HU228470B1 - Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity - Google Patents
Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity Download PDFInfo
- Publication number
- HU228470B1 HU228470B1 HU0003745A HUP0003745A HU228470B1 HU 228470 B1 HU228470 B1 HU 228470B1 HU 0003745 A HU0003745 A HU 0003745A HU P0003745 A HUP0003745 A HU P0003745A HU 228470 B1 HU228470 B1 HU 228470B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gene
- expression
- promoter
- sequence
- vector
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 10
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 title description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 title description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 141
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 130
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 98
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 65
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 54
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 43
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 34
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 28
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 24
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 22
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 18
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 17
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 14
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 13
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 9
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 7
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 6
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 5
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 101100005789 Caenorhabditis elegans cdk-4 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102220517657 KAT8 regulatory NSL complex subunit 3_T24F_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006359 hepatoblastoma Diseases 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 2
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 101150090188 Cdk8 gene Proteins 0.000 claims 2
- 102000003909 Cyclin E Human genes 0.000 claims 2
- 108090000257 Cyclin E Proteins 0.000 claims 2
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 claims 2
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 claims 2
- 101150112625 SSN3 gene Proteins 0.000 claims 2
- 101100150415 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) srb10 gene Proteins 0.000 claims 2
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 claims 2
- 101150073031 cdk2 gene Proteins 0.000 claims 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229940011399 escin Drugs 0.000 claims 2
- 229930186222 escin Natural products 0.000 claims 2
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 claims 1
- 102000002554 Cyclin A Human genes 0.000 claims 1
- 108010068192 Cyclin A Proteins 0.000 claims 1
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 claims 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 claims 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 claims 1
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 claims 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 claims 1
- 206010029897 Obsessive thoughts Diseases 0.000 claims 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 claims 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 claims 1
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 claims 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims 1
- 101710132082 Pyrimidine/purine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 claims 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 claims 1
- 102000013537 Thymidine Phosphorylase Human genes 0.000 claims 1
- 208000033781 Thyroid carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 claims 1
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 102000007739 porin activity proteins Human genes 0.000 claims 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000013077 thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 22
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 22
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 16
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 14
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 9
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 5
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical class CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 102100029083 Minor histocompatibility antigen H13 Human genes 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 3
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 2
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 208000034176 Neoplasms, Germ Cell and Embryonal Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXIFAEWFOJETOA-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-butyl Chemical group [CH2]CCCO SXIFAEWFOJETOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQRXBXNATIHDQO-UHFFFAOYSA-N 6-chloropyridine-3,4-diamine Chemical compound NC1=CN=C(Cl)C=C1N OQRXBXNATIHDQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150019464 ARAF gene Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100084900 Drosophila melanogaster Rpn11 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 101000987581 Homo sapiens Perforin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000897979 Homo sapiens Putative spermatid-specific linker histone H1-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101000713585 Homo sapiens Tubulin beta-4A chain Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000593935 Mus musculus Melatonin-related receptor Proteins 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 201000009053 Neurodermatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004459 Nitroreductase Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 201000007131 Placental site trophoblastic tumor Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 description 1
- 108700006317 Purine-nucleoside phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 102100021861 Putative spermatid-specific linker histone H1-like protein Human genes 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 208000005678 Rhabdomyoma Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 101100111688 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) BNI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102100036788 Tubulin beta-4A chain Human genes 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000002215 arabinonucleoside Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000003443 bladder cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 1
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 caffeine phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 208000012191 childhood neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 108010079940 cyanogenic beta-glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004651 endocytosis pathway Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000004055 fourth ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000001144 hymen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000000415 mammalian chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 108020001162 nitroreductase Proteins 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 235000020004 porter Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- GPKJTRJOBQGKQK-UHFFFAOYSA-N quinacrine Chemical compound C1=C(OC)C=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=C(C=CC(Cl)=C3)C3=NC2=C1 GPKJTRJOBQGKQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000211 third ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N trimethylxanthine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000029387 trophoblastic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 101150061422 yip5 gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Génterápiás eljárás és vektor tumorspecifikus cxtotoxxcitás í ndckálására
A találmány a 08/943608; sorozatazárná, 1977. október 3-án bejelentett, függő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés: részben folytatólagos bejelentése, mely referenciaként teljes terjedelmében a leírásba épül.
A. találmány a tumorsej/biológia és a rákgyőgyitás szakterületébe tartozik. Pontosabban a találmány haterőlóg gének, különösen eitotoxikus termékeket kódoló gének specifikus expressziéjára vonatkozik tumorsejlekben.
A Ή19 gén az egyike annak a néhány génnek, melyről tudjuk, hogy impríntingen esik át emberekben íüurst et al., Natúré
Genetics 42, 234-237 (1996; s. Az embríogenezis legelején a H19 mindkét kromoszómálís alléiról expresszáiödik iDeGroot et al,,
Trophoblast 8, 285-302 (1994)1. Röviddel ezután az apai allélek &
némává válnak, és csak az anyától örökölt alléi Íródik át.
A H19 nagy mennyiségben expresszáiödik az embriogenezís alatt, és ez volt az első gén, amelyről megállapították, hogy azt és az alfa-fötoprpteínt a májban a transz módon ható ra.f lőkusz együttesen szabályozza (Pachnis eb al., Proc. háti, Acad. Sci. USA 81, 5523-5527 (1984)}. Továbbá a H19-t egymástól függetlenül. több munkacsoport is kiónozta a szöveti differenciálódás alatt expresszáiódő gének izolálására végzett szűrőéijárásokat alkalmazva. Például Davis ős munkatársai (Cell 51, 987-1000 * * * ♦ (1987} | a H19 egér homológját olyan gének szűrésével azonosították, melyek a C3H10TÍ/2 sejtek differenciálódása alatt korán express2álódnak. Pourier és munkatársai (Development 113, 110511X4 (1991)1 megállapították, hogy az egér Hl9 az őssejtek differenciálódása alatt és az implantáció .folyamán expresszálódott. Felfedezték, hogy humán. R19 gén a citotrofoblasztok humán piacentából történő differenciálódásánál is átírődik (Rachmilewitz et al., Molec. Repród. Dev. 32, 196-202 (1992)},
Míg a H1.9 RNS transzkripciója számos különböző embríogén szövetben előfordul a magzati élet egész ideje alatt, a Hl 9 expressziója a születés után gátlődik. Továbbá a HIS transzkripció viszonylag alacsony szintjeiről számoltak be felnőtt egerek izmaiban és májában (Brunkow és Tilghman,· Genes & Dev. 5, 10921101 (1991)}, A H19 születés után a ráksejtekben szintén aktiválódik. Ariéi és munkatársai (Molec, Pathol. 50, 34-44 (1997)]
Hl9 expressziót mutattak ki számos olyan szövetből származó tumorban, melyben a H19 a születés előtt expresszálódott. Továbbá ezek a szerzők H19 RNS-t találtak az idegi szövetekből származó tumorokban, különösen az asztrocitémákban és osngiioneurobiasztómákban, melyekről nem volt ismert, hogy HIS expresszi© társulna hozzájuk. A HIS RNS-t expresszálö tumorok nagy száma miatt ezek a szerzők azt feltételezték, hogy a Hl 9 egy onkofötális RNS, és javasolták, begy a B19~t, mint a humán neoplázía (daganatképzodés) markerét kellene megvizsgálni.
Az ember és az egérféiék Hl 9 génjét is klónozták és szekvenálták már [Brannan et al., Molec. Cell. Bioi, 10, 2S-36 (1990)). Az emberi és egér HÍ9 gének összehasonlításából összesen 771-os nuklectidszekvencia-azonossáo derült ki. Annak, eile3 nére# hogy a két faj nukleotidhomológiája ilyen mértékben megőrződött , csak nagyon kicsi kikövetkeztetett aminosav-szekvencia azonosságot tudtak megjósolni a két gén nyitott leolvasási kereteiből (fentebb) . Továbbá/ bár a HIS RK-S-t az RNS polimerét II átírja, majd splicing-on esik át és poiiadenileződik, ügy tűnik, hogy nem trans-ziálódik. Ehelyett úgy találták# hogy a Hl9 RNS a 28S cito-p.lazmat.ikus RNS-hez kapcsolódik# mely ahhoz, a feltételezéshez vezetett# hogy a Hl9 RNS talán egy rifeonukleoprotein RNS komponenseként működik (fentebb) .
A Hl9 valódi fiziológiai szerepét még nem értjük egészen. A H19 domináns letáiis génként működhet? egy HIS transzgén nagymértékű rendellenes expressziója. letalitást okoz egerekben röviddel a születés előtt (Srunkow et al.# fentebb]. Ez a letáiis időszak egybevág azzal az időszakkal# amikor a HI9 transzkripció represszálttá válik. Másrészről sem a heterozigóta, sem- a homozigóta H19 knockout alléleket hordozó egerekben nem. figyeltek meg defektust' (Leighton st a.I., Natúré 37 S, 34-39 (1995) ]. Az anyai ágon öröklődő alléi knockoutja befolyásol ja a genetikailag kapcsolt és ellentétes imprlntingen áteső 1GF-2 gén imprintíngjét; a kapott egerek születéskor nagyobbak, mint az alomtársak az IGF-2 megnővekadétt születés előtti expressziőjának köszönhetően (fentebb). Hívei ez a két ellentétes impri.ntxngen áteső gén cisz működésű szabályozó szekvenciákat képez# Leighton és munkatársai feltételezték# hogy a H19 talán az 1GF-2 gén imprintíngjében. vesz részt.
Egy másik javasolt H19 géntermék funkció a tumor szuppresszor
RNS funkció. Hao és munkatársai (Natúré 365, 7 6-4-7 67 (1993) } beszámoltak arról, hogy két embrionális tumor sejtvonalat, az RD-t és G401~t egy H19 expressziös· szerkezettel transzfektálva a sejtnövekedés lassulását, morfológiai változásokat és csökkent tumorigenitást értek el csupasz egerekben. Megfigyelték, hogy az ilyen tumor szuppresszor aktivitás Összhangban áll azzal, hogy a rendellenes expresszié letalltást okoz az egerekben (Ha© et ai., fentebb], valamint azzal, hogy azoknak az egereknek, melyeknél kiütötték az anyai HIS alléit, megnövekedett a méretük (Leighton et al., fentebb], Azonban az a feltételezés, hogy a H19 egy tumor szuppresszor, vitázott. Az eredmények közül állítólag néhány nem volt reprodukálható, és más, a HIS-oei szoros kapcsoltságban lévé tumor szuppresszor gén jelöltek is léteznek (Ariéi et al., fentebbi . A H19 javasolt tumor szuppresszor szerepe szemben áll azokkal a kísérleti adatokkal, melyek szerint a H19 a tumorsejtek széles körében aktiválódik (lásd például LustigYariv et al,, Oncogene 23, 1S9-177 (1997)].
Az inzulinszerű növekedési faktor (IGF) gének
Az IGF-2 egy másik olyan impríntingen áteső gén, melynek az expressziéja attól függ, hogy melyik szülőtől származik. Azonban szemben a ülS-cei, az IGr-z-nél mind állatokban, mind emberekben az impri.nt.ing anyai ágon megy végbe, és ezért az az apai ágon örökölt alléinkról expresszálödik [Rainer et ai., Natúré 363, 747-749 (1933)1 . A humán ÍGk-2 gén kompi ex transzkripciós mintázatot mutat. Négy IGF-2 promóter létezik, mely szövet- és fejlődésspecifikus módon aktiválódik. A promóterek közül csak három, a P2, 93 és P4 esik át impríntingen, és aktív a magzati fejlődés alatt é rákos szövetekben. A negyedik, a Pl, nem át tmprintingsn, és csak a felnőtt májban és a plexus chorioideusban ía harmadik és a negyedik agykamra
ta isi.h3 tő érfonat} aktiválódik [lásd Holthui2«n et al., Hol. Repród. Dev. 35, 391-393 <19-93)} . Az IGF-2 gén P3 promótere részt vesz a máj c.irrózis és a hepatocelluláris ka-rcinóma kialakulásában [Kin és Park., J. Koreán Med. Sci. 13# 171-173 -(1998) ].
A Wilm tumor az IGF-2 imprintíngjének elvesztését is magában foglalja (Ogawa et al·., Natúré 353# 749-751 {1993)1. Ez a megfigyelés számos kutatót arra a feltételezésre jutatta# hogy az imprinting elveszítése és az imp-r int ingen átesett gének ké-talléles expressziója lehet # hogy részt vesz a növekedési rendellenességekben és a .rák kialakulásában [lásd még Rainer et al.# Katur-e 352., 747-749 (1933)., és -Glassman et al., C-ancer
Génét. Cytogenet. 39, 59-73 (1396)1.
Tumorhoz társult gének szabályozó szekvenciáit alkalmazták egy szüleid gén expressziójának szelektív megcélzására tumor eredetű sejtekben# Például alfa-fötoprotein expresszió indukálódik a hepatocelluláris karcinómáfean. Hube.r és munkatársai (Pro-c# Kati- Acad. Sci USA 38# 839-843· {1991} ] albumin génből vagy alfa-f Ót ©protein génből származó kontro-llszekvenclát alkalmaztak, hogy a Variceiia zoster timidin kinázt (V3V TK) kódoló szekvenciák expressziéj.át hepa.tóma sejtekbe irányítsák. Az egyik ilyen expresszibe szerkezetet tartalmazó retrovirális vektorral fertőzött hepatorna sejtek VZV TK-t expresszált-ak# és érzékennyé váltak a normális esetben nem-toxikus S-metoxipurin-arabinonuk.leozid.ra (arait). Kaneko és; munkatársai [Cancer Rés. 55, 52835287 (1995)1 egy olyan ad-enovirálls vektort szerkesztettek, mely expresszált az aifa-íőtoprotein kontroll szekvenciák
Ezt a vektort tartalmazó re kombi n.áns adenc vírus **« * » részecskéket közvetlenül injektálták a pimasz nélküli csupasz egerekben létrehozott hepatoc-eiluláris karcinóma-eredetű tumorokba. Az ezt követő ganciclovir injekciók a hepatocelluláris karcinóma eredetű, tumorok regresszióját okozták.
Osaki és munkatársai {Canoer Rés. 54, 5258--5261 {1954} j az AS4 9 tüdő karcinóma sejtekbe egy olyan expressziós szerkezetet transzfektáltak, mely a tüdő kareinoembrionális antigén génjének, szabályozó szekvenciáit tartalmazta a Herpes. simplex virus timidin kináz (HSV TK) kódoló szekvenciájához kapcsolva. A transzfektált sejtek érzékenyek voltak a ganciclovirra. Továbbá a csupasz egerekben a szubkután transzfektált sejtekből történő tumornöve.kedés gátlódott a ganciclovir ismételt intraperltoneálie injekcióival. .Azonban a kareinoembrionális gént a közelmúltban úgy Írták le, hogy az a normális vastagbél nyálkahártyán is expresszálódik, emiatt korlátozódott ezeknek a kontroli szekvenciáknak tumorspécifikus szabályozó régiókként való használhatósága (Qsaka et al., fentebb}. Így továbbra is szükség van olyan génterápiás vektorok kifejlesztésére, melyek specifikusan a tumor-sejtekben expresszál jak a gén terméke két.
A találmány tumorsejtekben heteroióg gének szelektív expresszlójának indukáiására szolgáló eljárásokra és készítményekre vonatkozik. Pontosabban a találmány olyan poiinukleotidokra vonatkozik, melyek olyan heteroióg génekhez működőképesen kapcsolt szabályozó transzkripciós szekvenciákat tartalmaznak, melyek a heteroióg gének tumorspeciíikus expressziéját eredményezik. Részletesebben a szabályozó transzkripciós szekvencia egy olyan, genomiáiis imprintingen átesett * -* « * *♦ * ♦* „.♦· sejtekben génből származik, mely specifikusan rákos expresszálódik, mint például a H19, és az XGF-2 P3 és P4 p-romóterek, és a heterológ gén egy citotoxikus fehérjét vagy citcsztatikus géntérmékét kódol, Λ találmány egy másik megvalósulási módjában az IGF-l promótert működőképesen kapcsoljuk össze egy heterológ génnel, hogy ez a gén tumorspecifikus expresszióját eredményezze. A szabályozó szekvenciák a génexpressziőt számos különböző rákos sejttípusba fogják irányítani. Az ilyen eljárások és készítmények a rákok és a hiperproliferatlv állapotok széles körének kezelésében felhasználhatóak.
A találmány egyik tárgyát olyan expressziős vektorok képezik, melyek ilyen szabályozó régiókat tartalmazó polinukleotídokat tartalmaznak működőképesen összekapcsolva a heterológ génekkel. Különösen előnyösek azok a szabályozó szekvenciák, melyek HIS· szabályozó régiókat, úgymint promóter és enhanszer szekvenciákat, ez IGF-2 F3~t vagy ?4 promótert vagy egy IGE-I promótert kódolnak. Ebben az összefüggésben a H19 enhanszer és aktív részei bármilyen 'kombinációban alkalmazhatóak a H19 promóterrel, promóterrel vagy az
pror | Péterrel, IGE- |
tőrrel | A ta iá Imám |
Ima zó | gazdasejteket |
«ί α
s. Ebben a vonatkozásban a heterológ gént tartalmazó- expressziős szerkezet, melyet promóter szabályoz a H19 enhanszerrel vagy anélkül, egy sejtbe együtt vihető be egy második szerkezettel, mely egy olyan heterológ gént tartalmaz, amit az IGF-1 promóter vagy IGE-2 P3 promóter vagy FM promóter szabályoz a H19 enhanszerrel együtt. Egy másik megvalósítási módban <
fr χ ♦ eljárásait biztosítja heterológ gének -express zálására tumoráéjbekben. A találmány egy további tárgya rá'k. kezelése a találmány -szerinti vektorokat alkalmazva a génterápiában.
1A-1C, ábra; A humán HU promóter régió nukleotidszekvenciája.. A -837. helyzettől, a -?< helyzetig terjedő promóter régiót (a transzkripció- sarthalyéhez viszonyítva) mutatjuk be (1. azonosítószámú szekvencia!.
2. ábra: Egy heterológ génnek H19 .szabályozó szekvenciák szabályozásával történő expresszálására. alkalmazott vektorok v«Ut o s d i a g r amm j- a.
3A-3E. ábra: A Hl 9 szabályozó szekvenciák egy heterológ gén (CAT) expresszióját irányítják húgyhólyag rákos s-ejt vonalakban. öt különböző jelzett, sejtvonalnál ábrázoljuk a GAT specifikus aktivitást {cpm/7g fehérje) a tr-anszfekcíóhoz használt vektor funkciójaként, 3A, ábra: HT-137Ó sejtek.. 3-B. ábra: EJ28. sejtek.. 3'C. ábra: T24P sejtek. 3D, ábra: 1137 sejtek. 3E ábra: UM-üC-3 sejtek. A következő vektorokat részletesebben az 1. példában lentebb ismertetjük: (1) pCAT-foasic; 12} pCAT-control; í3g
H) | pKlóEHlSD; és íS) | pH13EHl9R. | |
4E. | ábra: Az IGF-2 P | 3 és P4 promőterek egy hét | eroióg gén |
tát) | expresszió-ját i | rányitják húgyhólyag rákos | se-jtvona- |
bemutatott öt | k ü 1Ö n b-ö z ö j e 1 z e 11 sejt v | onalnál a | |
specifikus aktív. | ,tést. {cpm/7g fehérje) áh? | <3 Z Q i ’1 U X ci |
transz-fektéit szerkezetekben alkalmazott, a lu-ciferáz expressz ió jának irányítására, szolgáló IGF-2 p romó tér funkciójaként. 4A. ábra: T24P sejtek. 4B. ábra: 137$ sejtek. 4C. ábra: UM-UC3 sejtek,.. 4D< ábra: 1197 sejtek. 4S. ábra: EJ.28 sejtek.. A vektorokat részletesebben a 4. példában, lentebb ismertetjük.
5. ábra: Egy | s humán Hl 9 | promóter | **** ♦ ** * *** fragmentum |
nukleotidszekvenciája (2. | azon os i tós zárná | szekvencia), | |
6. ábra: A 0, 9 | kb-os Hl9 | enhanszer | fragmentum |
nukl-eotidszekvenciája {3. | azonosítős zárná | szekvencia). | |
7A. és 7b< ábra: | A 2 kb-o-s Hl 9 enhanszer | fragmentum | |
nukleotidszekvenciája (4. | a zenes ítószárná | szekvencia). | |
SA-8C, ábra; A | 4 kb-os Hl9 | enhanszer | fragmentum |
nukleotidszekvenciája (5. | azonos! tőszámú | szekvencia). |
9A-9C. ábra: A tumor sejtekben különböző- «19 szabályozó- régió és ?4 promóter kombinációkat tartalmazó vektorokkal történő transzfekció irányítja a lu-ciferáz expressziót. 9A. ábra: 5637 sejtek, 9B. ábra: Huh? -sejtek.,· SC. ábra: 293T sejtek.
ÍÖA-IÓE. ábra: HIS szabályozó szekvenciákat tartalmazó vektorokkal végzett trans-zfekci-ó Irányítja a luciferáz expressziét atumor sejtekben. 10&. ábra: 2S3T sejtek. 108. ábra: 724? sejtek. 10C. ábra: Huh? sejtek, 10D. ábra: 563? sejtek. 1ÖE. ábra: R7112 sejtek.
A találmány részben azon a felismerésen alapul, bogy az olyan genomiális inpríntíngen átesett génekből s tárma zó szabályozó régiók, melyek a rákos sejtekben expresszálódnak, a kívánt kódoló szekvenciák expressziójának irányítására alkalmazhatóak a rákos sejtekben, Fontosabban, úgy találtuk, hogy a HIS expresszié- a kar-cinőmák széles körében aktiválódik., ezek köze tartozik de. nem kizárólagosan a húgyhólyag karcinóma, h-epatocel.iuláris karcinéma, hep-atobiasztőma,· rabdomíosza.rkóma, petefészek karcinóma, cervikáiis karcinóma, tüdő karcinóma, emlőrák, pikkelyes sejt karcinóma a fejben és nyakban, nyelőcső karcinóma, pajzsmirigy karcinóma, as2trocitóma, gangliobl-asztóma és neuroblasztőma. To10 χ**Φ **** **ϊ vábbá felfedeztük, hogy azok a szerkezetek, melyek egy heterolőg génhez működőképesen kapcsolt H19 promótér régiókat vagy egy heterológ génhas működőképesen kapcsolt IGF-2 P3 vagy P4 promőtert tartalmaznak, vagy az Ilyen promótert egy downstream HIS enhanszerrel együtt tartalmazó szerkezetek specifikusan aktivá lódnak a tumor sejtekben,. A találmány egy másik megvalósítási módjában egy IGF-1 promőtert használunk egy heterolőg gén axpressziójának 1rányitására.
Következésképpen a találmány egyik tárgyát eljárások és készítmények képezik a rákos sejtek fenotípusának megváltoztatására vagy szelektív elpusztítására. A találmánynak ezt a tárgyát úgy valósítjuk meg, hogy a sejtekbe egy olyan polinakleotidot juttatunk be, mely olyan, .heterolőg génhez működőképesen kapcsolt, genomiális inprint.ingen átesett génekből származó szabályozó régiókat tartalmaz, melyek rákos sejtekben expresszáiódnak, A heterolőg gén például agy cítosztatikus vágy egy citotoxikus szert {például egy toxint, egy antiszensz RN'S-t vagy egy ribozimot) kódolhat.
Rákos sejtekben expresszálődó- genomiális imprintingen áteső génekből származó szabályozó régiók közé tartozik de nem kizárólag, a H19 promóter és enbanszer, és ez 1GE-2 R3 és Fá promőter.
Az itt leírt találmány értelmében a működőképesen kapcsolt' kifejezés azt jelenti, hogy egy nukleotidszekvencía egy szabályozó szekvenciához olyan módon kapcsolódik, hogy lehetővé válik, hogy a nukleotid-szekvencia expresszióját a szabályozó szekvencia irányítsa.
Egy heterolőg'' génszekvencia, a bejelentés érteimében, egy olyan gén-szekvenciára vonatkozik, mely normális esetben nem kapII χ’·» /‘, *'»« χ**»
Ο 8 . Ο 8 < ·’ * - _ * * >
* <.·· csalódik működőképesen a K19 gén .szabályozó szekvenciáihoz. Általánosságban a heterolog gén-szekvenciák olyan szekvenciákat foglalnak magukban» melyek citosztatikus és ci toboz ikus génter:mé ke ke t kő do In a k,
Ahogy itt használjuk, az *expresszié kifejezés a kérdéses DhS transzkripciójára, .splicíng-jára» érésére» stabilizálódására, és adott esetben az mRNS transzkriptum transzlációjára vonatkozik. A bejuttatott DNS molekula szerkezetétől függően az expresszié átmeneti vagy folyamatos lehet,
A H19 gén szabályozó szekvenciái, az XGF-2 P3 és F4 promófer és az XSF-X promóter
A bejelentésben olyan H13 szabályozó szekvenciákat írunk le, melyek egy he fce.ro lóg kódoló szekvencia tumor-sejt specifikus expressziójának irányítására alkalmazhatóak. Ezek a H19 szabályozó szekvenciák az upstream H19 promóter régiót és/vagy a downstream KIS enhanszer régiót foglalják magukban. Egy H19 promó-fcer régió nukleotidszekvenciáját. az 1A-1C. ábrán matatjuk be (1. azonosítószámú szekvencia). Ez a 830 nukleotidos szekvencia a ~837~es nukleofcidtől a nukleotidig terjed a táp helytől számítva (ahogy Brsnnan és munkatársai leírták, fentebb) . Egy konszenzus TATA szekvencia található a -27. nukleotidtöi. a -35, nukieotidig. Két konszenzus AF2 kötő hely (8/9-es illeszkedés) található- hozzávetőleg a -5ÖŰ. és -40. nuk.leotid.ná.1 a transzkripció kezdetétől felfelé. Amikor a szabályozó régiót egy heterolog gén kódoló régiójától felfelé elhelyezzük, ahogy lentebb részletesen ismertetjük, hozzávetőleg a. szabályozó régió 83ö bázispárja szükséges ahhoz, hogy a működőképesen kapcsolt heterolog gén expresszióját irányítsa azokban a rákos sejtekben, .**'*·* ν*«φ »4&φ ·? ** φ *·'Χ, Φχ* * “ ·’· * melyek endogén HiS-t is expresszáínak, Továbbá, egy másik, a -319. és + 14, nukleotid közötti H19 promóter régió (5. ábra, 2. azoncsifcőszámú szekvencia) szintén alkalmas egy működőképesen kapcsolt heterológ gén expresszlójának irányítására rákos sejtekben..
A humán HIS gén downstream. enhanszer régiója adott esetben hozzáadható egy HIS promóter/heteroló-g gén szerkezethez azért, hogy biztosítsuk a tumorsajt~speoífikus expresszió megnövelt szintjét, Ahogy részletesebben bemutatjuk a 6< példán keresztül, a do:wnstream enhanszer régiót egy Sacl restrikciós fragmentum foglalja magában, mely a transzkripció start helyéhez viszonyítva a + S kb-tói a + 11 kb-ig terjed. Ahogy az egy enhanszer -szekvenciától elvárható, a downstream enhanszer képes kifejteni a hatását, amikor vagy visszafele, vagy -egyenes irányban (a Hl9 gén irányához viszonyítva az endogén H13 génben) egy HIS promóter szabályozása alatt álló heterológ gén kódoló régiójától lefelé elhelyezzük. Továbbá ennek, az enhanszernek a -6., 7&,, 78, és 3A-3C. ábrákon bemutatott szekvenciákat tartalmazó fragmentumait arra használhatjuk fai, hogy elősegítsük a génaxpressziot<
Az 1GF-1 gén .expressziója a tüdőrákhoz és a mellrákhoz kapcsolódik. Az XGF-l promóter az 1-1630, nukleotidok közötti nukieotídszekvencía a humán XGF-1 gén-szekvenciában (Genhank nyilvántartási számi M12659 1477496, mely referenciaként a le*5 sba épül; [Rotwein et al., J. Bioi, Chem. 261,- 4628-4831 géntermék a négy különböző promóter régió egyikét .keimazva expresszáiődik. £ n-égv oromőte.
na rom impriutingen esik át, és emhriooén szövetekben expresszáiődik; a
Pl promótar viszont csak felnőtt szövetekben aktiválódik (Sussenbach et al<? Growth Reg. 2?
hepatokarcinőmában fordul elő. Az<
-9 {1992)). A P3 promőter i s £ e 1.1 s me r t ü k imprintingen áteső ?4 promőter {az 2SF-2 gén -546. nukleotidszekvencíéia) és P3 promóter {az XGF-2 -1229.
nogy a;
- -d02,
- +140.
nukieotidszekvenclája) humán húgyhólyag ráksejtekben aktiválódik, és arra alkalmazható, hogy egy működőképesen kapcsolt heterológ gén expresszié ját a tumorsejtekbe irányítsa.. Az IGF-2' P3 és 94 promótereket a H19 enhanszerrel vagy aktív fragmentumaival együtt alkalmazhatjuk.
Ezeket a szabályozó szekvenciákat, melyek olyan genomiális impringen átesett ás nem átesett génekből származnak, melyek ráksejtekben expresszálódnek, még részletesebben ismertetjük, hogy meghatározzuk azokat a minimális szabályozó szekvenciákat, melyek ahhoz szükségesek, hogy a kívánt tumorspecifikus expressziót elérjük. Például a promóter régió addíciókkai, szubsztitúciókkal és deléciókkal megváltoztatható, és mérhető a tumorspecifikus expressziét funkció megmaradására. A ül 9 downstream enhanszer különböző részletei egyenként teszteihető-k arra a képességükre, hogy fokozzák-e a HIS p rom-ót érről induló transzkripciót.
A szabályozó szekvenciák megváltoztatása egy sor különböző kémiai és enzimatikus eljárással valósítható mag, ezek a szakterületen. jártasak .számára jól ismertek. Például a s-zek.venciák restrikciós helyek által meghatározott régiói deletáihatok. Oligonukleotid által irányított mutagenezist alkalmazhatunk aszekvencia egy meghatározott módon történő magváltoztatására és/vagy azért, hogy restrikciós- helyeket vigyünk he a szekvenci14
án belüli specifikus· régiókba. Továbbá deléc.iós mutánsok hozhatók létre DHS nukleázokat, mint például Sal3i-t vagy ExoIII-t és SÍ nukieázt alkalmazva. A szabályozó szekvenciákban fokozatosan nagyobb deléciők hozhatók létre a DKS-t növekvő időtartamig inkubálva a nukieázokkal (a mutagenezis módszerek áttekintésére lásd Aus.ubel et al., Current F-rotocols fór Molecular Biology, (1989)1,
A megváltoztatott .szekvenciákat arra a képességükre vizsgáljuk meg, hegy képesek-e irányítani a heterolőg kódoló szekvenciák tumorspecifikus expresszlóg át a megfelelő gazdasej tökben, különösen a Hl9-t expresszáló karcinőma eredetű sejtekben (például a húgyhólyag karcinőma sejtekben). A találmány körébe tartozik bármely olyan megváltoztatott szabályozó szekvencia rekombináns· expressziós vektorba építése további használatra,· mely megőrizte azt a képességét, hogy tumorspecifikus expressziét irányítson. Egy sor különböző heterolőg gén expresszálható ezeknek a szabályozó szekvenciáknak a szabályozása alatt, mint például toxikusgéntermékeket, potenciális toxikus géntermékeket és anfciprolife-ráciős vagy citosztatikus géntermékeket kódoló gének, Markergének is expresssálhatők, ide tartoznak az enzimek (például CAT, béts-gu.luktozídáz, luolferáz), fluoreszcens fehérjék, mint például a zöld fluoreszcens fehérje vagy antigén markerek.,
A cítotoxíkus géntermékeket tágan határozzuk meg, ide értjük a tornácokat és apoptózíst indukáló szereket is. Továbbá a találmány értelmében a eitotoxikus géntermékek magukban foglalják a gyógyszer metabolizálö enzimeket, melyek egy gyógyszereiővegyüietet eitotoxikus termékké alakítanak át, A találmány szerinti eljárásokban használható eitotoxikus géntermékek köze .1 3·' tartozik például a diftéria toxin, Pseu-d-omonas toxin, ricin, kolera toxin, PS40 és tumor szuppresszor gének, mint például a retinoblasztóma gén és a p53. Továbbá a sejt .apoptózisban részt-
kódoló | szekvenciák | ‘tót. | is |
jtidek | közé tartozi | .k | az |
t a 1,, | hat. Senet, | b | |
) pspti: | 1 (lásd Wu | et | al |
7} ], a | kalcitonin c | jón | nel |
peptid (Sakuta et al,, J. Heuroimmunoi, 6 /, 103-109 (1996)} 1amint más Ismert vagy felfedezett apoptotikns peptidek..
Gyógyszer | •-elővegyület cítotoxikus- | termékké | alakításé | t végző |
gyógysz ermeta | bolizálo enzimek közé t | ertozi k | a tímidir | i kinéz |
(Kerpes simp | lex vagy Varicelía. zoste | r víruso | kbdl), a | citosih |
dezamináz. | nitroreduktáz, c i t o k r óm | p~4 50 | timidin |
foszforíláz, purín-nukieozid foszforiláz, alkalikus foszfatáz, Λ és G2 karboxlpeptidáz, iinamaráz, β-laktamáz és xantin oxidáz ('háttér-információként lásd Riggs és Slkora, Mól. Med. Today 359-366 (1997 . augusztus)}
Továbbá antiszensz, antigén, vagy aptamer olígonukleotidok juttathatók a rákos sejtekbe az itt leírt expressziós szerkezeteket alkalmazva.. Eibozímok vagy az egyszálö RNS-ek is expresszálható-k rákos sejtekben, hogy gátoljuk egy bizonyos kívánt gén expresszióját. Ezeknek az antiszensz. vagy rifoozim molekuláknak a céigénjeínek olyannak kell lenniük, melyek olyan géntermékeket kódolnak, amik elengedhetetlenek a sejt fennmaradásához vagy a rákos sejt fenotipus fennmaradásához. Ilyen célgének közé tartozik, de nem kizárólagosan a cdkz, cdkö, cdk21, cdclöé, ciki in Dl, cí klóin E, ciki in n és cdk4.
Például olyan vektorokat viszünk be a sejtekbe asért, hogy az endogén gének expresszióját korlátozzuk, melyek rákos sejtekben expresszálődo, imprintíngen átesett génekből vagy IGF-1 promótérből származó szabályozó szekvenciák szabályozása alatt p53, c~.fos# c~jun# Kr-ras és/vagy Her2/n.eu onkogén formáira specifikus antiszensz RNS-eket vagy ribosímokat expresszálnak, Azok a tumorsejtek# melyek HIS-t exprasszálnak, és képesek aktiválni a. H19 szabályozó szekvenciákat (vagy melyek, specifikusan aktiválják az IGF-1-t# IGF-2 P3 vagy P4 promótert.) specifikus célponttá válhatnak az antiszensz RNS vagy ribozim RNS exp.re.5szlőjához .
Az antiszensz megközelítési mód olyan oligcnuklectídok (ebben az esetben mRNSí megtervezését foglalja magában, mely komplementer a cél mRNS-sel. Az antiszensz oligonukleotidők a komplementer cél mRNS trsnszkriptumokboz fognak kötődni# és .meggátolják a transzlációt. Teljes komplementaritás# bár előnyös, de nem szükséges, A szekvencia komplementaritás*' egy RNS egy részével, ahogy itt használjuk, egy olyan szekvenciát jelent, mely megfelelő komplementaritással rendelkezik ahhoz, hogy az RNS-sei hibrid! tál jón egy stabil duplexet képezve, A hibrid!zálásra való képesség a komplementaritás fokától és az antiszensz nukieinsav hosszától is függ. Általánosságban a hosszabb hibridizálö nukieinsav több hibás bázispárosodást tartalmazhat egy RNS-sel ahhoz, hogy még stabil duplexet képezzen (vagy tripiexet, ha. ez lehetséges) - Egy szakterületen jártas szokásos eljárásokkal meg tudja becsülni a hibás bázispárosodás tolerálható mértékét, hogy meghatározza a hiforidizált komplex olvadáspontját.
Azok az oligonukleotidck, melyek komplementerek a cél transzkriptum 5' végével, például az S* se® transzlálódó szekvenciával az AUG iniciációs kodon!g ~ .azt is magában foglalva -, sokkal hatásosabban fognak működni a transzláció gátlásakor. Mindemellett az mRN-S-ek 3' nem transzlálódó szekvenciáival komplementer szekvenciákról a közelmúltban mutatták ki, hogy hatásosan gátolják az m'RMS-ek transzlációját. Lásd általánosságban Wagner R. cikkét, Natúré 372, 333-335 (1994) . A cél géntranszkríptumok Sf vagy 3 nem transzlálódó nem kódoló régióival komplementet oligonukleotidők alkalmazhatóak egy antiszensz módszerben az endogén gének transzlációjának gátlására. Az mRN.S 5' nem transzlálódó régiójával komplementer oligonukieotidőknek magukban kell foglalniuk az AüG start kodon komplementerét. Az mRNS kódoló régiókkal komplementet antiszensz oiigonukieotidok a transzláció kevésbé hatásos inhibitorai, de ezek is alkalmazhatóak a találmány szerint. Az antiszensz nukleinsavakna-k, melyeket úgy tervezzük meg, hogy akár a óéi mRNS 5f, 3' régiójához vagy akár a kódoló régiójához hibriditáljának, legalább hat nukleotid. hosszúságúnak keli lenniük, és előnyösen 6-től körülbelül 51 nukleotldig terjedd hosszúságúak, A specifikus megvalósítási módokban az oligonukleotid legalább 10 nukleotid, legalább 17 nukleotid, legalább 25 nukieotiö vagy legalább 50 nukleotid hosszú.
Tekintet nélkül a választott célszekvenciára, előnyös, ha előszót in vitro vizsgalatokat hajtunk végre az antiszensz oiigonukieotidok génexpresszió gátló képessége mértékének meghatározására. Ezekben a vizsgálatokban olyan kontrollokat kell alkalmaznunk, melyeknél különbséget tudunk tenni az antiszensz géngátlás és az oiigonukieotidok nem specifikus biológiai haté* A «kos sejt nőve.·. r ans z fc r í © fc umá- r a sai között. Szintén előnyös, ha ezekben a vizsgálatokban összehasonlítjuk a cél RNS vagy fehérje mennyiségét egy belső kontroli RNS vagy fehérje mennyiségével,
Létfontosságú célgén katalitikus hasítására tervezett ri.boz.im molekulákat használhatunk a cél mRHS transzlációjának meggátlására. (Lásd például a WO Sö/11364 számú, 19SÖ. október 4-én publikált nemzetközi közzétételi iratot; Sárvár et al.·, Science 27 4, 1222-12.25 (1990)), Amikor a rib-osimofc egy kedésében lét fontosságú· fehérjét kódoló gén specifikusak, az ilyen ribo-z imo-k egy rákos sejt fene-típus visszafordulását okozhatják, (kivel a ribozimok, melyek az mRNS-t helyspecifikus felismerési szekvenciáknál hasítják, a cél mRNSek szétroncsoiására alkalmazhatóak, a kalapácsfej (hammerhead) ribozimokat részesítjük előnyben, A kalapácsfej ribozimok az mRNS-eket a szegélyező régiók által megjelölt helyeken hasítják, melyek komplementer fcázispárofcat képeznek a cél mRNS-sel. Az egyetlen kivánalom, hogy a cél mRNS rendelkezzen a következő kétbázisos szekvenciával: 5~UG~3', A kalapácsfej ribozimok megszerkesztése és termelése a szakterületen jói ismert, és részletesen leírta Haseloff és- Gerlach, Natúré 334, 585-591 (1988) .
Előnyösen a ribozimot úgy szerkeszt jük meg, hogy a hasítási felismerő· hely a cél mRNS: 5' végéhez közel helyezkedjen el; azért hogy megnöveljük a hatásosságot, és legkisebbre csökkentsük a nem-funkcionális mRNS transrkriptumok sejten belüli felhalmozódását ,
A találmány szerinti alkalmazás céljából a ribozimok az RbS endoríbcnukieázokaf is magukban foglalják (ezek után Cechtlpusú ribozimok), mint például egy olyan ribozimot, mely a *♦ * * *χ <
~ : természetben a Tetrahymena thermophiIában fordul elő (IVS-ként vagy L-19 1VS RNS-ként ismert!, és melyet részletesen ismertetettek Thomas Cech és munkatársai (2aug et al., Science, 224, 5?4-5?8 (19841; 2aug és Cech, Science 231, 470-475 (198«); 2aug et al,, Natúr® 324, 429-433 (1986); a University Patents Inc. WO 88/04300 számú nemzetközi közzétételi irata; Besn és Cech, Cell 47, 207-216 (1986), A Cech-típusű ribozimok egy nyolc bázispáros aktív hellyel rendelkeznek, mely egy cél RNS szekvenciával hibrid! zál, majd megtörténik a cél RNS hasítás®, A találmány magában foglalja azoknak a Céch-típusú ribozlmoknak ez alkalmazását, melyek a célgénekben jelenlévő nyolc bázispáros aktív hely szekvenciákat veszik célba.
Az imprintingen átesett gén expresszióját reaktiválő sejtek szintén képesek lesznek az. ilyen, heterológ génhez, működőképesen kapcsolt, imprintingen .átesett gén szabályozó régióit tartalmazó expressziós szerkezetek specifikus aktiválására. Az ilyen, sejtek, különösen tumorsejtek megfelelő célpontjai a találmány szerinti génterápiás módszereknek, A H19 és IGF-2 93 és 94 specifikus expressziő mind a tumorokban mind a saj^vonalakban meghatározható· RNS anali2ises technikák, in situ hibridizáció és riportergénés szerkezetek alkalmazásává.!- Továbbá az aktivált IGF-l gén exprésszióval rendelkező tumorsejtek hasonlóképpen határoz.hatóak meg- és vehetők célba géntrerápiásan egy heterólőg gén közvetlen irányítására IGF-l promótert alkalmazva.
géntranszkriptumhoz spécitikusan hibridizáló, jeleit próbát készítünk a szakterületen tói ismert, módszerek valamely!kével. A
A leotöbb ENS-anslizises alkalmazásnál y' ,-*s <n es ** ** jelölt próba a HI9 nukleotidszekvencia legalább 15-30 komplementer bázisát tartalmazza, és még előnyösebben « H19 nukl-eotidszekvancía legalább 50-150 komplementer bázisát tartalmazza. A HIS expresszié agy különösen előnyös 'hibridizációs próbája a poli-A helytől .felfelé, a poli-A hely felé tartó hozzávetőleg 800 bázispárról származó N19 mRNS 3f végével komplementer oolinukle-otíd.
A találmány egy későbbiekben példával bemutatott specifikus megvalósítási módjában egy jelölt antiszensz RNS próbát hozunk létre in vitro egy ?? vagy T3 expressziós plazmidot alkalmazva, A H19 próbák random láncinditással is jelölhetők jelölt nukleotid jelenlétében, például Prlme-lt készletet CStretagene, La -Jolía, CA; katalógusszám: 3003920 alkalmazva. Alternatív megoldásként jelölt próbák hozhatók létre egy Hl9 kódoló-régió cONS ki-ónt és a kódolóré-gió egy területének amplif ikálására tervezett primereket használó PCR reakcióban, vagy egy standard nicktranszláciős reakcióval.
A poiinukl-eotid próbákhoz alkalmas jelek közé tartoznak ez olyan .n-ukleotidok, melyekbe radioaktív izotópokat építettünk be (úgymint 3?S~t és 'P-td, a fluoreszcens., lumineszcens és szín jelek, és az enzimatikus részek.
A jelölt próbát in situ egy sejt- vagy szövetmintához hi.bridaráljuk standard módszerekkel, mint például ahogy lentebb a működési példa segítségévei leírtuk, és a folyamatban lévő 08/704 706 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertettek, mely referenciaként a leírásba épül. Alternatív lehetőségként, ha elegendő mennyiségű meg-felelő sejtet nyerünk, standard P.NS analízis (mint például Northern analízis, «Μ-ázos védelem vagy primer extenzió) hajtható végre, hogy meghatározzuk a számunkra érdekes gén mRN.S expresszié jának mértékét .
Továbbá a2 is lehetséges, hogy génexpressziós assay-ket hajtsunk végre in situ, azaz közvetlenül a bicpsziákból vagy kimet szésekből származó beteg szövetek sejtmetszetein (rögzített vagy fagyasztott)., azért hogy nuxieinsav tisztítására ne legyen szükség, Nukieinsav reagensek, mint például a fentebb leírtak alkalmazhatóak próbaként és/vagy printerként az ilyen in situ eljárásokban (lásd például Nu-ovo·, G, J, PCR In situ Hybridization: Protocols and Applications., Raven. Press, NY),
Egyik alternatív módszer annak meghatározására, hogy egy sejttípus vagy tumor képes lesz-e specifikusan aktiválni a
Ezeket a módszereket alkalmazva, expresszíóval rendelkező tumor típusokra két említjük mec:
dott szabii | y ο χ ο x cí ej jü ő w |
az ilyen | expressziós |
sjtbe. Ebből | a célból a |
»rmék. Egy | assay-ben a |
:atja, hogy | a sejt vagy |
i a szabályé | XÓ róí^iőxk'”· |
az a k t | í *r X Ί r U 3 <1 .ί. V k. ll.i. > |
példaként a | következő- |
1. 'Wilm tumor ··>
3, Embrionális rabdomicszav kőma
Csiraseit tumorok és trofoblaszt tumoro) * * * J. φ φφ Φ
J. * | TesztXkuláris csírasejt tumorok | |
zs 9Í-. s | A petefészek .korai teretomája | |
n S-* W> | Ezekrekokcigeá1is tumor | |
4 » | Ko r ί o k a r c í nőma | |
5. | Méhlepény hely trofoblasst tumorok | |
C. Epítéiíélls felnőtt tumorok | ||
1. | Hú gyhó1yag kareínőma | |
2, | Hepat ocel1u1éri s kar cí nőma | |
3 v | Petefészek karcinóma | |
4. | Cervikéiis karcinóma | |
5 < | Tüdő karcinóma | |
Emlő karcinóma | ||
*7 | Fej és nyaki pikkelyes sejt karcinóma | |
8, | Kye1őcső karolnőma | |
q * | Faj z smir így karóinóma | |
0. Neux | •©gén tumorok | |
1. | Ásztrocitőma | |
.«\ | G a n g 11 o b 1 a s z t érne | |
Neuroblesttőma | ||
Teh | át a fentebb említett rákos megbetegedések a találmány | |
s zerínt | i eljárásokkal kezelhetők. Tulajdonképpen | bármely tumor, |
mely aí | rtiválje .a Hl 9 expresssiót, a találmány s: | zerinti eljárá- |
SOK Kct .ι. | s β 1. -í, ö % |
sózására alkalmazhatok, melyek aktiválják az 1GF--Í, és 1GF-2 P3 és P4 promőtereket. Esek a tumorok szintén kezelhetőek a találmány szerinti eljárásokkal, Például az IGF-2 aktiválódik a gyermekkori tumorokban, úgymint a Wilm tumorokban, rabtíomioΦΦΦ* * φ ’
szarkómákban, neur obiasz tómákba n és hepatoblas2tómákban.
Szabályozó szekvenciák irányítása alatt álló polinukleotidők gasda.se j tűkbe történő bejuttatásának módszerei
A találmány egy olyan gardasejtre is vonatkozik, melyet egy heterológ génhez működőképesen kapcsolt szabályozó régiókat tartalmazó poiinukleotidokkai transzferáltunk. Az ilyen gazdasejtek tenyészetben tarthatók fenn, vagy egy állat, előnyösen egy emlős részét képezhetik. A kívánt polinukleotidokat jellemzően a vektorok széles körének bármelyikével ínszertálhatjuk, melyeket ezután az itt ismertetett módszerekkel és anyagokkal juttatunk be. Ezeket a vektorokat jói ismert molekuláris biológiai módszereket alkalmazva állíthatjuk elő. (Általánosságban lásd Sambrook.
et al., Molecular Cloning 1-111. kötet, Coid Spring Harcot laboratory Press, Coid Spring Harbor, New York (1989), és Current Protoools in Molecular Hiology, John W.ile.y & Sons, összes kötet, időszakonkénti megújítása,, melyek referenciaként a leírásba épülnek] . Jellemzően,· ahol kívánatos a transzláció, a kérdéses heterológ gének is módosíthatók genetikailag, hogy egy alkalmas 3' poliadeniláció-s szekvenciát tartalmazzanak szükség esetén,
Tenyésztett sejtek
A héterőlóg génhez működőképesen kapcsolt, imprintingen átesett gén szabályozó szekvenciáit tartalmazó poiinukleotidokkai tra.nszf aktáit gazdasejtek bármilyen prokarióta vagy eukaríóta sejtek lehetnek, A po.iinukleofcidnak egy géns zerkezet.be, mint például egy vektorba történő iigálása, és gazdasejtekbe, akár eukaríóta (élesztő, madár,· rovar vagy emlős) , akár prokarióta (baktérium.) sejtekbe történő transzformálása vagy transzfek24 tálása a mikrobiológiai vagy szövettenyésztési 'technológiákban, széleskörűen alkalmazott általános eljárások közé tartoznak.
A találmány szerinti poiinukleotidok bakteriális sejtekben, mint például S. coliban való tenyésztésére alkalmas vektorok közé tartoznak
O-lfeH 2ΓΠΧ 0,0 K /· p BTac- eredetű p1a zmí dók, következő típusú plazmidok: pSR322~ból származó <BL~eredefcű piazmidok, pEX-eredetn plazmidok, és pGOeredetü plazmidok. élesztőben történő replikációhoz a YEP24, YIP5, YEP51, pYES2 és YRP17 plazmidok a felhasználható klónozó- és expressziós hordozók a génszerkeze-tek bevitelére S. cerevisiaeöe (lásd például Broach et al<, Experimental manípalation ot Gene Expression (szerk.: Inouye, Academic Press, 63 (1993)1, Ezek a vektorok, replikálhatók £. coliban a p8P322 orí-nak köszönhetően, és élesztőben is a 2 mikronos cirkuláris plazmád repliká-ciós determinánsának köszönhetően. Továbbá gyógyszer rezisztencia, mint például ampicillin rezisztrencia markerek alkalmazhatóak.
Hasonló .módon a találmány szerinti polinukleotidokhoz szolgáló emlős vektorok prokariota szekvenciákat is tartalmaznak, hogy lehetővé tegyék a vektor szaporodását baktériumban. Az ilyen smlős sejtekbe transzfektáijuk, úgy lehet hogy az emlős kromoszómába integrálódjanak a stabilitás érdekében egy kapcsolt szelektálható markergént alkalmazásva. Alternatív lehetőségként vírusok, úgymint .szarvasmarha papiilőmavírus (BFV-1) vagy Spstaín-Barr vírus származékait alkalmazhatjuk az átmeneti expresszióhoz.. A gazdaszervezetek plazmád transzformálásának végrehajtásában alkalmazott különböző eljárások a szakterületen jól ismertek. Más alv ektorokat, ami ko j megtervezni.
hős.szán tart;
kalmas vektorrendszereket valamint általános rekombináns aljára25 .*% .Ά W'vμ χ. < c .... . ... ,,» sokat lásd Sambrook és munkatársai művében, fentebb.
Génterápia
A találmány magában foglalja egy heter-ol-óg génhez működőképesen kapcsolt géns.zabályozó régiót tartalmazó polinukleotidok alkalmazását a génterápiában rák és hip-erpro.life.rafeív betegségek kezelésére. Génterápiás célokból a találmány szerinti expressziős szerkezeteket valamilyen biológiailag hatékony hordozóban, például valamely olyan készítményben vagy kompozícióban adhatjuk be, mely képes hatékonyan bejuttatni a rekorabináns gént a. sejtekbe in vivő. Ezek közé a módszerek közé tartozik az adott génnek a virusvektotokba történő ínszerfeálás-a, ilyen vektorok közé tartoznak a rekombináns retrovitusok, adenovírus, adenoasszociált vírus, és herpesz szimplex vírus 1,- vagy rekorabinánsb-akfeeriális vagy eukarióta plazmldok. A virális vektorok a sejteket közvetlenül fertőzik; a plazmidokat valamilyen segítséggel., például kationos polimerek, 'kát ionos lipos zómák (például lipofektin, koleszterin származékok, például D.D.A.S. és kafcionos foszfolípidek) vagy származék (például antitesttel konjugált} polilizln konjugátűrnek, gramicidin S, mesterséges virusfeurkok vagy más alkalmas intracelluláris hordozók segítségével juttathatjuk be, valamint a csupasz génszar kezet közvetlen beinjektálása., elektroporácíó vagy CAP-O-4 precipitáciő is végrehajtható- in vívó·. A rák-génterápiára szolgáló géntranszrer és expressziós rendszerek közelmúltban megjelent áttekintése: Cooper, Semínárs ín Öncology 23, 172-187 (1936).
Hive.1 a megfelelő célsejtek tran-szduk-ciója képviseli a gén terápia fontos első lépését, nyilvánvaló, hogy az adott génbeviteli rendszer megválaszfcása olyan tényezőktől füge, minfc a kivé26 ♦♦*φ
-φ φ φ * * φ * * Φ Φ Φ » φ Λ Φ * lasztott célszervezet feno-tipusa és a .beadás módja, mely például a lokális vagy -szisztémás beadás lehet. Továbbá érthető, hogy az expressziós szerkezetek in vivő transzdukálójához biztosított adott -gén-szerkezet felhasználhatóak a sejtek in vitro transzdukciójára is, mint például a fentebb leirt ex vivő szövettenyészet .rendszerekben.
A nukleinsav sejtbe történő in vivő bevitelének előnyös .módja egy nukle-insavat, például egy bizonyos citotoxikus gént a HU szabályozó szekvenciák szabályozása alatt tartalmazó virális vektor alkalmazásából áll. A sejtek virális vektorral történő fertőzésének az az előnye# hogy a megcélzott sejtek nagy része megkaphatja, a nukleínsavat, Továbbá a virusvektoron belüli, például a virusvektorban lévő oDLS által kódolt molekulák hatékonyan expressz-áiódnak azokban a sejtekben, melyek felvették a virális vektor nukieinsavát. Az itt ismertetett módszereket és készítményeket alkalmazva bejuttatható megfelelő vektorok közé taroznak a herpesz szimplex vírus vektorok, adenovirus vektorok, adeno-asszociált vírus- vektorok, retrc-vírus vektorok, pszeudorabiesz vírus, alfa-herpesz vírus vektorok és hasonlóak. Alapos áttekintést találhatunk a vitális vektorokról, különösen a nem. replikáiődó sejtek módosítására alkalmas virális vektorokról és arról, hogy hogyan használjuk ezeket a vektorokat a kérdéses po.linuki-eotí-dok expresszié jóval kapcsolatban, a Viral Vectors; Gene Therapy and Neuroscience Applications című könyvben [szerk. Caplitt és Loewy, Academic Press, San Diego (1355)1.
Kimutatták, hogy korlátozni lehet a vírusok és következésképpen a vírus-alapú vektorok fertőzési spektrumát a vírusrészecske felszínén lévő víruscsomagolő fehérjék módosításával [lásd péiX ** * dául a WG93/25234 ás WÖ94/0692G számú nemzetközi közzétételi iratot). Például a retrovirális vektorok fertőzési spektrumának, megváltoztatási stratégiái közé a következők tartoznak: sejtfelszíni antigénekre specifikus antitestek kapcsolása a virus env fehérjéjéhez (Roux et al., Proc. Nat. Acad. Sci. VSA 8 6, 90799083 (1989); Julan et al., J. Gén, Virol. u3, 3251-3255 (1992); és Goud et al,, Virology 163, 25.1-254 (1983) ]; vagy a sejtfelszíni Íigandumok env fehérjékhez kapcsolása [Neda et al., o. Bioi. Chem 266, 14143-14146 (1991)). A kapcsolás egy fehérjével vagy más változatával történő kémiai keresztkőtés lehet (például a laktóz az env fehérjét aszialoglikoproteinné alakítja), valamint fúziós fehérjék kialakításával (például egyláncú antitest/env fúziós fehérjék) , Például, ráksejtek vehetők célba ezeket a módszereket alkalmazva, például a tumorhoz társult molekulák elleni antitestek vagy ráksejt felszíni fehérjék kapcsolásával a rekombináns vírus felszínéhez, őz a módszer, mivel felhasználható arra, hogy a fertőzést korlátozzuk vagy egyéb módon bizonyos sejttípusokhoz Irányítsuk, arra is alkalmazható, hogy egy ektotrópikus vektort amfotrópikussá tegyünk.
A találmányban felhasználható egyik előnyös vírálís génbevitel! rendszer adenovirus eredetű vektorokat használ. ügy adenovirus genomja úgy manipulálható, hogy egy kérdéses génterméket kódoljon és expresszáljón, de ínaktivált az a képessége, hogy egy normális litikus vitális életciklusban replíkálódjon, Lásd például Berkner et al., BioTechnlques 6, 615 (1338);
Bosenfeid et al., Science 252, 431-434 (1991); és Rosenfeld et al.·, Cell 63, 14 3-155 (1992). Az 5 d!324 típusú AD aden-ovirusből vagy sas acenovi.ru sekböl íné Icául Ad.?., Ad3, Ad? stb.
* « # ♦ »»
‘.'V Ν .
' * V « » « * χ « *♦*« » « « ♦♦ ** származó megfelelő adenoviralis vektorok jói ismertek a szakterületen jártasak számára. A rekombináns adenovírusok előnyösek lehetnek bizonyos körülmények között, mert a sejttípusok széles körében alkalmazhatóak, ezek közé tartozik a légúti epitélium (Rosenfeld et al., 1992, fentebb idézve), endotéliális sejtek [Lemarchand et ai., Proo. Naél. Acad. Sci USA 69, 6482-64 68
(1992) ]:; hepatoclták (He | >rz. és Gerarö, | Froc, Nat |
90, .2812-2816 (1293)] és | izomsejtek ( | Quantin et |
Acad. Sói, USA 89, 2582 | :-258 4 (1992)1 | . Továbbá |
viszonylag stabil, ez a | : tulajdonság | felelős a |
koncentrálásért, és úgy | módosítható, | hogy az be; |
tőzési. spektrumot, Továbbá a bevitt adenovirálís DNS (és a benne lévő idegen DNS? nem integrálódik a gazdasajt genomjába., hanem episzőmáiis formában marad, ezáltal elkerüljük azokat a potenciális problémákat, melyek az inszercionális mutagenezis eredményeként előfordulhatnak azokban az esetekben, ahol a bevitt DNS a gazda genomba integrálódik (például retrovirális ON'S-nél? . Emellett az adenovirálís genom idegen DNS hordozó kapacitása nagy (8 kilobázisig terjed) más génbeviteli vektorokhoz viszonyitva (Berkner et al,, fentebb idézve; Haj-Ahmand. és Graham, J. Virol, 57, 267 (1986?]. A legtöbb jelenleg alkalmazott, és így a találmányban előnyben részesített replikáciöhiányos adenovirálís vektorok beleteltek a virális El és E3 gének egészére vagy részére, de az adenovirális genetikai anyag 80%-a megmarad (lásd például Jones et ai., Ceil 16, 683 (1979); Berkner et al., fentebb; és Graham et al., Methods in Mo.lecu.lar Blology, E< u, Murray (szerk.j (Humana, Ciifton N. u. 1991} 7, 109-127].
Euv másik, a találmány szerinti expressziős szerkezetek euyi29 kének bejuttatására használható virális vektorrendszer az. adenoasszociált vírus (AAV). Az adeno-asszociált vírus egy természetben előforduló defektlv vírus, melynek egy másik vírusra, úgymint egy adenovlrusra vagy egy herpesz vírusra van szüksége a hatékony replikádéhoz és a produktív életciklushoz, {Áttekintésként lásd Muzyozka ei al,., Curr, Topics in Micro, and Immunoi. 158, 97-129; . Ez az egyik olyan vírus azon néhány vírus közül, mely integrálni képes a DÚS-ét a nem osztódó sejtekbe, és nagy gyakoriságú stabil kölcsönhatást mutat (lásd például flotté et al., Am. J. Respír, Cell. Mól. Siói... 7, 349-354 (1992);
Samuiski et ai,, J. Virol 63, 3922-9928 (1989}; és McLaughlin et al., u, Virol, 63, 1963-1973 (1989}}. A kicsi, 390 bp-os AAV-t tartalmazó vektorok pakolhatök és integrálhatók. Az exogén DM3
mérete körülbelül | 4, | V | kb-íg | terjed, A DMS sejtekbe | V í 1 | telére | eg |
AAV vektor alkalm | azh | dl u | 6, mim | t például az, amit Trat | seb: | in és m | run |
katársai leírtak | [Mo | .1 < | Cell. | Bioi, 5, 3251-3260 (19 | 85). | ) . Sgy | se |
Coll, Bioi
Endoc.r inol..
.934 >
különböző nukleinsavat vittek be különböző sejttípusokba AAV vektorokat alkalmazva (lásd például Hormonét et el;, Proo,
Natl. Acad. Sd USA 81, 6466-6470 (1984); Tratschin et al., Mól,
207.2-2081 (198.5); Wondisford et al., Mól, .32-39 (1988?; Tratschin et al,, és Flotté et al, , J, Bioi. Chem _ (1 m 3Ί
A virális transzfer módszerek mellett, mint például amiket fentebb mutattunk be, nem virális módszerek is alkalmazhatóak, hogy egy kívánt heterolőg gén expressziéját egy állati szövetben targetáljuk, A nem virális génbevitel legtöbb módszere az emlős sejteknek a makromolekulák. felvételére és
o. viroi. 2?·,
268, 3781-3790 ί n r r..~ transzportjára használt normális mechanizmusaira épít, Az előnyös megvalósítási módokban a találmány szerinti nem vitális génbevitel! rendszerek a megcélzott sejtben a taralmány szerinti expressziós szerkezetek felvételére szolgáló endocitózis pályákon alapulnak. Ilyen típusú génbevitel! rendszerek például a liposzöma eredetű rendszerek» a. polilizin konjugátumok és a mesterséges v1rusburkok,
Klinikai gyakorlatban a terápiás expressziós szerkezetekhez
tartozó | génbe v i t e 1 i. | rendszerek számos |
ezek min | degyike jól | ismert a szakterül |
teli rendszer gyógyászati készítménye | ||
ravénás | injekcióvá1 | juttatható be, és |
spéci fik | us expressz | lója főként a trai |
szönhető | , melyet a | sejt típusú vagy |
biztosit | , ami a hét | , erológ gén exp re ss |
transzfekeióspeci£ításnak k ö dáknak vagy a szabályozó szekvenciákkal együtt az adott sejttípusokat célba vevő génbevívő hordozónak köszönhetőek. Más megvalósítási módokban a rekombináns expressziós szerkezet kezdeti .bevitele korlátozottabb, mivel az állatba történő bejuttatás helye teljesen meghatározott. Például a génhevivő hordozó katéterrel (lásd az 5328470 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] vagy sztereotaktikus injekcióval, {lásd Chen et al.» Proc, Natl. Acad... Sói USA 91» 3054-3057 (1994)] vihető be..
Egy találmány szerinti expressziós szerkezet a génterápiás szerkezetbe elektroporáciöval vihető be olyan módszereket alkalmazva, melyet például Dev és munkatársai írtak le (Cancer Trést.
Rév. 20, 105-115 (1994)5 .
A cénteráoiás szerkezet ovóuvászati készítménye lénvecében egy elfogadható 'higótószerben lévő génbe juttató rendszerből állhat, vagy egy lassú felszabadulásé mátrixot tartalmazhat, melybe a génbejuttatő hordozó beágyazódik, Alternatív lehetőségként, ahol az ép génbevitel! rendszer rekombináns sejtekből termelhető, ilyenek például a rekombináns vektorok, a gyógyászati készítmény egy vagy több génbevitel! rendszert termeid sejtet tartalmaz.
& végső terápiás felhasználások és a dózisok
A szakterületen átlagosan jártasak számára érthető, hogy egy gyakorló orvos vagy beteg szempontjából gyakorlatilag egy rákos állapothoz kapcsolódó nem kívánatos tünet (például fájdalom, érzékenység, testtömeg veszteség, és hasonlóak), bármilyen enyhítése vagy meggátlésa kívánatos. Továbbá a tumor tömegének vagy nö-
vekedési sebességéne | k csökkenés | e is kívánatos, mint | ahogy a tu- |
mór hísztopatoiógiai | képében va | ló javulás is. Tehát | a bejelentés |
értelmében a ” kezeié | >s, terápi | Lás alkalmazás vagy | gyógyászati |
alkalmazás' kifejező | sek, ahogy | itt alkalmazzuk, az | igényelt ké- |
szítmenyek bármely | és összes | olyan al ka ima zására | ·»•'A ** V.-á g? j -'a*' v U. £, .<« f |
mely egy betegséget | vagy a tün< | eteket meggyógyítja, | vagy máskép- |
p-en meggátolja, visszatartja, lelassítja vagy visszafordít ja a betegség előrehaladását vagy más nos· kívánatos tünetet bármilyen módon. A hatásos dózis és kezelési mód hagyományos eszközökkel határozható meg, laboratóriumi állatoknál kis dózissal kezdve, majd növelve a dózist, mialatt a hatásokat nyomon követjük, valamint szisztematikusan változtatva a dózisadagolásí rendet. Általában áilatvizsgálatokat, előnyösen emlős vizsgálatokat alkalmaznak arra, hogy meghatározzák a maximálisan tolerálható dózist, vagy az MTD-t a bioakt.lv szerre nézve testtömeg kíiooram* * ♦ φ φ.*' monként. A szakterületen jártasak szokásosan a hatásos dózisokat és a toxicitás elkerülését más fajokra extrapolálják, ide értve az embert is.
A humán hatástar.i vizsgálatok elvégzése előtt normális személyeken végzett I. fázisú klinikai vizsgálatok segítenek megállapítani a biztonságos dózisokat. Egy klinikus számos tényezőt vehet figyelembe, amikor egy adott személynél az optimális dózist maghatározza. Ezek közül elsődleges a toxicitás és a választott .heterolőg géntermék féléletideje< További tényezők közé tartozik a beteg mérete, a beteg kora, a beteg általános állapota, az adott kezelendő rákos betegség,· a betegség súlyossága, más gyógyszerek jelenléte a betegben, a géntermék in vivő aktivitása és hasonlóak. A kísérleti dózisokat az állatokon végzett vizsgálatok eredményei és a klinikai szakirodalom figyelembevételével kell megválasztani.
Például egy eitotoxikus szert, például timídin kinázt kódoló heterolőg génhez működőképesen kapcsolt Hl 9 szabályozó régiót tartalmazó adenovirális vektor jellemző humán dózisa 1 x lö! pfu és 1 x 10b; pfu közötti mennyiség közvetlen a tumor anyagába injektálva naponta. Előnyösebben egy ilyen közvetlenül a tumorba injektált adenovirális vektor napi dózisa 1. x 10* pfu és 1 x 10iV pfu közötti mennyiség, a tumor méretétől függőén. Egy eltérő mértékű toxlcitással rendelkező eitotoxikus gén termékhez, működőképesen kapcsolt H19 szabályozó régiót tartalmazó adenovirális vektornál ezek az értékek természetesen ennek megfelelően megváltoznak. Egy 1GF-2 P4 oroméiért és ehhez működőképesen kapcsolt eitotoxikus szert, úgymint tímidin kinázt kódoló heterolog gént taralmáző adenovirális vektor hasonló dózisai alkalmazható* ♦' >
ak javasolt kiindulási pontként.
Különösen az ín vivő alkalmazásnál a. találmány különböző komponensei előnyösen nagy tisztaságúak, és lényegében mentesek a potenciálisan ártalmas szennyeződésektőí (például legalább National Food CNF) .minőségű, általánosan analitikai minőségű, éa előnyösen legalább gyógyászati minőségű). Ehhez egy adott vegyületet a felhasználás előtt szintetizálni kell, és az ilyen szintézisnek vagy az ezt követő tisztításnak előnyösen egy olyan terméket kell eredményeznie,- mely lényegében mentes azoktól a potenciálisan toxikus szerektől, melyeket a szintézis vagy tisztítási eljárások alatt alkalmazhattunk.
A találmány az egy | ík magva1ősi | tási n |
állapotának kezelésére | egy olyan | ki tét |
egy sterilen töltött | fiola vagy | ampul |
citotoxikus szert kódol | .6 heterológ | génbe |
H19 szabályozó régiót tartalmazó polinukleotid vektort vagy egy vektor kibocsátó sejtet tartalmaz.. Az egyik megvalósulási módban a kit egy citotoxikus szert kódoló heterológ génhez működőképesen kapcsolt ölé szabályozó régiót tartalmazó polinukleotid vektort tartalmaz beadásra kész készítményként egységdózisos vagy többdózisos mennyiségben, ahol a csomag magában foglalja a csomag tartalmának rák kezelésére vonatkozó használati utasítását. Alternatív megoldásként és a találmány egy másik megvalósítási módja szerint a csomag egy olyan sterilen töltött fiolát vagy ampullát biztosit, mely egy ilyen vektort kibocsátó sejtet vagy sejtvonalat tartalmaz. A tároláshoz és a szállításhoz a vektorkibocsátó sejtet vagy sejtvonaiat le keli fagyasztani. Adott esetben a csornao táokozeoet és reagenseket tartalmazhat a vek34 torkibocsátó sejt vagy sejtvonal tenyésztéséhez.
A következő példák az itt. ismertetett találmány bemutatására szolgálnak a korlátozás szándéka nélkül,
1.
Ez a példa különböző expressziős szerkezetek előállítását írja .le# melyek Hl9 regu'láfcor szekvenciák szabályozása alá helyezett CAT riporter gént tartalmasnak., és ezek átvitelét több különböző húgyhólyag rákos sejtvonalba.
1. 1.
1.1.1
A HT-1376, EJ28, T24P# 1197 és üH-VC-3 húgyhólyag rákos sejtvonalakat az American Typ-e Culture Collection-től (ATTC) szereztük be, és az ATCC javaslatainak, megfelelően tartottuk fenn.
Átmeneti transzfekoiókat hajtottunk végre kalcium-foszfát kicsapásos tr-anszfekciós eljárást alkalmazva. 1 ml tápközegben lévő precípltánsokat (7 pg piazmidot tartalmazott) adtunk 0,3 κ 10° tápkőá . A s e j t e— &S: sejthez 30 mm~e« csészékben, 10 óra múlva a transzfekció
zegst élt | ávolltotfuk. | és friss tápköze |
két a tté | mszfekció u | tán 24-96 órával |
aktivitás | Τ' h-'.t g r-t 1 r>.- V# X·' \. ·*· X. -v -i- v.. x. | >& szerves fázisú |
mazásával | (Sambrcok e | :t al., 1983} ha tá- |
só fázis | q y s .ί χ κ v ο X | ját (100 pl) egy |
vittük át | ,. mely 3 ml | szcintiliéoiös f |
s eljárás elkel mértünk.
1.1,2. Expressziős vektorok szerkesztése
A pCAT-basic piazmid (mely egy Cat riporter gént tartalmaz amit eav többszörös kiónozó hel.v előz meoi . a pCAT-orcmote *'Χ·* ♦ ♦ * * X *
plazmád (a C | AT | riporter gént | tartalmazza az SV40 promóter | szabá- |
iyozásával), | a | pC AT - e n h a ne a r | piazmid (az SV40 enhanszert | tartal- |
mázzá a GAT | rí | .porter géntől | lefelé, és egy többszörös | klónozó |
helyet egy promóter beillesztésére a CA? riporter géntől felfelé) , és a pCAT-oontrol piazmid (a GAT riporter gént tartalmazza az SV4ö promóter és enhanszer szabályozásával} mindegyikét kereskedelmi .forgalomban a Fromegától (Madison, WI) szereztük be.
A FH19E pla.2mid létrehozásához, mely a GAT riporter gént tartalmazza a H19 promótér szabályozásával, a HI9 oromóte (1. azonosítószámú szekvencia) először a pSluescript 11 SHd-ba CRromega) klónoztuk.. A H15 promóter szekvenciát tartalmazó· pűlinukleotídot humán píacanta DHS-bói amplifikáituk a kővetkező prímereket alkalmazva:
S.SPCR21: GGGTTCCCCACTTCGCCAGTTT (6, azonosítószámú szekvencia) és
ESFCR22: GGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT 57. azonosítószámú szekvencia),
A RCR termékek végét Kleno-w enzimmel tompává tettük, és a pBiuescriptliSK* EcoRV helyére klónoztuk. A beillesztett DNS-t láncon belül vágó Pvu.II, EcoRl és Apai enzimekkel emésztve igazoltuk. A promóter iránya a vektor lacS kódoló régiójának Irányával ellentétes volt, A promóter régiót ezután HindiII-mai és Pstl-gyei hasítva kivágtuk, és a kapott, hozzávetőleg 0,9 kb-os fragmentumot a pCAT-basic piazmid Hindi XT.~Psti helyeire Ínssertáltuk, hogy a pHlúE-t létrehozzuk.
A Hív promóter/'GAT riporter géntől lefelé mindkét orientációban inszertált H19 enhanszer régiót tartalmazó expressziős piazmidokat a kővetkezőképpen hoztuk létre. A Hiú downstream enhanssert tartalmazó 5 kb-os Saol fragmentumot {a H15 transzkripció startjához viszonyítva Hjfö kb~tól tli kb-ig terjed) a pöCl9 SacI helyére klónoztuk. Ezt az ehhanszer fragmentumot ezután EeoRI-val és HindiII-mai kihasítottuk, és a pBlues-cript .IX S?ü EeoEl-HíndlII helyeire ligáitok, hogy létrehozzuk a pBhHlEEnSa-t. A pBhH!9En-Sa-t BamKI-val részlegesen emésztettük, és a H19-t (és egy belső BamKI helyet) tartalmazó 5 kb-os fragmentumot a Hl9 promóter/CAT riporter géntől lefelé elhelyezkedő BamKI helyre klónoztuk a pHI9E-be. A HX9 enhanszert jó irányban (pK19S19D) és fordítva (pKl9EK19Bj tartalmazó plazmido.kat hoztunk létre.
1.2, Bredmónyek és megtárgyalásuk őt különbőzé húgyhólyag rákos sejtvonalat, a KT-137€-t, SJ-
28-t, T24P-t, | 1197-t | és U | M-üC-3 pCat- | ba sic | plazmáddá' |
jelölve a 2. | ábrán), | |χ·> \»’fi A· | -contro-llal | (pSV4ö | w<m.‘. V íí.íÍK |
2. ábrán), | pH19E' | - v-er, | pHlSEHlüü | -vei | és pH! |
transzfektáltuk. Mindegyik szerkezet expressziós eredményeit a 3A-3E, ábrán mutatjuk be. Mindegyik sejtvonalban a CAT aktivitás legnagyobb mértékét a pGAT-controí plazmidnái figyeltük meg, mely az SV4Q eríhanszert és az SV40 promőtert is tartalmazta. Ez a szerkezet szolgált pozitív kontrollként, mivel az SV40 szabályozó szekvenciákról már megállapították, hogy a génexpresszió indukáló!. Azonban az SV40 szabályozó szekvenciáknak nem tnmorsejt-specifikus az a képességük, ahogy a génexpressziöt indukálják, A Cat riporter gént a HIS oromóter szabályozása alatt tartalmazó pK19E-ve( inszfektált sejtvonalak a háttérhez képest szintén jelentősen megnövekedett CAT expressziót mutattak.
A HI9 promőter Cat aktivitás indukciójának mértéke a. KT-137Í **** sejtvonalban lévő ötszörös mértéktől az üH-UC-3 sejfcvonaIpán lévő tízszeres mennyiségig terjedt, A. H19 enhanszer hozzáadása a HIS pxomófcex/CAT riporter génszerkezetekhez tovább növelte az adott sejtvonalakban az expresszió mértékét. Például az EJ28, T24F és 119? .sejtvonalakban a HIS enhanszer szignifikánsan megnövelte az expressziét a H19 promöter./CAT riporter génről, Mindemellett az enhanszer orientációja különböző eredményeket adott az eltérő sejtvonalakban. A HT-1376 és VH-UC-3 sejtvonalakban az enhanszer kiesi vagy semmilyen hatással nem volt az expressziére.
Az eredmények azt bizonyítják, hogy a humán HIS pxomöter régió egy működőképesen kapcsolt heterológ riporter gén expresszióját irányítja a húgyhólyag rák eredetű sejtvonalak széles körében. Néhány húgyhólyag eredetű sejtvonalban· a HIS enhanszer a H19 szabályozása alatt álló· riporter gén expresszióját tovább növelheti,
2, példa.: A Hl9 regaláfcor szekvenciák sssshályosása alatt álló toxm gén
2,1, Anyagok és módszerek
Az 1. példában fentebb leírt expressziős szerkezeteket ügy módosítjuk, hogy egy toxikus· termeket vagy egy győgyszerelővegyületet kódoló szekvenciát expresszáljanak a CAT helyett. Például a CAT génterméket kódoló szekvenciát eltávolítjuk, és herpesz simpiex vírus tim.ld.in kínért (HSV-TK) kódoló szekvenciával helyettesítjük a szakterületen ismert szokásos klőnozási módszereket alkalmazva.
A HiS/gyögyszer-eiövegyüiet expressziós plazmadókat hűgyhőlyao rák eredetű seitvonalakba transzfekiáijuk, ahogy az 1, pél38 dóban leírtuk. Húgyhólyag rák. sejtvonalakba transzfektálva egy H19/B57-TK expressziós plazmxd húgyhólyag ráksejt specifikus citotoxxcxtást indukál gancíclovir jelenlétében..
3.1.
Hetven öthetes .nőstény C3H/H© egéret (Charles .River). úgy neveltünk, hogy egy ketrecben hatot tartottunk, és hagytuk# hogy akklimatizálódjanak egy légkondicionált szobában 12 óra fény/12 óra sötétség megvilágítási ciklusban.. Nyolchetes korukban kezdtük el a kísérletet, és az egereket önkényesen egy kontroll csoportba <1Ö egér) és egy kísérleti csoportra (68 egér} osztottuk. Az egerek kísérleti csoportja, az ivóvizükben feloldott 0,15% Nbutil-H-(4-hidroxi-butii)-nitrózamint (Tokyo Kaséi Kogyo Co., Japán) kapott tetszés szerint. A. kontroll egerek, csapvizet kaptak. Mindkét csoportból a kísérlet megkezdése után 4,· 8, 12, IS, 28 és 26 héttel állatokat öltünk meg. A húgyhólyagokat kivágtuk, és a paraffin tömbökbe ágyaztuk szokásos eljárásokat alkalmazva..
3.1.1, Próba készítése
Sgy egér Hiú kódoló régiót tartalmazó 2,1 kb-os fragmentumot szubklónoztunk pBIuescript II KS plazmídba .(Stratagene, la •Joli-a, CA) a T7 és T3 RNS polímeráz. kötőhelyek mögé, - jelölt
antisz | 3 n 'μ 1 | S Ü | r· γ x m Íz i i V ó. V U i: 1 · ; | X <31?. V 7 < < | ||
xinear | izált plaz: | m.íd | DNS | -bői 77 | polimerázt | (3c |
és egy | Amersham | ί\η\· | n n A. V o | & V -í *· o. r v , <. vt. U· \T- u | aJ. rs Ima zva. | Az |
7 Cí t í t | •„ranszkript | amo k 10 | 7 cpmz-pg | specifikus | ak | |
keznek | . 73 ociir | ne r á ζ z a i | (Soehrinoer Manche | im< |
£co.R..I-val linearizált templátot használtunk kent
Φν « ΦΆ* Φ > φ *- φ Χ· ♦' « Φ χ Φ φ φφφ φφφ* «χ * Φ* »* rollként,
3.1.2. Σπ aítu hibridizáció
Formaiinnal rögzített szövetek p:araf Innal rögzített metszeteit (5 μΜύ 3-amino-propiI-trietoxilánnal (Tespa, Slgms) fedett mikroszkóp tárgylemezekre helyeztük# és 37cC~on egy éjszakán át szárítottuk. A metszetekből a gyantát xilollal eltávolítottuk# 4% paraformaldehiddel rögzítettük, majd proteinét K-vsl (Sigma) kezeltük. A lemezeket aeetileztük, hogy csökkentsük a próba nem specifikus kötését# és víztelenítettük egy etanoi sorozattal.
A b©)-jelölt RNS próbákat (50 000 cpu/μΐ specifikus aktivitás) ügy hiferidizálfcuk, ahogy Rangird és munkatársai leírták [Mech. Dev. 35, 13-2.4 (1391.)), kihagyva a tio-AMR-s lépést. A tárgylemezeket filmre- exponáltok 10 napon át, és hematoxi.1 innal és eozinnal kontrasztfestettük. A lemezeket megvizsgáltuk, és egy Polyvar (Felehet Jüng) mikroszkópot használva, világos és sötétmezős megvilágítás alatt lefényképeztük. A kontrollok szens-z RNS próbákkal történő hibridizálást és RN-ázos elöhíhridizálásos kezelést foglaltak magukban. Továbbá felnőtt egészséges egerek húgyhólyagjainak (melyek nem expresszáitak Hi9~t) és embrionális egér húgyhólyagok (melyek nem expresszáltak H19~t) metszetei szolgáltak negatív illetőleg pozitív kontrollként.
3.2. Eredmények és megtárgyalásuk
A 26. hétre az összes megmaradt kísérleti egércsoportba tartozó egérben tapintható húgyhólyag tumor fejlődött ki. A «19 nagymértékű expressziőjáfc ügyeltük meg a kémiailag indukált húgyhólyag tumorokban. Ezzel szemben# nem. mutattunk ki Hl 9 expressziét a normális felnőtt húgyhólyagban. Következésképpen a kémiailag indukált húgyhólyagnak az ilyen egér modelljét állati v* »♦·*» **<« '<
« X * * * * > ♦·* * * <
,n<
modellként használhatjuk, a. toxin génhez működőképesen, kapcsolt. Hl 9 szabályozó régiókat tartalmazó -szerkezetek in viw tumorspecifi kus citotoxicitásának igazolására.
A H19/toxín vagy gyógyszer-elóvegyület expressziős piazsidókat liposzómá-kba visszük be (ahogy azt T'akashita é-s munkatársai leírták, u, Ciín, lovast 93, 652--651 (1.933), mely referenciaként a leírásba épülj as in vívó egér húgyhólyagba juttatáshoz. Ehhez a kísérlethez használt egereknek kémiailag indukált húgyhólyag tumorjaik vannak, ahogy fentebb a 3, példában leírtuk.
Röviden, SCO μΐ Optime-n szérummentes közegben (8RL Life
Technologies, Gaithersburg, Ml?) feloldott 50 ug plazmid DNS-t adunk 250 pl Lipofectaminhoz 250 μΐ. vízben. Az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten inkuháljuk, majd hígítjuk 10 ml kiegyensúlyozott sóoldatban (SSS(~):: 140 mM NaCl, 5,4 mM KOI, 10 mM TrisHC1, pH-?, 6). miután- az oldatot 15000 rpm-mel 30 percig centrifugálva pe-11-etiz.áltuk, a liposzőmákat 1 ml, 1 mM CsCi^-t tartalmazó SSS(”5~ban újra szuszpendál juk. Hozzávetőleg 0,2 mi koncentrált liposzómát adunk be katéteren át a kémiailag indukált húgyhólyag tumorral rendelkező egereknek. A húgyhólyag tumorral rendelkező egerek kontroli csoportja DOS nélküli vagy a H19 szabályozó szekvenciák szabályozása alatt álló irreleváns gént tartalmazó liposzőmákat kapott. Meghatározott időpontokban mindegyik csoportból egereket Ölünk le, és a. húgyhólyagot kimetsszük, rögzítjük, és paraffin tömbökbe ágyazzuk szokásos eljárásokat alkalmazva. Minden második metszetet a fent leirt Hiú próbát il
Φ* fe* .»*·♦* ΦΛ·ν» *
Φ * » «· » * * ν X - * ν Φ
X * * » S * * f
Φ$Λ κ -♦» φ *. '*'·’vagy Fseudomcnas toxingén kódoló szekvenciához tervezett próbát alkalmazó in sí tv hibridizációhoz készítünk elő. Továbbá a tumorok méretét, számát és elhalását összehasonlítjuk a kontroll és a kísérleti csoportok között. Úgy találtuk, hogy a Psescomocas to-xln expressziója egv helyen fordul elő a HIS exprsssziójával a kísérleti egércsoportból származó- húgyhólyag tumorokban. Továbbá az egerek kísérleti csoportjában a húgyhólyag tumorok mérete lecsökken és nekrot ikus:, ha az egerek kontroli csoportjában lévő húgyhólyag tumorokkal összehasonlítjuk.
5, Példa: Expresszió IGF-2 P3 és P4 orométerekről tumor sejtvonalakban
5,1. Anyagok és módszerek
Ebben a kísérletben olyan- különböző expressziás szerkezeteket hoztunk létre, melyekben a luciferáz gént a négy különböze IGF-2 p-romóter egyikének szabályozása alá helyeztük, és több különböze húgyhólyag rák sejtvonalba vittük be. A következő humán IGF-2 promóter/Iuciferáz szerkezeteket 'készítettük el:
Piazmídszerkezetek | IGF-2 gon nukleotid- szekvencia | Promótér |
Hupl | -960 - +54. | Fromóter 1 |
Hup2 | -379- +271. | Fromóter 2 |
Hup3 | -1229 -+140, | Promőter 3 |
πυρ 4 | -546 - -102. | Fromóter 4 |
Az IGF-2 promóter szekvenciákat Sussenba-ch és munkatársai írták le (Growth Reg, Z, 1-9 (19925], mely referenciaként a leírásba épül. A luciferáz riporter vektor kereskedelmi forgalomban szerezhető be a Promegátől,- Malison, WI {katalógusszám;
fc < fc
VXs *
-. « V* * - fc :· fcv
V’
A kapott expressziós plazmido-kat HT~1376, EJ28, T24F, 119? és ÖM-UC-3 humán húgyhólyagrák sejtvonalakba transzfektáltuk, ahogy fentebb az 1. példában leírtuk. A luciferáz aktivitást egy kereskedelmi forgalomban kapható ki tét (Promega, Madison, W.I, katalógusszám: El Söö) alkalmazva mértük. A2 eredmények., melyeket a
4.A-4E. ábrán mutatunk be, igazolják, hogy az IG9-2 P4 promóter a luciferáz riporter gén expressziéját mindegyik vizsgált húgyhólyag rák sejtvonalban irányította. A 1197 sejtvonalban az IGF-2 93 promóter is irányítja a luciferáz riporter gén expressziedét. Az ezt követő kísérletekben az TGE-2 93 -és 94 promóterekröl kimutattuk, hogy a luciferáz gén expresszió.ját más tumor sejtvonalakban is Irányítja, ide értve a koriokarcinóma sejteket és a rabdo-mioszarkóma- sej tokét.
€, példa: A 013 promóter és az IGF-2 pri»ófcar a H19
;íro i
Négy luciferáz riporter vektort, a p.GLö~basic, pGt pGll-Snhancher és· pGL3-Controi vektort a 9romeg-át-ől szereztük be. Ezeket a vektorokat tenyésztett .sejt vonalakba transzfektáltuk számos különböző transzfekcíós reagenst alkalmazva., ezek közé tartozik a lipofetárnán (Gibco/SRL)fügén (S-oehringer) a Perfect Transfection Kit 3 különböző lipid reagenssel (Invitrogen) , TEX-iö, TFX-20, Tra.ns.fast (Prcmega), és a kalcium-foszfátos eljárás (Germán et al,, Mo-1. Cell. Siói. 2, i no-iηζΐ > ι os·?
ral amplifikáituk a
ATATGGTACCGACAACCCTCAGCAAAG-3! szekvencia) az
A pBluesoript II SK EcoRV helyére klónozott H19 promótert (pbhI9p#l) az 1.1, példában irtuk le fentebb. A Ki9 promptért kivágtuk Smal-gyel és Hind,III-mal hasítva, és a kapott 0,9 kb-os fragmentumot a pGL3-Basic vektor Smal-HindlIX helyére ins2ertáltuk, hogy a Lúc-pbhi9 szerkezetet létrehozzuk.
A -8.19, - +14. nukleotídig terjedd H19 promóter régiót PCHpbh!9p#l plazmídből, 5'(upstream., 8. azonos i tőszámú n,?rt ·* :«> *> y /V .‘p 5VJ .•τ·'.'PwΆ Γ* Z·*·??».»'·'» '> f
A λ nAkSV i ivx Ww λ .A*A\A„kv x <A.· i ^**.5 (downstream,· 9, azonosítószámú szekvencia) prímeteket alkalmazva. A kapott PCH terméket Κρηϊ-gyel és HindiXX-mai emésztettük, és a pGőE-Basic vektor Kpnl-HindiII helyére ligáltuk, mely a Luc-PB«I9 szerkezetet eredményezte. A BCB-ral létrehozott HI9 promótert mindkét irányban megszevenáltuk automatizált festék terminátor ciklus szekvenálóval (AKT Prism 377 DNS szekvenátor, Perkin Elmer). Az 5. ábra mutatja a H19 promóter PCR-ral létrehozott núkleotid szekvenciáját (2, azonosítószámú szekvencia)<
Az 1. példában fentebb leirt 5 kb-os HIS downstream enhanszert DamH-val emésztettük, hogy egy 4,1 kb-os és egy 0,9 kb-os fragmentumot hozzunk létre a 3' végen.
A Luc~PBH19~0.9DH19 és I,uc-BSH19-4EH19 szerkezeteket hoztuk létre a H19 enhanszer δ, 9 kb-os illetőleg a.
fráment«mainak a Luc~?BHl9 piazmid BamHX helyére inszertáiásával, Az enhanszer szekvenciákat a Hl 9 promöter/luciferáz riporter géntől lefelé helyeztük el.
A 0,9 kb-os BamHX enhanszer fragmentumot a pGL-Basic vektor
BamHX helyére ligáitok, hogy a Luc—0.9SH19 vektort hozzuk létre.
A pbhlűptl piazmid H19 promotsrét kihasítottuk Kpnl-SamHI-val, r ko-os »3®Ki ** * ♦ és a Luc-O,SSH19 szerkezet Kpn.I~Bg.iII helyére iigáltuk, mely a Luc~pbhl9~0.9SH19 expressziós szerkezetet eredményezte, mely tartalmazta az 1. példában leírt promóter klónkat, és a Hl3/Luc riporter géntől lefelé elhelyezkedő Q,9 kb-os enhanszert.
Hup-l-nek, Hup-2-nek, Hup~3-nak és Hup-4-nek nevezett expressziós vektorokat hoztunk létre, melyek a humán Pl, P2, P3 illetőleg F4 IGF-2 promóterek szabályozása alatt álló luciferáz gént tartalmazták, ahogy Sussenbac'h és munkatársai leírták (Growth Reg. 2, 1-9 (1392) ] . Egy 512 bp~os ?4 régiét amplíf1 háltunk PCR-ral a Hup-4 szerkezetből 5'ACAGGTACCTC?AGAGTCGACCT~3f ('upstream, 10. azonosítószámú szekvencia) és 5'-ATA?AAGC??GCTCCCATCCTGCA-3f (downstream, 11 azonosítószámú szekvencia) primereket alkalmazva. A kapott PCR terméket Kpnl-HindllI-maX emésztettük, és a pGL3-Basíc riporter gén KpnI-Hindi 12 helyére iigáltuk, hogy a buo-34 riporter gén vektort hozzuk létre.
IGR-2 P4 promótert és a HIS enhanszert tartalmazó expressziós vektorokat is létrehoztunk.. A korábban leírt 4,1 kb-os fragmentumból származó 2 kb-os BamBI enhanszer fragmentumot a L.uc-P4 szerkezet SamHI helyére klónoztuk a Luc-B'4-2EH19 expressziós vektort létrehozva.
A 0,9 kb-os·, 2 kb-os és 4,1 kb-os H19 enhanszereket automatizált DPS szekvenálást alkalmazva szekvenáltuk reg. A 0,9 kb-os enhanszer nukleotidszekvenciáját a 6. ábrán mutatjuk be (3, azonos! tőszámú szekvencia'} , A 2 kb-os enhanszer nukleotidszekvenciáját a 7A. és a 73. ábrákon mutatjuk be (4. azonosítószámú .szekvencia) . A 4,1 kb-os enhanszer nukleotidszekvenciáját a SA-SC. ábrákon .mutatjuk be (5, azonosítószámú szekvencia).
δ. 2 . Eredmények és magtáu
Amikor különböző -trans-zfekcíós- reagenst alkalmaztunk arra, hogy a négy luciferáz gént tartalmazó vektorokat a tenyésztett sejtvonalakba vigyük be, a kalcium-fo-szfátos kicsapás eredményezte a legnagyobb transzfakciós hatékonyságot a vizsgált sejtvonalak legtöbbjénél. Ezért ezt követően kalciumom kicsapást használtunk -a különböző- expressziós vektorok transzfektálására. Továbbá a plazmád DNS megnövelt koncentrációja nem gátolta a transzfekciő hatékonyságát, még akkor sem, amikor a felső szint feletti koncentrációban alkalmaztuk azokat.
Az 5637 húgyhólyag sejtvonal, a Huh? hepatocelluláris karcinóma (HCC) sejtvonal és a 293T vese-tumor -sejtvonal mindegyikét különböző· szerkezetekkel transzferáltuk, melyek a luciferáz riporter gént a H13 vagy IGF-2 ?4 promóter szabályozása alatt tartalmazták a KIS- -enhanszerrel együtt.
A riporter gént és- a Hl8 prométért tartalmazó Luc-phlS-cel és Luc-PHl 9-cel transzfektáit sejtek a háttérhez. képest megnövekedett génexpressziőt mutattak (3A-9C< ábra). A PCR-re.l létrehozott promótert tartalmazó Luc-PH19 szerkezet nagyobb aktivitást mutatott, mint a Luc~phl9, mindegyik vizsgált sejt-vonalban. A 0,9 kb~os H19 ennanszer fragmentum hozzáadása a LucphlS riporter vektorhoz iLuo-phl9~0,9EH19) tovább növelte ez expre-s-s-zió mértékét kétszereséről a négyszeresére- az 5637 illetőleg 29'3T sejtvonalakban.
Az XGF--2 F4 promóter ís megnövelte a luciferáz expresszió-ját a háttérhez képest az összes sejtvonalban< A 2 kb-os H19 enhahszsr fragmentum hozzáadása a Luc-P4 expressziós vektorhoz fokozta a P4 promóter aktivitását. A 2 kb-os enhanszer fragmentumnak a “ 6 ·* ♦ ·» • * * * * ♦ ♦ « * w luciferáz aktivitásra gyakorolt indukciója a 2937 sejtvonalban megtalálható kétszeres mértéktől a Huh? sejtvonalban talált hatszoros mennyiségig terjedt, míg az enhanszer csak csekély mértékbe fokozta a promóter aktivitást az 5H?3 sejtekben.
A 1ÖA-1ÖS. ábra .mutatja, a FCK-ral létrehozott H19 promótert és 4,1 kb-os Hl9 enhanszer fragmentumot is tartalmazó Lee~phi9~ 4EH19 szerkezet expresszióját. Az enhanszer nagymértékben, 3-28 szorosára növelte a promóter aktivitását, a sej tvonalakban, az
5637 seitvonal kivételével.
A kővetkező plazmidot deponáltuk az American Type Cuiture Coilectíon-nél (ATGCi, Hanassas, VA, a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezése nemzetközi elismeréséről szóló Budapesti Szerződés előírásai szerint:
Klón. ATCC nyilvántartási szám: letétbehelyezés ideje:
PH19EH19' 209322 2997, október 2'.
Az előzőekben ismertetett leírás alkalmas arra, hogy lehetővé tegye egy szakterületen jártas számára, hogy « találmányt a gyakorlatban megvalósítsa. Természetesen a találmány .megvalósítására szolgáló lentebb leírt eszközök különböző változatai, melyek nyilvánvalóak azok számára, akik a molekuláris biológia és az orvostudomány területén vagy a rokon szakterületeken jártasak, szándékaink szerint a következő igénvoontok oltalmi körén belül maradnak.
ívatkozott oubiikációk referenciaként teljes terjedelmükben a leírás részét kepezrk.
OfrS
ΟδΤ
ŐZT
SoSsaooSoS
3£«0825κ«2 «SőSaoaaSS
SSSSSoaSBo £55308555.3 £33£85a£o3
5560358283 svsaSaaSSa £888£S«2«S «ooooaBSoo zeoovsSSoo oSoSoSsSsa SoaoSooaSo 2232233332 8553322322 £S2£-33««22 2328322,283 2223583332 2388833328 3383538,533 832552.508« 3255588328 2323222282
£ | <S09> |
882380 ÖÜS3H | «εχχ* |
vsa | <5XX> |
εεο | <ττε> |
z | <000* |
GO JU ©O 855 22 S 0?>S OS* oz* 09£ Ö80 0*0 081 ®tí 22
SSSaSSSasa
3558333555 «552223252 £S8«5355«S aSoSSqsaSS
23Ő2382825
SoaSeSaasS
SSaSsaaSSS
3235«83«35
SaasSSBaw
3δδδ»53335
0S333353SS
5525838222
8558533855
SSSeőSSooS
8333633885 o»5«6SS53» £»«5322383
8a£«25«S55
0338555833
SeSaS»®»»» 5583383323 «£38»2»5a5 SaSaaSSaS» o53S«£«35e 53331? «3333 83S3823383 «233332322· 8888838223 8333383365 5235222388 SqasSaaaoJS 20O3555«£5 SaoooaSSSö SaSao-oaSSő £235353538 £s58S«53SS 522235653« 3382332825 23£55«£5«Β BOOS^kSSoO 332332235« 2233388255 £222365828 »3»b£55323 5535«285«5 £558532233 .8233835322 Ő35£S«3325 2 825888353 3283358322 3335853328 3352533232 3Ö565e«5»8 3253533823 »383333223 3338333383 2823838283 2233333883 8588828023 £555522035 5388882338 3832883253 3388855833 33852322«5 5552523553 5823332555 8855838382 2332382228 3883553335 8383288253 3353835238 33353355«» 323225«5«5 £833355525 2830008033 OOSSSOOSSOO 8883005855 £833322255 2333558838 0388833832 3338838833 3355583.533
T <2S8>*
0825«S 8'33;S <£~Z> vsa «πρ 508 <008* <OTZ>
G‘C «3Τ838Λ »A©9»7& OOJ C2£32«Z <S5T»
TT <09T>
εο-δτ-ζεετ «τετ» S05OS/SÖ S5 <GST>
O-OWSST <TST* üK’m/βδ sít «sst* &e~oo-sss~ <τ*τ» mos/mx/ioa m-nöö-tsM <οετ>
XXX32X05CXX3 □xáX3Sás;xom£ mxónasr voa ssmxxsoáms w ssoexsh «οετ»
85»XSSSn38£> JO
A8gS28A0Un Λ®3ί?8Η «%. ?« Λ288820 30212882g228SS8'á BJTSSJX <OTT>
egsTfvxousA^szs ik ssöt oss
GöS ow
SS 5
ŐS5 áss
ÖÖS s»s
08»
ÖCS' ösr
Sőt
3»S
ŐST
ŐST
ŐS
U8
0»S oes orr oss
OÖS o»s
08»
SS» osx est w
G8T οετ
OS €58 őst
ŐST oss
003 s»s
SS»
ÖS»
OSS
S0€ ooSouőősob 88s5o3522S 2822225502 foosSoooos SáSSSoőooS 50825=8203 S®«5eSöS'ő3 sossbSSsőS Ő82-53S55SS sbőSSsoo^o S«-9oseő8oS- oőőSioso»»· οο55ο5£ε33 ££8822225« o3353So83a S»08333530 ssoSoBoooo £322323333 3233323355 8253283060 33035553» BO8OOOO23O 22«SS335£5 5335555353 5S2S«55őő2 5233555335 £«55£3£.Ss3 Β3δ55335δ2: 333388030« 23«0300Ő02 225^555033 320S332233 őo.SoooooSe οοοοοδοοοο 533363633« 222-3353332 3253333035 5530335335 O35o0.SS322 2335325230 3322523353 23OO55s5«2 S03033S32S £55bs55&33 5333553355 «oSooooooo 5000332333 3233555553 BsooSobSSS «δοοδδδοοο 23.832222S3 3S23030Ő2S 5322335323 5533333252 3330333322 3333332233 3333233233 3525302333 0223332333 02.53322225 3OO£SO2S25 0203550220 3022083552 53O55OO332 0333335332 o£o32S5353 oSo.SoooőoS 02355ooSS3 3oSS55Sooo 02303230S3 53323o5e55 3S0S2220S0 soooSoőeSo οοοοδοοοοδ 33o63«63S3 SoSoSsSoSo S3S3S0S353 £253235353 £353235353 55530053.63 ££53o5k233 3333533253 822OOO3553 £«03032323 SSOOOSSSOO 23255.53055 3333055333 883200025« 235So55o23 £££££282%?%? 3332222553 2332333555 SSoSSSooaS »33Soo5o£S So«335o5o3 30833S3223 0555255355 2o5o5o2»23 ,3222223330 Sooooooáos SSooooaoB» SooooSSSoo » <053»
38TC88 C3S»H «€7£» νκσ <ετε>
OS«t <TTS>
» <ŐTS>
£553335 «05233230« 52235o5556 OOS5««3283 3335oSS520 333353S353 2333OSoo5s 5233322025 33θ£θθ£3Ο3 3253322353 0So£233038 2230283253 5333000580 2233082233 23200o55o5 0323252333 3223333533 2203232223 3533555008 OOSSOOOSOS 3«5S268053 0350325330 2353255553 3SSS3O3323 3333335308 5o60033SO0 ΟΟΟΟΟΟδδδΟ 8282335553 303355022«! 225&OS33SS 5053003553 25S0500020 2233052235 5O2O22»525 5303233833 8523302503 3350332582 83ŐO288883 2S32000503 2Ϊ20222223 3253333583 2250333003 3303330S03 2353032530 2253333322 000832i5«2 3250223033 2238322302 ΟΟδΟΟΟΟδοΟ 2223333508 0032330533 0358300833 3063022000 3353330530 0O6«3225«O 0θδθ22裫0 2353232320 2353323508 326«003832 33S3000380 OOSOOOOSOO 3358232583 2202333530 035θ3325«2 035o333So3 23SO332S33 33δΒ33θδ«3 3365333023 338033Ő330 3»O3«?SS08S S53S000003 25sb55o5oS o5oooo33«6 «32553556ο «SsoooSoos 3300503335 0232500303 2362033000 oSSooooSso ooSoSooooS SőooooSSoo SSooSosSoS 3333OOO65o ΟΟΟδοδοοδο 0233000000 2035333322 «55θ233®»5 5280028883
ε | |
ÍÍOTáOS 0520*5 | «Πϊ> |
VKü | «ετε» |
558 € | «ττε» <οτε> |
So5 55®ο3555®ο SoSSeSoooS 5033555222 Soooooőooo δκοοοοοοοδ £»22555223 3005553055 δοοδδδοοδδ 3255320322 οοδοοοοδδδ o65£ooooo5 5£S5o53222 SSSoSSoSőo SSSsoooSoo «οδδοοδοδο SooSoSoSoS oSSSooSoőö 52o56«oo33 ooSoSSoooo o5o25£«555 53δ3££55«5 SoooooSooS SoooooSooo 2S0332530S 2555520525 5®556o53oo oSSoosoSo» 5o555oS5S3 οοδδΰδεοο» oS£S5s2383 0025855200 55®o5eo5s5 SSooSSooSS 225oS55eo5
53S3«3oSo3 2222802330 oÖooooSőSe oooooSoőoo 3000523303 oooSSSSo^S 5^25535538 23528£oS33 32S0S2530S 5580380300 3000383333 2358232200 5203323222 «255253335 5555032022 θ£θ5320θ55 3355555533 o5523®«656 2056328832 S£223S«O2« OSkBooSosS o5338«o££o 5330253383 «SSSSoSooS
8>
036’ CCS’ Q35T SOS’ OH’ 0 85 ccsr ossz COS om osrr οτετ oszt oszt OSZT 0 SÓT οζοτ őst 00« 038 08» OZi SOS 00$ 0>S OS 5 on asz őst o>z
ŐST
ŐZT
OS »»»Sa»5S»5 »»£S»®»55» »£££»»»55» ®»33»»S»5»
Βοδδεδεδε» í3»»»55»»3 £ε5»ε555»5
3»»555ε»»»
33S»5o3S»S »3ε5»££££ε
33£5£££ε£)ε £3£«2:2:SS£S b5SSS5»»»S
33»»3335a» aoaSaSSaSs
S£3S5»3»5» »»5oíi22»33
5335352503 ooSSbSSboo
303»3»»»55
BSoSBfiSSS» »»5εδδδΒ»» a»5»»»»3a5
5»»»»ο5»36
SecooSbb&SS »»3Β3ΰ»»3» aasSS»»»»» aSsSaasSttS
33»»£«5b5b
Sa5a5a5a6a £5»3®555£»
33333:3305»
35553:55555 aao»·»»».»»»
S»»»»»»»»» »»S®»»»®£g »»»»B»3B»« boSsSSS»»» εεεεδε»».»®
555»5£δ33»
55ε»55ε»5ε
5»»£5ε£έ»ε aoaSSavSsS
5έ»£ε££«ε3 asa»»5s£»» »»»»SSoo»S
SSoo3355»» £££exre333£ £553353533
3330335a»5
03O»bS£o55
55b»»»»»5b £»5»»£»55£ s»»»5ss»»5
333S333330
SSaSaoSoaS
SűSbbSSS»» ®S3»555b»3 »»»»»333»»
3;5S»5£«»»3 »3:3^53355» »»3»5β3335
555» s»5aSa
3»a5553355 »»»»»»»555
3£5®5£»»3O
33333»»»®»
SS»®»»»»»» S»5£:55»3»» 5353355335 »5552232»» »35333»»»» 3»555»»55s 5S5a£»»»£a £S5»s£k»5£ 33333553»® £3££555»®» a»».»»»»®»» 555»»»SaSS »3.55355» »» 333»»»»®»» ΟδεοδοΒ»»» ,Ο333»»££β» £3»5»££őSő 3»»5»5»3»5 »»£»525»3» 5^55555533 £»53333353 esSesSSass Sa a»55»355 33»»»»»S5a »33333333» »3»»3B»55» 3«55£55bbb a33SasSaSa SSSa £'£33» a »»»»δ65»3» 55»55g3333 3333333333 »»5»»»»»»» 3333033333 aőSS®»»»®» 5aa3»»»»3» £»Sa»»£s»S 5553353333 as3a»S5aa3 ®»®30325ő£ »5»»6555»3 S»0».»3»33» SaaaSaSőSS »333523333 bSbBSOBSbo 5535533333 »335335333 3»»S®33»£» £»»££»»£»3 33555»3»33 K3»3»335»3 3» 3» 3333 33 3335£a»55a 353335333» aaa&safiBoS B»5»0»B»»» a5»33»3Sa5 »£3533333» 533253333» 3333333353 Sa5»5»5»5» 3aS»5»»»S3 33»a»3»»5® £Sa£3»S»»5 5333333333 »3»5»»3»SS 3333335533 3523333033 5525333333 £33.2353» 3 3 SgőSaa»»55 £»»»»»»»»» »»»»£65®»a £»»55»55»3 bkSSbBSboo 3»S5S3»553 »£33355533 S»»»»66»»£ »£ββ5β5»»β »£»»55b555 s£s5£555ag 55055a£3»5 5333335-3» 5 »3»5»5b»»» 3335.233.255 »»£3330003 S»3O5»£»33 3330233333 5®335a33aa £»»»»»5»»» »»»3333333 »»»»»»£»»» S»»»»g5®55 SaSaSaSaSa 335333355a »»55355333 »££»323233 65®O»3»o5B
S <
»»»»£S»»£a »3»»»£»333 5a»»5332a5 »££££33333 ®»»3»sS33.S 533353553» »»333»£»»» S5553»£»SS 33£35S££»5 33333S£e»3 ooSaoSSSe» 3»£»3»3»»S 5S5»£35«»® b£5»»»»55® SoSoőSőS»» 533SSa».Sőa £5b3S5»o££
3355333353 Saa»a»»3»3 5a»S£££»53 3333»»»5»» θ£3»»»3333 3»»»SS®»£3 »»»»55£5£» 2S333»»»5» 3»53»»»S»5 33£3a55aSa 3335333333 5a5»5»5»5» 53»»»»»3»a 5S5££aB»BB »333035»»» £33335523» 00»
333533 oson «πζ» sm *m* S «ÖT 2» osst SZ ST ess? OOBT OH? 089T OZST OSST 00 ST OW 08 TT OSST OSZT OOZT OSTT osor esSeSSfSa»
5553533 3»S 3δ5»£δ»«5» SaSSoaŐSSS 5»£as>»»5»5 »»»:»535»35 »553»3335S booooSSS»» 5£δ55ε»5ε» aaSvaSaaaS 23»555»»»» £53S»3»»33 3»»a»»35a» 3»e5355»S« £Ss£Sa®»Sa
553555»5»5 3»ε3»ε55»ε 555»5»S»5S »53»SBs3»» 333»»»335» £»3»555353 »»333»5»3δ oaSaoSeoSa οδεδδοεοδδ »»5δ»5»3»ε εοοοοδδοε® 3333333330 5533335533 5553333335 £»»33δ«δ3ε
5»3δ3»£££» 55555»»3»» SsSSSSSasíS 5ε5»33553» oBbooSbsSS 3553333333 B33o5«»£5S «OSSoSSbSS 3S555a£a»£ SaSeaasaaa SSSes»»»»» 53552^5333 »55ΒΟδΟΟδ» 3θ55ε££»»3 s£»isS£s£a3
3££3£££S»5 £»£»5»£»33 »£5£»Sa£aS 33»b5S»®5® 5S«bbo»3£» 3333333»»» aSőS»»»»»» »3££k££S»S £33»5££B»S »5»3»5b»5® 55»5®£®B»3 53333335S» 333333»»£5 5535533353 »33£3»£»»£ »3»£33»»»3
SSasSSSasS
3335333533
5535333253
5555233235 »»»3533333
3333333335
S»35«333»5
SbőSSsS»»» aS55«»»»S«
3»ε53δ»»33
3333033355
S5»S3»5B33 »»»533333» »533533333 »5»355s555
35355555»«
S53»3£«»b5 3355535»5a 3333355a«5 £5s£Sa555a 53»£55aa»3 55»3»333O3 3333335.033 O»5£B333»3 sS£S5»5»s£ »533553333 535333555» »33δεδ3333 555»535333 o55»3~3£53 5»5»£55533 53355»»SS» £ !γ V » * V
W3 «5~5> i£ *~T5> S <OTS>
sm | ||
0SC3 | 3555285588 | £263655326 |
ŰJS^ | 2882253835 | 2823283363 |
δ 95 ε | 55ο862555» | 53&3SS62S3 |
Οδδ ε | 3558388385 | 6385866556 |
om | 5835656888 | 2236333335 |
385ε | 3383332883 | 8832282382 |
οεεε | 8255535553 | 3333352358 |
δδδ£ | 558555256« | 6553568555 |
oost | 2523£5832» | 388253555« |
Ö8S5 | 3338335333 | .6855883858 |
om | 3332365368 | 5382382335 |
om | 8523258233 | 3355352223 |
οοεε | £335332353 | 3325533268 |
δοεε | 22S2223233 | ««8388856ο |
os-εε | SSoőoiraSSo | 2333336833 |
οθτε | 3263263335 | 3333366886 |
οετε | «568865883 | 2855833325 |
δδοε | 5«£«£o65S5 | 2686333638 |
δοοε | 8326323238 | «336333638 |
&w | «£«££32663 | 5«5SS88£65 |
3885 | 3363536263 | 5855533363 |
0885 | 3238558658 | 3686332663 |
0922 | 353286366« | £883822350 |
08 »2 | 8336323623 | 2282838623 |
«χ | »«55283333 | 3038556355 |
08«ε | 33«6«δ8288 | 3858235333 |
οε«ε | 5255255260 | 5356236683 |
0995 | 8223223333 | 5385333663 |
00 35 | 2665533338 | 3555553035 |
sm | 5333833352 | 2303533»»3 |
ο§εε | 5253383583 | 8550330335 |
οεεε | 2688636333 | 3386823303 |
09~ε | 5365336653 | 8683033865 |
δδτε | 2838535322 | 3580830353 . |
8405 | 0232323223 | ooSaaSosoő . |
aS5 2233338883 282O323S23 8£3o£«sS33 «δδ» usxctes oíoojí <ctj>
W <£X£> εε <ττε>
i. <080>
05«3330003 222330oSSa 9 «’δδ» k»t<?8s csajon <εχε> wa <ετε>
2t « ττε>
<ÖT5>
SosSs
553255£oo2 βκ»«β»ο5«£ SSSosSSeSS SqSsSgSSSS 8a£»e-»e£SS 25o5o5££82 s»«SSg3»»3 »5SaeSeS3S 3865323838 S5oB5e5S£S 5ο«5255£22 o5o£5£«533 38525653S5 saSSoSoSSo s»S£»3»«»5 5323326833 8B«2868s5S 632325o£»» 3o5o£2«333 3bbSo36S«« aaawjSSSsa-s. «3*»»»033δ· «SoafiSosofi SBeSegaasS 33335«ao»O sSSvSaőBea 3325So£«3« sSooSsoSSo □SaoosaS&s 3333283333 SSSooaaSoa SvsSooSSSS 233.£«25655 o£33£S555S «osssaSaSS oooSSSoS»» SaoossSesS Seasaroosa SoooHooőso £28282228« 3835558683 «SSSscoofiá 6o323«3os3 £S3»»3O.S55 o5«2»o33£» S^osaSSsao 2008203333 3333236382 ososoSfíofife 3628823333 3383022022 *32333303» 2026688888 »£o633»o5o 5683333282 3333333333 3258252233 8580368002 3333233338 8233228233 5533533655 5o2«33S855 586S5«5S5o aooSSSrasS ««SSsSSoSa «ο5»»885δδ £355556255 88«56£686« □S»2«»o6S8 ««SŐ3233SS 55«33o5o«5 o5«S35«333 33O36«OO23 2083330335 8232.632333 £322338223 36«Βθ£565θ £333.533255 8556833383 3855823385 5««558S555 5033320603 8555533555 5833533553 3525383033 5588-225555 0300255358 8222322283 3368588333 3282355555 3333325533 8283855833 3333233333 3335383855 322328222» 5833333533 «383555035 5553338585 2223588222 05s55«8333 3385338225 5558503823 3282333855 8585683228 5833333358 3333882833 2553533553 2555833333 3055566503 323SbŐ3503 3352283338 2255523253 5586333333 2882866583 »«23382333 0»»0»0»02» £535235335 5588555838 ££3555858» 0SS08«3225 θ5688θ5θ8θ 3535383353 3223333323 2555283683 3335838556 5838303233 2228555833 2355833325 8855533233 5538868333 3555583355 553822355« 5S6SS322»» 50220££«55 3828833858 5832333332 5-835833355 5532328825 8238833332 525s503023
««» a ** * ♦ * * * -* * ♦♦
Jt x « ♦ **» »y «223» íiofso sapxsm «4SÖ> S epacgpcacc ^acaaccefce ace&a&a «22«> 3 «2ΧΧ» 28 «2X2 > »
«2X3 > | Kc;r,« sápién |
«4C0> | S |
afcasas^ctt | ettcícccsc acccsgesi |
<2X5? | 20 |
«322» | 23 |
«222» | m |
«223» | K»“ö s&pisn |
««00» | XŐ |
acagg&aeet eiagagscffa ecp | |
«2X0» | 12 |
«2X2» | 24 |
«2X2» | SNA |
«2X3» | Homo sapisn |
«áss» | 22 |
atataagctí. gccccratec fcsjest
Claims (12)
1, Egy szekvencia tumorsejtben történő expressziójára szolgáié vektor, amely egy citotoxlkus génterméket kódoló heterolog szekvenciához működőképesen kapcsolt H19 szabályozó szekvenciát tartalmazó poiinukiectidot foglal magában.
2. Az 1, igénypont szerint} vektor, azzal jeiiemzve, hogy a Hl9 szabályozó szekvencia a H19 promotor, a H19 enhanszer vagy a H19 promotor és a H19 enhanszer együttesen,
3, A 2. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a H19 promotor tartalmaz:
(a) a H19 promoter az 1. azonosítószámú szekvencia 1-S3Ö. nukleotldjait tartalmazza; vagy (b) a Hl8 promoter a 2, azonosító számú szekvenciát, tartalmazza,
4, A 2, igénypont szerinti vektor, ahol a H18 enhanszer tartalmazza:
(a) a pH19EH19 plazmidba {letéthehelyezési száma: ATCC 209322) klónozott. Hl8 enhanszer szekvenciáját (b) a 3, azonositószámú szekvenciát;
(c) a 4. azonositószámú szekvenciát;
(d) az 5. azonositószámú szekvenciát;
ahol az enhanszer adott esetben a heterolőg szekvenciához képest 3’ irányban helyezkedik el,
5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a heterolőg szekvencia (a) E-galaktozidáz, diítéria toxin, Pseudomonas toxin, ricin, kolera toxin, retinoblasztóma gén, p53, Herpes simplex timidin kinéz, Varioella zosier timidin kinéz, citozin dezamináz, nitroredoktáz, citokróm p-43ö 281, timidin foszforiláz, porin nukleozid ·-· Jt * *
-D * * * * X « « ' * * Λ * « χ « *♦»* Κ«« « Φ # Λ íoszíohtáz, alkallkus foszfatáz, A és G2 karboxipaptidáz, ünamaráz, íl-lsktamáz vagy xantin oxidáz kódoló csoportból van választva;
(b) egy antiszensz szekvencia, mely specifikusén hibridizái a cdk2, cdk8, cdk21, odc25A, eskün Dí, ciklin E, ciklin Af cdk4 vagy az onkogén pS3, o-fos, c~jun, Kr-ras vagy a Her2/neu közöl választott gént kódoló szekvenciával; vagy
Cc) egy ribozimot kódol, amely specifikusan hasít egy, a cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A.. ciklin Dl, ciklin E, eskün A, cdk4 vagy az onkogén p53, c-fos, c-jun, Kr-ras vagy a Her2/neu gén közül választott kódoló RNS-t
8, Az előző igénypontok bármelyike szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt nem az emberi testben ven.
7> Áz 1-7. igénypontok bérmelyike szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a tumorsait egy húgyhólyag tumorsejt.
8. A 7. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a húgyhólyag tumorsejt a Ht-1376, EJ2S, T24F. 1197 vagy azÖm-UC-3 csoportból van választva,
9. Az 1-5., 7, és 8. igénypontok bármelyike szerinti vektor alkalmazása gyógyszer előálli'tására, mely alkalmas (a) a heterológ szekvencia expresszálasára egy tumorsejtben, ahol a szabályozó szekvencia egy Hl9 szabályozó szekvencia, mely specifikusan expresszáiódik a tumor sejtben; > vagy (b) rák kezelésére.
10. A 9, Igénypont, szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer tumoros alany kezelésére alkalmas vagy a rák húgyhólyag karcinéma, hepatocelluláris karcinóma, hepatoblasztóma, rabdomioszarkóma, petefészek karcinóma, cervikális karcinóma, tüdő karcinóma, emlőrák, feji és nyak! pikkelyes sejt karcinóma, nyelőcső karcinóma, pajzsrólngy karcinóma, asztrooltőma, gangüoblasztóma vagy neuroblasztóma.
11. Eljárás beteroióg szekvencia tumorban történő in vitro expresszálasára, azzal jellemezve, hogy a tumor sejtbe egy, az 1-5., 7. és 8. igénypontok bármelyike szerinti > <, * Φ !*V vektort bevezetjük.
12. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer rak kezelésére szolgái és a citotoxikus géntermék a díftétia toxín, Pseoöomonas toxln, licín, kolera toxln; retínoblasztóms gén vagy a p53 közül van válsztvs.
13. A 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer rák kezelésére szolgál és a citotoxikus géntermék egy citotoxikus géntermék.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US94360897A | 1997-10-03 | 1997-10-03 | |
PCT/IL1998/000486 WO1999018195A2 (en) | 1997-10-03 | 1998-10-04 | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUP0003745A2 HUP0003745A2 (hu) | 2001-02-28 |
HUP0003745A3 HUP0003745A3 (en) | 2002-04-29 |
HU228470B1 true HU228470B1 (en) | 2013-03-28 |
Family
ID=25479934
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU0003745A HU228470B1 (en) | 1997-10-03 | 1998-10-04 | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6087164A (hu) |
EP (1) | EP1019499B1 (hu) |
JP (3) | JP5153031B2 (hu) |
KR (1) | KR100524262B1 (hu) |
CN (1) | CN1229496C (hu) |
AT (1) | ATE407948T1 (hu) |
AU (1) | AU755774B2 (hu) |
BR (1) | BR9812717B1 (hu) |
CA (1) | CA2308124C (hu) |
CZ (2) | CZ294694B6 (hu) |
DE (1) | DE69840001D1 (hu) |
HU (1) | HU228470B1 (hu) |
IL (1) | IL135430A0 (hu) |
NO (2) | NO328470B1 (hu) |
PL (1) | PL339949A1 (hu) |
RU (1) | RU2214280C2 (hu) |
WO (1) | WO1999018195A2 (hu) |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040006220A1 (en) * | 2002-07-02 | 2004-01-08 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of insulin-like growth factor 2 expression |
US7041654B2 (en) | 1997-10-03 | 2006-05-09 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity |
DE19956568A1 (de) | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
JP2002541822A (ja) * | 1999-04-14 | 2002-12-10 | エム ユー エス シー ファンデーション フォー リサーチ ディベロップメント | 組織特異的および病原体特異的毒性物質ならびにリボザイム |
DE19928342A1 (de) * | 1999-06-21 | 2000-12-28 | Deutsches Krebsforsch | Vektoren zur gentherapeutischen Tumorbehandlung |
US7829693B2 (en) * | 1999-11-24 | 2010-11-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
AU2875602A (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-18 | Univ Pennsylvania | Selection of catalytic nucleic acids targeted to infectious agents |
US8546143B2 (en) | 2001-01-09 | 2013-10-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
US20040005567A1 (en) * | 2002-07-02 | 2004-01-08 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of cyclin-dependent kinase 4 expression |
AU2003241985A1 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-19 | Medinet Co., Ltd. | Dna inducing cancer cell-specific expression and cancer cell-specific expression vector |
US20040180844A1 (en) * | 2003-03-10 | 2004-09-16 | Fesik Stephen W. | Method of killing cancer cells |
US20040220085A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-04 | Jasbir Sandhu | Compositions for nucleic acid delivery |
US20040219099A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-04 | Jasbir Sandhu | Method for the treatment of tumors |
US7482156B2 (en) * | 2003-10-15 | 2009-01-27 | Cell Genesys, Inc. | Hepatocellular carcinoma specific promoter and uses thereof |
US7063947B2 (en) * | 2004-04-08 | 2006-06-20 | Promogen, Inc. | System for producing synthetic promoters |
US7429482B2 (en) * | 2005-01-13 | 2008-09-30 | United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Screening tools for discovery of novel anabolic agents |
CA2614531C (en) | 2005-07-07 | 2015-06-16 | Avraham Hochberg | Nucleic acid agents for downregulating h19, and methods of using same |
JP2009508516A (ja) | 2005-09-22 | 2009-03-05 | イッサム リサーチ ディベロプメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシティ オブ エルサレム | 核酸構築物、薬剤組成物、及び癌治療のためのその使用方法 |
US7928083B2 (en) * | 2007-01-16 | 2011-04-19 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | H19 silencing nucleic acid agents for treating rheumatoid arthritis |
CA2715080C (en) | 2007-09-28 | 2021-09-28 | Intrexon Corporation | Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof |
WO2009053982A1 (en) * | 2007-10-25 | 2009-04-30 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Constructs containing multiple expression cassettes for cancer therapy |
CA2729765A1 (en) | 2008-07-02 | 2010-01-07 | Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. | Artificial kidney precursor and process for production thereof |
EP2379720B1 (en) | 2009-01-20 | 2016-08-17 | Alona Zilberberg | Mir-21 promoter driven targeted cancer therapy |
EA016223B1 (ru) * | 2009-10-07 | 2012-03-30 | Учреждение Российской Академии Наук Институт Молекулярной Генетики Ран | Способ и генная конструкция для высокоспецифичного ингибирования нежелательного роста клеток |
AU2016258326A1 (en) * | 2015-05-05 | 2017-11-23 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd | Nucleic acid-cationic polymer compositions and methods of making and using the same |
JP2021521851A (ja) * | 2018-04-30 | 2021-08-30 | アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド | 遺伝子治療構築物及び使用方法 |
CN110714075B (zh) * | 2018-07-13 | 2024-05-03 | 立森印迹诊断技术(无锡)有限公司 | 一种用于检测肺肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用 |
CN111206093A (zh) * | 2018-11-21 | 2020-05-29 | 立森印迹诊断技术(无锡)有限公司 | 一种用于检测浸润性膀胱癌的标志物及其应用 |
CN109609505A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-04-12 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种体内筛选的剪切rna的锤头状核酶 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2699191B1 (fr) * | 1992-12-16 | 1995-02-10 | Univ Paris Curie | Nouveaux vecteurs rétroviraux, lignées cellulaires les contenant, et leur utilisation dans le traitement des tumeurs. |
US5631236A (en) * | 1993-08-26 | 1997-05-20 | Baylor College Of Medicine | Gene therapy for solid tumors, using a DNA sequence encoding HSV-Tk or VZV-Tk |
IL108879A (en) * | 1994-03-07 | 2000-08-31 | Yissum Res Dev Co | Diagnostic assay for malignancies using the H19 gene and kit |
FR2723697B1 (fr) * | 1994-08-17 | 1996-09-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de traitement de la restenose par la therapie genique |
FR2725213B1 (fr) * | 1994-10-04 | 1996-11-08 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique |
-
1998
- 1998-10-01 US US09/165,240 patent/US6087164A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 AU AU94571/98A patent/AU755774B2/en not_active Expired
- 1998-10-04 KR KR10-2000-7003609A patent/KR100524262B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-10-04 EP EP98947759A patent/EP1019499B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 CN CNB988118335A patent/CN1229496C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 CZ CZ20001201A patent/CZ294694B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-10-04 HU HU0003745A patent/HU228470B1/hu unknown
- 1998-10-04 WO PCT/IL1998/000486 patent/WO1999018195A2/en active IP Right Grant
- 1998-10-04 IL IL13543098A patent/IL135430A0/xx active IP Right Grant
- 1998-10-04 RU RU2000111553/14A patent/RU2214280C2/ru active
- 1998-10-04 DE DE69840001T patent/DE69840001D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 JP JP2000514993A patent/JP5153031B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 PL PL98339949A patent/PL339949A1/xx unknown
- 1998-10-04 CZ CZ2004741A patent/CZ294941B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-10-04 BR BRPI9812717-9A patent/BR9812717B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-10-04 CA CA002308124A patent/CA2308124C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 AT AT98947759T patent/ATE407948T1/de not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-31 NO NO20001684A patent/NO328470B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-05-10 US US09/568,059 patent/US6306833B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-05-24 JP JP2006144648A patent/JP2006304801A/ja not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-10-18 JP JP2007270777A patent/JP2008136480A/ja active Pending
-
2009
- 2009-10-22 NO NO20093194A patent/NO331723B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU228470B1 (en) | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity | |
JP2003265193A (ja) | 組換えp53アデノウイルス | |
EP3371315B1 (en) | Phagemid vector | |
EP3388522A1 (en) | Antitumor composition comprising gm-csf gene, flt3l-trail fusion gene, shrna inhibiting tgf- expression, and shrna inhibiting hsp expression | |
CN112639108A (zh) | 治疗非综合征性感觉神经性听力损失的方法 | |
JP6608284B2 (ja) | 癌の治療に使用されるrnaトランススプライシング分子(rtm) | |
WO2016030501A1 (en) | Synthetic alu-retrotransposon vectors for gene therapy | |
JP2002543792A (ja) | ベクターによるトランスポゾン配列の供給及び組込み | |
JP2005506386A (ja) | 腫瘍特異的細胞傷害性を誘導するための方法および組成物 | |
JP4528446B2 (ja) | 前立腺特異的膜抗原遺伝子のイントロン3を含む調節構築物 | |
CN113874512A (zh) | 诱导毛细胞分化的组合物和方法 | |
WO2022167009A1 (zh) | 靶向Aqp1 mRNA的sgRNA及其载体与应用 | |
US6677152B2 (en) | Reversal of cancer phenotype by inhibiting expression of prostate tumor inducing gene | |
Frederiksen et al. | Gene therapy for lung cancer | |
WO1999050411A2 (en) | Tumour-specific expression control region and the use thereof | |
KR102471898B1 (ko) | 면역관문 억제제를 발현하는 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 | |
JP2023521383A (ja) | Krasの阻害のためのrna干渉およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する方法および組成物 | |
WO2023060248A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of p53-mediated cancers | |
US8502015B1 (en) | Method of inducing cancer | |
CN116568283A (zh) | 用于治疗前庭神经鞘瘤相关症状的抗vegf抗体构建体和相关方法 | |
CN117836420A (zh) | 重组tert编码病毒基因组和运载体 | |
MXPA00003251A (en) | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity | |
IL135430A (en) | Use of a polynucleotide capable of expressing a cytotoxic gene product in the production of a pharmaceutical composition for treating tumors | |
Lee | hTERT or AFP promoter specific expression of HSV-tk induces apoptosis in tumor cells | |
WO2003006621A2 (en) | Super osteocalcin promoter for the treatment of calcified tumors and tissues |