功能相关基因的 DNA序列或与该 DNA序列具有同源性的 DNA序列作为治疗基因的引导序列所构建的基因载体 -FIX重组体。

2、根据权利要求 1所述的治疗血友病 B的基因药物，其特征在于所述的载体- FK重组体具有序列表 1表示的 DNA序列， FIX治疗基因的插入位点为 5910位。

3、根据权利要求 1或 2所述的基因药物，其特征在于所述的基因药物中包含有人离体细胞，该离体细胞中有权利要求 1或 2所述的基因载体 -FIX重组体。

4、制备权利要求 1所述的治疗血友病 B的基因药物的方法，其特征在于包括下列步骤：

( 1 ) 以人类 D、 G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的 DNA 序列或与该 DNA序列具有同源性的 DNA序列作为治疗基因的引导序列，构建基因载体；

(2)将 FIX治疗基因装入上述基因载体，得到载体 -FIX重组体。

5、根据权利要求 4所述的治疗血友病 B的基因药物的方法，其特征在于：

( 1 ) 治疗基因引导序列选自人类 D、 G组染色体短臂上无重要生理功能相关基因的 DNA序列，其长度为 3. 8Kb，利用 TK做为负筛选基因，将正筛选基因 Neo基因插入治疗基因引导序列中的 1500位，使其分为 1.5kb和 2.3kb两臂，构建成基因载体；

(2) FIX治疗基因的插入位点为 5910位。

6、根据权利要求 4或 5所述治疗血友病 B的基因药物的方法，其特征在于将所得到的载体 -FIX重组体装入人离体细胞中。