KR20010030912A - 종양 특이적인 세포독성을 유도할 수 있는 방법 및 조성물 - Google Patents
종양 특이적인 세포독성을 유도할 수 있는 방법 및 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 종양 세포안에서 전사 조절 서열의 제어 하에서 세포독성 생성물을 인코드하는 등의 이형 서열을 특이적으로 발현시키는 것에 관계한다. 특히 적절한 프로모터는 H19 조절 서열, IGF-1 프로모터, IGF-2 P3 및 P4 프로모터를 포함한다. 발명에는 이와 같은 발현 구조체를 투여하는 방법 및 발현 구조체를 제공한다. 본 발명의 조성물 및 빙법은 암을 치료하는데 유용하다.
Description
2.1. H19 유전자
H19 유전자는 사람에 이식되는 것으로 알려진 몇 가지 유전자중에 하나이다(Hurst et al., 1996, Nature Genetics 12:234-237). 배발생시작시에, H19는 염색체 대립형질에서 발현된다(DeGroot et al., 1994, Trophoblast 8:285-302). 바로 직후에, 모 대립형질의 침묵이 일러나고, 단지 모계에서 유전된 대립형질만 전사된다.
H19는 배발생동안에 풍부하게 발현되고, 이는 처음 유전자로 확인되었는데, 이는 trans-작용 위치 raf에 의해 간에서 알파-태아단백질과 공동으로 조절된다(Pachnis et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5523-5527). 또한, H19는 조직 분화동안에 발현되는 유전자를 분리하는 것을 목표로 하는 스크리닝을 이용하여 유전자 집단에 의해 독립적으로 클론된다. 예를 들면, Davis et al.(1987, Cell 51:987-1000)는 C3H10T1/2 세포의 분화 초기에 유전자 활성에 대해 스크리닝하는데 있어서, 생쥐의 H19 상동부분을 확인하였다. Pourier et al. (1991, Development 113:1105-1114)은 뮤린 H19가 간(stem) 세포 분화 및 이식하는 동안에 발현된다는 것을 알았다. 사람 H19 유전자가 사람의 태반에서 세포영양배엽이 분화하는 동안에 전사된다는 것을 발견하였다(Rachmilewitz et al., 1992, Molec. Reprod. Dev. 32:196-202).
H19 RNA의 전사가 태아의 일생 및 태반 발생을 통하여 상이한 배아 조직에서 일어나는데, 출생후에는 H19의 발현이 하향 조절된다는 것이다. 뮤린 어른 근육 및 간에서는 H19의 전사 수준이 상대적으로 낮다는 것이 보고된 바 있다(Brunkow and Tilghman, 1991, Genes ＆ Dev. 5:1092-1101). H19는 EH한, 암 세포에서 출생후에 활성화된다. Ariel et al. (1997, Molec. Pathol. 50:34-44)는 출생전에 발현되는 조직에서 발생되는 다수의 종양에서 H19 발현을 설명하였다. 또한, 이들은 신경 조직에서 유도된 종양, 특히 H19의 발현과 연관이 없는 것으로 공지된 성상세포종 및 신경절아세포종에서 H19 RNA를 발견하였다. H19 RNA를 발현하는 대량의 암 라인이 제공된다면, 이들은 H19가 oncofetal성 RNA이고, 사람의 신형성증에 대한 종양 표식으로 H19를 연구할 필요가 있다는 것이다.
사람 및 뮤린의 H19 유전자 모두가 클론되어 서열화되었다(Brannan et al., 1990, Molec. Cell. Biol. 10:28-36). 사람 및 뮤린의 H19 유전자를 비교하면, 전반적으로 77%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 가진다. 종간에 뉴클레오티드 상동성이 보존된다 하더라도, 두 유전자의 오픈 리딩 프레임에서 유추된 아미노산 서열 상동성이 매우 낮다는 것을 예측할 수 있다. 또한, H19 RNA가 RNA 폴리메라제 Ⅱ에 의해 전사되고, 접합되고, 폴리아데닐화되더라도, 이는 해독되는 것으로는 보이지 않는다. 대신, H19 RNA는 28S 세포질 RNA와 연관되어, H19 RNA가 리보뉴클레오프로테인의 RNA 성분으로 기능을 하는 것으로 유추할 수 있다(Id).
실제로 H19의 생리학적 역할에 대해서는 충분히 이해되지 않았다. H19는 우성 치사 유전자로 작용을 하고, H19 형질전환 유전자의 상당한 이형 발현으로 출생후 생쥐가 바로 즉사하는 원인이 된다(Brunkow et al., supra). 이와 같은 치사 기간은 H19 전사가 억제되는 시간과 일치한다. 다른 한편, H19 녹아웃 대립형질을 가지는 이형접합체 또는 동형접합체에서는 결함이 발견되지는 않는다(Leighton et al., 1995, Nature 375:34-39). 모계 유전되는 대립형질의 녹아웃은 유전적으로 연결되고, 반대편으로 이식되는 IGF-2 유전자의 이식을 방해하여; 생성된 생쥐는 이들의 한배에 있는 새끼에 비해 더 큰데 그 이유는 IGF-2의 출생전 발현이 증가되었기 때문이다(Id.). 이와 같이 두 개의 반대로 이식된 유전자는 cis-작용 조절 서열을 공유하기 때문에, Leighton 및 그의 동료들은 H19가 IGF-2 유전자의 이식에 관련된 것으로 판단하고 있다.
H19 유전자 생성물에 대해 제안된 또 다른 기능은 종양 억제 RNA이다. Hao et al. (1993, Nature 365:764-767)은 두 개의 배아 종양 세포주인 RD 및 G401를 H19 발현 구조체로 트랜스펙션시키면, 세포 생장이 지연되고, 형태학적 변형이 일어나고, 누드 생쥐에서 종양발생이 감소된다. 이와 같은 종양 억제 활성은 모체의 H19 eo에 대해 녹아웃된 생쥐의 크기가 커지고, 생쥐에서 기형 발현의 치사성(Hao et al., supra)과 일치하는 것으로 나타났다(Leighton et al., supra). 그러나, H19가 종양 억제물질이라는 제안은 여전히 논쟁의 여지를 제공하고 있다. 일부 결과는 다시 반복 재생되지 않는 것으로 보고되고 있어, H19와 매우 밀접하게 연결된 또 다른 추천되는 종양 억제 물질이 존재한다는 것이다(Ariel et al., supra). 종양 억제물질로의 H19의 제안된 역할은 H19가 다양한 종양 세포에서 활성화된다는 실험 자료와는 충돌되는 것이다(see for example Lustig-Yariv et al., 1997, Oncogene 23:169-177).
2.2. 인슐린-형 생장인자(IGF) 유전자
IGF-2는 모체 기원에 따라 발현되는 또 다른 각인(imprinted) 유전자이다. 그러나, H19와는 대조적으로, 생쥐 및 사람 모두에서 IGF-2는 모체로부터 각인되어 모체로부터 유전된 대립형질로부터 발현된다(Rainier et al., 1993, Nature 363:747-749). 사람 IGF-2 유전자는 복합적인 전사 패턴을 나타낸다. 조직 및 발생학적으로 특이적인 방식으로 활성화되는 것으로 4가지 IGF-2 프로모터가 있다. 이들 프로모터중 세 가지 즉 P2, P3, P4만 각인되고, 태아 발생동안에 그리고 암 세포에서 활성화된다. 네 번째인 P1 프로모터는 각인되지 않고, 이는 성인 간 및 융모막 총에서만 활성화된다(see Holthuizen et al., 1993, Mol. Reprod. Dev. 35:391-393). IGF-2 유전자의 P3 프로모터는 간 경화 및 간세포 암종의 진행에 관여하는 것으로 밝혀졌다(Kim and Park, 1998, J. Korean Med. Sci. 13:171-178).
IGF-2의 각인 상실은 Wilm의 종양에 복합되어 있다(Ogawa et al., 1993, Nature 363:749-751). 이와 같은 관찰로 인하여 많은 연구자들은 각인된 유전자의 각인 상실 및 이중 대립형질 발현의 상실은 생장 질환 및 암 발생과 연관이 있는 것으로 생각하게 한다(see also Rainier et al., 1993, Nature 362:747-749. and Glassman et al., 1996. Cancer Genet. Cytogenet. 89:69-73).
2.3. 종양-특이적인 유전자 치료법
종양과 연관된 유전자에서 구한 조절 서열을 이용하여 종양에서 유도된 세포에서 자살 유전자를 선택저으로 표적 발현시킨다. 예를 들면, 간세포암종에서 알파-태아단백질 발현을 유도한다. Huber et al. (1991, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 88:8039-8043)는 알무민 유전자 또는 알파-태아단백질 유전자에서 유도된 기준 서열을 이용하여, 간암종 세포에 수두-대상포진 티미딘 카이나제(VZV TK) 유전자를 인코드하는 서열을 표적 발현시킨다. 이와 같은 발현 구조체중 하나를 포함하는 레트로바이러스로 in vitro에 감염된 간암종 세포는 VZV TK를 발현하고, 정상적인 비-독성 프로드럭 6-메톡시퓨린 아라비노뉴클레로시드(araM)에 감응성을 가지게 된다. Kaneko et al. (1995, Cancer Res. 55:5283-5287)는 알파-태아단백질 기준 서열의 제어하에서 HSV TK를 발현시키는 아데노바이러스성 벡터를 작제한다. 이와 같은 벡터를 포함하는 재조합 아데노바이러스성 입자를 무흉선 누드 생쥐에서 발생된 간세포 암종-유도된 종양으로 직접 주사하였다. 강시클로비어를 연속하여 복막으로 주사하면, 간세포 암종-유도된 종양이 퇴행된다.
Osaki et al. (1994, Cancer Res. 54:5258-5261)는 A549 폐 암종 세포로 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 카이나제(HSV TK)의 코딩 서열에 연결된 폐 태생기암 항원 유전자의 기준 서열을 포함하는 발현 구조체를 트랜스텍션시킨다. 트랜스펙트된 세포는 강시클로비어(ganciclovir)에 감응성이 있다. 피하로 주사된 트랜스펙션된 세포로부터 누드 생쥐의 종양 생장은 강시클로비어(ganciclovir)를 반복적으로 복막으로 주사함으로써 저해를 받는다. 그러나, 태생기암 항원 유전자는 정상 결장 점막에서 발현되는 것으로 최근 밝혀졌고, 이는 이와 같은 기준 서열을 종양 특이적인 조절 부분으로 이용하는 것을 제한한다는 것이다(Osaki et al., supra). 따라서, 종양 세포에서 특이적으로 유전자 생성물을 발현시키는 유전자 치료 벡터를 개발할 필요가 있다.
3. 발명의 요약
본 발명은 종양 세포에서 이형성 유전자를 선택적으로 발현시킬 수 있는 방법 및 조성물에 관계한다. 특히, 본 발명은 이형 유전자에 연결된 전사 조절 서열로 구성되어, 이형 유전자를 종양-특이적으로 발현시키는 폴리뉴클레오티드에 관계한다. 좀더 구체적으로는 전사 조절 서열은 H19, IGF-2 P3, P4 프로모터와 같은 암 세포에서 특이적으로 발현되는 게놈상으로 각인된 유전자에서 유도되고, 이형 유전자는 세포독성 단백질 또는 세포정격 유전자 생성물을 인코드한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, IGF-1 프로모터는 이형 유전자에 작동식으로 연결되어, 종양-특이적으로 유전자를 발현시키게 된다. 조절 서열은 여러 가지 다른 암 세포 타입에서 유전자 발현에 관계한다. 이와 같은 방법 및 조성물은 다양한 암과 과증식성 질환을 치료하는데 유용한다.
본 발명의 한 특징은 이형성 유전자에 연결된 이와 같은 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구서오딘 발현벡터에 관계한다. 특히 적절한 조절 서열에는 IGF-2 P3 또는 P4프로모터 및 IGF-1 프로모터등의 프로모터 및 인헨서 서열과 같은 H19 조절 부분을 인코드하는 것이다. 이와 관련하여, H19 인헨서 및 이의 활성 부분을 H19 프로모터, IGF-1 프로모터, IGF-2 P3 프로모터, IGF-2 P4 프로모터와 복합하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에는 이와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포도 포함된다. 이에 대해, H19 인헨서 유무에 관계없이, H19 프로모터에 의해 조절되는 이형 유전자와 H19 인헨서와 복합하여 IGF-1 프로모터 또는 IGF-2 P3 프로모터 또는 P4 프로모터에 의해 조절을 받는 이형 유전자를 포함하는 제 2 구조를 세포에 공동으로 도입시킬 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포에서 이형 유전자를 발현시키는 이와 같은 벡터를 이용한다. 본 발명의 또 다른 특징은 유전자 치료법에서 본 발명의 벡터를 이용하여 암을 치료하는 것이다.
본 출원은 1997년 10월 3일자로 출원된 08/943,608의 연속출원이다.
본 발명은 종양 세포 생물학 및 암 치료에 관계한다. 좀더 특이적으로는, 본 발명은 이형성 유전자의 특이적인 발현에 관계하는데, 종양 세포에서 세포독성 생산물을 인코드하는 유전자의 발현에 관계한다.
도 1A-C는 사람의 H19 프로모터 부분의 뉴클레오티드 서열이다. 뉴클레오티드 위치 -837 내지 -7(전사 시작 부분에 대해)의 프로모터 부분을 나타낸 것이다(서열:1).
도 2는 H19 조절 서열의 제어하에서 이형 유전자를 발현시키는데 이용되는 벡터를 구조적으로 나타낸 것이다.
도 3은 Bladder Cancer Cell Lines에서 이형 유전자(CAT)의 H19 조절 서열에 직접적인 발현을 나타낸다. 5가지 다른 지적한 세포주에서, IGF-2 P3 특이 활성(cpm/7g protein)은 트랜스펙션에 이용되는 벡터에 대한 함수로써 플로팅한다. 도 3A는 HT-1376 세포. 도 3B는 EJ28 세포. 도 3C는 T24P세포. 도 3D는 1197세포. 도 3E는 UM-UC-3세포. 다음에서 볼 수 있는 벡터는 단락 6에서 상세하게 설명한다;(1) pCAT-기본; (2) pCAT-기준; (3) pH19E; (4) pH19EH19D; (5) pH19EH19R.
도 4A-4E에서는 Bladder Cancer Cell Lines에서 이형 유전자(루시페라제)의 IGF-2 P3 및 P4 프로모터 직접적인 발현을 나타낸 것이다. 나타낸 것과 같이 5가지 다른 세포주에서, 루시페라제 활성(counts per g protein)은 루시페라제 발현시키는 트랜스펙트된 구조에 이용된 IGF-2 프로모터에 대한 함수로 플롯팅하였다. 도 4A는 T24P 세포. 도 4B는 1376 세포. 도 4C는 UM-UC3 세포. 도 4D는 1197 세포. 도 4E는 EJ28 세포. 벡터는 단락 10에서 좀더 상세하게 설명한다.
도 5는 사람의 H19 프로모터 단편의 뉴클레오티드 서열이다(서열:2).
도 6은 0.9kb의 사람 H19 인헨서 단편의 뉴클레오티드 서열이다(서열:3).
도 7A 및 7B는 2kb의 사람 H19 인헨서 단편의 뉴클레오티드 서열이다(서열:4).
도 8A-C는 4kb의 사람 H19 인헨서 단편의 뉴클레오티드 서열이다(서열:5).
도 9A-9는 다양한 H19 조절 부분 및 P4 프로모터를 포함하는 벡터로 트랜스펙션시켜 종양 세포에서 루시페라제 발현을 나타낸다. 도 9A는 5637세포. 도 9B는 Huh7 세포. 도 9C는 293T 세포.
도 10A-10E는 종양 세포에서 루시페라제 발현에 관계하는 H19 조절 서열을 포함하는 벡터로 트랜스펙션한 것을 나타낸다. 도 10A는 293T 세포. 도 10B는 T24P 세포. 도 10C는 Huh7 세포. 도 10D는 5637 세포. 도 10E는 RT112 세포.
본 발명은 암 세포에서 발현될 수 있는 게놈상으로 각인된 유전자의 조절 부분을 이용하여 암세포에서 원하는 코딩 서열을 표적 발현시킬 수 있다것을 발견한 것에 부분적으로 기초한 것이다. 특히, 강범위한 암종에서 H19 발현이 활성화되는데, 이때 암종에는 방광 암종, 간세포 암종, 간진성종양, 횡문근육종, 난소 암종, 경부 암종, 폐 암종, 유방 암종, 머리 및 목에서 측두린 세포 암종, 식도 암종, 갑상선 암종, 성상세포암종, 신경아세포종, 신경절아세포종등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 또한, 이형 유전자에 연결된 H19 프로모터 부분을 포함하는 구조체 또는 이형 유전자에 연결된 IGF-2 P3 또는 P4 프로모터를 포함하는 구조체 또는 H19 인헨서의 하류와 복합된 이와 같은 프로모터를 포함하는 구조체는 종양 세포에서 특이적으로 활성화된다. 또 다른 본 발명의 특징에 있어서, IGF-1 프로모터를 이용하여 이형 유전자를 직접적으로 발현시킨다.
따라서, 본 발명의 한 가지 특징으로, 본 발명은 암 세포의 표현형을 변경시키거나 선택적으로 죽일 수 있는 방법 및 조성물을 제공한다. 이를 위해서는 이형 유전자에 연결된 암세포에서 발현될 수 있는 게놈상에서 각인된 유전자로부터 기인된 조절 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 세포로 운반하면 된다. 이형 유전자는 세포독성 또는 세포정균성 물질(가령, 독소, 안티센스 RNA 또는 리보자임)을 인코드한다.
암세포에서 발현될 수 있는 게놈상에서 각인된 유전자의 조절 부분에는 H19 프로모터, 인헨서, IGF-2 P3 및 P4 프로모터등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.
여기에서 설명하는 본 발명의 목적에서, "조절가능하도록 연결된"이란 의미는 뉴클레오티드 서열이 조절 서열에 의해 지시를 받아 뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있는 방식으로 조절 서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
"이형 유전자"는 본 출원에 맞게, H19의 조절 서열에 정상적으로 작동되도록 연결되지 않은 유전자 서열을 말한다. 일반적으로 이형성 유전자 서열에는 세포 정균 및 세포독성 유전자 생성물을 인코드하는 서열을 포함한다.
여기에서 이용된 것과 같이, "발현"이란 원하는 DNA의 전사, 접합, 프로세싱 및 안정도 그리고 이에 상응하는 mRNA 전사체의 해독등을 말하는 것이다. 운반될 DNA의 구조에 따라, 발현이 일시적이거나 지속적일 수 있다.
5.1. H19 유전자, IGF-2 P3, P4 프로모터 및 IGF-1 프로모터
여기에서 설명하는 것은 종양 세포에서 이형 유전자 서열에 관계하는데 이용하는 H19 조절 서열이다. 이와 같은 H19 조절 서열에는 H19 프로모터 상류 부분 및 H19 인헨서 하류 유전자를 포함한다. 한 가지 H19 프로모터 부분의 뉴클레오티드 서열을 도 1A-1C(서열:1)에 나타내었다. 이와 같은 830개 뉴클레오티드 서열은 캡 부위의 -837에서 -7 뉴클레오티드까지 이어진다(as described in Brannan et al., supra). 콘센선스 TATA 서열은 -27 내지 -35 뉴클레오티드에서 발생한다. 두 개 콘센선스 AP2 결합 부위(8/9메취)는 전사 개시부위 상류에서 약 -500 내지 -40 뉴클레오티드에서 발생한다. 하기에서 좀더 상세하게 설명하겠지만, 이형 유전자에 대한 코딩 부분의 상류에 놓을 경우에, 약 830bp의 조절 부분 염기쌍으로 내생 H19를 발현시킬 수 있는 암 세포에서 작동가능하게 연결된 이형 유전자를 충분히 발현시킨다. 또한, 뉴클레오티드 -819 내지 +14 사에에 있는 또 다른 H19 프로모터 부분(도 5, 서열 2)으로도 암세포에서 조절식으로 연결된 이형 유전자를 발현시킬 수 있다.
사람 H19 유전자의 하류 인헨서 부분을 H19 프로모터/이형 유전자 구조에 선택적으로 첨가하여, 종양 세포-특이적인 발현 수준을 강화시킨다. 하기에서 좀더 상세하게 설명하겠지만, 하류 인헨서 부분에는 전사 개시 부분에 대해 +6kb 내지 +11kb까지 이어진 SacI 제한 효소 단편을 포함한다. 인헨서 서열에서 예측할 수 있는 것과 같이, 하류 인헨서는 H19 프로모터의 조절하에서 이형 유전자의 코딩 부분의 하류에 역으로 또는 바른 방향으로(이는 내생 H19 유전자에 있는 H19 인헨서의 방향에 대해) 위치하는 경우에 이의 효과를 발휘한다. 또한, 이 서열을 포함하는 인헨서의 단편은 도 6, 7A, 7B, 8A-8C(서열:3-5)에 나타내는데, 이는 유전자 발현을 실행하는데 이용된다.
IGF-1 유전자 발현은 폐 암 및 유방 암과 관련된 것으로 보인다. IGF-1 프로모터(사람의 IGF-1 유전자 서열에서 뉴클레오티드 1 내지 1630사이에 뉴클레오티드 서열)(Genbank accession number M12659 M77496 incorporated herein by reference; Rotwein et al., 1986, J.Biol. Chem. 261:4828-4832).
네 가지 상이한 프로모터 유전자중 하나를 이용하여 IGF-2 유전자 생성물을 발현시킨다. 이들 네가지 프로모터중 세 개가 각인되고, 이는 배아 조직에서 발현된다; 그러나, 프로모터 P1은 성인 조직에서만 활성화된다(Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9). P3 프로모터는 간암종에 관련된 것으로 보인다. 각인된 P4 프로모터(IGF-2 db의 뉴클레오티드 서열 -546 내지 -102) 및 P3 프로모터(IGF-2 유전자의 뉴클레오티드 서열 -1229 내지 -140)은 사람의 방광 암세포에서 활성화되고, 이는 종양 세포에서 이형 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 발견하였다. IGF-2 P3 및 P4 프로모터를 H19 인헨서 또는 이의 활성 단편과 복합하여 이용할 수 있다.
암세포에서 발현될 수 있는 게놈상으로 각인된 그리고 비-각인된 세포에서 이와 같은 조절 서열은 원하는 종양 특이적인 발현을 얻는데 필요한 최소 조절 서열로 정의할 수 있을 것이다. 예를 들면, 프로모터 부분을 추가, 치환, 결손등으로 변경시키고, 종양 특이적인 기능을 보유하는 지를 검사한다. H19 프로모터에서 전사를 장화시키는 능력에 대해 H19 하류 인헨서의 다양한 부분을 개별적으로 테스트할 수 있다.
당분야에 공지된 화학적 그리고 효소적 방법을 이용하여 조절 서열을 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 제한 효소부위로 정의되는 서열 부분을 결손시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드-관련된 돌연변이 발생을 이용하여, 한정된 방식으로 서열을 변경시키거나 또는 서열내에 특정 부분에 제한효소 부위를 도입시킬 수 있다. 또한, Ba131 또는 ExoⅢ 및 S1 뉴클레아제와 같은 DNA 뉴클레아제를 이용하여 결손 돌연변이를 만든다. DNA를 시간을 증가시키면서 뉴클레아제와 배양시켜, 조절 서열에 점진적으로 결손 범위를 증가시킬 수 있다(See Ausubel, et al., 1989 Current Protocols for Molecular Biology, for a review of mutagenesis techniques).
변경된 서열에 대해 적절한 숙주 세포 특히 H19를 발현시키는 암종에서 유도된 세포(예를 들면, 방광 암종 세포)에서 이형 코딩 서열을 종양 특이적으로 발현시키는 능력이 있는 지에 대해 테스트한다. 종양 특이적인 발현을 지시할 수 있는 능력을 보유하고 있는 임의 변경된 조절 서열을 추가 사용을 위해 재조합 발현벡터에 결합시키는 것도 본 발명의 범위에 속한다.
다양한 범위의 이형 유전자를 이와 같은 조절 서열 제어하에서 발현시키는데, 예를 들면, 독성 유전자 생성물을 인코드하는 유전자, 독성 유전자 물질 가능성이 있는 것을 인코드하는 유전자, 항-증식 또는 세포정균 유전자 생성물등이 된다. 효소(가령, CAT, 베타-갈락토시다제, 루시페라제), 형광 단백질, 그린색 형광 단백질 또는 항원성 표식을 포함하는 표식 유전자도 발현될 수 있다.
세포독성 유전자는 독소 및 아팝토시스-유도 유전자를 포함하는 것으로 광범위하게 정의할 수 있다. 또한, 본 발명의 목적에서, 프로-드럭을 세포독성 생성물로 전환시킬 수 있는 약물 대사 효소등이 세포독성 유전자 생성물에 포함된다. 본 발명의 방법에 이용되는 세포독성 유전자 생성물을 예로 들면, 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리친, 콜레라 독소, PE40, 망막아종 및 p53과 같은 종양 억제 유전자등으로 구성된다. 또한, 세포 아팝토시스를 유도하는 아팝토시스성 펩티드를 인코드하는 서열을 이용할 수 있다. 아팝토시스 펩티드에는 Alzheimer's 베타 펩티드(see LaFerla et al., 1995, Nat. Genet. 9:21-30), 나트륨 이노성 펩티드(see Wu et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:14860-14866), 칼시토닌 유전자 관련된 펩티드(see Sakuta et al., 1996, J. Neuroimmunol. 67:103-109) 및 다른 공지의 아팝토시스 펩티드등이 포함된다.
프로-드럭을 세포독성 생성물로 전환하는 약물 대사 효소에는 티미딘 카이나제(허피스 심플렉스 또는 수두-대상포진 바이러스), 사이토신 디아미네이즈, 니트로환원효소, 사이트크롬 p-450 2B1, 티미딘 포스포릴라제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 알칼리 포스포타제, 카르복시펩티다제 A 및 G2, 리나마라제, 람타마제, 산틴 산화효소(see Rigg and Sikora, August 1997, Mol. Med. Today, pp. 359-366 for background)등이 포함된다.
또한, 현재 이용하는 발현 구조체를 이용하여 안티센스, 항원, aptameric 올리고뉴클레오티드를 암세포로 운반시킬 수 있다. 리보자임 또는 단일 가닥 RNA가 암 세포에서 발현되어, 특정 유전자의 발현을 저해시킬 수 있다. 이와 같은 안티센스에 대한 표적 유전자 또는 리보자임 분자는 세포 유지에 필수적인 또는 암 세포 표현형의 유지에 필수적인 유전자 생성물이 될 수 있다. 이와 같은 표적 유전자에는 cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyclinD1, cyclinE, cyclinA, cdk4등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.
예를 들면, 암 페소에서 발현될 수 있는 각인된 유전자 또는 IGF-1 프로모터의 조절 서열하에서 안티센스 RNA 또는 p53, c-fos, c-jun, Kr-ras, Her2/neu의 전사체에 특이적인 리보자임을 발현시킬 수 있는 벡터를 세포로 도입시켜, 내생 유전자의 발현을 하향 조절한다. H19를 발현시키고, H19 조절 서열을 활성화시키는(또는 IGF-1, IGF-2 P3 또는 P4 프로모터를 특이적으로 발현시키는) 종양세포로 안티센스 RNA 또는 리보자임 RNA의 발현을 특이적으로 표적화시킨다.
안티센스 방법은 표적 mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드(이 경우에, mRNA)의 고안하는 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상보적인 표적 mRNA 전사체에 결합하여 해독을 방해한다. 절대적인 상보체가 요구되지는 않는다. 여기에서 언급하는 RNA 부분에 "상보적인" 서열이란 RNA와 하이브리드할 수 있어, 안정한 이중나선을 만들 수 있을 정도의 충분한 상보성을 가지는 서열을 말한다. 일반적으로 하이브리드되는 핵산 서열이 길수록, RNA와 미스메취되는 염기가 더 많지만, 여전히 안정한 이중나선을 형성한다(일부의 경우에, 삼중나선을 만들 수 있다). 당업자는 하이브리드된 복합체의 용융점을 결정하는 표준 과정을 이용하여 허용할 수 있을 정도의 미스메취를 확인할 수 있다.
표적 메시지의 5'말단에 상보적인 올리고뉴클레오티드 가령, AUG 개시 코돈을 포함하고, 5' 해독안된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 해독을 저해하는데 가장 효과적이라는 것이다. 그러나, mRNA의 3' 해독안된 서열에 상보적인 서열이 mRNA의 해독을 저해하는데 효과적이라는 것을 알 수 있다(Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335). 따라서, 표적 유전자 전사체의 5' 또는 3' 비-해독된, 비-코딩 부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 안티센스 방식에 이용하여 내생 유전자의 해독을 방해한다. mRNA의 5' 해독안된 부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 해독의 저해물질로는 효과가 다소 적지만, 본 발명에서 이용할 수는 있다. 표적 mRNA의 5', 3' 또는 코딩 부분에 하이브리드될 수 있도록 고안된 경우에, 안티센스 핵산의 길이는 적어도 6개 뉴클레오티드가 되어야 하고, 적절하게는 올리고뉴클레오티드는 길이가 6 내지 약 50개 뉴클레오티드가 된다. 특이적인 면에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10개 뉴클레오티드, 적어도 17개 뉴클레오티드, 적어도 25개 뉴클레오티드 또는 적어도 50개 뉴클레오티드가 된다.
표적 서열의 선택에 관계없이, in vitro연구에서는 유전자 발현을 저해시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력을 정량화시키는 작업을 먼저 실행한다. 이와 같은 연구는 안티센스 유전자 저해 및 올리고뉴클레오티드의 비-특이적인 생물학적 효솨사이에 차이를 구별하는 기준으로 이용할 수 있다. 이와 같은 연구는 내부 기준 RNA 또는 단백질의 것과 표적이 되는 RNA 또는 단백질의 수준을 비교하는 것이 적절하다.
필수적인 표적 유전자를 촉매적으로 절단하도록 고안된 리보자임 분자를 이용하여 표적 mRNA의 해독을 방해한다(See, e.g., PCT International Publication WO90/11364, published October 4, 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). 리보자임이 암 세포 생장에 필수적인 단백질을 인코드하는 유전자 전사체에 특이적인 경우에, 이와 같은 리보자임은 암 세포 표현형을 역전시키게 된다. 부위 특이적인 인지 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임을 이용하여 표적 mRNA를 파괴하는 동안에 망치머리형 리보자임을 이용하는 것이 바람직하다. 망치머리 리보자임은 표적이 되는 mRNAs와 상보적인 염기쌍을 이루는 부위에 인접한 위치에 있는 mRNA를 절단한다. 유일한 조건은 표적 mRNA는 5'-UG-3'와 같은 두 개 염기 서열을 가지고 있어야 한다는 것이다. 망치머리 리보자임의 작제 및 생산은 당분야에 공지된 것이고, 이는 Haseloff 및 Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591에서 상세하게 설명하고 있다. 적절하게는 리보자임은 절단 부위가 표적 mRNA의 5'말단 부근에 위치하도록 조작되는데, 예를 들면, 효과를 증가시키고, 기능을 하지 않는 mRNA 전사체의 축적을 최소화시킬 수 있도록 조작하는 것이다.
본 발명에 이용할 수 있는 리보자임에는 RNA 엔도리보뉴클레아제(이하에서는 "Cech-type ribozymes"이라고 칭함)을 포함하는데, 이는 Tetrahymena thermophilia에서 자연 발생되는 것으로(이는 IVS, L-19 IVS RNA)이는 Thomas Cech 및 그의 동료등에 의해 상세하게 설명되었다(Zaug et al., 1984, Science, 224:574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug et al., 1986, Nature, 324:429-433; published International Patent Application No. WO 88/04300 by University Patents Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216). Cech형 리보자임은 표적 RNA 서열에 하이브리드될 수 있는 8개 염기쌍 활성 부분을 가지는데, 이 다음에 표적 RNA가 절단이 된다. 본 발명은 표적 유전자에 존재하는 8개 염기쌍 활성 부분을 표적으로 하는 Cech-형 리보자임을 이용하는 것을 포함한다.
5.2. 종양 세포에서 유전자의 활성화반응
각인된 유전자 발현을다시 활성화시키는 세포는 이형 유전자에 작동가능하게 연결된 이와 같은 각인된 유전자 조절 부분을 포함하는 발현 구조체를 특이적으로 활성화시킬 수 있다. 이와 같은 세포 특히 종양 세포는 본 발명의 유전자 치료법에 적절한 표적이 된다. 종양 세포 및 세포주에서 H19, IGF-2 P3 및 P4 특이적인 발현은 RNA 분석 기술, 하이브리드 반응, 리포터 유전자 구조체를 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 활성화된 IGF-1 유전자 발현을 하는 종양 세포를 유사하게 결정할 수 있고, 이는 IGF-1 프로모터를 이용한 유전자 치료에 표적으로 삼아서, 이형 유전자가 발현되도록 지시할 수 있다.
대부분 RNA 분석 분야에서, 관심이 되는 유전자 전사체에 특이적으로 하이브리드되는 라벨된 프로브는 당분야에 공지된 임의 기술을 이용하여 준비한다. 라벨된 프로브에는 H19 sb 서열에 상보적인 적어도 15-30개 염기를 포함하고, 적절하게는 H19 전사체에 상보적인 적어도 50개 내지 150개 염기를 포함한다. H19 발현에 특히 적절한 하이브리드 반응 프로브는 폴리A 부위의 상류 약 800개 염기쌍에서 폴리A부위까지 H19 메시지의 3'말단에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 된다.
하기에서 설명하는 본 발명의 특정 구체예에서, 라벨된 안티센스 RNA 프로브는 T7 또는 T3 발현 플라스미드를 이용하여 in vitro에서 만들 수 있다. H19 프로브는 라벨된 뉴클레오티드 존재하에서 무작위 프라이밍으로 라벨시키는데, 예를 들면 Prime-It kit(Stratagene, La Jolla, CA; Catalog No. 300392)를 이용한다. 또는 코딩 부분을 증폭시키도록 고안된 프라이머와 H19 코딩 부분의 cDNA 클론을 이용하여 PCR 반응으로 라벨된 프로브를 만들 수 있고 또는 표준 니크 해독 반응으로 만들 수 있다.
폴리뉴클레오티드 프로브에 적절한 라벨에는 방사능활성 동위원소(35S 및32P), 형광물질, 발광물질, 색깔 테그, 효소 부분이 결합된 뉴클레오티드가 포함된다.
라벨된 프로브는 하기 실시예에서 설명하는 것과 같은 표준 기술을 이용하여, 세포 또는 조직에 하이브리드되고, 이는 미국 출원 No. 08/704,786에서 설명하고 있다. 또는, 충분한 양의 적절한 세포를 수득하는 경우에, 표준 RNA 분석(가령, 노던 분석, RNase 보호 또는 프라이머 연장)을 실행하여, 관심이 되는 유전자의 mRNA 수준을 결정한다.
또한, 이와 같은 유전자 발현 검사를 "in situ"에서 실행할 수 있는데, 예를 들면, 즉, 핵산의 정제과정이 필요없이 생검 또는 절개에 의해 환자의 조직에서 수득된 조직 부분(고정된 또는 냉동된)에서 직접행하는 것이다. 상기에서 설명하는 것과 같은 핵산 시약을 "in situ" 과정의 프로브 또는 프라이머로 이용한다(See, for example, Nuovo, G.J., 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications", Raven Press, NY).
세포 형 또는 종양이 이형 유전자가 작동방식으로 연결된 특정 조절 서열을 포함하는 발현 구조체를 특이적으로 활성화시킬 수 있는 지를 결정하는 방법은 이와 같은 세포로 실제 이와 같은 발현 구조체를 트랜스펙트시키는 것이다. 이와 같은 목적을 위해, 이형 유전자는 적절하게는 표식 유전자 생성물이 된다. 표식 유전자 생성물의 검사에서 긍정적인 결과는 세포 또는 세포주가 조절 부분으로부처 발현을 활성화시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다.
이와 같은 기술을 이용하여, 활성화된 H19를 발현하는 동양 세포를 예로 들면 다음과 같다;
A. 소아성 충실성 종양
1. Wilm 종양
2. 간 진성 종양
3. 배아 횡문근육종
B. 생식 세포 종양 및 영양배엽종양
1. 고환 생식 세포 종양
2. 비성숙된 난소의 사구선충
3. 천골 종양
4. 융모막 암
5. 태반부위 영양배엽 종양
C. 상피 성인 종양
1. 방광 암종
2. 간세포 암종.
3. 난소 암종
4. 경부 암종
5. 폐 암종.
6. 유방 암종
7. 머이 및 목에 측두린 세포 암종
8. 식도 암종
9. 갑상선 암종
D. 신경성 종양
1. 성상세포종
2. 신경절아세포종
3. 신경아세포종
따라서, 상기 암은 본 발명의 방법을 이용하여 치료할 수 있다. 사실, H19 발현을 활성화시키는 임의 종양은 본 발명의 방법을 이용하여 치료할 수 있다.
또한, 전술한 기술을 이용하여, IGF-1, IGF-2 P3 및 P4 프로모터를 활성화시키는 종양을 결정할 수 있다. 이와 같은 종양은 본 발명의 방법을 이용하여 치료할 수 있다. 예를 들면, IGF-2는 Wilm 종양, 횡문근육종, 신경아세포종 및 간 진성종양과 같은 어린이 종양에서 활성화될 수 있다.
5.3. 숙주 세포에 조절 서열 제어하에서 폴리뉴클레오티드를 조입시키는 방법.
본 발명은 이형 유전자가 작동가능하게 연결된 조절 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙트된 숙주 세포를 포함한다. 이와 같은 숙주 세포는 배양물에 유지된 것이거나 사람과 같은 동물의 일부가 될 수 있다. 관심이 있는 폴리뉴클레오티드는 여기에서 설명하는 방법을 이용하여 실제 운반될 다양한 벡터중 하나에 삽입시킨다. 이와 같은 벡터는 잘 정립된 분자생물학적 기술을 이용하여 생산할 수 있다(see generally, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning Vols. Ⅰ-Ⅲ, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, and Current Protocols in Molecular Biology (1989) John Wiley ＆ Sons, all Vols. and periodic updates thereof, herein incorporated by reference). 일반적으로, 해독이 바람직한 경우에는 관심이 되는 이형 유전자를 필요에 따라 적절한 3' 폴리아데닐화 서열을 가지도록 조작할 수 있다.
5.3.1 배양된 세포
이형 유전자에 작동식으로 연결된 각인된 유전자의 조절 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙트된 숙주 세포는 진핵세포 또는 원핵세포가 될 수 있다. 미생물 또는 조직-배양 기술에 광범위하게 이용되는 표준 과정으로 벡터와 같은 유전자 구조체에 폴리뉴클레오티드를 결찰시키고, 숙주 세포(진핵 세포(이스트, 조류, 곤충 또는 포유류) 또는 원핵세포(박테리아 세포)에 형질도입 또는 트랜스펙트시킨다.
대장균(E. coli)과 같은 박테리아 세포에서 해당 폴리뉴클레오티드를 배양시키는데 적절한 벡터에는 pBR322-유도된 플라스미드, pEMBL-유도된 플라스미드, pEX-유도된 플라스미드, pBTac-유도된 플라스미드, pUC-유오된 플라스미드와 같은 플라스미드를 포함한다. 이스트에서 복제를 위해서는 YEP24, YIP5, YEP51, pYES2, YRP17 플라스미드가 S. cerevisiae에서 유전자 구조의 도입에 유용한 클로닝 및 발현 벡터가 된다(see, for example, Broach et al., 1993, in Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye, Academic press, p. 83). 이와 같은 벡터는 E. coli 및 이스트 모두에서 복제될 수 있는데, 그 이유는 대장균에는 pBR322 ori가 존재하고, 이스트에는 2Γm 원형 플라스미드 복제 결정부위가 있기 때문이다. 또한, 암피실린과 같은 약물 저항성 표식이 이용될 수 있다.
유사하게는, 본 qkfuad의 폴리뉴클레오티드에 대해 적절한 포유류 벡터에는 박테리아에서 벡터의 증식을 실행시킬 수 있는 진핵 서열을 포함한다. 이와 같은 벡터는 포유류 세포로 트랜스펙션될 경우에, 연결된 선택성 표식 유전자를 이용하여 장시간 안정성을 위해 포유류 염색체에 통합되도록 고안될 수 있다. 또는 소 파필로마바이러스(BPV-1) 또는 Epstein-Barr 바이러스와 같은 바이러스 유도체를 일시적인 발현에 이용할 수 있다. 숙주 유기체의 플라스미드 형질변환에 이용되는 다양한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 다른 적절한 벡터 시스템의 경우에 일반적인 재조합 과정을 이용할 수 있다(Sambrook et al., supra.).
5.3.2. 유전자 치료법
본 발명은 또한 암 및 과증식성 질병을 치료하기 위해, 유전자 치료법에 이용하기 위해 이형 유전자에 작동식으로 연결된 각인된 유전자의 조절 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용하는 것을 포함한다. 유전자 치료를 위한 목적으로, 본 발명의 발현 구조체는 임의 생물학적 효과를 가지는 담체를 통하여 투여될 수 있는데, 예를 들면, in vivo에서 세포로 재조합 유전자를 효과적으로 운반할 수 있는 임의 조성물 또는 조성물이 될 수 있다. 방식으로는 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스, 허피스 심플렉스 바이러스-1, 재조합 박테리아 또는 진핵 플라스미드를 포함하는 바이러스성 벡터에 이와 같은 유전자를 삽입하는 것을 포함한다. 바이러스 벡터를 세포에 직접 트랜스펙트시키는데; 플라스미드 DNA는 양이온 고분자, 양이온 리포좀(가령, 리포펙틴, D.D.A.B.와 같은 콜레스테롤 유도체, 양이온 인지질) 또는 유도된(가령, 항체 접합된), 폴리리신 동액체, 그라미시딘 S, 인공 바이러스 외비 또는 다른 세포내 담체등의 도움뿐만 아니라 네이키드 DNA 구조의 직접 주입, 전기천공, CaPO4침전등으로 운반할 수 있다. 암 유전자 치료법에 이용되는 발현 시스템 및 유전자 전달에 대해서는 Cooper, 1996, Seminars in Oncology 23:172-187의 것을 참고로 한다.
유전자 치료에 적절한 숙주 세포의 트랜스덕션이 중요한 첫 단계이기 때문에, 특정 유전자 운반 시스템을 선택하는 것은 원하는 표적의 표현형 및 투여 경로 (즉, 국소 또는 전신)에 따라 달라질 수 있다. 또한, 발현 구조의 in vivp 트랜스덕션을 제공하는 특정 유전자 구조체는 세포의 in vitro 트랜스덕션에 유용하고, 이는 상기에서 설명한 것과 같은 ex vivo 조직 배양 시스템에도 이용할 수 있다.
세포에 핵산을 in vivo 트랜스덕션을 위한 적절한 방법은 H19 조절 서열의 제어하에서 특정 세포독성 유전자와 같은 핵산을 포함하는 바이러스성 벡터를 이용하는 것이다. 세포에 바이러스 벡터를 감염시키면, 표적이 되는 서열의 상당 부분이 핵산을 수용하게 되는 장점이 있다. 또한, 바이러스 벡터내에 인코드된 분자 즉, 바이러스성 벡터에 포함된 cDNA에 의해 인코드된 분자는 바이러스성 벡터 핵산을 수용한 세포에서 효과적으로 발현된다. 현재 이용되는 방법 및 조성물을 이용하여 운반될 수 있는 적절한 벡터에는 허피스 심플렉스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 슈도라비스 바이러스, 알파-허피스 바이러스 벡터등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 바이러스 벡터, 비-복제 세포를 변형시키는데 적합한 특정 바이러스 벡터, 관심이 되는 폴리뉴클레오티드의 발현과 관계하여 이와 같은 벡터의 이용등에 관한 것은 "Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications" Ed. Caplitt and Loewy, Academic Press, San Diego(1995)을 참고로 한다.
바이러스 입자의 표면에 있는 바이러스성 포장 단백질을 변형시켜 바이러스 및 바이러스-계 벡터의 감염 스펙트럼을 제한하는 것이 가능하다는 것이다(see, for example PCT publications WO93/25234 and WO94/06920). 예를 들면, 레트로바이러스성 벡터의 감염 스펙트럼을 변형시키는 전략에는 바이러스의 env 단백질에 세포 표면 항원에 특이적인 항체의 결합(Roux et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:9079-9083; Julan et al., 1992, J. Gen. Virol. u3:3251-3255; and Goud et al., 1983, Virology 163:251-254); 또는 바이러스성 env 단백질에 세포 표면 수용체 리간드의 결합(Neda et al., 1991. J. Biol. Chem 266:14143-14146)시키는 것이 포함된다. 결합은 단백질 또는 다양한 부분(가령, env 단백질을 아시알로글리코단백질로 전환시키는 락토즈)에 화학적으로 교차-연결된 형이거나 융합 단백질(가령, 단일 쇄 항체/env 융합 단백질)을 만들어서 실행한다. 예를 들면, 이와 같은 기술을 이용하여 제조합 바이러스의 표면에 암 세포 표면 단백질 또는 종양-연합된 분자에 대한 항체를 결합시켜 암 세포를 표적으로 할 수 있다. 이와 같은 기술을 이용하여 외생 벡터를 양쪽성 백터로 전환시키는데 이용한다.
본 발명에 유용한 적절한 바이러스성 유전자 운반 시스템은 아데노바이러스-유도된 벡터를 이용한다. 아데노바이러스 게놈을 조작하여, 관심이 있는 유전자 생성물을 인코드하고, 발현시키나, 정상적인 용균성 바이러스의 생명 과정에서 복제할 수 있는 이의 능력에서는 비활성화되도록 한다(Berkner et al., 1988, BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; and Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155). 아데노바이러스 균주 AD 형 5 d1324에서 유도된 적절한 아데노바이러스 벡터 또는 다른 아데노바이러스 균주(가령, Ad2, Ad3, Ad7등)는 당분야에 공지된 것이다. 재조합 아데노바이러스는 이들을 이용하여 다양한 세포형을 감염시키는데 이용할 수 있는 등의 특정 환경에서 장점을 가지는데; 가령, 기도 상피(Rosenfeld et al., 1992, cited supra), 내피 세포(Lemarchand et al., 1992, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:6482-6486); 간세포(Herz and Gerard, 1993, Proc. Natl. Acad Sci USA 90:2812-2816); 근육 세포(Quantin et al., 1992, Proc. Natl. Acad Sci USA 89:2581-2584). 또한, 바이러스 입자는 정제 및 농축에 대해 상대적으로 안정적이고, 수용할 수 있는 것으로써, 이는 감염성 스펙트럼에 효과를 주기위해 변형시킬 수 있다. 또한, 도입된 아데노바이러스 DNA( 및 이에 포함된 외부 DNA)는 숙주 세포의 게놈에는 통합되지 않으나, 이는 상피에서는 유지되어, 도입된 DNA는 숙주 게놈에 결합되는 상황에서 삽입 돌연변이를 발생시키는 문제를 피할 수 있다(레트로바이러스 DNA). 또한, 다른 유전자 운반 벡터에 비해, 외부 DNA에 대한 아데노바이러스성 게놈의 운반 능력이 상당히 크다(최고 8kb)(Berkner et al., cited supra, Haj-Ahmand and Graham, 1986, J. Virol.57:267). 본 발명에서 이용하고, 선호하는 대부분의 복제-결함 아데노바이러스 벡터는 바이러스 E1 및 E3 유전자의 전부 또는 일부가 결손되었으나, 아데노바이러스 유전자 물질의 80%정도가 남아있다(See, e.g., Jones et al., 1979, Cell 16:683; Berkner et al., supra; and Graham et al., in Methods in Molecular Biology, E.J.Murray, Ed.(Humana, Clifton NJ, 1991) vol. 7, pp. 109-127)).
발현 구조중 하나를 운반하는데 유용한 또 다른 바이러스성 벡터 시스템은 아데노-연합된 바이러스(AAV)이다. 아데노-연합된 바이러스는 실제 아데노바이러스 또는 허피스 바이러스와 같은 또 다른 바이러스를 효과적인 복제 및 생산성 생명 과정을 위한 헬퍼 바이러스로 요구하는 자연 발생 결합 바이러스이다(For a review see Muzyczka et al., 1992, Curr. Topics in Micro. and Immunol. 158:97-129). 비-분할 세포에 이의 DNA를 통합시키고, 높은 빈도로 안정적인 상호작용을 할 수 있는 바이러스중에 하나이다(see for example Flotte et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-354; Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828; and McLaughlin et al., 1989, J. Virol. 63:1963-1973). AAV와 같은 작은 300개 염기를 포함하는 벡터를 포잡하여, 통합시킬 수 있다. 외생 DNA에 대한 공간은 약 4.5kb정도로 제한된다. Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260에서 설명하는 것과 같이 AAV 벡터를 이용하여, 세포로 DNA를 도입시킨다. 다양한 핵산을 AAV 벡터를 이용하여 여러 가지 다른 세포 형으로 도입시킨다(see for example Hermonat et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6466-6470; Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 4-2072-2081; Wondisford et al., 1988, Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al.,1984, J. Virol. 51:611-619; and Flotte et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:3781-3790).
상기에서 설명하는 바이러스 전달 방법에 추가하여, 비-바이러스성 방법을 이용하여, 동물의 조직으로 원하는 이형 유전자를 직접적으로 발현되게 한다. 유전자 전달을 위한 대부분의 비-바이러스 방법은 거대분자의 수용 및 세포내 운반을 위해 포유류 세포에 의해 이용되는 정상적인 기작에 의존한다. 적절한 구체예에서, 본 발명의 비-바이러스성 유전자 운반 시스템은 표적이 되는 세포가 발현 구조를 수용하는 세포내 취입(endocytosis) 과정에 따라 달라진다. 예를 들면, 이와 같은 형태의 유전자 운반 시스템에는 리포좀 유도된 시스템, 폴리리신 공액체, 인공 바이러스 외피등이 포함된다.
임상적인 세팅에서, 치료요법적 발현 구조체를 위한 유전자 운반 시스템을 당분야에 공지된 다양한 방법 중 하나를 이용하여 환자로 도입시킨다. 예를 들면, 유전자 운반 시스템을 가지는 제약학적 조성물은 정맥 조사등의 방법을 이용하여 전신으로 도입될 수 있고, 표적 세포에서 구조체의 특이적인 발현은 세포-형 또는 조직-형 발현에 의해 제공되는 트랜스펙션 특이성에 따라 발생하는데, 그 이유는 조절 서열이 이형 유전자의 발현을 조절하거나 또는 특정 세포형을 표적으로 하는 유전자 운반체와 복합된 조절 서열을 이용하기 때문이다. 다른 구체예에서, 재조합 발현 구조체의 초기 운반은 동물내로 도입시키는 것이 상당히 제한된다. 예를 들면, 유전자 운반 담체를 카테테르(see U.S. Patent 5,328,470) 또는 입체적으로 주사(e.g. Chen et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3054-3057)하는 등의 방법으로 도입시킬 수 있다. 본 발명의 발현 구조체는 Dev et al., 1994, Cancer Treat. Rev. 20:105-115에서 설명하는 기술을 이용하여 전기천공에 의해 유전자 요법으로 운반시킨다.
유전자 치료 구조체로 된 제약학적 조성물은 수용가능한 희석물에 있는 유전자 운반 시스템으로 구성되거나 또는 유전자 운반체가 포함된 서방형 매트릭스로 구성된다. 또는, 완전한 유전자 운반 시스템이 레트로바이러스 벡터와 같은 재조합 세포로부터 만들어지는 경우에, 제약학적 조성물은 유전자 운반 시스템을 생산하는 한 가지 이상의 세포로 구성된다.
5.3.3. 치료 종료점 및 약량
당업자는 암과 관련된 바람직하지 못한 증상(통증, 감응성, 체중 감소등)의 예방 또는 경감을 원한다는 것을 인지할 것이다. 또한, 종양의 양 및 생장 속도의 임의 감소 뿐만 아니라 종양의 조직병리학적 모양도 개선될 것을 원한다. 따라서, 본 발명의 목적에서, "치료", "치료요법적 용도", "의학적 용도"등은 질병 또는 증상을 치료하는 청구된 조성물을 모두 사용하는 것을 말하거나 또는 어떠한 방식으로든간에 질병 또는 다른 원하지 않는 증상의 예방, 방해, 지연, 역전시킬 수 있는 청구된 조성물을 사용하는 것을 말한다.
효과적인 약량 및 치료 프로토콜은 동상적인 수단으로 결정할 수 있는데, 이는 실험 동물에서 낮은 약량으로 시작하여, 효과를 모니터하면서 약량을 증가시키고, 그 다음 약량 섭생을 다양하게 하는 것이다. 동물 연구, 적절하게는 포유류 연구를 이용하여, 최대 내성 약량을 결정하거나 또는 체중 ㎏당 생활성 물질의 MTD를 결정한다. 당업자는 사람을 포함하는 다른 종에 대해 독성을 피하면서 효과를 가지는 약량을 추정할 수 있다.
효과에 대해 사람에서 연구를 하기 전에, 정상적인 개체에서 Phase I 임상 연구를 실시하여, 안전한 약량을 확립한다. 주어진 개체에서 최적의 약량을 결정하는데 있어서, 임상의사들은 여러 가지 인자를 고려해야 한다. 이들중 주로 고려되는 것은 선택된 이형 유전자 생성물의 독성 및 반감기이다. 추가 인자에는 환자의 체구, 환자의 나이, 환자의 일반적인 상태, 치료해야할 특정 암과 관련된 질병, 질병의 심각성, 환자에 다른 약물을 사용하는지의 여부, 유전자 생성물의 in vivo 활성등이 된다. 동물 연구 및 임상 문헌의 결과를 고려한 후에 시도할 약량을 선택할 수 있다.
예를 들면, 티미딘 카이나제와 같은 이형 유전자에 작동식으로 연결된 H19 조절 부분을 포함하는 아데노바이러스성 벡터를 일반적으로 사람에 이용하는 약량은 하루에 종양에 바로 주입되는 양으로는 1 x 107pfu 내지 1 x 1010pfu가 된다. 좀더 적절하게는 종양으로 바로 주입되는 아데노바이러스성 벡터의 매일 약량은 종양의 크기에 따라 1 x 108pfu 내지 1 x 1010pfu가 된다. 상이한 독성 수준을 가지는 세포독성 유전자 생성물에 작동식으로 연결된 H19 조절 부분을 포함하는 아데노바이러스성 벡터의 경우에, 이 값은 물론 경우에 따라 변경된다. 티미딘 카이나제와 같은 세포독성 물질을 인코드하는 이형 유전자에 작동식으로 연결된 H19 조절 부분을 포함하는 아데노바이러스성 벡터를 유사한 약량으로 이용하여 시작할 수도 있다.
특히, in vivo에서 이용하는 것을 고려할 경우에, 본 발명의 다양한 생화학적 성분은 순도가 높아야 하고, 실제 유해한 오염물질(예를 들면, 적어도 NF 등급, 일반적으로는 적어도 분석용 등급, 가장 적절하게는 제약학적 조성물로 이용할 수 있는 등급)이 없어야 한다. 주어진 화합물을 사용하기 전에 합성하는 경우에, 이와 같은 합성 또는 연속하여 정제함으로써, 합성 또는 정제하는 과정 동안에 이용된 임의 독성이 있을 수 있는 물질을 제거한 생성물을 얻을 수 있다.
환자의 암 질환을 치료하는데 이용하는 경우에, 본 발명은 또한, 세포독성 물질을 인코드하는 이형 유전자에 작동식으로 연결된 H19 조절 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터 또는 벡터를 방출하는 세포를 포함하는 멸균된 바이알 또는 앰플의 형태로 된 멸균 키트 또는 포장을 제공한다. 한 구체예에서, 키트에는 세포독성 물질을 인코드하는 이형 유전자에 작동식으로 연결된 H19 조절 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 포함하는데, 이는 바로 투여할 수 있는 조제물로 단위 약형 또는 다중 약량을 포함할 수도 있고, 이때 포장에는 암을 치료하기 위한 내용물의 사용방법을 설명한 라벨을 부착한다. 또는 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 포장에는 이와 같은 벡터를 방출하는 세포 또는 세포주를 포함하는 멸균 바이알 또는 앰플을 제공한다. 저장 및 운반을 위해서, 벡터를 방출하는 세포 또는 세포주는 냉동시킬 수 있다. 선택적으로, 포장에는 벡터를 방출하는 세포 또는 세포주를 배양하기 위한 배지 또는 시약을 포함한다.
본 발명은 다음의 실시예를 통하여 설명하나 이에 국한시키고자 함은 아니다.
6. 실시예: 종양 세포주에서 이형 유전자의 발현을 실행하는 H19 조절 서열
이 단락에서는 H19 조절 서열의 조절하에 있는 CAT 리포터 유전자를 포함하는 다양한 발현 구조체의 작제 및 몇 가지 다른 방광 세포주로 이를 전달하는 것에 대해 설명한다.
6.1. 재료 및 방법
6.1.1. 세포 주 및 트렌스펙션
방광 암 세포주 HT-1376, EJ28, T24P, 1197 및 UM-UC-3는 American Type Culture Colection(ATCC)에서 구하고, ATCC에서 권하는 방식으로 유지시켰다.
인산칼슘 침전 트랜스펙션 방법을 이용하여 일시적인 트랜스펙션을 실시하였다. 침전물(7g 플라스미드를 포함)은 30mm 배양접시에 있는 0.3 ×106세포 배지 1㎖에 첨가하였다. 16시간 후에, 트랜스펙션 배지를 제거하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 트랜스펙션 후 24-96시간에 세포를 제거하고, 부티릴-CoA 유기상 추출 과정(Sambrook et al., 1989)을 이용하여 CAT 활성을 결정한다. 유기 상측 상(700l) 몇 방물을 3㎖ 신틸레이션 유체를 포함하는 신틸레이션 웰로 옮기고 이를 카운터한다.
6.1.2. 발현벡터의 작제
Promega(Madison, WI)로부터 다음과 같은 기본 플라스미드를 구할 수 있다; 플라스미드 pCAT-계(다중 클로닝 부위 다음에 CAT 리포터 유전자를 포함), pCAT-프로모터(SV40 프로모터 제어하에 CAT 리포터 유전자를 포함), pCAT-인헨서(CAT 리포터 유전자의 하류에 SV40 인헨서를 포함하고, CAT 리포터 유전자의 상류에 프로모터 삽입부위에 다중 클로닝 부위를 포함), pCAT-기준(SV40 프로모터 및 인헨서의 제어하에 CAT 리포터 유전자를 포함).
H19 프로모터의 제어하에 있는 CAT 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 pH19E를 작제하기 위해, H19 프로모터 부위(서열:1)을 우선 pBluescriptⅡSK+(Promega)에 클로닝시킨다. 다음의 프라이머를 이용하여 사람의 태반 DNA로부터 H19 프로모터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시켰다;
ESPCR21 : CGGTTCCCCACTTCCCCAGTTT(서열:6)
ESPCR22 : CGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT(서열:7)
PCR 생성물은 Klenow 효소를 이용하여 단편을 마무리하고, 이를 pBluescriptⅡSK+의 EcoRV 부위로 클로닝시킨다. 삽입된 DNA는 PvuⅡ, EcoR1, ApaⅠ 내부 절단 효소를 이용하여 절단하여 증명한다. 프로모터의 방향은 벡터의 lacZ 코딩 부분의 것과는 반대가 된다. 프로모터 부분은 그 다음 HindⅢ, PstⅠ을 이용하여 잘라내고, 생성된 약 0.9 kb의 단편을 pCAT계의 HindⅢ-PstⅠ부위로 삽입하여, pH19E를 만든다.
H19 프로모터/CAT 리포터 유전자의 하류 양방향으로 삽입된 H19 인헨서 부분을 포함하는 발현 플라스미드는 다음과 같이 작제한다. H19 하류 인헨서를 포함하는 5kb SacⅠ단편(H19 전사 시작부분에 대해, +6.0kb 내지 +11kb 까지)를 pUC19의 SacⅠ부분에 클로닝한다. 이와 같은 인헤서 단편은 EcoRⅠ- HindⅢ로 잘라내고, pBluescriptⅡSK+의 EcoRⅠ- HindⅢ 부분에 결찰시켜, pBhH19En-Sa를 만든다. pBhH19En-Sa는 BamHI를 이용하여 부분적으로 절단시켜, H19 인헨서( 및 내부 BamHI을 포함)를 포함하는 5kb 단편을 pH19E의 H19 프로모터/CAT 리포터 유전자의 하류 BamHI 부위에 클로닝시킨다. H19 인헨서를 동일한 방향으로 포함하는 플라스미드(pH19EH19D) 및 역방향으로 포함된 플라스미드(pH19EH19D)가 만들어진다.
6.2. 결과 및 토론
다섯가지 상이한 방광 암 세포 주 HT-1376, EJ28, T24P, 1197, UM-UC-3를 각 pCAT계(이는 도 2의 P-E로 칭함), pCAT-기준(이는 도 2의 pSV40ESV40로 칭함), pH19E, pH19EH19D, pH19EH19R로 트랜스펙트시킨다. 각 구조체의 발현 결과는 도 3A-3E에 나타내었다. 각 세포주에서, 최대 수준의 CAT 활성은 SV40 인헨서 및 SV40 프로모터를 포함하는 pCAT-기준 플라스미드에서 관찰되었다. 이와 같은 구조체는 SV40 조절 서열이 유전자 발현 유도물질로 정립되었기 때문에 포지티브 기준으로 작용한다. 그러나, SV40 조절 서열은 유전자 발현을 유도하는 이들의 능력에서 종양 세포-특이적인 것은 아니다. H19 프로모터의 제어하에서 CAT 리포터 유전자를 포함하는 pH19E로 트랜스펙트된 세포주 역시 배경에 비해 CAT 발현이 상당히 증가되었음을 나타낸다. H19 프로모터에 의한 CAT 활성의 유도 수준은 HT-1376 세포주의 5배 내지 UM-UC-3 세포주의 10배 수준이 된다. H19 프로모터/CAT 리포터 유전자 구조에 H19 인헨서를 추가하면, 특정 세포주에서 발현 수준이 추가로 증가되었다. 예를 들면, EJ28, T24P, 1197 세포주에서, H19 인헨서는 H19 프로모터/CAT 리포터 유전자의 발현을 상당히 증가시켰다. 그러나, 인헨서의 방향은 여러 다른 세포주에서 다른 결과를 유도한다. 세포주 HT-1376, UM-UC-3에서는 인헨서는 발현에 거의 효과가 없었다.
결과를 보면, 사람 H19 프로모터 부분은 다양한 범위의 방광 암-유도된 세포주에서 작동식으로 연결된 이형 리포터 유전자의 발현을 지시한다는 것을 설명한다. 일부 방광 암-유도된 세포주에서, H19 인헨서는 H19 조절하에 있는 리포터 유전자의 발현을 추가로 증가시킨다.
7. 실시예: H19 조절 서열의 제어하에 있는 독소 유전자
7.1. 재료 및 방법
단락 6에서 설명하는 발현 구조체를 변형시켜, CAT 대신에 독성 생성물 또는 프로드럭을 인코드하는 서열을 발현시킨다. 예를 들면, CAT 유전자 생성물을 인코드하는 서열을 제거하고, 당분야에 공지된 표준 클로닝 방법을 이용하여 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 카이나제(HSV-TK)를 인코드하는 서열을 치환시킨다.
H19/프로드럭 발현 플라스미드는 단락 6에서 설명하는 방광 암-유도된 세포주에 트랜스펙트시킨다. 방광 암 세포주에 트랜스펙트시킬 경우에, H19/HSV-TK 발현 플라스미드는 강시클로비어(ganciclovir) 존재하에서 방광 암 세포 특이적인 세포독성을 유도한다.
8. 실시예: 화학적으로 유도된 방광 암종을 가지는 생쥐 모델에서 H19의 발현
8.1. 재료 및 방법
주령이 75주된 늙은 암컷 생쥐(Charles River)를 우리당 6마리 있는 우리에 가두고, 12시간 주기의 빛을 제공하는 공기 조절된 방에 적응시킨다. 8주에 실험을 시작하는데, 생쥐는 임의로 기준 군(10마리 생쥐) 및 실험 군(60마리 생쥐)로 나눈다. 실험 군의 생쥐에는 이들이 마시는 물에 용해시킨 0.05% N-부틸-N-(4-하이드록시부틸)니트로자민(BBM)(Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd., Tokyo, Japan)을 제공한다. 양 집단에 있는 동물을 실험시작 후 4, 12, 16, 20, 26주에 죽인다. 방광을 잘라내거, 고정시키고, 표준 과정을 이용하여 파라핀 블록에 묻는다.
8.1.1. 프로브의 준비
H19 코딩 부분을 포함하는 2.1kb 단편을 T7 및 T3 RNA 폴리메라제 결합 부위뒤의 pBluescriptⅡKS 플라스미드(Stratagene, La Jolla, CA)에 서브클로닝시킨다. T7 폴리메라제(Boehringer Mannheim) 및 Amersham RPN 2006 키트를 이용하여, HindⅢ-를 이용하여 선형으로 만든 플라스미드 DNA에서 [35S]-라벨된 안티센스 H19 RNA를 만든다. In vitro-에 의해 발생된 전사체는 107cpm/g활성을 가진다. 기준으로는 T3 폴리메라제(Boehringer Mannheim) 및 EcoRI-선형화된 주형을 가지는 센스 H19 mRNA를 이용한다.
8.1.2. in situ 하이브리드반응
포르말린 고정된 조직의 파라핀 왁스 부분(5M)을 3-아미노프로필트리에톡실란(Tespa, Sigma) 피복된 현미경 슬라이드에 얹고, 37℃에서 한 시간 동안 건조시킨다. 부분은 실렌으로 왁스를 제거하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 프로테인분해효소 K (Sigma)로 처리하였다. 슬라이드는 아세틸화시켜, 프로브의 비-특이적인 결합을 감소시키고, 에탄올을 통하여 탈수화시킨다.
[35S]-라벨된 RNA 프로브(특이활성 50,000 cpu/l)은 Rangini et al, 1991,, Mech. Dev. 35:13-24에서 설명하는 과정을 이용하여 하이브리드시키는데, 단 thio-AMP 단계는 생략한다. 슬라이드는 10일간 플름에 노출시키고, 헤마톡실린 및 에오신으로 카운터-착색시킨다. 슬라이드를 검사하고, 밝은 장 및 어두운 장 조명하에서 Polyvar(Reichert Jung) 현미경을 이용하여 광사진을 찍는다. 기준에는 센스 RNA 프로브 및 RNAse 프리-하이브리드 반응 처리된 하이브리드가 포함된다. 추가로, 성장한 건강한 생쥐의 방광(H19를 발현하지 않음) 및 배아 생쥐 방광(H19를 발현하는)에서 방광 부분을 각 네가티브 및 포지티브 기준으로 삼는다.
8.2. 결과 및 토론
26주에, 모든 생존된 실험 군 생쥐에는 손으로 만질 수 있을 정도의 방광 종양을 가지낟. 화학적으로 유도된 방광 종양에서는 H19 발현이 상당히 많음을 관찰할 수 있다. 따라서, 화학적으로 유도된 방광 암을 가지는 이와 같은 생쥐 모델을 동물 모델로 이용하여 독소 유전자에 작동가능하게 연결된 H19 조절 부분을 포함하는 in vivo 구조체의 종양-특이적인 세포독성을 설명할 수 있다.
9. 실시예: 방광 암종을 가지는 생쥐 모델에서 이형 유전자를 발현시키기 위해 H19 조절 서열을 이용한 유전자 치료법
in vivo에서 생쥐 방광으로 운반시키기 위해, H19/독소 또는 프로드럭 발현 플라스미드를 리포좀에 결합시킨다(as described by Takashita et al., 1993, J. Clin. Invest. 93:652-651, incorporated herein by reference). 이 실험에서 이용되는 생쥐는 단락 8에서 설명하는 화학적으로 유도된 방광 종양을 가진다.
간략하게 설명하면, 50g 플라스미드 DNA(Optimen's 무혈청 배지(BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) 500l에 용해된)를 리포펙타민 250l에 첨가시킨다. 혼합물을 실온에서 30분간 배양시키고, 그 다음 10㎖ 발란스를 이룬 염 용액(BSS(-): 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6)으로 희석한다. 30분간 15,000rpm에서 용액을 원심분리하여 펠렛화시킨 후에, 리포좀은 1mM CaCl2를 포함하는 1㎖ BSS(-)에 재현탁시킨다. 약 0.2㎖의 농축된 리포좀을 카테테르를 통하여 화학적으로 유도된 방광 종양을 가지는 생쥐에 투여한다. 방광 종양을 가지는 생쥐 기준 군은 H19 조절 서열의 제어하에 무관한 유전자를 가지는 구조체를 포함하는 리포좀 또는 DNA가 없는 리포좀을 제공받는다. 정해진 시간대에, 각 군의 생쥐를 죽이고, 방광을 잘라내고, 표준 과정을 이용하여 고정시키고, 파라핀 블록에 묻는다. 또 다른 부분은 상기에서 설명하는 것과 같이 H19 프로브를 이용하여 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 독소 유전자의 코딩 서열에 대한 프로브를 이용하여 in situ 하이브리드를 시키는 과정을 거치게 한다. 실험군 생쥐의 방광 종양에서 H19의 발현과 함께 슈도모나스(Pseudomonas) 독소의 발현이 동시에 국소화되었다는 것을 알 수 있다. 또한, 기준 군의 생쥐에 있는 방광 종양과 비교하였을 때, 실험군 생쥐의 방광 종양의 크기 및 괴사가 감소되었다.
10. 실시예: 종양 세포주에서 IGF-2 P3 및 P4 프로모터의 발현
이와 같은 실험에서, 네 가지 다른 IGF-2 프로모터중 하나의 제어하게 있는 루시페라제 리포터 유전자를 포함하는 다양한 발현 구조체를 작제하여, 몇 가지 다른 방광 암 세포주로 옮긴다. 다음과 같은 사람 IGF-2 프로모터/루시페라제 구조체를 만든다;
| 플라스미드 구조체 | IGF-2 유전자 뉴클레오티드 서열 | 프로모터 |
| Hup1 | -980∼+54 | 프로모터 1 |
| Hup2 | -379∼+271 | 프로모터 2 |
| Hup3 | -1229∼+140 | 프로모터 3 |
| Hup4 | -546∼+102 | 프로모터 4 |
IGF-2 프로모터 서열(Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9)에서 설명하고 있다. 루시페라제 리포터 벡터는 Promega, Madison, WI(catalog #E1641)에서 시판되는 것을 구할 수 있다.
10.2 결과 및 토론
생성된 발현 플라스미드를 단락 6에서 설명하는 것과 같이 사람의 방광 암 세포 주 HT-1376, EJ28, T24P, 1197, UM-UC-3로 트랜스펙트시킨다. 루시페라제 활성은 시판되는 키트를 이용하여 검사한다(Promega, Madison, WI, catalog #E1500). 도 4A-4E에서 나타낸 것과 같은 결과는 IGF-2 P4 프로모터는 테스트한 각 방광 암 세포에서 볼 수 있는 루시페라제 리포터 유전자의 발현을 지시한다는 것을 알 수 있다. 세포 주 1197에서는, IGF-2 P3 프로모터 역시 루시페라제 리포터 유전자의 발현을 지시한다. 연속한 실험에서, IGF-2 P3 및 P4 프로모터는 융모막암종 세포 및 횡문근육종을 포함하는 다른 종양 세포주에서 루시페라제 유전자 발현을 지시하는 것을 볼 수 있다.
11. 실시예; 이형 유전자 발현을 실행하기 위해 H19 인헨서와 함께 H19 프로모터 및 IGF-2 프로모터의 기능
11. 재료 및 방법
네 가지 루시페라제 리포터 벡터, pGL3-기본, pGL3-프로모터, pGL3-인헨서, pGL3-기준을 Promega에서 구하였다. 이와 같은 벡터를 여러 가지 다른 트랜스펙션 시약을 이용하여 배양된 세포주로 트랜스펙션시키는데, 이용되는 시약을 예를 들면, 리포펙타민(Gibco/BRL), fugene(Boehringer), 8가지 다른 지질 시약을 포함하는 perfect transfection Kit(Invitrogen), TFX-10, TFX-20, transfast(Promega), 인산칼슘염 방법(Gorman et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051)등이 있다.
단락 6.1에서는 pBluescriptⅡSK(pbh19p #1)의 EcoRV 부위로 클론된 H19를 설명하고 있다. H19는 SmaⅠ 및 HindⅢ으로 절단하여 잘라내고, 생성된 0.9kb 단편을 pGL3의 SmaⅠ-HindⅢ 부위로 삽입하여, Luc-pbh19 구조체를 만든다.
nt -819 내지 +14의 H19 프로모터 부분은 PCR을 이용하여, pbh19p #1플라스미드로부터 증폭시키는데, 이때 이용되는 프라이머는 다음과 같다;
5'-ATATGGTACCGACAACCCTCACCAAAG-3' (upstream, 서열:8)
5'-ATATAAGCTTCTTCTCCCTCACCCTGCTC-3' (downstream, 서열:9)
생성된 PCR 생성물을 KpnⅠ 및 HindⅢ로 절단하고, 이는 pGL3-기본 벡터의 KpnⅠ-HindⅢ 부위에 결찰시켜, Luc-PBH19 생성물을 만든다. 이와 같은 PCR-만들어진 H19 프로모터를 자동화된 염료 종료물질 사이클 서열화기에 의해 양방향으로 서열을 결정한다(ABT Prism 377 DNA sequencer, Perkin Elmer). 도 5에서는 PCR에 의해 만들어진 H19 프로모터의 뉴클레오티드 서열(서열 2)을 나타낸다.
단락 6에서 설명하는 5kb H19 하류 인헨서를 DamH으로 절단하여, 3'말단에 4.1kb 및 0.9kb 두 개 단편을 만든다. Luc-PBH19-0.9EH19 및 Luc-PBH19-4EH19 구조체는 각각 H19 인헨서의 0.9kb 및 4.1kb BamHⅠ 단편을 Luc-PBH19 플라스미드의 BamHⅠ 부위에 삽입시켜 만든다. 인헨서 서열은 H19 프로모터/루시페라제 리포터 유전자의 하류에 위치한다.
0.9kb의 BamHⅠ 인헨서 단편은 pGL-기본 벡터의 BamHⅠ부위로 결찰시켜, Luc-0.9EH19 벡터를 만든다. pbh19p #1 플라스미드의 H19 프로모터는 KpnI-BamHI으로 잘라내고, 이는 Luc-0.9EH19 구조체의 KpnI-BglⅡ로 결찰시켜, 단락 6에서 설명하는 프로모터 클론 및 H19/Luc 리포터 유전자의 하류 0.9kb를 포함하는 Luc-pbh19-0.9EH19 발현구조체를 만든다.
사람의 IGF-2 프로모터 P1, P2, P3, P4의 제어하게 각각 있는 루시페라제 유전자를 포함하는 Hup-1, Hup-2, Hup-3, Hup-4로 지정된 발현벡터는 Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9에서 설명하는 방법을 이용하여 작제하였다. P4의 512bp 부분은 PCR을 이용하여, Hup-4로부터 증폭시키는데, 이때 이용된 프라이머는 다음과 같다;
5'-ACAGGTACCTCTAGAGTCGACCT-3' (upstream, 서열:10)
5'-ATATAAGCTTGCTCCCATCCTGCA-3' (downstream, 서열:11).
생성된 PCR 생성물을 KpnI-HindⅢ로 절단시키고, 이를 리포터 유전자 벡터인 pGL3-기본의 KpnI-HindⅢ 부위로 결찰시켜, Luc-P4 리포터 유전자 벡터를 만든다.
IGF-2 P4 프로모터 및 H19 인헨서를 포함하는 발현 벡터를 또한 준비한다. 이미 설명한 바와 같이 4.1kb 단편에서 유도된 2kb의 BamHI 인헨서 단편을 Luc-P4 구조체의 BamHI 부위로 클론시켜, Luc-P4-3EH19 발현 벡터를 만든다.
0.9kb, 2kb, 4.1kb H19 인헨서는 자동화된 DNA 서열화기를 이용하여 서열화시킨다. 0.9kb 인헨서의 뉴클레오티드 서열은 도 6(서열:3)에 나타내었다. 2kb의 인헨서 서열은 도 7A 및 7B(서열:4)에 나타내었다. 4.1kb 인헨서의 뉴클레오티드 서열은 도 8A-8C(서열:5)에 나타내었다.
11.2 결과 및 토론
몇 가지 트랜스펙션 시약을 이용하여 배양된 세포주로 네 가지 루시페라제 유전자를 포함하는 벡터를 도입시키는 경우에, 인산 칼슘 침전물은 테스트한 대부분의 세포 주에서 최대 트랜스펙션 효과를 만드낟. 따라서, 칼슘 친전을 연속적으로 이용하여 다양한 발현벡터를 트랜스펙트시킨다. 또한, 플라스미드 DNA의 농도를 증가시키면 이들이 최정점 이상의 농도를 이용하더라도 트랜스펙션 효과를 저해하지 않는다.
방광 암 세포 주 5637, 간 세포 암종(HCC), 세포 주 Huh7, 신장 종양 세포 주 293T는 각각 H19 인헨서와 복합하여, H19 또는 IGF-2 P4 프로모터의 제어하에 있는 루시페라제 리포터 유전자를 포함하는 여러 가지 다른 구조체로 트랜스펙션시킨다.
Luc-PH19 및 리포터 유전자 및 H19 프로모터를 포함하는 Luc-ph19로 트랜스펙트된 세포는 배경이상으로 유전자 발현이 증가되었음을 보여준다(도 9A-9C). PCT-에 의해 발생된 프로모터를 포함하는 구조체 Luc-PH19는 각 테스트란 세포주에서 Luc-ph19보다 더 높은 활성을 나타낸다. H19 0.9kb 인헨스 단편을 Luc-ph19 리포터 벡터에 추가하면(Luc-ph19-0.9EH19), 세포 주 5637 및 293T에서 각 2 내지 4배 수준으로 발현이 증가되었다.
IGF-2 P4 프로모터는 모든 세포주에서 배경이상으로 루시페라제의 발현을 증가시켰다. 2kb H19 인헨서 단편을 Luc-P4 발현 단편에 첨가하는 경우에, P4 프로모터 활성을 강화시켰다. 2kb 인헨서 단편에 의해 루시페라제 활성이 유도되는 수준은 293T 세포주의 2배 내지 Huh7 세포주의 6배 정도가 된고, 인헨서는 5673 세포에서 프로모터 활성을 조금만 강화시켰다.
도 10A-10E에서는 PCR에 의해 만들어진 H19 프로모터 및 H19 인헨서 단편을 모두 포함하는 구조체(Luc-ph19-4EH19)의 발현을 나타낸다. 인헨서는 5673세포주만을 제외하고는 모든 세포주에서 3-28배정도 프로모터의 활성을 상당히 증가시켰다.
12. 클론의 기탁
다음의 플라스미드는 특허 출원을 목적으로 하는 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 의해 American Type Culture Collection(ATCC),Manassas, VA,에 가탁하였다;
클론 ATCC 기탁 번호 기탁 일
pH19EH19 209322 1997년 10월 2일
상기 명세서는 당업자가 본 발명을 실행할 수 있을 정도로 충분하게 기재된 바 있다. 또한, 분자생물학, 의학 및 관련 분야에 당업자에게 명백한 본 발명을 실행하기 위해 상기 설명한 수단을 다양하게 변형한 것도 다음의 청구범위내에 속한다.
여기에 언급한 모든 공보는 전문을 첨가한다.
Claims (41)
- 종양 세포에서 이형 서열을 발현시키는 방법에 있어서, 종양 세포로 폴리뉴클레오티드를 도입시키는데, 이때 폴리뉴클레오티드는 세포독성 유전자 생성물을 인코드하는 이형 서열에 작동식으로 연결된 조절 서열로 구성되고, 이때 조절 서열은 종양 세포에서 특이적으로 발현되는 게놈상으로 각인된 유전자에서 유도된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 조절 서열은 H19 조절 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 조절 서열은 IGF-2 P4 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 조절 서열은 IGF-2 P3 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 종양 세포는 방광 종양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 방광 종양 세포는 Ht-1376, EJ28, T24P, 1197, Um-UC-3에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, H19 조절 서열은 H19 프로모터, H19 인헨서 또는 H19 프로모터 및 H19 인헨서인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 이형 서열은 λ갈락토시다제, 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리친, 콜레라 독소, 망막아종 유전자, p53, 허피스 심플렉스 티미딘 카아나제, 수두-대상포진 티미딘 카이나제, 사이토신디아미나제, 니트로환원효소, 사이토크롬 p450 2B1, 티미딘 포스포릴라제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 알칼리 포스포타제, 카르복시펩티다제 A, G2, 리나마라제, λ락타메이즈, 산틴 옥시다제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 이형 서열은 cdk2, cdk8,cdk21,cdc25A, cyclinD 1, cyclinE, cyclinA, cdk4, p53, c-fos, c-jun, Kr-ras, Her2/neu에서 선택된 유전자를 인코드하는 서열에 특이적으로 하이브리드되는 안티센스 서열이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서. 이형 서열은 cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyclinD 1, cyclinE, cyclinA, cdk4, p53, c-fos, c-jun, Kr-ras, Her2/neu에서 선택된 유전자를 인코드하는 RNA를 특이적으로 절단하는 리보자임을 인코드하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 종양 세포는 개체안에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 개체는 방광 암종, 간세포 암종, 간진성종양, 횡문근육종, 난소 암종, 경부 암종, 폐 암종, 유방 암종, 머리 및 목에서 측두린 세포 암종, 식도 암종, 갑상선 암종, 성상세포암종, 신경아세포종, 신경절아세포종에서 선택된 종양을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, H19 프로모터는 서열 1의 뉴클레오티드 1 내지 830으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, H19 프로모터는 서열 2로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, H19 인헨서는 플라스미드 pH19EH19(ATCC 기탁번호 209322)에 클론된 H19 인헨서의 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, H19 인헨서는 서열 3로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, H19 인헨서는 서열 4로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, H19 인헨서는 서열 5로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, H19 인헨서는 이형 서열의 3'에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 종양 세포에서 서열을 발현시키는 벡터에 있어서, 벡터는 세포독성 유전자 생성물을 인코드하는 이형 서열에 작동식으로 연결된 조절 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 조절 서열은 암 세포에서 특이적으로 발현되는 게놈상으로 각인된 유전자에서 기인된 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 20 항에 있어서, 조절 서열은 H19 조절 서열인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 20 항에 있어서, 조절 서열은 IGF-2 P4 프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 20 항에 있어서, 조절 서열은 IGF-2 P3 프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 21 항에 있어서, H19 조절 서열은 H19 프로모터 및 H19 인헨서로 구성되고, 이형 서열은 λ갈락토시다제, 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리친, 콜레라 독소, 망막아종 유전자, p53, 허피스 심플렉스 티미딘 카아나제, 수두-대상포진 티미딘 카이나제, 사이토신디아미나제, 니트로환원효소, 사이토크롬 p450 2B1, 티미딘 포스포릴라제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 알칼리 포스포타제, 카르복시펩티다제 A, G2, 리나마라제, λ락타메이즈, 산틴 옥시다제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 20 항에 따른 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 개체에 있는 암을 치료하는 방법에 있어서, 암세포에서 특이적으로 발현되는 게놈상으로 각인된 유전자에서 유도된 조절 서열에 작동식으로 연결된 세포독성 또는 세포정균성 유전자를 코딩하는 포릴뉴클레오티드를 개체에 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항에 있어서, 조절 서열은 H19 조절 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항에 있어서, 조절 서열은 IGF-2 P4 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항에 있어서, 조절 서열은 IGF-2 P3 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 26 항에 있어서, 세포독성 유전자 생성물은 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리친, 콜레라 독소, 망악아세포종 유전자, p53에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 27 항에 있어서, H19 조절 서열은 H19 프로모터, H19 인헨서 또는 H19 프로모터 및 H19 인헨서인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, H19 프로모터는 서열 1의 뉴클레오티드 1 내지 830으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, H19 프로모터는 서열 2로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, H19 인헨서는 플라스미드 pH19EH19(ATCC 기탁번호 209322)에 클론된 H19 인헨서의 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, H19 인헨서는 서열 3로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, H19 인헨서는 서열 4로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, H19 인헨서는 서열 5로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, H19 인헨서는 이형 서열의 3'에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 31 항에 있어서, 암은 방광 암종, 간세포 암종, 간진성종양, 횡문근육종, 난소 암종, 경부 암종, 폐 암종, 유방 암종, 머리 및 목에서 측두린 세포 암종, 식도 암종, 갑상선 암종, 성상세포암종, 신경아세포종, 신경절아세포종에서 선택된 종양을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 종양 세포에서 이형 서열을 발현시키는 방법에 있어서, 종양 세포로 세포독성 유전자 생성물을 인코드하는 이형 서열에 작동식으로 연결된 IGF-1 프로모터로 구성된 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 종양 세포에서 이형 유전자를 발현시키는 벡터에 있어서, 세포 독성 유전자 생성물을 인코드하는 이형 서열에 작동식으로 연결된 IGF-1 프로모터로 구성된 폴리뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
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