BR9812717B1 - vetor para expressar uma seqüência em uma célula de tumor, e, vetor para expressar uma seqüência heterológa em uma célula de tumor. - Google Patents

Description

"VETOR PARA EXPRESSAR UMA SEQÜÊNCIA EM UMA CÉLULA DETUMOR, E, VETOR PARA EXPRESSAR UMA SEQÜÊNCIAHETERÓLOGA EM UMA CÉLULA DE TUMOR".

1. Campo da invenção

A invenção se situa no campo da biologia das células detumores e do tratamento do câncer. Mais especificamente, a invenção serefere à expressão específica de genes heterólogos, e particularmente a genesque codificam produtos citotóxicos, em células tumorosas.

2. Fundamentos da invenção

2.1 O gene H19

O gene Hl9 é um dos poucos genes conhecidos como sendoimpressos em humanos (Hurst et al., 1996, Nature Genetics 12: 234-237).No princípio imediato da embriogênese, o Hl9 é expresso de ambos os aleloscromossômicos (DeGroot et al., 1994, Trophoblast 8: 285-302). Pouco após,ocorre o silenciamento do alelo paterno, e só o alelo materno herdado étranscrito.

O Hl9 é expresso abundantemente durante a embriogênese, efoi identificado pela primeira vez como um gene que foi reguladocoordenadamente com alfa-fetoproteína no fígado pelo locus raf com atuaçãotrans (Pachnis et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 5523-5527).Adicionalmente, o Hl 9 foi clonado independentemente por uma quantidadede grupos que utilizam filtros visando isolar genes expressados durante adiferenciação do tecido. Por exemplo, Davis et al. (1987, Cell 51: 987-1000)identificaram o homólogo de camundongo do Hl9 em um filtro para genesprecocemente ativos durante a diferenciação de células C3H10T1/2. Pourieret al. (1991, Development 113: 1105-1114) verificou que o Hl9 murino foiexpresso durante a diferenciação e no momento da implantação Atranscrição do gene humano Hl9 também foi descoberta na diferenciação decitotrofoblastos da placenta humana (Rachmilewitz et ai, 1992, Molec.

Reprod. Dev. 32: 196-202).

Enquanto a transcrição de RNA do Hl9 ocorre numaquantidade de diferentes tecidos embriônicos através da vida fetal e dodesenvolvimento da placenta, a expressão do Hl 9 é regulada para baixo pós-natalmente. No entanto, foram reportados níveis relativamente baixos detranscrição de Hl9 no fígado e no músculo adultos murinos (Brunkow eTilghman, 1991, Genes & Dev. 5: 1092-1101). O Hl9 também é ativado pós-natalmente em células cancerosas. Ariel et al. (1997, Molec. Pathol. 50: 34-44) demonstrou a expressão de Hl9 numa quantidade de tumores que surgemdos tecidos em que o mesmo é expreso pré-natalmente. Adicionalmente, estesautores verificaram RNA de Hl9 em tumores derivados de tecidos neurais,em particular o astrocitoma e o ganglioneuroblastoma, que não sãoconhecidos como sendo associados com a expressão do Hl9. Dado umgrande conjunto de cânceres que expressam RNA de H19, estes autoresespecularam que o Hl9 possui um RNA oncofetal e propuseram investigar oHl9 como um marcador de tumor para a neoplasia humana.

Tanto os genes de Hl9 humanos e murinos foram clonados eseqüenciados (Brannan et ai, 1990, Molec. Celi Bioi 10: 28-36). Acomparação dos genes Hl9 de humanos e de camundongos revelou umaidentidade global de 77 % da seqüência de nucleotídeos. Apesar destaconservação da homologia de nucleotídeos entre as espécies, poderia-sepredizer uma identidade de seqüências de aminoácidos deduzida muito baixaa partir das matrizes de leitura aberta dos dois genes (Id.). Além disso,embora o RNA de Hl9 seja transcrito pela RNA polimerase II, emendada epoliadenilada, ele não parece estar traduzido. Em vez disto, verificou-se queο RNA de Hl9 está associado com o RNA citoplásmico 28S, levando àespeculação de que o RNA de Hl9 pode funcionar com um componente deRNA de uma ribonucleoproteína (Jd.).

O papel fisiológico efetivo do Hl9 não é completamentecompreendido. O Hl9 pode atuar como um gene letal dominante; umaexpressão altamente ectópica de um transgene de Hl9 causa letalidade emcamundongos pouco antes do nascimento (Brunkow et al., supra). Esteperíodo letal coincide com o momento em que a transcrição do Hl9 se tornareprimida. Por outro lado, não se observou qualquer defeito tanto emcamundongos heterozigotos ou homozigotos portanto um alelo(s) deknockout de Hl9 (Leighton et al., 1995, Nature 375: 34-39). Um knockout doalelo herdado maternalmente interfere com a impressão do gene IGF-2 ligadogeneticamente e impresso de maneira oposta; os camundongos resultantessão maiores, no nascimento, do que seus pares originais devido à maiorexpressão pré-natal de IGF-2 (Id.). Como estes dois genes impressos demaneira oposta compartilham seqüências reguladoras com atuação eis,Leighton e colegas especularam que o Hl9 pode estar envolvido naimpressão do gene IGF-2.

Outra função proposta para o produto do gene Hl9 é aquela deum RNA supressor de tumor. Hao et al. (1993, Nature 365: 764-767)reportou que a transfecção de duas linhas celulares embrionárias de tumor,RD e G401, com uma construção de expressão de Hl9 resultou em retardo dodesenvolvimento celular, alterações morfológicas e reduzidatumorigenicidade em camundongos nus. Uma tal atividade supressora detumor foi observada como consistente com a letalidade observada daexpressão ectópica em camundongos (Hao et al., supra) bem como o maiortamanho dos camundongos que são knocked-out para o alelo de Hl9 maternal(Leighton et al., supra). No entanto, a proposta de que o Hl9 é um supressorde tumor tem sido controversa. Alguns dos resultados não foramreproduzidos reportadamente, e pode existir outro gene candidato supressorde tumor ligado intimamente ao Hl9 (Ariel et al., supra). O papel propostodo Hl9 como um supressor de tumor também conflita com os dadosexperimentais em que o Hl9 é ativado num amplo conjunto de células detumor (ver, por exemplo, Lustig-Yariv et al., 1997, Oncogene 23: 169-177).

2.2 Os genes de fator de crescimento semelhante à insulina(IGF: Insulin-Like Growth Factor Genes)

O IGF-2 é outro gene impresso cuja expressão depende de suaorigem parental. No entanto, em contraste com o H19, o IGF-2, tanto emcamundongos como em humanos, é impresso maternalmente e, portanto,expresso do alelo herdado paternalmente (Rainier et al., 1993, Nature 363:747-749). O gene de IGF-2 humano apresenta um padrão transcricionalcomplexo. Há quatro promotores de IGF-2 que são ativados em um tecido ede maneira específica no que se refere ao desenvolvimento. Apenas três dospromotores, P2, P3 e P4 são impressos e ativos durante o desenvolvimentofetal e em tecidos de câncer. O quarto, o promotor PI, não é impresso e só éativado no fígado adulto e no plexo coróide (ver Holthuizen et al., 1993, Mol.Reprod. Dev. 35: 391-393). O promotor P3 do gene IGF-2 esteve implicadona progressão da cirrose do fígado e no carcinoma hepatocelular (Kim e Park,1998, J. Korean Med. Sei. 13: 171 -178).

A perda de impressão do IGF-2 esteve implicada no tumor deWilm (Ogawa et al., 1993, Nature 363: 749-751). Esta observação levoumuitos investigadores a especular que a perda de impressão e de expressãobialélica de genes impressos pode estar envolvida em distúrbios docrescimento e no desenvolvimento de câncer (ver também Rainier et al.,1993, Nature 362: 747-749, e Glassman et al., 1996, Câncer Genet.Cytogenet. 89: 69-73).

2.3 Terapia de genes específicos para tumor

As seqüências reguladoras de genes associados com tumortêm sido usadas para objetivar seletivamente a expressão de um gene suicidaem células derivadas de tumor. Por exemplo, a expressão de alfa-fetoproteínaé induzida no carcinoma hepatocelular. Huber et al. (1991, Proc. Natl. Acad.Sc. USA 88: 8039-8043) utilizou seqüências de controle do gene de albuminaou do gene de alfa-fetoproteína para objetivar a expressão do gene detimidina quinase varicela-zoster (VZV TK) codificando seqüências paracélulas de hepatoma. As células de heptaoma infectadas in vitro com umvetor retroviral contendo uma destas construções de expressão expressaramVZV TK e tornaram-se insensíveis à prodroga normalmente não-tóxica, o 6-metoxipurina arabinonucleosídeo (arM). Kaneko et al. (1995, Câncer Res.55: 5283-5287) construiu um vetor adenoviral expressando HSV TK sob ocontrole das seqüências de controle de alfa-fetoproteína. As partículasadenovirais recombinantes contendo este vetor foram injetadas diretamenteem tumores derivados de carcinoma hepatocelular gerados em camundongosnus atímicos. Injeções intraperitoneais subseqüentes com ganciclovircausaram a regressão dos tumores derivados de carcinoma hepatocelular.

Osaki et al. (1994, Câncer Res. 54: 5258-5261) transfectouem células de carcinoma do pulmão A549 uma construção de expressãocontendo as seqüências de controle para o gene de antígenocarcinoembriônico do pulmão ligado à seqüência codificante para a timidinaquinase do vírus do Herpes simplex (HSV TK). As células transfectadasmostraram-se sensíveis ao ganciclovir. Adicionalmente, o crescimento detumor em ratos nus a partir de células transfectadas injetadassubcutaneamente foi inibido através de repetidas injeções intraperitoneais deganciclovir. No entanto, o gene de antígeno carcionembriônico foi descritorecentemente como expresso na mucosa colônica normal, limitando, destaforma, a utilidade destas seqüências de controle como regiões reguladorasespecíficas para tumor (Osaka et al, supra). Assim, existe a necessidade dodesenvolvimento de vetores de terapia de genes que expressemespecificamente produtos de genes em células de tumor.

3. Sumário da invenção

A invenção refere-se a processos e composições para induzir aexpressão seletiva de genes heterólogos em células de tumor. Em particular, ainvenção refere-se a polinucleotídeos que compreendem uma seqüênciatranscricional reguladora ligada operativamente a genes heterólogos queresulta na expressão específica para tumor dos genes heterólogos. Maisparticularmente, a seqüência transcricional reguladora deriva-se de um geneimpresso genomicamente que é expresso especificamente em células de câncer, como o Hl9, e os promotores IGF-2, PR3 e P4, e o gene heterólogocodifica uma proteína citotóxica ou produto de gene citostático. Em outraconcretização da invenção, o promotor IGF-I é ligado operativamente a umgene heterólogo de modo a resultar na expressão específica-para-tumor dogene. As seqüências reguladoras direcionarão a expressão de genes numaquantidade de diferentes tipos de células cancerosas. Esses processos ecomposições são úteis no tratamento de uma ampla variedade de cânceres ede condições hiperproliferativas.

Um aspecto da invenção consiste de vetores de expressãocontendo polinucleotídeos compreendendo esse tipo de regiões reguladoras ligadas operativamente a genes heterólogos. Regiões reguladorasparticularmente preferidas são aquelas que codificam regiões reguladoras deH19, como seqüências de intensificador e promotor, o promotor IGF-2 P3 ouP4 ou um promotor IGF-1. Em conexão com isto, o intensificador de Hl9 esuas porções ativas podem ser usados em qualquer combinação com o promotor de H19, promotor IGF-1, promotor IGF-2 P3 ou promotor IGF-2P4. Também são abrangidas pela invenção as células hospedeiras que contêmesses vetores. Com relação a isto, uma construção de expressão contendo umgene heterólogo controlado pelo promotor de Hl9 com um semintensificador de Hl9 pode ser co-introduzida numa célula com uma segundaconstrução contendo um gene heterólogo controlado pelo promotor IGF-I oupromotor IGF-2 P3 ou P4 em combinação com o intensifícador de II19... Emoutro aspecto, a invenção proporciona processos para se utilizar esse tipo devetores para expressar genes heterólogos em células de tumor. Ainda outroaspecto da invenção consiste do tratamento de câncer utilizando os vetores dainvenção na terapia de genes.

4. Breve descrição das figuras

Figura 1A-1C. A seqüência de nucleotídeos da região dopromotor de Hl9 humano. A região promotora da posição de nucleotídeos -837 a -7 (relativamente ao início da transcrição) e mostrada (SEQ ID NO: 1).

Figura 2. Diagrama esquemático dos vetores utilizados paraexpressar um gene heterólogo sob o controle de seqüências reguladoras deH19.

Figura 3A-3E. Seqüência reguladoras de Hl9 direcionam aexpressão de um gene heterólogo (CAT) em linhas de células cancerosas dabexiga. Para as cinco diferentes linhas de células indicadas, a atividadeespecífica de CAT (cpm^g proteína) é plotada como uma função do vetorutilizado para transfecção. Figura 3A: células HT-1376. Figura 3B: célulasEJ28. Figura 3C: células T24P. Figura 3D: células 1197. Figura 3E: célulasUM-UC-3. Os vetores, como a seguir, são descritos mais plenamente abaixona seção 6: (1) pCAT-básico; (2) pCAT-controle; (3) PHl9E; (4)pH19EH19D; e (5) pH19EH19R.

Figura 4A-4E. Os promotores IGF-2 P3 e P4 direcionam aexpressão de um gene heterólogo (Luciferase) em linhas de célulascancerosas da bexiga. Para as cinco diferentes linhas de células mostradas, aatividade específica de luciferase (contagem por μg de proteína) é plotadacomo uma função do promotor IGF-2 utilizado na construção transfectadapara direcionar a expressão de luciferase. Figura 4A: células T24P. Figura4B: células 1376. Figura 4C: células UM-UC3. Figura 4D: células 1197.Figura 4E: células EJ28. Os vetores são descritos de maneira mais completaabaixo, na seção 10.

Figura 5. Seqüência de nucleotídeos de um fragmento depromotor de Hl9 humano (SEQ ID NO: 2).

Figura 6. Seqüência de nucleotídeos do fragmento deintensificador de Hl9 com 0,9 kb (SEQ ID NO: 3).

Figura 7A e 7B. Seqüência de nucleotídeos do fragmento deintensificador de Hl9 com 2 kb (SEQ ID NO: 4).

Figura 8A-8C. Seqüencia de nucleotídeos do fragmento depromotor de Hl9 com 4 kb (SEQ ID NO: 5).

Figure 9A-9. Transfecção com vetores contendo váriascombinações de região reguladora de Hl9 e promotor P4 direciona aexpressão de luciferase em células de tumor. Figura 9A: células 5637. Figura9B: células Huh7. Figura 9C: células 293T.

Figura 10A-10E. Transfecção com vetores contendo regiõesreguladoras de Hl9 direcionam a expressão de luciferase em células detumor. Figura 10A: células 293T. Figura 10B: células T24P. Figura 10C:células Huh7. Figura 10D: células 5637. Figura 10E: células RTl 12.

5. Descrição detalhada da invenção

A invenção baseia-se, em parte, na verificação de que as

regiões reguladoras de genes impressos genomicamente que são expressosem células cancerosas podem ser usados para objetivar a expressão deseqüências codificantes de interesse em células cancerosas. Em particular,verificou-se que a expressão de Hl9 é ativada em um amplo conjunto decarcinomas, incluindo, porém sem limitar-se, ao carcinoma da bexiga,carcinoma hepatocelular, hepatoblastoma, rabdomiossarcoma, carcinoma doovário, carcinoma cervical, carcinoma do pulmão, carcinoma do seio,carcinoma de células esquamosas na cabeça e no pescoço, carcinomaesofagal, carcinoma da tiróide, astrocitoma, ganglioblastoma eneuroblastoma. Além disso, verificou-se que construções contendo as regiõespromotoras de Hl9 ligadas operativamente a um gene heterólogo, ou opromotor IGF-2 P3 ou P4 ligado operativamente a um gene heterólogo, ouconstruções contendo um tal promotor em combinação com umintensificador de Hl9 a jusante, são especificamente ativadas em células detumor. Em outro aspecto da invenção, utiliza-se um promotor IGF-I paradirecionar a expressão do gene heterólogo.

Correspondentemente, em um de seus aspectos, a invençãoproporciona processos e composições para alterar o fenótipo de, ou eliminarseletivamente, células cancerosas. Este objeto é realizado fornecendo-se àscélulas um polinucleotídeo compreendendo as regiões reguladoras de genesimpressos genomicamente que são expressos em células cancerosas ligadooperativamente a um gene heterólogo. O gene heterólogo pode codificar, porexemplo, um agente citostático ou citotóxico (p. ex., uma toxina, um RNAanti-sentido ou uma ribozima).

As regiões reguladoras de genes impressos genomicamenteque são expressas em células de câncer incluem, porém sem limitar-se, ointensificador e promotor de Hl 9, e o promotor IGF-2 P3 e P4.

Para os fins da invenção aqui descrita, o termo "ligadooperativamente" significa que uma seqüência de nucleotídeos está ligada auma seqüência reguladora de uma maneira que permite a expressão daseqüência de nucleotídeos a ser direcionada pela seqüência reguladora.

Uma seqüência de genes "heteróloga" refere-se, para os finsdo presente pedido, a uma seqüência de gene que não está ligadaoperativamente, de modo normal, às seqüências reguladoras do gene Hl9.Geralmente, as seqüências heterólogas de gene incluem seqüências quecodificam produtos de gene citotóxicos e citostáticos.

Como usado aqui, o termo "expressão" refere-se à transcriçãodo DNA de interesse, e ao splicing, processamento, à estabilidade, e,opcionalmente, à tradução da correspondente transcrição de mRNA.Dependendo da estrutura da molécula de DNA fornecida, a expressão podeser transiente ou contínua.

5.1 Seqüências reguladoras do gene H19, dos promotoresIGF-2 P3 e P4 e do promotor IGF-I

Encontram-se descritas aqui as seqüências reguladoras de Hl9que podem ser usadas para direcionar a expressão específica para célula detumor de uma seqüência codificante heteróloga. Estas seqüências reguladorasde Hl9 incluem a região do promotor de Hl9 a montante e/ou a região dointensificador de Hl9 a jusante. A seqüência de nucleotídeos de uma regiãode promotor de Hl9 é mostrada na figura IA-IC (SEQ ID NO: 1). Estaseqüência de 830 nucleotídeos estende-se desde os nucleotídeos -837 até -7do sítio de terminação (como descrito em Brannan et al., supra). Umaseqüência TATA de consenso ocorre nos nucleotídeos -27 até -35. Dois sítiosAP2 de consenso (8/9 pareamentos) ocorrem a aproximadamente -500 e -40nucleotídeos a montante do início de transcrição. Quando dispostos amontante da região codificante para um gene heterólogo, conforme discutidomais detalhadamente abaixo, aproximadamente 830 pares de bases da regiãoreguladora são suficientes para direcionar a expressão do gene heterólogoligado operativãmente em células de câncer que também expressam Hl9endógeno. Adicionalmente, outra região de promotor de Hl9 entre osnucleotídeos -819 a +14 (Figura 5, SEQ ID NO: 2) também é suficiente paradirecionar a expressão do gene heterólogo ligado operativamente em célulasde câncer.

A região intensificadora a jusante do gene Hl9 humano podeser opcionalmente adicionada a uma construção promotor de H19/geneheterólogo com o fim de proporcionar níveis incrementados de expressãoespecífica para células de tumor. Como descrito mais plenamente abaixo eilustrado a título de exemplo na seção 6, a região intensificadora a jusante éabrangida num fragmento de restrição SacI estendendo-se de +6 kb até +11kb relativamente ao sítio de início de transcrição. Como esperado de umaseqüência de intensificador, o intensificador a jusante é capaz de exercer seuefeito quando colocado tanto em orientação reversa como em orientaçãodireta (relativamente à orientação do intensificador de Hl9 no gene Hl9endógeno) a justante da região codificante de um gene heterólogo sob ocontrole do promotor Hl 9. Adicionalmente, fragmentos deste intensificadorcontendo as seqüências como mostrado nas figuras 6, 7 A, 7B e 8A-8C (SEQID NOS: 3-5) também podem ser usados para facilitar a expressão do gene.

A expressão do gene IGF-I tem sido associada com o câncerdo pulmão e o câncer do seio. O promotor IGF-I (seqüência de nucleotídeosentre os nucleotídeos de 1 a 1630 na seqüência de genes de IGF-I humana(número de registro Genbank M12659 M77496 incorporada aqui porreferência; Rotwein eí a/., 1986, J. Biol. Chem. 261: 4828-4832).

O produto de gene IGF-2 é expresso utilizando-se uma dequatro regiões de promotor diferentes. Três destes quatro promotores sãoimpressos e são expressos em tecidos embriônicos; contudo, o promotor Plsó é ativado em tecidos adultos (Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2: 1-9). O promotor P3 foi implicado no hepatocarcinoma. Verificou-se também que o promotor P4 impresso (seqüência de nucleotídeos de -546 a +102 dogene IGF-2 gene) e o promotor P3 (seqüência de nucleotídeos de -1229 a+140 do gene IGF-2) são ativados em células do câncer da bexiga humana, epodem ser usados para direcionar a expressão de um gene heterólogo ligadooperativamente a células de tumor. Os promotores IGF-2 P3 e P4 podem ser utilizados em combinação com o intensificador de Hl9 ou seus fragmentosativos.

Estas seqüências reguladoras de genes genomicamenteimpressos e não-impressos que são expressas em células de câncer podem serainda mais delineadas para definir as seqüências reguladoras mínimasrequeridas de modo a se obter a desejada expressão específica para tumor.Por exemplo, a região promotora pode ser alterada com adições, substituiçõesou deleções, e analisada quanto à retenção da função de expressão específicapara tumor. Várias porções do intensificador de Hl9 a jusante podem sertestadas individualmente quanto à capacidade de intensificar a transcrição dopromotor de H19.

Pode-se gerar alterações nas seqüências reguladorasutilizando-se uma variedade de processos químicos e enzimáticos que sãobem conhecidos por aqueles versados na arte. Por exemplo, as regiões dasseqüências definidas por sítios de restrição podem ser deletadas. Pode-seempregar a mutagênese direcionada para oligonucleotídeo de modo a alterara seqüência de uma maneira definida e/ou introduzir sítios de restrição emregiões específicas dentro da seqüência. Adicionalmente, pode-se gerarmutantes de deleção utilizando-se DNA nucleases, como a Bal31 ou ExoIII eSl nuclease. Deleções progressivamente maiores nas seqüências reguladorassão geradas incubando-se o DNA com nucleases para períodos maiores detempo (ver, Ausubel et al., 1989, Current Protocols for Molecular Biology,para uma revisão de técnicas de mutagênese).

As seqüências alteradas são avaliadas quanto à sua capacidadede direcionar a expressão específica-para-tumor de seqüências codificantesheterólogas em células hospedeiras apropriadas, particularmente célulasderivadas de carcinoma expressando Hl9 (p. ex., células do carcinoma dabexiga, apenas para citar um exemplo). Encontra-se dentro do escopo dapresente invenção que quaisquer seqüências reguladoras alteradas que retêmsua capacidade de direcionar expressão específica-para-tumor sejamincorporadas em vetores de expressão recombinante para uso ulterior.

Uma ampla variedade de genes heterólogos pode ser expressasob o controle destas seqüências reguladoras, como genes que codificamprodutos de gene tóxicos, produtos de gene potencialmente tóxicos, eprodutos de gene citostáticos ou de antiproliferação. Genes marcadorestambém podem ser expressos, incluindo enzimas (p. ex., CAT5 beta-galactosidase, luciferase), proteínas fluorescentes, como a proteínafluorescente verde, ou marcadores fluorescentes.

Os produtos de gene citotóxicos são amplamente definidospara incluir toxinas e agentes indutores de apoptose. Adicionalmente, para osfins da invenção, os produtos de gene citotóxicos incluem enzimasmetabolizadoras de drogas que convertem uma prodroga num produtocitotóxico. Exemplos de produtos de gene citotóxicos que podem ser usadosem processos da invenção compreendem a toxina da difteria, toxina dePseudomonas, ricina, toxina do cólera, genes supressores de tumor e PE40,como o gene do retinoblastoma e p53. Adicionalmente, pode-se adicionarseqüências codificando peptídeos apoptódicos que induzem a apoptose decélulas. Esses peptídeos apoptósicos incluem o peptídeo A beta de Alzheimer(ver LaFerla et al, 1995, Nat. Genet. 9: 21-30), o peptídeo natriurético atrial(Ver Wu et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 14860-14866), o peptídeorelacionado com o gene de calcitonina (Ver Sakuta et al., 1996, J.Neuroimmunol. 67: 103-109), bem como outros peptídeos apópticosconhecidos ou a serem descobertos.

As enzimas metabolizadoras de drogas que convertem umaprodroga num produto citotóxico incluem a timidina quinase (dos vírus doherpes simplex ou da varicela zóster), citosina deaminase, nitrorredutase,citocromo p-450 2B1, timidina fosforilase, nucleosídeo fosforilase purina,fosfatase alcalina, carboxipeptidases A e G2, linamarase, λ-lactmase exantina oxidase) ver Rigg e Sikora, agosto de 1997, Mol. Med. Today, pp.359-366 como fundo). Adicionalmente, oligonucleotídeos anti-sentido,antigene, ou aptaméricos podem ser fornecidos a células de câncerutilizando-se as construções de expressão presentemente descritas. Asribozimas ou RNA de filamento único também podem ser expressos na célulade câncer para inibir a expressão de um gene particular de interesse. Os genespara estas moléculas anti-sentido ou de ribozima deveriam ser aqueles quecodificam produtos de gene que são essenciais para a manutenção da célulaou para a manutenção do fenótipo de célula cancerosa. Esses genes-alvoincluem, embora sem limitar-se, cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyclinDl,cyclinE, cyclinA e cdk4.

Por exemplo, vetores que expressam, sob o controle deseqüências reguladoras de genes impressos ou promotor IGF-I que sãoexpressos em células de câncer, RNAs anti-sentido ou ribozimas específicaspara as transcrições das formas oncogênicas de p53, c-fos, c-jun, Kr-ras e/ouHer2/neu, são introduzidos em células com o fim de regular para baixo aexpressão dos genes endógenos. As células de tumor que expressam Hl9, eque podem ativar as seqüências reguladoras de Hl9 (ou que ativamespecificamente IGF-1, o promotor IGF-2 P3 ou P4) podem ser alvejadasespecificamente para a expressão do RNA anti-sentido ou RNA de ribozima.

As abordagens anti-sentido envolvem o projeto deoligonucleotídeos (neste caso, mRNA) que são complementares para omRNA-alvo. Os oligonucleotídeos anti-sentido ligar-se-ão às transcriçõescomplementares de mRNA-alvo e impedirão a tradução. Acomplementaridade absoluta, embora preferida, não é necessária. Umaseqüência "complementar" a uma porção de um RNA, como referido aqui,significa uma seqüência com suficiente complementaridade para ser capaz dehibridizar com o RNA, formando um duplex estável. A capacidade dehibridizar dependerá tanto do grau de complementaridade como docomprimento do ácido nucleico anti-sentido. Geralmente, quanto maiscomprido o ácido nucleico hibridizador, tanto mais inpareamentos de basescom um RNA ele poderá conter e ainda formar um duplex estável (ou triplex,conforme o caso). Alguém versado na arte poderá avaliar um grau tolerávelde inpareamento utilizando procedimentos convencionais para determinar oponto de fusão do complexo hibridizado.

Os oligonucleotídeos que são complementares à ponta 5' damensagem-alvo, p. ex., a seqüência não-traduzida a 5' até, e incluindo, ocódon de iniciação AUG, deveriam atuar da maneira mais eficiente nainibição da tradução. No entanto, seqüências complementares às seqüênciasnão-traduzidas a 3' dos mRNAs mostraram recentemente que também sãoefetivas para inibir a tradução de mRNAs. Ver, geralmente, WagnerR, 1994,Nature, 372: 333-335. Assim, os oligonucleotídeos complementares a cadauma das regiões não-codificantes, não-traduzidas a 5' ou 3', das transcriçõesde gene-alvo poderiam ser usados em uma abordagem anti-sentido para inibira tradução de genes endógenos. Os oligonucleotídeos complementares àregião não-traduzida em 5' do mRNA deveriam incluir o complemento docódon de início AUG. Os oligonucleotídeos anti-sentido complementares àsregiões codificantes de mRNA são inibidores menos eficientes de tradução,porém deveriam ser utilizados de acordo com a invenção. Caso projetadospara hibridizar com a região a 5', 3' ou codificante do mRNA-alvo, os ácidosnucleicos anti-sentido deveriam apresentar um comprimento de pelo menosseis nucleotídeos e são, de preferência, oligonucleotídeos que abrangem umcomprimento de 6 a cerca de 50 nucleotídeos. Em aspectos específicos, ooligonucleotídeo tem pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 17nucleotídeos, pelo menos 25 nucleotídeos ou pelo menos 50 nucleotídeos.

Independentemente da escolha da seqüência-alvo, prefere-serealizar primeiramente estudos in vitro para quantificar a capacidade de ooligonucleotídeo anti-sentido inibir a expressão do gene. Estes estudosdeveriam utilizar controles que distinguem entre inibição de genes anti-sentido e efeitos biológicos não-específicos de oligonucleotídeos. Prefere-setambém que estes estudos comparem níveis da proteína ou RNA-alvo comaqueles de uma proteína ou RNA de controle interno.

As moléculas de ribozima projetadas para clivarcataliticamente um gene-alvo essencial também podem ser utilizadas paraimpedir a tradução de mRNA-alvo. (Ver, p. ex., Publicação InternacionalPCT W090/11364, publicado em 4 de outubro de 1990; Sarver et al, 1990,Science, 247: 1222-1225). Quando a ribozima é específica para umatranscrição de gene codificando uma proteína essencial para odesenvolvimento da célula cancerosa, essas ribozimas podem causar areversão de um fenótipo de célula cancerosa. Embora as ribozimas queclivam mRNA em seqüências de reconhecimento específicas-para-sítiopossam ser usadas par destruir mRNAs-alvo, prefere-se o uso de ribozimascabeça-de-martelo. Ribozimas cabeça-de-martelo clivam mRNAs em locaisditados por regiões flanqueadoras que formam pares de basescomplementares com o mRNA-alvo. A única exigência é que o mRNA-alvotenha a seguinte seqüência de duas bases: 5'-UG-3'. A construção e aprodução de ribozimas cabeça-de-martelo é bem conhecida na arte e édescrita de forma mais completa em Haseloff e Gerlach 1988, Nature, 334:585-591. De preferência, a ribozima é manipulada de modo que o sítio dereconhecimento de clivagem seja localizado próximo da ponta 5' do mRNA-alvo; i.e., para aumentar a eficiência e minimizar o acúmulo intracelular detranscrições de mRNA não-funcional.

As ribozimas para uso na presente invenção também incluemRNA endorribonucleases (daqui em diante denominadas "ribozimas de tipoCech ") como aquela que ocorre naturalmente em Tetrahymena thermophila(conhecida como a IVS, ou L-19 IVS RNA) e que foi extensivamentedescrita por Thomas Cech e colaboradores (Zaug et al., 1984, Science, 224:574-578; Zaug e Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug et al., 1986,Nature, 324: 429-433; Pedido Internacional de Patente publicado n° WO88/04300 por University Patents Inc.; Been e Cech, 1986, Cell1 47: 207-216).As ribozimas tipo Cech apresentam um sítio ativo de oito pares de bases quehibridiza a uma seqüência de RNA-alvo, após o que ocorre a clivagem doRNA-alvo. A invenção contempla o uso dessas ribozimas tipo Cech quealvejam seqüências de sítio ativo com oito pares de bases que estão presentesem genes-alvo.

5.2 Ativação de genes em células de tumor

As células que reativam a expressão de gene impresso tambémserão capaze sde ativar especificamente as construções de expressãocontendo esse tipo de regiões reguladoras de genes impressos ligadosoperativamente a um gene heterólogo. Essas células, particularmente célulasde tumor, são alvos apropriados para os processos de terapia de genes dainvenção. A expressão específica para IGF-2 P3 e P4, H19, tanto em tumorescomo em linhas de células, pode ser determinada utilizando-se técnicas deanálise de RNA, hibridização in situ, e construções de gene repórter.Adicionalmente, as células de tumor com expressão de gene de IGF-I ativadapode ser determinada semelhantemente e objetivada na terapia de genesutilizando-se o promotor IGF-I para direcionar a expressão de um geneheterólogo.

Para a maior parte das aplicações de análise de RNA, umasonda marcada que hibridiza especificamente à transcrição de gene deinteresse é preparada utilizando-se qualquer número de técnicas bemconhecidas na arte. A sonda marcada pode conter pelo menos 15-30 basescomplementares à seqüência de nucieotídeos de H19, e, maispreferivelmente, contém pelo menos 50 a 150 bases complementares àtranscrição de H19. Uma sonda de hibridização particularmente preferidapara a expressão de Hl9 é um polinucleotídeo complementar à ponta 3' damensagem de Hl9 de aproximadamente 800 pares de bases a montante dosítio poli A ao sítio poli A.

Em uma concretização específica da invenção, ilustradaabaixo a título de exemplo de trabalho, uma sonda marcada de RNA anti-sentido é gerada in vitro utilizando-se um plasmídeo de expressão T7 ou T3.As sondas Hl9 também podem ser marcadas por meio de priming randômicona presença de nucleotídeo marcado, por exemplo, utilizando-se o kit Prime-It (Stratagene, La Jolla, CA; número de catálogo 300392). Alternativamente,pode-se gerar sondas marcadas numa reação de PCR utilizando-se um clonede cDNA da região codificante de Hl9 e iniciadores projetados para ampliara região da região codificante, ou por meio de uma reação de tradução de nickconvencional.

Os marcadores apropriados para sondas de polinucleotídeosincluem os nucleotídeos que incorporam isótopos radioativos (como 35S e32P), fluorescentes, luminescentes e marcadores coloridos, e porçõesenzimáticas.

A sonda marcada é hibridizada in situ a uma amostra de tecidoou célula utilizando-se técnicas convencionais, como descritas abaixo comum exemplo de trabalho, e no pedido de patente norte-americano copendentecom número de série U.S. 08/704.786, incorporado aqui por referência.Alternativamente, sendo possível obter uma quantidade suficiente de célulasapropriadas, pode-se realizar análise de RNA convencional (como análiseNorthern, proteção de RNase ou extensão de iniciador) para se determinar onível de expressão de mRNA do gene de interesse.

Adicionalmente, é possível realizar esse tipo de análises deexpressão de gene in situ, i.e. diretamente em seções de tecido (fixadas e/oucongeladas) do tecido do paciente obtido de biópsias ou ressecções, de modoque não é necessária qualquer purificação de ácido nucleico. Os reagentes deácido nucleico, como aqueles descritos acima podem ser usados como sondase/ou iniciadores para esse tipo de procedimentos in situ. (Ver, por exemplo,Nuovo, G.J., 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications",Raven Press, NY).

Um processo alternativo para se determinar se um tipo decélula ou tumor é capaz de ativar especificamente construções de expressãocontendo as regiões de regulação particulares ligadas operativamente a umgene heterólogo consiste em transfectar efetivamente essas construções deexpressão na célula. Para estes fins, o gene heterólogo é, de preferência, umproduto de gene marcador. Um resultado positivo numa análise para oproduto de gene marcador revela que a célula ou linha de células é capaz deativar expressão das regiões reguladoras.

Utilizando-se estas técnicas, os tipos exemplares de tumorcom expressão de Hl9 ativado são os seguintes:

A. Tumores sólidos pediátricos

1. tumor de Wilm

2. hepatoblastoma

3. rabdomiossarcoma embrional

B. Tumores de célula germinal e tumores trofoblásticos

1. tumores de célula germinal testicular

2. teratoma imaturo do o vário

3. tumor sacrococical

4. coriocarcinoma

5. tumores trofoblásticos de sítio placental

C. Tumores epiteliais do adulto

1. carcinoma da bexiga

2. carcinoma hepatocelul μΓ

3. carcinoma ovário

4. carcinoma cervical

5. carcinoma do pulmão

6. carcinoma do seio

7. carcinoma de células esquamosas na cabeça e pescoço

8. carcinoma esofagal

9. carcinoma da tiróide

D. Tumores neurogênicos1. atrocitoma

2. ganglioblastoma

3. neuroblastoma

Correspondentemente, os cânceres acima são tratáveis com osprocessos da invenção.

Efetivamente, quaisquer tumores que ativam a expressão deHl9 podem ser tratados com os processos da invenção.

Adicionalmente, as técnicas previamente indicadas podem seraplicadas para se determinar tumores que ativam o IGF-1, e os promotoresIGF-2 P3 e P4. Esses tumores também são tratáveis com os processos dainvenção. Por exemplo, o IGF-2 é ativado em tumores da infância, como ostumores de Wilm, rabdomiossarcomas, neuroblastomas e hepatoblastomas.

5.3 Processos para introduzir polinucleotídeos sob ocontrole de seqüências reguladoras em células hospedeiras

A invenção também se refere a uma célula hospedeiratransfectada com polinucleotídeos contendo regiões reguladoras ligadasoperativamente a um gene heterólogo. Essas células hospedeiras podem sermantidas em cultura ou podem ser parte de um animal, de preferência ummamífero. Os polinucleotídeos de interesse são inseridos, tipicamente, numaampla variedade de vetores que são subseqüentemente fornecidos utilizando-se os processos c materiais presentemente descritos. Esses vetores podem serproduzidos utilizando-se técnicas de biologia molecular bem estabelecidas(ver, geralmente, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning vols. I-III, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, e CurrentProtocols in Molecular Biolgv (1989) John Wiley & Sons, todos os volumes,e suas atualizações periódicas, incorporados aqui por referência).Tipicamente, onde a tradução é desejada, os genes heterólogos de interessetambém serão manipulados de modo a compreenderem uma seqüênciaadequada de poliadenilação a 3', se necessário.5.3.1 Células cultivadas

As células hospedeiras com polinucleotídeos contendo regiõesreguladoras de gene impressas ligadas operativamente a um gene heterólogopodem consistir de qualquer célula procariótica ou eucariótica. Ligando opolinucleotídeo numa construção de gene, como um vetor, e transformandoou transfectando em células hospedeiras, tanto eucarióticas (levedura, deaves, insetos ou mamíferos) como procarióticas (células bacterianas), sãoprocedimentos convencionais amplamente utilizados nas tecnologiasmicrobianas ou de cultura de tecidos.

Os vetores adequados para o cultivo dos polinucleotídeos emcélulas bacterianas, como E. coli, incluem plasmídeos dos tipos: plasmídeosderivados de pBR322, plasmídeos derivados de pEMBL, plasmídeosderivados de pEX, plasmídeos derivados de pBTac, e plasmídeos derivadosde pUC. Para a replicação na levedura, os plasmídeos YEP24, YIP5, YEP51,pYES2 e YRP17 são veículos de clonagem e expressão úteis na introduçãode construções genéticas em S. cerevisiae (ver, por exemplo, Broach et al.,1993, em Experimental Manipulation of Gene Extression. editor M. Inouye,Academic press, p. 83). Estes vetores podem replicar em ambas E. colidevido à presença do pBR322 sobre e na levedura devido ao determinante dereplicação do plasmídeo com círculo de 2 μηι da levedura. Adicionamente,pode-se utilizar os marcadores resistentes à droga, como a ampicilina.

Semelhantemente, os vetores mamíferos preferidos para ospolinucleotídeos da invenção contêm ambas as seqüências procarióticas parafacilitar a propagação do vetor em bactérias. Esses vetores, quandotransfectados em células mamíferas, podem ser projetados para se integraremno cromossomo mamífero para uma estabilidade de longo prazo através douso de um gene marcador selecionável ligado. Alternativamente, osderivados de vírus, como o papilomavírus bovino (BPV-I) ou o vírus deEpstein-Barr, podem ser usados para a expressão transiente. Os diversosprocessos empregados na preparação da transformação de plasmídeos deorganismos hospedeiros são bem conhecidos na arte. Para outros sistemas devetores adequados, bem como para procedimentos recombinantes gerais, verSambrook, et al., supra.

5.3.2 Terapia de genes

A invenção também abrange o uso de polinucleotídeoscontendo uma região reguladora de genes ligada operativamente a um geneheterólogo para uso na terapia de genes para tratar o câncer e doençashiperproliferativas. Para fins de terapia de genes, as construções de expressãoda presente invenção podem ser administradas em qualquer veículobiologicamente efetivo, p. ex., qualquer formulação ou composição capaz defornecer efetivamente o gene recombinante a células in vivo. As abordagensincluem a inserção do gene em pauta em vetores virais, incluindo retrovírusrecombinantes, adenovírus, vírus adeno-associados, e vírus-1 do herpessimplex, ou plasmídeos eucarióticos ou bacteriais recombinantes. Os vetoresvirais transfectam células diretamente; o DNA de plasmídeo pode serfornecido com o auxílio de, por exemplo, polímeros catiônicos, lipossomascatiônicos (p. ex., lipofectina, derivados do colesterol, como D.D.A.B. efosfolipídeos) ou derivados (p. ex., conjugados com anticorpos), conjugadosde polilisina, gramicidina S, envelopes virais artificiais, ou outros veículosintracelulares desse tipo, bem como a injeção direta da construção do genenu, eletroporação ou precipitação com CaPO4 realizada in vivo. Uma revisãorecente de sistemas de expressão e transferência de genes para a terapiagênica do câncer é oferecida por Cooper, 1996, Seminars in Oncology 23:172-187.

Há de se considerar que, porque a transdução das células-alvoapropriadas representa uma primeira etapa importante na terapia de genes, aescolha do sistema particular de fornecimento de genes dependerá de fatores,como o fenótipo do alvo intensionado e da via de administração, p. ex., localou sistêmica. Além disso, há de se reconhecer que a construção particular degene proporcionada para a transdução in vivo de construções de expressãotambém é útil para a transdução in vitro de células, como para o uso nossistemas de cultura de tecidos descritos acima.

Uma abordagem preferida para a introdução in vivo de ácidonucleico numa célula se dá pelo uso de um vetor viral contendo ácidonucleico, p. ex., um gene citotóxico particular sob o controle de seqüênciasreguladoras de Hl9. A infecção de células com um vetor viral tem avantagem de que uma grande proporção das células objetivadas pode recebero ácido nucleico. Adicionalmente, as moléculas codificadas dentro do vetorviral, p. ex., por um cDNA contido no vetor viral, são expressaseficientemente em células que receberam ácido nucleico de vetor viral. Osvetores adequados que podem ser fornecidos utilizando-se os processos ecomposições presentemente revelados incluem, porém sem limitar-se, osvetores de vírus do herpes simplex, vetores de adenovírus, vetores de vírusadeno-associados, vetores retrovirais, vírus de pseudo-raiva, vetores de vírusde alfa-herpes, e análogos. Uma revisão meticulosa de vetores virais,particularmente vetores virais adequados para modificar células não-replicantes, e como utilizar esses vetores em conjunto com a expressão depolinucleotídeos de interesse podem ser encontrados no livro "Viral Vectors:Gene Therapy and Neuroscience Applications" editor Caplitt e Loewy,Academic Press, San Diego (1995).

Ficou demonstrado que é possível limitar o espectro deinfecção de vírus e, conseqüentemente, de vetores à base de vírus,modificando-se as proteínas de embalagem viral sobre a superfície dapartícula viral (ver, por exemplo, as publicações PCT W093/25234 eW094/06920). Por exemplo, estratégias para a modificação do espectro deinfecção de vetores retrovirais incluem: anticorpos de acoplamentoespecíficos para antígenos de superfície celular para a proteína viral env(Roux et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86: 9079-9083; Julan et al,1992, J. Gen. Virol. u3: 3251-3255; e Goud et al, 1983, Virology 163: 251-254); ou acoplamento de ligantes de receptor de superfície celular para asproteínas virais env (Neda et al, 1991, J. Biol. Chem 266: 14143-14146). Oacoplamento pode ser em forma de reticulação química com uma proteína ououtra variedade (p. ex., Iactose para converter a proteína env a umaasialogicoproteína), bem como gerando-se proteínas de fusão (p. ex.,proteínas de fusão env/anticorpo de cadeia única). Por exemplo, as células decâncer podem ser objetivadas com o uso desta técnica, por exemplo,acoplando-se anticorpos contra moléculas associadas a tumor ou proteínas desuperfície de células cancerosas à superfície do vírus recombinante. Estatécnica, conquanto útil para limitar ou, de outra forma, direcionar a infecçãopara determinados tipos de tecido, também pode ser utilizada para converterum vetor ectotrópico a um vetor anfotrópico.

Um sistema preferido de fornecimento de genes virais útil napresente invenção utiliza vetores derivados de adenovírus. O genoma de umadenovírus pode ser manipulado de modo que codifique e expresse umproduto de gene de interesse, porém é inativado em termos de sua capacidadede replicar em um ciclo de vida viral lítico normal. Ver, por exemplo,Berkner et al., 1988, BioTechniques 6: 616; Rosenfeld et al., 1991, Science252: 431-434; e Rosenfeld et al, 1992, Cell 68: 143-155. Os vetoresadenovirais adequados derivados da cepa de adenovírus AD tipo 5 dl324 oude outras cepas de adenovírus (p. ex., Ad2, Ad3, Ad7 etc.) são bemconhecidas por aqueles versados na arte. Adenovírus recombinantes podemser vantajosos em determinadas circunstâncias pelo fato de que podem serusados para infectar uma ampla variedade de tipos de células, incluindo oepitélio das vias aéreas (Rosenfeld et al, 1992, citado acima), célulasendoteliais (Lemarchand et al, 1992, Proc. Natl. Acad Sei. USA 89: 6482-6486), hepatócitos (Herz e Gerard, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:2812-2816) e células musculares (Quantin et al, 1992, Prôc. Natl Acad. SciUSA 89: 2581-2584). Além disso, a partícula de vírus é relativamente estável,passível de purificação e concentração, e pode ser modificada de modo aafetar o espectro de infectividade. Adicionalmente, o DNA adenoviral introduzido (e o DNA estranho ali contido) não é integrado no genoma deuma célula hospedeira, porém permanece episomal, evitando, com isto,problemas potenciais que podem ocorrer como um resultado de mutagêneseinsercional em situações em que o DNA introduzido se torna integrado nogenoma hospedeiro (p. ex., DNA retroviral). Além disso, a capacidade desuporte do genoma adenoviral para o DNA estranho é grande (até 8quilobases) relativamente aos outros vetores de fornecimento de genes(Berkner el al. citado acima, Haj-Ahmand e Graham, 1986, J. Virol. 57: 267).A maior parte dos vetores adenovirais defectivos para replicaçãocorrentemente em uso e, portanto, favorecidas pela presente invenção, édeletada para todos, ou parte de, os genes virais El e E3, porém retém até 80% do material genético adenoviral (ver, p. ex., Jones et al, 1979, Cell 16:683; Berkner et al. supra; e Graham et al. em Methods in Molecular Biology,E.J. Murray, editor (Humana, Clifton NJ, 1991) vol. 7, pp. 109-127).

Outro sistema de vetor viral útil para o fornecimento de uma das construções de expressão em pauta é o vírus adeno-associado (AAV). Ovírus adeno-associado é um vírus defectivo naturalmente ocorrente querequer outro vírus, como um adenovírus ou um vírus do herpes, como umvírus auxiliar para a replicação eficiente e um ciclo de vida produtivo. (Parauma revisão, ver Muzyczka et al. 1992, Curr. Topics in Micro, and Immunol. 158: 97-129). Este também é um dos poucos vírus que podem integrar seuDNA em células que não se dividem, e apresenta uma alta freqüência deinteração estável (ver, por exemplo, Flotte et al, 1992, Am. J. Respir. CellMol Biol. 7: 349-354; Samuiski et al, 1989, J. Virol 63: 3822-3828; eMcLaughlin et al, 1989, J. Virol. 63: 1963-1973). Os vetores contendoapenas cerca de 300 pares de bases de AAV podem ser embalados e podemintegrar. O espaço para o DNA exógeno é limitado a cerca de 4,5 kb. Umvetor de AAV como aquele descrito em Tratschin et al, 1985, Mol. CellBiol. 5: 3251-3260 pode ser usado para introduzir DNA nas células. Umavariedade de ácidos nucleicos foi introduzida em diferentes tipos de célulasutilizando vetores de AAV (ver, por exemplo, Hermonat et al., 1984, Proc.Nati. Acad. Sci USA 81: 6466-6470; Tratschin et al, 1985, Mol. Cell Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al, 1988, Mol Endocrinol. 2: 32-39; Tratschin etal, 1984, J. Virol. 51: 611-619; e Flotte et al, 1993, J. Biol. Chem. 268:3781-3790).

Adicionalmente aos processos de transferência firal, comoaqueles ilustrados acima, também é possível empregar processos não-viraispara causar a expressão direta de um gene heterólogo desejado no tecido deum animal. A maior parte dos processos não-virais de transferência de genesbaseia-se em mecanismos normais utilizados por células mamíferas para arecepção e o transporte intracelular de macromoléculas. Em concretizaçõespreferidas, os sistemas de fornecimento de genes não-virais da presenteinvenção baseiam-se em caminhos endocíticos para a recepção dasconstruções de expressão em pauta por parte da célula objetivada. Sistemasde fornecimento de genes exemplares deste tipo incluem sistemas derivadoslipossomais, conjugados de poli-lisina, e envelopes virais artificiais.

Na prática clínica, os sistemas de fornecimento de genes paraa construção de expressão terapêutica podem ser introduzidos num pacienteatravés de qualquer número de processos, cada um dos quais bem conhecidona arte. Por exemplo, uma preparação farmacêutica do sistema defornecimento de gene pode ser introduzida sistemicamente, p. ex., por meiode injeção intravenosa, e a expressão específica da construção nas células-alvo ocorre predominantemente a partir da especificidade de transfecçãoproporcionada pela expressão do tipo de célula ou do tipo de tecido, devidoàs seqüências reguladoras que controlam a expressão do gene heterólogo ouàs seqüências reguladoras em combinação com o veículo de fornecimento degene que objetiva determinados tipos de células. Em outras concretizações, ofornecimento inicial da construção de expressão recombinante é maislimitado, sendo que a introdução no animal é bastante localizada. Porexemplo, o veículo de fornecimento de gene pode ser introduzido por catéter(ver a patente U.S. n° 5.328.470) ou por meio de injeção estereotáctica (p.ex., Chen et al, 1994, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 91: 3054-3057). Umaconstrução de expressão da invenção pode ser fornecida numa construção deterapia de genes por meio de eletroporação utilizando-se técnicas descritas,por exemplo, por Dev et al, 1994, Câncer Treat. Rev. 20: 105-115.

A preparação farmacêutica da construção de terapia gênicapode consistir essencialmente do sistema de fornecimento de genes em umdiluente aceitável, ou pode compreender uma matriz de liberação lenta emque o veículo de fornecimento de genes se encontra embutido.Alternativamente, onde o sistema completo de fornecimento de genes podeser produzido intacto a partir de células recombinantes, p. ex., vetoresretrovirais, a preparação farmacêutica pode compreender um ou mais célulasque produzem o sistema de fornecimento de genes.

5.3.3 Pontos terminais e dosagens terapêuticas

Alguém com prática ordinária há de considerar que, do pontode vista de um paciente ou de um praticante médico, seria desejávelvirtualmente qualquer alívio ou prevenção de um sintoma indesejávelassociado com uma condição cancerosa (p. ex., dor, sensibilidade, perda depeso, e análogos). Adicionalmente, qualquer redução da massa tumorosa ouda taxa de crescimento é desejável, bem como um aperfeiçoamento da figurahistopatológica do tumor. Assim, para os fins deste pedido, os termos"tratamento", "uso terapêutico", ou "uso medicinal" utilizado aqui devereferir-se a quaisquer e a todos os usos das composições reivindicadas queremediam um estado doentio ou sintomas, ou que, de outra forma, previnem,impedem, retardam, ou revertem a progressão da doença ou de outrossintomas indesejáveis de qualquer maneira.

Uma dosagem efetiva e o protocolo de tratamento podem serdeterminados por meios convencionais, iniciando com uma dose baixa emanimais de laboratório e, então, aumentando-se a dosagem enquanto semonitora os efeitos, e variando-se também, sistematicamente, o regime dedosagem. Estudos em animais, de preferência estudos em mamíferos, sãocomumente utilizados para determinar a dose máxima tolerável, ou MTD[maximal tolerable dose] do agente bioativo por quilograma de peso. Aquelesversados na arte extrapolam regularmente as doses visando eficácia e paraevitar toxidez para outras espécies, incluindo os humanos.

Antes de empreender-se os estudos de eficácia em humanos,estudos clínicos de Fase I em sujeitos normais auxiliam a estabelecer asdoses seguras. Numerosos fatores podem ser levados em consideração porum clínico quando ao determinar uma dosagem ótima para um dado sujeito.Entre estes [fatores] são primários: a toxidez e a meia-vida do produto degene heterólogo. Fatores adicionais incluem o tamanho do paciente, a idadedo paciente, a condição geral do paciente, a doença cancerosa que está sendotratada, a gravidade da doença, a presença de outras drogas no paciente, aatividade in vivo do produto de gene, e análogos. As dosagens de ensaioseriam selecionadas após consideração dos resultados de estudos em animaise na literatura clínica.

Por exemplo, uma dose típica para humanos de um vetoradenoviral contendo uma região reguladora de Hl9 ligada operativamente aum gene heterólogo codificando um agente citotóxico, como a timidinaquinase, é de 1 χ 107 pfu a 1 χ 1010 pfu, injetados diretamente na massa dotumor por dia. Mais preferivelmente, a dose diária de um tal vetor adenoviralinjetada diretamente em um tumor seria de 1 χ IO8 pfu a 1 χ 1010 pfu,dependendo do tamanho do tumor. Para um vetor adenovirai contendo umaregião reguladora de Hl9 ligada operativãmente a um produto de genecitotóxico com um nível diferente de toxidez, estes valores seriamevidentemente alterados de forma correspondente. Doses semelhantes de umvetor adenovirai contendo um promotor IGF-2 P4 ligado operativamente aum gene heterólogo codificando um agente citotóxico, como a timidinaquinase, também podem ser usadas como um ponto inicial sugerido.

Particularmente onde se contempla o uso in vivo, os diversoscomponentes bioquímicos da presente invenção são, de preferência de altapureza e são substancialmente isentos de contaminantes potencialmentenocivos (p. ex., pelo menos de grau National Food (NF)5 geralmente em graupelo menos analítico e, de preferência, em grau pelo menos farmacêutico).Na medida em que um dado composto precisa ser sintetizado antes do uso,esse tipo de síntese ou purificação subseqüente deveria resultar, depreferência, num produto que é substancialmente isento de quaisquer agentespotencialmente tóxicos que podem ser sido usados durante os processos desíntese ou purificação.

Para o uso no tratamento de uma condição cancerosa em umsujeito, a presente invenção também proporciona em um de seus aspectos umkit ou embalagem, na forma de um frasco ou ampola enchido de maneiraestéril, que contém um vetor de polinucleotídeo contendo uma regiãoreguladora de Hl9 ligada operativamente a um gene heterólogo codificandoum agente citotóxico ou uma célula liberadora de vetor. Em umaconcretização, o kit contém um vetor de polinucleotídeo contendo uma região reguladora de Hl9 ligada operativamente a um gene heterólogo codificandoum agente citotóxico, como uma formulação pronta para emprego, tanto emdose unitária ou em quantidades de doses múltiplas, em que a embalagemincorpora um rótulo que instrui o uso de seu conteúdo para o tratamento docâncer. Alternativamente, e de acordo com outra concretização da invenção, aembalagem proporciona um frasco ou ampola enchido de maneira estérilcontendo uma tal célula ou linha de células liberadora de vetor. Para oarmazenamento e transporte, a célula ou linha de células liberadora de vetordeveria ser congelada. Opcionalmente, a embalagem também pode contermeios e reagentes para cultivar a célula ou linha de células liberadora devetor.

A invenção tendo sido descrita, os exemplos a seguir sãooferecidos a título de ilustração e não de limitação.

6. Exemplo: Seqüências reguladoras de Hl9 facilitam a expressão de umgene heterólogo em linhas de células de tumor

Esta seção descreve a construção de uma variedade deconstruções de expressão contendo um gene repórter CAT que se encontrasob o controle de seqüências reguladoras de Hl9 e sua transferência paradiferentes linhas de células de câncer da bexiga.

6.1 Materiais e processos

6.1.1 Linhas de células e transfecçõesAs linhas de células de câncer da bexiga HT-1376, EJ28;T24P, 1197 e UM-UC-3 foram obtidas da American Type Culture Collection(ATCC) e mantidas de acordo com as recomendações da ATCC.

Foram realizadas transfecções transientes utilizando-se oprocesso de transfecção que emprega precipitação com fosfato de cálcio. Osprecipitantes (contendo 7 μg de plasmídeo) foram adicionados em 1 ml demeio a 0,3 χ IO6 células em discos de 30 mm. Após 16 horas, os meios detransfecção foram removidos e adicionou-se meios frescos. As células foramcolhidas 24-96 horas após a transfecção, e a atividade CAT foi determinadautilizando-se o processo de extração de fase orgânica com butiril-CoA(Sambrook et al, 1989). Uma parcela da fase superior orgânica (100 μΐ) foitransferida para um poço de cintilação contendo 3 ml de fluído de cintilação,e contou-se.6.1.2 Construção de vetores de expressão

Plasmídeos pCAT-básico (contendo um gene repórter CATprecedido por um sítio de clonagem múltiplo), pCAT-promotor (contendo ogene repórter CAT sob controle de um promotor SV40), pCAT-intensificador(contendo o intensificador SV40 a jusante do gene repórter CAT5 e um sítiode clonagem múltiplo para inserção de um promotor a montante do generepórter CAT) e pCAT-controle (contendo o gene repórter CAT sob controlede ambos, o intensificador e o promotor SV40) foram, todos, obtidoscomercialmente junto à Promega (Madison, WI).

Para construir o plasmídeo pH19E, contendo o gene repórterCAT sob controle do promotor de H19, a região do promotor de Hl9 (SEQID NO: 1) foi primeiramente clonada em pBluescript II SK+ (Promega). Umpolinucleotídeo contendo a seqüência de promotor de Hl9 foi ampliado deplacenta humana utilizando-se iniciadores de DNA.

ESPCR21: CGGTTCCCCACTTCCCCAGTTT (SEQ ID NO:6) eESPCR22: CGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT (SEQ ID NO:7).

O produto de PCR foi polido em sua extremidade com enzimade Klenow e clonado no sítio EcoRV de pBluescriptIISK+. O DNA inseridofoi verificado por digestão com enzimas de corte interno PvuII, EcoRI eApaI. A orientação do promotor foi oposta àquela da região codificante IacZdo vetor. A região promotora foi então excisada por meio de clivagem comHindIII e PstI, e o fragmento resultante com aproximadamente 0,9 kb foiinserido nos sítios HindIII-PstI de pCAT-básico para produzir pH19E.

Os plasmídeos de expressão contendo a região dointensificador de Hl9 inserida em ambas as orientações, a jusante do generepórter CAT/promotor de H19, foram construídos como a seguir. Umfragmento SacI de 5 kb contendo o intensificador de Hl9 a jusante (de +6,0kb a +11 kb relativamente ao início da transcrição de H19) foi clonado nosítio SacIde pUC19. Este fragmento de intensificador foi então excisado comEcoRI e HindIII e ligado nos sítios EcoRI-HindIII de pBluescript II SK+ paracriar pBhH19En-Sa. pBhH19En-Sa foi parcialmente digerido com BamHI, eo fragmento de 5 kb contendo o intensificador de Hl9 (e um sítio BamHIinterno) foi clonado no sítio BamHI a jusante do gene repórterCAT/promotor de Hl9 em pH19E. Foram gerados plasmídeos contendo ointensificador de Hl9 tanto na orientação direta (pH19EH19D) como nareversa (pH19EH19R).

6.2 Resultados e discussão

Cinco diferentes linhas de células de câncer da bexiga, HT-1376, EJ28, T24P, 1197 e UM-UC-3 foram tansfectadas, cada uma, compCAT-básico (denominado P-E na Figura 2), pCAT-control (denominadopSV40ESV40 na Figura 2), pH19E, pH19EH19D e pH19EH19R. Osresultados de expressão de cada construção são apresentados na figura 3A-3E. Observou-se, em cada linha de células, o nível mais alto de atividadeCAT, sendo que o plasmídeo de pCAT-controle continha tanto ointensificador SV40 como o promotor SV40. Esta construção serviu comoum controle positivo, pois as seqüências reguladoras de SV40 foramestabelecidas como indutores da expressão de genes. No entanto, asseqüências reguladoras de SV40 não são específicas para células de tumorem sua capacidade de induzir a expressão de genes. As linhas de célulastransfectadas com pH19E, contendo o gene repórter CAT sob controle dopromotor de H19, também apresentaram uma expressão significativamenteaumentada de CAT sobre o fundo. O nível de indução da atividade CAT pelopromotor de Hl9 abrangeu de cinco vezes na linha de células HT-1376 atédez vezes na linha de células UM-UC-3. A adição do promotor de Hl9 àsconstruções de promotor de H19/gene repórter CAT aumentaram ainda maisos níveis de expressão em determinadas linhas de células. Por exemplo, naslinhas de células EJ28, T24P e 1197, o intensificador de Hl9 aumentousignificativamente a expressão do promotor de H19/gene repórter CAT. Noentanto, a orientação do intensificador proporcionou diferentes resultados emdiferentes linhas de células. Nas linhas de células HT- 1376 e UM-UC-3, ointensificador exerceu pouco ou nenhum efeito sobre a expressão.

Os resultados demonstram que região do promotor de Hl9humano direciona a expressão de um gene repórter heterólogo ligadooperativamente numa ampla variedade de linhas de células derivadas decâncer da bexiga. Em algumas linhas de células derivadas de câncer dabexiga, o intensificador de Hl9 pode aumentar ainda mais a expressão de umgene repórter sob controle do Hl 9.

7. Exemplo: Um gene de toxina sob o controle das seqüênciasreguladoras de H19

7.1 Materiais e processos

As construções de expressão descritas acima na seção 6 sãomodificadas para expressar uma seqüência que codifica um produto tóxico ou uma prodroga em lugar de CAT. Por exemplo, a seqüência codificando oproduto de gene CAT é removida e substituída por uma seqüênciacodificando timidina quinase do vírus do herpes simplex (HSV-TK)utilizando-se processos convencionais de clonagem que são bem conhecidosna arte.

Os plasmídeos de expressão de Hl 9 Iprodroga sãotransfectados para linhas de células derivadas de câncer da bexiga, conformedescrito na seção 6. Quando transfectado para linhas de células de câncer dabexiga, um plasmídeo de expressão H19/HSV-TK induz citotoxidezespecífica para células de câncer da bexiga na presença de ganciclovir.

8. Exemplo: Expressão de Hl9 em um modelo de camundongo docarcinoma da bexiga induzido quimicamente

8.1 Materiais e processos

Setenta camundongos fêmeas com cinco semanas de vidaC3H/He (Charles River) foram alojados a 6 camundongos por gaiola edeixados aclimatar em um recinto com ar condicionado, com um ciclo deiluminação de 12 horas de luz/12 horas de escuridão. Com 8 semanas devida, o experimento foi iniciado e os ratos foram divididos arbitrariamenteem um grupo de controle (10 camundongos) e um grupo experimental (60camundongos). O grupo experimental de camundongos recebeu 0,05 % de N-butil-N-(4-hidroxibutil)nitrosamina (BBM) (Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd.,Tokyo, Japão) dissolvido e sua água potável ad libitum. Os camundongos decontrole receberam água potável. Os animais de ambos os grupos forammortos a 4, 8, 12, 16, 20 e 26 semanas após o início do experimento. Asbexigas foram excisadas, fixadas e embutidas em blocos de parafinaempregando-se procedimentos convencionais.

8.1.1 Preparação da sonda

Um fragmento de 2,1 kb contendo a região codificante do Hl9de camundongo foi subclonado no plasmídeo de pBluescript II KS(Stratagene, La Jolla, CA) atrás dos sítios de ligação de RNA polimerase T7 eT3. O RNA de Hl9 anti-sentido marcado com [35S] foi produzido in vitro apartir do DNA de plasmídeo linearizado com HindIII utilizando polimerasede T7 (Boehringer Mannheim) e um kit Amersham RPN 2006 kit.Transcrições geradas in vitro apresentaram uma atividade específica de IO7cprn^g. mRNA de Hl9 no sentido, preparado com polimerase T3(Boehringer Marinheim) e modelo linearizado com EcORI, foi utilizadocomo um controle.

8.1.2 Hibridização in situ

Seções de cera de parafina (5 μΜ) de tecidos fixados comformalina foram montadas sobre placas de microscópio revestidas com 3-aminopropiltrietoxissilano (Tespa, Sigma) e secadas de um dia para o outro a37°C. As seções foram desenceradas com xileno, fixadas com 4 % deparaformaldeído e, depois, tratadas com proteinase K (Sigma). As placasforam acetiladas para reduzir a ligação não-específica da sonda e desidratadasatravés de uma série de etanol.

Sondas de RNA marcadas com [35S] (atividade específica de50.000 cpu/μl) foram hibridizadas conforme descrito por Rangini et al,1991, Mech. Dev. 35: 13-24, omitindo-se a etapa de tio-AMP. As placasforam expostas a película durante 10 dias, e contra-manchadas comhematoxilina e eosina. As placas foram examinadas e fotografadasutilizando-se um microscópio Polyvar (Reichert Jung) sob iluminação decampo brilhante e escuro. Os controles incluíram hibridização com sonda deRNA no sentido e tratamento de pré-hibridização com RNAse.

Adicionalmente, seções de bexigas de camundongos adultos sadios (que nãoexpressam H19) e bexigas de camundongo embriônico (que expressam H19)serviram como controles negativo e positivo, respectivamente.

8.2 Resultados e discussão

A 26 semanas, todos os camundongos sobreviventes do grupoexperimental haviam desenvolvido tumores de bexiga palpáveis. Observou-se expressão extensiva de Hl9 nos tumores de bexiga induzidosquimicamente. Em contraste, não se detectou expressão de Hl9 na bexiga doadulto normal. Correspondentemente, este modelo de camundongo de câncerde bexiga induzido quimicamente pode ser utilizado como um modelo animalpara demonstrar a citotoxidez específica para tumor in vivo de construçõescontendo as regiões reguladoras de Hl9 ligadas operativãmente a um gene detoxina.

9. Exemplo: Terapia gênica utilizando seqüências reguladoras de Hl9para expressar um gene heterólogo em um modelo de camundongo decarcinoma da bexiga

Os plasmídeos de expressão de prodroga ou H19/toxina sãoincorporados em lipossomas (conforme descrito por Takashita et al. 1993, J.Clin. Invest. 93: 652-661, incorporado aqui por referência) para fornecimentona bexiga de camundongo in vivo. Os camundongos usados nesteexperimento possuem tumores na bexiga induzidos quimicamente, conformedescrito na seção 8.

Em resumo, 50 μg de DNA de plasmídeo, dissolvidos em 500μΐ de meio Optimen isento de soro (BRL Life Technologies, Gaithersburg,MD) são adicionados a 250 μΐ de Lipofectamina [sic] 250 μΐ de água. Amistura é incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente, depoisdiluída em 10 ml de solução salina balanceada (BSS(-):140 mM de NaCl, 5,4mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,6). Após pelotizar a solução por meiode centrifugação a 15.000 rpm durante 30 minutos, os lipossomas sãoressuspensos em 1 ml de BSS(-) contendo 1 mM de CaCl2.Aproximadamente 0,2 mis dos lipossomas concentrados são administradosvia cateter a camundongos que possuem tumores de bexiga induzidosquimicamente. Um grupo de controle de camundongos com tumores debexiga recebem lipossomas sem DNA ou com uma construção contendo umgene irrelevante sob o controle das seqüências reguladoras de H19. Emmomentos definidos, camundongos de cada grupo são sacrificados e asbexigas foram excisadas, fixadas e embutidas em blocos de parafina usandoprocedimentos convencionais. Seções alternadas são processadas para ahibridização in situ utilizando-se ou a sonda de H19, como descrito acima, ouuma sonda para a seqüência codificante do gene da toxina de Pseudomonas.Adicionalmente, compara-se o tamanho, o número e a necrose dos tumoresentre os grupos de controle e experimental. Verificou-se que a

expressão da toxina de Pseudomonas co-localiza-se com aexpressão de Hl9 nos tumores da bexiga do grupo experimental decamundongos. Adicionalmente, os tumores da bexiga no grupo experimentalde camundongos têm o tamanho e a necrose reduzida, se comparado com ostumores de bexiga no grupo de camundongos de controle.10. Exemplo: Expressão dos promotores IGF-2 P3 e P4 em linhas decélulas de tumor10.1 Materiais e processos

Neste experimento, uma variedade de construções deexpressão contendo o gene repórter de luciferase sob o controle de um dentrequatro diferentes promotores IGF-2 foi construída e transferida paradiferentes linhas de células de câncer de bexiga. Foram preparadas asseguintes construções de promotor IGF-2/luciferase:

<table>table see original document page 38</column></row><table>

As seqüências de promotor IGF-2 são descritas emSussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2: 1-9, incorporada aqui por referência.

O vetor repórter de luciferase é comercialmente disponível junto à Promega,Madison, WI (n° de catálogo E1641).

10.2 Resultados e discussão

Os plasmídeos de expressão resultantes foram transfectadospara linhas de células de câncer de bexiga humana HT-1376, EJ28, T24P,1197 e UM-UC-3 como descrito acima na seção 6. A atividade luciferase foianalisada utilizando-se um kit comercial (Promega, Madison, WI, n° decatálogo El 500). Os resultados, mostrados na Figura 4A-4E, demonstramque o promotor IGF-2 P4 direcionou a expressão do gene repórter deluciferase em cada linha de células de câncer de bexiga testada. Na linha decélulas 1197, o promotor IGF-2 P3 também direcionou a expressão do generepórter de luciferase. Em experimentos subseqüentes, os promotores IGF-2P3 e P4 mostraram direcionar a expressão da expressão do gene de luciferaseem outras linhas de células de tumor, incluindo células de coriocarcinoma ecélulas de rabdomiossarcoma.

11. Exemplo: Função de promotor IGF-2 e promotor de H19 comintensificador de Hl9 para facilitar a expressão de um gene heterólogo

11.1 Materiais e processos

Quatro vetores de luciferase, pGL3-básico, pGL3-promotor,pGL3-intensificador e pGL3-controle foram obtidos junto à Promega. Estes vetores foram transfectados em linhas de células cultivadas utilizando-se umnúmero de diferentes reagentes de transfecção, incluindo lipofetamina(Gibco/BRL), fugene (Boehringer), o Perfect Transfection Kit de 8 diferentesreagentes de lipideos (Invitrogen), TFX-10, TFX-20, transfast (Promega), e oprocesso de fosfato de cálcio (Gorman et al, 1982, Mol. Cell Biol. 2: 1044- 1051).

O promotor de Hl9 clonado no sítio EcoRV site depBluescript II SK (pbhl9p #1) é descrito na seção 6,1, supra. O promotorHl9 foi excisado por meio de clivagem com Sma I e Hind III, e o fragmentoresultante com 0,9 kb foi inserido nos sítios Sma I-Hind III do vetor pGL3- básico para produzir a construção Luc-pbhl9.

A região do promotor de Hl9 desde nt -819 até +14 foiampliada com PCR a partir do plasmídeo pbhl9p #1, utilizando-seiniciadores 5' -ATATGGTACCGACAACCCTCACCAAAG-3' (a montante,SEQ ID NO:8) e 5'-ATATAAGCTTCTTCTCCCTCACCCTGCTC-3' (a jusante, SEQ ID NO:9). O produto de PCR resultante foi digerido com KpnIe Hind III, e ligado nos sítios KpnI-Hind III do vetor pGL3-básico, dando aconstrução Luc-PBHl9. Este promotor de Hl9 gerado por PCR foiseqüenciado em ambas as direções por meio de seqüenciamentoautomatizado de ciclo terminador de corante (seqüenciador de DNA ABTPrism 377, Perkin Elmer). A figura 5 mostra a seqüência de nucleotídeos dopromotor de Hl9 (SEQ ID:NO 2) gerada por PCR.

O intensificador de Hl9 a jusante com 5 kb descrito na seção6, acima, foi digerido com DamH dando dois fragmentos de 4,1 kb e 0,9 kbna ponta 3*. As construções Luc-PBH 19-0,9EH 19 e Luc-PBH 19-4EH19foram construídas por meio da inserção dos fragmentos BamH I de 0,9 kb e4,1 kb do intensificador de Hl9 no sítio BamH I do plasmídeo Luc-PBH 19,respectivamente. As seqüências de intensificador foram posicionadas ajusante do gene repórter de luciferase/promotor de H19.

O fragmento do intensificador de BamH I com 0,9 kb foiligado no sítio BamH I do vetor pGL-básico para produzir o vetor Luc-0.9EH19. O promotor de H19 do plasmídeo pbhl9p #1 foi excisado comKpnI-BamH I, e ligado nos sítios Kpnl-BgIII da construção Luc-0.9EH19,dando a construção de expressão Luc-pbhl9-0.9EH19 que continha os clonesde promotor como descrito na seção 6, acima, e o intensificador de 0,9 kb ajusante do gene repórter H19/Luc.

Os vetores de expressão designados como Hup-1, Hup-2,Hup-3, e Hup-4, contendo o gene de luciferase sob controle dos promotoresIGF-2 humanos PI, P2, P3 e P4, respectivamente, foram construídos comodescrito em Sussenbach et al 1992, Growth Reg. 2: 1-9. Uma região de 512bp de P4 foi ampliada por meio de PCR a partir da construção Hup4utilizando-se iniciadores 5 '-AC AGGT ACCTCT AG AGTCGACCT-3' (amontante, SEQ ID NO: 10) e 5'-ATATAAGCTTGCTCCCATCCTGCA-3' (ajusante, SEQ ID NO: 11). O produto de PCR resultante foi digerido comKpnI-Hind III e ligado nos sítios KpnI-Hind III do vetor de gene repórterpGL3-básico para produzir o vetor de gene repórter Luc-P4.

Os vetores de expressão contendo o promotor IGF-2 P4 e ointensificador de Hl9 também foram preparados. Um fragmento deintensificador de BamHI derivado do fragmento de 4,1 kb previamentedescrito foi clonado no sítio BamH I do produto Luc-P4, produzindo o vetorde expressão Luc-P4-2EH19.

Os intensificadores de Hl9 com 0,9 kb, 2 kb e 4,1 kb foramseqüenciados utilizando-se seqüenciamento automatizado de DNA. Aseqüência de nucleotídeos do intensificador com 0,9 kb é mostrada na figura6 (SEQ ID NO:3). A seqüência de nucleotídeos do intensificador com 2 kb émostrado na figura 7 A e 7B (SEQ ID NO:4). A seqüência de nucleotídeos dointensificador com 4,1 kb é mostrada na figura 8A-8C (SEQ ID NO:5).

11.2 Resultados e discussão

Quando se utilizar diversos reagentes de transfecção paraintroduzir quatro vetores contendo gene de luciferase em linhas de célulascultivadas, a precipitação com fosfato de cálcio produziu a maior eficiênciade transfecção para a maior parte das linhas de células testadas. Portanto, aprecipitação com cálcio foi utilizada subseqüentemente para transfectarvários vetores de expressão. Adicionalmente, a maior concentração de DNAde plasmídeo não inibiu a eficiência de transfecção, mesmo quandoutilizaram a concentrações acima do platô.

A linha de células de câncer da bexiga 5637, a linha de célulasdo carcinoma hepatocelular (HCC) Huh7 e a linha de células de tumor do rim 293T foram transfectadas, cada uma, com diferentes construções contendo ogene repórter de luciferase sob o controle do promotor de Hl9 ou IGF-2 P4em combinação com o intensificador de Hl 9.

As células transfectadas com Luc-phl9 e Luc-PH 19 contendoo gene repórter e o promotor de Hl9 apresentaram maior expressão de genesobre o fundo (Figura 9A-9C). A construção Luc-PH 19 contendo o promotorgerado com PCR mostra uma maior atividade do que Luc-phl9 em cada linhade células testada. A adição do fragmento de intensificador de Hl9 com 0,9kb ao vetor repórter Luc-phl9 (Luc-phl9-0.9EH19) aumentou ainda mais osníveis de expressão, de 2 a 4 vezes nas linhas de células 5637 e 293T,respectivamente.

O promotor IGF-2 P4 também aumentou a expressão deluciferase em todas as linhas de células sobre o fundo. A adição do fragmentode intensificador de Hl9 com 2 kb ao vetor de expressão Luc-P4 intensificoua atividade de promotor P4. O nível de indução de atividade luciferase com ofragmento de intensificador com 2 kb abrangeu de duas vezes, na linha decélulas 293T, até seis vezes, na linha de células Huh7, enquanto que ointensificador intensificou apenas marginalmente a atividade de promotor emcélulas 5673.

A figura 10A-10B mostra que a expressão da construção Luc-phl9AEH19) contendo ambos, o promotor de Hl9 gerado com PCR e ofragmento intensificador de Hl9 com 4,1 kb. O intensificador aumentoumuito a atividade do promotor em 3-28 vezes nas linhas de células, exceto nalinha de células 5637.

12 DEPÓSITO DE CLONE

O seguinte plasmídeo foi depositado junto à American TypeCulture Collection (ATCC), Manassas, VA, sob os termos do Tratado deBudapeste com o Reconhecimento Internacional do Depósito deMicroorganismos para Fins de Procedimento de Patente:

<table>table see original document page 42</column></row><table>

EQUIVALENTES

O relatório descritivo escrito precedente é suficiente parapermitir a alguém versado na arte praticar a invenção. Efetivamente, devemser incluídas no escopo das reivindicações a seguir as várias modificaçõesdos meios descritos acima para a realização da invenção, que são óbvias paraaqueles versados na arte da biologia molecular, medicina ou camposrelacionados.

Todas as publicações indicadas aqui são incorporadasintegralmente por referência.

Claims (12)

1. Vetor para expressar uma seqüência em uma célula detumor, caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeocompreendendo uma seqüência reguladora humana ligada operativamente auma seqüência heteróloga que codifica um produto de gene citotóxico, emque a seqüência reguladora é selecionada do grupo consistindo em: umaseqüência reguladora de Hl 9, um promotor IGF-2 P4, e um promotor IGF-2 P3.

2. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a célula de tumor é uma célula de tumor de bexiga.

3. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a célula de tumor de bexiga é selecionada do grupo que consisteem Ht-1376, EJ28, T24P, 1197 e Um-UC-3.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as seqüências reguladoras de Hl9 são o promotor de Hl9, ointensifícador de H19, ou ambos o promotor de Hl9 e o intensificador deH19.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a seqüência heteróloga é selecionada do grupo que consiste naseqüência codificadora de λ-galactosidase, toxina de difteria, toxina dePseudomonas, ricina, toxina do cólera, timidina quinase do herpes simplex,timidina quinase do varicela zóster, citosina deaminase, nitrorredutase,citocromo P-450 2B1, timidina fosforilase, nucleosídeo fosforilase purina,fosfatase alcalina, carboxipeptidases A e G2, linamarase, λ-lactamase, exantina oxidase.

6. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a célula de tumor está em um indivíduo.

7. Vetor de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que o indivíduo possui um tumor selecionado do grupo que consisteem carcinoma da bexiga, carcinoma hepatocelular, hepatoblastoma,rebdomiossarcoma, carcinoma do ovário, carcinoma cervical, carcinoma dopulmão, carcinoma do seio, carcinoma de células escamosas na cabeça e nopescoço, carcinoma esofagal, carcinoma da tiróide, astrocitoma, ganglioblastomae neuroblastoma.

8. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as seqüências reguladoras de Hl9 compreendem o promotor deHl9 e o intensificador de Hl9, e a seqüência heteróloga codifica uma proteínaselecionada do grupo que consiste em λ-galactosidase, toxina de difteria,toxina de Pseudomonas, ricina, toxina do cólera, timidina quinase do herpessimplex, timidina quinase do varicela zóster, citosina deaminase,nitrorredutase, citocromo p-450 2B 1, timidina fosforilase, nucleosídeofosforilase purina, fosfatase alcalina, carboxipeptidases A e G2, linamarase,λ-lactamase, e xantina oxidase.

9. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a seqüência reguladora de Hl9 é um promotor de Hl9, em que opromotor de Hl9 compreende:(a) nucleotídeos 1 a 830 da SEQ ID NO:l; ou(b) a seqüência de SEQ ID NO:2.

10. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a seqüência reguladora de Hl9 é um intensificador de H19, emque o intensificador de Hl9 compreende:(a) a seqüência de SEQ ID NO:3;(b) a seqüência de SEQ ID NO:4; ou(c) a seqüência de SEQ ID NO:5.

11. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que o intensificador de Hl 9 é colocado em 3' na seqüência heteróloga.

12. Vetor para expressar uma seqüência heteróloga em umacélula de tumor, caracterizado pelo fato de compreender:(a) um polinucleotídeo compreendendo um promotor IGF-Iligado operativamente a uma seqüência heteróloga que codifica um produtode gene citotóxico.