CN1319982C - 一种羊生长激素释放激素基因及其表达产物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种羊生长激素释放激素基因及其表达产物与应用。本发明的目的是提供一种羊生长激素释放激素基因及其编码的羊生长激素释放激素，该基因在动物能得到较好表达，表现为动物生产性状的显著提高。本发明的羊生长激素释放激素基因的核苷酸序列为序列表中的1号序列，由135个核苷酸组成，它编码的是序列2的蛋白质，由44个氨基酸残基组成。本发明的目的之二是提供一种替换GHRH自身的引导肽。从而可以确保引导该蛋白分泌到细胞外，进入体液循环。肌肉的膜蛋白引导肽核苷酸序列是序列表中的3号序列。以本发明为活性成分的药物可以用于促进生长激素分泌提高羊的生产性状也可用于肌肉萎缩性疾病的治疗。

Description

一种羊生长激素释放激素基因及其表达产物与应用

技术领域

本发明涉及一种人工合成基因及其表达产物与应用，特别是一种人工合成的羊生长激素释放激素基因及其表达产物与应用。

背景技术

生长激素释放激素(Growth Hormone Releasing Hormone，GHRH)是动物下丘脑中分泌的一种多肽类激素。其作用机理是，生长激素释放激素作为垂体的生长激素(Growth Hormone，GH)的正性调控因子，能促进垂体合成和分泌生长激素，提高体内生长激素水平，并通过生长激素使全身性类胰岛素生长因子(Insulin-like GrowthFactor I，IGF-I)水平提高，进而提高动物的生产性能。因此，GHRH在畜牧业上具有重要的应用价值。

一、GHRH研究的兴起

1973年Buger从肢端肥大症病人的胰腺肿瘤提取到对GH分泌有刺激作用的提取物。1980年Frohman从肢端肥大症病人的垂体外肿瘤分离到部分纯化的GHRH。Thomer对伴有Turner’s症的肢端肥大症病人进行垂体摘除，未见效，后查出胰腺有肿瘤，并摘除之，则血中GH水平由70ng/ml降至2ng/ml。Guillemin和Vale分别对肿瘤组织体外培养和分析获得，具有促进GH释放作用的是两个不同的肽，两种均有活性，它们分别由44个和40个氨基酸残基组成。44肽的结构为：酪-丙-天冬-丙-异亮-苯丙-苏-天冬酰胺-丝-酪-精-赖-缬-亮-甘-谷氨-亮-丝-丙-精-赖-亮-亮-谷氨-天冬-异亮-甲硫-丝-精-谷氨-谷氨-甘-谷-丝-天冬酰胺-谷氨-谷-精-甘-丙-精-丙-精-亮-NH2。这种物质被称之为人胰腺生长激素释放因子(hpGHRH)。

Vale还报道了两种分别由40个和37个氨基酸残基组成的肽。这两种肽的体外研究均证明有生物活性，而以GHRH40活性最高。Guillemin认为GHRH37和GHRH40为GHRH44的降解物。目前已经确认人下丘脑GHRH为44肽。

有人从几千个人的下丘脑中分离GHRH活性物质。1984年Guillemin证明来自下丘脑的GHRH与来自胰腺瘤的相同。大鼠的GHRH有15个氨基酸与人的不相同。大鼠的GHRH为43肽，有一游离的C末端。牛和猪下丘脑的GHRH均为44肽，羧端已酰胺化。就目前资料来看GHRH有种属差异。

二、GHRH在体内的分布

GHRH在中枢神经系统的分布

免疫组织化学证实GHRH的胞体位于弓状核，对人、猴、猪和大鼠的研究表明，在弓状核中GHRH胞体很密集。电生理研究证实电刺激腹内侧核可引起GH分泌。此外，在猫的海马、杏仁、壳核，大鼠的内侧前脑束、背内侧核及室周核和穹隆附近也有GHRH胞体分布。

在中枢神经系统中GHRH有广泛的分布，尤以下丘脑浓度最高。人和猫GHRH神经末捎对称分布在正中隆起外侧，平行于毛细血管，终止于垂体门脉血管。大鼠的GHRH纤维主要分布于正中隆起中央。

GHRH在中枢神经系统以外的分布

在猴发现GHRH分布在垂体前叶细胞，在人的胎盘、胰腺也存有GHRH活性样物质，用RIA测得人的空肠、十二指肠和胃的提取物中有GHRH。

三、GHRH的生理作用及机理

GHRH和生长激素抑制素也称生长抑素(Somatostatin，SS)对GH的分泌起双重调节作用。正常情况下，GH每天以一定时间间隔脉冲式释放。镇发周期约为1～3h。给清醒的大鼠注射GHRH，在GH释放的谷期刺激作用极小，而在峰期则非常明显。但将大鼠用SS抗血清处理后，GHRH在GH释放谷期也能刺激GH的释放。因此说明SS对GH的释放起关键性作用。V.Padmanabhan等(1987)亦得到相同结果，用牛的腺垂体进行体外培养，当介质中加入10∶2～10∶7的GHRH时，GH的分泌呈线性增加，尤以10∶7时达到最高峰，但当介质中再加入SS时则腺垂体GH的释放效应受到SS的负相抑制。GHRH对GH的释出脉冲是必要的。体外研究表明，GHRH对GH的释放有刺激作用。

雄鼠侧脑室注入微量的人GHRH 2～20ng导致GH分泌的降低和抑制自发性脉冲释放，但在侧脑室注入较高量GHRH 0.2～2ug时于15～20分钟内血浆中出现GH分泌高峰。有人认为下丘脑内GHRH对内源GHRH和SS分泌有直接作用。Katakani报道，静注SS抗血清可阻断侧脑室注入GHRH对GH分泌的抑制作用，提示中枢GHRH通过刺激SS的释放而抑制GH的分泌。目前认为SS参与GHRH自身的超短反馈。

GHRH经垂体门脉系统到达腺垂体，并与嗜酸性细胞结合，通过膜内cAMP引起生物效应。可能是GHRH与膜结合后成为激素-受体复合物，先激活一种刺激性G蛋白(Stimulatory G protein，Gs)。G蛋白的激活需要GTP参与，当GTP变为GDP时则G蛋白失活。Gs激活膜上AC的催化亚基，使ATP转化为cAMP。通过该过程促进GH的合成与释放。

近年来人们尝试通过多种方式提高动物体内GHRH水平，进而促进垂体GH的合成与分泌，从而实现提高动物的生长速度和胴体瘦肉率。研究表明，注射GHRH可以显著提高动物的生长速度和瘦肉率。但是GHRH的半衰期很短，在体内只有十几分钟，因此，在实际的应用中，注射GHRH给生产带来了诸多不便。因此，通过一些促合成能力提高动物自身GHRH是大势所趋。有的添加生长添加剂来增加动物下丘脑中GHRH的合成；有的则是通过真核表达载体的应用增加体内GHRH的水平。

由于GHRH可以促进肌肉的生长，这就隐含着GHRH的另一个非常重要的潜能——肌肉萎缩症的治疗。

肌肉萎缩是指横纹肌营养不良，肌肉体积较正常体积小，肌纤维变细甚至消失。神经肌肉病变性肥大。肌肉营养状况除肌肉组织本身的病理变化外，更与神经系统有密切关系。脊髓疾病常导致肌肉营养不良而发生肌肉萎缩，它们是神经、肌肉疾病的一种常见症状。

肌肉疾病的研究目前已经成为神经科学中最活跃的领域之一，这是因为分子生物学、免疫学和生物化学的进展使得对肌肉疾病的分子缺陷、发病机制有了进一步的研究。

从解剖方面来说，肌肉组织不属于神经系统，可是肌肉是机体在中枢神经系统调节下，适应和改造客观世界不可缺少的效应器官之一。而且，每一肌肉的收缩，又直接通过运动神经的支配而进行，因此，肌肉疾病是肌肉本身和神经肌肉接头(突触)处，由于遗传因素、内分泌代谢、炎症，中毒、病毒感染、免疫及微量元素等原因所致的一组疾病。

肌肉本身的疾病，系由肌纤维化学成分改变、代谢障碍或不明原因等引起的肌纤维变性、萎缩。近几年来，有人认为肌肉本身的病变亦可能起源于神经源性，引起肌肉生化代谢的改变，或由于遗传基因的突变引起某些相应酶系统的合成障碍，继发于这些特殊酶系统的紊乱发生肌肉的变性、萎缩、无力，少数病人伴有肥胖。这类病人在疾病的进展期常有肌肉代谢的酶系统异常，特别是糖代谢异常。近几年也有文献报道，肌病的发病机制与免疫因素有关，常见的肌肉疾病，如重症肌无力，肌力综合症，突发性肌肉、皮肤炎等的发病均与免疫能力相关。

无论何种原因引起的肌病，基临床表现不外乎肌无力或肌强直，肌肉萎缩，假性肥大，肌肉疼痛等。但在某些神经源性疾病中，亦可出现上述共同的相似症状。治疗该类病症的一个重要手段是恢复肌肉的生长，因此GHRH被视为一种候选的基因治疗手段。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种羊生长激素释放激素基因及其编码的羊生长激素释放激素，该基因在动物能得到较好表达，表现为动物生产性状的显著提高。

本发明的羊生长激素释放激素基因的核苷酸序列为序列表中的1号序列，由135个核苷酸组成，它编码的是序列2的蛋白质，由44个氨基酸残基组成。

本发明的目的之二是提供一种替换GHRH自身的引导肽。从而可以确保引导该蛋白分泌到细胞外，进入体液循环。

肌肉的膜蛋白引导肽核苷酸序列是序列表中的3号序列，由63个核苷酸组成。它编码的是序列4的蛋白质，由21个氨基酸残基组成。

在本发明中，序列1与序列3的DNA是连锁的，序列2与序列4的蛋白质也是连锁的。

为了促进本发明羊生长激素释放激素基因的核苷酸序列在肌肉内的表达，在本发明羊生长激素释放激素基因的两侧加有驱动调节的调控元件5’及3’侧翼核苷酸序列。

5’侧翼核苷酸序列是序列表中的5号序列，由2445个核苷酸组成，称为5’-flanking。

3’侧翼核苷酸序列是序列表中的6号序列，由805个核苷酸组成，称为3’-flanking。

含有序列1、序列3、序列5、序列6的质粒及生物细胞均应属于本发明的保护范围。

本发明的目的之三是提供一种促进生长激素分泌的药物，该药物的活性成分是序列1的羊生长激素释放激素核苷酸或序列2的羊生长激素释放激素。

本发明的目的之四是提供一种治疗肌肉疾病的药物，该药物的活性成分是序列1的羊生长激素释放激素核苷酸或序列2的羊生长激素释放激素。

为了提高药物的效用，在上述药物中，还包括药学上可接受的载体，其中优选的是脂质体。

脂质体技术是被喻为“生物导弹”的第四代靶向给药技术，脂质体属于纳米级药物载体，该技术利用脂质体的独有特性，将毒副作用大、在血液中稳定性差、降解快的药物包裹在脂质体内，由于病灶部位血管内皮细胞间隙较大，脂质体药物可透过此间隙到达病灶部位，在病灶部堆积释放，达到定向给药。

脂质体是由磷脂、胆固醇等为膜材包合而成。这两种成分不但是形成脂质体双分子层的基础物质，而且本身也具有极为重要的生理功能。按结构和粒径，脂质体可分为单室脂质体、多室脂质体、含有表面活性剂的脂质体。按性能，脂质体可分为一般脂质体(包括上述单室脂质体、多室脂质体和多相脂质体等)、特殊性能脂质体、热敏脂质体、pH敏感脂质体、超声波敏感脂质体、光敏脂质体和磁性脂质体等。按荷电性，脂质体可分为中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。

1987年Felgner等首次用人工合成的阳离子脂质体N-(1-(2，3-二油酰氧)丙基)-N1N1N-氧化三甲铵(DOTMA)构建小单层脂质体，与DNA自发作用形成脂质体-DNA复合物，促进了DNA的细胞摄入及胞内的稳定表达。后来的研究又进一步发现有中性磷脂参与构成的阳离子脂质体活性更强。Lip即是由阳离子脂质(DOTMA)和中性磷脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)合成的脂质体。适用于将各种核酸导入培养的细胞内。其机理是阳离子脂质体通过静电引力作用与带负电荷的核酸自发形成复合物，净电荷为正的复合物又很容易结合到带负电荷的细胞表面，与细胞融合，通过细胞内吞作用进入胞内。因此它与传统脂质体不同，并非将核酸包入脂质体囊内，而是结合到表面，只需混合即可俘获几乎100％的核酸，而传统脂质体的核酸包裹率不到10％。与硫酸钙共沉淀法或二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖方法相比，应用Lip的核酸转染效率要高出5～100倍。因此阳离子脂质体应用方便，优势明显，近几年被广泛用于将DNA，RNA和蛋白质导入活细胞。但关于应用此类脂质体介导相对小分子的反义寡聚脱氧核糖核苷酸(ASODN)转染活细胞的报道罕见。1989年Stoolman研究发现，DOTMA可使细胞摄入ASODN的量增加10倍以上，而且因为显著改变了其在细胞内的情况使ASODN的生物活性增强了100倍。1991年Chiang等首次在哺乳动物细胞中证实阳离子脂质体可使ASODN的作用明显增强。1994年Nestle等将Lip与靶向细胞间粘合分子1(ICAM-1)mRNA的ASODN混合后作用于角细胞，使ICAM-1的表达减少50％，而无Lip介导时仅减少30％。本发明发明人的实验结果也表明人DNA-polamRNA特异的ASODN在Lip介导下抑制人肝癌细胞增殖的作用增强了10倍。因此各类脂质体特别是Lip可以做为简单有效的运载工具，介导GHRH进入体外培养或体内细胞，解决细胞摄入困难的问题，从而大大提高GHRH的作用效果，减少注射量，降低成本。

另外，为促进肌肉细胞摄入GHRH的效率，在注射时给予注射部位适当的电脉冲刺激也将提高GHRH的使用效率。

本发明依据GHRH在生理上可以促进动物生长的调节作用，通过设计人工的基因序列，实现由动物体自身的肌肉细胞生产GHRH，并释放到体液循环中，参与动物生产性状的调整。设计时考虑了以下几个因素：1、确保GHRH基因可以在肌肉细胞中表达，要选用肌肉中丰度高的蛋白表达元件来驱动GHRH基因的表达。2、为确保在肌肉细胞中表达的GHRH可以穿过细胞膜进入体液循环，选择了合适的引导肽。引导GHRH分泌出膜的是肌肉M-Cadherin(muscle calcium-dependent intercellularadhesion)引导肽，M-Cadherin是钙依赖的细胞间粘素。羊生长激素释放激素基因协同引导肽基因一起人工合成是较理想的方案。肌肉细胞内分泌蛋白及穿膜蛋白的引导肽均可被用来使用。

下面结合附图对本发明的具体实施例做进一步说明。

附图说明

图1为表达载体的构建示意图。

图2为本发明的表达克隆的构建示意图。

图3为含有5’侧翼核苷酸序列(2442bp)的质粒pGEM-A5F及3’侧翼核苷酸序列(805bp)的质粒pGEM-A3F的分别鉴定。

图4为3’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A3F与5’侧翼核苷酸序列质粒pGEM-A5F经过Nde I+Nsi I双切后的结果。

图5为表达载体pGEM-A5F3F构建。

图6为表达载体质粒pGEM-A5F3F的鉴定。

图7为人工合成的含有引导肽的GHRH序列的拼接鉴定。

图8-A为表达质粒pGEM-A5F3F-M-GHRH的构建及鉴定。

图8-B为表达质粒pGEM-A5F3F-M-GHRH的构建及鉴定。

具体实施方式

材料及试剂：

1、菌株和质粒

大肠杆菌DH5α及载体pGEM-T vector。pGEM-T vector载体为Promega公司生产的克隆PCR产物的载体，其具有Amp筛选抗性及lac Z筛选标记，在与宿主菌DH5α配合使用下，方便筛选阳性质粒。

表达载体与目的基因的连接：

A、将构建的表达载体pGEM-A5f3f用Sna B1进行酶切，而后补平。进而利用SalI对其进行酶切。

B、利用Sal I对合成的GHRH片段酶切。

C、连接A、B酶切的结果，形成表达克隆。

2、试剂及其它材料

克隆载体pGEM-T vector、连接酶、琼脂糖和蛋白分子量标准购自Promega公司；限制性内切酶购自Biolab公司及Promega公司，DNA回收试剂盒为上海生工SK 13I产品。

质粒提取的溶液I、II、III和pH8.0的TE、STE、Tris、EDTA缓冲液等各种缓冲液都是按照科学出版社出版的《分子克隆实验指南》(第二版)中的配方配制。

3、途径和方法：

质粒的碱裂解法制备是利用质粒DNA在通过碱环境后比基因组DNA更易复性，并可同时去除大量蛋白的原理进行的。经过变性与复性后，质粒可通过乙醇或异丙醇沉淀下来。

(1)质粒DNA的大量制备及纯化(碱裂解法)：

将一单菌落接入含Amp的200mlLB液体培养基中，37℃遥床培养过夜。

                            ↓

将细菌培养液移入50ml的离心管，于4℃8000rpm离心5分钟回收细菌。

                            ↓

倒掉上清，将细菌沉淀重悬于10ml冰预冷的STE中，充分振荡洗涤。

                            ↓

             4℃，8000rpm离心5分钟重新回收细菌。

                            ↓

               加入1ml冰预冷的溶液，剧烈振荡。

                            ↓

加入2ml新配制的溶液II，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，于室

                        温放置6分钟。

                            ↓

加入1.5ml冰预冷的溶液III，用混合液缓缓自下而上浸润离心管全部管壁，尽量

    避免菌体散落在管壁上，冰上放置10分钟，管内出现白色絮状沉淀。

                            ↓

                   4℃度12000rpm离心15分钟。

                            ↓

用4层滤纸将上清过滤到另一50ml的离心管中，加0.6倍体积的异丙醇，充分混

                     匀，于室温放置10分钟。

                            ↓

                 室温，12000rpm离心15分钟，沉淀核酸。

                            ↓

吸弃上清，于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁数分钟。倒出乙醇，用真空装置吸

                      取管壁及管底液体。

                                ↓

                 用350ul灭菌双蒸水溶解核酸沉淀。

                                ↓

将DNA溶液转入1.5ml离心管，再加入等体积的5Mol/L氯化锂溶液，充分混匀，于

                    室温以12000rpm离心10分钟。

                                ↓

将上清转移到另一1.5ml离心管中，加等量的异丙醇，充分混匀，于室温以12000rpm

                    离心10分钟，以回收核酸沉淀。

                                ↓

吸弃上清，于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁数分钟，倒出乙醇，用真空装置吸

                        去管壁及底部液体。

                                ↓

用100ul灭菌双蒸水溶解沉淀，加入10ul 10mg/ml无DNase的Rnase，于37℃放

                            置1小时。

                                ↓

     补加400ul灭菌双蒸水，用等体积的酚，酚∶氯仿，氯仿各抽提一遍。

                                ↓

将水相转移到另一离心管，加入1/4体积的NaAc(3M，pH5.2)，充分混匀，加入2倍体积的乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12000rpm离心15分钟，回收质粒DNA。

                                ↓

              吸弃上清，加入1ml70％的乙醇，洗涤沉淀5分钟。

                                ↓

               用真空装置吸干沉淀，并溶于50ul灭菌双蒸水。

                                ↓

                    取1ul上样电泳，检查提取效果。

(2)质粒的纯化

大规模的纯化主要依赖柱层析法，依靠柱床在不同条件下对质粒的亲合度差异，使质粒与其他杂质分离。

(3)质粒DNA浓度及纯度的检测好。此时的值可反映出样本的浓度，与浓度之间的关系是10D260＝50ug/ml。实际应用中，0D260/0D280的比值不一定必须为1.8，但是越接近表示纯度越好。

实施例1、表达克隆的构建

一、表达克隆的构建元件

1、5’侧翼核苷酸序列

5’侧翼核苷酸序列是由牛骨骼肌肌动蛋白启动子改造而来

引物设计如下：

up：    CTGGGGAGGAGGGTTTCGTATGT

LENGTH：23nt    ΔG＝-3.6kcal/mol    (G+C)％＝56.5％    Tm＝72

Low：

TCTGGTTTCTGCAAGGACAGG

      Sna BI

LENGTH：28nt    ΔG＝-6.9kcal/mol    (G+C)％＝50.0％   Tm＝72

以下为通过以上引物PCR获得的5’侧翼核苷酸序列与报道的牛骨骼肌肌动蛋白启动子序列(GENEBANK序列号为U02285)对比，同源性为99％。

Upper line：通过以上引物PCR获得的5’侧翼核苷酸序列

              from 1 to 2445

Lower line：报道的牛骨骼肌肌动蛋白启动子

              from 1 to 2441

1     CTGGGGAGGAGGGTTTCGTATGTGCTTTTATATCCCTCTTCGAGGACCCGCACCTGTCCC

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||

1     CTGGGGAGGAGGGTTTCGTATGTGCTTTTATATCCCTCTTCGAGGACCCACACCTGTCCC

61    AGTTGCTGAGTTCCACCACCGAGTTCCTATTCTGGGAACACTTGAGCACATCAGAAAAAT

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121   GAGTGGTTCCATTCTGGCTCACATCACATCACTGATGCACCCCTTAAAGCATGTCCCTGA

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

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181   GTTCATTGCAGAAAATTGTTCCTCCTTGTACCTTCCACAGCAAGGTTAGAACTGTTCCCC

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

181   GTTCATTGCAGAAAATTGTTCCTCCTTGTACCTTCCACAGCAAGGTTAGAACTGTTCCCC

241   TCAGGGGAAAAAACAGTGAGAAGCACCAACTTAATAACCTCCTCTGACCCCTACTCCACC

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||

241   TCAGGGGAAAAAACAGTGAGAAGCACCAACTTAATAACCTCCTTTGACCCCTACTCCACC

301   TTTACCATAAGTAGATCCAAATCCTTCTAGAAAATCAGAAAGACATATCCCCGTGTATCA

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301   TTTACCATAAGTAGATCCAAATCCTTCTAGAAAATCAGAAAGACAGATCCCCATGTATCA

361   GCGGTATAAATAGAACCGCTCTGCAGACTCTGGTGGACGGTGACTCTCCAAGGTGGATTG

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361   GCGGTATAAATAGAACCGCTCTGCAGACTCTGGTGGACGGTGACTCTCCAAGGTGGATTG

421   GGAGTCAGCCGGCCTTGGCTGGGCATCACCCTCTAAATATAACGATGAGTTTGTTCAGCC

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421   GGAATCAGCTGGCCTTGGCTGGGCATCACCCTCTAAATATAACGATGAGTTTGTTCAGCC

481   TTTGCAGAAGGGAAAGGTTTTGCCCATCCTAGAGCGCGATGCCCTTGTCCTCCTTACAGG

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541   GAGGAGAGACGGTTGAGGCTTCATCTAGTAAGAGCACTTCTCAGTTCCCATCCTAGGGAT

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541   GAGGAGAGACGGTTGAGGCTTCATCTAGTAAGAGCACCTCTCAGTTCCCACCCTAGGGCT

601   ATGACACTTGCCTTTCCTCCCCAGGACTGGGAAGTCGGTGAGCCCCGCCAAGGATGCGGG

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601   ATGACACTTGCCTTTCCTCCCCAGGACTGGGAAGTCGGTGAGCCCCGCCAAGGATGCGGG

661   AGTAGGGTGCTCAGCTCGGCCTGCCATACTCCAGAGCCGGCCAGTTAGTCACTCAACTTC

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721   ACTCCCTTCATGAGCTCCCGAGCCCACAACACGTCCCCGAGACGGGCAGCTCTGGGTGTC

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781   CTGGCTCAGTGCCAGAGGCTGCGAGAGCCGCTGCGGGGCCTGTGCCGGGAGCCCAGCGCC

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841   TCCTCCCCGGACTCTCCACAGTTGTCCTCGCGACAGGTGCGCGCCCGCCGGCCTCCGGTG

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901   ACCCTCTCCGGTGGGGGTGGGGGCCGACGGTGTCAGCCCTCTGGATTGGGGAGCTCGGGG

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961   TTGGGGGAGAGACCGAGTTCGCTGGGAGTCTGGGGGGAGGGATCGCCTGCCTCCCTGCCC

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1021  GGGACTCCGGGAGTGACTCCATCTCCGGTCCTCTTGGCCCCACCACTAGGATATAGAGTC

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1081  CTCCTCGGTGGAGTCACACTTAAGGAGTTGGAGGTGGGGGGTAAGGGTGAACAACCCGAA

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1081  CTCCTCGGTGGAGTCACACTTAAGGAGTTGGAGGTGGGGGGTAGGGGTGAAGAACCCGAA

1141  GAAGAGGTGAAATGTGGGCGCACCTTCCCGAGGCTCGGAGAACACCGAATGGCCGGGGGC

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1141  GAAGAGGTGAAATGTGGGCGCACCTTCCCGAGGCTCGGAGAACACCGAATGGCCGGGGGC

1201  GGGGCGGCTGCGGACAGGTGCAGCCCGGGCGCAGGCTCACTGGCGCACCCCGAACACTCG

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1261  GTGACCCTCGCCGCACCCCAGCCCCTCCGCCAGGCAACCGGGCGGGGTCGGGAGGGGCCG

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1321  ACCAGCGGGCAGACACTCCATATACGGCCCGGCCCGTGTTACCTGGGCTCAGGCCAGGCC

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1321  ACCAGCGGGCAGACACTCCATATACGGCCCGGCCCGTGTTACCTGGGCTCAGGCCAGGCC

1381  TCTCCTTCTTTGGTCAGCGCAGGGGACCCGGGCGGGGACCCAGGCCTTGAACTGGTCGGG

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1381  TCTCCTTCTTTGGTCAGCGCAGGGGACCCGGGCGGGGACCCAGGCCTTGAACTGGTCGGG

1441  GGAGGGGGCTCTAGTGCCCAACACCCAAATATGGCTCGAGAAGGGGAGCGACATTCCTGC

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||

1441  GGAGGGGGCTCTAGTGCCCAACACCCAAATATGGCTCGAGAAGGGGAGCGACA.TCCTGC

1501  GGGGCGGCGCGAGGGGAGCGCCCGAGGGCTATATAAAACCTGAGCAGGGGGACGAGCGGC

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

1500  GGGGCGGCGCGAGGGGAGCGCCCGAGGGCTATATAAAACCTGAGCAGGGGGACGAGCGGC

1561  CACCGCAGCGGATAGCGCCGAGAGAAGTCTCGCTTCCTTCCCACGGTGACCGGGACCGGA

      |||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

1560  CACCGCAGCGGACAGCGCCGAGAGAAGTCTCGCTTCCTTCCCACGGTGACCGGGACCGGA

1621  GCCGGAGAGCCGCAGGTGTAGCCACCCGCCCAGGTAGGCAGGGGCGGGGTGGGGACAGTA

      |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |

1620  GCCGGAGAGCCGCAGGTGTAGCCACCCGCCCAGGTAGGCAGGGGCGGGGTGGGGACAGAA

1681  GGACGTGTCCCACCGCGGCAGCCTGGAGAACTCCAGGTAGAGCGCGGCCCCTCACTGCAT

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

1680  GGACGTGTCCCACCGCGGCAGCCTGGAGAACTCCAGGTAGAGCGCGGCCCCTCACTGCAT

1741  CAGCCCCAGCCCCGCGTCCTGTGAGCCGCGCCTCTGGCCCCAGAGTCACGTGTGCTTTAA

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

1740  CAGCCCCAGCCCCGCGTCCTGTGAGCCGCGCCTCTGGCCCCAGAGTCACGTGTGCTTTAA

1801  AGAAGAGACAGGAAGCCGGGTCCTTTGGAAAGATCTCCAAATTTATTCCCAGCCCTTTGG

      |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||

1800  AGAAGAGACAGGAAGCCGGGTCCTTTGGAAAGATCTCCAAATTTATTCCCAG.CCTTTGG

1861  GGCAGCTCTCCTTGACACTTCGTGCGTGCCGAGGTAGATGAAAGGTTTTGCTTTAGTCCT

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

1859  GGCAGCTCTCCTTGACACTTCGTGCGTGCCGAGGTAGATGAAAGGTTTTGCTTTAGTCCT

1921  CCCCAGGGCAGTTCCTTCCCAGCAGAACCAAAGGACAGTAGAAGGGACAATTTCCCCTGG

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

1919  CCCCAGGGCAGTTCCTTCCCAGCAGAACCAAAGGACAGTAGAAGGGACAATTTCCCCTGG

1981  CTCGCCATCAGTTACAAGGGCGCTTCGGCTGAGTCTGAAGTGCCATGGAGGTCCAAAATA

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

1979  CTCGCCATCAGTTACAAGGGCGCTTCGGCTGAGTCTGAAGTGCCATGGAGGTCCAAAATA

2041  AGCCATTCGTGTCCTGGTGCAGTGCCCAAGCCCTTTCCACGGCGTCTCCTTCCACCCTCA

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

2039  AGCCATTCGTGTCCTGGTGCAGTGCCCAAGCCCTTTCCACGGCGTCTCCTTCCACCCTCA

2101  CAGTGGCCCAGAAATCAGGGTTCGCGGACCTTGACCCCCATGCGATGCCAGGGAGGGGCG

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

2099  CAGTGGCCCAGAAATCAGGGTTCGCGGACCTTGACCCCCATGCGATGCCAGGGAGGGGCG

2161  GAGAGGGCGGTGCCTGCAGCGAA.GCAGACAACTCTCGGGTCTGTGTGTCCTGAGTTCCC

      ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||

2159  GAGAGGGCGGTGCCTGCAGCGAAGGCAGACAACTCTCGGGTCTGTGTGTCCTGAGTTCCC

2220  AGATGGAGAAACGCTCTCTGTGGTCTCCTCGCAGTAGAGCTCGCAGCAGCGAAGCTCCGC

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

2219  AGATGGAGAAACGCTCTCTGTGGTCTCCTCGCAGTAGAGCTCGCAGCAGCGAACGTCCGC

2280  CCGCGCGGCTTTGATTGCTTCCCCCGCAGGATGGCGCCGGGCTGCGGGCTGGAGGCTGGA

      |||||| ||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||

2279  CCGCGC.GCTTTGATTGCTTCCCCCGCA.GATGGCGCCGGGCTGCGGGCTGGAGGCTGGA

2340  GGTGTCCATAGGTCCCCGGGGAGGGAGGGCGCTCCAGCCAGCGGGGCCTCTTGCGTGAAA

      |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||

2337  GGTGTCCATAGGTCCCCGGGGA.GGAGGGCGCTCCAGCCAGCGGGGCCTCTTGCCTGAAA

2400  CACTGAGCGTCTCCATGGCATTCCTGTCCTTGCAGAAACCAGATAC

      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

2396  CACTGAGCGTCTCCATGGCATTCCTGTCCTTGCAGAAACCAGATAC

                             表1.蛋白结合位点对比结果

5’侧翼核苷酸序列			报道的牛骨骼肌肌动蛋白启动子
						Name	Position	Site	Name	Position	Site
ICSBP	12	ggtttc	ICSBP	12	ggtttc

AR	21	tgtgct	AR	21	tgtgct
						AR	95	ggaaca	NF-uE5	50	acacctg
AR	105	agcaca	AR	95	ggaaca
						AR	113	agaaaa	AR	105	agcaca
NFIII	117	aaatga	AR	113	agaaaa
						AP-1	135	tggctca	NFIII	117	aaatga
COUP	180	agttca	AP-1	135	tggctca
						AR	190	agaaaa	COUP	180	agttca
AR	197	tgttcc	AR	190	agaaaa
						PU.1	199	ttcctc	AR	197	tgttcc
AR	228	agaact	PU.1	199	ttcctc
						AR	233	tgttcc	AR	228	agaact
AR	250	aaaaca	AR	233	tgttcc
						COUP	285	tgaccc	AR	250	aaaaca
AR	329	agaaaa	COUP	285	tgaccc
						TFIID	365	tataaa	AR	329	agaaaa
AR	372	agaacc	TFIID	365	tataaa
						AP-1	421	ggagtca	AR	372	agaacc
AR	472	tgttca	GT-2B	426	cagctg
						AR	526	tgtcct	AR	472	tgttca
AR	571	agagca	AR	526	tgtcct
						PU.1	614	ttcctc	AR	571	agagca
AP-1	705	ttagtca	PU.1	614	ttcctc
						PEA1	705	ttagtca	PEA1	705	ttagtca
MLTF	708	gtcact	AP-1	705	ttagtca
						AP-1	709	tcactca	MLTF	708	gtcact
AR	746	acaaca	AP-1	709	tcactca
						SIF	761	gacggg	AR	746	acaaca
AR	777	tgtcct	SIF	761	gacggg
						AP-1	782	tggctca	AR	777	tgtcct
AR	863	tgtcct	AP-1	782	tggctca

COUP	899	tgaccc	AR	863	tgtcct
						BPV-E2	901	accctctccggt	GT-2B	874	cagctg
MLTF	1032	agtgac	COUP	899	tgaccc
						AP-1	1034	tgactcc	BPV-E2	901	accctctccggt
AP-1	1090	ggagtca	MLTF	1032	agtgac
						AR	1128	tgaaca	AP-1	1034	tgactcc
AR	1140	agaaga	AP-1	1090	ggagtca
						AP-2	1167	cccgaggc	AR	1131	agaacc
AR	1179	agaaca	AR	1140	agaaga
						Sp1	1197	gggcgg	AP-2	1167	cccgaggc
Sp1	1202	gggcgg	AR	1179	agaaca
						COUP	1262	tgaccc	Sp1	1197	gggcgg
AP-2	1276	ccccagcc	Sp1	1202	gggcgg
						BPV-E2	1297	accgggcggggt	COUP	1262	tgaccc
Sp1	1300	gggcgg	AP-2	1276	ccccagcc
						SRF	1338	ccatatacgg	BPV-E2	1297	accgggcggggt
SRF	1384	ccttctttgg	Sp1	1300	gggcgg
						Sp1	1410	gggcgg	SRF	1338	ccatatacgg
COUP	1428	tgaact	SRF	1384	ccttctttgg
						SRF	1465	ccaaatatgg	Sp1	1410	gggcgg
GT-IIC	1491	acattcc	COUP	1428	tgaact
						Sp1	1502	gggcgg	SRF	1465	ccaaatatgg
TFIID	1532	tataaa	Sp1	1501	gggcgg
						COUP	1607	tgaccg	TFIID	1531	tataaa
NF-uE5	1633	caggtgt	COUP	1606	tgaccg
						BPV-E2	1644	acccgcccaggt	NF-uE5	1632	caggtgt
Sp1	1646	ccgccc	BPV-E2	1643	acccgcccaggt
						Sp1	1662	gggcgg	Sp1	1645	ccgccc
AP-2	1701	gcctggag	Sp1	1661	gggcgg
						AR	1707	agaact	AP-2	1700	gcctggag
AP-2	1744	ccccagcc	AR	1706	agaact

MLTF	1785	gtcacg	AP-2	1748	ccccagcc
						AR	1791	tgtgct	MLTF	1784	gtcacg
AR	1801	agaaga	AR	1790	tgtgct
						AR	1944	agaacc	AR	1800	agaaga
AR	1952	aggaca	AR	1942	agaacc
						AP-2	1974	cccctggc	AR	1950	aggaca
AR	2050	tgtcct	AP-2	1972	cccctggc
						COUP	2132	tgaccc	AR	2048	tgtcct
Sp1	2156	gggcgg	COUP	2130	tgaccc
						Sp1	2165	gggcgg	Sp1	2154	gggcgg
AR	2206	tgtcct	Sp1	2163	gggcgg
						Sp1	2276	ccgccc	AR	2205	tgtcct
AR	2424	tgtcct	Sp1	2275	ccgccc
						ICSBP	2434	gaaacc	AR	2420	tgtcct
			ICSBP	2430	gaaacc

由上述序列及表格的比较可以看出，本发明所使用的通过PCR方法所获得的5’侧翼核苷酸序列的一些碱基突变导致了转录因子结合位点的改变，其中在强启动区1491增加了一个GT-IIC结合位点。

2、3’侧翼核苷酸序列

3’侧翼核苷酸序列由牛骨骼肌肌动蛋白poly(A)加尾信号改造而成：

up：

CCTCTCCGACAGCCGCGAC

        Nde I

LENGTH：28nt    ΔG＝-10.3kcal/mol    (G+C)％＝60.7％    Tm＝70

Low： TTCCCGCCTCCTCCCACCT

        Nsi I

LENGTH：28nt    ΔG＝-9.9kcal/mol    (G+C)％＝60.7％    Tm＝66

3、包括引导肽的GHRH成熟肽编码基因(山羊、绵羊)

人工合成序列1及序列3的连锁核苷酸序列，序列3位于序列1的5’端。

二、表达克隆的构建

1、载体(pGEM-A5f3f)的构建

如图1所示：

将PCR扩增的5’侧翼核苷酸序列插入到T-vector的多克隆位点之间，记为pGEM-A5F。将pGEM-A5F及3’侧翼核苷酸序列PCR产物均用Nde I及Nsi I酶切，连接构成真核表达载体pGEM-A5F3F。

如图3所示，为含有5’侧翼核苷酸序列(2442bp)的质粒pGEM-A5F及3’侧翼核苷酸序列(805bp)的质粒pGEM-A3F的分别鉴定，其中，1、为3’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A3F的Apa I+Sac I双切结果，切下的小带为800bp及一条3kb的载体带；2、为3’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A3F的Nde I+Nsi I双切结果，切下的小带为800bp及一条3kb的载体带；3、为3’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A3F的NsiI单切结果，切下的小带为800bp及一条3kb的载体带；4、为3’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A3F的Nde I单切结果，将质粒切为线形，大小为3.8kb，无切下的小带；5、为5’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A5F的Nde I+Nsi I双切结果将质粒切为线形，大小为5.5kb；6、为5’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A5F的Nsi I单切结果将质粒切为线形，大小为5.5kb；7、为5’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A5F的Nde I单切结果将质粒切为线形，大小为5.5kb；8、为5’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A5F的Sph I+SnaB I双切结果将质粒切为两条带，大小为2.5kb与3.0kb；9为1kb Marker；10、为3’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A3F；11、为5’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A5F；12、为空的质粒，大小为3.0kb；13、为空质粒单切，大小为3.0kb(作为对照)。

如图4所示，为3’侧翼核苷酸序列的质粒pGEM-A3F与5’侧翼核苷酸序列质粒pGEM-A5F经过Nde I+Nsi I双切后回收的结果，其中1、为含有3’-flanking的质粒pGEM-A3F经过Nde I+Nsi I双切后大小为800bp的带的回收电泳；2、为含有5’-flanking的质粒pGEM-A5F经过Nde I+Nsi I双切后的结果，大小为5.5bp；m、为1kbMarker。

如图5所示，为表达载体pGEM-A5F3F构建，其中，1、为插入5’-flanking(2.5kb)及3’-flanking(800bp)的表达载体质粒pGEM-A5F3F(6.3kb)；2、为只插入5’-flanking(2.5kb)的质粒pGEM-A5F(5.5kb)(作为对照)。

如图6所示，为表达载体质粒pGEM-A5F3F的鉴定，其中，1、1kb Marker；2、为Nde I单切质粒pGEM-A5F3F，大小为6.3kb；3、为SnaB I单切质粒pGEM-A5F3F，大小为6.3kb；4、为Nde I+SnaB I双切质粒pGEM-A5F3F的结果，切下的带的大小为2.5kb+3.8kb；5、为Nde I+Nsi I双切质粒pGEM-A5F3F的结果，切下的带的大小为800bp+5.5kb；6、质粒pGEM-A5F3F，大小为6.3kb；7、1kb Marker；8、质粒pGEM-A5F，大小为5.5kb。

利用该载体提供的三个酶切位点Spe I、Not I、Sal I作为外源片段的插入位点。

为保证外源片段的表达及5-UTR完整，在ATG前需要加一碱基“C”(actine的5-UTR结尾)。

2、GHRH基因片段合成

片段是人工合成的，全长198bp。为便于连接，5’端设计为平端，3’端设计为带有Sal I的粘端。

其具体操作中鉴于合成片段的局限，采用分步合成。

全序列：

CATGGGTTCTGCTCTGCTCCTCGCCCTCGGGCTGCTTGCCCAGAGCCTTGGCCTGTCCTGGGCATACGCTGATGCTATCTTCACCAACTCCTA AAAATCCTGGGCCAGCTGTCCGCTCGGAAGCTGCTGCAGGATATCATGAACCGGCAGCAGGGCGAGCGGAACCAGGAGCAGGGCGCCAAGGTGCGGCTGTAG

利用片段内中部的一个特异序列-ccgg-构建酶切位点，进而连接合成片段。

合成第一条链：

GHRH的5’端为顿端，与载体的5-flanking的3’端Sna BI切点补平后连接。

CATGGGTTCTGCTCTGCTCCTCGCCCTCGGGCTGCTTGCCCAGAGCCTTGGCCTGTCCTGGGCATACGCTGATGCTATCTTCACCAACTCCT ccg

A/CCGGT为Age I位点

补为双连的引物

5’CATGGGTTCTGCTCTGCTCC 3’

5’GGACCGGTAGGAGTTGGTGA 3’

合成第二条链：

tctT AAAATCCTGGGCCAGCTGTCCGCTCGGAAGCTGCTGCAGGATATCATGAACCGGCAGCAGGGCGAGCGGAACCAGGAGCAGGGCGCCAAGGTGCGGCTGTAGtcgacttt

T/CCGGA为Acc III位点

G/TCGAC为Sal I位点，用于插入载体。

补为双连的引物

5’TCTTCCGGAAAATCCTGGG 3’

5’AAAGTCGACTAGAGCCGCA 3’

GHRH的3’端为Sal I\Not I\Spe I的粘端，与载体的3-flanking的5’端SalI\Not I\Spe I切点连接。

如图7所示，为人工合成的含有引导肽的GHRH序列的拼接鉴定，其中，1、Hae IIIMarker；2、扩增的片段II(F II)：拼接M-cadherin引导肽及GHRH序列的，大小为118bp；3、扩增的片段I(F I)：拼接M-cadherin引导肽及GHRH序列，大小为105bp。

如图8-A及8-B所示，均为表达质粒pGEM-A5F3F-M-GHRH的构建及鉴定，其中，图8-A中，1、1kb Marker；2、为SnaB I+Sal I双切载体质粒pGEM-A5F3F的结果，切下的带的大小为6.3kb；3、为引导肽及GHRH序列的片段I与II拼接克隆(F I-II)经由Nco I与Sal I双切的结果，大小为198bp；4、为Hae III Marker；5、为引导肽及GHRH序列的片段I与II拼接克隆(F I-II)PCR的结果，大小为213bp。图8-B中，1、拼接克隆(F I-II)PCR结果，大小为213bp；2、空白对照；3、阳性质粒PCR结果为213bp；4、阴性质粒对照；5、表达质粒pGEM-A5F3F-M-GHRH的PCR结果，213bp；6、载体质粒质粒pGEM-A5F3FPCR对照；7、Hae III Marker；8、1kb Marker；9、阴性质粒pGEM-A5F(5.5kb)的Nco I+Nde I双切对照；10、表达质粒pGEM-A5F3F-M-GHRH的Nco I+Nde I双切结果为2.4kb\3.8kb\256bp\387bp；11、载体质粒pGEM-A5F3F的Nco I+Nde I双切结果为2.4kb\3.8kb\387bp。

3、GHRH基因表达克隆说明：

如图2所示，

A、将构建的表达载体pGEM-A5f3f用Sna BI进行酶切，而后补平。进而利用SalI对其进行酶切。

B、利用Sal I对合成的GHRH基因片段酶切。

C、连接A、B酶切的结果，形成表达克隆。

实施例2、表达质粒在活体内促进绵羊生长

注射方式：一次性臀部两侧肌肉注入本发明的表达质粒1.2-1.5mg/头。注射后促生长效果如表2所示。

本实施例中具体操作方法参见科学出版社出版的《分子克隆实验指南》(第二版)中的相应部分。实验中，公羊、母羊各为半数，采用随机分组。饲养方式基本上为放牧，极少补充精料。

                 表2：表达质粒活体肌肉注射促生长效果表

品种性状	新疆哈萨克羊		蒙古乌珠穆沁羊		山东小尾寒羊
							实验组	对照组	实验组	对照组	实验组	对照组

头数	15	20	12	22	20	25
							实验前体重kg	12.62	12.75	13.25	13.38	15.80	15.92
5月龄体重kg	23.50	20.34	40.86	36.68	45.76	40.82
							10月体龄重kg	38.28	32.86	54.52	46.89	70.05	60.40
10月龄胴体重kg	19.95	14.80	29.16	22.50	40.65	31.58
							屠宰率	52％	45％	53.6％	48％	55.8％	52.6％
总提高率	25.49％		21.27％		22.34％

其中，实验前重主要是断奶时体重，本发明注射液使用为羔羊断奶前5天注射；总提高率指总生产效率的提高，综合了日增重和产肉率的因素。

从表中的结果可以看出，本发明注射液对于不同种的羊在不同时期的体重增加均有显著的促进作用。

                           序列表

<160>6

<210>1

<211>135

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tacgctgatg ctatcttcac caactcctac cggaaaatcc tgggccagct gtccgctcgg    60

aagctgctgc aggatatcat gaaccggcag cagggcgagc ggaaccagga gcagggcgcc   120

aaggtgcggc tgtag                                                    135

<210>2

<211>44

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Ile Leu Gly

                 5                  10                  15

Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Asn Arg Gln

                20                  25                  30

Gln Gly Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala Lys Val Arg Leu

                35                  40               44

<210>3

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atgggttctg ctctgctcct cgccctcggg ctgcttgccc agagccttgg cctgtcctgg   60

gca                                                                 63

<210>4

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Met Gly Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Gln Ser

                 5                   10                 15

Leu Gly Leu Ser Trp Ala

                20   21

<210>5

<211>2445

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

ctggggagga gggtttcgta tgtgctttta tatccctctt cgaggacccg cacctgtccc     60

agttgctgag ttccaccacc gagttcctat tctgggaaca cttgagcaca tcagaaaaat    120

gagtggttcc attctggctc acatcacatc actgatgcac cccttaaagc atgtccctga    180

gttcattgca gaaaattgtt cctccttgta ccttccacag caaggttaga actgttcccc    240

tcaggggaaa aaacagtgag aagcaccaac ttaataacct cctctgaccc ctactccacc    300

tttaccataa gtagatccaa atccttctag aaaatcagaa agacatatcc ccgtgtatca    360

gcggtataaa tagaaccgct ctgcagactc tggtggacgg tgactctcca aggtggattg    420

ggagtcagcc ggccttggct gggcatcacc ctctaaatat aacgatgagt ttgttcagcc    480

tttgcagaag ggaaaggttt tgcccatcct agagcgcgat gcccttgtcc tccttacagg    540

gaggagagac ggttgaggct tcatctagta agagcacttc tcagttccca tcctagggat    600

atgacacttg cctttcctcc ccaggactgg gaagtcggtg agccccgcca aggatgcggg    660

agtagggtgc tcagctcggc ctgccatact ccagagccgg ccagttagtc actcaacttc    720

actcccttca tgagctcccg agcccacaac acgtccccga gacgggcagc tctgggtgtc     780

ctggctcagt gccagaggct gcgagagccg ctgcggggcc tgtgccggga gcccagcgcc     840

tcctccccgg actctccaca gttgtcctcg cgacaggtgc gcgcccgccg gcctccggtg     900

accctctccg gtgggggtgg gggccgacgg tgtcagccct ctggattggg gagctcgggg     960

ttgggggaga gaccgagttc gctgggagtc tggggggagg gatcgcctgc ctccctgccc    1020

gggactccgg gagtgactcc atctccggtc ctcttggccc caccactagg atatagagtc    1080

ctcctcggtg gagtcacact taaggagttg gaggtggggg gtaagggtga acaacccgaa    1140

gaagaggtga aatgtgggcg caccttcccg aggctcggag aacaccgaat ggccgggggc    1200

ggggcggctg cggacaggtg cagcccgggc gcaggctcac tggcgcaccc cgaacactcg    1260

gtgaccctcg ccgcacccca gcccctccgc caggcaaccg ggcggggtcg ggaggggccg    1320

accagcgggc agacactcca tatacggccc ggcccgtgtt acctgggctc aggccaggcc    1380

tctccttctt tggtcagcgc aggggacccg ggcggggacc caggccttga actggtcggg    1440

ggagggggct ctagtgccca acacccaaat atggctcgag aaggggagcg acattcctgc    1500

ggggcggcgc gaggggagcg cccgagggct atataaaacc tgagcagggg gacgagcggc    1560

caccgcagcg gatagcgccg agagaagtct cgcttccttc ccacggtgac cgggaccgga    1620

gccggagagc cgcaggtgta gccacccgcc caggtaggca ggggcggggt ggggacagta    1680

ggacgtgtcc caccgcggca gcctggagaa ctccaggtag agcgcggccc ctcactgcat    1740

cagccccagc cccgcgtcct gtgagccgcg cctctggccc cagagtcacg tgtgctttaa    1800

agaagagaca ggaagccggg tcctttggaa agatctccaa atttattccc agccctttgg    1860

ggcagctctc cttgacactt cgtgcgtgcc gaggtagatg aaaggttttg ctttagtcct    1920

ccccagggca gttccttccc agcagaacca aaggacagta gaagggacaa tttcccctgg    1980

ctcgccatca gttacaaggg cgcttcggct gagtctgaag tgccatggag gtccaaaata    2040

agccattcgt gtcctggtgc agtgcccaag ccctttccac ggcgtctcct tccaccctca    2100

cagtggccca gaaatcaggg ttcgcggacc ttgaccccca tgcgatgcca gggaggggcg    2160

gagagggcgg tgcctgcagc gaagcagaca actctcgggt ctgtgtgtcc tgagttccca    2220

gatggagaaa cgctctctgt ggtctcctcg cagtagagct cgcagcagcg aagctccgcc    2281

cgcgcggctt tgattgcttc ccccgcagga tggcgccggg ctgcgggctg gaggctggag    2341

gtgtccatag gtccccgggg agggagggcg ctccagccag cggggcctct tgcgtgaaac    2401

actgagcgtc tccatggcat tcctgtcctt gcagaaacca gatac                    2445

<210>6

<211>805

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gcctctccga cagccgcgac ttctccccag gacgacgaat ctgctcgcgg cgcaggcggc     60

tgacctcgag ccaccgcgca gcagctgctc tccaaccatc agcgttgccg ctgccgcaaa    120

ctgacacact gtttataatg tgtacataca ttgtttacct cattttgtta tttttaaaac    180

gaagccctgt ggaaggaaat ggaaaacttg aagcattaaa ctcagccgtt ctgttttgct    240

gcgtaaagtt gtctgctgtg tttctttgcg ggggcgggga gctgtgcgga taggggagta    300

aaagggactc cgtcttcctc cgtcactttt cacaatactc taaatgagtg caggccttac    360

aaggccgtga gttaggtctt ccgcagctca cggccctcgc ctctggctca gatctattcc    420

tcagactggc acctgcgccg tggcccgact tgacctctgg cgtgtcccct gtgcagggct    480

atctgccgga ggcgccgggg cggcgctcgg gtggccaggg cgcgcctcgg gcagggcgct    540

gaccgtggtg ctggcctggg gtcccgagag caaagcgcgc tcccgctcca cccgcggggg    600

cgtggcctta ctgaagctcg gttccctcct caatctgaga tctaaactga aaagtgtgcg    660

ttctgcattt gaggaaccag ttctcctttg ttaagtgaag ataacccctt ctcgggaagg    720

cctttgcttc gtctgggtga cgaagcgccc tttccagagt ggggagggga aggagccgcg    780

cccagaggtg ggaggaggcg ggaaa                                          805

Claims (8)

1、序列1的羊生长激素释放激素基因。

2、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：它的5’端还连接有序列3的引导肽基因。

3、根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于：它的5’端还连接有序列5的5’侧翼核苷酸序列。

4、根据权利要求1或2所述的基因，其特征在于：它的3’端还连接有序列6的3’侧翼核苷酸序列。

5、氮端连接有序列4的引导肽的序列2的羊生长激素释放激素。

6、含有序列1的质粒。

7、一种促进生长激素分泌的药物，它的活性成分是序列1的羊生长激素释放激素基因。

8、一种治疗肌肉萎缩性疾病的药物，它的活性成分是序列1的羊生长激素释放激素基因。

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