NO328470B1 - Vektor for a uttrykke en sekvens i en tumorcelle og vertcelle omfattende denne, samt fremgangsmater for a uttrykke sekvensen in vitro og anvendelse av vektoren for fremstilling av et medikament for behandling av cancer. - Google Patents

Description

1. Oppfinnelsens felt

Foreliggende oppfinnelse er i området av tumorcellebiologi og cancerbehandling. Oppfinnelsen vedrører vektor for å uttrykke en sekvens i en tumorcelle og vertcelle omfattende denne, samt fremgangsmåter for å uttrykke sekvensen in vitro og anvendelse av vektoren for fremstilling av et medikament for behandling av cancer. Mer spesifikt, vedrører oppfinnelsen den spesifikke ekspresjonen av heterologe gener, spesielt gener som koder for cytotoksiske produkter, i tumorceller.

2. Bakgrunn for oppfinnelsen

2.1 H19 gen

Hl 9 genet er en av de få kjente gener som er kjent å være preget hos mennesker (Hurst et al, 1996, Nature Genetics 12:234-237). Påbegynnelsen av embryogenesen, ble H19 uttrykt fra begge kromosomale allelene (DeGroot et al, 1994, Trophoblast 8:285-302). Kort etterpå skrus det farsarvede allelet av, og bare det morsarvede allelet blir transkribert.

Hl9 blir uttrykt rikelig under embryogenesen, og blir identifisert som et gen som ble regulert samordnet med alfa-fetoprotein i lever ved det transvirkende locuset raf (Pachnis et al, 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:5523-5527). I tillegg har H19 uavhengig blitt klonet av et antall grupper som bruker screeninger rettet mot isolering av gener som blir uttrykt under vevsdifferensiering. F.eks., Davis et al (1987, Cell 51:987-1000) identifiserte musehomologen til Hl9 i en screening for gener som er aktive tidlig under differensiering av C3H10T1/2 celler. Pourier et al (1991, Develop-ment 113:1105-1114) fant at murint Hl9 blir uttrykt under stamcelledifferensiering på tidspunktet for implantering. Transkripsjon av humant Hl9 genet ble også oppdaget i differensierende cytotrofoblaster fra human placenta (Rachmilewitz et al, 1992, Molec. Reprod. Dev. 32:196-202).

Mens transkripsjon av H19 RNA forekommer i et antall forskjellig embryogene vev under fosterutviklingen og placentautviklingen, blir Hl9 ekspresjon nedregulert etter fødselen. Relativt lave mengder av Hl9 transkripsjon av blitt rapportert, imidlertid i murint voksen muskel og lever (Brunkow and Tilghman, 1991, Genes & Dev. 5:1092-1101). H19 blir også aktivert etter fødselen i cancerceller. Ariel et al, (1997, Molec, Pathol. 50:34-44) viste H19 ekspresjon i mange tumorer som oppsto fra vev som hadde blitt uttrykt prenatalt. I tillegg fant disse forfatterenene Hl9 RNA i tumorer avledet fra neurale vev, spesielt astrocytom og ganglioneuroblastom som ikke er kjent for å være assosiert med Hl9 ekspresjon. Ved at en lang rekke av cancere uttrykte Hl9 RNA spekulerte disse forfatterene i om Hl9 var et onkoføtalt RNA og foreslo å undersøke H19 som en tumormarkør for human neoplasi.

Både humane og murine Hl 9 gener har blitt klonet og sekvensert (Brannan et al, 1990, Mooec, Cell. Biol. 10:28-36). Sammenligning av det humane og muse Hl9 gener ga en 77% nukleotidsekvensidentitet. På tross av denne konserveringen av nukleotidhomologi mellom artene, kunne svært få deduserte aminosyresekvensidentitet bli predikert fra de åpne leserammene hos de to genene ( Id). Dessuten, skjønt Hl9 RNA blir transkribert ved RNA polymerase II, spleiset og polyadenylert, ser det ikke ut til å bli translatert. Isteden har Hl9 RNA blitt funnet assosiert med 28S cytoplasmisk RNA, som fører til spekulasjoner om Hl9 RNA kan fungere som en RNA komponent til et ribonukleo-protein ( Id.).

Den aktuelle fysiologiske rollen til Hl9 er ikke fullstendig forstått. Hl9 kan virke som et dominant letalt gen; en høy ektopisk ekspresjon av et Hl9 transgen forårsaker død hos mus kort etter fødsel (Brunkow el al., supra). Denne letale perioden faller sammen med det tidspunktet når Hl9 transkripsjon blir undertrykket. På den annen side har ingen defekt blitt observert i verken heterozygote eller homozygote mus som bærer en H19 knockout allel(er) (Leighton et al, 1995, Nature 375:34-39). En knockout av det morsarvede allelet interfererer ikke med pregingen av det genetisk koblede og den motsatte pregede IGF-2 genet; den resulterende musen er større ved fødsel enn de andre i kullet på grunn av økt prenatal ekspresjon av IGF-2 ( Id.). Siden disse to motsatte pregede gener deler cw-virkende regulatoriske sekvenser spekulerte Leighton og kollegaer på om Hl9 kan være involvert i preging av IGF-2 genet.

En annen funksjon som er foreslått for Hl9 genproduktet er tumorsupressor RNA. Hao et al. (1993, Nature 365:764-767) rapporterte at transfeksjon av to embryonale tumorcellelinjer, RD og G401, med en Hl9 ekspresjonskonstruksjon resulterte i cellevekst-retardering, morfologiske endringer og redusert tumorgenisitet i nakne mus. En slik tumorsupressoraktivitet har blitt sett å være konsistent med den observerte dødeligheten av ektopisk ekspresjon i mus (Hao et al, supra) så vel som den økte størrelsen av mus som er knocked out for det Hl9 morsallelet (Leighton et al, supra). Forslaget om at H19 er en tumorsupressor har vært kontroversielt. Noen av resultatene kunne ikke reproduseres, og det kan eksistere et annet tumorkandidatsupressorgen som er nært koblet til H19 (Ariel et al, supra). H19s foreslåtte rolle som en tumorsupressor er også i konflikt med de eksperimentelle data om at Hl9 blir aktivert i mange forskjellige tumorceller (se f.eks. Lustig-Yariv et al, 1997, Oncogene 23:169-177).

2.2 Insulinlignende vesktfaktor ( IGF) gener

IGF-2 er et annet preggen hvis ekspresjon avhenger av foreldrenes opprinnelse. Imidlertid i motsetning til Hl9, er IGF-2 fra mor preget i både mus og menneske og derfor uttrykt fra det farsarvede allelet (Rainier et al, 1993, Nature 363:747-749). Det humane IGF-2 genet utviser et komplekst transkripsjonelt mønster. Det er fire IGF-2 promotorer som blir aktivert på en vevs- og utviklingspesifikk måte. Bare tre av promoterene, P2, P3 og P4 er preget og aktive under føtal utvikling og i cancervev. Det fjerde promoter Pl er ikke preget og blir aktivert kun i voksen lever og choroid pleksus (se Holthuizen et al, 1992, Mol. Reprod. Dev. 35:391-393). P3 promoter fra IGF-2 genet har vært implisert i progresjon av lever cirrhose og hepatocellulært karsinom (Kim and Park, 1998, J. Korean Med. Sei. 13:171-178).

Tap av preging av IGF-2 har vært implisert i Wilms tumor (Ogawa et al, 1993, Nature 363:749-751). Denne observasjonen førte til at mange forskere spekulerte i om tap av preging og biallelisk ekspresjon av pregede gener kan være involvert i vekstforstyrrelser og utvikling av cancer (se også Rainier et al, 1993, Nature 362:747-749, og Glassman et al, 1996, Cancer Genet. Cytogenet. 89:69-73).

2.3 Tumorspesifikk genterapi

Regulatoriske sekvenser fra tumorassosierte gener har blitt brukt for selektivt å målrette ekspresjon av et selvmordsgen i tumorderiverte celler. F.eks., blir alfa-fetoproteineks-presjon indusert i hepatocellulær karsinom. Huber et al, (1991, Proe. Nati. Acad. Sc. USA 88:8039-8043) brukte kontrollsekvenser fra enten albumingenet eller alfa-feto-proteingenet for å målrette ekspresjon av varicella-zoster tymidinkinase (VZV TK) genet som kodene sekvenser til hepatomceller. Hepatomceller infisert in vitro med en retroviral vektor som inneholder en av disse ekspresjonskonstruksjonene uttrykte VZV TK og ble sensitive for normal ikke toksisk promedikament 6-metoksypurin arabino-nukleosid (araM). Keneko et al, (1995, Cancer Res. 55:5283-5287) konstruerte en adenoviral vektor som uttrykte HSC TK under kontroll av alfa-fetoproteinkontroll-sekvenser. Rekombinante adenovirale partikler som inneholdt denne vektoren ble direkte injisert inn i hepatocellulær karsinomavledede tumorer dannet i atymiske nakne mus. Deretter forårsaket intraperitonale injeksjoner med ganciklovir regresjon av hepatocellulært karinomavledede tumorer.

Osaki et al (1994, Cancer Res. 54:5258-5261) transfekterte inn i A549 lungekarsinom-celler en ekspresjonskonstruksjon som inneholdt kontrollsekvensene for lungekarsino-embryonalt antigen gen koblet til den kodene sekvensen for Herpes simplex virus tymidinkinase (HSV TK). De transfekterte cellene ble sensitive for ganciklovir. I tillegg ble tumorvekst i nakne mus fra subkutant injiserte transfekterte celler inhibert ved repeterte intraperitonale injeksjoner av ganciklovir. Imidlertid har karsinoembryonalt antigen nylig blitt beskrevet som uttrykt i normal konolmukosa, og derfor begrense anvendelsen av disse kontrollsekvensene som tumorspesifikke regulatorisk regioner (Osaka et al., supra). Derfor er det fortsatt et behov for utvikling av genterapi vektorer som spesifikt uttrykker genprodukter i tumorceller.

3. Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører vektor for å uttrykke en sekvens i en tumorcelle, kjennetegnet ved at vektoren omfatter et polynukleotid som omfatter en Hl 9 regulatorisk sekvens operativt koblet til en heterolog sekvens som koder for et cytotoksisk genprodukt.

Oppfinnelsen vedrører også en vertscelle kjennetegnet ved at den inneholder en vektor hvori vertcellen ikke er i en menneskekropp.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en vektor for fremstilling av et medikament for: a) å utrykke den heterologe sekvens i en tumorcelle, hvori den regulatoriske sekvens er en Hl9 regulatorisk sekvens som spesifikt blir utrykt i

tumorcellen; eller

b) behandling av kreft.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å uttrykke en heterolog sekvens i en

tumorcelle in vitro, kjennetegnet ved at den omfatter å introdusere inn i tumorcellen en vektor ifølge oppfinnelsen.

4. Kort beskrivelse av figurene

Figur 1A-IC. Nukleotidsekvens av human Hl9 promoterregion. Promoterregionen fra nukleotidposisjon -837 til -7 (relativt til start av transkripsjon) er vist (SEQ ID NO:l). Figur 2. Skjematisk diagram av vektorene brukt for å uttrykke et heterologt gen under kontroll av Hl9 regulatoriske sekvenser. Figur 3A-3E. H19 regulatoriske sekvenser direkte ekspresjon av et heterologt gen (CAT) i blærecancercellelinje. For de fem forskjellige indikerte cellelinjene, er CAT spesifikk aktivitet (cpm/ \ ig proteiner) plottet som en funksjon av vektoren brukt for transfeksjon. Figur 3A: HT-1376 celler. Figur 3B: EJ28 celler. Figur 3C: T24P celler.

Figur 3D: 1197 celler. Figur 3E: UM-UC-3 celler. Disse vektorene som følger, er beskrevet i mer detalj under i avsnitt 6: (1) pCAT-basis; (2) pCAT-kontroll; (3) pH19E;

(4) pH19EH19D; og (5) pH19EH19R.

Figur 4A-4E. IGF-2 P3 og P4 promotere dirigerer ekspresjon av et heterologt gen (luciferase) i blærecancercellelinje. For de fem forskjellige cellelinjene som er vist, er luciferasespesifikk aktivitet (tellinger per g av protein) er plottet som en funksjon av IGF-2 promoter brukt i transfeksjonskonstruksjonen for å dirigere ekspresjon av luciferase. Figur 4A: T24P eller. Figur 4B: 1376 celler. Figur 4C: UM-UC3 celler. Figur 4D: 1197 celler. Figur 4E: EJ28 celler. Vektorene er beskrevet i mer detalj under i avsnitt 10. Figur 5. Nukleotidsekvensen til et humant Hl 9 promoterfragment (SEQ ID NO:2).

Figur 6. Nukleotidsekvens av 0,9 kb Hl9 enhancerfragment (SEQ ID NO:3).

Figur 7A og 7B. Nukleotidsekvens av 2 kb Hl9 enhancerfragment (SEQ ID NO: 4). Figur 8A-8C. Nukleotidsekvens av 4 kb H19 enhancerfragment (SEQ ID NO: 5). Figur 9A-9C. Transfeksjon med vektorer som inneholder forskjellige Hl9 regulatorisk region og P4 promoterkombinasjoner som dirigerer luciferaseekspresjon i tumorceller.

Figur 9A: 5637 celler. Figur 9B: Huh7 celler. Figur 9C: 293T celler.

Figur 10A-10E. Transfeksjon med vektorer som inneholder H19 regulatoriske regioner som dirigerer luciferaseekspresjon i tumorceller. Figur 10A: 293T celler. Figur 10B;: T24P celler. Figur 10C: Huh7 celler. Figur 10D: 5637 celler. Figur 10E: RT112 celler.

5. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen vedrører vektor for å uttrykke en sekvens i en tumorcelle kjennetegnet ved at vektoren omfatter et polynukleotid som omfatter en Hl9 regulatorisk sekvens operativt koblet til en heterolog sekvens som koder for et cytotoksisk genprodukt.

En utførelsesform ifølge oppfinnelsen vedrører vektor kjennetegnet ved at den Hl9 regulatoriske sekvens er Hl9 promoteren, Hl9 forsterkeren (enhancer) eller både Hl9 promoteren og Hl9 forsterkeren.

Hl9 promoteren omfatter fortrinnsvis

a) nukleotidene 1 til 830 fra SEQ ID NO: 1; eller

b) sekvensen fra SEQ ID NO:2.

Hl9 forsterkeren omfatter fortrinnsvis

a) sekvensen fra H19 forsterkeren klonet inn i plasmid pH 19EH19 (ATCC deponeringsnummer 209322); b) sekvensen fra SEQ ID NO:3;

c) sekvensen fra SEQ ID NO:4; eller

d) sekvensen fra SEQ ID NO:5;

hvori, eventuellt forsterkeren er plassert 3' til den heterologiske sekvensen.

Vektoren ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved at den heterologe sekvens:

a) er valgt fra gruppen bestående av den kodende sekvensen for galaktosidase, difteritoksin, pseudomonatoksin, ricin, koleratoksin, retinoblastmagen, p53, herpes simplex tymidinkinase, varicellazostertymidinkinase, cytosindeaminase, nitroreduktase, cytokrom p-450 2B1, tymidinfosforylase, purinnukleosidfosforylase, alkalisk fosfatase, karboksypeptidaser A og G2, linamarase, laktamase og xantinoksidase; b) er en antisenssekvens som spesifikt hybridiserer til en sekvens som koder for et gen selektert fra gruppen bestående av cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyklinE, cyklinA, cdk4, onkogene former av p53, c-fos, c-jun, Kr-ras og Her2/neu; eller c) koder for et ribozym som spesifikt kutter et RNA som koder for et gen selektert fra gruppen bestående avcdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl,

cyklinE, cyklinA, cdk4, onkogene former av p53, c-fos, c-jun, Kr-ras og Her2/neu.

Tumorcellen er fortrinnsvis en blæretumorcelle, helst valgt fra gruppen bestående av Ht-1376, EJ28, T24P, 1197 og Um-UC-3.

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av en vektor som definert ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for: a) å utrykke den heterologe sekvens i en tumorcelle, hvori den regulatoriske sekvens er en Hl9 regulatorisk sekvens som spesifikt blir utrykt i tumorcellen;

eller

b) behandling av kreft.

Spesielt er medikamentet for behandling av et individ som har en tumor eller kreft valgt

fra gruppen bestående av blærekarsinom, hepatocellulært karsinom, hepatoblastoma, rabdomyosarkom, ovarikarsinom, cervisk karsinom, lungekarsinom, brystkarsinom, squamous cellekarsinom i hode og nakke, spiserørskarsinom, tyroidkarsinom, astrocytoma, ganglioblastom og neuroblastom.

Alternativt er medikamentet for behandling av kreft og det cytotoksiske genprodukt er valgt fra gruppen bestående av difteritoksin, pseudomonatoksin, ricin, kolera toksin, retinoblastomgen og p53.

Alternativt er medikamentet for behandling av kreft og det cytotoksiske genprodukt er et cytostatisk genprodukt.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å uttrykke en heterolog sekvens i en tumorcelle in vitro, kjennetegnet ved den omfatter å introdusere inn i tumorcellen en vektor som definert ifølge oppfinnelsen.

For formålet av oppfinnelsen betyr betegnelsen "operativt koblet" at nukleotidsekvensen er koblet til en regulatorisk sekvens på måter som tillater ekspresjon av nukleotidsekvensen og blir dirigert ved den regulatoriske sekvensen.

Et "heterologt gen" sekvens refererer seg til, for formålene for direkte anvendelse, til en gensekvens som ikke er normalt koblet til de regulatoriske sekvensene til Hl9 genet. Genetiske heterologe gensekvenser inkluderer sekvenser som koder cytostatiske og cytotoksiske genprodukter.

Som brukt heri, refererer "ekspresjon" seg til transkripsjon av DNA av interesse, og spleising, prosessering, stabilitet og eventuelt translasjon av det korresponderende mRNA transkriptet. Avhengig av strukturen til DNA molekylet som avleveres, kan ekspresjon være forbigående eller kontinuerlig.

5.1 Regulatoriske sekvenser av H19 genet, IGF- 2 P3 og P4 promotere og IGF- 1

promoter

Hl9 er regulatoriske sekvenser som kan bli brukt for å dirigere tumor-celle spesifikk ekspresjon av en heterolog kodende sekvens. Disse Hl9 regulatoriske sekvenser inkluderer oppstrøms Hl9 promoterregion og/eller nedstrøms Hl9 enhancerregion. Nukleotidsekvensen til en H19 promoterregion er vist i figur 1A-1C (SEQ ID NO: 1). Denne 830 nukleotidsekvensen strekker seg fra -837 til -7 nukleotider fra cap sete (som beskrevet i Brannan et al, supra). En konsensus TAT A sekvens forekommer ved nukleotidene -27 til -35. To konsensus AP2 bindingsseter (8/9 matcher) forekommer ved omtrent -500 og -40 nukleotider oppstrøms for initieringen av transkripsjon. Når den er plassert oppstrøms for den kodende regionen til et heterologt gen, som diskutert i mer detalj under, er omtrent 830 basepar av den regulatoriske regionen tilstrekkelig for å dirigere ekspresjon av det operativt koblede heterologe genet i cancerceller som også uttrykker endogent Hl9.1 tillegg, er en annen Hl9 promoterregion mellom nukleotidene -819 til +14 (Figur 5, SEQ ID NO: 2) tilstrekkelig for å dirigere ekspresjon av operativt koblet heterologt gen i cancerceller.

Nedstrømsenhancerregionen til humant Hl9 gen kan eventuelt bli tilsatt til en Hl9 promoter/heterologenkonstruksjon for å tilveiebringe økte nivåer av tumorcellespesifikk ekspresjon. Som beskrevet mer fullstendig under og illustrert ved eksempel i avsnitt 6, omfatter nedstrømsenhancerregionen et SacI restriksjonsfragment som strekker seg fra +6 kb til +11 kb relativt til startsete for transkripsjon. Som det er forventet fra en enhancersekvens, er nedstrømsenhanceren i stand til å utøve dets effekt når den er plassert i enten revers eller direkte orientering (relativ til orienteringen av H19 enhanceren i den endogene Hl9 genet) nedstrøms for de kodende regionene til et heterologen under kontroll av Hl9 promoteren. I tillegg kan også fragmentet fra denne enhanceren som inneholder sekvensene som vist i figur 6, 7A, 7B og 8A-8C (SEQ ID NO: 3-5) også bli brukt for å fremme genekspresjon.

Ekspresjonen av IGF-1 genet har blitt assosiert med lungecancer og brystcancer. IGF-1 promoter er nukletidsekvensen mellom nukleotidene 1 til 1630 i human IGF-1 gen-sekvensen (Genbank akssesjonsnummer Ml2659 M77496 inkorporert heri ved referanse; Rotwein et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4828-4832).

IGF-2 genproduktet blir uttrykt ved å bruke en av fire forskjellige promoterregioner. Tre av disse fire promoterene er preget og blir uttrykt i embryonalt vev; promoter Pl, blir imidlertid aktivert kun i voksent vev (Sussenbach et al, 1992, Growth Reg. 2:1-9). P3 promoter er blitt implisert i hepatokarsinom. Det er også blitt oppdaget at preget P4 promoter (nukleotidsekvens -546 til +102 i IGF-2 genet) og P3 promoter (nukleotidsekvens -1229 til +140 hos IGF-2 genet) er aktivert i humane blærcancerceller, og kan bli brukt for å dirigere ekspresjon av et operativt koblet heterologt gen til tumorceller. IGF-2 P3 og P4 promotere kan bli brukt i kombinasjon med Hl9 enhancer eller aktive fragmenter derav.

Disse regulatorisk sekvensene fra genomiske pregede og ikke pregede gener som blir uttrykt i cancerceller kan ytterligere bli beskrevet ved å definere de minimale regulatoriske sekvensene som kreves for å erverve ønsket tumorspesifikk ekspresjon. F.eks. kan promoterregionen bli endret ved addisjoner, substitusjoner eller delesjoner og analysert for retensjon av tumorspesifikk ekspresjonsfunskjon. Forskjellige deler av H19 ned-strøms enhancer kan bli testet individuelt for evnen til å øke transkripsjon fra Hl9 promoter.

Endringer i de regulatoriske sekvensene kan bli dannet ved å bruke forskjellige kjemiske eller enzymatiske metoder som er velkjent for de som kjenner fagfeltet. F.eks. kan regioner av sekvenser definert ved restriksjonsseter deleteres. Oligonukleotidrettet mutagenese kan anvendes for å endre sekvensen på en definert måte og/eller for å introdusere restriksjonsseter i spesifikke regioner innen sekvensen. I tillegg kan delesjonsmutanter bli dannet ved å bruke DNA nuklease slik som Bal31 eller ExoIII og S1 nuklease. Progressivt større delesjoner i de regulatoriske sekvensene blir dannet ved å inkubere DNA med nukleaser i øket tidsperiode (se Ausubel, et al., 1989 Current Protocols for Molecular Biology, for en oversikt over mutageneseteknikker).

De endrede sekvensene blir evaluert for deres evne til å dirigere tumorspesifikk ekspresjon av heterologe kodene sekvenser i egnede vertsceller, spesielt Hl9 uttrykk-ende karsinomaavledede celler (f.eks. blærekarsinomceller for å gi et eksempel). Det er innenfor området av den foreliggende oppfinnelse at en hver endret regulatorisk sekvens som bibeholder deres evne til å dirigere tumorspesifikk ekspresjon kan bli inkorporert i rekombinante ekspresjonsvektorer for ytterligere anvendelse.

Mange forskjellige heterologe gener kan bli uttrykt under kontroll av disse regulatoriske sekvensene slik som gener som koder for toksiske genprodukter, potensielt toksiske genprodukter, og antiproliferering eller cytostatiske genprodukter. Markørgener kan også bli uttrykt, inklusive enzymer (f.eks. CAT, beta-galaktosidase, luciferase), fluorescensproteiner slik som grønt fluorescensprotein, eller antigene markører. Cytotoksiske genprodukter er vidt definert til å inkludere både toksiner og apoptose-induserende midler. I tillegg inkluderer cytotoksiske genprodukter medikamentmetaboliserende enzymer som konverterer et promedikament til et cytotoksisk produkt. Eksempler på cytotoksiske genprodukter omfatter difteritoksin, pseudomonas toksin, risin, koleratoksin, PE40 og tumorsuppressorgener slik som retinoblastomgenet og p53. I tillegg kan sekvenser som koder for apoptotiske peptider som induserer celleapoptose bli brukt. Slike apoptotiske peptider inkluderer Alzheimers A beta peptid (se LaFerla et al, 1995, Nat, Genet, 9:21-30), det ateriale natriuretiske peptid (se Wu et al, 1997, J. Biol. Chem. 272:14860-14866), kalsitoningenrelatert peptid (se Sakuta et al, 1996, J, Neuroimmunol. 67:103-109) som andre kjente apoptotiske peptider kjent.

Medikamentmetaboliserende enzymer som konverterer et promedikament til et cytotoksisk produkt inkluderer tymidinkinase (fra herpes simplex eller varicella zoster viruser), cytosindeaminase, nitroreduktase, cytokrom p-450 2B1, tymidinfosforylase, purinnukleosidfosforylase, alkalinfosfatase, karboksypeptidaser A og G2, linamarase, "Mactamase og xantinoksidase) se Rigg and Sikora, August 1997, Mol. Med. Today, sidene 359-366 for ytterligere bakgrunnsstoff).

I tillegg kan antisens antigen, eller apatameriske oligonukleotider som kan avleveres til cancerceller ved å bruke tidligere beskrevet ekspresjonskonstruksjoner. Ribozymer eller enkelttrådet RNA kan også bli uttrykt i cancerceller for å inhibere ekspresjon av et helt spesielt gen av interesse. Målgenene for disse antisens eller ribozymmolekylene skulle være de kodede genproduktene som er essensielle for celleopprettelse eller opprettelse av cancercellefenotype. Slike målgener inkluderer men er ikke begrenset til cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyclinDl, cyclinE, cyclinA og edk4.

F.eks. vektorer som uttrykker, under kontroll av regulatoriske sekvenser fra pregede gener eller IGF-1 promoter som blir uttrykt i cancercelle, antisens RNA eller ribozymer spesifikk for transkripter av onkogene former av p53, c-fos, c-jun, Kr-ras og/eller Her2/neu blir introdusert inn i cellene for å nedregulere ekspresjon av de endogene genene. Tumorceller som uttrykker Hl9, og kan aktivere Hl9 regulatoriske sekvenser, (eller som spesifikt aktiverer IGF-1, IGF-2 P3 eller P4 promoter) kan være spesifikt målretter for ekspresjon av antisens RNA eller ribozym RNA.

Antisenstilnærminger involverer design oligonukleotider (i dette tilfellet mRNA) som er komplementære til mål mRNA. Antisensoligonukleotidene vil binde til de komplementære mål mRNA transkriptene og hindre translasjon. Absolutt komplementaritet, er foretrukket, men er ikke et krav. En sekvens komplementær med en del av et RNA, som referert til heri, betyr en sekvens som har tilstrekkelig komplementaritet til å være i stand til å hybridisere med RNA, for å danne et stabilt dupleks. Evnen til å hybridisere vil avhenge av både grad av komplementaritet og lengden av antisens nukleoinsyre. Generelt, jo lenger hybridiseringsnukleinsyren, jo mer basefeilparring med et RNA kan den inneholde og allikevel danne et stabilt dupleks (eller tripleks, som kan være tilfelle). En som kjenner fagfeltet kan beregne en tolererbar grad av feilparring ved anvendelse av standard prosedyre ved å bestemme smeltepunkt til hybridiseringskomplekset.

Oligonukleotidene som er komplementære til 5' ende av målsekvensen, f.eks. 5' utrans-latert sekvens opp til og inklusiv AUG initieringskodon, skal virke mest effektivt til å inhibere translasjon. Imidlertid, sekvenskomplementarietet til 3' utranslaterte sekvenser av mRNA har nylig blitt vist å være effektiv til å inhibere translasjon av mRNA også. Se, Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335. Derfor, kan oligonukleotider som er komplentære til enten 5'- eller 3'- ikke-translaterte, ikke-kodende regioner til målgen-transkriptene bli brukt i en antisenstilnærming for å inhibere translasjon av endogene gener. Oligonukleotidene som er komplementære til 5' utranslaterte region til mRNA skal inkludere komplementet til AUG startkodon. Antisensoligonukleotider som er komplementære med mRNA kodende regioner er mindre effektive inhibitorer av translasjon, men kan bli benyttet. Om den er designet til å hybridisere til 5', 3' eller kodende region til mål mRNA, skal antisensnukleinsyren være minst 6 nukleotider i lengde, og er fortrinnsvis oligonukleotider som varierer i mengder fra 6 til omtrent 50 nukleotider. Oligonukleotidene er minst 10 nukleotider og minst 17 nukleotider, minst 25 nukleotider eller minst 50 nukleotider.

Uansett valg av målsekvens, er det foretrukket at in vitro studier først blir utført for å kvantifisere evnen antisensoligonukleotidet har til å inhibere genekpresjon. Disse studiene bør benytte kontroller som skiller mellom antisensinhibering og ikke-spesifikke biologiske effekter av oligonukleotidet. Det er også foretrukket at disse studiene sammenligner nivåene av mål RNA eller protein med det fra en intern kontroll-RNA eller -protein.

Ribozymmolekylet designet for atalyttisk å kutte et essensielt målgen kan også bli brukt for å hindre translasjon av mål mRNA. (Se f.eks., PCT international publikasjon WO90/11364, publisert 4. oktober 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). Når ribozymet er spesifikt for et gentranskript som koder for et protein essensielt for cancercellevekst, kan slike ribozymer forårsake reversering av en canceraktig cellefeno-type. Mens ribozymer som kutter mRNA ved setespesifikke gjenkjenningssekvenser kan bli brukt til å øke mål mRNA, er anvendelsen av hammerhoderibozymer foretrukket. Hammerhoderibozymer kutter mRNA ved lokaliseringer i flankeringsregionene som danner komplementære basepar med mål mRNA. Det eneste krav er at mål mRNA har følgende sekvens av to baser: 5-UG-31. Konstruksjon og produksjon av hammer-ribozymer er velkjent innen fagfeltet og er beskrevet mer utførlig i Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591. Fortrinnsvis blir ribozymet fremstilt slik at kutte-gjenkjenningssete er lokalisert nær 5' ende av mål mRNA; dvs. for å øke effektiviteten og minimalisere den intracellulære akkumuleringen av ikke-funksjonelle mRNA transkripter.

Ribozymer som er anvendelige inkluderer RNA endoribonukleaser (heretter "Cech-typeribozymer") slik som det som naturlig forekommer i tetrahymena termofilia (kjent som rVS eller L-19IVS RNA) og som er utførlig beskrevet at Thomas Cech og med-arbeidere (Zaug et al, 1984, Science, 224:574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug et al, 1986, Nature, 324:429-433; publisert i international patent-søknad nr. WO 88/04300 ved universitetets patenter Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216). Cech-typeirbozymer har et åtte basepars aktivt sete som hybridiserer til en mål RNA sekvens hvoretter kutting av mål RNA finner sted.

5.2 Aktivering av gener i tumorceller

Cellene som reaktiverer preget genekspresjon vil også være i stand til å spesifikk danne ekspresjonskonstruksjoner som inneholder slike pregede genregulatoriske regioner operativt koblet til et heterologt gen. Slike celler, spesielt tumorceller, er egnede mål for genterapimetoder. H19 og IGF-2 P3 og P4 spesifikk ekspresjon i både tumorer og cellelinjer kan bli bestemt ved å bruke teknikker fra RNA analyse, in situ hybridisering og reportergenkonstruksjoner. I tillegg kan tumorceller med aktivert IGF-1 genekspresjon bli bestemt på samme måte og målsøkt i genterapi ved å bruke IGF-1 promoter for å dirigere ekspresjon av et heterologt gen.

For de fleste RNA analyseanvendelser, blir en merket probe som spesifikk hybridiserer til gentranskriptet av interesse fremstilt ved å bruke en av de mange teknikkene som er velkjent innen fagfeltet. Den merkede proben kan inneholde minst 15-30 baser komplementære til Hl9 nukleotidsekvensen, og fortrinnsvis minst 50 til 150 baser som er komplemenære til Hl9 transkripter. En spesiell foretrukket hybridiseirngsprobe for H19 ekspresjon er et polynukleotid som er komplementær til 3' ende av Hl9 message fra omtrent 800 basepar oppstrøms for poly A setet til poly A setet.

I en spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen som er illustrert under ved arbeids-eksempler, blir en merket antisens RNA probe dannet ved in vitro å bruke en T7 eller T3 ekspresjonsplasmid. Hl9 prober kan også bli merket ved tilfeldig priming ved tilstedeværelse av merked nukleotid, f.eks. ved å bruke Prime-It kit (Stratagene, La Jolla, CA; Catalog nr. 300392). Alternativt, kan merkede prober bli dannet i en PCR reaksjon ved å bruke en cDNA klon fra den H19 kodene regionen og primere designet for å amplifisere en region fra den kodende regionen, eller ved standard "nick"-trans-lasjonsreaksjon.

Merkinger som er egnet for polynukleotidprober inkluderer nukleotider som inkorporerer radioaktive isotoper (slik som 35S og <32>P), fluorescens, luminiscens og farge-merker og enzymatiske enheter.

Den merkede proben blir hybridisert in situ til en cellevevsprøve ved å bruke standard-teknikker slik som beskrevet under i arbeidseksemplet, og i U.S. patentsøknad med serienummer 08/704,786. Alternativt, hvis tilstrekkelig kvantum av egnede celler kan erverves, kan standard RNA analyse (slik som Northern analyse, RNase beskyttelse eller primerforlengelse) bli utført for å bestemme nivået av mRNA ekspresjon av genet av interesse.

I tillegg er det mulig å utføre slike genekspresjonsanalyser "in situ", dvs. direkte på vevssnittene (fiksert og/eller frossen) til pasientvevet ervervet fra biopsier eller reseksjoner, slik at ingen nukleinsyrerensing er nødvendig. Nukleinsyrereagensene slik som de som er beskrevet over kan bli brukt som prober og/eller primere for slik in situ prosedyrer (se f.eks., Nuovo, G.J., 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications", Raven Press, NY).

En alternativ metode for å bestemme om en celletype eller tumor vil være i stand til å spesifikt aktivere ekspresjonskonstruksjoner som inneholder spesielle regulatoriske regioner operativt koblet til et heterologt gen er å faktisk transfektere slike ekspresjonskonstruksjoner inn i cellen. For dette formålet er det heterologe genet fortrinnsvis et markørgenprodukt. Et positivt resultat i en analyse for markørgenproduktet gir at cellen eller cellelinjen er i stand til å aktivere ekspresjon fra de regulatoriske regionene.

Ved å bruke disse teknikkene, er eksempler på tumortyper med aktivert H19 ekspresjon som følger:

A. Pediatriske faste tumorer

1. Wiln<V>s tumor

2. Hepatoblastom

3. Embryonalt radbomyosarkom

B. Kimcelletumorer og trofoblastiske tumorer

1. Testikulær kimcelletumorer

2. Umoden teratoma fra ovarie

3. Sacrococcygeal tumor

4. Choriokarsinom

5. Placental setetrofoblastisk tumor

C. Epitel voksentumorer

1. Blærekarsino

2. Hepatocellulært karsinom

3. Ovariekarsinom

4. Cervixkarsinom

5. Lungekarsinom

6. Brystkarsinom

7. Squamous cellekarsinom i hode og nakke

8. Spiserørskarsinom

9. Tyroidkarsinom

D. Neurogene tumorer

1. Astrocytom

2. Ganglioblastom

3. Neuroblastom

De ovenfor nevnte cancerene kan behandles med medikamenter fremstilt ved anvendelse av vektorer ifølge oppfinnelsen. Faktisk kan enhver tumor som aktiverer Hl9 ekspresjon bli behandlet.

I tillegg kan de før nevnte teknikkene anvendes for å bestemme tumorer som aktiverer IGF-1, og IGF-2 P3 og P4 promotere. Slike tumorer kan også behandles med medikamenter fremstilt ved anvendelse av vektorer ifølge oppfinnelsen. F.eks. blir IGF-2 aktivert i tumorer i barneårene, slik som Wilm's tumorer, rabdomyosarkomer, neuro-blastomer og hepatoblastomer.

5.3 Fremgangsmåter for innføring av regulatoriske sekvenser inn i vertsceller Oppfinnelsen omfatter også vertsceller transfektert med polynukleotider som inneholder regulatoriske regioner operativt koblet til et heterologt gen. Slike vertsceller kan opp-rettholdes i kultur eller kan være en del av et dyr, fortrinnsvis pattedyr. Polynukleotider av interesse blir satt inn i hvilken som helst av en rekke av vektorer som deretter blir avlevert ved å bruke beskrevne metoder og materialer. Slike vektorer kan bli produksert ved å bruke veletablerte molekylærbiologiske teknikker (se Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning bind I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, og Current Protocols in Molecular Biology (1989) John Wiley & Sons, alle bind, og periodiske oppdateringer derav, heri inkorporerte ved referanse). Der hvor translasjon er ønsket, vil de heterologe genene av interesse også bli fremstilt for å omfatte en egnet 3' polyadenyleringssekvens hvis nødvendig.

5.3.1 Dyrkede celle

Vertsceller transfektert med polynukleotider som inneholder pregede genregulatoriske regioner operativt koblet til et heterologt gen kan være en hver prokaryot eller eukaryot-celle. Ved å ligere polynukleotid inn i en genkonstruksjon, slik som en vektor, og transformering eller transfektering inn i verstcelle, enten eukaryote (gjær, ape, insekt eller pattedyr) eller prokaryot (bakterielle celler) er standardprosedyrer som brukes i mikrobiell eller vevskulturteknologier.

Vektorer som er egnet for dyrking av disse polynukleotidene i bakterielle celler, slik som E. coli, inkluderer plasmider av typen: pBR322-avledede plasmider, pEMBL-avledede plasmider, pEX-avledede plasmider, pBTac-avledede plasmider og pUC-avledede plasmider. For replikasjon i gjær, er YEP24, YIP5, YEP51, pYES2 og YRP17 plasmider klonings og ekspresjonsbærere som er nyttige for å introdusere genetiske konstruksjoner i S. cerevisiae (se f.eks., Broach et al., 1993, i Experimental Manipulation of Gene Expression. ed. M. Inouye, Academic press, s. 83). Disse vektorene kan replikere i både E. coli på grunn av tilstedeværelsen av pBR322 ori og i gjær på grunn av replikasjonsbestemmelse av gjær 2 fim sirkelplasmid. I tillegg kan resitensmarkører slik som ampicillin bli brukt.

På samme måte inneholder foretrukne mammalske vektorer for polynukleotidene ifølge oppfinnelsen begge prokaryote sekvenser for å lette propageringen av vektoren i bakterier. Slike vektorer, når de blir transfektert i mammalske celler, kan designes for å integreres inn i mammalsk kromosom for langtids stabilitet ved å anvende et koblet selekterbart markørgen. Alternativt kan derivater av virus slik som bovint papilloma-virus (BPV-1) eller Epstein-Barr virus bli brukt for transientekspresjon. De forskjellige metodene som er anvendt i fremstillingen av plasmidtransformasjon av vertsorgan-ismene er velkjent innen fagfeltet. For andre vektorsystemer så vel som generelle rekombinante prosedyrer, se Sambrook et al, supra.

5.3.2 Genterapi

Polynukleotider som inneholder en genregulatorisk region operativt koblet til et heterologt gen kan anvendes innen genterapi for å behandle cancer og hyperproliferative sykdommer. For genterapiformål, medikamenter omfattende ekspresjonskonstruksjoner ifølge den foreliggende oppfinnelse kan bli administrert i enhver biologisk effektiv bærer, f.eks, enhver formulering eller sammensetning som er i stand til effektivt å avlevere det rekombinante genet til cellene in vivo. Tilnærminger inkluderer insertion av det aktuelle genet i virale vektorer som inkluderer rekombinante retrovirus, adenovirus, adeno-assosierte virus og herpes simplex virus-1, eller rekombinante bakterielle eller eukaryote plasmider. Virale vektorer transfekterer celler direkte: plasmid DNA kan bli avlevert ved hjelp av, f.eks. kationiske polymerer, kationiske liposomer (f.eks. lipofektin, kolesterolderivater slik som D.D.A.B og kationiske fosforlipider) eller derivater (f.eks. antistoffkonjugert), polylysinkonjugater, gramisidin S, kunstig virale kappe eller andre slike intracellulære bærere, så vel som direkte injeksjon av naken genkonstruksjon, elektroporering eller CaPCU presipitering utført in vivo. En nylig oversikt av genoverføring og ekspresjonssystemer for cancergenterapi er Cooper, 1996, Seminars in Oncology 23:172-187.

Det vil forstås at fordi transfeksjon av egnet målceller representerer et viktig første trinn i genterapi, vil valg av spesielt avleveringssystem avhengig av slike faktorer som fenotype tilsiktede målet og måter for administrering, f.eks. lokalt eller systemisk. Videre vil det gjenkjennes at den spesielle genkonstruksjonen som er tilveiebrakt av in vivo transduksjon av ekspresjonskonstruksjoner også er nyttige for in vitro transduksjon av celler, slik som for anvendelse i ex vivo vevskultursystemer beskrevet tidligere.

En foretrukket tilnærmingsmåte for in vivo transduksjon av nukleinsyre inn i en celle er ved anvendelse av en viral vektor som inneholder nukleionsyre, f.eks. et spesielt cytotoksisk gen under kontroll av H19 regulatoriske sekvenser. Infeksjon av celler med en viral vektor har fordelen at en stor del av målcellene kan motta nukleinsyren. I tillegg blir molekyler som er kodet for av viral vektor, f.eks. ved en cDNA inneholdt i den virale vektoren, uttrykt effektivt i celler som har tatt opp virale vektornukleinsyre. Egnede vektorer som kan avlevere ved å bruke de herværende beskrevne metoder og sammensetninger inkludere, men er ikke begrenset til, herpes simplex virusvektor, adenovirusvektorer, adeno-assosiert virusvektorer, retrovirale vektorer, pseudorabies-virus, alfa-herpes virusvektorer og dets like. En grundig oversikt over virale vektorer, spesielt virale vektorer som er egnet for modifisering av ikke repliserende celler, og hvordan anvende slike vektorer i konjuksjon med ekspresjon av polynukleotider av interesse kan finnes i boken "Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications" Ed. Caplitt and Loewy, Academic Press, San Diego (1995).

Det er blitt vist at det er mulig å begrense infeksjonsspekteret av virus og som en konsekvens av viralbaserte vektorer, ved å modifisere de virale pakkeproteinene på overflaten av den virale partikkel (se f.eks. PCT publikasjonene W093/25234 og WO94/06920). F.eks. strategier for å modifisere infeksjonsspekteret til retrovirale vektorer inkluderer: å koble antistoffer spesifikke for celleoverflateantigenet til viralt kappeprotein (Roux et al, 1989, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86:9079-9083; Julan et al, 1992, J. Gen. Virol. u3:3251-3255; og Goud et a., 1983, Virology 163:251-254); eller koble celleoverflatereseptorligander til de virale kappeproteinene (Neda et al, 1991, J. Biol. Chem. 266:14143-14146). Koblingen kan være i form av kjemisk kryssbinding med et protein eller annen variant (f.eks. laktose for å omdanne kappeproteinet til en asialogykoprotein), så vel som det å danne fusjonsproteiner (f.eks. enkelt-kjede antistoff/kappefusjonsproteiner). F.eks. kan cancerceller bli målsøkt ved å bruke denne teknikken, f.eks. å koble antistoffer mot tumorassosierte molekyler eller cancercelle-overflateproteiner til overflaten av rekombinante virus. Denne teknikken, er nyttig for å begrense eller på annen måte dirigere infeksjonen til visse vevstyper, og kan også bli brukt til å omdanne en ektotropisk vektor til en amfotropisk vektor.

Et foretrukket viralt genavleveirngssystem utnytter adenovirus-avledede vektorer. Genomet til et adenovirus kan bli manipulert slik at det koder og uttrykker et genprodukt av interesse, men blir inaktivert når dets evne til å replikere i normal lytisk viral livssyklus. Se f.eks. Berkner et al, 1988, Bio Techniques 6:616; Rosenfeld et al, 1991, Science 252:431-434; og Rosenfeld et al, 1992, Cell 68:143-155. Egnede adenovirale vektorer avledet fra adenovirusstammen AD type 5 dl 1324 eller andre stammer av adenovirus (f.eks. Ad2, Ad3, Ad7 etc.) er velkjent for de som kjenner fagfeltet. Rekombinante adenovirus kan være fordelaktig i visse tilfeller ved at de kan bli brukt til å infisere et stort antall av celletyper, inklusiv luftveisepitel (Rosenfeld et al, 1992, sitert supra), endotelceller (Lemarchand et al, 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:6482-6486), hepacyttes (Herz and Gerard, 1993, Proe. Nati. Acad. Sei USA 90:2812-2816) og muskelceller (Quantin et al, 1992, Proe. Nati. Acad. Sei USA 89:2581-2584). Videre er viruspartiklene relativt stabile, og er mottagelig for rensing og konsentrering, og kan bli modifisert for å innvirke på spekteret av infektivitet. I tillegg blir introdusert adenoviralt DNA (og fremmed DNA innehold deri) ikke integrert i genomet til en vertscelle med forblir episomal, for derved å unngå potensielle problemer som kan oppstå som et resultat av insersjonsmutagenese i situasjoner hvor introdusert DNA blir integrert inn i vertsgenomet (f.eks. retroviralt DNA). Dessuten er bærerkapa-siteten til adenoviralt genom for fremmed DNA stor (opptil 8 kilobaser) relativ til andre genavleveringsvektorer (Berkner et al, sitert supra, Haj-Ahmand and Graham, 1986, J. Virol. 57:267). De fleste replikasjonsdefekte adenovirale vektorer som for tiden blir brukt og derfor favoriseres er deletert for alle eller deler av viralt El og E3 gener men bibeholder så mye som 80% av det adenovirale genetiske materiale (se f.eks., Jones et ah, 1979, Cell 16:683; Berkner et al., supra; og Graham et al. in Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed. (Humana, CliftonNJ, 1991) kapittel 7, sidene 109-127).

Et annet viralt vektorsystem som er nyttig for avlevering av en av ekspresjonskonstruksjonene er adeno-assosiert virus (AAV). Adeno-assosiert virus er et naturlig forekomne defekt virus som krever et annet virus, slik som et adenovirus eller et herpesvirus, som et hjelpevirus for effektiv replikasjon og en produktiv livssyklus. (For en oversikt se Muzyczka et al, 1992, Curr. Topics in Micro, and Immunol. 158:97-129). Det er også et av de få virus som kan integrere sitt DNA inn i ikke-delende celler, og utviser en høy frekvens av stabil interaksjon (se f.eks. Flotte et al, 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-354; Samulski et al, 1989, J. Virol. 63:3822-3828; og McLaughlin et al, 1989, J. Virol. 63:1963-1973). Vektorer som inneholder så lite som 300 basepar av AAV kan bli pakket og integrert. Rom for eksogent DNA begrenset til omtrent 4,5 kb. En AAV vektor slik som den som er beskrevet i Tratschin et al, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 kan bli brukt for å introdusere DNA inn i celler. Mange nukleinsyrer har blitt introdusert inn i forskjellige celletyper ved å bruke AAV vektorer (se f.eks. Hermonat et al, 1984, Proe. Nati. Acad. Sei USA 81:6466-6470; Tratschin et al, 1985, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al, 1988, Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al, 1984, J. Virol. 51:611-619; og Flotte et al, 1993, J. Biol. Chem. 268:3781-3790).

I tillegg til virale overføringsmetoder, slik som de som er illustrert over, kan ikke-virale metoder også anvendes til å forårsake dirigert ekspresjon av et ønsket heterologt gen i vevet til et dyr. De fleste ikke-virale metodene for genoverføring baserer seg på normale mekanismer brukt av mammalske celler for opptak av intracellulær transport av makro-molekylet. I foretrukne utførelsesformer, baseres ikke-virale gensystemer seg på endo-cytiske reaksjonsveier for opptak av ekspresjonskonstruksjoner i målcellene. Eksempler på genavlevereirngssystemer av denne typen inkluderer liposomale avleveringssys-temer, poly-lysinkonjugater og kunstige virale kapper.

I klinisk sammenheng kan genavleveringssystemene for terapeutiske ekspresjonskonstruksjoner bli introdusert til en pasient ved mange forskjellige metoder, hvor hver er kjent innen fagfeltet. F.eks. kan et farmasøytisk preparat av genavleveringssystemet bli introdusert systemisk, f.eks. ved intravenøs ekspresjon og spesifikk ekspresjon av konstruksjonen i målcellene forekommer fortrinnsvis fra spesifisitet fra transfeksjonen tilveiebrakt ved celletype eller vevstypeekspresjon på grunn av regulatoriske sekvenser som kontrollerer ekspresjonen av det heterologe genet, eller regulatoriske sekvenser i kombinasjon med genavleveringsredskapet som målsøker spesielle celletyper. I andre utførelsesformer, er initiell avlevering av den rekombinante ekspresjonskonstruksjonen mer begrenset hvor introduksjonen inn i dyret er svært lokal. F.eks. genavleveirngsred-skapet kan bli introdusert ved kateter (se U.S. patent 5,328,470) eller ved stereotaktisk injeksjon (f.eks. Chen et al, 1994. Proe. Nat. Acad. Sei. USA 91:3054-3057). En ekspresjonskonstruksjon kan avleveres i en genterapikonstruksjon ved elektroporering ved å bruke teknikker beskrevet, f.eks, av Dev et al, 1994, Cancer Treat. Rev. 20:105-115.

Farmasøytiske preparater av genterapikonstruksjoner kan bestå hovedsakelig av genavleveringssystemet i en akseptabel diluent, eller kan omfatte en langsom frigivelses-matriks hvor i genavleveringsformidleren er omsluttet. Alternativt kan det fullstendige genavleveringssystemet bli produsert intakt fra rekombinante celler, f.eks. retrovirale vektorer, hvor det farmasøytiske preparatet kan omfatte en eller flere celler som produserer genavleveringssystemet.

5.3.3 Terapeutiske endepunkter og doseringer

En som kjenner fagfeltet vil forstå ut fra legens eller pasientens perspektiv, at nesten all lindring eller forebygging av uønsket symptom assosiert med en cancertilstand (f.eks. smerte, sensitivitet, vekttap og dets like) vil være ønsket. I tillegg er enhver reduksjon i tumormasse eller vekstrate ønsket, så vel som en forbedring i det histopatologiske bilde av tumoren. Derfor, for formålene av denne søknaden, skal betegnelsen"behandling",

"terapeutisk anvendelse" eller "medisinsk anvendelse" brukt heri refererer til en hver og alle anvendelser av de sammensetningene som er angitt i kravene som botemiddel for en sykdomstilstand eller symptomer, eller på annen måte forebygger, hindrer, reversere progresjonen av sykdom eller andre uønskede symptomer.

En effektiv dose og behandlingsprotokoll kan bestemmes ved konvensjonelle metoder, ved å starte med en lav dose i laboratoriedyr og deretter øke dosen mens en overvåker effektene, og systematisk varierer doseregimet. Dyrestudiet, fortrinnsvis pattedyrs-studier, blir vanligvis brukt for å bestemme den maksimale tolererbare dosen, eller MTD, av bioaktivt middel per kilogram vekt. De som kjenner fagfeltet ekstrapolerer ofte doser for effektivitet og for å unngå toksisitet hos andre arter, inklusiv mennesker.

Før menneskestudier for effektivitet settes i gang, hjelper fase I kliniske studier hos normale individer til med å etablere sikre doser. Forskjellige faktorer kan bli tatt med i betraktning av en lege når en bestemmer en optimal dose for et gitt individ. Primært blant disse er toksisiteten og halveringstiden av det valgte heterologe genproduktet. Ytterligere faktorer inkluderer størrelsen på pasienten, alderen til pasienten, den generelle tilstanden til pasienten, den spesielle cancersykdommen som skal behandles, alvorlighetsgrad av sykdommen, tilstedeværelse av andre medikamenter hos pasienten, in vivo aktivitet av genproduktet, og dets like. Utprøvningsdosene vil bli valgt etter overveielse av resultatene av dyrestudier og klinisk litteratur.

F.eks. er en typisk human dose av en adenoviral vektor som inneholder et Hl 9 regulatorisk region operativt koblet til et heterologt gen som koder for et cytotoksisk middel slik som tymidinkinase fra 1 x IO<7> pfu til 1 x IO<10> pfu injisert direkte i tumor-massen per dag. Mer foretrukket, er den daglige dosen av en slik adenoviral vektor injisert direkte i tumoren fra 1 x IO<8> pfu til 1 x IO<10> pfu avhengig av tumorstørrelsen. For en adenoviral vektor som inneholder en Hl9 regulatorisk region operativt koblet til et cytotoksisk genprodukt med forskjellig nivå av toksisitet, vil disse verdiene selv-følgelig endres tilsvarende. Lignende doser av en adenoviral vektor som inneholder en IGF-2 P4 promoter operativt koblet til et heterologt gen som koder for et cytotoksisk middel slik som tymidinkinase kan også bli brukt som et foreslått startpunkt.

Spesielt, der hvor in vivo anvendelse blir brukt, er forskjellige biokjemiske komponenter ifølge den foreliggende oppfinnelsen fortrinnsvis av høy renhet og er i det vesentlige fri for det potensielle farlige forurensinger (f.eks. minst "National Food" (NF) grad, generelt minst analyttisk grad, og fortrinnsvis minst farmasøytisk grad). I den utstrek-ning at et gitt forbindelse må syntetiseres forut for anvendelse, skal slike synteser eller etterfølgende rensing fortrinnsvis resultere i et produkt som er vesentlig fritt for potensielle toksiske midler som har blitt brukt under syntese eller rensingsprosedyrene.

For anvendelse i behandling av cancertilstand hos et individ, kan det også tilveiebringes et kitt eller pakning, i form av et sterilt fylt rør eller ampulle, som inneholder en polynukleotidvektor som inneholder en Hl9 regulatorisk region operativt koblet til et heterologt gen som koder for et cytotokisk middel eller en vektorfrigivende celle. I en utførelsesform inneholder kittet en polynukleotidvektor som inneholder en Hl9 regulatorisk region operativt koblet til et heterologt gen som koder for et cytotoksisk middel, som en administreringsklar formulering, i enten enhetsdose eller multidose-mengde, hvor i pakken inkorporerer en instruksjon for anvendelse av dets innhold for behandling av cancer. Alternativt tilveiebringes i pakken et sterilt fylt rør eller ampulle som inneholder en slik vektorfrigivende celle eller cellelinjer. For lagring og transport kan den vektorfrigivende cellen eller cellelinjen bli frosset. Eventuelt kan pakken også inneholde medium og reagenser for å dyrke den vektorfrigivende celle eller cellelinje.

Oppfinnelsen som har blitt beskrevet, er de følgende eksemplene tilveiebrakt for å illustrere.

6. Eksempel: H19 regulatoriske sekvenser letter ekspresjon

av et heterologt gen i tumorcellelinier

Dette avsnittet beskriver konstruksjonen av forskjellige ekspresjonskonstruksjoner som inneholder et CAT reportergen plassert under kontroll av Hl9 regulatoriske sekvenser og deres overføring inn i flere forskjellige blærecancercellelinjer.

6.1 Materialer og metoder

6.1.1 Cellelinjer og transfeksioner

Blærecancercellelinjene HT-1376, EJ28, T24P, 1197 og UM-UC-3 ble ervervet fra American Type Culture Collection (ATCC) og opprettholdt ifølge ATCC anbefalinger.

Transiente transfeksjoner ble utført ved å bruke kalsiumfosfatpresipiterings-transfek-sjonsmetode. Presipitanter (som inneholdt 7 jo,g plasmid) ble tilsatt i 1 ml medium til 0,3 x IO<6> celler i 30 mm skåler. Etter 16 timer, ble transfeksjonsmediumet fjernet og fersk medium tilsatt. Celle ble høstet 24-96 timer etter transfeksjon og CAT aktiviteten bestemt ved å bruke butyryl-CoA organisk faseekstraksjonsprosedyre (Sambrook et ah, 1989). En alikvot av den organiske øvre fasen (100 ul) ble overført i en scintillasjons-brønn som inneholdt 3 ml scintillasjonsvæske og talt.

6.1.2 Konstruksjon av ekspresjonsvektorene

Plasmidene pCAT basis (som inneholt en CAT reportergen satt inn ved et multipelt kloningssete), pCAT-promoter (som inneholdt CAT reportergenene under kontroll av en SV40 promoter), pCAT-enhancer (som inneholder SV40 enhancer nedstrøms for CAT reportergenet, og et multipelt kloningssete for insersjon av en promoter oppstrøms for CAT reportergenet) og pCAT-kontroll som inneholder CAT reportergenet under kontroll av både SV40 promoter og enhancer) ble alle ervervet kommersielt fra Promega (Madison, WI).

For å konstruere plasmidet pH19E, som inneholder CAT reportergen under kontroll av H19 promoteren, ble H19 promoterregionen (SEQ ID NO:l) først klonet inn i pBluescript IISK<+> (Promega). Et polynukleotid som inneholdt H19 promotersekvensen ble amplifisert fra human placente DNA ved å bruke primerene

PCR produktet ble endepolert ved Klenow enzym og klonet inn i EcoRV setet til pBluescirptIISK+. Det innsatte DNA ble verifisert ved kutting med internt kuttende enzymer PvuII, EcoRI og Apal. Orienteringen av promoteren var motsatt den til lacZ kodene region til vektoren. Promoterregionen ble deretter kuttet ut med kutting med Hindll og Pstl, og det resulterende omtrent 0,9 kb fragmentet ble satt inn i Hindlll-Pstl seter hos pCAT basisk for å produsere pH19E.

Ekspresjonsplasmidene som inneholdt Hl9 enhancerregionen satt inn i begge orienteringene nedstrøms for Hl9 promoter/CAT reportergenet ble konstruert som følger. Et 5 kb SacI fragment som inneholdt Hl9 nedstrøms enhancer (fra +6,0 kb til +11 kg relativt til start av H19 transripsjon) ble klonet inn i SacI setet til pUC19. Enhanserrfagmentet ble deretter kuttet ut med EcoRI og Hindlll og ligert inn i EcoRI-Hindlll setene i pBlueskript IISK<+> for å danne pBhl9En-Sa. pBhH19En-Sa ble partiellt kuttet med BamHI, og 5 kb fragmentet som inneholdt Hl9 enhanceren (og et internt BamHI sete) ble klonet inn i BamHI setet nedstrøms for H19 promoter/CAT reportergenet i pH19E. Plasmidene som inneholdt Hl9 enhancer i både den direkte (pH19EH19D) og reverse (pH19EH19R) orienteringer ble dannet.

6.2 Resultater og diskusjon

Fem forskjellige blærecancercellelinjer HT-1376, EJ28, T24P, 1197 og UM-UC-3 ble hver transfektert med pCAT-basis (kalt P-E i figur 2), pCAT-kontroll (kalt pSV40ESV40 i figur 2), pH19E, pH19EH19D og pH19EH19R. Ekspresjonsresultatene av hver konstruksjon er presentert i figurene 3A-3E. I hver cellelinje, ble det høyeste nivået av CAT aktivitet observert med pCAT-kontrollplasmid som inneholdt både SV40 enhancer og SV40 promoter. Denne konstruksjonen tjente som en positiv kontroll, siden SV40 regulatoriske sekvenser har blitt etablert som indusere for genekspresjon. Imidlertid er SV40 regulatorisk sekvenser ikke tumorcellespesifikk i deres evne til å indusere genekspresjon. Cellelinjene som er transfektert med pH19E, som inneholder CAT reportergenet under kontroll av Hl9 promoteren, utviser også signifikant økt ekspresjon av CAT over bakgrunn. Nivået av induksjon av CAT aktivitet av Hl9 promoteren er fra fem ganger i HT-1376 cellelinje til ti ganger i UM-UC-3 cellelinje. Tilsettning av H19 enhancer til Hl9 promoter/CAT reportergenkonstruksjonene instruerte ytterligere nivåene av ekspresjon i visse cellelinjer. F.eks., i cellelinjene EJ28, T24P og 1197, økte Hl9 enhanceren signifikant ekspresjonen fra Hl9 promoter/CAT reportergenet. Imidlertid ga orienteringen av enhanceren forskjellige resultater i de forskjellige cellelinjer. I cellelinjene HT-1376 og UM-UC-3 hadde enhanceren ingen liten eller ingen effekt på ekspresjonen.

Resultatene viste at human Hl9 promoterregion dirigerer ekspresjon av en operativt koblet heterolog raportergen i mange forskjellige blærecanceravledede cellelinjer. I noen blærecanceravledede cellelinjer, kan Hl9 enhancere ytterligere øke ekspresjon av et reportergen under kontroll av Hl9.

7. Eksempel: Et toksingen under kontroll av H19 regulatoriske sekvenser

7.1 Materialer og metoder

Ekspresjonskonstruksjoner beskrevet over i seksjon 6 er modifisert for å uttrykke en sekvens som koder for et toksisk produkt eller et promedikament isteden for CAT. F.eks., blir sekvensen som koder for CAT genproduktet fjernet og erstattet med en sekvens som koder for herpes simplex virus tymidinkinase (HSV-TK) ved å bruke standard kloningsmetoder som er velkjent innen fagfeltet.

H19/promedikamentekspresjonsplasmidene er transfektert inn i blærecanceravledede cellelinjer som beskrevet over. Når den blir transfektert inn i blærecancercellelinjer, induserer en H19/HSV-TK ekspresjonsplasmid blærecancercellespesifikk cytotoksisitet ved tilstedeværelse av ganciklovir.

8. Eksempel: Ekspresjon av H19 i en musemodell av kiemiskindusert blærekarsinom

8.1 Materialer og metoder

Syttifem ukers gamle hunn C3H/He mus (Charles River) ble holdt med 6 mus i hvert bur og fikk lov til å akklimatisere seg i air-conditionert rom med en 12 timers lys/12 timers mørk syklus. Ved 8 ukers alder, var eksperimentet begynt og musene ble delt uvilkårlig inn i en kontrollgrupper (10 mus) og en eksperimentell gruppe (60 mus). Den eksperimentelle gruppen av mus ble gitt 0,5% N-butyl-N-(4-hydroksynutyl)nitrosamin (BBM) (Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd., Tokyo, Japan) løst i drikkevann ad libitum. Kontrollmusene ble gitt vanlig vann. Dyrene fra begge gruppene ble drept ved 4, 8,12, 16, 20 og 26 uker etter starten på eksperimentet. Blærene ble tatt ut, fiksert og støpt inn i parafinblokker ved å bruke standard prosedyre.

8.1.1 Fremstilling av probe

Et 2,1 kb fragment som inneholdt mus Hl9 kodene region ble subklonet inn i pBluescript II KS plasmid (Stratagene, La Jolla, CA) bak T7 og T3 RNA polymerase-bindingsseter. [<3S>S]-merket antisens Hl9 RNA ble produsert in vitro fra Hindlll-linearisert plasmid DNA ved å bruke T7 polymerase (Boehringer Mannheim) og et Amersham RPN 2006 kit. In vitro dannede transkripter har en spesifikk aktivitet på IO<7 >cpm/ug. Sens Hl9 mRNA fremstilt med T3 polymerase (Boehringer Mannheim) og EcoRI linearisert templat ble brukt som en kontroll.

8.1.2 In situ hybridisering

Parafinvokssnitt (5 uM) av formalinfiksert vev ble montert på 3-aminopropyltri-etoksylan (Tespa, Sigma) overtrukne mikroskopiobjektglass og tørket over natt ved 37°C. Snittene ble vokset av med xylen, fiksert med 4% paraformaldehyd, og deretter behandlet med proteinase K (Sigma). Objektglassene ble acetylert for å redusere ikke-spesifikk binding av proben og dehydrert gjennom etanolserier.

[<35>S]-merkede RNA prober (spesifikk aktivitet på 50.000 cpu/ul) ble hybridisert som beskrevet av Rangini et al, 1991, Mech. Dev. 35:13-24, som utelater tio-AMP trinn. Slidsene ble eksponert for film i 10 dager og motfarget med hematoksylin og eosin. Slidsene ble undersøkt og fotografert ved å bruke et Polyvar (Reichert Jung) mikroskop under lys og mørkfeltsiluminering. Kontrollene inkludert hybridisering med sens RNA probe og RNAse prehybridiseringsbehandling. I tillegg, tjente snitt fra blærer fra voksne friske mus (som ikke uttrykker Hl9) og embryonale museblærer (som uttrykker Hl9) som negative og positive kontroller respektivt.

8.2 Resultater og diskusjon

Ved 26 uker hadde alle overlevende mus i den eksperimentelle gruppen utviklet

palpable blæretumorer. Utstrakt ekspresjon av Hl9 ble observert i de kjemiske induserte blæretumorene. I motsetning til ingen ekspresjon av Hl9 ble detektert i normale voksne blærer. Følgelig, kan denne musemodell for kjemisk indusert blærecancer bli brukt som en dyremodell for å vise tumorspesifikk cytotoksisitet in vivo av konstruksjoner som inneholder Hl9 regulatoriske regioner operativt koblet til et toksingen.

9. Eksempel: Genterapi ved å bruke H19 regulatoriske sekvenser for å

uttrykke et heterologt gen i en musemodell for blærekarsinom H19/toksin eller promedikamentekspresjonsplasmider blir inkorporert inn i liposomer (som beskrevet av Takashita et ai, 1993, J. Clin. Invest. 93:652-651, inkorporert heri ved referanse) for avlevering til museblære in vivo. Musene som ble brukt til dette eksprerimentet har kjemisk induserte blæretumorer som beskrevet over.

I korthet ble 50 ug av plasmid DNA løst i 500 ul av Optimen's serumfritt medium (BRL Life Technoogies, Geithersburg, MD) tilsatt til 250 ul av lipofektamin 250 ul vann.

Blandingen blir inkubert i 30 minutter ved romtemperatur, deretter fortynnet i 10 ml balansert saltløsning (BSS(-): 140 mM NaCl, 5,4 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6). Etter pelletering av løsningen ved sentrifugering ved 15.000 rpm i 30 minutter, blir hposomene resuspendert i 1 ml BSS(-) som inneholder 1 mM CaC^. Omtrent 0,2 ml av de konsentrerte Hposomene blir administrert til mus som har kjemisk induserte blæretumorer via kateter. En kontrollgruppe av mus med blæretumorer som mottar liposomer med uten DNA eller med en konstruksjon som inneholder en relevant gen under kontroll av H19 regulatoriske sekvenser. Ved definerte tidspunkter, blir mus fra hver gruppe avlivet og blæren skåret ut, fiksert og støpt inn i parafinblokker ved å bruke standard prosedyre. Alternative snitt blir fremstilt for in situ hybridisering ved å bruke enten Hl9 probe, som beskrevet over, eller en probe til den kodende sekvensen for pseudomonas toksingen. I tillegg, blir størrelsen, antallet og nekrose av tumorer sammenlignet mellom kontrollen og eksperimentelle grupper. Ekspresjon av Pseudomonas toksin blir funnet å samlelokalisere med ekspresjon av Hl 9 ved blæretumorer fra gruppe med eksperimentelle mus. I tillegg blir blæretumorene i den eksperimentelle gruppen av mus redusert i størrelse og nekrotisk sammenlignet med blæretumorer i kontrollgruppen av mus.

10. Eksempel: Ekspresjon fra IGF- 2 P3 og P4 promotere i tumorcellelinier

10.1 Materialer og metoder

I dette eksperimentet ble forskjellige ekspresjonskonstruksjoner som inneholder luciferaserapportgenet plassert under kontroll av en av de fire forskjellige IFG-2 promoterene ble konstruert og overført til flere forskjellige blærecancercellelinjer. Følgende human IGF-2 promoter/luciferasekonstruksjoner ble fremstilt:

IGF-2 promotersekvensen er beskrevet i Sussenbach et ah, 1992, Growth Reg. 2:1-9, inkorporert heri ved referanse. Lusiferaserapportvektoren er kommersielt tilgjengelig fra Promega. Madison, WI (katalog #E1641).

10.2 Resultater og diskusjon

De resulterende ekspresjonsplasmidene ble transfektert inn i de humane blærecancercellelinjene HT-1376, EJ28, T24P, 1197 og UM-UC-3 som beskrevet over. Luciferase-aktiviteten ble analysert ved bruke et kommersielt kit (Promega, Madison, WI, katalog #E1500). Resultatene, vist i figur 4A-4E, viser at IGF-2 P4 promoter dirigerer ekspresjonen av luciferaserapportgenet i hver blærecancercellelinje som ble testet. I cellelinje 1197, dirigerte også IGF-2 P3 promoteren ekspresjon av luciferaserapportgenet. I etterfølgende eksperimenter, ble IGF-2 P3 og P4 promoterene vist å dirigere ekspresjon av luciferasegenekspresjonen i andre tumorcellelinjer, inklusiv choriokarsi-nomceller og rabdomyosarkomceller.

11. Eksempel: H19 promoter og IGF- 2 promoterfunksjon med H19 enhancer for å lette ekspresjon av et heterologt gen

11.1 Materialer og metoder

Fire lusiveraserapportvektorer, pGL3-basis, pGL3-promoter, pGL3-enhancer og pGL3-kontroll ble ervervet fra Promega. Disse vektorene ble transfektert i dyrkede cellelinjer ved å bruke et antall av forskjellige transfeksjonsreagenser, inklusiv lipofetamin (Gibco/BRL), fugene (Boehringer), Perfeckt Transfection Kit av 8 forskjellige lipidreagenser (Invitrogen), TFX-10, TFX-20, transfast (Promega) og kalsiumfosfat-metoden (Gorman et al, 1982, Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051).

H19 promoteren ble klonet inn i EcoRV setet til pBluescript II SK (pbh 19p #1) beskrevet i avsnittet 6,1, supra. Hl9 promoteren ble kuttet ut med kutting med Smal og Hindlll, og det resulterende 0,9 kb fragmentet ble satt inn i Sma I-Hind III setene til pGL3-basisvektor for å produsere Luc-pbh 19 konstruksjon.

H19 promoterregionen fra nt -819 til +14 ble amplifisert ved PCR fra pbhl9p #1 plasmid, ved å bruke primerene 5'-ATATGGTACCGACAACCCTCACCAAAG-3'

(oppstrøm, SEQ ID NO:8) og 5'-AT AT A AGCTTCTTCTCCCTC ACCCTGCTC-3'

(nedstrøm, SEQ ID NO:9). Det resulterende PCR produktet ble kuttet med Kpnl og Hind III og ligert inn i kpnl-Hind III setene til pGL3-basisvektor, som gav Luc-PBH19 konstruksjonen. Denne PCR dannede Hl9 promoter ble sekvensert i begge retninger ved automatisk fargeterminator cyklussekvenseringsmaskin (ABT Prism 377 DNA sequencer, Perkin Eimer). Figur 5 viser nukleotidsekvensen til Hl9 promoteren (SEQ ID NO: 2) dannet ved PCR. 5 kb Hl9 nedstrømsenhancer beskrevet supra, ble kuttet med DamH for å gi to fragmenter på 4,1 kb og 0,9 kb i 3' ende. Luc-PBH19-0,9EH19 og Luc-PBP19-4EH19 konstruksjoner ble konstruert ved å sette inn 0,9 kg og 4,1 kb BamH I fragmenter fra Hl9 enhanceren i BamH I sete til Luc-PBH19 plasmidet respektivt. Enhancer-sekvensene ble posisjonert nedstrøms for Hl9 promoter/luciferaserapportgenet.

BamH I enhancerfragmentet på 0,9 kb le ligert inn i BamH I setet på pGL-basisvektor for å produsere Luc-0,9EH19 vektor. H19 promoteren til pbhl9p #1 plasmidet ble kuttet med kpnl-BamH I, og ligert inn i Kpnl-BgHI setet til Luc-0,9EH19 konstruksjonen, som ga Luc-pbh 19-0,9EH 19 ekspresjonskonstruksjon som inneholdt promoterklonene som beskrevet supra, og 0,9 kb enhancer nedstrøms for H19/Luc rapportgenet.

Ekspresjonsvektorene ble kalt Hup-1, Hup-2, Hup-3 og Hup-4, som inneholdt luci-ferasegenet under kontroll av de humane IGF-2 promoterene Pl, P2, P3 og P4 respektivt, ble konstruert som beskrevet i Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9. En 512 basepars region av P4 ble amplifisert ved PCR fra Hup-4 konstruksjonen ved å bruke primerene 5'-ACAGGTACCTCTAGAGTCGACCT-3' (oppstrøms, SEQ ID NO: 10) og 5'-AT AT AAGCTTGCTCCC ATCCTGC A-3' (nedstrøms, SEQ ID NO: 11). Det resulterende PCR produktet ble kuttet med Kpnl-Hindlll og ligert inn i Kpnl-Hind III setene til rapportgenvektor pGL3-basis for å produsere Luc-P4 rapportgenvektoren.

Ekspresjonsvektorene som inneholdt IGF-2 P4 promoteren og Hl9 enhanceren ble også fremstilt. Et BamHI enhancerfragment på 2 kb avledet fra 4,1 kb fragment tidligere beskrevet ble klonet inn i BamH I setet til Luc-P4 kontraksjon, som produserte Luc-P4-2EH19 ekspresjonsvektoren.

0,9 kb, 2 kb og 4,1 kb H19 enhancere ble sekvensert ved å bruke automatisk DNA sekvensering. Nukleotidsekvensene til 0,9 kb enhanceren er vist i figur 6 (SEQ ID NO:3). Nukleotidsekvensen til 2 kb enhanceren er vist i figur 7A og 7B (SEQ ID NO:4). Nukleotidsekvensen til 4,1 kb enhanceren er vist i figur 8A-8C (SEQ ID NO: 5).

11.2 Resultater og diskusjon

Når flere transfeksjonsreagenser ble brukt for å introdusere 4 luciferaseinnholdende vektorer inn i dyrkede cellelinjer, produserte kalsiumfosfatpresipitering den høyeste transfeksjonseffektiviteten for de fleste av cellelinjene som ble testet. Derfor var kalsiumpresipitering brukt i det etterfølgende for å transfektere forskjellige ekspresjonsvektorer. I tillegg inhiberte økt konsentrasjon av plasmid DNA ikke transfeksjonseffektiviteten, selv når den ble brukt ved konsentrasjoner over platået.

Blærecancercellelinjer 5637, hepatocellulært karsinom (HCC) cellelinje Huh7 og nyretumorcellelinjer 293T ble hver transfektert med forskjellige konstruksjoner som inneholdt luciferaserapportgenet under kontroll av H19 eller IGF-2 P4 promoter i kombinasjon med Hl9 enhanceren.

Celler som ble transfektert med Luc-phl9 og Luc-PH19 som inneholdt rapportgenet og Hl9 promoteren utviste økt genekspresjon over bakgrunnen (figur 9A-9C). Konstruksjonen Luc-PH19 som inneholdt PCR-dannet promoter viser en høyere aktivitet enn Luc-phl9 i hver cellelinje som ble testet. I tillegg til Hl9 økte 0,9 kb enhancerfragmentet hos Luc-phl9 repportvektor (Luc-phl9-0,9EH19) ytterligere nivået av ekspresjon fra 2 til 4 ganger i henholdsdvis cellelinjene 5637 og 293T.

IGF-2 P4 promoter økte også ekspresjon av luciferase i alle cellelinjene over bakgrunn. Tilsetning av 2 kb Hl9 enhancerfragementet til Luc-P4 ekspresjonsvektoren økte P4 promoteraktiviteten. Nivået av injeksjon av luciferaseaktivitet ved 2 kb enhancerfragmentet varierte fra to ganger i 293T cellelinje til seks ganger i Huh7 cellelinje, mens enhanceren bare marginalt økte promoteraktiviteten i 5673 celler.

Figur 10A-10E viste at ekspresjon av kontraksjonen Luc-phl9-4EH19 som inneholdt både PCR dannet Hl9 promoter og 4,1 kb Hl9 enhancerfragment. Enhanceren økte aktiviteten av promoteren med 3-28 ganger i cellelinjer med unntak av 5637 cellelinjen.

12 DEPONERING AV KLON

Følgende plasmid ble deponert ved American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA under Budapestavtalen når det gjelder "the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure:"

Claims (13)

1. Vektor for å uttrykke en sekvens i en tumorcelle, karakterisert ved at vektoren omfatter et polynukleotid som omfatter en Hl9 regulatorisk sekvens operativt koblet til en heterolog sekvens som koder for et cytotoksisk genprodukt.

2. Vektor ifølge krav 1, karakterisert ved atdenH19 regulatoirske sekvens er Hl9 promoteren, Hl9 forsterkeren eller både Hl9 promoteren og Hl9 forsterkeren.

3. Vektor ifølge krav 2, karakterisert ved atH19 promoteren omfatter: a) nukleotidene 1 til 830 fra SEQ ID NO:l; eller b) sekvensen fra SEQ ID NO:2.

4. Vektor ifølge krav 2, karakterisert ved atH19 forsterkeren omfatter: a) sekvensen fra H19 forsterkeren klonet inn i plasmid pH 19EH19 (ATCC deponeringsnummer 209322); b) sekvensen fra SEQ ID NO:3; c) sekvensen fra SEQ ID NO:4; eller d) sekvensen fra SEQ ID NO:5; hvori, eventuellt forsterkeren er plassert 3' til den heterologiske sekvensen.

5. Vektor ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den heterologe sekvens: a) er valgt fra gruppen bestående av den kodene sekvensen for galaktosidase, difteritoksin, pseudomonatoksin, ricin, koleratoksin, retinoblastmagen, p53, herpes simplex tymidinkinase, varicellazostertymidinkinase, cytosindeaminase, nitroreduktase, cytokrom p-450 2B1, tymidinfosforylase, purinnukleosidfosforylase, alkalisk fosfatase, karboksypeptidaser A og G2, linamarase, laktamase og xantinoksidase; b) er en antisenssekvens som spesifikt hybridiserer til en sekvens som koder for et gen selektert fra gruppen bestående av cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyklinE, cyklinA, cdk4, onkogene former av p53, c-fos, c-jun, Kr-ras og Her2/neu; eller c) koder for et ribozym som spesifikt kutter et RNA som koder for et gen selektert fra gruppen bestående avcdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyklinE, cyklinA, cdk4, onkogene former av p53, c-fos, c-jun, Kr-ras og Her2/neu.

6. Vertscelle, karakterisert ved at den inneholder en vektor ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvori vertcellen ikke er i en menneskekropp.

7. Vektor ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert v e d at tumorcellen er en blære tumor celle.

8. Vektor ifølge krav 7, karakterisert ved at blære tumor cellen er valgt fra gruppen bestående av Ht-1376, EJ28, T24P, 1197 og Um-UC-3.

9. Anvendelse av en vektor som definert i hvilket som helst av kravene 1-5, 7 og 8 for fremstilling av et medikament for: a) å utrykke den heterologe sekvens i en tumorcelle, hvori den regulatoriske sekvens er en Hl9 regulatorisk sekvens som spesifikt blir utrykt i tumorcellen; eller b) behandling av kreft.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvori medikamentet er for behandling av et individ som har en tumor eller kreft valgt fra gruppen bestående av blærekarsinom, hepatocellulært karsinom, hepatoblastoma, rabdomyosarkom, ovarikarsinom, servisk karsinom, lungekarsinom, brystkarsinom, squamous cellekarsinom i hode og nakke, spiserørskarsinom, tyroidkarsinom, astrocytoma, ganglioblastom og neuroblastom.

11. Fremgangsmåte for å uttrykke en heterolog sekvens i en tumorcelle in vitro, karakterisert ved at det omfatter å introdusere inn i tumorcellen en vektor som definert i hvilket som helst av kravene 1-5, 7 og 8.

12. Anvendelse ifølge krav 9, hvori medikamentet er for behandling av kreft og det cytotoksiske genprodukt er valgt fra gruppen bestående av difteritoksin, pseudomonatoksin, ricin, kolera toksin, retinoblastomgen og p53.

13. Anvendelse ifølge krav 9, hvori medikamentet er for behandling av kreft og det cytotoksiske genprodukt er et cytostatisk genprodukt.