CN1229496C - 诱导肿瘤特异性细胞毒性的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在调节转录序列的控制下，异源序列尤其是编码细胞毒性产物的基因在肿瘤细胞中的特异性表达。特别优选的启动子包括H19调节序列、IGF-1启动子和IGF-2 P3和P4启动子。本发明提供表达构建体和施用上述表达构建体的方法。本发明的组合物和方法可用于癌症治疗。

Description

诱导肿瘤特异性细胞毒性的方法和组合物
本申请是1997年10月3日提交的未决申请专利系列号08/943,608的部分继续申请，其全文在此引入作为参考。
1.发明领域
本发明属于肿瘤细胞生物学和癌症治疗领域。更具体而言，本发明涉及异源基因尤其是编码细胞毒产物的基因在肿瘤细胞中的特异性表达。
2.发明背景
2.1  H19基因
H19基因是少数已知的人类印记基因之一(Hurst等，1996，自然遗传学12：234-237)。在胚胎发生的最早期，H19在2个染色体等位基因上都表达(DeGroof等，1994，滋养层8：285-302)。自此不久，出现父系等位基因沉默，而仅母系遗传的等位基因被转录。
H19在胚胎发生期广泛表达，并首先被鉴定为通过反式作用基因座raf在肝中和甲胎蛋白协同调节的基因(Pachnis等，1984，美国国家科学院院报81：5523-5527)。另外，H19已被许多研究组用目的是分离在组织分化期表达的基因的筛选方法独立克隆。例如，Davis等(1987，细胞51：987-1000)在筛选C3H10T1/2细胞的分化过程中早期活性基因时鉴定了H19的小鼠同源物。Pourier等(1991，发育113：1105-1114)发现鼠H19在干细胞分化期间和植入期表达。人H19基因的转录在人胎盘滋养层细胞分化中也发现(Rachmilewitz等1992，分子生殖发育32：196-202)。
尽管H19 RNA的转录在整个胎儿期和胎盘发育期许多不同的胚胎组织中发生，H19表达在出生后下调。然而，在鼠成年肌肉和肝中报道了相对低水平的H19转录(Brunkow和Tilghman，1991，基因和发育5：1092-1101)。在癌细胞中H19也在出生后活化。Ariel等人(1997，分子病理学50：34-44)表明来源于出生前H19表达的组织的许多肿瘤中H19表达升高。另外，这些作者发现来源于神经组织的肿瘤尤其是星形细胞瘤和成神经节胶质细胞瘤中有H19 RNA，其中这被已知与H19的表达无关。鉴于大量癌细胞表达H19 RNA，这些作者推测H19是一种癌胚RNA并建议研究作为人恶性肿瘤的肿瘤标志的H19。
已经克隆和测序了人和鼠H19基因(Brannan等，1990，分子细胞生物学10：28-36)。比较人和小鼠H19基因显示全长77％的核苷酸序列一致性。尽管种间核苷酸同源性的保守性，根据两种基因的开放读框可预测非常低的氨基酸序列一致性(同上)。而且，虽然H19RNA被RNA聚合酶II转录，然后拼接和聚腺苷化，但似乎它不被翻译。反之，发现H19 RNA和28S细胞质RNA有关，导致人们推测H19 RNA可能作为核糖核苷酸蛋白的RNA组分起作用(同上)。
H19的真正生理作用还没有完全了解。H19能作为一种显性致死基因起作用；H19转基因的高异位表达引起小鼠将要出生前的致死性(Brunkow等，上文)。该致死期恰与H19的表达被抑制的时间相一致。另一方面，在携带H19敲除等位基因的杂合或纯合的小鼠中，没有观察到缺陷(Leighton等，1995，自然375：34-39)。敲除母系遗传的等位基因确实干扰遗传连锁和相反印记IGF-2基因的印记过程；由于增加的出生前IGF-2的表达，得到的小鼠出生时比同窝鼠更大(同上)。因为这2个相反印记基因具有顺式作用的调节序列，Leighton和同事们推测H19可能涉及IGF-2基因的印记。
提出的H19基因产物的另一个功能是肿瘤抑制RNA。Hao等人(1993，自然365：764-767)报道用H19表达构建体转染的2种胚胎性肿瘤细胞系，RD和G401，导致在裸鼠中细胞生长阻滞，形态改变和降低致癌性。已注意到上述肿瘤抑制活性与小鼠中观察到的异位表达的致死性(Hao等，同上)以及敲除母系H19等位基因的小鼠增加体积(Leighton等，同上)的结果一致。然而，H19是肿瘤抑制因子的建议存在争议。某些结果被报道不能重复，可能存在另一种与H19紧密连锁的候选肿瘤抑制基因(Areil等，同上)。建议的H19作为肿瘤抑制因子的作用还与以下实验数据相抵触，即H19在广泛种类的肿瘤细胞中活化(如见例如Lustig-Yariv等，1997，癌基因23：169-177)。
2.2  胰岛素样生长因子(IGF)基因
IGF-2是另一种其表达依赖于它们父系来源的印记基因。不过与H19相反，在小鼠和人类中的IGF-2为母系印记，因此从父系遗传的等位基因表达(Rainier等，1993，自然363：747-749)。人IGF-2基因显示复杂的转录类型。有4种在组织中和以发育特异的方式活化的IGF-2启动子。在胚胎发育过程和癌组织中，仅3种启动子P2、P3和P4被印记和活化。第4种启动子P1不被印记，仅在成年肝和脉络膜丛中活化(见Holthuizen等，1993，分子生殖发育35：391-393)。IGF-2基因的P3启动子与肝硬变和肝细胞癌的发展有关(Kim和Park，1998，韩国医学科学杂志13：171-178)。
IGF-2印记的丢失与Wilm′s肿瘤有关(Ogawa等，1993，自然363：749-751)。该观察结果导致许多研究者推测印记的丢失和印记基因的双等位表达可能涉及癌的生长失调和发展(也见Rainier等，1993，自然362：747-749和Glassman等，1996，癌症遗传细胞遗传杂志89：69-73)。
2.3  肿瘤特异的基因治疗
来自肿瘤有关的基因的调节序列被用于选择地导向表达在衍生于肿瘤细胞中的自杀基因。例如，在肝细胞癌中诱导甲胎蛋白的表达。Huber等(1991，美国国家科学院院报88：8039-8043)用来自白蛋白基因或胎儿蛋白基因的控制序列将水痘带状疱疹胸腺嘧啶激酶(VZV TK)基因编码序列在肝癌细胞中导向表达。用含有这些表达构建体之一的逆转录病毒载体感染的肝癌细胞表达VZV TK而变得对正常无毒性的药物原6-甲基嘌呤阿拉伯核苷(araM)敏感。Kaneko等，(1995，癌症研究55：5283-5287)构建了在甲胎蛋白控调序列控制下表达HSV TK的腺病毒载体。含有该载体的重组腺病毒颗粒被直接注射到在无胸腺裸鼠中产生的衍生于肝细胞癌的肿瘤。接着用9-(1，3-二羟基-2-丙氧甲基)鸟嘌呤腹膜内注射引起衍生于肝细胞癌的肿瘤消退。
Osaki等(1994，癌症研究54：5258-5261)把一种表达构建体转染到A549肺癌细胞中，该表达构建体含有连接负责简单疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV TK)的编码序列的肺癌胚抗原基因的控制序列。所转染的细胞对9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤敏感。另外，在裸鼠中来自皮下注射转染细胞的肿瘤生长被重复的腹膜内注射9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)所抑制。不过，最近描述该癌胚抗原基因在正常结肠粘膜中表达，因而限制了这些控制序列作为肿瘤特异调节区的有用性(Osaka等，同上)。因此，开发在肿瘤细胞中特异性表达基因产物的基因治疗载体仍有必要。
3.发明概述
本发明涉及诱导在肿瘤细胞中选择性表达异源基因的方法和组合物。具体而言，本发明涉及包含操作性与异源基因连接的调节转录序列的多核苷酸，它引起异源基因的肿瘤特异表达。更具体而言，该调节转录序列来源于在癌细胞中特异表达的基因组印记基因如H19，IGF-2 P3和P4启动子，而异源基因编码细胞毒蛋白或细胞抑制基因产物。在本发明的另一个实施方案中，IGF-1启动子与异源基因操作性相连接，以导致肿瘤特异的基因表达。该调节序列将调节在许多不同癌细胞类型中的基因表达。上述方法和组合物可用于广泛种类的癌症和增殖过度病情的治疗。
本发明还涉及一种包含与调节序列操作性连接的编码细胞毒性基因产物的异源序列的多核苷酸在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途，其中该调节序列来自H19启动子调节元件。
本发明的另一方面是含有多核苷酸的表达载体，该多核苷酸包括上述与异源基因操作性连接的调节区。特别优选的调节区是那些编码H1 9调节区如启动子和增强子序列，IGF-2 P3或P4启动子或IGF-1启动子。从那种连接方式，H19的增强子和其活性部分可用于与H19启动子、IGF-1启动子、IGF-2 P3启动子或IGF-2 P4启动子形成任一种组合。本发明还包括含有上述载体的宿主细胞。关于这方面，含有由具有或没有H19增强子的H19启动子控制的异源基因的表达构建体可以和第2种构建体共导入到细胞中，其中该第2种构建体含有由与H19增强子组合在一起的IGF-1启动子或IGF-2 P3或P4启动子控制的异源基因。在另一方面，本发明提供用上述载体在肿瘤细胞中表达异源基因的方法。而本发明的另一方面是在基因治疗中利用本发明的载体治疗癌症。
4.附图简述
图1A-1C.人H19启动子区的核苷酸序列。显示从核苷酸位-837-7(相对于转录起始点)的启动子区(SEQ ID NO：1)。
图2.在H19调节序列的控制下用所述的载体表达异源基因的简图。
图3A-3E.H19调节序列指导异源基因(CAT)在膀胱癌细胞系中的表达。对于5种所示的不同细胞系，CAT的比活(cpm/μg蛋白)以所用转染的载体的函数作图。图3A：HT-1376细胞、图3B：EJ28细胞、图3C：T24P细胞、图3D：1197细胞、图3E：UM-UC-3细胞。下面的载体将在下面第6节更完整地描述：(1)pCAT-基础；(2)pCAT-对照；(3)pH19E；(4)pH19EH19D；和(5)pH19EH19R。
图4A-4E.IGF-2 P3和P4启动子指导异源基因在膀胱癌细胞系中的表达。对于5种所示的不同细胞系，萤光素酶的比活(每μg蛋白的计数)以在转染构建体中所用的指导萤光素酶表达的IGF-2启动子的函数作图表示。图4A：T24P细胞；图4B：1376细胞：图4C：UM-UC3细胞；图4D：1197细胞；图4E：EJ28细胞。所述的载体在下面第10节更完整地描述。
图5.人H19启动子片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
图6.0.9kb的H19增强子片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
图7A和7B.2kb的H19增强子片段的核苷酸序列
         (SEQ ID NO：4)。
图8A-8C.4kb的H19增强子片段的核苷酸序列
        (SEQ ID NO：5)。
图9A-9C.用含有各种H19调节区和P4启动子组合的载体的转染指导萤光素酶在肿瘤细胞中表达。图9A：5637细胞；图9B：Huh 7细胞；图9C：293T细胞。
图10A-10E.用含有H19调节区的载体的转染指导萤光素酶在肿瘤细胞中表达。图10A：293T细胞；图10B：T24P细胞；图10C：Huh 7细胞；图10D：5637细胞；图10E：RT112细胞。
5.发明详述
本发明部分基于如下的发现，来源于在肿瘤细胞中表达的基因组印记基因的调节区能用于导向目的编码序列在癌细胞中表达。具体而言，已经发现H19的表达在各种类型的癌瘤中活化，这些肿瘤包括但不局限于膀胱癌、肝细胞癌、成肝细胞癌、成横纹肌细胞瘤、卵巢癌、颈部癌、肺癌、乳腺癌、头颈部扁平细胞癌、食管癌、类胸腺癌、星形细胞瘤、成神经节胶质神经瘤和成神经细胞瘤。而且发现含有操作性与一种异源基因相连的H19启动子区或操作性与一种异源基因相连的IGF-2 P3或P4启动子的构建体，或者含有启动子与H19增强子下游结合在一起的构建体均在肿瘤细胞中被特异性活化。在本发明的另一方面，IGF-1的启动子被用于指导异源基因的表达。
因此，在本发明的一个方面中，本发明提供改变癌细胞表型或选择性杀死癌细胞的方法和组合物。本目的通过把一种多核苷酸输送到所述的细胞来完成，所述的多核苷酸包含来自操作性地与异源基因连结在一起，在癌细胞中表达的基因组印记基因的调节区。例如，该异源基因能编码一种细胞抑制剂或细胞毒剂(如，毒素、反义RNA或核酶)。
在癌细胞中表达的来自基因组印记基因的调节区包括但不局限于H19启动子和增强子，以及IGF-2 P3和P4启动子。
针对在此所描述的本发明的目的，术语“操作性连接”意味着核苷酸序列用如下的方式与调节序列连接在一起，该方式允许所述的核苷酸序列的表达受调节序列指导。
为了本申请的目的，“异源的”基因序列指的是该基因序列一般情况下未与H19基因的调节序列操作性地连接在一起。大体来说，异源基因序列包括编码抑制细胞和细胞毒基因产物的序列。
如本文所采用的术语“表达”，意味着目的DNA的转录和剪接、加工、稳定性以及可选择的相应的mRNA转录体的翻译。根据所传递的DNA分子结构，表达可以是瞬时或连续的。
5.1 H19基因的调节序列，IGF-2 P3和P4启动子和IGF-1启动子
在此描述的是H19调节序列，该调节序列能用于指导异源编码序列在肿瘤细胞中特异性表达。这些H19的调节序列包括上游H19启动子区和/或下游H19增强子区。一种H19启动子区的核苷酸序列在图1A-1C显示(SEQ ID NO：1)。该830个核苷酸的序列从-837延长到帽部位点的-7(如Brannan等的描述，上文)。一个共有的TATA序列出现在核苷酸-27～-35处。2个共有的AP2结合位点(8/9匹配)出现在转录起始位点上游大约-500和-40的核苷酸处。当如在下面更详细讨论的那样被置于异源基因编码区的上游时，大约830个碱基对的调节区足以指导操作性连接的异源基因在也表达内源H19的癌细胞中表达。另外，另一个位于核苷酸-819-+14位核苷酸的H19启动子区(图5，SEQ ID NO：2)也足以指导操作性连接的异源基因在癌细胞中表达。
为了提供增强水平的肿瘤细胞特异性的表达，可任选将人H19基因的下游增强子区加到H19启动子/异源基因的构建体上。如在第6节以实施例的形式更详细描述和阐明的，下游增强子区包含在相对于转录起始位点从+6kb延长到+11kb的SacI限制性片段上。根据增强子序列预计，当在H19启动子控制之下，以反向或正向(相对于内源H19基因中的H19增强子的方向)置于异源基因编码区的下游时，该下游增强子能发挥其作用。另外，含有在图6、7A、7B和8A-8C(SEQ ID NOS 3-5)所示的序列的该增强子片段也可用于方便基因表达。
IGF-1基因的表达和肺癌及乳腺癌有关。IGF-1启动子R(在人IGF-1基因序列中位于核苷酸1-1630的核苷酸序列(基因库登记号M12659 M77496)，在此引入以供参考；Rotwein等，1986，生物化学杂志261：4828-4832)。
用4种不同的启动子区之一表达IGF-2的基因产物。在胚胎组织中这4种启动子的3种被印记和表达；然而，启动子P1仅在成年组织中活化(Sussenbach等，1992，生长调节2：1-9)。P3启动子与肝癌有关。也发现印记的P4启动子(IGF-2基因的核苷酸序列-546～+102)和P3启动子(IGF-2基因的核苷酸序列-1229～+140)在人膀胱癌细胞中活化，并且可用于指导操作性连接的异源基因对肿瘤细胞的表达。IGF-2 P3和P4启动子可与H19增强子或其活性片段结合在一起使用。
这些来自在癌细胞中表达的基因组印记和非印记基因的调节序列能进一步去线性化，以确定获得所希望的肿瘤特异性表达所需的最短调节序列。例如，通过添加、替换或缺失可改变启动子区，然后分析其保留的特异于肿瘤的表达功能。可逐个检测H19下游增强子的各个部分增强从H19启动子转录的能力。
用各种化学和酶方法能引起调节序列中的各种改变，这些方法在本领域的技术人员中众所周知。例如，由限制性位点确定的序列区能被缺失。能用寡核苷酸定点诱变方法以确定的方式改变序列和/或把限制性位点导入到序列特定区中。另外，用诸如Bal 31或ExoIII和S1核酸酶的DNA核酸酶能产生缺失突变体。通过把所述的DNA与核酸酶温育更长的时间逐步产生调节序列中更大的缺失(见Ausubel等，1989，分子生物学现代技术，见诱变技术综述)。
评价改变的序列在合适的宿主细胞，尤其是表达H19衍生于癌，细胞(例如膀胱癌细胞，称为一个实施例)中，指导异源编码序列的特异于肿瘤的表达的能力。为进一步用途保留其指导肿瘤特异表达能力并结合到重组表达载体中的任何改变的调节序列在本发明的范围之中。在这些调节序列的控制下能表达各种类型的异源基因，如编码毒性基因产物、潜在的毒性基因产物、如抗增殖或抑制细胞的基因产物的基因。也能表达标志基因，它们包括酶(如CAT、β-半乳糖苷酶、萤光素酶)、如绿色萤光蛋白的萤光蛋白或抗原标记分子。
广义来说，细胞毒基因产物定义为包括毒素和诱导凋亡剂。此外，针对本发明的目的，细胞毒基因产物包括把前药转变成细胞毒产物的药物代谢酶类。用在本发明方法中的细胞毒基因产物的实施例包括白喉毒素、假单胞菌毒素、蓖麻毒蛋白霍乱毒素、PE 40和肿瘤抑制子基因如视网膜成细胞瘤和p53。此外，也可用编码诱导细胞凋亡的凋亡肽的序列。上述凋亡肽包括阿尔海默茨Aβ肽(见LaFerla等，1995，自然遗传学9：21-30)、前房钠尿肽(见Wu等，1997，生物化学杂志272：14860-14866)、降钙素基因相关肽(见Sakuta等，1996，神经免疫学杂志67：103-109)、以及其他已知的或待发现的凋亡肽。
把前药转变成细胞毒产物的药物代谢酶包括胸腺嘧啶激酶(来自单纯疱疹病毒或水痘带状疱疹病毒)、胞嘧啶脱氨酶、硝酸还原酶、细胞色素p-450 2B1、胸腺嘧啶磷酸化酶、嘌呤核苷磷酸化酶、碱性磷酸酶、羧肽酶A和G2、亚麻苦苷酶(linamarase)、λ内酰胺酶、黄嘌呤氧化酶(见Rigg和Sikora，1997 8月今日分子医学，pp359-366的有关背景资料)。
此外，用本发明描述的表达构建体可把反义、反基因或aptameric寡核苷酸传递到癌细胞中。核酶或单链RNA也能在癌细胞中表达以抑制特殊的目的基因的表达。这些反义或核酶分子作用的靶基因应该是那些对细胞维持或维持癌细胞表型所必需的编码基因产物。上述靶基因包括但不局限于cdk2、cdk8、cdk21、cdc25A、周期蛋白D1、周期蛋白E、周期蛋白A和cdk4。
例如，为了下调内源基因的表达，把下列载体、反义RNAS或核酶导入到细胞中，其中所述的载体在来源于在癌细胞中表达的印记基因或IGF-1启动子的调节序列控制下；而反义RNAS或核酶对癌基因形式的p53、c-fos、c-jun、kr-ras和/或Her2/neu的转录体具有特异性。表达H19和能活化H19调节序列(或特异性地活化IGF-1、IGF-2 P3或P4启动子)的肿瘤细胞能特异地被导向用于表达反义RNA或核酶RNA。
反义方法包括设计与靶mRNA互补的寡核苷酸(在此情况下，mRNA)。该反义寡核苷酸将结合到互补的靶mRNA转录体，然后阻止翻译。绝对的互补性，尽管是优选的，并不需要。在此所指的对部分RNA的序列“互补性”意味着一种具有能和RNA杂交，形成稳定的双链体的足够互补性的序列。杂交能力将依赖于互补性的程度和反义核酸的长度。一般来说，所杂交的核酸越长，它可能含有的与RNA形成的碱基错配就越多，但仍能形成稳定的双链体(或三联体，视具体情况而定)。本领域的技术人员可使用标准方法确定错配的可容许程度，以确定杂交复合体的熔点。
与靶信使RNA的5′末端互补的寡核苷酸，例如直到并包括AUG起始密码子的5′非翻译序列，应最有效地起抑制翻译的作用。然而，最近研究表明，与mRNAs的3′非翻译序列互补的序列也有效地抑制mRNAs的翻译。一般性地参见，Wagner R，1994，自然372：333-335。因此，与靶基因转录体的5′-或3′-非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可用于反义方法，以抑制内源基因的翻译。与mRNA的5′非翻译区互补的寡核苷酸应包括AUG起始密码子的互补部分。与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸是不太有效地翻译抑制剂，但根据本发明可以使用。不管被设计成与靶mRNA的5′、3′或与编码区杂交，反义核酸至少长为6个核苷酸，优选地为长6-约50个核苷酸范围的寡核苷酸。具体来说，该寡核苷酸至少有10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
不管如何选择靶序列，首先进行体外研究以定量确定反义寡核苷酸抑制基因表达的能力是优选。这些研究应该使用对照组，该对照组区分寡核苷酸的反义基因抑制和非特异的生物学效应。将所述的靶RNA或蛋白水平与内部对照RNA或蛋白的水平进行比较的这些研究方法，也是优选的。
设计催化性裂解必需靶基因的核酶分子也能用于阻止靶mRNA的翻译。(如见，PCT国际公开WO 90/11364，1990年10月4日公开；Sarver等，1990，科学247：1222-1255)。当该核酶特异于一种编码对癌细胞生长必需的基因转录体时，上述核酶能引起癌细胞表型的逆转。虽然在特异识别序列的位点裂解mRNA的核酶可被用于摧毁靶mRNAs时，但优选地使用锤头核酶。锤头核酶在与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区所示的位置裂解mRNAs。唯一的要求是靶mRNA具有下列2个碱基的序列：5′-UG-3′。锤头核酶的构建和产生在本领域众所周知，并且在Haseloff和Gerlach，1988，自然，334：585-591的方法中更完整地描述。优选工程化核酶，这样裂解识别位点位于靶mRNA的5′末端附近；即能增加有效性并使细胞内非功能性mRNA转录体的积累最少。
用于本发明的核酶也包括RNA内切核糖核酸酶(下文被称为“Cech型核酶”)，例如在嗜温四膜虫中天然产生的核酶(称之为IVS，或L-19 IVS RNA)，该酶由Thomas Cech和合作者进行了深入的描述(Zaug等，1984，科学224：574-578；Zaug和Cech，1986，科学，231：470-475；Zaug等，1986，自然，324：429-433；大学专利公司出版的公开的国际专利申请号WO 88/04300；Been和Cech，1986，细胞，47：207-216)。Cech型核酶拥有一个8碱基对的活性位点，该位点与靶RNA序列杂交，然后出现靶RNA的裂解。本发明设想使用靶定存在于靶基因中的8个碱基对活性位点序列的那些Cech类型的核酶。
5.2  在肿瘤细胞中的基因活化
重新活化印记基因表达的细胞也能特异地活化表达构建体，其中该表达构建体含有操作性与异源基因相连的上述印记基因调节区。上述细胞，尤其是肿瘤细胞，是本发明基因治疗方法的合适靶物。应用RNA分析、原位杂交和报道基因构建体技术，可以测定H19和IGF-2 P3和P4在肿瘤和细胞系中的特异表达。另外，用指导异源基因表达的IGF-1启动子、可类似地在基因治疗中确定和导向具有活化的IGF-1基因表达的肿瘤细胞。
对于大部分RNA分析应用，用本领域熟知的任何技术制备特异与目的基因转录体杂交的标记探针。该标记探针可含有至少15-30个与H19核苷酸序列互补的碱基，更优选地含有与H19转录体互补的50-150个碱基。针对H19表达的特别优选的杂交探针是一种与H19信使RNA的3′末端互补，从聚A位点上游大约800个碱基对到聚A位点的多核苷酸。
在以下由实施例方式说明的本发明具体实施方案中，用T7或T3表达质粒体外产生标记过的反义RNA探针。在标记核苷酸的存在下通过随机引物法，例如用Prime-It试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA；商品名号300392)，也能标记H19探针。另外，标记探针也能用PCR反应或标准缺刻翻译反应的方法产生，其中在PCR反应中，用H19编码区的cDNA克隆和被设计用来扩增编码区的某一区域的探针。
适于多核苷酸探针的标记物包括掺入了放射性同位素(如35S和32P)、萤光素、发光和显色标签分子和酶组分的核苷酸。
用标准技术原位把标记探针与细胞或组织样品杂交，例如用以下实施例描述的方法及本文引作参考的未决美国专利申请系列号08/704,786的方法。另外，如果能获得足够量的合适细胞，可进行标准RNA分析(如Northern分析、RNA酶保护法或RNA酶引物延伸法)，测定目的基因mRNA的表达水平。
另外，有可能“原位”进行上述基因表达分析，即直接从活检或切除物获得的病人组织的组织切片(固定和/或固定)上进行，这样没有必要纯化核酸。诸如上面描述的那些核酸试剂可在这些原位方法中用作探针和/或引物(例如见，Nuovo，G.J.1992，“原位杂交的PCR法：方法和应用”，Raven出版社，纽约)。
确定一种细胞类型或肿瘤能特异地活化含有操作性与异源基因相连的特异调节区的表达构建体的一种替代方法事实上是把上述表达构建体转染到细胞中。为这些目的，异源基因优选是一种标记基因产物。在一次对标记基因产物分析中的阳性结果显示：细胞或细胞系能从该调节区活化表达。
用这些技术，具有活化的H19表达的实例性肿瘤类型表示如下：
A.儿童实体瘤
1.Wilm′s肿瘤
2.肝胚细胞瘤
3.胚胎性成横纹肌细胞瘤
B.胚细胞肿瘤和滋养层肿瘤
  1.睾丸胚细胞瘤
  2.非成熟卵巢畸胎瘤
  3.骶尾瘤
  4.绒毛膜癌
  5.胎盘点滋养层肿瘤
C.成人表皮肿瘤
  1.膀胱癌
  2.肝细胞癌
  3.卵巢癌
  4.颈部癌
  5.肺癌
  6.乳腺癌
  7.头颈部扁平细胞癌
  8.食管癌
  9.类胸腺癌
D.起源于神经的肿瘤
  1.星形细胞瘤
  2.成神经节胶质神经瘤
  3.成神经细胞瘤
相应地，通过本发明的方法可治疗上述癌症。事实上，活化H19表达的任何肿瘤可通过本发明的方法治疗。
另外，上面提到的技术可用于确定活化IGF-1和IGF-2P3及P4启动子的肿瘤。上述肿瘤也可通过本发明的方法治疗。例如，在儿童肿瘤中，诸如Wilm′s瘤、成横纹肌细胞瘤和成肝细胞瘤中，IGF-2被活化。
5.3  把在调节序列控制下的多核苷酸导入到宿主细胞的方法
本发明也涉及一种用含有操作性与异源基因连接的调节区的多核苷酸转染的宿主细胞。上述宿主细胞可用培养方法维持，或者是动物的一部分，优选哺乳动物。一般来说，用本发明披露的方法和材料，目的多核苷酸可插入到随后被传递的各种载体的任一种中。用完全可靠的分子生物学技术(一般见，Sambrook等(1989)分子克隆I-III卷，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约和分子生物学当代方法(1989)，John Wiley & Sons，所有卷和定期的最新资料，在此引入仅供参考)，能产生上述载体。一般来说，如果需要翻译，也可改造目的异源基因以包含一种如有必要的合适的3′聚腺苷化序列。
5.3.1  培养细胞
用含有操作性与异源基因连接的印记基因调节区的多核苷酸转染的宿主细胞可以是任一种原核或真核细胞。把多核苷酸连接到基因构建体如载体中，然后转化或转染到真核(酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物)或原核(细菌细胞)的宿主细胞中是在微生物或组织培养技术中广泛使用的标准方法。
适于在诸如大肠杆菌的细菌细胞中培养目的多核苷酸的载体包括如下类型的质粒：来源于pBR322的质粒、来源于pEMBL的质粒、来源于pEX的质粒、来源于pBTac的质粒以及来源于pUC的质粒。为了在酵母中复制，YEP24、YIP5、YEP51，pYES2和YRP17质粒是用于把遗传构建体导入到啤酒糖酵母中的克隆和表达载体(例如见，Broach等，1993，基因表达的实验操作，由M.Inouge编著，学术出版社，83页)。这些载体由于存在pBR322 ori能在大肠杆菌中复制，并且由于酵母2μm环形质粒的复制决定子能在酵母中复制。此外，也可用如氨苄霉素的药物抗性标记。
相似地，用于本发明的多核苷酸的优选的哺乳动物载体含有2种原核生物的序列，以便于该载体在细菌中繁殖。应用连接的选择性标记基因，设计上述载体当转染到哺乳动物细胞中时，以长期稳定的方式整合到哺乳动物的染色体上。另外，诸如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒等病毒的衍生物能用于瞬时表达。用于制备宿主生物质粒转化的各种方法在本领域众所周知。有关合适的载体系统以及一般重组方法见Sambrook等，见上文。
5.3.2  基因治疗
本发明也包括含有操作性连接用于基因治疗的异源基因的基因调节区的多核苷酸在治疗癌症和过度增殖疾病中的用途。为了基因治疗的目的，本发明的表达构建体可用任一种生物有效载体施用，如能体内有效地把重组基因传递到细胞的任一种制剂或组合物。这些方法包括把所述的基因插入到病毒载体或重组的细菌或真核生物的质粒中，所述的病毒载体包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺病毒有关的病毒、单纯疱诊病毒-1。病毒载体直接转染细胞；质粒DNA用下列物质辅助下传递，例如阳离子聚合物、阳离子脂质体(如lipofectin，胆固醇衍生物如D.D.A.B.和阳离子磷脂)或其衍生物(如连接抗体)、聚赖氨酸偶联物、短杆菌肽S、人工病毒包被蛋白或其他上述细胞内载体；也可以体内进行裸基因构建体的直接注射、电穿孔或CaPO4沉淀法。用于癌症基因治疗的基因转移和表达系统的最新综述见Cooper，1996，肿瘤学讨论会23：172-187。
应当理解，由于转导合适的靶细胞代表基因治疗的重要的第一步，具体的基因传递系统的选择性将依赖于目标靶物的表型和如局部或全身给药途径等这些因素。而且，应当认为，提供用作体内转导表达构建体的具体基因构建体也用于体外转导细胞，例如用在上面描述的离体组织培养系统中。
优选的体内转导核酸到细胞中的方法是使用含有核酸的病毒载体，例如该核酸为一种在H19调节序列控制下的特异细胞毒基因。用病毒载体感染细胞的优点是大部分靶细胞能接受核酸。此外，在病毒载体中编码的分子，如在病毒载体中含有的cDNA，可在接受病毒裁体核酸的细胞中有效表达。可用本发明披露的方法和组合物传递的合适载体，包括但不局限于单纯疱诊病毒载体、腺病毒载体、腺病毒有关的病毒载体、逆转录病毒载体、假狂犬病毒载体、阿尔发-疱诊病毒载体等。病毒载体尤其是适用于修饰非复制细胞的病毒载体，以及如何使用上述载体目的多核苷酸表达相连接的方法的完整综述，在“病毒载体：基因治疗和神经科学应用”Caplitl和Loewy编著，学术出版社，圣地亚哥(1995)一书中可找到。
已经表明：通过修饰病毒颗粒表面的病毒包装蛋白(例如见PCT公开WO 93/25234和WO 94/06920)，有可能限制病毒和接着基于病毒的载体的感染谱。例如，修饰逆转录病毒载体的感染谱的策略包括：将特异于细胞表面抗原的抗体耦联至病毒env蛋白中(Roux等，1989，美国国家科学院院报86：9079-9083；Julan等，1992，普通病毒学杂志，u3：3251-3255；和Goud等，1983，病毒学163：251-254)；或将细胞表面受体配体耦联至病毒env蛋白中(Neda等，1991，生物化学杂志；266：14143-14146)。耦联方法可以是和蛋白或其他种类的分子化学交联的形式(如把env蛋白转化成脱唾液酸糖蛋白的乳糖)，以及产生融合蛋白(如单链抗体/env融合蛋白)。例如，使用该技术，例如通过将抗肿瘤有关分子的抗体或癌细胞表面蛋白的抗体耦联至重组病毒表面可靶定癌细胞。该技术，在用于限制或另外指导对某些组织类型的感染的同时，也能用于把外向载体转变成兼嗜性载体。
优选的用于本发明的病毒基因传递系统使用衍生于腺病毒的载体。可操作处理腺病毒的基因组，使其编码和表达目的基因产物，而在正常裂解性病毒生活周期中的复制能力方面被失活。例如见Berkner等，1988，生物技术6：616；Rosenfeld等，1991，科学252：431-434；和Rosenfeld等，1992，细胞68：143-155。合适的来源于腺病毒株AD型5 d1324或其他腺病毒株(如Ad2、Ad3、Ad7等)的腺病毒载体在本领域的技术人员中众所周知。在某些情况下重组腺病毒是有利的，因为它们可用于感染各种类型的细胞类型，这些细胞包括气管表皮(Rosenfeld等，1992，见上文的引用)、内皮细胞(Lemarchand等，1992，美国国家科学院院报89：6482-6486)、肝细胞(Herz和Gerard，1993，美国国家科学院院报90：2812-2816)和肌肉细胞(Quantin等，1992，美国国家科学院院报89：2581-2584)。而且，病毒颗粒相对稳定，容易纯化和浓缩，并可被修饰以影响感染谱。此外，导入的腺病毒DNA(和含在其中的外源DNA)不整合到宿主细胞的基因组中但以附加体形式存在，因而避免可能出现的插入诱变的潜在问题，在插入诱变的情形中，导入的DNA成为整合到宿主基因组中(如逆病毒DNA)。再者，相对于其他基因传递载体，腺病毒基因组携带外源DNA的能力大(高达8个碱基对)(Berkner等，见上文的引用，Hai-Ahmand和Graham 1986，病毒学杂志57：267)。普遍使用并因此受本发明推崇的大部分复制缺陷的腺病毒载体，被缺失所有或部分病毒的E1和E3基因，但仍保留多达80％的腺病毒遗传物质(如见，Jones等，1979，细胞16：683；Berkner等，同上；和Graham等，分子生物学方法，E.J.Murray编著(Humana，Clifton NJ，1991)7卷，109-127页)。
另一种用于本发明目的表达构建体传递之一的病毒载体系统是腺伴随病毒(AAV)。腺伴随病毒是一种天然产生的缺陷病毒，该病毒需要另一种病毒如腺病毒或疱诊病毒作为辅助病毒，以进行有效的复制和增殖性生命周期(见Muzyczka等的综述，当代微生物学和免疫学专题158：97-129)。它也是可以把其DNA整合到非分裂细胞并表现为高频率的稳定相互作用的少数病毒之一(例如见Flotte等，1992，美国呼吸协会细胞分子生物学杂志7：349-354，Samulski等，1989，病毒学杂志，63：3822-3828；和McLaughlin等，1989，病毒学杂志63：1963-1973)。含有少达300个AAV碱基对的载体能被包装和整合。对外源DNA的空间限制为大约4.5kb。诸如在Tratschin等，1985，分子细胞生物学5：3251-3260中描述的一种AAV载体可用于把DNA导入到细胞中。用AAV载体，已把各种核酸导入到不同类型的细胞中(例如见Hermonat等，1984，美国国家科学院院报81：6466-6470；Tratschin等，1985分子细胞生物学4：2072-2081；Wondisford等，1988，分子内分泌学2：32-39；Tratschin等，1984，病毒学杂志51：611-619；和Flotte等，1993，生物化学杂志268：3781-3790)。
除了如上述所描述的病毒输送方法外，也可以使用非病毒方法以引起所需的外源基因在动物组织中的定向表达。大多数基因输送的非病毒法依赖于由哺乳动物细胞用于吸收和胞内运送大分子的普通机理。在优选的实施方案中，本发明的非病毒基因传递系统依赖用于靶向细胞吸收目的表达构建体的胞吞通路。该类型的说明性基因传递系统包括来源于脂质体的系统、聚赖氨酸偶联物和人工病毒包被。
在临床应用方面，用于治疗性表达构建体的基因传递系统可由众多方法之任一种导入到病人中，其中每一种方法在本领域众所周知。例如，基因传递系统的药用制剂可通过如静脉注射而全身性导入，并且由于异源基因的调节序列受控表达，或者与基因传递载体靶向具体细胞类型结合的调节序列，该构建体在靶细胞中的特异表达根据由细胞类型或组织类型表达所提供的转染特异性显著地发生。在另一种实施方案中，伴随着导入相当局限的动物中，重组表达构建体的初始传递更受限制。例如，可用导管(见美国专利5,328,470)或立体注射法(例，Chen等，1994，美国国家科学院院报91：3054-3057)导入基因传递载体。可在基因治疗构建体中，用例如由Dev等，1994，癌症治疗综述20：105-115所描述的技术经电穿孔法传递本发明的表达构建体。
基因治疗构建体的药用制剂本质上由在可接受的稀释剂中的基因传递系统所组成，或者可包含一种缓释基质，其中所述基因传递载体包埋在该基质中。另外，在完整的基因传递系统可完整地从重组细胞产生时，例如逆转录病毒载体，该药用制剂可包括产生基因传递系统的一种或多种细胞。
5.3.3  治疗终点和剂量
普通技术人员应当懂得，从医生或病人的角度来看，任何基本上缓解或预防和癌症病情有关的非所希望的症状(如，疼痛、敏感性和体重减轻等)是合乎要求的。另外，任何肿瘤重量或生长率的降低以及改善肿瘤组织病理图像是所希望的。因此，关于本申请的目的，在此所用的术语“治疗”、“治疗用途”、或“医药用途”指的是所要求保护的组合物的任何及所有的用途，其中这些组合物治疗疾病状态或症状，或者换言之用任何提及的方法预防、阻止、延缓或逆转疾病的发展或其他非所需的症状。
有效剂量和治疗方案可通过常规方法确定，在实验室动物中用低剂量开始，然后增加剂量并同时监测作用效果，并也可以用全身性地改变剂量方案。动物研究，优选地哺乳动物研究通常被用来确定每公斤体重生物活性剂的最大可耐受剂量，或MTD。本领域的技术人员通常外推有效剂量并避免对其他物种，包括人类的毒性。
进行对人的效能研究前，在正常个体中的I期临床研究有助于确立安全剂量。当确定对给定个体的最佳剂量时，临床医生可能考虑许多因素。这些因素中最主要的是所选择的异源基因产物的毒性和半衰期。其他因素包括病人的个体大小、病人的年龄、病人的一般情况、被治疗的具体癌症、疾病的严重度、病人所用的其他药物、基因产物的体内活性等。考虑动物研究的结果和临床文献后，选择实验剂量。
例如，含有操作性与一种异源基因连接的H19调节区的腺病毒载体的直接注射到肿瘤块内的一般人用剂量为1×107pfu-1×1010pfu/天，其中所述的异源基因编码一种诸如胸腺嘧啶激酶的细胞毒剂。更优选地，把上述腺病毒载体直接注射到肿瘤内的每日剂量为1×108pfu-1×10-10pfu。对于一种含有操作性与不同水平毒性的细胞毒基因产物连接的H19调节区的腺病毒载体来说，这些值当然将作相应的改变。也能用相似剂量的一种腺病毒载体作为表示性起点，其中该腺病毒载体含有操作性与编码如胸腺嘧啶激酶的细胞毒剂的异源基因的IGF-2P4启动子。
尤其是考虑体内使用时，本发明的各种生化组分优选地具有高纯度并且基本上无潜在的有害污染物(例如，至少国家食品(NF)级、通常至少分析级和优选地至少药用级)。由于所确定的化合物必须使用前合成，上述合成或随后的纯化优选产生这样的产物，其中该产物在合成或纯化方法中基本上无任何潜在的所用的毒性剂。
对于用于治疗个体的癌症病情，本发明在一方面提供以无菌分装的小瓶或安瓿形式的一种试剂盒或试剂包，其中它含有与编码细胞毒剂的异源基因操作性连接在一起的H19调节区的多核苷酸载体或载体释放细胞。在一实施方案中，以即可给药的制剂的形式，该试剂盒包含单剂或复剂形式的含有一种操作性与编码细胞毒剂的异源基因连接的H19调节区的多核苷酸载体，其中所述的包装内含一种指导其内含物用于治疗癌症的标记物。另外，根据本发明的另一个实施方案，该试剂包提供一种无菌分装的含有上述释放载体的细胞或细胞系的小瓶或安瓿瓶。为了贮存和运输，应该冷冻载体释放细胞或细胞系。另外，该试剂包也可以含有用于培养所述的释放载体的细胞或细胞系的培养基和试剂。
描述本发明后，提供下列实施例用以说明而不是限制本发明。
6.实施例：H19调节序列有利于异源基因在肿瘤细胞系中的表达
本节描述含有置于H19调节序列的控制下的CAT报道基因的各种表达构建体的构建方法，以及将它们转移到几种不同的膀胱癌细胞系。
6.1  材料和方法
6.1.1  细胞系和转染方法
膀胱癌细胞系HT-1376、EJ28、T24P、1197和UM-UC-3从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，并按照ATCC推荐的方法维持。
瞬时转染用磷酸钙转染方法进行。把沉淀物(7μg质粒)加入到30mm平皿0.3×106个细胞的1ml培养基中。16小时后，移去转染培养基并加入新鲜的培养基。转染后24-96小时收获细胞，然后用丁酰基-CoA有机相抽提法(Sambrook等，1989)测定CAT活性。把上层有机相的等分试样(100μl)转移到含有3ml闪烁液的孔中，然后计数。
6.1.2  表达载体的构建方法
pCAT基本质粒(含有多个克隆位点之前的一个CAT报道基因)、pCAT启动子质粒(含有在SV40启动子控制下的CAT报道基因)、pCAT增强子质粒(含有位于CAT报道基因下游的SV40增强子)和一个用于在CAT报道基因上游插入启动子的多克隆位点)以及pCAT对照质粒(含有SV40启动子和增强子控制下的CAT报道基因)，全部按商业途径从Promega(Madison，WI)购得。
为构建含有H19启动子控制下的CAT报道基因的质粒pH19E，首先把H19启动子区(SEQ ID NO：1)克隆到pBluescript II SK+(Promega)中。从人胎盘DNA用下列引物，扩增含有H19启动子序列的多核苷酸。
ESPCR21：CGGTTCCCCACTTCCCCAGTTT(SEQ ID NO：6)
ESPCR22：CGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT
         (SEQ ID NO：7)
用Klenow酶把该PCR产物的末端抹平并克隆到pBluescript IISK+的EcoRV位点上。所插入的DNA用内切酶PvuII、EcoRI和ApaI消化证实。该启动子的方向与载体的lacZ编码区的方向相反。然后用HindIII和PstI切割法切下该启动子区，所得到的大约0.9kb的片段插入到pCAT基本质粒HindIII-PstI位点中以产生pH19E。
按下列方法构建表达质粒，其中该表达质粒含有在H19启动子/CAT报道基因下游2个方向插入的H19增强子区。一条含有H19下游增强子(相对于H19转录起点+6.0kb～+11kb)的5kb SacI片段被克隆到pUC19的SacI位点。然后用EcoRI和HindIII切下该增强子片段，并连接到pBluescript II SK+的EcoRI-HindIII位点上而产生pBhH19En-Sa。用BamHI部分消化pBhH19En-Sa，含有H19增强子(和一个内部BamHI位点)的该5kb片段被克隆到在pH19E中H19启动子/CAT报道基因的下游的BamHI位点上。产生了在正方向(pH19EH19D)和反方向(pH19EH19R)含有H19增强子的质粒。
6.2  结果和讨论
用pCAT基本质粒(在图2命名为P-E)、pCAT对照质粒(在图2命名为pSV40ESV40)、pH19E、pH19EH19D和pH19EH19R的每一种转染5种不同的膀胱癌细胞系HT-1376、EJ28、T24P、1197和UM-UC-3。每种构建体的表达结果在图3A-3E表示。在每种细胞系中，用含有SV40增强子和SV40启动子的pCAT对照质粒观察到最高水平的CAT活性。该构建体用作阳性对照，因为已经确立了SV40调节序列作为基因表达的诱导子。然而SV40调节序列其诱导基因表达的能力并不是肿瘤细胞特异的。用含有在H19启动子的控制下的CAT报道基因的pH19E转染的细胞系，也显示相对于背景明显增加的CAT的表达。由H19启动子诱导CAT活性的水平范围在从HT-1376细胞系中的5倍至在UM-UC-3细胞系中的10倍。把H19增强子加入到H19启动子/CAT报道基因的构建体中进一步增加在某些细胞系中的表达水平。例如，在细胞系EJ28、T24P和1197中，H19增强子明显地增加从H19启动子/CAT报道基因起始的表达。然而，增强子的方向在不同细胞系中得到不同的结果。在细胞系HT-1376和UM-UC-3中，该增强子对表达有微弱影响或没有影响。
这些结果表明人H19启动子区指导操作性连接的异源基因在各种类型的来源于膀胱癌的细胞系中表达。在一些来源于膀胱癌的细胞系中，该H19增强子能进一步增加在H19控制下的报道基因的表达。
7.实施例：一种在H19调节序列控制下的毒素基因
7.1  材料和方法
修饰在上述6节中描述的表达构建体，替代CAT以表达编码毒性产物或药物原的序列。例如，用本领域众所周知的标准克隆方法，移去编码CAT基因产物的序列，并用编码单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)的序列取代。
把H19/药物原表述质粒转染到在6节描述的来源于膀胱癌的细胞系中。当转染到膀胱癌细胞系中时，在9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤的存在下，H19/HSV-TK表达质粒诱导膀胱癌细胞特异的细胞毒性。
8.实施例：在化学诱导的膀胱癌的小鼠模型中的H19表达
8.1  材料和方法
以每笼6只小鼠饲养70只5周龄的雌性C3H/He小鼠(CharlesRiver)，并使小鼠适应12小时光照/12小时黑暗周期的空调房间。在8周龄时，开始实验，把小鼠强制分成对照组(10只小鼠)和实验组(60只小鼠)。随意喂给实验组小鼠溶在饮用水中的0.05％N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺(Tokyo Kasei Kogyo Co.Ltd.东京，日本)。对照组小鼠喂给自来水。实验开始后的第4、8、12、16、20和26周杀死来自两组的动物。用标准方法切下膀胱，固定，并包埋在石蜡块中。
8.1.1  探针的制备
含有小鼠H19编码区的2.1kb的片段亚克隆到pBluescript II KS质粒(Stratagene，La Jolla，CA)中T7和T3 RNA聚合酶结合位点之后。用T7聚合酶(Boehringer Mannheim)和Amersham RPN2006试剂盒，从HindIII线性化的质粒DNA中，体外产生〔35S〕标记的反义H19 RNA。体外产生的转录体具有107cpm/μg的比活。用T3聚合酶(Boehringer Mannheim)和EcoRI线性化模板制备的有义H19mRNA被用作对照。
8.1.2  原位杂交
福尔马林固定组织的石蜡切片(5μM)被固定在3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(3-aminopropyltriethoxylane)(Tespa，Sigma)包被的显微镜用载玻片上，然后37℃干燥过夜。切片用二甲苯脱蜡，用4％多聚甲醛固定，然后用蛋白酶K(Sigma)处理。切片被乙酰化，以降低探针的非特异结合，并通过系列乙醇脱水。
按照Rangini等，1991，Mech.Dev.35：13-24描述的方法(省略thio-AMP步骤)，用〔35S〕标记的RNA探针(比活50,000CPU/μl)杂交。切片与显影膜接触10天，然后用苏木精和伊红复染。在明暗视野照明下用Polyvar(Reichert Jung)显微镜检查载玻片并照相。对照组包括与正义RNA探针杂交及RNA酶预杂交处理。另外，来自成年健康小鼠(不表达H19)和胚胎小鼠膀胱(表达H19)的膀胱切片分别用作阴性和阳性对照。
8.2  结果和讨论
到第26周，所有存活的实验组小鼠出现可触摸的膀胱肿瘤。在化学诱导的膀胱肿瘤中观察到H19的广泛表达。相反，在正常成年膀胱中，未检测到H19的表达。因此，该化学诱导膀胱癌的小鼠模型可用作一种动物模型，用来说明含有操作性与毒素基因相连接的H19调节区的构建体体内特异于肿瘤的细胞毒性。
9.实施例：用H19调节序列以在膀胱癌小鼠模型中表达异源基因的基因治疗
为了体内传递到小鼠膀胱中，把H19/毒素或前药表达质粒结合到脂质体中(如按照Takashita等，1993，临床研究杂志93：652-651所描述的方法，在此引入仅供参考)。用于本实验的小鼠是在上面第8节描述的患有化学的膀胱肿瘤。
简言之，将溶在500μl的Optimen′s无血清培养基(BRL生命技术公司，Gaithersburg，MD)的50μg质粒DNA加到250μl Lipofectamine及250μl水中。混合液在室温下温育30分钟，然后稀释在10ml的平衡盐溶液中(BSS(-)：140mM NaCl，5.4mM KCl，10mM Tris-HCl，pH 7.6)。把溶液在15,000rpm离心30分钟沉淀后，该脂质体重新悬浮在1ml含有1mM CaCl2的BSS(-)中。大约0.2ml的浓缩脂质体经导管施用到载有化学诱导的膀胱肿瘤的小鼠中。带有膀胱肿瘤的对照组小鼠接受没有DNA的脂质体，或者含有在H19调节序列控制下的无关基因的构建体。在确定的时间点，杀死每组的小鼠，用标准方法切下膀胱，固定并包埋在石蜡块中。在原位杂交中用上面描述的H19探针或针对假单胞杆菌毒素基因的编码序列的探针处理另外的切片。此外，比较对照组和实验组之间肿瘤的大小、数量和坏死程度。发现假单胞菌毒素的表达与H19的表达共同定位在来自实验组小鼠的膀胱肿瘤内。此外，与对照组小鼠中的膀胱肿瘤相比较，实验组小鼠中的膀胱肿瘤大小减少并且坏死程度降低。
10.实验例：在肿瘤细胞系中从IGF-2 P3和P4启动子起始的表达
10.1  材料和方法
在本实验中，构建各种含有置于4种不同的IGF-2启动子之一控制下的萤光素酶报道基因的表达构建体，并转移到几种不同膀胱癌的细胞系中。制得了下列人IGF-2启动子/萤光脂酶构建体：
质粒构建体 IGF-2基因核苷酸序列 启动子
Hup1 -980 to+54 启动子1
Hup2 -379 to+271 启动子2
Hup3 -1229 to+140 启动子3
Hup4 -546 to+102 启动子4
在Sussenbuch等，1992，生长调节2：1-9中描述IGF-2的启动子序列，在此引入以供参考。萤光素酶报道基因按商业途径从Promega公司，Madison，WI(目录号#E1641)购到。
10.2  结果和讨论
按上面第6节所描述的方法，把得到的表达质粒转移到人膀胱癌细胞系HT-1376、EJ28、T24P、1197和UM-UC-3中。用试剂盒(Promega公司，Medison，WI，目录号E1500)测定萤光素酶活性。在图4A-4E中显示的结果说明，IGF-2 P4启动子指导在每种所测定的膀胱癌细胞系中萤光素酶报道基因的表达。在细胞系1197中，IGF-2 P3启动子也指导萤光素酶报道基因的表达。在后续的实验中，IGF-2 P3和P4启动子被显示指导萤光素酶在其他肿瘤细胞系包括绒毛膜癌细胞和成横纹肌细胞瘤细胞中的表达。
11.实施例：H19启动子和IGF-2启动子与H19增强子一起作用促进异源基因的表达
11.1  材料和方法
4种萤光素酶报道基因载体，pGL3-基本、pGL3-启动子、PGL3-增强子和pGL3-对照从Promega公司获得。用多种不同的转染试剂和磷酸钙方法(Gorman等，1982，分子细胞生物学2：1044-1051)，把这些载体转染到培养细胞系中，所用的转染试剂包括lipofetamine(Gibco/BRL)、fugene(Boehringer)、8种脂质试剂的完美转染试剂盒(Invitrogen)、TFX-10、TFX-20、快速转染试剂盒(Promega)。
被克隆到pBluescript II SK的EcoRV位点上的H19启动子(pbh19p#1)在第6节描述，同上。通过用SmaI和HindIII切割切下H19启动子，然后将所得列的0.9kb的片段插入到pGL3-基本载体的SmaI-HindIII位点上，以产生Luc-pbh19构建体。
用引物5′-ATATGGTACCGACAACCCTCACCAAAG-3′(上游，SEQ ID NO：8)和5′-ATATAAGCTTCTTCTCCCTCACCCTGCTC-3′(下游，SEQ ID NO：9)，从pbh19p#1质粒经PCR法扩增来自nt-819-+14的H19启动子区。用kpnI和HindIII消化所得到的PCR产物，然后连接到pGL-3-基本载体的KpnI-HindIII位点上，产生Luc-PBH19构建体。该PCR产生的H19启动子通过自动染料终止子循环测序法(ABT Prism 377 DNA测序仪，Perkin Elmer)，在2个方向测序。图5显示通过PCR产生的H19启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
按第6节描述的(同上)5kb H19下游增强子用DamH消化，产生2条片段4.1kb和3′末端的0.9kb。把H19增强子的0.9kb和4.1kb的BamHI片段分别插入到Luc-PBH19质粒的BamHI位点上构建Luc-PBH19-0.9EH19和Luc-PBH19-4EH19构建体。该增强子序列定位在H19启动子/萤光素酶报道基因的下游。
将0.9kb BamHI增强子片段连接至pGL-基本载体的BamHI位点以产生Luc-0.9EH19载体。用KpnI-BamHI切下pbh19p#1质粒的H19启动子，并连接至Luc-0.9EH19构建体的KpnI-BglII位点，产生包含如节6，见上文所描述的启动子克隆和位于H19Luc报道基因下游的0.9kb增强子的Luc-pbh19-0.9EH19表达载体。
用Sussenbach等，1992，生长调节2：1-9中所描述的方法，构建分别在人IGF-2启动子P1、P2、P3和P4控制下含有萤光素酶基因命名为Hup-1、Hup-2、Hup-3和Hup-4的表达载体。用引物5′-ACAGGTACCTCTAGAGTCGACCT-3′(上游，SEQ ID NO：10)和5′-ATATAAGCTTGCTCCCATCCTGCA-3′(下游，SEQ IDNO：11)，从Hup-4构建体通过PCR法扩增512bp的P4区。所得到的PCR产物用KpnI-HindIII消化，然后连接到pGL3-基本报道基因载体的KpnI-HindIII位点，以产生Luc-P4报道基因的载体。
还制备了含有IGF-2 P4启动子和H19增强子的表达裁体。一条来源于前面描述的4.1kb片段的2kb BamHI增强子片段被克隆到Luc-P4构建体的BamHI位点，产生Luc-P4-2EH19表达载体。
用自动DNA测序法对0.9kb、2kb和4.1kb的H19增强子测序。0.9kb增强子的核苷酸序列在图6显示(SEQ ID NO：3)。2kb增强子的核苷酸序列在图7A和7B显示(SEQ ID NO：4)。4.1kb增强子的核苷酸序列在图8A-8C显示(SEQ ID NO：5)。
11.2  结果和讨论
当用几种转染试剂把4种含萤光素酶基因的载体导入到培养的细胞系时，对大部分所测定的细胞系来说，磷酸钙沉淀法产生最高的转染效率。因此，钙沉淀法随后被用来转染各种表达载体。此外，增加质粒DNA的浓度不抑制转染效率，甚至它们在平台期以上的浓度使用时也如此。
将膀胱癌细胞系5637、肝细胞癌(HCC)细胞系Huh7和肾瘤细胞系293T用不同构建体的每一种转染，所述的构建体含有和H19增强子结合在一起在H19或IGF-2 P4启动子控制下的萤光素酶报道基因。
相对于背景，用含有报道基因和H19启动子的Luc-ph19和Luc-PH19转染的细胞表现为增加基因表达(图9A-9C)。在所测定的每种细胞系中，含有PCR产生的启动子的构建体Luc-PH19比Luc-ph19表现为更高的活性。把H19 0.9kb的增强子片段添加到Luc-ph19报道载体(Luc-ph19-0.9EH19)上进一步在细胞系5637和293T中分别增加表达水平，为2-4倍。
相对于背景，IGF-2 P4启动子也增加在所有的细胞系中萤光素酶的表达。把2kb H19增强子片段添加到Luc-P4表达载体上增强P4启动子活性。由2kb增强子片段诱导的萤光素酶活性水平的范围从293T细胞系的2倍至Huh7细胞系中的6倍，而该增强子仅微弱地增强在5673细胞中的启动子活性。
图10A-10E显示含有PCR产生的H19启动子和4.1kb H19增强子片段的构建体Luc-ph19-4EH19的表达。除了在5637细胞系外，该增强子在细胞系中将启动子活性增强3-28倍。
12.克隆的保藏
根据用于专利程序的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约的有关规定，将下述质粒保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)、Manassas，VA。
克隆                ATCC                保藏日期
                    登记号
pH19EH19            209322            1997年10月2日
                        等值方案
前面描述的具体内容足以使本领域的技术人员实施本发明。的确，对分子生物学、医学或相关领域的技术人员来说显而易见的在实施本发明时作出上述方案的各种修改方案被认为在下列权利要求的范围之内。
在此引用的所有出版物其全文被引出参考。
                            序列表
<110>耶路撒冷希伯莱大学伊森姆研究开发公司
<120>诱导对肿瘤特异的细胞毒性的方法和组合物
<130>9457-0014-228
<140>PCT/IL98/00486
<141>1998-10-04
<150>US 09/165,240
<151>1998-10-01
<150>US 08/943,608
<151>1997-10-03
<160>11
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>830
<212>DNA
<213>人类
<400>1
ctgcagggcc ccaacaaccc tcaccaaagg ccaaggtggt gaccgacgga cccacagcgg     60
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<211>833
<212>DNA
<213>人类
<400>2
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agtcgaaact cgccagtctc cactccactc ccaaccgtgg tgccccacgc gggcctggga    120
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<210>3
<211>877
<212>DNA
<213>人类
<400>3
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<210>4
<211>1960
<212>DNA
<213>人类
<400>4
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<210>5
<211>4085
<212>DNA
<213>人类
<400>5
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tcccctctag agagaaacgt ggaggtcctg gggctggggg cgctcatagc cctgtgacac    2100
aggtgcatgg ggtcaggggt cccagaatgg cccctgggaa ggacctcagc tgggccggcg    2160
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tgccagggcc tcccagagcc ctgtgagccc ctggggggtc tggcctgatg cccccctcca    2460
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acccaggaga ggcctcgcct ccactgaggg gccaccgacc tctgtcagac cacagagacc    2580
cccaaggagt ctgaaggctg gagacccggg gctgggacca ggtgggactt tcccacggag    2640
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gacccaggac catccaggga ggcccgtctg tggggcaagc gggaagggag cggctggaga    2940
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cccagtgagt gatgtccagg ggccctggaa aggtcacagc atgtttgagc ggggtgagag    3060
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caggtcccct cccctcatta ccaggcctag agcctccagt cccggtggcc cccagcccga    3420
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aaggctgaat ttcacgtgtc ctgtgacttg ggtagacaaa gcccctgtcc aaaggggcag    3840
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atataagctt gctcccatcc tgca                                           24

Claims (20)

1.一种包含与调节序列操作性连接的编码细胞毒性基因产物的异源序列的多核苷酸在制备用于治疗患者的癌症的药物中的用途，其中该调节序列来自H19调节元件。
2.权利要求1的用途，其中该H19调节序列是H19启动子、H19增强子或H19启动子和H19增强子两者。
3.权利要求2的用途，其中该H19启动子包含SEQ ID NO：1的1-830位的核苷酸。
4.权利要求2的用途，其中该H19启动子包含SEQ ID NO：2的序列。
5.权利要求2的用途，其中该H19增强子包含克隆在ATCC保藏号209322的质粒pH19EH19中的H19增强子的序列。
6.权利要求2的用途，其中该H19增强子包含SEQ ID NO：3的序列。
7.权利要求2的用途，其中该H19增强子包含SEQ ID NO：4的序列。
8.权利要求2的用途，其中该H19增强子包含SEQ ID NO：5的序列。
9.权利要求2的用途，其中该H19增强子被置于异源序列的3′侧。
10.权利要求1-9中任意一项的用途，其中该癌症是膀胱癌。
11.一种载体，该载体含有一种包含与编码细胞毒性基因产物的异源序列操作性连接的调节序列的多核苷酸，其中该调节序列来自H19调节元件。
12.权利要求11的载体，其中该H19调节序列包括H19启动子、H19增强子或H19启动子和H19增强子两者。
13.权利要求12的载体，其中该H19启动子包含SEQ ID NO：1的1-830位的核苷酸。
14.权利要求12的载体，其中该H19启动子包含SEQ ID NO：2的序列。
15.权利要求12的载体，其中该H19增强子包含克隆在ATCC保藏号209322的质粒pH19EH19中的H19增强子的序列。
16.权利要求12的载体，其中该H19增强子包含SEQ ID NO：3的序列。
17.权利要求12的载体，其中该H19增强子包含SEQ ID NO：4的序列。
18.权利要求12的载体，其中该H19增强子包含SEQ ID NO：5的序列。
19.权利要求12的载体，其中该H19增强子被置于异源序列的3′侧。
20.包含权利要求11-19的任意一项的载体的宿主细胞。
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