HU228470B1 - Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity - Google Patents

Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity Download PDF

Info

Publication number
HU228470B1
HU228470B1 HU0003745A HUP0003745A HU228470B1 HU 228470 B1 HU228470 B1 HU 228470B1 HU 0003745 A HU0003745 A HU 0003745A HU P0003745 A HUP0003745 A HU P0003745A HU 228470 B1 HU228470 B1 HU 228470B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
expression
promoter
sequence
vector
Prior art date
Application number
HU0003745A
Other languages
English (en)
Inventor
Abraham Hochberg
Suhail Ayesh
Original Assignee
Yissum Res Dev Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yissum Res Dev Co filed Critical Yissum Res Dev Co
Publication of HUP0003745A2 publication Critical patent/HUP0003745A2/hu
Publication of HUP0003745A3 publication Critical patent/HUP0003745A3/hu
Publication of HU228470B1 publication Critical patent/HU228470B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Génterápiás eljárás és vektor tumorspecifikus cxtotoxxcitás í ndckálására
A találmány a 08/943608; sorozatazárná, 1977. október 3-án bejelentett, függő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés: részben folytatólagos bejelentése, mely referenciaként teljes terjedelmében a leírásba épül.
A. találmány a tumorsej/biológia és a rákgyőgyitás szakterületébe tartozik. Pontosabban a találmány haterőlóg gének, különösen eitotoxikus termékeket kódoló gének specifikus expressziéjára vonatkozik tumorsejlekben.
A Ή19 gén az egyike annak a néhány génnek, melyről tudjuk, hogy impríntingen esik át emberekben íüurst et al., Natúré
Genetics 42, 234-237 (1996; s. Az embríogenezis legelején a H19 mindkét kromoszómálís alléiról expresszáiödik iDeGroot et al,,
Trophoblast 8, 285-302 (1994)1. Röviddel ezután az apai allélek &
némává válnak, és csak az anyától örökölt alléi Íródik át.
A H19 nagy mennyiségben expresszáiödik az embriogenezís alatt, és ez volt az első gén, amelyről megállapították, hogy azt és az alfa-fötoprpteínt a májban a transz módon ható ra.f lőkusz együttesen szabályozza (Pachnis eb al., Proc. háti, Acad. Sci. USA 81, 5523-5527 (1984)}. Továbbá a H19-t egymástól függetlenül. több munkacsoport is kiónozta a szöveti differenciálódás alatt expresszáiódő gének izolálására végzett szűrőéijárásokat alkalmazva. Például Davis ős munkatársai (Cell 51, 987-1000 * * * ♦ (1987} | a H19 egér homológját olyan gének szűrésével azonosították, melyek a C3H10TÍ/2 sejtek differenciálódása alatt korán express2álódnak. Pourier és munkatársai (Development 113, 110511X4 (1991)1 megállapították, hogy az egér Hl9 az őssejtek differenciálódása alatt és az implantáció .folyamán expresszálódott. Felfedezték, hogy humán. R19 gén a citotrofoblasztok humán piacentából történő differenciálódásánál is átírődik (Rachmilewitz et al., Molec. Repród. Dev. 32, 196-202 (1992)},
Míg a H1.9 RNS transzkripciója számos különböző embríogén szövetben előfordul a magzati élet egész ideje alatt, a Hl 9 expressziója a születés után gátlődik. Továbbá a HIS transzkripció viszonylag alacsony szintjeiről számoltak be felnőtt egerek izmaiban és májában (Brunkow és Tilghman,· Genes & Dev. 5, 10921101 (1991)}, A H19 születés után a ráksejtekben szintén aktiválódik. Ariéi és munkatársai (Molec, Pathol. 50, 34-44 (1997)]
Hl9 expressziót mutattak ki számos olyan szövetből származó tumorban, melyben a H19 a születés előtt expresszálódott. Továbbá ezek a szerzők H19 RNS-t találtak az idegi szövetekből származó tumorokban, különösen az asztrocitémákban és osngiioneurobiasztómákban, melyekről nem volt ismert, hogy HIS expresszi© társulna hozzájuk. A HIS RNS-t expresszálö tumorok nagy száma miatt ezek a szerzők azt feltételezték, hogy a Hl 9 egy onkofötális RNS, és javasolták, begy a B19~t, mint a humán neoplázía (daganatképzodés) markerét kellene megvizsgálni.
Az ember és az egérféiék Hl 9 génjét is klónozták és szekvenálták már [Brannan et al., Molec. Cell. Bioi, 10, 2S-36 (1990)). Az emberi és egér HÍ9 gének összehasonlításából összesen 771-os nuklectidszekvencia-azonossáo derült ki. Annak, eile3 nére# hogy a két faj nukleotidhomológiája ilyen mértékben megőrződött , csak nagyon kicsi kikövetkeztetett aminosav-szekvencia azonosságot tudtak megjósolni a két gén nyitott leolvasási kereteiből (fentebb) . Továbbá/ bár a HIS RK-S-t az RNS polimerét II átírja, majd splicing-on esik át és poiiadenileződik, ügy tűnik, hogy nem trans-ziálódik. Ehelyett úgy találták# hogy a Hl9 RNS a 28S cito-p.lazmat.ikus RNS-hez kapcsolódik# mely ahhoz, a feltételezéshez vezetett# hogy a Hl9 RNS talán egy rifeonukleoprotein RNS komponenseként működik (fentebb) .
A Hl9 valódi fiziológiai szerepét még nem értjük egészen. A H19 domináns letáiis génként működhet? egy HIS transzgén nagymértékű rendellenes expressziója. letalitást okoz egerekben röviddel a születés előtt (Srunkow et al.# fentebb]. Ez a letáiis időszak egybevág azzal az időszakkal# amikor a HI9 transzkripció represszálttá válik. Másrészről sem a heterozigóta, sem- a homozigóta H19 knockout alléleket hordozó egerekben nem. figyeltek meg defektust' (Leighton st a.I., Natúré 37 S, 34-39 (1995) ]. Az anyai ágon öröklődő alléi knockoutja befolyásol ja a genetikailag kapcsolt és ellentétes imprlntingen áteső 1GF-2 gén imprintíngjét; a kapott egerek születéskor nagyobbak, mint az alomtársak az IGF-2 megnővekadétt születés előtti expressziőjának köszönhetően (fentebb). Hívei ez a két ellentétes impri.ntxngen áteső gén cisz működésű szabályozó szekvenciákat képez# Leighton és munkatársai feltételezték# hogy a H19 talán az 1GF-2 gén imprintíngjében. vesz részt.
Egy másik javasolt H19 géntermék funkció a tumor szuppresszor
RNS funkció. Hao és munkatársai (Natúré 365, 7 6-4-7 67 (1993) } beszámoltak arról, hogy két embrionális tumor sejtvonalat, az RD-t és G401~t egy H19 expressziös· szerkezettel transzfektálva a sejtnövekedés lassulását, morfológiai változásokat és csökkent tumorigenitást értek el csupasz egerekben. Megfigyelték, hogy az ilyen tumor szuppresszor aktivitás Összhangban áll azzal, hogy a rendellenes expresszié letalltást okoz az egerekben (Ha© et ai., fentebb], valamint azzal, hogy azoknak az egereknek, melyeknél kiütötték az anyai HIS alléit, megnövekedett a méretük (Leighton et al., fentebb], Azonban az a feltételezés, hogy a H19 egy tumor szuppresszor, vitázott. Az eredmények közül állítólag néhány nem volt reprodukálható, és más, a HIS-oei szoros kapcsoltságban lévé tumor szuppresszor gén jelöltek is léteznek (Ariéi et al., fentebbi . A H19 javasolt tumor szuppresszor szerepe szemben áll azokkal a kísérleti adatokkal, melyek szerint a H19 a tumorsejtek széles körében aktiválódik (lásd például LustigYariv et al,, Oncogene 23, 1S9-177 (1997)].
Az inzulinszerű növekedési faktor (IGF) gének
Az IGF-2 egy másik olyan impríntingen áteső gén, melynek az expressziéja attól függ, hogy melyik szülőtől származik. Azonban szemben a ülS-cei, az IGr-z-nél mind állatokban, mind emberekben az impri.nt.ing anyai ágon megy végbe, és ezért az az apai ágon örökölt alléinkról expresszálödik [Rainer et ai., Natúré 363, 747-749 (1933)1 . A humán ÍGk-2 gén kompi ex transzkripciós mintázatot mutat. Négy IGF-2 promóter létezik, mely szövet- és fejlődésspecifikus módon aktiválódik. A promóterek közül csak három, a P2, 93 és P4 esik át impríntingen, és aktív a magzati fejlődés alatt é rákos szövetekben. A negyedik, a Pl, nem át tmprintingsn, és csak a felnőtt májban és a plexus chorioideusban ía harmadik és a negyedik agykamra
ta isi.h3 tő érfonat} aktiválódik [lásd Holthui2«n et al., Hol. Repród. Dev. 35, 391-393 <19-93)} . Az IGF-2 gén P3 promótere részt vesz a máj c.irrózis és a hepatocelluláris ka-rcinóma kialakulásában [Kin és Park., J. Koreán Med. Sci. 13# 171-173 -(1998) ].
A Wilm tumor az IGF-2 imprintíngjének elvesztését is magában foglalja (Ogawa et al·., Natúré 353# 749-751 {1993)1. Ez a megfigyelés számos kutatót arra a feltételezésre jutatta# hogy az imprinting elveszítése és az imp-r int ingen átesett gének ké-talléles expressziója lehet # hogy részt vesz a növekedési rendellenességekben és a .rák kialakulásában [lásd még Rainer et al.# Katur-e 352., 747-749 (1933)., és -Glassman et al., C-ancer
Génét. Cytogenet. 39, 59-73 (1396)1.
Tumorhoz társult gének szabályozó szekvenciáit alkalmazták egy szüleid gén expressziójának szelektív megcélzására tumor eredetű sejtekben# Például alfa-fötoprotein expresszió indukálódik a hepatocelluláris karcinómáfean. Hube.r és munkatársai (Pro-c# Kati- Acad. Sci USA 38# 839-843· {1991} ] albumin génből vagy alfa-f Ót ©protein génből származó kontro-llszekvenclát alkalmaztak, hogy a Variceiia zoster timidin kinázt (V3V TK) kódoló szekvenciák expressziéj.át hepa.tóma sejtekbe irányítsák. Az egyik ilyen expresszibe szerkezetet tartalmazó retrovirális vektorral fertőzött hepatorna sejtek VZV TK-t expresszált-ak# és érzékennyé váltak a normális esetben nem-toxikus S-metoxipurin-arabinonuk.leozid.ra (arait). Kaneko és; munkatársai [Cancer Rés. 55, 52835287 (1995)1 egy olyan ad-enovirálls vektort szerkesztettek, mely expresszált az aifa-íőtoprotein kontroll szekvenciák
Ezt a vektort tartalmazó re kombi n.áns adenc vírus **« * » részecskéket közvetlenül injektálták a pimasz nélküli csupasz egerekben létrehozott hepatoc-eiluláris karcinóma-eredetű tumorokba. Az ezt követő ganciclovir injekciók a hepatocelluláris karcinóma eredetű, tumorok regresszióját okozták.
Osaki és munkatársai {Canoer Rés. 54, 5258--5261 {1954} j az AS4 9 tüdő karcinóma sejtekbe egy olyan expressziós szerkezetet transzfektáltak, mely a tüdő kareinoembrionális antigén génjének, szabályozó szekvenciáit tartalmazta a Herpes. simplex virus timidin kináz (HSV TK) kódoló szekvenciájához kapcsolva. A transzfektált sejtek érzékenyek voltak a ganciclovirra. Továbbá a csupasz egerekben a szubkután transzfektált sejtekből történő tumornöve.kedés gátlódott a ganciclovir ismételt intraperltoneálie injekcióival. .Azonban a kareinoembrionális gént a közelmúltban úgy Írták le, hogy az a normális vastagbél nyálkahártyán is expresszálódik, emiatt korlátozódott ezeknek a kontroli szekvenciáknak tumorspécifikus szabályozó régiókként való használhatósága (Qsaka et al., fentebb}. Így továbbra is szükség van olyan génterápiás vektorok kifejlesztésére, melyek specifikusan a tumor-sejtekben expresszál jak a gén terméke két.
A találmány tumorsejtekben heteroióg gének szelektív expresszlójának indukáiására szolgáló eljárásokra és készítményekre vonatkozik. Pontosabban a találmány olyan poiinukleotidokra vonatkozik, melyek olyan heteroióg génekhez működőképesen kapcsolt szabályozó transzkripciós szekvenciákat tartalmaznak, melyek a heteroióg gének tumorspeciíikus expressziéját eredményezik. Részletesebben a szabályozó transzkripciós szekvencia egy olyan, genomiáiis imprintingen átesett * -* « * *♦ * ♦* „.♦· sejtekben génből származik, mely specifikusan rákos expresszálódik, mint például a H19, és az XGF-2 P3 és P4 p-romóterek, és a heterológ gén egy citotoxikus fehérjét vagy citcsztatikus géntérmékét kódol, Λ találmány egy másik megvalósulási módjában az IGF-l promótert működőképesen kapcsoljuk össze egy heterológ génnel, hogy ez a gén tumorspecifikus expresszióját eredményezze. A szabályozó szekvenciák a génexpressziőt számos különböző rákos sejttípusba fogják irányítani. Az ilyen eljárások és készítmények a rákok és a hiperproliferatlv állapotok széles körének kezelésében felhasználhatóak.
A találmány egyik tárgyát olyan expressziős vektorok képezik, melyek ilyen szabályozó régiókat tartalmazó polinukleotídokat tartalmaznak működőképesen összekapcsolva a heterológ génekkel. Különösen előnyösek azok a szabályozó szekvenciák, melyek HIS· szabályozó régiókat, úgymint promóter és enhanszer szekvenciákat, ez IGF-2 F3~t vagy ?4 promótert vagy egy IGE-I promótert kódolnak. Ebben az összefüggésben a H19 enhanszer és aktív részei bármilyen 'kombinációban alkalmazhatóak a H19 promóterrel, promóterrel vagy az
pror Péterrel, IGE-
tőrrel A ta iá Imám
Ima zó gazdasejteket
«ί α
s. Ebben a vonatkozásban a heterológ gént tartalmazó- expressziős szerkezet, melyet promóter szabályoz a H19 enhanszerrel vagy anélkül, egy sejtbe együtt vihető be egy második szerkezettel, mely egy olyan heterológ gént tartalmaz, amit az IGF-1 promóter vagy IGE-2 P3 promóter vagy FM promóter szabályoz a H19 enhanszerrel együtt. Egy másik megvalósítási módban <
fr χ ♦ eljárásait biztosítja heterológ gének -express zálására tumoráéjbekben. A találmány egy további tárgya rá'k. kezelése a találmány -szerinti vektorokat alkalmazva a génterápiában.
1A-1C, ábra; A humán HU promóter régió nukleotidszekvenciája.. A -837. helyzettől, a -?< helyzetig terjedő promóter régiót (a transzkripció- sarthalyéhez viszonyítva) mutatjuk be (1. azonosítószámú szekvencia!.
2. ábra: Egy heterológ génnek H19 .szabályozó szekvenciák szabályozásával történő expresszálására. alkalmazott vektorok v«Ut o s d i a g r amm j- a.
3A-3E. ábra: A Hl 9 szabályozó szekvenciák egy heterológ gén (CAT) expresszióját irányítják húgyhólyag rákos s-ejt vonalakban. öt különböző jelzett, sejtvonalnál ábrázoljuk a GAT specifikus aktivitást {cpm/7g fehérje) a tr-anszfekcíóhoz használt vektor funkciójaként, 3A, ábra: HT-137Ó sejtek.. 3-B. ábra: EJ28. sejtek.. 3'C. ábra: T24P sejtek. 3D, ábra: 1137 sejtek. 3E ábra: UM-üC-3 sejtek. A következő vektorokat részletesebben az 1. példában lentebb ismertetjük: (1) pCAT-foasic; 12} pCAT-control; í3g
H) pKlóEHlSD; és íS) pH13EHl9R.
4E. ábra: Az IGF-2 P 3 és P4 promőterek egy hét eroióg gén
tát) expresszió-ját i rányitják húgyhólyag rákos se-jtvona-
bemutatott öt k ü 1Ö n b-ö z ö j e 1 z e 11 sejt v onalnál a
specifikus aktív. ,tést. {cpm/7g fehérje) áh? <3 Z Q i ’1 U X ci
transz-fektéit szerkezetekben alkalmazott, a lu-ciferáz expressz ió jának irányítására, szolgáló IGF-2 p romó tér funkciójaként. 4A. ábra: T24P sejtek. 4B. ábra: 137$ sejtek. 4C. ábra: UM-UC3 sejtek,.. 4D< ábra: 1197 sejtek. 4S. ábra: EJ.28 sejtek.. A vektorokat részletesebben a 4. példában, lentebb ismertetjük.
5. ábra: Egy s humán Hl 9 promóter **** ♦ ** * *** fragmentum
nukleotidszekvenciája (2. azon os i tós zárná szekvencia),
6. ábra: A 0, 9 kb-os Hl9 enhanszer fragmentum
nukl-eotidszekvenciája {3. azonosítős zárná szekvencia).
7A. és 7b< ábra: A 2 kb-o-s Hl 9 enhanszer fragmentum
nukleotidszekvenciája (4. a zenes ítószárná szekvencia).
SA-8C, ábra; A 4 kb-os Hl9 enhanszer fragmentum
nukleotidszekvenciája (5. azonos! tőszámú szekvencia).
9A-9C. ábra: A tumor sejtekben különböző- «19 szabályozó- régió és ?4 promóter kombinációkat tartalmazó vektorokkal történő transzfekció irányítja a lu-ciferáz expressziót. 9A. ábra: 5637 sejtek, 9B. ábra: Huh? -sejtek.,· SC. ábra: 293T sejtek.
ÍÖA-IÓE. ábra: HIS szabályozó szekvenciákat tartalmazó vektorokkal végzett trans-zfekci-ó Irányítja a luciferáz expressziét atumor sejtekben. 10&. ábra: 2S3T sejtek. 108. ábra: 724? sejtek. 10C. ábra: Huh? sejtek, 10D. ábra: 563? sejtek. 1ÖE. ábra: R7112 sejtek.
A találmány részben azon a felismerésen alapul, bogy az olyan genomiális inpríntíngen átesett génekből s tárma zó szabályozó régiók, melyek a rákos sejtekben expresszálódnak, a kívánt kódoló szekvenciák expressziójának irányítására alkalmazhatóak a rákos sejtekben, Fontosabban, úgy találtuk, hogy a HIS expresszié- a kar-cinőmák széles körében aktiválódik., ezek köze tartozik de. nem kizárólagosan a húgyhólyag karcinóma, h-epatocel.iuláris karcinéma, hep-atobiasztőma,· rabdomíosza.rkóma, petefészek karcinóma, cervikáiis karcinóma, tüdő karcinóma, emlőrák, pikkelyes sejt karcinóma a fejben és nyakban, nyelőcső karcinóma, pajzsmirigy karcinóma, as2trocitóma, gangliobl-asztóma és neuroblasztőma. To10 χ**Φ **** **ϊ vábbá felfedeztük, hogy azok a szerkezetek, melyek egy heterolőg génhez működőképesen kapcsolt H19 promótér régiókat vagy egy heterológ génhas működőképesen kapcsolt IGF-2 P3 vagy P4 promőtert tartalmaznak, vagy az Ilyen promótert egy downstream HIS enhanszerrel együtt tartalmazó szerkezetek specifikusan aktivá lódnak a tumor sejtekben,. A találmány egy másik megvalósítási módjában egy IGF-1 promőtert használunk egy heterolőg gén axpressziójának 1rányitására.
Következésképpen a találmány egyik tárgyát eljárások és készítmények képezik a rákos sejtek fenotípusának megváltoztatására vagy szelektív elpusztítására. A találmánynak ezt a tárgyát úgy valósítjuk meg, hogy a sejtekbe egy olyan polinakleotidot juttatunk be, mely olyan, .heterolőg génhez működőképesen kapcsolt, genomiális inprint.ingen átesett génekből származó szabályozó régiókat tartalmaz, melyek rákos sejtekben expresszáiódnak, A heterolőg gén például agy cítosztatikus vágy egy citotoxikus szert {például egy toxint, egy antiszensz RN'S-t vagy egy ribozimot) kódolhat.
Rákos sejtekben expresszálődó- genomiális imprintingen áteső génekből származó szabályozó régiók közé tartozik de nem kizárólag, a H19 promóter és enbanszer, és ez 1GE-2 R3 és Fá promőter.
Az itt leírt találmány értelmében a működőképesen kapcsolt' kifejezés azt jelenti, hogy egy nukleotidszekvencía egy szabályozó szekvenciához olyan módon kapcsolódik, hogy lehetővé válik, hogy a nukleotid-szekvencia expresszióját a szabályozó szekvencia irányítsa.
Egy heterolőg'' génszekvencia, a bejelentés érteimében, egy olyan gén-szekvenciára vonatkozik, mely normális esetben nem kapII χ’·» /‘, *'»« χ**»
Ο 8 . Ο 8 < ·’ * - _ * * >
* <.·· csalódik működőképesen a K19 gén .szabályozó szekvenciáihoz. Általánosságban a heterolog gén-szekvenciák olyan szekvenciákat foglalnak magukban» melyek citosztatikus és ci toboz ikus génter:mé ke ke t kő do In a k,
Ahogy itt használjuk, az *expresszié kifejezés a kérdéses DhS transzkripciójára, .splicíng-jára» érésére» stabilizálódására, és adott esetben az mRNS transzkriptum transzlációjára vonatkozik. A bejuttatott DNS molekula szerkezetétől függően az expresszié átmeneti vagy folyamatos lehet,
A H19 gén szabályozó szekvenciái, az XGF-2 P3 és F4 promófer és az XSF-X promóter
A bejelentésben olyan H13 szabályozó szekvenciákat írunk le, melyek egy he fce.ro lóg kódoló szekvencia tumor-sejt specifikus expressziójának irányítására alkalmazhatóak. Ezek a H19 szabályozó szekvenciák az upstream H19 promóter régiót és/vagy a downstream KIS enhanszer régiót foglalják magukban. Egy H19 promó-fcer régió nukleotidszekvenciáját. az 1A-1C. ábrán matatjuk be (1. azonosítószámú szekvencia). Ez a 830 nukleotidos szekvencia a ~837~es nukleofcidtől a nukleotidig terjed a táp helytől számítva (ahogy Brsnnan és munkatársai leírták, fentebb) . Egy konszenzus TATA szekvencia található a -27. nukleotidtöi. a -35, nukieotidig. Két konszenzus AF2 kötő hely (8/9-es illeszkedés) található- hozzávetőleg a -5ÖŰ. és -40. nuk.leotid.ná.1 a transzkripció kezdetétől felfelé. Amikor a szabályozó régiót egy heterolog gén kódoló régiójától felfelé elhelyezzük, ahogy lentebb részletesen ismertetjük, hozzávetőleg a. szabályozó régió 83ö bázispárja szükséges ahhoz, hogy a működőképesen kapcsolt heterolog gén expresszióját irányítsa azokban a rákos sejtekben, .**'*·* ν*«φ »4&φ ·? ** φ *·'Χ, Φχ* * “ ·’· * melyek endogén HiS-t is expresszáínak, Továbbá, egy másik, a -319. és + 14, nukleotid közötti H19 promóter régió (5. ábra, 2. azoncsifcőszámú szekvencia) szintén alkalmas egy működőképesen kapcsolt heterológ gén expresszlójának irányítására rákos sejtekben..
A humán HIS gén downstream. enhanszer régiója adott esetben hozzáadható egy HIS promóter/heteroló-g gén szerkezethez azért, hogy biztosítsuk a tumorsajt~speoífikus expresszió megnövelt szintjét, Ahogy részletesebben bemutatjuk a 6< példán keresztül, a do:wnstream enhanszer régiót egy Sacl restrikciós fragmentum foglalja magában, mely a transzkripció start helyéhez viszonyítva a + S kb-tói a + 11 kb-ig terjed. Ahogy az egy enhanszer -szekvenciától elvárható, a downstream enhanszer képes kifejteni a hatását, amikor vagy visszafele, vagy -egyenes irányban (a Hl9 gén irányához viszonyítva az endogén H13 génben) egy HIS promóter szabályozása alatt álló heterológ gén kódoló régiójától lefelé elhelyezzük. Továbbá ennek, az enhanszernek a -6., 7&,, 78, és 3A-3C. ábrákon bemutatott szekvenciákat tartalmazó fragmentumait arra használhatjuk fai, hogy elősegítsük a génaxpressziot<
Az 1GF-1 gén .expressziója a tüdőrákhoz és a mellrákhoz kapcsolódik. Az XGF-l promóter az 1-1630, nukleotidok közötti nukieotídszekvencía a humán XGF-1 gén-szekvenciában (Genhank nyilvántartási számi M12659 1477496, mely referenciaként a le*5 sba épül; [Rotwein et al., J. Bioi, Chem. 261,- 4628-4831 géntermék a négy különböző promóter régió egyikét .keimazva expresszáiődik. £ n-égv oromőte.
na rom impriutingen esik át, és emhriooén szövetekben expresszáiődik; a
Pl promótar viszont csak felnőtt szövetekben aktiválódik (Sussenbach et al<? Growth Reg. 2?
hepatokarcinőmában fordul elő. Az<
-9 {1992)). A P3 promőter i s £ e 1.1 s me r t ü k imprintingen áteső ?4 promőter {az 2SF-2 gén -546. nukleotidszekvencíéia) és P3 promóter {az XGF-2 -1229.
nogy a;
- -d02,
- +140.
nukieotidszekvenclája) humán húgyhólyag ráksejtekben aktiválódik, és arra alkalmazható, hogy egy működőképesen kapcsolt heterológ gén expresszié ját a tumorsejtekbe irányítsa.. Az IGF-2' P3 és 94 promótereket a H19 enhanszerrel vagy aktív fragmentumaival együtt alkalmazhatjuk.
Ezeket a szabályozó szekvenciákat, melyek olyan genomiális impringen átesett ás nem átesett génekből származnak, melyek ráksejtekben expresszálódnek, még részletesebben ismertetjük, hogy meghatározzuk azokat a minimális szabályozó szekvenciákat, melyek ahhoz szükségesek, hogy a kívánt tumorspecifikus expressziót elérjük. Például a promóter régió addíciókkai, szubsztitúciókkal és deléciókkal megváltoztatható, és mérhető a tumorspecifikus expressziét funkció megmaradására. A ül 9 downstream enhanszer különböző részletei egyenként teszteihető-k arra a képességükre, hogy fokozzák-e a HIS p rom-ót érről induló transzkripciót.
A szabályozó szekvenciák megváltoztatása egy sor különböző kémiai és enzimatikus eljárással valósítható mag, ezek a szakterületen. jártasak .számára jól ismertek. Például a s-zek.venciák restrikciós helyek által meghatározott régiói deletáihatok. Oligonukleotid által irányított mutagenezist alkalmazhatunk aszekvencia egy meghatározott módon történő magváltoztatására és/vagy azért, hogy restrikciós- helyeket vigyünk he a szekvenci14
án belüli specifikus· régiókba. Továbbá deléc.iós mutánsok hozhatók létre DHS nukleázokat, mint például Sal3i-t vagy ExoIII-t és SÍ nukieázt alkalmazva. A szabályozó szekvenciákban fokozatosan nagyobb deléciők hozhatók létre a DKS-t növekvő időtartamig inkubálva a nukieázokkal (a mutagenezis módszerek áttekintésére lásd Aus.ubel et al., Current F-rotocols fór Molecular Biology, (1989)1,
A megváltoztatott .szekvenciákat arra a képességükre vizsgáljuk meg, hegy képesek-e irányítani a heterolőg kódoló szekvenciák tumorspecifikus expresszlóg át a megfelelő gazdasej tökben, különösen a Hl9-t expresszáló karcinőma eredetű sejtekben (például a húgyhólyag karcinőma sejtekben). A találmány körébe tartozik bármely olyan megváltoztatott szabályozó szekvencia rekombináns· expressziós vektorba építése további használatra,· mely megőrizte azt a képességét, hogy tumorspecifikus expressziét irányítson. Egy sor különböző heterolőg gén expresszálható ezeknek a szabályozó szekvenciáknak a szabályozása alatt, mint például toxikusgéntermékeket, potenciális toxikus géntermékeket és anfciprolife-ráciős vagy citosztatikus géntermékeket kódoló gének, Markergének is expresssálhatők, ide tartoznak az enzimek (például CAT, béts-gu.luktozídáz, luolferáz), fluoreszcens fehérjék, mint például a zöld fluoreszcens fehérje vagy antigén markerek.,
A cítotoxíkus géntermékeket tágan határozzuk meg, ide értjük a tornácokat és apoptózíst indukáló szereket is. Továbbá a találmány értelmében a eitotoxikus géntermékek magukban foglalják a gyógyszer metabolizálö enzimeket, melyek egy gyógyszereiővegyüietet eitotoxikus termékké alakítanak át, A találmány szerinti eljárásokban használható eitotoxikus géntermékek köze .1 3·' tartozik például a diftéria toxin, Pseu-d-omonas toxin, ricin, kolera toxin, PS40 és tumor szuppresszor gének, mint például a retinoblasztóma gén és a p53. Továbbá a sejt .apoptózisban részt-
kódoló szekvenciák ‘tót. is
jtidek közé tartozi .k az
t a 1,, hat. Senet, b
) pspti: 1 (lásd Wu et al
7} ], a kalcitonin c jón nel
peptid (Sakuta et al,, J. Heuroimmunoi, 6 /, 103-109 (1996)} 1amint más Ismert vagy felfedezett apoptotikns peptidek..
Gyógyszer •-elővegyület cítotoxikus- termékké alakításé t végző
gyógysz ermeta bolizálo enzimek közé t ertozi k a tímidir i kinéz
(Kerpes simp lex vagy Varicelía. zoste r víruso kbdl), a citosih
dezamináz. nitroreduktáz, c i t o k r óm p~4 50 timidin
foszforíláz, purín-nukieozid foszforiláz, alkalikus foszfatáz, Λ és G2 karboxlpeptidáz, iinamaráz, β-laktamáz és xantin oxidáz ('háttér-információként lásd Riggs és Slkora, Mól. Med. Today 359-366 (1997 . augusztus)}
Továbbá antiszensz, antigén, vagy aptamer olígonukleotidok juttathatók a rákos sejtekbe az itt leírt expressziós szerkezeteket alkalmazva.. Eibozímok vagy az egyszálö RNS-ek is expresszálható-k rákos sejtekben, hogy gátoljuk egy bizonyos kívánt gén expresszióját. Ezeknek az antiszensz. vagy rifoozim molekuláknak a céigénjeínek olyannak kell lenniük, melyek olyan géntermékeket kódolnak, amik elengedhetetlenek a sejt fennmaradásához vagy a rákos sejt fenotipus fennmaradásához. Ilyen célgének közé tartozik, de nem kizárólagosan a cdkz, cdkö, cdk21, cdclöé, ciki in Dl, cí klóin E, ciki in n és cdk4.
Például olyan vektorokat viszünk be a sejtekbe asért, hogy az endogén gének expresszióját korlátozzuk, melyek rákos sejtekben expresszálődo, imprintíngen átesett génekből vagy IGF-1 promótérből származó szabályozó szekvenciák szabályozása alatt p53, c~.fos# c~jun# Kr-ras és/vagy Her2/n.eu onkogén formáira specifikus antiszensz RNS-eket vagy ribosímokat expresszálnak, Azok a tumorsejtek# melyek HIS-t exprasszálnak, és képesek aktiválni a. H19 szabályozó szekvenciákat (vagy melyek, specifikusan aktiválják az IGF-1-t# IGF-2 P3 vagy P4 promótert.) specifikus célponttá válhatnak az antiszensz RNS vagy ribozim RNS exp.re.5szlőjához .
Az antiszensz megközelítési mód olyan oligcnuklectídok (ebben az esetben mRNSí megtervezését foglalja magában, mely komplementer a cél mRNS-sel. Az antiszensz oligonukleotidők a komplementer cél mRNS trsnszkriptumokboz fognak kötődni# és .meggátolják a transzlációt. Teljes komplementaritás# bár előnyös, de nem szükséges, A szekvencia komplementaritás*' egy RNS egy részével, ahogy itt használjuk, egy olyan szekvenciát jelent, mely megfelelő komplementaritással rendelkezik ahhoz, hogy az RNS-sei hibrid! tál jón egy stabil duplexet képezve, A hibrid!zálásra való képesség a komplementaritás fokától és az antiszensz nukieinsav hosszától is függ. Általánosságban a hosszabb hibridizálö nukieinsav több hibás bázispárosodást tartalmazhat egy RNS-sel ahhoz, hogy még stabil duplexet képezzen (vagy tripiexet, ha. ez lehetséges) - Egy szakterületen jártas szokásos eljárásokkal meg tudja becsülni a hibás bázispárosodás tolerálható mértékét, hogy meghatározza a hiforidizált komplex olvadáspontját.
Azok az oligonukleotidck, melyek komplementerek a cél transzkriptum 5' végével, például az S* se® transzlálódó szekvenciával az AUG iniciációs kodon!g ~ .azt is magában foglalva -, sokkal hatásosabban fognak működni a transzláció gátlásakor. Mindemellett az mRN-S-ek 3' nem transzlálódó szekvenciáival komplementer szekvenciákról a közelmúltban mutatták ki, hogy hatásosan gátolják az m'RMS-ek transzlációját. Lásd általánosságban Wagner R. cikkét, Natúré 372, 333-335 (1994) . A cél géntranszkríptumok Sf vagy 3 nem transzlálódó nem kódoló régióival komplementet oligonukleotidők alkalmazhatóak egy antiszensz módszerben az endogén gének transzlációjának gátlására. Az mRN.S 5' nem transzlálódó régiójával komplementer oligonukieotidőknek magukban kell foglalniuk az AüG start kodon komplementerét. Az mRNS kódoló régiókkal komplementet antiszensz oiigonukieotidok a transzláció kevésbé hatásos inhibitorai, de ezek is alkalmazhatóak a találmány szerint. Az antiszensz nukleinsavakna-k, melyeket úgy tervezzük meg, hogy akár a óéi mRNS 5f, 3' régiójához vagy akár a kódoló régiójához hibriditáljának, legalább hat nukleotid. hosszúságúnak keli lenniük, és előnyösen 6-től körülbelül 51 nukleotldig terjedd hosszúságúak, A specifikus megvalósítási módokban az oligonukleotid legalább 10 nukleotid, legalább 17 nukleotid, legalább 25 nukieotiö vagy legalább 50 nukleotid hosszú.
Tekintet nélkül a választott célszekvenciára, előnyös, ha előszót in vitro vizsgalatokat hajtunk végre az antiszensz oiigonukieotidok génexpresszió gátló képessége mértékének meghatározására. Ezekben a vizsgálatokban olyan kontrollokat kell alkalmaznunk, melyeknél különbséget tudunk tenni az antiszensz géngátlás és az oiigonukieotidok nem specifikus biológiai haté* A «kos sejt nőve.·. r ans z fc r í © fc umá- r a sai között. Szintén előnyös, ha ezekben a vizsgálatokban összehasonlítjuk a cél RNS vagy fehérje mennyiségét egy belső kontroli RNS vagy fehérje mennyiségével,
Létfontosságú célgén katalitikus hasítására tervezett ri.boz.im molekulákat használhatunk a cél mRHS transzlációjának meggátlására. (Lásd például a WO Sö/11364 számú, 19SÖ. október 4-én publikált nemzetközi közzétételi iratot; Sárvár et al.·, Science 27 4, 1222-12.25 (1990)), Amikor a rib-osimofc egy kedésében lét fontosságú· fehérjét kódoló gén specifikusak, az ilyen ribo-z imo-k egy rákos sejt fene-típus visszafordulását okozhatják, (kivel a ribozimok, melyek az mRNS-t helyspecifikus felismerési szekvenciáknál hasítják, a cél mRNSek szétroncsoiására alkalmazhatóak, a kalapácsfej (hammerhead) ribozimokat részesítjük előnyben, A kalapácsfej ribozimok az mRNS-eket a szegélyező régiók által megjelölt helyeken hasítják, melyek komplementer fcázispárofcat képeznek a cél mRNS-sel. Az egyetlen kivánalom, hogy a cél mRNS rendelkezzen a következő kétbázisos szekvenciával: 5~UG~3', A kalapácsfej ribozimok megszerkesztése és termelése a szakterületen jói ismert, és részletesen leírta Haseloff és- Gerlach, Natúré 334, 585-591 (1988) .
Előnyösen a ribozimot úgy szerkeszt jük meg, hogy a hasítási felismerő· hely a cél mRNS: 5' végéhez közel helyezkedjen el; azért hogy megnöveljük a hatásosságot, és legkisebbre csökkentsük a nem-funkcionális mRNS transrkriptumok sejten belüli felhalmozódását ,
A találmány szerinti alkalmazás céljából a ribozimok az RbS endoríbcnukieázokaf is magukban foglalják (ezek után Cechtlpusú ribozimok), mint például egy olyan ribozimot, mely a *♦ * * *χ <
~ : természetben a Tetrahymena thermophiIában fordul elő (IVS-ként vagy L-19 1VS RNS-ként ismert!, és melyet részletesen ismertetettek Thomas Cech és munkatársai (2aug et al., Science, 224, 5?4-5?8 (19841; 2aug és Cech, Science 231, 470-475 (198«); 2aug et al,, Natúr® 324, 429-433 (1986); a University Patents Inc. WO 88/04300 számú nemzetközi közzétételi irata; Besn és Cech, Cell 47, 207-216 (1986), A Cech-típusű ribozimok egy nyolc bázispáros aktív hellyel rendelkeznek, mely egy cél RNS szekvenciával hibrid! zál, majd megtörténik a cél RNS hasítás®, A találmány magában foglalja azoknak a Céch-típusú ribozlmoknak ez alkalmazását, melyek a célgénekben jelenlévő nyolc bázispáros aktív hely szekvenciákat veszik célba.
Az imprintingen átesett gén expresszióját reaktiválő sejtek szintén képesek lesznek az. ilyen, heterológ génhez, működőképesen kapcsolt, imprintingen .átesett gén szabályozó régióit tartalmazó expressziós szerkezetek specifikus aktiválására. Az ilyen, sejtek, különösen tumorsejtek megfelelő célpontjai a találmány szerinti génterápiás módszereknek, A H19 és IGF-2 93 és 94 specifikus expressziő mind a tumorokban mind a saj^vonalakban meghatározható· RNS anali2ises technikák, in situ hibridizáció és riportergénés szerkezetek alkalmazásává.!- Továbbá az aktivált IGF-l gén exprésszióval rendelkező tumorsejtek hasonlóképpen határoz.hatóak meg- és vehetők célba géntrerápiásan egy heterólőg gén közvetlen irányítására IGF-l promótert alkalmazva.
géntranszkriptumhoz spécitikusan hibridizáló, jeleit próbát készítünk a szakterületen tói ismert, módszerek valamely!kével. A
A leotöbb ENS-anslizises alkalmazásnál y' ,-*s <n es ** ** jelölt próba a HI9 nukleotidszekvencia legalább 15-30 komplementer bázisát tartalmazza, és még előnyösebben « H19 nukl-eotidszekvancía legalább 50-150 komplementer bázisát tartalmazza. A HIS expresszié agy különösen előnyös 'hibridizációs próbája a poli-A helytől .felfelé, a poli-A hely felé tartó hozzávetőleg 800 bázispárról származó N19 mRNS 3f végével komplementer oolinukle-otíd.
A találmány egy későbbiekben példával bemutatott specifikus megvalósítási módjában egy jelölt antiszensz RNS próbát hozunk létre in vitro egy ?? vagy T3 expressziós plazmidot alkalmazva, A H19 próbák random láncinditással is jelölhetők jelölt nukleotid jelenlétében, például Prlme-lt készletet CStretagene, La -Jolía, CA; katalógusszám: 3003920 alkalmazva. Alternatív megoldásként jelölt próbák hozhatók létre egy Hl9 kódoló-régió cONS ki-ónt és a kódolóré-gió egy területének amplif ikálására tervezett primereket használó PCR reakcióban, vagy egy standard nicktranszláciős reakcióval.
A poiinukl-eotid próbákhoz alkalmas jelek közé tartoznak ez olyan .n-ukleotidok, melyekbe radioaktív izotópokat építettünk be (úgymint 3?S~t és 'P-td, a fluoreszcens., lumineszcens és szín jelek, és az enzimatikus részek.
A jelölt próbát in situ egy sejt- vagy szövetmintához hi.bridaráljuk standard módszerekkel, mint például ahogy lentebb a működési példa segítségévei leírtuk, és a folyamatban lévő 08/704 706 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertettek, mely referenciaként a leírásba épül. Alternatív lehetőségként, ha elegendő mennyiségű meg-felelő sejtet nyerünk, standard P.NS analízis (mint például Northern analízis, «Μ-ázos védelem vagy primer extenzió) hajtható végre, hogy meghatározzuk a számunkra érdekes gén mRN.S expresszié jának mértékét .
Továbbá a2 is lehetséges, hogy génexpressziós assay-ket hajtsunk végre in situ, azaz közvetlenül a bicpsziákból vagy kimet szésekből származó beteg szövetek sejtmetszetein (rögzített vagy fagyasztott)., azért hogy nuxieinsav tisztítására ne legyen szükség, Nukieinsav reagensek, mint például a fentebb leírtak alkalmazhatóak próbaként és/vagy printerként az ilyen in situ eljárásokban (lásd például Nu-ovo·, G, J, PCR In situ Hybridization: Protocols and Applications., Raven. Press, NY),
Egyik alternatív módszer annak meghatározására, hogy egy sejttípus vagy tumor képes lesz-e specifikusan aktiválni a
Ezeket a módszereket alkalmazva, expresszíóval rendelkező tumor típusokra két említjük mec:
dott szabii y ο χ ο x cí ej jü ő w
az ilyen expressziós
sjtbe. Ebből a célból a
»rmék. Egy assay-ben a
:atja, hogy a sejt vagy
i a szabályé XÓ róí^iőxk'”·
az a k t í *r X Ί r U 3 <1 .ί. V k. ll.i. >
példaként a következő-
1. 'Wilm tumor ··>
3, Embrionális rabdomicszav kőma
Csiraseit tumorok és trofoblaszt tumoro) * * * J. φ φφ Φ
J. * TesztXkuláris csírasejt tumorok
zs 9Í-. s A petefészek .korai teretomája
n S-* W> Ezekrekokcigeá1is tumor
4 » Ko r ί o k a r c í nőma
5. Méhlepény hely trofoblasst tumorok
C. Epítéiíélls felnőtt tumorok
1. Hú gyhó1yag kareínőma
2, Hepat ocel1u1éri s kar cí nőma
3 v Petefészek karcinóma
4. Cervikéiis karcinóma
5 < Tüdő karcinóma
Emlő karcinóma
*7 Fej és nyaki pikkelyes sejt karcinóma
8, Kye1őcső karolnőma
q * Faj z smir így karóinóma
0. Neux •©gén tumorok
1. Ásztrocitőma
.«\ G a n g 11 o b 1 a s z t érne
Neuroblesttőma
Teh át a fentebb említett rákos megbetegedések a találmány
s zerínt i eljárásokkal kezelhetők. Tulajdonképpen bármely tumor,
mely aí rtiválje .a Hl 9 expresssiót, a találmány s: zerinti eljárá-
SOK Kct .ι. s β 1. -í, ö %
sózására alkalmazhatok, melyek aktiválják az 1GF--Í, és 1GF-2 P3 és P4 promőtereket. Esek a tumorok szintén kezelhetőek a találmány szerinti eljárásokkal, Például az IGF-2 aktiválódik a gyermekkori tumorokban, úgymint a Wilm tumorokban, rabtíomioΦΦΦ* * φ ’
szarkómákban, neur obiasz tómákba n és hepatoblas2tómákban.
Szabályozó szekvenciák irányítása alatt álló polinukleotidők gasda.se j tűkbe történő bejuttatásának módszerei
A találmány egy olyan gardasejtre is vonatkozik, melyet egy heterológ génhez működőképesen kapcsolt szabályozó régiókat tartalmazó poiinukleotidokkai transzferáltunk. Az ilyen gazdasejtek tenyészetben tarthatók fenn, vagy egy állat, előnyösen egy emlős részét képezhetik. A kívánt polinukleotidokat jellemzően a vektorok széles körének bármelyikével ínszertálhatjuk, melyeket ezután az itt ismertetett módszerekkel és anyagokkal juttatunk be. Ezeket a vektorokat jói ismert molekuláris biológiai módszereket alkalmazva állíthatjuk elő. (Általánosságban lásd Sambrook.
et al., Molecular Cloning 1-111. kötet, Coid Spring Harcot laboratory Press, Coid Spring Harbor, New York (1989), és Current Protoools in Molecular Hiology, John W.ile.y & Sons, összes kötet, időszakonkénti megújítása,, melyek referenciaként a leírásba épülnek] . Jellemzően,· ahol kívánatos a transzláció, a kérdéses heterológ gének is módosíthatók genetikailag, hogy egy alkalmas 3' poliadeniláció-s szekvenciát tartalmazzanak szükség esetén,
Tenyésztett sejtek
A héterőlóg génhez működőképesen kapcsolt, imprintingen átesett gén szabályozó szekvenciáit tartalmazó poiinukleotidokkai tra.nszf aktáit gazdasejtek bármilyen prokarióta vagy eukaríóta sejtek lehetnek, A po.iinukleofcidnak egy géns zerkezet.be, mint például egy vektorba történő iigálása, és gazdasejtekbe, akár eukaríóta (élesztő, madár,· rovar vagy emlős) , akár prokarióta (baktérium.) sejtekbe történő transzformálása vagy transzfek24 tálása a mikrobiológiai vagy szövettenyésztési 'technológiákban, széleskörűen alkalmazott általános eljárások közé tartoznak.
A találmány szerinti poiinukleotidok bakteriális sejtekben, mint például S. coliban való tenyésztésére alkalmas vektorok közé tartoznak
O-lfeH 2ΓΠΧ 0,0 K /· p BTac- eredetű p1a zmí dók, következő típusú plazmidok: pSR322~ból származó <BL~eredefcű piazmidok, pEX-eredetn plazmidok, és pGOeredetü plazmidok. élesztőben történő replikációhoz a YEP24, YIP5, YEP51, pYES2 és YRP17 plazmidok a felhasználható klónozó- és expressziós hordozók a génszerkeze-tek bevitelére S. cerevisiaeöe (lásd például Broach et al<, Experimental manípalation ot Gene Expression (szerk.: Inouye, Academic Press, 63 (1993)1, Ezek a vektorok, replikálhatók £. coliban a p8P322 orí-nak köszönhetően, és élesztőben is a 2 mikronos cirkuláris plazmád repliká-ciós determinánsának köszönhetően. Továbbá gyógyszer rezisztencia, mint például ampicillin rezisztrencia markerek alkalmazhatóak.
Hasonló .módon a találmány szerinti polinukleotidokhoz szolgáló emlős vektorok prokariota szekvenciákat is tartalmaznak, hogy lehetővé tegyék a vektor szaporodását baktériumban. Az ilyen smlős sejtekbe transzfektáijuk, úgy lehet hogy az emlős kromoszómába integrálódjanak a stabilitás érdekében egy kapcsolt szelektálható markergént alkalmazásva. Alternatív lehetőségként vírusok, úgymint .szarvasmarha papiilőmavírus (BFV-1) vagy Spstaín-Barr vírus származékait alkalmazhatjuk az átmeneti expresszióhoz.. A gazdaszervezetek plazmád transzformálásának végrehajtásában alkalmazott különböző eljárások a szakterületen jól ismertek. Más alv ektorokat, ami ko j megtervezni.
hős.szán tart;
kalmas vektorrendszereket valamint általános rekombináns aljára25 .*% .Ά W'vμ χ. < c .... . ... ,,» sokat lásd Sambrook és munkatársai művében, fentebb.
Génterápia
A találmány magában foglalja egy heter-ol-óg génhez működőképesen kapcsolt géns.zabályozó régiót tartalmazó polinukleotidok alkalmazását a génterápiában rák és hip-erpro.life.rafeív betegségek kezelésére. Génterápiás célokból a találmány szerinti expressziős szerkezeteket valamilyen biológiailag hatékony hordozóban, például valamely olyan készítményben vagy kompozícióban adhatjuk be, mely képes hatékonyan bejuttatni a rekorabináns gént a. sejtekbe in vivő. Ezek közé a módszerek közé tartozik az adott génnek a virusvektotokba történő ínszerfeálás-a, ilyen vektorok közé tartoznak a rekombináns retrovitusok, adenovírus, adenoasszociált vírus, és herpesz szimplex vírus 1,- vagy rekorabinánsb-akfeeriális vagy eukarióta plazmldok. A virális vektorok a sejteket közvetlenül fertőzik; a plazmidokat valamilyen segítséggel., például kationos polimerek, 'kát ionos lipos zómák (például lipofektin, koleszterin származékok, például D.D.A.S. és kafcionos foszfolípidek) vagy származék (például antitesttel konjugált} polilizln konjugátűrnek, gramicidin S, mesterséges virusfeurkok vagy más alkalmas intracelluláris hordozók segítségével juttathatjuk be, valamint a csupasz génszar kezet közvetlen beinjektálása., elektroporácíó vagy CAP-O-4 precipitáciő is végrehajtható- in vívó·. A rák-génterápiára szolgáló géntranszrer és expressziós rendszerek közelmúltban megjelent áttekintése: Cooper, Semínárs ín Öncology 23, 172-187 (1936).
Hive.1 a megfelelő célsejtek tran-szduk-ciója képviseli a gén terápia fontos első lépését, nyilvánvaló, hogy az adott génbeviteli rendszer megválaszfcása olyan tényezőktől füge, minfc a kivé26 ♦♦*φ
-φ φ φ * * φ * * Φ Φ Φ » φ Λ Φ * lasztott célszervezet feno-tipusa és a .beadás módja, mely például a lokális vagy -szisztémás beadás lehet. Továbbá érthető, hogy az expressziós szerkezetek in vivő transzdukálójához biztosított adott -gén-szerkezet felhasználhatóak a sejtek in vitro transzdukciójára is, mint például a fentebb leirt ex vivő szövettenyészet .rendszerekben.
A nukleinsav sejtbe történő in vivő bevitelének előnyös .módja egy nukle-insavat, például egy bizonyos citotoxikus gént a HU szabályozó szekvenciák szabályozása alatt tartalmazó virális vektor alkalmazásából áll. A sejtek virális vektorral történő fertőzésének az az előnye# hogy a megcélzott sejtek nagy része megkaphatja, a nukleínsavat, Továbbá a virusvektoron belüli, például a virusvektorban lévő oDLS által kódolt molekulák hatékonyan expressz-áiódnak azokban a sejtekben, melyek felvették a virális vektor nukieinsavát. Az itt ismertetett módszereket és készítményeket alkalmazva bejuttatható megfelelő vektorok közé taroznak a herpesz szimplex vírus vektorok, adenovirus vektorok, adeno-asszociált vírus- vektorok, retrc-vírus vektorok, pszeudorabiesz vírus, alfa-herpesz vírus vektorok és hasonlóak. Alapos áttekintést találhatunk a vitális vektorokról, különösen a nem. replikáiődó sejtek módosítására alkalmas virális vektorokról és arról, hogy hogyan használjuk ezeket a vektorokat a kérdéses po.linuki-eotí-dok expresszié jóval kapcsolatban, a Viral Vectors; Gene Therapy and Neuroscience Applications című könyvben [szerk. Caplitt és Loewy, Academic Press, San Diego (1355)1.
Kimutatták, hogy korlátozni lehet a vírusok és következésképpen a vírus-alapú vektorok fertőzési spektrumát a vírusrészecske felszínén lévő víruscsomagolő fehérjék módosításával [lásd péiX ** * dául a WG93/25234 ás WÖ94/0692G számú nemzetközi közzétételi iratot). Például a retrovirális vektorok fertőzési spektrumának, megváltoztatási stratégiái közé a következők tartoznak: sejtfelszíni antigénekre specifikus antitestek kapcsolása a virus env fehérjéjéhez (Roux et al., Proc. Nat. Acad. Sci. VSA 8 6, 90799083 (1989); Julan et al., J. Gén, Virol. u3, 3251-3255 (1992); és Goud et al,, Virology 163, 25.1-254 (1983) ]; vagy a sejtfelszíni Íigandumok env fehérjékhez kapcsolása [Neda et al., o. Bioi. Chem 266, 14143-14146 (1991)). A kapcsolás egy fehérjével vagy más változatával történő kémiai keresztkőtés lehet (például a laktóz az env fehérjét aszialoglikoproteinné alakítja), valamint fúziós fehérjék kialakításával (például egyláncú antitest/env fúziós fehérjék) , Például, ráksejtek vehetők célba ezeket a módszereket alkalmazva, például a tumorhoz társult molekulák elleni antitestek vagy ráksejt felszíni fehérjék kapcsolásával a rekombináns vírus felszínéhez, őz a módszer, mivel felhasználható arra, hogy a fertőzést korlátozzuk vagy egyéb módon bizonyos sejttípusokhoz Irányítsuk, arra is alkalmazható, hogy egy ektotrópikus vektort amfotrópikussá tegyünk.
A találmányban felhasználható egyik előnyös vírálís génbevitel! rendszer adenovirus eredetű vektorokat használ. ügy adenovirus genomja úgy manipulálható, hogy egy kérdéses génterméket kódoljon és expresszáljón, de ínaktivált az a képessége, hogy egy normális litikus vitális életciklusban replíkálódjon, Lásd például Berkner et al., BioTechnlques 6, 615 (1338);
Bosenfeid et al., Science 252, 431-434 (1991); és Rosenfeld et al.·, Cell 63, 14 3-155 (1992). Az 5 d!324 típusú AD aden-ovirusből vagy sas acenovi.ru sekböl íné Icául Ad.?., Ad3, Ad? stb.
* « # ♦ »»
‘.'V Ν .
' * V « » « * χ « *♦*« » « « ♦♦ ** származó megfelelő adenoviralis vektorok jói ismertek a szakterületen jártasak számára. A rekombináns adenovírusok előnyösek lehetnek bizonyos körülmények között, mert a sejttípusok széles körében alkalmazhatóak, ezek közé tartozik a légúti epitélium (Rosenfeld et al., 1992, fentebb idézve), endotéliális sejtek [Lemarchand et ai., Proo. Naél. Acad. Sci USA 69, 6482-64 68
(1992) ]:; hepatoclták (He >rz. és Gerarö, Froc, Nat
90, .2812-2816 (1293)] és izomsejtek ( Quantin et
Acad. Sói, USA 89, 2582 :-258 4 (1992)1 . Továbbá
viszonylag stabil, ez a : tulajdonság felelős a
koncentrálásért, és úgy módosítható, hogy az be;
tőzési. spektrumot, Továbbá a bevitt adenovirálís DNS (és a benne lévő idegen DNS? nem integrálódik a gazdasajt genomjába., hanem episzőmáiis formában marad, ezáltal elkerüljük azokat a potenciális problémákat, melyek az inszercionális mutagenezis eredményeként előfordulhatnak azokban az esetekben, ahol a bevitt DNS a gazda genomba integrálódik (például retrovirális ON'S-nél? . Emellett az adenovirálís genom idegen DNS hordozó kapacitása nagy (8 kilobázisig terjed) más génbeviteli vektorokhoz viszonyitva (Berkner et al,, fentebb idézve; Haj-Ahmand. és Graham, J. Virol, 57, 267 (1986?]. A legtöbb jelenleg alkalmazott, és így a találmányban előnyben részesített replikáciöhiányos adenovirálís vektorok beleteltek a virális El és E3 gének egészére vagy részére, de az adenovirális genetikai anyag 80%-a megmarad (lásd például Jones et ai., Ceil 16, 683 (1979); Berkner et al., fentebb; és Graham et al., Methods in Mo.lecu.lar Blology, E< u, Murray (szerk.j (Humana, Ciifton N. u. 1991} 7, 109-127].
Euv másik, a találmány szerinti expressziős szerkezetek euyi29 kének bejuttatására használható virális vektorrendszer az. adenoasszociált vírus (AAV). Az adeno-asszociált vírus egy természetben előforduló defektlv vírus, melynek egy másik vírusra, úgymint egy adenovlrusra vagy egy herpesz vírusra van szüksége a hatékony replikádéhoz és a produktív életciklushoz, {Áttekintésként lásd Muzyozka ei al,., Curr, Topics in Micro, and Immunoi. 158, 97-129; . Ez az egyik olyan vírus azon néhány vírus közül, mely integrálni képes a DÚS-ét a nem osztódó sejtekbe, és nagy gyakoriságú stabil kölcsönhatást mutat (lásd például flotté et al., Am. J. Respír, Cell. Mól. Siói... 7, 349-354 (1992);
Samuiski et ai,, J. Virol 63, 3922-9928 (1989}; és McLaughlin et al., u, Virol, 63, 1963-1973 (1989}}. A kicsi, 390 bp-os AAV-t tartalmazó vektorok pakolhatök és integrálhatók. Az exogén DM3
mérete körülbelül 4, V kb-íg terjed, A DMS sejtekbe V í 1 telére eg
AAV vektor alkalm azh dl u 6, mim t például az, amit Trat seb: in és m run
katársai leírtak [Mo .1 < Cell. Bioi, 5, 3251-3260 (19 85). ) . Sgy se
Coll, Bioi
Endoc.r inol..
.934 >
különböző nukleinsavat vittek be különböző sejttípusokba AAV vektorokat alkalmazva (lásd például Hormonét et el;, Proo,
Natl. Acad. Sd USA 81, 6466-6470 (1984); Tratschin et al., Mól,
207.2-2081 (198.5); Wondisford et al., Mól, .32-39 (1988?; Tratschin et al,, és Flotté et al, , J, Bioi. Chem _ (1 m 3Ί
A virális transzfer módszerek mellett, mint például amiket fentebb mutattunk be, nem virális módszerek is alkalmazhatóak, hogy egy kívánt heterolőg gén expressziéját egy állati szövetben targetáljuk, A nem virális génbevitel legtöbb módszere az emlős sejteknek a makromolekulák. felvételére és
o. viroi. 2?·,
268, 3781-3790 ί n r r..~ transzportjára használt normális mechanizmusaira épít, Az előnyös megvalósítási módokban a találmány szerinti nem vitális génbevitel! rendszerek a megcélzott sejtben a taralmány szerinti expressziós szerkezetek felvételére szolgáló endocitózis pályákon alapulnak. Ilyen típusú génbevitel! rendszerek például a liposzöma eredetű rendszerek» a. polilizin konjugátumok és a mesterséges v1rusburkok,
Klinikai gyakorlatban a terápiás expressziós szerkezetekhez
tartozó génbe v i t e 1 i. rendszerek számos
ezek min degyike jól ismert a szakterül
teli rendszer gyógyászati készítménye
ravénás injekcióvá1 juttatható be, és
spéci fik us expressz lója főként a trai
szönhető , melyet a sejt típusú vagy
biztosit , ami a hét , erológ gén exp re ss
transzfekeióspeci£ításnak k ö dáknak vagy a szabályozó szekvenciákkal együtt az adott sejttípusokat célba vevő génbevívő hordozónak köszönhetőek. Más megvalósítási módokban a rekombináns expressziós szerkezet kezdeti .bevitele korlátozottabb, mivel az állatba történő bejuttatás helye teljesen meghatározott. Például a génhevivő hordozó katéterrel (lásd az 5328470 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] vagy sztereotaktikus injekcióval, {lásd Chen et al.» Proc, Natl. Acad... Sói USA 91» 3054-3057 (1994)] vihető be..
Egy találmány szerinti expressziós szerkezet a génterápiás szerkezetbe elektroporáciöval vihető be olyan módszereket alkalmazva, melyet például Dev és munkatársai írtak le (Cancer Trést.
Rév. 20, 105-115 (1994)5 .
A cénteráoiás szerkezet ovóuvászati készítménye lénvecében egy elfogadható 'higótószerben lévő génbe juttató rendszerből állhat, vagy egy lassú felszabadulásé mátrixot tartalmazhat, melybe a génbejuttatő hordozó beágyazódik, Alternatív lehetőségként, ahol az ép génbevitel! rendszer rekombináns sejtekből termelhető, ilyenek például a rekombináns vektorok, a gyógyászati készítmény egy vagy több génbevitel! rendszert termeid sejtet tartalmaz.
& végső terápiás felhasználások és a dózisok
A szakterületen átlagosan jártasak számára érthető, hogy egy gyakorló orvos vagy beteg szempontjából gyakorlatilag egy rákos állapothoz kapcsolódó nem kívánatos tünet (például fájdalom, érzékenység, testtömeg veszteség, és hasonlóak), bármilyen enyhítése vagy meggátlésa kívánatos. Továbbá a tumor tömegének vagy nö-
vekedési sebességéne k csökkenés e is kívánatos, mint ahogy a tu-
mór hísztopatoiógiai képében va ló javulás is. Tehát a bejelentés
értelmében a ” kezeié >s, terápi Lás alkalmazás vagy gyógyászati
alkalmazás' kifejező sek, ahogy itt alkalmazzuk, az igényelt ké-
szítmenyek bármely és összes olyan al ka ima zására ·»•'A ** V.-á g? j -'a*' v U. £, .<« f
mely egy betegséget vagy a tün< eteket meggyógyítja, vagy máskép-
p-en meggátolja, visszatartja, lelassítja vagy visszafordít ja a betegség előrehaladását vagy más nos· kívánatos tünetet bármilyen módon. A hatásos dózis és kezelési mód hagyományos eszközökkel határozható meg, laboratóriumi állatoknál kis dózissal kezdve, majd növelve a dózist, mialatt a hatásokat nyomon követjük, valamint szisztematikusan változtatva a dózisadagolásí rendet. Általában áilatvizsgálatokat, előnyösen emlős vizsgálatokat alkalmaznak arra, hogy meghatározzák a maximálisan tolerálható dózist, vagy az MTD-t a bioakt.lv szerre nézve testtömeg kíiooram* * ♦ φ φ.*' monként. A szakterületen jártasak szokásosan a hatásos dózisokat és a toxicitás elkerülését más fajokra extrapolálják, ide értve az embert is.
A humán hatástar.i vizsgálatok elvégzése előtt normális személyeken végzett I. fázisú klinikai vizsgálatok segítenek megállapítani a biztonságos dózisokat. Egy klinikus számos tényezőt vehet figyelembe, amikor egy adott személynél az optimális dózist maghatározza. Ezek közül elsődleges a toxicitás és a választott .heterolőg géntermék féléletideje< További tényezők közé tartozik a beteg mérete, a beteg kora, a beteg általános állapota, az adott kezelendő rákos betegség,· a betegség súlyossága, más gyógyszerek jelenléte a betegben, a géntermék in vivő aktivitása és hasonlóak. A kísérleti dózisokat az állatokon végzett vizsgálatok eredményei és a klinikai szakirodalom figyelembevételével kell megválasztani.
Például egy eitotoxikus szert, például timídin kinázt kódoló heterolőg génhez működőképesen kapcsolt Hl 9 szabályozó régiót tartalmazó adenovirális vektor jellemző humán dózisa 1 x lö! pfu és 1 x 10b; pfu közötti mennyiség közvetlen a tumor anyagába injektálva naponta. Előnyösebben egy ilyen közvetlenül a tumorba injektált adenovirális vektor napi dózisa 1. x 10* pfu és 1 x 10iV pfu közötti mennyiség, a tumor méretétől függőén. Egy eltérő mértékű toxlcitással rendelkező eitotoxikus gén termékhez, működőképesen kapcsolt H19 szabályozó régiót tartalmazó adenovirális vektornál ezek az értékek természetesen ennek megfelelően megváltoznak. Egy 1GF-2 P4 oroméiért és ehhez működőképesen kapcsolt eitotoxikus szert, úgymint tímidin kinázt kódoló heterolog gént taralmáző adenovirális vektor hasonló dózisai alkalmazható* ♦' >
ak javasolt kiindulási pontként.
Különösen az ín vivő alkalmazásnál a. találmány különböző komponensei előnyösen nagy tisztaságúak, és lényegében mentesek a potenciálisan ártalmas szennyeződésektőí (például legalább National Food CNF) .minőségű, általánosan analitikai minőségű, éa előnyösen legalább gyógyászati minőségű). Ehhez egy adott vegyületet a felhasználás előtt szintetizálni kell, és az ilyen szintézisnek vagy az ezt követő tisztításnak előnyösen egy olyan terméket kell eredményeznie,- mely lényegében mentes azoktól a potenciálisan toxikus szerektől, melyeket a szintézis vagy tisztítási eljárások alatt alkalmazhattunk.
A találmány az egy ík magva1ősi tási n
állapotának kezelésére egy olyan ki tét
egy sterilen töltött fiola vagy ampul
citotoxikus szert kódol .6 heterológ génbe
H19 szabályozó régiót tartalmazó polinukleotid vektort vagy egy vektor kibocsátó sejtet tartalmaz.. Az egyik megvalósulási módban a kit egy citotoxikus szert kódoló heterológ génhez működőképesen kapcsolt ölé szabályozó régiót tartalmazó polinukleotid vektort tartalmaz beadásra kész készítményként egységdózisos vagy többdózisos mennyiségben, ahol a csomag magában foglalja a csomag tartalmának rák kezelésére vonatkozó használati utasítását. Alternatív megoldásként és a találmány egy másik megvalósítási módja szerint a csomag egy olyan sterilen töltött fiolát vagy ampullát biztosit, mely egy ilyen vektort kibocsátó sejtet vagy sejtvonalat tartalmaz. A tároláshoz és a szállításhoz a vektorkibocsátó sejtet vagy sejtvonaiat le keli fagyasztani. Adott esetben a csornao táokozeoet és reagenseket tartalmazhat a vek34 torkibocsátó sejt vagy sejtvonal tenyésztéséhez.
A következő példák az itt. ismertetett találmány bemutatására szolgálnak a korlátozás szándéka nélkül,
1.
Ez a példa különböző expressziős szerkezetek előállítását írja .le# melyek Hl9 regu'láfcor szekvenciák szabályozása alá helyezett CAT riporter gént tartalmasnak., és ezek átvitelét több különböző húgyhólyag rákos sejtvonalba.
1. 1.
1.1.1
A HT-1376, EJ28, T24P# 1197 és üH-VC-3 húgyhólyag rákos sejtvonalakat az American Typ-e Culture Collection-től (ATTC) szereztük be, és az ATCC javaslatainak, megfelelően tartottuk fenn.
Átmeneti transzfekoiókat hajtottunk végre kalcium-foszfát kicsapásos tr-anszfekciós eljárást alkalmazva. 1 ml tápközegben lévő precípltánsokat (7 pg piazmidot tartalmazott) adtunk 0,3 κ 10° tápkőá . A s e j t e— &S: sejthez 30 mm~e« csészékben, 10 óra múlva a transzfekció
zegst élt ávolltotfuk. és friss tápköze
két a tté mszfekció u tán 24-96 órával
aktivitás Τ' h-'.t g r-t 1 r>.- V# X·' \. ·*· X. -v -i- v.. x. >& szerves fázisú
mazásával (Sambrcok e :t al., 1983} ha tá-
só fázis q y s .ί χ κ v ο X ját (100 pl) egy
vittük át ,. mely 3 ml szcintiliéoiös f
s eljárás elkel mértünk.
1.1,2. Expressziős vektorok szerkesztése
A pCAT-basic piazmid (mely egy Cat riporter gént tartalmaz amit eav többszörös kiónozó hel.v előz meoi . a pCAT-orcmote *'Χ·* ♦ ♦ * * X *
plazmád (a C AT riporter gént tartalmazza az SV40 promóter szabá-
iyozásával), a pC AT - e n h a ne a r piazmid (az SV40 enhanszert tartal-
mázzá a GAT rí .porter géntől lefelé, és egy többszörös klónozó
helyet egy promóter beillesztésére a CA? riporter géntől felfelé) , és a pCAT-oontrol piazmid (a GAT riporter gént tartalmazza az SV4ö promóter és enhanszer szabályozásával} mindegyikét kereskedelmi .forgalomban a Fromegától (Madison, WI) szereztük be.
A FH19E pla.2mid létrehozásához, mely a GAT riporter gént tartalmazza a H19 promótér szabályozásával, a HI9 oromóte (1. azonosítószámú szekvencia) először a pSluescript 11 SHd-ba CRromega) klónoztuk.. A H15 promóter szekvenciát tartalmazó· pűlinukleotídot humán píacanta DHS-bói amplifikáituk a kővetkező prímereket alkalmazva:
S.SPCR21: GGGTTCCCCACTTCGCCAGTTT (6, azonosítószámú szekvencia) és
ESFCR22: GGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT 57. azonosítószámú szekvencia),
A RCR termékek végét Kleno-w enzimmel tompává tettük, és a pBiuescriptliSK* EcoRV helyére klónoztuk. A beillesztett DNS-t láncon belül vágó Pvu.II, EcoRl és Apai enzimekkel emésztve igazoltuk. A promóter iránya a vektor lacS kódoló régiójának Irányával ellentétes volt, A promóter régiót ezután HindiII-mai és Pstl-gyei hasítva kivágtuk, és a kapott, hozzávetőleg 0,9 kb-os fragmentumot a pCAT-basic piazmid Hindi XT.~Psti helyeire Ínssertáltuk, hogy a pHlúE-t létrehozzuk.
A Hív promóter/'GAT riporter géntől lefelé mindkét orientációban inszertált H19 enhanszer régiót tartalmazó expressziős piazmidokat a kővetkezőképpen hoztuk létre. A Hiú downstream enhanssert tartalmazó 5 kb-os Saol fragmentumot {a H15 transzkripció startjához viszonyítva Hjfö kb~tól tli kb-ig terjed) a pöCl9 SacI helyére klónoztuk. Ezt az ehhanszer fragmentumot ezután EeoRI-val és HindiII-mai kihasítottuk, és a pBlues-cript .IX S?ü EeoEl-HíndlII helyeire ligáitok, hogy létrehozzuk a pBhHlEEnSa-t. A pBhH!9En-Sa-t BamKI-val részlegesen emésztettük, és a H19-t (és egy belső BamKI helyet) tartalmazó 5 kb-os fragmentumot a Hl9 promóter/CAT riporter géntől lefelé elhelyezkedő BamKI helyre klónoztuk a pHI9E-be. A HX9 enhanszert jó irányban (pK19S19D) és fordítva (pKl9EK19Bj tartalmazó plazmido.kat hoztunk létre.
1.2, Bredmónyek és megtárgyalásuk őt különbőzé húgyhólyag rákos sejtvonalat, a KT-137€-t, SJ-
28-t, T24P-t, 1197-t és U M-üC-3 pCat- ba sic plazmáddá'
jelölve a 2. ábrán), |χ·> \»’fi A· -contro-llal (pSV4ö w<m.‘. V íí.íÍK
2. ábrán), pH19E' - v-er, pHlSEHlüü -vei és pH!
transzfektáltuk. Mindegyik szerkezet expressziós eredményeit a 3A-3E, ábrán mutatjuk be. Mindegyik sejtvonalban a CAT aktivitás legnagyobb mértékét a pGAT-controí plazmidnái figyeltük meg, mely az SV4Q eríhanszert és az SV40 promőtert is tartalmazta. Ez a szerkezet szolgált pozitív kontrollként, mivel az SV40 szabályozó szekvenciákról már megállapították, hogy a génexpresszió indukáló!. Azonban az SV40 szabályozó szekvenciáknak nem tnmorsejt-specifikus az a képességük, ahogy a génexpressziöt indukálják, A Cat riporter gént a HIS oromóter szabályozása alatt tartalmazó pK19E-ve( inszfektált sejtvonalak a háttérhez képest szintén jelentősen megnövekedett CAT expressziót mutattak.
A HI9 promőter Cat aktivitás indukciójának mértéke a. KT-137Í **** sejtvonalban lévő ötszörös mértéktől az üH-UC-3 sejfcvonaIpán lévő tízszeres mennyiségig terjedt, A. H19 enhanszer hozzáadása a HIS pxomófcex/CAT riporter génszerkezetekhez tovább növelte az adott sejtvonalakban az expresszió mértékét. Például az EJ28, T24F és 119? .sejtvonalakban a HIS enhanszer szignifikánsan megnövelte az expressziét a H19 promöter./CAT riporter génről, Mindemellett az enhanszer orientációja különböző eredményeket adott az eltérő sejtvonalakban. A HT-1376 és VH-UC-3 sejtvonalakban az enhanszer kiesi vagy semmilyen hatással nem volt az expressziére.
Az eredmények azt bizonyítják, hogy a humán HIS pxomöter régió egy működőképesen kapcsolt heterológ riporter gén expresszióját irányítja a húgyhólyag rák eredetű sejtvonalak széles körében. Néhány húgyhólyag eredetű sejtvonalban· a HIS enhanszer a H19 szabályozása alatt álló· riporter gén expresszióját tovább növelheti,
2, példa.: A Hl9 regaláfcor szekvenciák sssshályosása alatt álló toxm gén
2,1, Anyagok és módszerek
Az 1. példában fentebb leírt expressziős szerkezeteket ügy módosítjuk, hogy egy toxikus· termeket vagy egy győgyszerelővegyületet kódoló szekvenciát expresszáljanak a CAT helyett. Például a CAT génterméket kódoló szekvenciát eltávolítjuk, és herpesz simpiex vírus tim.ld.in kínért (HSV-TK) kódoló szekvenciával helyettesítjük a szakterületen ismert szokásos klőnozási módszereket alkalmazva.
A HiS/gyögyszer-eiövegyüiet expressziós plazmadókat hűgyhőlyao rák eredetű seitvonalakba transzfekiáijuk, ahogy az 1, pél38 dóban leírtuk. Húgyhólyag rák. sejtvonalakba transzfektálva egy H19/B57-TK expressziós plazmxd húgyhólyag ráksejt specifikus citotoxxcxtást indukál gancíclovir jelenlétében..
3.1.
Hetven öthetes .nőstény C3H/H© egéret (Charles .River). úgy neveltünk, hogy egy ketrecben hatot tartottunk, és hagytuk# hogy akklimatizálódjanak egy légkondicionált szobában 12 óra fény/12 óra sötétség megvilágítási ciklusban.. Nyolchetes korukban kezdtük el a kísérletet, és az egereket önkényesen egy kontroll csoportba <1Ö egér) és egy kísérleti csoportra (68 egér} osztottuk. Az egerek kísérleti csoportja, az ivóvizükben feloldott 0,15% Nbutil-H-(4-hidroxi-butii)-nitrózamint (Tokyo Kaséi Kogyo Co., Japán) kapott tetszés szerint. A. kontroll egerek, csapvizet kaptak. Mindkét csoportból a kísérlet megkezdése után 4,· 8, 12, IS, 28 és 26 héttel állatokat öltünk meg. A húgyhólyagokat kivágtuk, és a paraffin tömbökbe ágyaztuk szokásos eljárásokat alkalmazva..
3.1.1, Próba készítése
Sgy egér Hiú kódoló régiót tartalmazó 2,1 kb-os fragmentumot szubklónoztunk pBIuescript II KS plazmídba .(Stratagene, la •Joli-a, CA) a T7 és T3 RNS polímeráz. kötőhelyek mögé, - jelölt
antisz 3 n 'μ 1 S Ü r· γ x m Íz i i V ó. V U i: 1 · ; X <31?. V 7 < <
xinear izált plaz: m.íd DNS -bői 77 polimerázt (3c
és egy Amersham ί\η\· n n A. V o & V -í *· o. r v , <. vt. U· \T- u aJ. rs Ima zva. Az
7 Cí t í t •„ranszkript amo k 10 7 cpmz-pg specifikus ak
keznek . 73 ociir ne r á ζ z a i (Soehrinoer Manche im<
£co.R..I-val linearizált templátot használtunk kent
Φν « ΦΆ* Φ > φ *- φ Χ· ♦' « Φ χ Φ φ φφφ φφφ* «χ * Φ* »* rollként,
3.1.2. Σπ aítu hibridizáció
Formaiinnal rögzített szövetek p:araf Innal rögzített metszeteit (5 μΜύ 3-amino-propiI-trietoxilánnal (Tespa, Slgms) fedett mikroszkóp tárgylemezekre helyeztük# és 37cC~on egy éjszakán át szárítottuk. A metszetekből a gyantát xilollal eltávolítottuk# 4% paraformaldehiddel rögzítettük, majd proteinét K-vsl (Sigma) kezeltük. A lemezeket aeetileztük, hogy csökkentsük a próba nem specifikus kötését# és víztelenítettük egy etanoi sorozattal.
A b©)-jelölt RNS próbákat (50 000 cpu/μΐ specifikus aktivitás) ügy hiferidizálfcuk, ahogy Rangird és munkatársai leírták [Mech. Dev. 35, 13-2.4 (1391.)), kihagyva a tio-AMR-s lépést. A tárgylemezeket filmre- exponáltok 10 napon át, és hematoxi.1 innal és eozinnal kontrasztfestettük. A lemezeket megvizsgáltuk, és egy Polyvar (Felehet Jüng) mikroszkópot használva, világos és sötétmezős megvilágítás alatt lefényképeztük. A kontrollok szens-z RNS próbákkal történő hibridizálást és RN-ázos elöhíhridizálásos kezelést foglaltak magukban. Továbbá felnőtt egészséges egerek húgyhólyagjainak (melyek nem expresszáitak Hi9~t) és embrionális egér húgyhólyagok (melyek nem expresszáltak H19~t) metszetei szolgáltak negatív illetőleg pozitív kontrollként.
3.2. Eredmények és megtárgyalásuk
A 26. hétre az összes megmaradt kísérleti egércsoportba tartozó egérben tapintható húgyhólyag tumor fejlődött ki. A «19 nagymértékű expressziőjáfc ügyeltük meg a kémiailag indukált húgyhólyag tumorokban. Ezzel szemben# nem. mutattunk ki Hl 9 expressziét a normális felnőtt húgyhólyagban. Következésképpen a kémiailag indukált húgyhólyagnak az ilyen egér modelljét állati v* »♦·*» **<« '<
« X * * * * > ♦·* * * <
,n<
modellként használhatjuk, a. toxin génhez működőképesen, kapcsolt. Hl 9 szabályozó régiókat tartalmazó -szerkezetek in viw tumorspecifi kus citotoxicitásának igazolására.
A H19/toxín vagy gyógyszer-elóvegyület expressziős piazsidókat liposzómá-kba visszük be (ahogy azt T'akashita é-s munkatársai leírták, u, Ciín, lovast 93, 652--651 (1.933), mely referenciaként a leírásba épülj as in vívó egér húgyhólyagba juttatáshoz. Ehhez a kísérlethez használt egereknek kémiailag indukált húgyhólyag tumorjaik vannak, ahogy fentebb a 3, példában leírtuk.
Röviden, SCO μΐ Optime-n szérummentes közegben (8RL Life
Technologies, Gaithersburg, Ml?) feloldott 50 ug plazmid DNS-t adunk 250 pl Lipofectaminhoz 250 μΐ. vízben. Az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten inkuháljuk, majd hígítjuk 10 ml kiegyensúlyozott sóoldatban (SSS(~):: 140 mM NaCl, 5,4 mM KOI, 10 mM TrisHC1, pH-?, 6). miután- az oldatot 15000 rpm-mel 30 percig centrifugálva pe-11-etiz.áltuk, a liposzőmákat 1 ml, 1 mM CsCi^-t tartalmazó SSS(”5~ban újra szuszpendál juk. Hozzávetőleg 0,2 mi koncentrált liposzómát adunk be katéteren át a kémiailag indukált húgyhólyag tumorral rendelkező egereknek. A húgyhólyag tumorral rendelkező egerek kontroli csoportja DOS nélküli vagy a H19 szabályozó szekvenciák szabályozása alatt álló irreleváns gént tartalmazó liposzőmákat kapott. Meghatározott időpontokban mindegyik csoportból egereket Ölünk le, és a. húgyhólyagot kimetsszük, rögzítjük, és paraffin tömbökbe ágyazzuk szokásos eljárásokat alkalmazva. Minden második metszetet a fent leirt Hiú próbát il
Φ* fe* .»*·♦* ΦΛ·ν» *
Φ * » «· » * * ν X - * ν Φ
X * * » S * * f
Φ$Λ κ -♦» φ *. '*'·’vagy Fseudomcnas toxingén kódoló szekvenciához tervezett próbát alkalmazó in sí tv hibridizációhoz készítünk elő. Továbbá a tumorok méretét, számát és elhalását összehasonlítjuk a kontroll és a kísérleti csoportok között. Úgy találtuk, hogy a Psescomocas to-xln expressziója egv helyen fordul elő a HIS exprsssziójával a kísérleti egércsoportból származó- húgyhólyag tumorokban. Továbbá az egerek kísérleti csoportjában a húgyhólyag tumorok mérete lecsökken és nekrot ikus:, ha az egerek kontroli csoportjában lévő húgyhólyag tumorokkal összehasonlítjuk.
5, Példa: Expresszió IGF-2 P3 és P4 orométerekről tumor sejtvonalakban
5,1. Anyagok és módszerek
Ebben a kísérletben olyan- különböző expressziás szerkezeteket hoztunk létre, melyekben a luciferáz gént a négy különböze IGF-2 p-romóter egyikének szabályozása alá helyeztük, és több különböze húgyhólyag rák sejtvonalba vittük be. A következő humán IGF-2 promóter/Iuciferáz szerkezeteket 'készítettük el:
Piazmídszerkezetek IGF-2 gon nukleotid- szekvencia Promótér
Hupl -960 - +54. Fromóter 1
Hup2 -379- +271. Fromóter 2
Hup3 -1229 -+140, Promőter 3
πυρ 4 -546 - -102. Fromóter 4
Az IGF-2 promóter szekvenciákat Sussenba-ch és munkatársai írták le (Growth Reg, Z, 1-9 (19925], mely referenciaként a leírásba épül. A luciferáz riporter vektor kereskedelmi forgalomban szerezhető be a Promegátől,- Malison, WI {katalógusszám;
fc < fc
VXs *
-. « V* * - fc :· fcv
V’
A kapott expressziós plazmido-kat HT~1376, EJ28, T24F, 119? és ÖM-UC-3 humán húgyhólyagrák sejtvonalakba transzfektáltuk, ahogy fentebb az 1. példában leírtuk. A luciferáz aktivitást egy kereskedelmi forgalomban kapható ki tét (Promega, Madison, W.I, katalógusszám: El Söö) alkalmazva mértük. A2 eredmények., melyeket a
4.A-4E. ábrán mutatunk be, igazolják, hogy az IG9-2 P4 promóter a luciferáz riporter gén expressziéját mindegyik vizsgált húgyhólyag rák sejtvonalban irányította. A 1197 sejtvonalban az IGF-2 93 promóter is irányítja a luciferáz riporter gén expressziedét. Az ezt követő kísérletekben az TGE-2 93 -és 94 promóterekröl kimutattuk, hogy a luciferáz gén expresszió.ját más tumor sejtvonalakban is Irányítja, ide értve a koriokarcinóma sejteket és a rabdo-mioszarkóma- sej tokét.
€, példa: A 013 promóter és az IGF-2 pri»ófcar a H19
;íro i
Négy luciferáz riporter vektort, a p.GLö~basic, pGt pGll-Snhancher és· pGL3-Controi vektort a 9romeg-át-ől szereztük be. Ezeket a vektorokat tenyésztett .sejt vonalakba transzfektáltuk számos különböző transzfekcíós reagenst alkalmazva., ezek közé tartozik a lipofetárnán (Gibco/SRL)fügén (S-oehringer) a Perfect Transfection Kit 3 különböző lipid reagenssel (Invitrogen) , TEX-iö, TFX-20, Tra.ns.fast (Prcmega), és a kalcium-foszfátos eljárás (Germán et al,, Mo-1. Cell. Siói. 2, i no-iηζΐ > ι os·?
ral amplifikáituk a
ATATGGTACCGACAACCCTCAGCAAAG-3! szekvencia) az
A pBluesoript II SK EcoRV helyére klónozott H19 promótert (pbhI9p#l) az 1.1, példában irtuk le fentebb. A Ki9 promptért kivágtuk Smal-gyel és Hind,III-mal hasítva, és a kapott 0,9 kb-os fragmentumot a pGL3-Basic vektor Smal-HindlIX helyére ins2ertáltuk, hogy a Lúc-pbhi9 szerkezetet létrehozzuk.
A -8.19, - +14. nukleotídig terjedd H19 promóter régiót PCHpbh!9p#l plazmídből, 5'(upstream., 8. azonos i tőszámú n,?rt ·* :«> *> y /V .‘p 5VJ .•τ·'.'PwΆ Γ* Z·*·??».»'·'» '> f
A λ nAkSV i ivx Ww λ .A*A\A„kv x <A.· i ^**.5 (downstream,· 9, azonosítószámú szekvencia) prímeteket alkalmazva. A kapott PCH terméket Κρηϊ-gyel és HindiXX-mai emésztettük, és a pGőE-Basic vektor Kpnl-HindiII helyére ligáltuk, mely a Luc-PB«I9 szerkezetet eredményezte. A BCB-ral létrehozott HI9 promótert mindkét irányban megszevenáltuk automatizált festék terminátor ciklus szekvenálóval (AKT Prism 377 DNS szekvenátor, Perkin Elmer). Az 5. ábra mutatja a H19 promóter PCR-ral létrehozott núkleotid szekvenciáját (2, azonosítószámú szekvencia)<
Az 1. példában fentebb leirt 5 kb-os HIS downstream enhanszert DamH-val emésztettük, hogy egy 4,1 kb-os és egy 0,9 kb-os fragmentumot hozzunk létre a 3' végen.
A Luc~PBH19~0.9DH19 és I,uc-BSH19-4EH19 szerkezeteket hoztuk létre a H19 enhanszer δ, 9 kb-os illetőleg a.
fráment«mainak a Luc~?BHl9 piazmid BamHX helyére inszertáiásával, Az enhanszer szekvenciákat a Hl 9 promöter/luciferáz riporter géntől lefelé helyeztük el.
A 0,9 kb-os BamHX enhanszer fragmentumot a pGL-Basic vektor
BamHX helyére ligáitok, hogy a Luc—0.9SH19 vektort hozzuk létre.
A pbhlűptl piazmid H19 promotsrét kihasítottuk Kpnl-SamHI-val, r ko-os »3®Ki ** * ♦ és a Luc-O,SSH19 szerkezet Kpn.I~Bg.iII helyére iigáltuk, mely a Luc~pbhl9~0.9SH19 expressziós szerkezetet eredményezte, mely tartalmazta az 1. példában leírt promóter klónkat, és a Hl3/Luc riporter géntől lefelé elhelyezkedő Q,9 kb-os enhanszert.
Hup-l-nek, Hup-2-nek, Hup~3-nak és Hup-4-nek nevezett expressziós vektorokat hoztunk létre, melyek a humán Pl, P2, P3 illetőleg F4 IGF-2 promóterek szabályozása alatt álló luciferáz gént tartalmazták, ahogy Sussenbac'h és munkatársai leírták (Growth Reg. 2, 1-9 (1392) ] . Egy 512 bp~os ?4 régiét amplíf1 háltunk PCR-ral a Hup-4 szerkezetből 5'ACAGGTACCTC?AGAGTCGACCT~3f ('upstream, 10. azonosítószámú szekvencia) és 5'-ATA?AAGC??GCTCCCATCCTGCA-3f (downstream, 11 azonosítószámú szekvencia) primereket alkalmazva. A kapott PCR terméket Kpnl-HindllI-maX emésztettük, és a pGL3-Basíc riporter gén KpnI-Hindi 12 helyére iigáltuk, hogy a buo-34 riporter gén vektort hozzuk létre.
IGR-2 P4 promótert és a HIS enhanszert tartalmazó expressziós vektorokat is létrehoztunk.. A korábban leírt 4,1 kb-os fragmentumból származó 2 kb-os BamBI enhanszer fragmentumot a L.uc-P4 szerkezet SamHI helyére klónoztuk a Luc-B'4-2EH19 expressziós vektort létrehozva.
A 0,9 kb-os·, 2 kb-os és 4,1 kb-os H19 enhanszereket automatizált DPS szekvenálást alkalmazva szekvenáltuk reg. A 0,9 kb-os enhanszer nukleotidszekvenciáját a 6. ábrán mutatjuk be (3, azonos! tőszámú szekvencia'} , A 2 kb-os enhanszer nukleotidszekvenciáját a 7A. és a 73. ábrákon mutatjuk be (4. azonosítószámú .szekvencia) . A 4,1 kb-os enhanszer nukleotidszekvenciáját a SA-SC. ábrákon .mutatjuk be (5, azonosítószámú szekvencia).
δ. 2 . Eredmények és magtáu
Amikor különböző -trans-zfekcíós- reagenst alkalmaztunk arra, hogy a négy luciferáz gént tartalmazó vektorokat a tenyésztett sejtvonalakba vigyük be, a kalcium-fo-szfátos kicsapás eredményezte a legnagyobb transzfakciós hatékonyságot a vizsgált sejtvonalak legtöbbjénél. Ezért ezt követően kalciumom kicsapást használtunk -a különböző- expressziós vektorok transzfektálására. Továbbá a plazmád DNS megnövelt koncentrációja nem gátolta a transzfekciő hatékonyságát, még akkor sem, amikor a felső szint feletti koncentrációban alkalmaztuk azokat.
Az 5637 húgyhólyag sejtvonal, a Huh? hepatocelluláris karcinóma (HCC) sejtvonal és a 293T vese-tumor -sejtvonal mindegyikét különböző· szerkezetekkel transzferáltuk, melyek a luciferáz riporter gént a H13 vagy IGF-2 ?4 promóter szabályozása alatt tartalmazták a KIS- -enhanszerrel együtt.
A riporter gént és- a Hl8 prométért tartalmazó Luc-phlS-cel és Luc-PHl 9-cel transzfektáit sejtek a háttérhez. képest megnövekedett génexpressziőt mutattak (3A-9C< ábra). A PCR-re.l létrehozott promótert tartalmazó Luc-PH19 szerkezet nagyobb aktivitást mutatott, mint a Luc~phl9, mindegyik vizsgált sejt-vonalban. A 0,9 kb~os H19 ennanszer fragmentum hozzáadása a LucphlS riporter vektorhoz iLuo-phl9~0,9EH19) tovább növelte ez expre-s-s-zió mértékét kétszereséről a négyszeresére- az 5637 illetőleg 29'3T sejtvonalakban.
Az XGF--2 F4 promóter ís megnövelte a luciferáz expresszió-ját a háttérhez képest az összes sejtvonalban< A 2 kb-os H19 enhahszsr fragmentum hozzáadása a Luc-P4 expressziós vektorhoz fokozta a P4 promóter aktivitását. A 2 kb-os enhanszer fragmentumnak a “ 6 ·* ♦ ·» • * * * * ♦ ♦ « * w luciferáz aktivitásra gyakorolt indukciója a 2937 sejtvonalban megtalálható kétszeres mértéktől a Huh? sejtvonalban talált hatszoros mennyiségig terjedt, míg az enhanszer csak csekély mértékbe fokozta a promóter aktivitást az 5H?3 sejtekben.
A 1ÖA-1ÖS. ábra .mutatja, a FCK-ral létrehozott H19 promótert és 4,1 kb-os Hl9 enhanszer fragmentumot is tartalmazó Lee~phi9~ 4EH19 szerkezet expresszióját. Az enhanszer nagymértékben, 3-28 szorosára növelte a promóter aktivitását, a sej tvonalakban, az
5637 seitvonal kivételével.
A kővetkező plazmidot deponáltuk az American Type Cuiture Coilectíon-nél (ATGCi, Hanassas, VA, a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezése nemzetközi elismeréséről szóló Budapesti Szerződés előírásai szerint:
Klón. ATCC nyilvántartási szám: letétbehelyezés ideje:
PH19EH19' 209322 2997, október 2'.
Az előzőekben ismertetett leírás alkalmas arra, hogy lehetővé tegye egy szakterületen jártas számára, hogy « találmányt a gyakorlatban megvalósítsa. Természetesen a találmány .megvalósítására szolgáló lentebb leírt eszközök különböző változatai, melyek nyilvánvalóak azok számára, akik a molekuláris biológia és az orvostudomány területén vagy a rokon szakterületeken jártasak, szándékaink szerint a következő igénvoontok oltalmi körén belül maradnak.
ívatkozott oubiikációk referenciaként teljes terjedelmükben a leírás részét kepezrk.
OfrS
ΟδΤ
ŐZT
SoSsaooSoS
3£«0825κ«2 «SőSaoaaSS
SSSSSoaSBo £55308555.3 £33£85a£o3
5560358283 svsaSaaSSa £888£S«2«S «ooooaBSoo zeoovsSSoo oSoSoSsSsa SoaoSooaSo 2232233332 8553322322 £S2£-33««22 2328322,283 2223583332 2388833328 3383538,533 832552.508« 3255588328 2323222282
£ <S09>
882380 ÖÜS3H «εχχ*
vsa <5XX>
εεο <ττε>
z <000*
GO JU ©O 855 22 S 0?>S OS* oz* 09£ Ö80 0*0 081 ®tí 22
SSSaSSSasa
3558333555 «552223252 £S8«5355«S aSoSSqsaSS
23Ő2382825
SoaSeSaasS
SSaSsaaSSS
3235«83«35
SaasSSBaw
3δδδ»53335
0S333353SS
5525838222
8558533855
SSSeőSSooS
8333633885 o»5«6SS53» £»«5322383
8a£«25«S55
0338555833
SeSaS»®»»» 5583383323 «£38»2»5a5 SaSaaSSaS» o53S«£«35e 53331? «3333 83S3823383 «233332322· 8888838223 8333383365 5235222388 SqasSaaaoJS 20O3555«£5 SaoooaSSSö SaSao-oaSSő £235353538 £s58S«53SS 522235653« 3382332825 23£55«£5«Β BOOS^kSSoO 332332235« 2233388255 £222365828 »3»b£55323 5535«285«5 £558532233 .8233835322 Ő35£S«3325 2 825888353 3283358322 3335853328 3352533232 3Ö565e«5»8 3253533823 »383333223 3338333383 2823838283 2233333883 8588828023 £555522035 5388882338 3832883253 3388855833 33852322«5 5552523553 5823332555 8855838382 2332382228 3883553335 8383288253 3353835238 33353355«» 323225«5«5 £833355525 2830008033 OOSSSOOSSOO 8883005855 £833322255 2333558838 0388833832 3338838833 3355583.533
T <2S8>*
0825«S 8'33;S <£~Z> vsa «πρ 508 <008* <OTZ>
G‘C «3Τ838Λ »A©9»7& OOJ C2£32«Z <S5T»
TT <09T>
εο-δτ-ζεετ «τετ» S05OS/SÖ S5 <GST>
O-OWSST <TST* üK’m/βδ sít «sst* &e~oo-sss~ <τ*τ» mos/mx/ioa m-nöö-tsM <οετ>
XXX32X05CXX3 □xáX3Sás;xom£ mxónasr voa ssmxxsoáms w ssoexsh «οετ»
85»XSSSn38£> JO
A8gS28A0Un Λ®3ί?8Η «%. ?« Λ288820 30212882g228SS8'á BJTSSJX <OTT>
egsTfvxousA^szs ik ssöt oss
GöS ow
SS 5
ŐS5 áss
ÖÖS s»s
08»
ÖCS' ösr
Sőt
3»S
ŐST
ŐST
ŐS
U8
0»S oes orr oss
OÖS o»s
08»
SS» osx est w
G8T οετ
OS €58 őst
ŐST oss
003 s»s
SS»
ÖS»
OSS
S0€ ooSouőősob 88s5o3522S 2822225502 foosSoooos SáSSSoőooS 50825=8203 S®«5eSöS'ő3 sossbSSsőS Ő82-53S55SS sbőSSsoo^o S«-9oseő8oS- oőőSioso»»· οο55ο5£ε33 ££8822225« o3353So83a S»08333530 ssoSoBoooo £322323333 3233323355 8253283060 33035553» BO8OOOO23O 22«SS335£5 5335555353 5S2S«55őő2 5233555335 £«55£3£.Ss3 Β3δ55335δ2: 333388030« 23«0300Ő02 225^555033 320S332233 őo.SoooooSe οοοοοδοοοο 533363633« 222-3353332 3253333035 5530335335 O35o0.SS322 2335325230 3322523353 23OO55s5«2 S03033S32S £55bs55&33 5333553355 «oSooooooo 5000332333 3233555553 BsooSobSSS «δοοδδδοοο 23.832222S3 3S23030Ő2S 5322335323 5533333252 3330333322 3333332233 3333233233 3525302333 0223332333 02.53322225 3OO£SO2S25 0203550220 3022083552 53O55OO332 0333335332 o£o32S5353 oSo.SoooőoS 02355ooSS3 3oSS55Sooo 02303230S3 53323o5e55 3S0S2220S0 soooSoőeSo οοοοδοοοοδ 33o63«63S3 SoSoSsSoSo S3S3S0S353 £253235353 £353235353 55530053.63 ££53o5k233 3333533253 822OOO3553 £«03032323 SSOOOSSSOO 23255.53055 3333055333 883200025« 235So55o23 £££££282%?%? 3332222553 2332333555 SSoSSSooaS »33Soo5o£S So«335o5o3 30833S3223 0555255355 2o5o5o2»23 ,3222223330 Sooooooáos SSooooaoB» SooooSSSoo » <053»
38TC88 C3S»H «€7£» νκσ <ετε>
OS«t <TTS>
» <ŐTS>
£553335 «05233230« 52235o5556 OOS5««3283 3335oSS520 333353S353 2333OSoo5s 5233322025 33θ£θθ£3Ο3 3253322353 0So£233038 2230283253 5333000580 2233082233 23200o55o5 0323252333 3223333533 2203232223 3533555008 OOSSOOOSOS 3«5S268053 0350325330 2353255553 3SSS3O3323 3333335308 5o60033SO0 ΟΟΟΟΟΟδδδΟ 8282335553 303355022«! 225&OS33SS 5053003553 25S0500020 2233052235 5O2O22»525 5303233833 8523302503 3350332582 83ŐO288883 2S32000503 2Ϊ20222223 3253333583 2250333003 3303330S03 2353032530 2253333322 000832i5«2 3250223033 2238322302 ΟΟδΟΟΟΟδοΟ 2223333508 0032330533 0358300833 3063022000 3353330530 0O6«3225«O 0θδθ22裫0 2353232320 2353323508 326«003832 33S3000380 OOSOOOOSOO 3358232583 2202333530 035θ3325«2 035o333So3 23SO332S33 33δΒ33θδ«3 3365333023 338033Ő330 3»O3«?SS08S S53S000003 25sb55o5oS o5oooo33«6 «32553556ο «SsoooSoos 3300503335 0232500303 2362033000 oSSooooSso ooSoSooooS SőooooSSoo SSooSosSoS 3333OOO65o ΟΟΟδοδοοδο 0233000000 2035333322 «55θ233®»5 5280028883
ε
ÍÍOTáOS 0520*5 «Πϊ>
VKü «ετε»
558 € «ττε» <οτε>
So5 55®ο3555®ο SoSSeSoooS 5033555222 Soooooőooo δκοοοοοοοδ £»22555223 3005553055 δοοδδδοοδδ 3255320322 οοδοοοοδδδ o65£ooooo5 5£S5o53222 SSSoSSoSőo SSSsoooSoo «οδδοοδοδο SooSoSoSoS oSSSooSoőö 52o56«oo33 ooSoSSoooo o5o25£«555 53δ3££55«5 SoooooSooS SoooooSooo 2S0332530S 2555520525 5®556o53oo oSSoosoSo» 5o555oS5S3 οοδδΰδεοο» oS£S5s2383 0025855200 55®o5eo5s5 SSooSSooSS 225oS55eo5
53S3«3oSo3 2222802330 oÖooooSőSe oooooSoőoo 3000523303 oooSSSSo^S 5^25535538 23528£oS33 32S0S2530S 5580380300 3000383333 2358232200 5203323222 «255253335 5555032022 θ£θ5320θ55 3355555533 o5523®«656 2056328832 S£223S«O2« OSkBooSosS o5338«o££o 5330253383 «SSSSoSooS
8>
036’ CCS’ Q35T SOS’ OH’ 0 85 ccsr ossz COS om osrr οτετ oszt oszt OSZT 0 SÓT οζοτ őst 00« 038 08» OZi SOS 00$ 0>S OS 5 on asz őst o>z
ŐST
ŐZT
OS »»»Sa»5S»5 »»£S»®»55» »£££»»»55» ®»33»»S»5»
Βοδδεδεδε» í3»»»55»»3 £ε5»ε555»5
3»»555ε»»»
33S»5o3S»S »3ε5»££££ε
33£5£££ε£)ε £3£«2:2:SS£S b5SSS5»»»S
33»»3335a» aoaSaSSaSs
S£3S5»3»5» »»5oíi22»33
5335352503 ooSSbSSboo
303»3»»»55
BSoSBfiSSS» »»5εδδδΒ»» a»5»»»»3a5
5»»»»ο5»36
SecooSbb&SS »»3Β3ΰ»»3» aasSS»»»»» aSsSaasSttS
33»»£«5b5b
Sa5a5a5a6a £5»3®555£»
33333:3305»
35553:55555 aao»·»»».»»»
S»»»»»»»»» »»S®»»»®£g »»»»B»3B»« boSsSSS»»» εεεεδε»».»®
555»5£δ33»
55ε»55ε»5ε
5»»£5ε£έ»ε aoaSSavSsS
5έ»£ε££«ε3 asa»»5s£»» »»»»SSoo»S
SSoo3355»» £££exre333£ £553353533
3330335a»5
03O»bS£o55
55b»»»»»5b £»5»»£»55£ s»»»5ss»»5
333S333330
SSaSaoSoaS
SűSbbSSS»» ®S3»555b»3 »»»»»333»»
3;5S»5£«»»3 »3:3^53355» »»3»5β3335
555» s»5aSa
3»a5553355 »»»»»»»555
3£5®5£»»3O
33333»»»®»
SS»®»»»»»» S»5£:55»3»» 5353355335 »5552232»» »35333»»»» 3»555»»55s 5S5a£»»»£a £S5»s£k»5£ 33333553»® £3££555»®» a»».»»»»®»» 555»»»SaSS »3.55355» »» 333»»»»®»» ΟδεοδοΒ»»» ,Ο333»»££β» £3»5»££őSő 3»»5»5»3»5 »»£»525»3» 5^55555533 £»53333353 esSesSSass Sa a»55»355 33»»»»»S5a »33333333» »3»»3B»55» 3«55£55bbb a33SasSaSa SSSa £'£33» a »»»»δ65»3» 55»55g3333 3333333333 »»5»»»»»»» 3333033333 aőSS®»»»®» 5aa3»»»»3» £»Sa»»£s»S 5553353333 as3a»S5aa3 ®»®30325ő£ »5»»6555»3 S»0».»3»33» SaaaSaSőSS »333523333 bSbBSOBSbo 5535533333 »335335333 3»»S®33»£» £»»££»»£»3 33555»3»33 K3»3»335»3 3» 3» 3333 33 3335£a»55a 353335333» aaa&safiBoS B»5»0»B»»» a5»33»3Sa5 »£3533333» 533253333» 3333333353 Sa5»5»5»5» 3aS»5»»»S3 33»a»3»»5® £Sa£3»S»»5 5333333333 »3»5»»3»SS 3333335533 3523333033 5525333333 £33.2353» 3 3 SgőSaa»»55 £»»»»»»»»» »»»»£65®»a £»»55»55»3 bkSSbBSboo 3»S5S3»553 »£33355533 S»»»»66»»£ »£ββ5β5»»β »£»»55b555 s£s5£555ag 55055a£3»5 5333335-3» 5 »3»5»5b»»» 3335.233.255 »»£3330003 S»3O5»£»33 3330233333 5®335a33aa £»»»»»5»»» »»»3333333 »»»»»»£»»» S»»»»g5®55 SaSaSaSaSa 335333355a »»55355333 »££»323233 65®O»3»o5B
S <
»»»»£S»»£a »3»»»£»333 5a»»5332a5 »££££33333 ®»»3»sS33.S 533353553» »»333»£»»» S5553»£»SS 33£35S££»5 33333S£e»3 ooSaoSSSe» 3»£»3»3»»S 5S5»£35«»® b£5»»»»55® SoSoőSőS»» 533SSa».Sőa £5b3S5»o££
3355333353 Saa»a»»3»3 5a»S£££»53 3333»»»5»» θ£3»»»3333 3»»»SS®»£3 »»»»55£5£» 2S333»»»5» 3»53»»»S»5 33£3a55aSa 3335333333 5a5»5»5»5» 53»»»»»3»a 5S5££aB»BB »333035»»» £33335523» 00»
333533 oson «πζ» sm *m* S «ÖT 2» osst SZ ST ess? OOBT OH? 089T OZST OSST 00 ST OW 08 TT OSST OSZT OOZT OSTT osor esSeSSfSa»
5553533 3»S 3δ5»£δ»«5» SaSSoaŐSSS 5»£as>»»5»5 »»»:»535»35 »553»3335S booooSSS»» 5£δ55ε»5ε» aaSvaSaaaS 23»555»»»» £53S»3»»33 3»»a»»35a» 3»e5355»S« £Ss£Sa®»Sa
553555»5»5 3»ε3»ε55»ε 555»5»S»5S »53»SBs3»» 333»»»335» £»3»555353 »»333»5»3δ oaSaoSeoSa οδεδδοεοδδ »»5δ»5»3»ε εοοοοδδοε® 3333333330 5533335533 5553333335 £»»33δ«δ3ε
5»3δ3»£££» 55555»»3»» SsSSSSSasíS 5ε5»33553» oBbooSbsSS 3553333333 B33o5«»£5S «OSSoSSbSS 3S555a£a»£ SaSeaasaaa SSSes»»»»» 53552^5333 »55ΒΟδΟΟδ» 3θ55ε££»»3 s£»isS£s£a3
3££3£££S»5 £»£»5»£»33 »£5£»Sa£aS 33»b5S»®5® 5S«bbo»3£» 3333333»»» aSőS»»»»»» »3££k££S»S £33»5££B»S »5»3»5b»5® 55»5®£®B»3 53333335S» 333333»»£5 5535533353 »33£3»£»»£ »3»£33»»»3
SSasSSSasS
3335333533
5535333253
5555233235 »»»3533333
3333333335
S»35«333»5
SbőSSsS»»» aS55«»»»S«
3»ε53δ»»33
3333033355
S5»S3»5B33 »»»533333» »533533333 »5»355s555
35355555»«
S53»3£«»b5 3355535»5a 3333355a«5 £5s£Sa555a 53»£55aa»3 55»3»333O3 3333335.033 O»5£B333»3 sS£S5»5»s£ »533553333 535333555» »33δεδ3333 555»535333 o55»3~3£53 5»5»£55533 53355»»SS» £ !γ V » * V
W3 «5~5> i£ *~T5> S <OTS>
sm
0SC3 3555285588 £263655326
ŰJS^ 2882253835 2823283363
δ 95 ε 55ο862555» 53&3SS62S3
Οδδ ε 3558388385 6385866556
om 5835656888 2236333335
385ε 3383332883 8832282382
οεεε 8255535553 3333352358
δδδ£ 558555256« 6553568555
oost 2523£5832» 388253555«
Ö8S5 3338335333 .6855883858
om 3332365368 5382382335
om 8523258233 3355352223
οοεε £335332353 3325533268
δοεε 22S2223233 ««8388856ο
os-εε SSoőoiraSSo 2333336833
οθτε 3263263335 3333366886
οετε «568865883 2855833325
δδοε 5«£«£o65S5 2686333638
δοοε 8326323238 «336333638
&w «£«££32663 5«5SS88£65
3885 3363536263 5855533363
0885 3238558658 3686332663
0922 353286366« £883822350
08 »2 8336323623 2282838623
«χ »«55283333 3038556355
08«ε 33«6«δ8288 3858235333
οε«ε 5255255260 5356236683
0995 8223223333 5385333663
00 35 2665533338 3555553035
sm 5333833352 2303533»»3
ο§εε 5253383583 8550330335
οεεε 2688636333 3386823303
09~ε 5365336653 8683033865
δδτε 2838535322 3580830353 .
8405 0232323223 ooSaaSosoő .
aS5 2233338883 282O323S23 8£3o£«sS33 «δδ» usxctes oíoojí <ctj>
W <£X£> εε <ττε>
i. <080>
05«3330003 222330oSSa 9 «’δδ» k»t<?8s csajon <εχε> wa <ετε>
2t « ττε>
<ÖT5>
SosSs
553255£oo2 βκ»«β»ο5«£ SSSosSSeSS SqSsSgSSSS 8a£»e-»e£SS 25o5o5££82 s»«SSg3»»3 »5SaeSeS3S 3865323838 S5oB5e5S£S 5ο«5255£22 o5o£5£«533 38525653S5 saSSoSoSSo s»S£»3»«»5 5323326833 8B«2868s5S 632325o£»» 3o5o£2«333 3bbSo36S«« aaawjSSSsa-s. «3*»»»033δ· «SoafiSosofi SBeSegaasS 33335«ao»O sSSvSaőBea 3325So£«3« sSooSsoSSo □SaoosaS&s 3333283333 SSSooaaSoa SvsSooSSSS 233.£«25655 o£33£S555S «osssaSaSS oooSSSoS»» SaoossSesS Seasaroosa SoooHooőso £28282228« 3835558683 «SSSscoofiá 6o323«3os3 £S3»»3O.S55 o5«2»o33£» S^osaSSsao 2008203333 3333236382 ososoSfíofife 3628823333 3383022022 *32333303» 2026688888 »£o633»o5o 5683333282 3333333333 3258252233 8580368002 3333233338 8233228233 5533533655 5o2«33S855 586S5«5S5o aooSSSrasS ««SSsSSoSa «ο5»»885δδ £355556255 88«56£686« □S»2«»o6S8 ««SŐ3233SS 55«33o5o«5 o5«S35«333 33O36«OO23 2083330335 8232.632333 £322338223 36«Βθ£565θ £333.533255 8556833383 3855823385 5««558S555 5033320603 8555533555 5833533553 3525383033 5588-225555 0300255358 8222322283 3368588333 3282355555 3333325533 8283855833 3333233333 3335383855 322328222» 5833333533 «383555035 5553338585 2223588222 05s55«8333 3385338225 5558503823 3282333855 8585683228 5833333358 3333882833 2553533553 2555833333 3055566503 323SbŐ3503 3352283338 2255523253 5586333333 2882866583 »«23382333 0»»0»0»02» £535235335 5588555838 ££3555858» 0SS08«3225 θ5688θ5θ8θ 3535383353 3223333323 2555283683 3335838556 5838303233 2228555833 2355833325 8855533233 5538868333 3555583355 553822355« 5S6SS322»» 50220££«55 3828833858 5832333332 5-835833355 5532328825 8238833332 525s503023
««» a ** * ♦ * * * -* * ♦♦
Jt x « ♦ **» »y «223» íiofso sapxsm «4SÖ> S epacgpcacc ^acaaccefce ace&a&a «22«> 3 «2ΧΧ» 28 «2X2 > »
«2X3 > Kc;r,« sápién
«4C0> S
afcasas^ctt ettcícccsc acccsgesi
<2X5? 20
«322» 23
«222» m
«223» K»“ö s&pisn
««00» XŐ
acagg&aeet eiagagscffa ecp
«2X0» 12
«2X2» 24
«2X2» SNA
«2X3» Homo sapisn
«áss» 22
atataagctí. gccccratec fcsjest

Claims (12)

1, Egy szekvencia tumorsejtben történő expressziójára szolgáié vektor, amely egy citotoxlkus génterméket kódoló heterolog szekvenciához működőképesen kapcsolt H19 szabályozó szekvenciát tartalmazó poiinukiectidot foglal magában.
2. Az 1, igénypont szerint} vektor, azzal jeiiemzve, hogy a Hl9 szabályozó szekvencia a H19 promotor, a H19 enhanszer vagy a H19 promotor és a H19 enhanszer együttesen,
3, A 2. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a H19 promotor tartalmaz:
(a) a H19 promoter az 1. azonosítószámú szekvencia 1-S3Ö. nukleotldjait tartalmazza; vagy (b) a Hl8 promoter a 2, azonosító számú szekvenciát, tartalmazza,
4, A 2, igénypont szerinti vektor, ahol a H18 enhanszer tartalmazza:
(a) a pH19EH19 plazmidba {letéthehelyezési száma: ATCC 209322) klónozott. Hl8 enhanszer szekvenciáját (b) a 3, azonositószámú szekvenciát;
(c) a 4. azonositószámú szekvenciát;
(d) az 5. azonositószámú szekvenciát;
ahol az enhanszer adott esetben a heterolőg szekvenciához képest 3’ irányban helyezkedik el,
5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a heterolőg szekvencia (a) E-galaktozidáz, diítéria toxin, Pseudomonas toxin, ricin, kolera toxin, retinoblasztóma gén, p53, Herpes simplex timidin kinéz, Varioella zosier timidin kinéz, citozin dezamináz, nitroredoktáz, citokróm p-43ö 281, timidin foszforiláz, porin nukleozid ·-· Jt * *
-D * * * * X « « ' * * Λ * « χ « *♦»* Κ«« « Φ # Λ íoszíohtáz, alkallkus foszfatáz, A és G2 karboxipaptidáz, ünamaráz, íl-lsktamáz vagy xantin oxidáz kódoló csoportból van választva;
(b) egy antiszensz szekvencia, mely specifikusén hibridizái a cdk2, cdk8, cdk21, odc25A, eskün Dí, ciklin E, ciklin Af cdk4 vagy az onkogén pS3, o-fos, c~jun, Kr-ras vagy a Her2/neu közöl választott gént kódoló szekvenciával; vagy
Cc) egy ribozimot kódol, amely specifikusan hasít egy, a cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A.. ciklin Dl, ciklin E, eskün A, cdk4 vagy az onkogén p53, c-fos, c-jun, Kr-ras vagy a Her2/neu gén közül választott kódoló RNS-t
8, Az előző igénypontok bármelyike szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt nem az emberi testben ven.
7> Áz 1-7. igénypontok bérmelyike szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a tumorsait egy húgyhólyag tumorsejt.
8. A 7. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a húgyhólyag tumorsejt a Ht-1376, EJ2S, T24F. 1197 vagy azÖm-UC-3 csoportból van választva,
9. Az 1-5., 7, és 8. igénypontok bármelyike szerinti vektor alkalmazása gyógyszer előálli'tására, mely alkalmas (a) a heterológ szekvencia expresszálasára egy tumorsejtben, ahol a szabályozó szekvencia egy Hl9 szabályozó szekvencia, mely specifikusan expresszáiódik a tumor sejtben; > vagy (b) rák kezelésére.
10. A 9, Igénypont, szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer tumoros alany kezelésére alkalmas vagy a rák húgyhólyag karcinéma, hepatocelluláris karcinóma, hepatoblasztóma, rabdomioszarkóma, petefészek karcinóma, cervikális karcinóma, tüdő karcinóma, emlőrák, feji és nyak! pikkelyes sejt karcinóma, nyelőcső karcinóma, pajzsrólngy karcinóma, asztrooltőma, gangüoblasztóma vagy neuroblasztóma.
11. Eljárás beteroióg szekvencia tumorban történő in vitro expresszálasára, azzal jellemezve, hogy a tumor sejtbe egy, az 1-5., 7. és 8. igénypontok bármelyike szerinti > <, * Φ !*V vektort bevezetjük.
12. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer rak kezelésére szolgái és a citotoxikus géntermék a díftétia toxín, Pseoöomonas toxln, licín, kolera toxln; retínoblasztóms gén vagy a p53 közül van válsztvs.
13. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer rák kezelésére szolgál és a citotoxikus géntermék egy citotoxikus géntermék.
HU0003745A 1997-10-03 1998-10-04 Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity HU228470B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94360897A 1997-10-03 1997-10-03
PCT/IL1998/000486 WO1999018195A2 (en) 1997-10-03 1998-10-04 Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0003745A2 HUP0003745A2 (hu) 2001-02-28
HUP0003745A3 HUP0003745A3 (en) 2002-04-29
HU228470B1 true HU228470B1 (en) 2013-03-28

Family

ID=25479934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0003745A HU228470B1 (en) 1997-10-03 1998-10-04 Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6087164A (hu)
EP (1) EP1019499B1 (hu)
JP (3) JP5153031B2 (hu)
KR (1) KR100524262B1 (hu)
CN (1) CN1229496C (hu)
AT (1) ATE407948T1 (hu)
AU (1) AU755774B2 (hu)
BR (1) BR9812717B1 (hu)
CA (1) CA2308124C (hu)
CZ (2) CZ294941B6 (hu)
DE (1) DE69840001D1 (hu)
HU (1) HU228470B1 (hu)
IL (1) IL135430A0 (hu)
NO (2) NO328470B1 (hu)
PL (1) PL339949A1 (hu)
RU (1) RU2214280C2 (hu)
WO (1) WO1999018195A2 (hu)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040006220A1 (en) * 2002-07-02 2004-01-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor 2 expression
US7041654B2 (en) 1997-10-03 2006-05-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity
DE19956568A1 (de) * 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
CA2365901A1 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
DE19928342A1 (de) * 1999-06-21 2000-12-28 Deutsches Krebsforsch Vektoren zur gentherapeutischen Tumorbehandlung
US7829693B2 (en) * 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
WO2002046449A2 (en) * 2000-12-07 2002-06-13 The Penn State Research Foundation Selection of catalytic nucleic acids targeted to infectious agents
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US20040005567A1 (en) * 2002-07-02 2004-01-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of cyclin-dependent kinase 4 expression
AU2003241985A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-19 Medinet Co., Ltd. Dna inducing cancer cell-specific expression and cancer cell-specific expression vector
US20040180844A1 (en) * 2003-03-10 2004-09-16 Fesik Stephen W. Method of killing cancer cells
US20040220085A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Compositions for nucleic acid delivery
US20040219099A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Method for the treatment of tumors
US7482156B2 (en) * 2003-10-15 2009-01-27 Cell Genesys, Inc. Hepatocellular carcinoma specific promoter and uses thereof
US7063947B2 (en) * 2004-04-08 2006-06-20 Promogen, Inc. System for producing synthetic promoters
US7429482B2 (en) * 2005-01-13 2008-09-30 United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Screening tools for discovery of novel anabolic agents
EP1915448B1 (en) 2005-07-07 2013-09-04 Yissum Research Development Company, of The Hebrew University of Jerusalem Nucleic acid agents for downregulating h19, and methods of using same
DE602006014009D1 (de) 2005-09-22 2010-06-10 Yissum Res Dev Co Nukleinsäure konstrukten, pharmazeutische kompositionen und methoden für die behandlung von krebs
CA2675967A1 (en) * 2007-01-16 2008-07-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusale M Nucleic acid constructs and methods for specific silencing of h19
CA2715080C (en) 2007-09-28 2021-09-28 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
WO2009053982A1 (en) * 2007-10-25 2009-04-30 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Constructs containing multiple expression cassettes for cancer therapy
EP2298866A4 (en) * 2008-07-02 2013-11-20 Otsuka Pharma Co Ltd ARTIFICIAL KIDNEY PRECURSOR AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME
US8492133B2 (en) 2009-01-20 2013-07-23 Ramot At Tel Aviv University, Ltd. MIR-21 promoter driven targeted cancer therapy
EA016223B1 (ru) * 2009-10-07 2012-03-30 Учреждение Российской Академии Наук Институт Молекулярной Генетики Ран Способ и генная конструкция для высокоспецифичного ингибирования нежелательного роста клеток
WO2016178233A1 (en) * 2015-05-05 2016-11-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd Nucleic acid-cationic polymer compositions and methods of making and using the same
BR112020021962A2 (pt) * 2018-04-30 2021-01-26 Amicus Therapeutics, Inc. construtos para terapia gênica e métodos de uso
CN110714075B (zh) * 2018-07-13 2024-05-03 立森印迹诊断技术（无锡）有限公司 一种用于检测肺肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用
CN111206093A (zh) * 2018-11-21 2020-05-29 立森印迹诊断技术（无锡）有限公司 一种用于检测浸润性膀胱癌的标志物及其应用
CN109609505A (zh) * 2019-01-14 2019-04-12 中国科学院成都生物研究所 一种体内筛选的剪切rna的锤头状核酶

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2699191B1 (fr) * 1992-12-16 1995-02-10 Univ Paris Curie Nouveaux vecteurs rétroviraux, lignées cellulaires les contenant, et leur utilisation dans le traitement des tumeurs.
US5631236A (en) * 1993-08-26 1997-05-20 Baylor College Of Medicine Gene therapy for solid tumors, using a DNA sequence encoding HSV-Tk or VZV-Tk
IL108879A (en) * 1994-03-07 2000-08-31 Yissum Res Dev Co Diagnostic assay for malignancies using the H19 gene and kit
FR2723697B1 (fr) * 1994-08-17 1996-09-20 Rhone Poulenc Rorer Sa Methode de traitement de la restenose par la therapie genique
FR2725213B1 (fr) * 1994-10-04 1996-11-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999018195A3 (en) 1999-08-12
AU755774B2 (en) 2002-12-19
EP1019499A2 (en) 2000-07-19
BR9812717A (pt) 2000-08-22
DE69840001D1 (de) 2008-10-23
CA2308124A1 (en) 1999-04-15
WO1999018195A2 (en) 1999-04-15
ATE407948T1 (de) 2008-09-15
JP2001519148A (ja) 2001-10-23
IL135430A0 (en) 2001-05-20
HUP0003745A2 (hu) 2001-02-28
CZ294941B6 (cs) 2005-04-13
CZ20001201A3 (cs) 2000-09-13
BR9812717B1 (pt) 2011-06-28
NO328470B1 (no) 2010-02-22
JP2008136480A (ja) 2008-06-19
JP5153031B2 (ja) 2013-02-27
RU2214280C2 (ru) 2003-10-20
JP2006304801A (ja) 2006-11-09
HUP0003745A3 (en) 2002-04-29
NO20093194L (no) 2000-06-02
CZ294694B6 (cs) 2005-02-16
KR100524262B1 (ko) 2005-10-28
NO20001684L (no) 2000-06-02
NO331723B1 (no) 2012-03-05
AU9457198A (en) 1999-04-27
CN1229496C (zh) 2005-11-30
EP1019499B1 (en) 2008-09-10
US6306833B1 (en) 2001-10-23
CN1280616A (zh) 2001-01-17
US6087164A (en) 2000-07-11
CA2308124C (en) 2008-07-08
KR20010030912A (ko) 2001-04-16
PL339949A1 (en) 2001-01-15
NO20001684D0 (no) 2000-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228470B1 (en) Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity
JP2003265193A (ja) 組換えｐ５３アデノウイルス
EP3371315B1 (en) Phagemid vector
EP3388522B1 (en) Antitumor composition comprising gm-csf gene, flt3l-trail fusion gene, shrna inhibiting tgf- expression, and shrna inhibiting hsp expression
CN112639108A (zh) 治疗非综合征性感觉神经性听力损失的方法
JP6608284B2 (ja) 癌の治療に使用されるｒｎａトランススプライシング分子（ｒｔｍ）
WO2016030501A1 (en) Synthetic alu-retrotransposon vectors for gene therapy
JP2002543792A (ja) ベクターによるトランスポゾン配列の供給及び組込み
JP2005506386A (ja) 腫瘍特異的細胞傷害性を誘導するための方法および組成物
CN113874512A (zh) 诱导毛细胞分化的组合物和方法
WO2022167009A1 (zh) 靶向Aqp1 mRNA的sgRNA及其载体与应用
JP2002537807A (ja) 前立腺特異的膜抗原遺伝子のイントロン３を含む調節構築物
US6677152B2 (en) Reversal of cancer phenotype by inhibiting expression of prostate tumor inducing gene
Frederiksen et al. Gene therapy for lung cancer
WO1999050411A2 (en) Tumour-specific expression control region and the use thereof
KR102471898B1 (ko) 면역관문 억제제를 발현하는 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도
JP2023521383A (ja) Ｋｒａｓの阻害のためのｒｎａ干渉およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する方法および組成物
WO2023060248A1 (en) Compositions and methods for the treatment of p53-mediated cancers
US8502015B1 (en) Method of inducing cancer
CN116568283A (zh) 用于治疗前庭神经鞘瘤相关症状的抗vegf抗体构建体和相关方法
CN117836420A (zh) 重组tert编码病毒基因组和运载体
MXPA00003251A (en) Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity
IL135430A (en) Use of a polynucleotide capable of expressing a cytotoxic gene product in the production of a pharmaceutical composition for treating tumors
Lee hTERT or AFP promoter specific expression of HSV-tk induces apoptosis in tumor cells
WO2003006621A2 (en) Super osteocalcin promoter for the treatment of calcified tumors and tissues