NO331723B1 - Vektor som kan utrykke et cytotoksisk genprodukt samt anvendelse av en slik vektor for fremstilling av et preparat for behandling av kreft - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen vedrører spesifikk ekspresjon av heterologe sekvenser, spesielt gener som koder for cytotoksiske produkter, i tumorceller under kontroll av regulatoriske transkripsjonelle sekvenser. Spesielt foretrukket promotere inkluderer HI 9 regulatoriske sekvenser, IGF-1 promoter og IGF-2 P3 og P4 promotere. Oppfinnelsen tilveiebringer ekspresjonskonstruksjoner og metoder for administrering av slike ekspresjonskonstruksjoner. Sammensetningene og metodene fra oppfinnelsen er nyttige i behandling av cancer.

Description

1. Oppfinnelsens felt

Foreliggende oppfinnelse er i området av tumorcellebiologi og cancerbehandling. Mer spesifikt vedrører oppfinnelsen spesifikk ekspresjonen av heterologe gener, spesielt gener som koder for cytotoksiske produkter, i tumorceller.

2. Bakgrunn for oppfinnelsen

2.1 H19 gen

H19 genet er en av de fa kjente gener som er kjent å være preget hos mennesker (Hurst et al, 1996, Nature Genetics 12:234-237). På begynnelsen av embryogenesen, ble H19 uttrykt fra begge kromosomale allelene (DeGroot et al, 1994, Trophoblast 8:285-302). Kort etterpå, skrus det partanale allele av, og bare det maternelle arvede allele blir transkribert.

Hl9 blir uttrykt rikelig under embryogenesen, og blir identifisert som et gen som ble koordinert regulert med alfa-fetoprotein i lever ved det transvirkende locuset raf (Pachnis et al, 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:5523-5527). I tillegg, har H19 uavhengig blitt klonet av et antall av grupper som bruker screeninger rettet mot isolering av gener som blir uttrykt under vevsdifferensiering. F.eks., Davis et al. (1987, Cell 51:987-1000) identifiserte musehomologen til H19 i en screen for gener som er aktive tidlig under differensiering av C3H10T1/2 celler. Pourier et al. (1991, Development 113:1105-1114) fant at murint H19 blir uttrykt under stamcelledifferensiering på tidspunktet for implantering. Transkripsjon av humant Hl9 genet ble også oppdaget i differensierende cytotrofoblaster fra human plasenta (Rachmilewitz et al, 1992, Molec. Reprod. Dev. 32:196-202).

Mens transkripsjon av Hl9 RNA forekommer i et antall av forskjellig embryogene vev under fosterutviklingen og plasentautviklingen, blir H19 ekspresjon nedregulert etter fødselen. Relativt lave mengder av H19 transkripsjon av blitt rapportert, imidlertid, i murint voksen muskel og lever (Brunkow and Tilghman, 1991, Genes & Dev. 5:1092-1101). H19 blir også aktivert etter fødselen i cancerceller. Ariel et al, (1997, Molec, Pathol. 50:34-44) viste Hl9 ekspresjon i mange tumorer som oppstod fra vev som hadde blitt uttrykt prenatalt. I tillegg, fant disse forfatterenene Hl9 RNA i tumorer avledet fra neurale vev, spesielt astrocytoma og ganglioneuroblastoma som ikke er kjent for å være assosiert med Hl9 ekspresjon. Ved at en lang rekke av cancere uttrykte H19 RNA spekulerte disse forfatterene i at Hl9 var et onkoetalt RNA og foreslo å undersøke H19 som en tumormarkør for human neoplasi.

Både human og murin H19 gener har blitt klonet og sekvensert (Brannan et al., 1990, Mooec, Cell. Biol. 10:28-36). Sammenligning av det humane og muse Hl9 gener av en 77% nukleotidsekvensidentitet. På tross av denne konserveringen av nukleotidhomologi mellom artene, kunne svært få deduserte aminosyresekvensidentitet bli predikert fra de åpne leserammene hos de to genene ( Id.). Dessuten, skjønt Hl9 RNA blir transkribert ved RNA polymerase II, spleiset og polyadenylert, ser det ikke ut til å bli translater. isteden, har H19 RNA blitt funnet assosiert med 28S cytoplasmisk RNA, som fører til spekulasjoner om Hl9 RNA kan fungere som en RNA komponent til et ribonukleoprotein ( Id.).

Den aktuelle fysiologiske rollen til H19 er ikke fullstendig forstått. H19 kan virke som

et dominant letalt gen; et høy ektopisk ekspresjon av et H19 transgen forårsaker død hos mus kort etter fødsel (Brunkow et al., supra). Denne letale perioden faller sammen med det tidspunktet når Hl9 transkripsjon blir represert. På den annen side, har ingen defekt blitt observert i verken heterozygote eller homozygotemus som bærer en Hl9 knockout allel(er) (Leighton et al., 1995, Nature 375:34-39). En knockout av det maternelle arvede allelet interfererer ikke med pregingen av det genetisk koblede og den motsatte pregede IGF-2 genet; den resulterende musen er større ved fødsel enn de andre i kullet på grunn av økt prenatal ekspresjon av IGF-2 ( Id.). Siden disse to motsatte pregede gener deler cis-virkende regulatoriske sekvenser spekulerte Leighton og kollegaer på om H19 kan være involvert i preging av IGF-2 genet.

En annen funksjon som er foreslått for Hl9 genproduktet er tumorsupressor RNA. Hao et al. (1993, Nature 365:764-767) rapporterte at transfeksjon av to embryonale tumorcellelinjer, RD og G401, med en H19 ekspresjonskonstruksjon resulterte i cellevekstretardering, morfologiske endringer og redusert tumorgenisitet i nakne mus. En slik tumor supressoraktivitet har blitt sett å være konsistent med den observerte dødeligheten av etopisk ekspresjon i mus (Hao et al., supra) så vel som den økte størrelsen av mus som er knocked out for det maternelle Hl9 allele (Leighton et al., supra). Forslaget at H19 er en tumorsupressor har vært kontroversielt. Noen av resultatene kunne ikke reproduseres, og det kan eksistere et annet tumorkandidatsupressorgen som er nært koblet til H19 (Ariel et al., supra). H19s foreslåtte rolle som en tumorsupressor er også i konflikt med de eksperimentelle data at Hl9 blir aktivert i mange forskjellige tumorceller (se f.eks. Lustig-Yariv et al., 1997, Oncogene 23:169-177).

2.2 Insulinlignende vesktfaktor ( IGF) gener

IGF-2 er et annet preggen hvis ekspresjon avhenger av dets parentale opprinnelse. Imidlertid i motsetning til Hl9, er IGF-2 maternalt preget i både mus og menneske og derfor uttrykt fra det paternelle arvede allele (Rainier et al, 1993, Nature 363:747-749). Det humane IGF-2 genet utviser et kompleks transkripsjonelt mønster. Det er fire IGF-2 promotorer som blir aktivert på et vevs og utviklingspesifikk måte. Bare tre av promoterene, P2, P3 og P4 er preget og aktive under fetal utvikling og i cancervev. Det fjerde promoter Pl er ikke preget og blir aktivert kun i voksen lever og koroid pleksus (se Holthuizen et al, 1992, Mol. Reprod. Dev. 35:391-393). P3 promoter fra IGF-2 genet har vært implisert i progresjon av lever cirrhose og hepatocellulær karsinom (Kim and Park, 1998, J. Korean Med. Sei. 13:171-178).

Tap av preging av IGF-2 har vært implisert i Wilms tumor (Ogawa et al, 1993, Nature 363:749-751). Denne observasjonen førte til at mange forskere spekulerte i om tap av preging og biallelisk ekspresjon av pregede gener kan være involvert i vekstforstyrrelser og utvikling av cancer (se også Rainier et al, 1993, Nature 362:747-749, og Glassman et al, 1996, Cancer Genet. Cytogenet. 89:69-73).

2.3 Tumor spesifikk genterapi

Regulatoriske sekvenser fra tumorassosierte gener har blitt brukt for å selektivt målrette ekspresjon av et selvmordsgen i tumorderiverte celler. F.eks., blir alfa-fetoproteineks-presjon indusert i hepatocellulær karsinom. Huber et al, (1991, Proe. Nati. Acad. Sc. USA 88:8039-8043) brukte kontrollsekvenser fra enten albumingenet eller alfa-fetoproteingenet for å målrette ekspresjon av varicella-zoster tymidinkinase (VZV TK) genet som kodene sekvenser til hepatomaceller. Hepatomaceller infisert in vitro med en retroviral vektor som inneholder en av disse ekspresjonskonstruksjonene uttrykte VZV TK og ble sensitive for normal ikke toksisk promedikament 6-metoksypurin arabinonukleosid (araM). Keneko et al, (1995, Cancer Res. 55:5283-5287) konstruerte en adenoviral vektor som uttrykte HSC TK under kontroll av alfa-fetoproteinkontroll-sekvenser. Rekombinante adenovirale partikler som inneholdt denne vektoren ble direkte injisert inn i hepatocellulær karsinoma avledede tumorer dannet i atymiske nakne mus. Deretter foråraket intraperitonale injeksjoner med ganciklovir regresjon av hepatocellulær karinomavledede tumorer.

Osaki et al. (1994, Cancer Res. 54:5258-5261) transfektert inn i A549 lungekarsinoma-celler en ekspresjonskonstruksjon som inneholdt kontrollsekvensene for lungekarsino-embryonalt antigen gen koblet til den kodene sekvensen for Herpes simplex virus tymidinkinase (HSV TK). De transfekterte cellene ble sensitive for ganciklovir. I tillegg, ble tumorvekst i nakne mus fra subkutant injiserte transfekterte celler inhibert ved repeterte intraperitonale injeksjoner av ganciklovir. Imidlertid, har carsinoembryonalt antigen nylig blitt beskrevet som uttrykt i normal konolmukusa, og derfor begrenser anvendelsen av disse kontrollsekvensene som tumorspesifikke regulatorisk regioner (Osaka et al., supra). Derfor er det fortsatt et behov for utvikling av genterapivektorer som spesifikt uttrykker genprodukter i tumorceller.

FR2725213 beskriver virale vektorer som er avledet fra adenovirus som omfatter to terapeutiske gener, men utrykk av nevnte to terapeutiske gener er ikke regulert med en IGF-2 P3-promoter.

Hepatology. december 1995, Vol.22, Nr.6, side 1788-1796 beskriver en vektor hvor en IGF-2 P3 promoter benyttes for å styre uttrykket av reportergenet nls-LacZ i maligne leverceller.

3. Oppsummering av oppfinnelsen

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en vektor for uttrykkelse av en sekvens i en tumorcelle og for terapeutisk eller profylaktisk behandling av cancer, kjennetegnet ved at vektoren omfatter et polynukleotid omfattende en IGF-2 P3-promoter operasjonelt koblet til en heterolog sekvens som koder for et cytotoksisk genprodukt.

Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en vertscelle inneholdende en vektor ifølge det første aspekt ved foreliggende oppfinnelse.

Et tredje aspekt ved oppfinnelsen vedrører anvendelse av en vektor ifølge det første aspekt ved foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for behandling av kreft.

Et fjerde aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å uttrykke en heterolog sekvens i en tumorcelle in vitro, kjennetegnet ved at den omfatter introduksjon i tumorcellen av en vektor ifølge det første aspekt ved foreliggende oppfinnelse.

4. Kort beskrivelse av figurene

Figur 1A-IC. Nukleotidsekvens av human H19 promoterregion.

Promoterregionen fra nukleotidposisjon -837 til -7 (relativt til start av transkripsjon) er vist (SEQIDNO:l). Figur 2. Skjematisk diagram av vektorene brukt for å uttrykke et heterologt gen under kontroll av H19 regulatoriske sekvenser. Figur 3A-3E. H19 regulatoriske sekvenser direkte ekspresjon av et heterologt gen (CAT) i blærecancercellelinje. For de fem forskjellige indikerte cellelinjene, er CAT spesifikk aktivitet (cpm/ ug proteiner) plottet som en funksjon av vektoren brukt for transfeksjon. Figur 3A: HT-1376 celler. Figur 3B: EJ28 celler. Figur 3C: T24P celler. Figur 3D: 1197 celler. Figur 3E: UM-UC-3 celler. Disse vektorene som følger, er beskrevet i mer detalj under i avsnitt 6: (1) pCAT-basis; (2) pCAT-kontroll; (3) pH19E;

(4) pH19EH19D; og (5) pH19EH19R.

Figur 4A-4E. IGF-2 P3 og P4 promotere dirigerer ekspresjon av et heterologt gen (lusiferase) i blærecancercellelinje. For de fem forskjellige cellelinjene som er vist, er lusiferasespesifikk aktivitet (tellinger per g av protein) er plottet som en funksjon av IGF-2 promoter brukt i transfeksjonskonstruksjonen for å dirigere ekspresjon av lusiferase. Figur 4A: T24P eller. Figur 4B: 1376 celler. Figur 4C: UM-UC3 celler. Figur 4D: 1197 celler. Figur 4E: EJ28 celler. Vektorene er beskrevet i mer detalj under i avsnitt 10. Figur 5. Nukleotidsekvens en til et humant H19 promoter fragment (SEQ ID NO:2).

Figur 6. Nukleotidsekvens av 0,9 kb Hl9 enhanserfragment (SEQ ID NO:3).

Figur 7A og 7B. Nukleotidsekvens av 2 kb H19 enhanserfragment (SEQ ID NO: 4). Figur 8A-8C. Nukleotidsekvens av 4 kb H19 enhanserfragment (SEQ ID NO: 5). Figur 9A-9C. Transfeksjon med vektorer som inneholder forskjellige H19 regulatorisk region og P4 promoterkombinasjoner som dirigerer lusiferaseekspresjon i tumorceller.

Figur 9A: 5637 celler. Figur 9B: Huh7 celler. Figur 9C: 293T celler.

Figur 10A-10E. Transfeksjon med vektorer som inneholder H19 regulatorisk regioner som dirigerer lusiferaseekspresjon i tumorceller. Figur 10A: 293T celler. Figur 10B;: T24P celler. Figur 10C: Huh7 celler. Figur 10D: 5637 celler. Figur 10E: RT112 celler.

5. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen er delvis basert på den oppdagelse at regulatorisk regioner fra genomisk pregede gener som blir uttrykt i cancerceller kan bli brukt til å målrette ekspresjonen av kodene sekvenser av interesse i cancerceller. Spesielt, er det blitt funnet at Hl9 ekspresjon blir aktivert i mange karsinomaer, inklusiv men ikke begrenset til blærekarsinom, hepatocellulært karsinom, hepatoblastom, rabdomyosarkom, ovarie karsinom, cerviks karsinom, lungekarsinom, brystkarsinom, squamous cellekarsinom i hode og nakke, spiserørskarsinom, tyroidkarsinom, astrocytom, ganglioblastom og neuroblastom. Videre har det blitt oppdaget at konstruksjoner som inneholder Hl9 promoterregioner operativt koblet til et heterologt gen eller IGF-2 P3 eller P4 promoter operativt koblet til et heterologt gen eller konstruksjoner som inneholder en slik promoter i kombinasjon med en nedstrøms H19 enhanser, blir spesifikt aktivert i tumorceller.

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en vektor for uttrykkelse av en sekvens i en tumorcelle og for terapeutisk eller profylaktisk behandling av cancer, kjennetegnet ved at vektoren omfatter et polynukleotid omfattende en IGF-2 P3-promoter operasjonelt koblet til en heterolog sekvens som koder for et cytotoksisk genprodukt.

Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en vektor ifølge det første aspekt ved foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for behandling av kreft. Dette målet blir oppnådd ved å avlevere til cellen et polynukleotid som omfatter nevnte regulatoriske region operativt koblet til et heterologt gen. Det heterologe genet koder for et cytotoksisk middel (f.eks. et toksin, et antisens RNA eller et rbozym).

For formålet av oppfinnelsen beskrevet heri, betyr betegnelsen "operativt koblet" at nukleotidsekvensen er koblet til en regulatorisk sekvens på måter som tillater ekspresjon av nukleotidsekvensen og blir dirigert ved den regulatoriske sekvensen.

Et "heterologt gen" sekvens refererer seg til, for formålene for direkte anvendelse, til en gensekvens som ikke er normalt koblet til den regulatoriske sekvens. Genetiske heterologe gensekvenser inkluderer sekvenser som koder cytotoksiske genprodukter.

Som brukt heri, refererer "ekspresjon" seg til transkripsjon av det DNA av interesse, og spleising, prosessering, stabilitet og eventuelt translasjon av det korresponderende mRNA transkriptet. Avhengig av strukturen til DNA molekylet som avleveres, kan ekspresjon være transient eller kontinuerlig.

5.1 Regulatoriske sekvenser av H19 genet, IGF- 2 P3 og P4 promotere og IGF- 1

promoter

Beskrevet heri er H19 regulatoriske sekvenser som kan bli brukt for å dirigere tumorcelle spesifikk ekspresjon av en heterolog kodende sekvens. Disse H19 regulatoriske sekvenser inkluderer oppstrøms H19 promoter region og/eller nedstrøms Hl9 enhanseregion. Nukleotidsekvensen til en H19 promoterregion er vist i figur 1A-1C (SEQ ID NO: 1). Denne 830 nukleotidsekvensen strekker seg fra -837 til -7 nukleotider fra cap sete (som beskrevet i Brannan et al, supra). En konsensus TATA sekvens forekommer ved nukleotidene -27 til -35. To konsensus AP2 bindingsseter (8/9 matcher) forekommer ved omtrent -500 og -40 nukleotider oppstrøms for initieringen av transkripsjon. Når den er plassert oppstrøms for den kodene regionen til et heterologt gen, som diskutert i mer detalj under, er omtrent 830 basepar av den regulatoriske regionen tilstrekkelig for å dirigere ekspresjon av det operativt koblede heterologe genet i cancerceller som også uttrykket endogent Hl9.1 tillegg, er en annen Hl9 promoterregion mellom nukleotidene -819 til +14 (Figur 5, SEQ ID NO: 2) tilstrekkelig for å dirigere ekspresjon av operativt koblet heterologt gen i cancerceller.

Nedstrømsenhanserregionen til humant Hl9 gen kan eventuelt bli tilsatt til en H19 promoter/heterologenkonstruksjon for å tilveiebringe økte nivåer av tumorcellespesifikk ekspresjon. Som beskrevet mer fullstendig under og illustrert ved eksempel i avsnitt 6, omfatter nedstrømsenhanserregionen et SacI restriksjonsfragment som strekker seg fra +6 kb til +11 kb relativt til startsete for transkripsjon. Som det er forventet fra en enhansersekvens, er nedstrømsenhanseren i stand til å utvise dets effekt når den er plassert i enten revers eller direkte orientering (relativ til orienteringen av H19 enhanseren i den endogene Hl9 genet) nedstrøms for den kodene regionene til et heterologen under kontroll av Hl9 promoteren. I tillegg, kan også fragmentet fra denne enhanseren som inneholder sekvensene som vist i figur 6, 7A, 7B og 8A-8C (SEQ ID NO: 3-5) også bli brukt for å fremme genekspresjon.

Ekspresjonen av IGF-1 genet har blitt assosiert med lungecancer og brystcancer. IGF-1 promoter (nukletidsekvens mellom nukleotidene 1 til 1630 i human IGF-1 gensekvens (Genbank akssesjonsnummer M12659 M77496 inkorporert heri ved referanse; Rotwein et al, 1986, J. Biol. Chem. 261:4828-4832).

IGF-2 genproduktet blir uttrykt ved å bruke en av fire forskjellige promoterregioner. Tre av disse fire promoterene er preget og blir uttrykt i embryonalt vev; promoter Pl, blir imidlertid aktivert kun i voksent vev (Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9). P3 promoter er blitt implisert i hepatokarsinom. Det er også blitt oppdaget at preget P4 promoter (nukleotidsekvens -546 til +102 i IGF-2 genet) og P3 promoter (nukleotidsekvens -1229 til +140 hos IGF-2 genet) er aktivert i humane blærcancerceller, og kan bli brukt for å dirigere ekspresjon av en operativ koblet heterolog gen til tumorceller. IGF-2 P3 og P4 promotere kan bli brukt i kombinasjon med H19 enhanser eller aktive fragmenter derav.

Disse regulatorisk sekvensene fra genomiske pregede og ikke pregede gener som blir uttrykt i cancerceller kan ytterligere bli skilt til å definere de minimale regulatoriske sekvensene som kreves for å erverve ønsket tumorspesifikk ekspresjon. F.eks., kan promoterregionen bli endret ved addisjoner, substitusjoner eller delesjoner og analysert for retensjon av tumorspesifikk ekspresjonsfunskjon. Forskjellige deler av H19 nedstrøms enhanser kan bli testet individuelt for evnen til å øke transkripsjon fra H19 promoter.

Endringer i de regulatoriske sekvensene kan bli dannet ved å bruke forskjellige kjemiske eller enzymatiske metoder som er velkjent for de som kjenner fagfeltet. F.eks., regioner av sekvenser definert ved restriksjonsseter kan deleteres. Oligonukleotidrettet mutagenese kan anvendes for å andre sekvensen på en definert måte og/eller for å introdusere restriksjonsseter i spesifikke regioner innen sekvensen. I tillegg, kan delesjonsmutanter bli dannet ved å bruke DNA nuklease slik so Bal31 eller ExoIII og Sl nuklease. Progressivt større delesjoner i de regulatoriske sekvensene blir dannet ved å inkubere DNA med nukleaser i øket tidsperiode (se Ausubel, et al., 1989 Current Protocols for Molecular Biology, for en oversikt over mutageneseteknikker).

De endrede sekvensene blir evaluert for deres evne til å dirigere tumorspesifikk ekspresjon av heterologe kodene sekvenser i egnede vertsceller, spesielt H19 uttrykkende karsinomaavledede celler (f.eks. blærekarsinomaceller for å gi et eksmpel).

Mange forskjellige heterologe gener kan bli uttrykt under kontroll av disse regulatoriske sekvensene slik som gener som koder for toksiske genprodukter, potensielt toksiske genprodukter, og antiproliferering eller cytostatiske genprodukter. Markørgener kan også bli uttrykt inklusive enzymer, (f.eks. CAT, beta-galaktosidase, lusiferase), fluoresensproteiner slik som grønt fluoresensprotein, eller antigene markører.

Cytotoksiske genprodukter er vidt definert til å inkludere både toksiner og apoptosisk-induserende midler. I tillegg, med formålet fra oppfinnelsen, inkluderer cytotoksiske genprodukter medikamentmetaboliserende enzymer som konverterer et promedikament til et cytotoksisk produkt. Eksempler på cytotoksiske genprodukter kan bli brukt i metoder fra oppfinnelsen og omfatter difteritosin, pseudomonas toksin, risin, koleratoksin, PE40 og tumorsuppressorgener slik som retinoblastomgenet og p53.1 tillegg, kan sekvenser som koder for apoptotiske peptider som induserer celleapoptose bli brukt. Slike apoptotiske peptider inkluderer Alzheimers A beta peptid (se LaFerla et al, 1995, Nat, Genet, 9:21-30), det ateriale natriuretiske peptid (se Wu et al, 1997, J. Biol. Chem. 272:14860-14866), kalsitoningenrelatert peptid (se Sakuta et al, 1996, J, Neuroimmunol. 67:103-109) som andre apoptotiske peptider kjent eller som blir oppdaget.

Medikamentmetaboliserende enzymer som konverterer et promedikament til et cytotoksisk produkt inkluderer tymidinkinase (fra herpes simplex eller varicella zoster vimser), cytosindeaminase, nitroreduktase, cytokrom p-450 2B1, tymidinfosforylase, purinnukleosidfosforylase, alkalinfosfatase, karboksypeptidaser A og G2, linamarase, "Hactamase og xantinoksidase) se Rigg and Sikora, August 1997, Mol. Med. Today, sidene 359-366 for ytterligere bakgrunnsstoff).

I tillegg, kan antisens antigen, eller apatameriske oligonukleotider som kan avleveres til cancerceller ved å bruke tidligere beskrevet ekspresjonskonstruksjoner. Ribozymer eller enkelttrådet RNA kan også bli uttrykt i cancerceller for å inhibere ekspresjon av et helt spesielt gen av interesse. Målgenene for disse antisens eller ribozymmolekylene skulle være de kodede genproduktene som er essensielle for celleopprettelse eller opprettelse av cancercellefenotype. Slike målgener inkluderer men er ikke begrenset til cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyclinDl, cyclinE, cyclinA og edk4.

F.eks., vektorer som uttrykker, under kontroll av regulatoriske sekvenser fra pregede gener eller IGF-1 promoter som blir uttrykt i cancercelle, antisens RNA eller ribozymer spesifikk for transkripter av onkogene former av p53, c-fos, c-jun, Kr-ras og/eller Her2/neu blir introdusert inn i cellene for å nedregulere ekspresjon av de endogene genene. Tumorceller som uttrykker H19, og kan aktivere H19 regulatoriske sekvenser, (eller som spesifikt aktiverer IGF-1, IGF-2 P3 eller P4 promoter) kan være spesifikt målretter for ekspresjon av antisens RNA eller ribozym RNA.

Antisenstilnærminger involverer design oligonukleotider (i dette tilfellet mRNA) som er komplementære til mål mRNA. Antisensoligonukleotidene vil binde til de komplementære mål mRNA transkriptene og hindre translasjon. Absolutt komplementaritet, er foretrukket men er ikke et krav. En sekvens "komplementaritet" til en del av et RNA, som referert til heri, betyr en sekvens som har tilstrekkelig komplementaritet til å være i stand til å hybridisere med RNA, for å danne et stabilt dupleks. Evnen til å hybridisere vil avhenge av både grad av komplementaritet og lengden av antisens nukleoinsyre. Generelt, jo lenger hybridiseringsnukleinsyren, jo mer basemismatcher med et RNA kan den inneholde og allikevel danne et stabilt dupleks (eller tripleks, som kan være tilfelle). En som kjenner fagfeltet kan beregne en tolererbar grad av mismatch ved anvendelse av standard prosedyre ved å bestemme smeltepunkt til hybridiseringskomplekset.

Oligonukleotidene som er komplementare til 5' ende av målmessage, f.eks. 5' utranslatert sekvens opp til og inklusiv AUG initieringskodon, skal virke mest effektivt i å inhibere translasjon. Imidlertid, sekvenskomplementarietet til 3' utranslaterte sekvenser av mRNA har nylig vist å være effektiv i å inhibere translasjon av mRNA også. Se, Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335. Derfor, kan oligonukleotider som er komplentære til enten 5'- eller 3'- ikke translatert, ikke kodende regioner til målgentranskriptene bli brukt i en antisenstilnærming for å inhibere translasjon av endogene gener. Oligonukleotidene som er komplementære til 5' utranslaterte region til mRNA skal inkludere komplementet til AUG startkodon. Antisensoligonukleotider som er komplementære mRNA kodene regioner er mindre effektive inhibitorere for translasjon men kan bli brukt i samsvar med oppfinnelsen. Om den er designet til å hybridisere til 5', 3' eller kodende region til mål mRNA, skal antisensnukleinsyren være minst 6 nukleotider i lengde, og er fortrinnsvis oligonukleotider som varierer i mengder fra 6 til omtrent 50 nukleotider. I spesifikke aspekter er oligonukleotiden minst 10 nukleotider og minst 17 nukleotider, minst 25 nukleotider eller minst 50 nukleotider.

Uansett valg av målsekvens, er det foretrukket at in vitro studier først blir utført for å kvantifisere evnen til antisensoligonukleotidet til å inhibere genekpresjon. Disse studiene bør utnytte kontroller som skiller mellom antisensinhibering og ikke spesifikk biologiske effekter av oligonukleotidet. Det er også foretrukket at disse studiene sammenligner nivåene av mål RNA eller protein med det fra en intern kontroll RNA eller protein.

Ribozymmolekylet designet for å katalyttisk kutte et essensielt målgen kan også bli brukt for å hindre translasjon av mål mRNA. (Se f.eks., PCT international publikasjon WO90/11364, publisert 4. oktober 1990; Sarver et al, 1990, Science 247:1222-1225). Når ribozymet er spesifikt for et gentranskript som koder for et protein essensielt for cancercellevekst, slik som ribozymer som kan forårsake reversering av en canceriøs cellefenotype. Mens ribozymer som kutter mRNA ved setespesifikke gjenkjenningssekvenser kan bli brukt til å øke mål mRNA, er anvendelsen av hammerhoderibozymer foretrukket. Hammerhoderibozymer kutter mRNA ved lokaliseringer i flankeringsregionene som danner komplementære basepar med mål mRNA. Det eneste krav er at mål mRNA har følgende sekvens av to baser: 5'-UG-3'. Konstruksjon og produksjon av hammerribozymer er velkjent innen fagfeltet og er beskrevet mer utførlig i Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591. Fortrinnsvis, blir ribozymet fremstilt slik at kuttegjenkjenningssete er lokalisert nær 5' ende av mål mRNA; dvs. for å øke effektiviteten og minimalisere den intracellulære akkumuleringen av ikke funksjonelle mRNA transkripter.

Ribozymer for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse inkluderer RNA endoribonukleaser (heretter "Cech-typeirbozymer") slik som det som naturlig forekommer i tetrahymena termofilia (kjent som IVS eller L-19IVS RNA) og som er utførlig beskrevet at Thomas Cech og medarbeidere (Zaug et al, 1984, Science, 224:574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug et al, 1986, Nature, 324:429-433; publisert i international patentsøknad nr. WO 88/04300 ved universitetets patenter Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216). Cech-typeribozymer har en åtte basepars aktivt sete som hybridiserer ti en mål RNA sekvens hvor etter kutting av mål RNA finner sted. Oppfinnelsen omfatter anvendelse av slike Cech-typeribozymer som målsøker åtte basepar aktive setesekvenser som er tilstede i målgenene.

5.2 Aktivering av gener i tumorceller

Cellene som reaktiverer preget genekspresjon vil også være i stand til å spesifikk danne ekspresjonskonstruksjoner som inneholder slike pregede genregulatoriske regioner operativt koblet til et heterologt gen. Slike celler, spesielt tumorceller, er egnede mål for genterapimetoder fra oppfinnelsen. H19 og IGF-2 P3 og P4 spesifikk ekspresjon i både tumorer og cellelinjer kan bli bestemt ved å bruke teknikker fra RNA analyse, in situ hybridisering og reportergenkonstruksjoner. I tillegg, kan tumorceller med aktivert IGF-1 genekspresjon bli bestemt på samme måte og målsøkt i genterapi ved å bruke IGF-1 promoter for å dirigere ekspresjon av et heterologt gen.

For de fleste RNA analyseanvendelser, blir en merket probe som spesifikk hybridiserer til gentranskriptet av interesse fremstilt ved å bruke en av de mange teknikkene som er velkjent innen fagfeltet. Den merkede proben kan inneholde minst 15-30 baser komplementære til H19 nukleotidsekvensen, og mer foretrekkbart å inneholde minst 50 til 150 baser som er komplemenære til H19 transkripter. En spesiell foretrukket hybridiseirngsprobe for H19 ekspresjon er et polynukleotid som er komplementær til 3' ende av Hl9 message fra omtrent 800 basepar oppstrøms for poly A setet til poly A setet.

Innmerkinger som er egnet for polynukleotidprober inkluderer nukleotider som inkorporerer radioaktive isotoper (slik som35S og<32>P), fluoresens, luminisens og fargemerker og enzymatiske deler.

Den merkede proben blir hybridisert in situ til en cellevevsprøve ved å bruke standardteknikker slik som beskrevet under i arbeidseksemplet, og i "co-pending" U.S. patentsøknad med serienummer 08/704,786. Alternetivt, hvis tilstrekkelig kvantum av egnede celler kan erverves, kan standard RNA analyse (slik som Northern analyse, RNase beskyttelse eller primerforlengelse) bli utført for å bestemme nivået av mRNA ekspresjon av genet av interesse.

I tillegg, er det mulig å utføre slike genekspresjonsanalyser "in situ", dvs. direkte på vevssnittene (fiksert og/eller frossen) til pasientvevet ervervet fra biopsier eller reseksjoner, slik at ingen nukleinsyrerensing er nødvendig. Nukleinsyrereagensene slik som de som er beskrevet over kan bli brukt som prober og/eller primere for slik in situ prosedyrer (se f.eks., Nuovo, G.J., 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications", Raven Press, NY).

En alternativ metode for å bestemme om en celletype eller tumor vil være i stand til å spesifikt aktivere ekspresjonskonstruksjoner som inneholder spesielle regulatoriske regioner operativt koblet til et heterologt gen er å faktisk transfektere slike ekspresjonskonstruksjoner inn i cellen. For dette formålet, er det heterologe genet fortrinnsvis et markørgenprodukt. Et positivt resultat i en analyse for markørgenproduktet gir at cellen eller cellelinjen er i stand til å aktivere ekspresjon fra de regulatoriske regionene.

Ved å bruke disse teknikkene, er eksempler på tumortyper med aktivert H19 ekspresjon som følger:

A. Pediatriske faste tumorer

1. Wilm's tumor

2. Hepatoblastom

3. Embryonalt radbomyosarkom

B. Kimcelletumorer og trofoblastiske tumorer

1. Testikulær kimcelletumorer

2. Umoden teratoma fra overie

3. Sacrococcygeal tumor

4. Koriokarsinom

5. Plasental setetrofoblastisk tumor

C. Epitel voksentumorer

1. Blærekarsino

2. Hepatocellulært karsinom

3. Ovarikarsinom

4. Cervikskarsinom

5. Lungekarsinom

6. Brystkarsinom

7. Squamous cellekarsinom i hode og nakke

8. Spiserørskarsinom

9. Tyroidkarsinom

D. Neurogene tumorer

1. Astrocytom

2. Ganglioblastom

3. Neuroblastom

De ovenfor nevnte cancerene kan behandles med metoder fra oppfinnelsen.

I tillegg, kan de før nevnte teknikkene anvendes for å bestemme tumorer som aktiverer IGF-1, og IGF-2 P3 og P4 promotere. Slike tumorer kan også behandles ved metoder fra oppfinnelsen. F.eks., blir IGF-2 aktivert i tumorer i barneårene, slik som Wilm's tumorer, rabdomyosarkomer, neuroblastomer og hepatoblastomer.

5.3 Framgangsmåter for innføring av regulatoriske sekvenser inn i vertsceller

Oppfinnelsen omfatter også vertsceller transfektert med polynukleotider som inneholder regulatoriske regioner operativt koblet til et heterologt gen. Slike vertsceller kan opprettholdes i kultur eller kan være en del av et dyr, fortrinnsvis pattedyr. Polynukleotider av interesse blir satt inn i hvilken som helst av en rekke av vektorer som deretter blir avlevert ved å bruke beskrevne metoder og materialer. Slike vektorer kan bli produksert ved å bruke veletablerte molekylærbiologiske teknikker (se Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning bind I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, og Current Protocols in Molecular Biology

(1989) John Wiley & Sons, alle bind, og periodiske oppdateringer derav, heri inkorporerte ved referanse). Der hvor translasjon er ønsket, vil de heterologe genene av interesse også bli fremstilt for å omfatte en egnet 3' polyadenyleringssekvens hvis nødvendig.

5.3.1 Dyrkede celle

Vertsceller transfektert med polynukleotider som inneholder pregede genregulatoriske regioner operativt koblet til et heterologt gen kan være en hver prokaryot eller eukaryotcelle. Ved å ligere polynukleotid inn i en genkonstruksjon, slik som en vektor, og transformering eller transfektering inn i verstcelle, enten eukaryote (gjær, ape, insekt eller pattedyr) eller prokaryot (bakterielle celler) er standardprosedyrer som brukes i mikrobiell eller vevskulturteknologier.

Vektorer som er egnet for dyrking av disse polynukleotidene i bakterielle celler, slik som E. coli, inkluderer plasmider av typen: pBR322-avledede plasmider, pEMBL-avledede plasmider, pEX-avledede plasmider, pBTac-avledede plasmider og pUC-avledede plasmider. For replikasjon i gjær, er YEP24, YIP5, YEP51, pYES2 og YRP17 plasmider klonings og ekspresjonsbærere som er nyttige for å introdusere genetiske konstruksjoner i S. cerevisiae (se f.eks., Broach et al, 1993, i Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye, Academic press, s. 83). Disse vektorene kan replikere i både E. coli på grunn av tilstedeværelsen av pBR322 ori og i gjær på grunn av replikasjonsbestemmelse av gjær 2 um sirkelplasmid. I tillegg, kan resitensmarkører slik som ampicillin bli brukt.

På samme måte, inneholder foretrukne mammalske vektorer for polynukleotidene fra oppfinnelsen både prokaryote sekvenser for å lette propageringen av vektoren i bakterier. Slike vektorer, når de blir transfektert i mammalske celler, kan designes for å integreres inn i mammalsk kromosom for langtids stabilitet ved å anvende et koblet selekterbart markørgen. Alternativ, kan derivater av virus slik som bovin papillomavirus (BPV-1) eller Epstein-Barr virus kan bli brukt for transientekspresjon. De forskjellige metodene som er anvendt i fremstillingen av plasmidtransformasjon av vertsorganismene er velkjent innen fagfeltet. For andre vektorsystemer så vel som generelle rekombinante prosedyrer, se Sambrook et al, supra.

5.3.2 Genterapi

Oppfinnelsen omfatter anvendelse av en vektor som omfatter polynukleotider som inneholder en genregulatorisk region operativt koblet til et heterologt gen for fremstilling av et preparat for behandling av cancer. For genterapiformål, kan ekspresjonskonstruksjoner av den foreliggende oppfinnelse bli administrert i en hver biologisk effektiv bærer, f.eks, en hver formulering eller sammensetning som er i stand til effektivt å avlevere det rekombinante genet til cellene in vivo. Tilnærminger inkluderer insertion av det aktuelle genet i virale vektorer som inkluderer rekombinante retrovirus, adenovirus, adeno-assosierte virus og herpes simplex virus-1, eller rekombinante bakterielle eller eukaryote plasmider. Virale vektorer transfekterer celler direkte: plasmid DNA kan bli avlevert ved hjelp av, f.eks. kationiske polymerer, kationiske liposomer (f.eks. lipofektin, kolesterolderivater slik som D.D.A.B og kationiske fosforlipider) eller derivater (f.eks. antistoffkonjugert), polylysinkonjugater, gramisidin S, kunstig virale kappe eller andre slike intracellulære bærere, så vel som direkte injeksjon av naken genkonstruksjon, elektroprering eller CaP04presipitering utført in vivo. En nylig oversikt av genoverføring og ekspresjonssystemer for cancergenterapi er Cooper, 1996, Seminars in Oncology 23:172-187.

Det vil forstås at fordi transfeksjon av egnet målceller representerer et viktig første trinn i genterapi, vil valg av spesielt avleveringssystem avhengig av slike faktorer som fenotype tilsiktede målet og måter for administrering, f.eks. lokalt eller systemisk. Videre, vil det gjenkjennes at den spesielle genkonstruksjonen som er tilveiebrakt av in vivo transduksjon av ekspresjonskonstruksjoner også er nyttige for in vitro transduksjon av celler, slik som for anvendelse i ex vivo vevskultursystemer beskrevet over.

Infeksjon av celler med en viral vektor har fordelen at en stor del av målcellene kan motta nukleisyren. I tillegg, blir molekyler som er kodet for av viral vektor, f.eks. ved en cDNA inneholdt i den virale vektoren, uttrykt effektivt i celler som har tatt opp virale vektornukleinsyre. Egnede vektorer som kan avlevere ved å bruke de herværende beskrevne metoder og sammensetninger inkludere, men er ikke begrenset til, herpes simplex virusvektor, adenovirusvektorer, adeno-assosiert virusvektorer, retrovirale vektorer, pseudorabiesvirus, alfa-herpes virusvektorer og dets like. En grundig oversikt over virale vektorer, spesielt virale vektorer som er egnet for modifisering av ikke repliserende celler, og hvordan anvende slike vektorer i konjuksjon med ekspresjon av polynukleotider av interesse kan finnes i boken "Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications" Ed. Caplitt and Loewy, Academic Press, San Diego (1995).

Det er blitt vist at det er mulig å begrense infeksjonsspekteret av virus og som en konsekvens av viralbaserte vektorer, ved å modifisere de virale pakkeproteinene på overflaten av den virale partikkel (se f.eks. PCT publikasjonene W093/25234 og WO94/06920). F.eks., strategier for å modifisere infeksjonsspekteret til retrovirale vektorer inkluderer: å koble antistoffer spesifikke for celleoverflateantigenet til viralt kappeprotein (Roux et al, 1989, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86:9079-9083; Julan et al, 1992, J. Gen. Virol. u3:3251-3255; og Goud et a., 1983, Virology 163:251-254); eller koble celleoverflatereseptorligander til de virale kappeproteinene (Neda et al, 1991, J. Biol. Chem. 266:14143-14146). Koblingen kan være i form av kjemisk kryssbinding med et protein eller annen variant (f.eks,. laktose for å omdanne kappeproteinet til en asialogykoprotein), så vel som det å danne fusjonsproteiner (f.eks. enkelt-kjede antistoff/kappefusjonsproteiner). F.eks., kan cancerceller bli målsøkt ved å bruke denne teknikken, f.eks., å koble antistoffer mot tumorassosierte molekyler eller cancercelle-overflateproteiner til overflaten av rekombinante virus. Denne teknikken, er nyttig for å begrense eller på annen måte dirigere infeksjonen til visse vevstyper, kan også bli brukt til å omdanne en ektotropisk vektor til en anfotropisk vektor.

Et foretrukket viralt genavleveringssystem som er nyttig i den foreliggende oppfinnelsen utnytter adenovirus-avledede vektorer. Genomet til et adenovirus kan bli manipulert slik at det koder og uttrykker et genprodukt av interesse men blir inaktivert når dets evne til å replikere i normal lytisk viral lifssyklus. Se f.eks. Berkner et al, 1988, Bio Techniques 6:616; Rosenfeld et al, 1991, Science 252:431-434; og Rosenfeld et al, 1992, Cell 68:143-155. Egnede adenovirale vektorer avledet fra adenovirusstammen AD type 5 dll324 eller andre stammer av adenovirus (f.eks. Ad2, Ad3, Ad7 etc.) er velkjent for de som kjenner fagfeltet. Rekombinante adenovirus kan være fordelaktig i visse tilfeller ved at de kan bli brukt til å infisere et stort antall av celletyper, inklusiv luftveisepitel (Rosenfeld et al, 1992, sitert supra), endotelceller (Lemarchand et al, 1992, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:6482-6486), hepacytes (Herz and Gerard, 1993, Proe. Nati. Acad. Sei USA 90:2812-2816) og muskelceller (Quantin et al, 1992, Proe. Nati. Acad. Sei USA 89:2581-2584). Videre, er viruspartiklene relativt stabile, og er mottagelig for rensing og konsentrering, og kan bli modifisert for å innvirke på spektrumet av infektivitet. I tillegg, blir introdusert adenoviralt DNA (og fremmed DNA innehold deri) ikke integrert i genomet til en vertscelle med forblir episomal, for derved å unngå potensielle problemer som kan oppstå som et resultat av insersjonsmutagenese i situasjoner hvor introdusert DNA blir integrert inn i vertsgenomet (f.eks. retroviralt DNA). Dessuten, er bærerkapasiteten til adenoviralt genom for fremmed DNA stor (opptil 8 kilobaser) relativ til andre genavleveringsvektorer (Berkner et al, sitert supra, Haj-Ahmand and Graham, 1986, J. Virol. 57:267). De fleste replikasjonsdefekte adenovirale vektorer som for tiden blir brukt og derfor favoriseres av den foreliggende oppfinnelse er deletert for alle eller deler av viralt El og E3 gener men bibeholder så mye som 80% av det adenovirale genetiske materiale (se f.eks., Jones et al, 1979, Cell 16:683; Berkner et al, supra; og Graham et al in Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed. (Humana, Clifton NJ, 1991) kapittel 7, sidene 109-127).

Et annet viralt vektorsystem som er nyttig for avlevering av en av ekspresjonskonstruksj onene er adeno-assosiert virus (AAV). Adeno-assosiert virus er et naturlig forekomne defekt virus som krever et annet virus, slik som et adenovirus eller et herpesvirus, som et hjelpevirus for effektiv replikasjon og en produktiv livssyklus.

(For en oversikt se Muzyczka et al, 1992, Curr. Topics in Micro, and Immunol. 158:97-129). Det er også en av de få virus som kan integrere det DNA inn i ikke delende celler, og utviser en høy frekvens av stabil interaksjon (se f.eks. Flotte et al, 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-354; Samulski et al, 1989, J. Virol. 63:3822-3828; og McLaughlin et al, 1989, J. Virol. 63:1963-1973). Vektorer som inneholder så lite som 300 basepar av AAV kan bli pakket og integrert. Rom for eksogent DNA begrenset til omtrent 4,5 kg. En AAV vektor slik som den som er beskrevet i Tratschin et al, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 kan bli brukt for å introdusere DNA inn i celler. Mange nukleinsyrer har blitt introdusert inn i forskjellige celletyper ved å bruke AAV vektorer

(se f.eks. Hermonat et al, 1984, Proe. Nati. Acad. Sei USA 81:6466-6470; Tratschin et al, 1985, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al, 1988, Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al, 1984, J. Virol. 51:611-619; og Flotte et al, 1993, J. Biol. Chem. 268:3781-3790).

I tillegg til virale overføringsmetoder, slik som de som er illustrert over, kan ikke virale metoder også anvendes til å forårsake dirigert ekspresjon av et ønsket heterologt gen i

vevet til et dyr. De fleste ikke virale metodene for genoverføring baserer seg på normale mekanismer brukt av mammalske celler for opptak av intracellulær transport av makro-molekylet. I foretrukne utførelsesformer, baseres ikke virale gensystemer seg på fra den foreliggende oppfinnelse på endocytiske reaksjonsveier for opptak av foreliggende ekspresjonskonstruksjoner av målcellene. Eksempler på genavlevereringssystemer av denne typen inkluderer liposomal avleveringssystemer, poly-lysinkonjugater og kunstige virale kapper.

I klinisk sammenheng, kan genavleveringssystemene for terapeutisk ekspresjonskonstruksjoner bli introdusert til en pasient ved mange forskjellige metoder, hvor hver er kjent innen fagfeltet. F.eks., kan en farmasøytisk fremstilling av genavleveringssystemet bli introdusert systemisk, f.eks. ved intravenøs ekspresjon og spesifikk ekspresjon av konstruksjonen i målcellene forekommer fortrinnsvis fra spesifisitet fra transfeksjonen tilveiebrakt ved celletype eller vevstypeekspresjon på grunn av regulatoriske sekvenser som kontrollerer ekspresjonen av det heterologe genet, eller regulatoriske sekvenser i kombinasjon med genavleveringsredskapet som målsøker spesielle celletyper. I andre utførelsesformer, er initiell avlevering av den rekombinante ekspresjonskonstruksjonen mer begrenset hvor introduksjonen inn i dyret er svært lokalisert. F.eks., genavleveringsredskapet kan bli introdusert ved kateter (se U.S. patent 5,328,470) eller ved stereotaktisk injeksjon (f.eks. Chen et al, 1994. Proe. Nat. Acad. Sei. USA 91:3054-3057). En ekspresjonskonstruksjon fra oppfinnelsen kan avleveres i en genterapikonstruksjon ved elektroporering ved å bruke teknikker beskrevet, f.eks, av Dev et al, 1994, Cancer Treat. Rev. 20:105-115.

Farmasøytisk fremstilling av genterapikonstruksjoner kan består essensielt av genavleveringssystemet i en akseptabel diluent, eller kan omfatte en langsom frigivelsesmatriks hvor i genavleveringsformidleren er omsluttet. Alternativt, kan det fullstendig genavleveringssystemet bli produsert intakt fra rekombinante celler, f.eks. retrovirale vektorer, hvor den farmasøytiske fremstillingen kan omfatte en eller flere celler som produserer genavleveringssystemet.

5.3.3 Terapeutiske endopunkter og doseringer

En som kjenner fagfeltet, vil forstå ut fra medisinens eller pasientens perspektiv, at nesten all lindring eller forebygging av uønsket symptom assosiert med en cancertilstand (f.eks. smerte, sensitivitet, vekttap og dets like) vil være ønsket. I tillegg, er en hver reduksjon i tumormasse eller vekstrate ønsket, så vel som en forbedring i det histopatologiske bilde av tumoren. Derfor, for formålene av denne søknaden, skal betegnelsen"behandling", "terapeutisk anvendelse" eller "medisinsk anvendelse" brukt heri refererer til en hver og alle anvendelser av de sammensetningene som er angitt i kravene som botemiddel for en sykdomstilstand eller symptomer, eller på annen måte forebygger, hindrer, reversere progresjonen av sykdom eller andre uønskede symptomer.

En effektiv dose og behandlingsprotokoll kan bestemmes ved konvensjonelle metoder, ved å starte med en lav dose i laboratoriedyr og deretter øke dosen mens en overvåker effektene, og systematisk varierer doseregimet. Dyrestudiet, fortrinnsvis pattedyrsstudier, blir vanligvis brukt for å bestemme den maksimale tolererbare dosen, eller MTD, av bioaktivt middel per kilogram vekt. De som kjenner fagfeltet ekstrapolerer ofte doser for effektivitet og for å unngå toksisitet hos andre arter, inklusiv mennesker.

Før menneskestudier for effektivitet settes i gang, hjelper fase I kliniske studier hos normale individer til med å etablere sikre doser. Forskjellige faktorer kan bli tatt med i betraktning av en lege når en bestemmer en optimal dose for et gitt individ. Primært blant disse er toksisiteten og halveringstiden av det valgte heterologe genproduktet. Ytterligere faktorer inkluderer størrelsen på pasienten, alderen til pasienten, den generelle tilstanden til pasienten, den spesielle cancersykdommen som skal behandles, alvorlighetsgrad av sykdommen, tilstedeværelse av andre medikamenter hos pasienten, irt vivo aktivitet av genproduktet, og dets like. Utprøvningsdosene vil bli valgt etter overveielse av resultatene av dyrestudier og klinisk litteratur.

F.eks., er en typisk human dose av en adenoviral vektor som inneholder et H19 regulatorisk region operativt koblet til et heterologt gen som koder for et cytotoksisk middel slik som tymidinkinase fra 1 x IO<7>pfu til 1 x IO<10>pfu injisert direkte i tumormassen per dag. Mer foretrukket, er den daglige dosen av en slik adenoviral vektor injisert direkte i tumoren fra 1x10 pfu til 1x10 pfu avhengig av tumorstørrelsen. For en adenoviral vektor som inneholder en Hl9 regulatorisk region operativt koblet til et cytotoksisk genprodukt med forskjellig nivå av toksisitet, vil disse verdiene selvfølgelig endres tilsvarende. Lignende doser av en adenoviral vektor som inneholder en IGF-2 P4 promoter operativt koblet til et heterologt gen som koder for et cytotoksisk middel slik som tymidinkinase kan også bli brukt som en foreslått startpunkt.

Spesielt, der hvor in vivo anvendelse blir brukt, er forskjellige biokjemiske komponenter fra den foreliggende oppfinnelsen fortrinnsvis av høy renhet og er i det vesentlige fri for det potensielle farlige forurensinger (f.eks. minst "National Food" (NF) grad, generelt minst analyttisk grad, og fortrinnsvis minst farmasøytisk grad). I den utstrekning av et gitt forbindelse må syntetiseres forut for anvendelse, skal slike synteser eller etterfølgene rensing fortrinnsvis resultere i et produkt som er vesentlig fritt for potensielle toksiske midler som har blitt brukt under syntese eller rensingsprosedyrene.

6. Eksempel: H19 regulatoriske sekvenser letter ekspresjon

av et heterologt gen i tumorcellelinjer

Dette avsnittet beskriver konstruksjonen av forskjellige ekspresjonskonstruksjoner som inneholder et CAT reportergen plassert under kontroll av H19 regulatoriske sekvenser og deres overføring inn i flere forskjellige blærecancercellelinjer.

6.1 Materialer og metoder

6.1.1 Cellelinjer og transfeksjoner

Blærecancercellelinjene HT-1376, EJ28, T24P, 1197 og UM-UC-3 ble ervervet fra American Type Culture Collection (ATCC) og opprettholdt ifølge ATCC anbefalinger.

Transiente transfeksjoner ble utført ved å bruke kalsiumfosfatpresipiterings-transfeksjonsmetode. Presipitanter (som inneholdt 7 ug plasmid) ble tilsatt i 1 ml medium til 0,3 x IO<6>celler i 30 mm skåler. Etter 16 timer, ble transfeksjonsmediumet fjernet og fersk medium tilsatt. Celle ble høstet 24-96 timer etter transfeksjon og CAT aktiviteten bestemt ved å bruke butyryl-CoA organisk faseekstraksjonsprosedyre (Sambrook et a/., 1989). En alikvot av den organiske øvre fasen (100 ul) ble overført i en scintillasjonsbrønn som inneholdt 3 ml scintillasjonsvæske og talt.

6.1.2 Konstruksjon av eks<p>resjonsvektorene

Plasmidene pCAT basis (som inneholt en CAT reportergen satt inn ved et multipelt kloningssete), pCAT-promoter (som inneholdt CAT reportergenene under kontroll av en SV40 promoter), pCAT-enhanser (som inneholder SV40 enhanser nedstrøms for CAT reportergenet, og et multipelt kloningssete for insersjon av en promoter oppstrøms for CAT reportergenet) og pCAT-kontroll som inneholder CAT reportergenet under kontroll av både SV40 promoter og enhanser) ble alle ervervet kommersielt fra Promega (Madison, WI).

For å konstruere plasmidet pH19E, som inneholder CAT reportergen under kontroll av Hl9 promoteren, ble Hl9 promoterregionen (SEQ ID NO:l) først klonet inn i pBluescript II SK<+>(Promega). Et polynukleotid som inneholdt H19 promotersekvensen ble amplifisert fra human plasente DNA ved å bruke primerene

PCR produktet ble endepolert ved Klenow enzym og klonet inn i EcoRV setet til pBluescriptIISK+. Det innsatte DNA ble verifisert ved kutting med internt kuttende enzymer PvuII, EcoRI og Apal. Orienteringen av promoteren var motsatt den til lacZ kodene region til vektoren. Promoterregionen ble deretter kuttet ut med kutting med Hindll og Pstl, og det resulterende omtrent 0,9 kb fragmentet ble satt inn i Hindlll-Pstl seter hos pCAT basisk for å produsere pH19E.

Ekspresjonsplasmidene som inneholdt Hl9 enhanserregionen satt inn i begge orienteringene nedstrøms for H19 promoter/CAT reportergenet ble konstruert som følger. Et 5 kb SacI fragment som inneholdt H19 nedstrøms enhanser (fra +6,0 kb til +11 kg relativt til start av H19 transripsjon) ble klonet inn i SacI setet til pUC19. Enhanserfragmentet ble deretter kuttet ut med EcoRI og Hindlll og ligert inn i EcoRI - Hindlll setene i pBlueskript II SK<+>for å danne pBhl9En-Sa. pBhH19En-Sa ble partiellt kuttet med BamHI, og 5 kb fragmentet som inneholdt H19 enhanseren (og et internt BamHI sete) ble klonet inn i BamHI setet nedstrøms for H19 promoter/CAT reportergenet i pH19E. Plasmidene som inneholdt Hl9 enhanser i både den direkte (pH19EH19D) og reverse (pH19EH19R) orienteringer ble dannet.

6.2 Resultater og diskusjon

Fem forskjellige blærecancercellelinjer HT-1376, EJ28, T24P, 1197 og UM-UC-3 ble hver transfektert med pCAT-basis (kalt P-E i figur 2), pCAT-kontroll (kalt pSV40ESV40 i figur 2), pH19E, pH19EH19D og pH19EH19R. Ekspresjonsresultatene av hver konstruksjon er presentert i figurene 3A-3E. I hver cellelinje, ble det høyeste nivået av CAT aktivitet observert med pCAT-kontrollplasmid som inneholdt både SV40 enhanser og SV40 promoter. Denne konstruksjonen tjente som en positiv kontroll, siden SV40 regulatoriske sekvenser har blitt etablert som indusere for genekspresjon. Imidlertid, er SV40 regulatorisk sekvenser ikke tumorcellespesifikk i deres evne til å indusere genekspresjon. Cellelinjene som er transfektert med pH19E, som inneholder CAT reportergenet under kontroll av Hl9 promoteren, utviser også signifikant økt ekspresjon av CAT over bakgrunn. Nivået av induksjon av CAT aktivitet av Hl9 promoteren er fra fem ganger i HT-1376 cellelinje til ti ganger i UM-UC-3 cellelinje. Tilsettning av H19 enhanser til Hl9 promoter/CAT reportergenkonstruksjonene instruerte ytterligere nivåene av ekspresjon i visse cellelinjer. F.eks., i cellelinjene EJ28, T24P og 1197, økte H19 enhanseren signifikant ekspresjonen fra H19 promoter/CAT reportergenet. Imidlertid, gav orienteringen av enhanseren forskjellige resultater i de forskjellige cellelinjer. I cellelinjene HT-1376 og UM-UC-3 hadde enhanseren ingen liten eller ingen effekt på ekspresjonen.

Resultatene viste at human Hl9 promoterregion dirigerer ekspresjon av en operativt koblet heterolog raportergen i mange forskjellige blærecanceravledede cellelinjer. I noen blærecanceravledede cellelinjer, kan Hl9 enhansere ytterligere øke ekspresjon av et reportergen under kontroll av Hl9.

7. Eksempel: Et toksingen under kontroll av H19 regulatoriske sekvenser

7.1 Materialer og metoder

Ekspresjonskonstruksjoner beskrevet over i seksjon 6 er modifisert for å uttrykke en sekvens som koder for et toksisk produkt eller et promedikament isteden for CAT. F.eks., blir sekvensen som koder for CAT genproduktet fjernet og erstattet med en sekvens som koder for herpes simplex virus tymidinkinase (HSV-TK) ved å bruke standard kloningsmetoder som er velkjent innen fagfeltet. H19/promedikamentekspresjonsplasmidene er transfektert inn i blærecanceravledede cellelinjer som beskrevet over. Når den blir transfektert inn i blærecancercellelinjer, induserer en H19/HSV-TK ekspresjonsplasmid blærecancercellespesifikk cytotoksisitet ved tilstedeværelse av ganciklovir.

8. Eksempel: Ekspresjon av H19 i en musemodeU av kjemiskindusert blærekarsinom

8.1 Materialer og metoder

Syttifem ukers gamle hunn C3H/He mus (Charles River) ble holdt med 6 mus i hvert bur og fikk lov til å akklimatisere seg i air-conditionert rom med en 12 timers lys/12 timers mørk syklus. Ved 8 ukers alder, var eksperimentet begynt og musene ble delt uvilkårlig inn i en kontrollgrupper (10 mus) og en eksperimentell gruppe (60 mus). Den eksperimentelle gruppen av mus ble gitt 0,5% N-butyl-N-(4-hydroksynutyl)nitrosamin (BBM) (Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd., Tokyo, Japan) løst i drikkevann ad libitum. Kontrollmusene ble gitt vanlig vann. Dyrene fra begge gruppene ble drept ved 4, 8,12, 16, 20 og 26 uker etter starten på eksperimentet. Blærene ble tatt ut, fiksert og støpt inn i parafinblokker ved å bruke standard prosedyre.

8.1.1 Fremstilling av probe

En 2,1 kb fragment som inneholdt mus H19 kodene region ble subklonet inn i pBluescript II KS plasmid (Stratagene, La Jolla, CA) bak T7 og T3 RNA polymerasebindingsseter. [<35>S]-merket antisens H19 RNA ble produsert in vitro fra Hindlll-linearisert plasmid DNA ved å bruke T7 polymerase (Boehringer Mannheim) og et Amersham RPN 2006 kit. In vitro dannede transkripter har en spesifikk aktivitet på IO<7>cpm/ug. Sens H19 mRNA fremstilt med T3 polymerase (Boehringer Mannheim) og EcoRI linearisert templat ble brukt som en kontroll.

8.1.2 In situ hybridisering

Parafinbokssnitt (5 uM) av formalinfiksert vev ble montert på 3-aminopropyltrietoksylan (Tespa, Sigma) overtrukne mikroskopiobjektglass og tørket over natt ved 37°C. Snittene ble vokset av med xylen, fiksert med 4% paraformaldehyd, og deretter behandlet med proteinase K (Sigma). Objektglassene ble acetylert for å redusere ikke spesifikk binding av proben og dehydrert gjennom etanolserier.

[<35>S]-merkede RNA prober (spesifikk aktivitet på 50.000 cpu/ul) ble hybridisert som beskrevet av Rangini et al., 1991, Mech. Dev. 35:13-24, som utelater tio-AMP trinn. Slidsene ble eksponert for film i 10 dager og motfarget med hematoksylin og eosin. Slidsene ble undersøkt og fotografert ved å bruke et Polyvar (Reichert Jung) mikroskop under lys og rnørkfeltsiluminering. Kontrollene inkludert hybridisering med sens RNA probe og RN Ase prehybridiseringsbehandling. I tillegg, tjente snitt fra blærer fra voksne friske mus (som ikke uttrykker Hl9) og embryonale museblærer (som uttrykker Hl9) som negative og positive kontroller respektivt.

8.2 Resultater og diskusjon

Ved 26 uker hadde alle overlevende mus i den eksperimentelle gruppen utviklet

palpable blæretumorer. Utstrakt ekspresjon av H19 ble observert i de kjemiske induserte blæretumorene. I motsetning til ingen ekspresjon av H19 ble detektert i normale voksne blærer. Følgelig, kan denne musemodell for kjemisk indusert blærecancer bli brukt som en dyremodell for å vise tumorspesifikk cytotoksisitet in vivo av konstruksjoner som inneholder Hl9 regulatoriske regioner operativt koblet til et toksingen.

9. Eksempel: Genterapi ved å bruke H19 regulatoriske sekvenser for å uttrykke et heterologt gen i en musemodell for blærekarsinom

H19/toksin eller promedikamentekspresjonsplasmider blir inkorporert inn i liposomer (som beskrevet av Takashita et al., 1993, J. Clin. Invest. 93:652-651, inkorporert heri ved referanse) for avlevering til museblære in vivo. Musene som ble brukt til dette eksprerimentet har kjemisk induserte blæretumorer som beskrevet over.

I korthet, ble 50 ug av plasmid DNA løst i 500 (il av Optimen's serumfritt medium (BRL Life Technoogies, Geithersburg, MD) tilsatt til 250 ul av lipofektamin 250 ul vann.

Blandingen blir inkubert i 30 minutter ved romtemperatur, deretter fortynnet i 10 ml balansert saltløsning (BSS(-): 140 mM NaCl, 5,4 mM KC1,10 mM Tris-HCl, pH 7,6). Etter pelletering av løsningen ved sentrifugering ved 15.000 rpm i 30 minutter, blir liposomene resuspendert i 1 ml BSS(-) som inneholder 1 mM CaCb. Omtrent 0,2 ml av de konsentrerte liposomene blir administrert til mus som har kjemisk induserte blæretumorer via kateter. En kontrollgruppe av mus med blæretumorer som mottar liposomer med uten DNA eller med en konstruksjon som inneholder en relevant gen under kontroll av Hl9 regulatoriske sekvenser. Ved definerte tidspunkter, blir mus fra hver gruppe avlivet og blæren skåret ut, fiksert og støpt inn i parafinblokker ved å bruke standard prosedyre. Alternative snitt blir fremstilt for in situ hybridisering ved å bruke enten Hl9 probe, som beskrevet over, eller en probe til den kodene sekvensen for pseudomonas toksingen. I tillegg, blir størrelsen, antallet og nekrose av tumorer sammenlignet mellom kontrollen og eksperimentelle grupper. Ekspresjon av Pseudomonas toksin blir funnet å samlelokalisere med ekspresjon av H19 ved blæretumorer fra gruppe med eksperimentelle mus. I tillegg, blir blæretumorene i den eksperimentelle gruppen av mus redusert i størrelse og nekrotisk sammenlignet med blæretumorer i kontrollgruppen av mus.

10. Eksempel: Ekspresjon fra IGF- 2 P3 og P4 promotere i tumor cellelinjer

10.1 Materialer og metoder

I dette eksperimentet, ble forskjellige ekspresjonskonstruksjoner som inneholder lusiferaserapportgenet plassert under kontroll av en av de fire forskjellige IFG-2 promoterene ble konstruert og overført til flere forskjellige blærecancercellelinjer. Følgende human IGF-2 promoter/lusiferasekonstruksjoner ble fremstilt:

IGF-2 promotersekvensen er beskrevet i Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9, inkorporert heri ved referanse. Lusiferaserapportvektoren er kommersielt tilgjengelig fra Promega. Madison, WI (katalog #E1641).

10.2 Resultater og diskusjon

De resulterende ekspresjonsplasmidene ble transfektert inn i de humane blærecancercellelinjene HT-1376, EJ28, T24P, 1197 og UM-UC-3 som beskrevet over. Lusiferase-aktiviteten ble analysert ved bruke et kommersielt kit (Promega, Madison, WI, katalog #E1500). Resultatene, vist i figur 4A-4E, viser at IGF-2 P4 promoter dirigerer ekspresjonen av lusiferaserapportgenet i hver blærecancercellelinje som ble testet. I cellelinje 1197, dirigerte også IGF-2 P3 promoteren ekspresjon av lusiferaserapportgenet. I etterfølgende eksperimenter, ble IGF-2 P3 og P4 promoterene vist å dirigere ekspresjon av lusiferasegenekspresjonen i andre tumorcellelinjer, inklusiv koriokarsinomceller og rabdomyosarkomceller.

11. Eksempel: H19 promoter og IGF- 2 promoterfunksjon med H19 enhanser for å lette ekspresjon av et heterologt gen

11.1 Materialer og metoder

Fire lusiveraserapportvektorer, pGL3-basis, pGL3-promoter, pGL3-enhanser og pGL3-kontroll ble ervervet fra Promega. Disse vektorene ble transfektert i dyrkede cellelinjer ved å bruke et antall av forskjellige transfeksjonsreagenser, inklusiv lipofetamin (Gibco/BRL), fugene (Boehringer), Perfeckt Transfection Kit av 8 forskjellige lipidreagenser (Invitrogen), TFX-10, TFX-20, transfast (Promega) og kalsiumfosfat-metoden (Gorman et al, 1982, Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051).

Hl9 promoteren ble klonet inn i EcoRV setet til pBluescript II SK (pbh 19p #1) beskrevet i avsnittet 6,1, supra. H19 promoteren ble kuttet ut med kutting med Smal og Hindlll, og det resulterende 0,9 kb fragmentet ble satt inn i Sma I-Hind III setene til pGL3-basisvektor for å produsere Luc-pbh 19 konstruksjon.

Hl9 promoterregionen fra nt -819 til +14 ble amplifisert ved PCR fra pbhl9p #1 plasmid, ved å bruke primerene 5'-ATATGGTACCGACAACCCTCACCAAAG-3'

(oppstrøm, SEQ ID NO:8) og 5'-ATATAAGCTTCTTCTCCCTCACCCTGCTC-3'

(nedstrøm, SEQ ID NO:9). Det resulterende PCR produktet ble kuttet med Kpnl og Hind III og ligert inn i kpnl-Hind III setene til pGL3-basisvektor, som gav Luc-PBH19 konstruksjonen. Denne PCR dannede Hl9 promoter ble sekvensert i begge retninger ved automatisk fargeterminator cyklussekvenseringsmaskin (ABT Prism 377 DNA

sequencer, Perkin Eimer). Figur 5 viser nukleotidsekvensen til H19 promoteren (SEQ ID NO: 2) dannet ved PCR. 5 kb Hl9 nedstrømsenhanser beskrevet supra, ble kuttet med DamH for å gi to fragmenter på 4,1 kb og 0,9 kb i 3' ende. Luc-PBH19-0,9EH19 og Luc-PBP19-4EH19 konstruksjoner ble konstruert ved å sette inn 0,9 kg og 4,1 kb BamH I fragmenter fra Hl9 enhanseren i BamH I sete til Luc-PBH19 plasmidet respektivt. Enhansersekvensene ble posisjonert nedstrøms for H19 promoter/lusiferaserapportgenet.

BamH I enhanserfragmentet på 0,9 kb le ligert inn i BamH I setet på pGL-basisvektor for å produsere Luc-0,9EH19 vektor. H19 promoteren til pbhl9p #1 plasmidet ble kuttet med kpnl-BamH I, og ligert inn i Kpnl-BgHI setet til Luc-0,9EH19 konstruksjonen, som gav Luc-pbhl9-0,9EH19 ekspresjonskonstruksjon som inneholdt promoterklonene som beskrevet supra, og 0,9 kb enhanser nedstrøms for H19/Luc rapportgenet.

Ekspresjonsvektorene ble kalt Hup-1, Hup-2, Hup-3 og Hup-4, som inneholdt lusiferasegenet under kontroll av de humane IGF-2 promoterene Pl, P2, P3 og P4 respektivt, ble konstruert som beskrevet i Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9. En 512 basepars region av P4 ble amplifisert ved PCR fra Hup-4 konstruksjonen ved å bruke primerene 5'-ACAGGTACCTCTAGAGTCGACCT-3' (oppstrøms, SEQ ID NO:10) og 5'-ATATAAGCTTGCTCCCATCCTGCA-3' (nedstrøms, SEQ ID NO: 11). Det resulterende PCR produktet ble kuttet med Kpnl-Hindlll og ligert inn i Kpnl-Hind III setene til rapportgenvektor pGL3-basis for å produsere Luc-P4 rapportgenvektoren.

Ekspresjonsvektorene som inneholdt IGF-2 P4 promoteren og Hl9 enhanseren ble også fremstilt. Et BamHI enhanserfragment på 2 kb avledet fra 4,1 kb fragment tidligere beskrevet ble klonet inn i BamH I setet til Luc-P4 kontraksjon, som produserte Luc-P4-2EH19 ekspresjonsvektoren.

0,9 kb, 2 kb og 4,1 kb H19 enhansere ble sekvensert ved å brake automatisk DNA sekvensering. Nukleotidsekvensene til 0,9 kb enhanseren er vist i figur 6 (SEQ ID NO:3). Nukleotidsekvensen til 2 kb enhanseren er vist i figur7A og 7B (SEQ ID NO:4). Nukleotidsekvensen til 4,1 kb enhanseren er vist i figur 8A-8C (SEQ ID NO: 5).

11.2 Resultater og diskusjon

Når flere transfeksjonsreagenser ble brukt for å introdusere 4 lusiferaseinnholdene vektorer inn i dyrkede cellelinjer, produserte kalsiumfosfatpresipitering den høyeste transfeksjonseffektiviteten for de fleste av cellelinjene som ble testet. Derfor, var kalsiumpresipitering brukt i det etterfølgende for å transfektere forskjellige ekspresjonsvektorer. I tillegg, inhiberte økt konsentrasjon av plasmid DNA ikke transfeksjonseffektiviteten, selv når den ble brukt ved konsentrasjoner over platået.

Blærecancercellelinjer 5637, hepatocellulært karsinom (HCC) cellelinje Huh7 og nyretumorcellelinjer 293T ble hver transfektert med forskjellige konstruksjoner som inneholdt lusiferaserapportgenet under kontroll av H19 eller IGF-2 P4 promoter i kombinasjon med H19 enhanseren.

Celler som ble transfektert med Luc-phl9 og Luc-PH19 som inneholdt rapportgenet og Hl9 promoteren utviste økt genekspresjon over bakgrunnen (figur 9A-9C). Konstruksjonen Luc-PH19 som inneholdt PCR-dannet promoter viser en høyere aktivitet enn Luc-phl9 i hver cellelinje som ble testet. I tillegg til H19 økte 0,9 kb enhanserfragmentet hos Luc-phl9 repportvektor (Luc-phl9-0,9EH19) ytterligere nivået av ekspresjon fra 2 til 4 ganger i cellelinjene 5637 og 293T, respektivt.

IGF-2 P4 promoter økte også ekspresjon av lusiferase i alle cellelinjene over bakgrunn. Tilsetning av 2 kb Hl9 enhanserfragementet til Luc-P4 ekspresjonsvektoren økte P4 promoteraktiviteten. Nivået av injeksjon av lusiferaseaktivitet ved 2 kb enhanserfragmentet varierte fra to ganger i 293T cellelinje til seks ganger i Huh7 cellelinje, mens enhanseren bare marginalt økte promoteraktiviteten i 5673 celler.

Figur 10A-10E viste at ekspresjon av kontraksjonen Luc-phl9-4EH19 som inneholdt både PCR dannet Hl9 promoter og 4,1 kb Hl9 enhanserfragment. Enhanseren økte aktiviteten av promoteren med 3-28 ganger i cellelinjer med unntak av 5637 cellelinjen.

12 DEPONERING AV KLON

Følgende plasmid ble deponert ved American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA under Budapestavtalen når det gjelder "the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure:"

Claims (10)

1. Vektor for uttrykkelse av en sekvens i en tumorcelle og for terapeutisk eller profylaktisk behandling av cancer,karakterisert vedat vektoren omfatter et polynukleotid omfattende en IGF-2 P3-promoter operasjonelt koblet til en heterolog sekvens som koder for et cytotoksisk genprodukt.

2. Vektor ifølge krav 1,karakterisert vedat den heterologe sekvensen (a) er utvalgt fra en gruppe bestående av den kodende sekvens for for X-galaktosidase, difteritoksin, pseudomonatoksin, ricin, koleratoksin, retinoblastmagen, p53, herpes simplex tymidinkinase, varicellazostertymidinkinase, cytosindeaminase, nitroreduktase, cytokrom p-450 2B1, tymidinfosforylase, purinnukleosidfosforylase, alkalisk fosfatase, karboksypeptidaser A og G2, linamarase, X-laktamase og xantinoksidase; (b) er en antisenssekvens som spesifikt hybridiserer til en sekvens som koder for et gen selektert fra gruppen bestående av cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyklinE, cyklinA, cdk4, onkogene former av p53, c-fos, c-jun, Kr-ras og Her2/neu; eller (c) koder for et ribozym som spesifikt kutter et RNA som koder for et gen selektert fra gruppen bestående avcdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyklinE, cyklinA, cdk4, onkogene former av p53, c-fos, c-jun, BCr-ras og Her2/neu.

3. En vektor ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat tumorcellen er en blæretumorcelle.

4. Vektor ifølge krav 3,karakterisert vedat blæretumorcellen er utvalgt fra gruppen bestående av Ht-1376, EJ28, T24P, 1197 og Um-UC-UC-3.

5. Vertscelle inneholdende en vektor ifølge et hvilket som helst av de foregående krav.

6. Anvendelse av en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4 for fremstilling av et medikament for behandling av kreft.

7. Anvendelse ifølge krav 6, der medikamentet er for behandling av et individ som har en tumor eller en cancer utvalgt fra gruppen bestående av blærekarsinom, hepatocellulært karsinom, hepatoblastoma, rabdomyosarkom, ovarikarsinom, servisk karsinom, lungekarsinom, brystkarsinom, squamous cellekarsinom i hode og nakke, spiserørskarsinom, tyroidkarsinom, astrocytoma, ganglioblastom og neuroblastom.

8. Fremgangsmåte for å uttrykke en heterolog sekvens i en tumorcelle in vitro,karakterisert vedat den omfatter introduksjon i tumorcellen av en vektor ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4.

9. Anvendelse ifølge krav 6, der medikamentet er for behandling av cancer og det cytotoksiske genprodukt er utvalgt fra gruppen bestående av difteritoksin, Pseudomonas toksin, ricin, koleratoksin, retinoblastomgen og p53.

10. Anvendelse ifølge krav 6, der medikamentet er for behandling av cancer og det cytotoksiske genprodukt er et cytostatisk genprodukt.