CZ20001201A3 - Způsob exprese heterologní sekvence v nádorové buňce - Google Patents

Description

1. Oblast techniky

Vynález se týká oblasti nádorové buněčné biologie a léčby rakoviny. Konkrétně se vynález týká specifické exprese heterologních genů v nádorových buňkách, zejména genů kódujících cytotoxické produkty.

io 2. Dosavadní stav techniky

2.1 Gen H19

Gen H19 je jedním z mála genů, o nichž se ví, že jsou u člověka imprintovány (Hurst et al., 1996, Nátuře Genetics 12:234-237). Na samém začátku embryogeneze je H19 exprimován z obou chromosomálních alel (DeGroot et al., 1994, Trophoblast 8:285-302). Krátce poté však dochází k umlčení otcovské alely a transkribuje se pouze alela zděděná od matky.

H19 je vysoce exprimován během embryogeneze a poprvé byl identifikován jako gen, který je v játrech koordinovaně regulován společně s alfa-fetoproteinem účinkem řrans-působícího lokusu raf (Pachnis et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:5523-5527). H19 byl vedle toho nezávisle nakloňován řadou laboratoří, které se zabývaly izolací genů exprimovaných během diferenciace tkání. Například Davis et al. (1987, Cell 51:987-1000) identifikovali myší homolog H19 při vyhledávání genů aktivních v časných fázích diferenciace buněk C3H10T1/2. Pourier et al. (1991, Development 113:1105-1114) zjistili, že myší H19 se exprimuje při diferenciaci • · · • · · · ·· ·· kmenových buněk a v době implantace. Transkripce lidského H19 genu byla rovněž pozorována v diferencujících se cytotrofoblastech z lidské placenty (Rachmilewitz et al., 1992, Molec. Reprod. Dev. 32:196-202).

Zatímco v průběhu fetálního života dochází k transkripci H19

RNA v řadě různých embryonálních tkání, po narození je exprese H19 zastavena. Avšak ve svalu a játrech dospělých myší (Brunkow a Tilghman, 1991, Genes & Dev. 5:1092-1101) byla zjištěna určitá relativně nízká hladina transkripce H19. Postnatálně je H19 aktivován io rovněž v nádorových buňkách. Ariel et al. (1997, Molec. Pathol. 50:3444) prokázali expresi H19 v řadě nádorů vzniklých v tkáních, ve kterých je H19 exprimován prenatálně. Dále tito autoři zjistili H19 RNA v nádorech odvozených z neurálních tkání, zejména v astrocytomech a ganglioneuroblastomech, o nichž není známá asociace s expresí

H19. Vzhledem k velkému množství nádorů exprimujících H19 RNA tito autoři uvažovali o možnosti, že H19 je onkofetální RNA a navrhli výzkum H19 jako nádorového markéru pro lidské neoplazie.

Lidský i myší H19 gen byl nakloňován a sekvenován (Brannan et al., 1990, Molec. Cell. Biol. 10:28-36). Srovnání lidského a myšího

2o genu H19 ukázalo celkovou 77% identitu nukleotidové sekvence. Navzdory této mezidruhové homologii na nukleotidové úrovni, aminokyselinové sekvence odvozené z otevřených čtecích rámců obou genů vykazovaly nízkou identitu (/ď). Dále, ačkoliv H19 RNA je transkribována RNA polymerasou II, dochází u ní k sestřihu a polyadenylaci, zdá se, že není překládána. Namísto toho bylo zjištěno, že H19 RNA asociuje s 28S cytoplasmatickou RNA, což vedlo k úvahám, že H19 RNA by mohla působit jako RNA složka ribonukleoproteinového komplexu (/d.).

Skutečná fyziologická role H19 není zcela jasná. H19 může

3o působit jako dominantně letální gen; vysoká ektopická exprese H19 transgenu u myší je příčinou letality krátce před narozením (Brunkow ···· ·«· · » · · • · · · ···· · · · * • ····· ·· ··· · · · • · ···· · · · · • ·· · · ·· · · · · ··

- 3 et al., supra). Tento časový úsek letality se shoduje s dobou, kdy nastává represe transkripce H19 genu. Na druhé straně však nebyl pozorován žádný defekt u myší nesoucích heterozygotní nebo homozygotní knockout H19 alely (alel) (Leighton et al., 1995, Nátuře

375:34-39). Knockout mateřské alely brání imprintingu geneticky vázaného a opačně imprintovaného IGF-2 genu; výsledné myši jsou při narození větší než jejich sourozenci z vrhu díky zvýšené prenatální expresi IGF-2 (Id.). Jelikož tyto dva opačně imprintované geny sdílejí c/s-působící regulační sekvence, Leighton se spolupracovníky io uvažovali o možnosti, že H19 by mohl hrát rolí v imprintingu IGF-2 genu.

Produktu H19 genu je dále též přisuzována funkce nádorové supresorové RNA. Hao et al. (1993, Nátuře 365:764-767) popsali, že transfekce dvou embryonálních nádorových buněčných linií, RD aG401, DNA konstruktem exprimujícím H19, vedla k retardaci buněčného růstu, k morfologickým změnám a ke snížení tumorigenity v nudě myších. Takováto nádorová supresorová aktivita je v souladu s pozorovanou letalitou ektopické exprese (Hao et al., supra), jakož i se zvětšenou velikostí myší majících knockout mateřské alely H19 (Leighton et al.,supra). Představa, že H19 je nádorový supresor však zůstává kontroverzní. Některé výsledky nebyly údajně reprodukovány a případný jiný nádorový supresorový gen může existovat v těsné vazbě kH19 (Ariel et al., supra). Navrhovaná funkce H19 jako nádorového supresoru je také v rozporu s experimentálními údaji, podle kterých dochází k aktivaci H19 v širokém spektru nádorových buněk (viz například Lustig-Yariv et al., 1997, Oncogene 23:169-177).

2.2 Geny růstového faktoru podobného insulinu (Insulinlike Growth Factor, IGF)

IGF-2 je další imprintovaný gen, jehož exprese závisí na tom, z kterého rodiče pochází. Avšak na rozdíl od H19 je IGF-2 mateřsky imprintován, jak u myší tak u lidí, a proto je exprimován z otcovské alely (Rainier et al., 1993, Nátuře 363:747-749). Lidský IGF-2 gen vykazuje komplikovaný transkripční profil. Existují čtyři IGF-2 promotory, jež jsou tkáňově a vývojově specificky aktivovány. Pouze tři z promotorů, P2, P3 a P4 jsou imprintovány a jsou aktivní během fetálního vývoje a v rakovinných tkáních. Čtvrtý promotor, P1, není imprintován a je aktivován pouze v dospělých játrech a v choroidální pleteni (viz Holthuizen et al., 1993, Mol. Reprod. Dev. 35:391-393). P3 promotor IGF-2 genu snad hraje roli v progresi jaterní cirhózy io a hepatocelulárního karcinomu (Kim a Park, 1998, J. Korean Med. Sci.

13:171-178).

Ztráta imprintingu IGF-2 byla zjištěna v případě Wilmsova nádoru (Ogawa et al., 1993, Nátuře 363:749-751). Toto pozorování vedlo mnoho badatelů k představě, že ztráta imprintingu a bialelická exprese imprintovaných genů může hrát roli v poruchách růstu ave vývoji rakoviny (viz také Rainier et al., 1993, Nátuře 362:747-749; Glassman et al., 1996, Cancer Genet. Cytogenet. 89:69-73).

2.3 Nádorově specifická genová terapie

Regulační oblasti genů asociovaných s nádory se používají k cílené selektivní expresi sebevražedného genu v buňkách odvozených z nádorů. Například v hepatocelulárním karcinomu je indukována exprese alfa-fetoproteinu. Huber et al. (1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:8039-8043) použili regulačních sekvencí genů albuminu nebo alfa-fetoproteinu k cílené expresi thymidin kinasy viru varicella-zoster (VZV TK) v buňkách hepatomu. Hepatomové buňky infikované in vitro retrovirovým vektorem obsahujícím jeden z těchto expresních konstruktů exprimovaly VZV TK a staly se citlivé vůči normálně netoxickému 6-methoxypurin arabinonukleosidu (araM).

Kaneko et al. (1995, Cancer Res. 55:5283-5287) sestrojili adenovirový vektor exprimující HSV TK pod kontrolou regulačních sekvencí alfafetoproteinu. Rekombinantní adenovirové částice obsahující tento vektor byly přímo injikovány do nádorů odvozených z hepatocelulárního karcinomu, vytvořených v bezthymových “nudě“ myších. Následné intraperitoneální injekce gancicloviru způsobily regresi nádorů odvozených z hepatocelulárního karcinomu.

Osaki et al. (1994, Cancer Res. 54:5258-5261) transfekovali plicní karcinomové buňky A54 expresním vektorem, který obsahoval regulační sekvence genu pro antigen plicního embryonálního karcinomu spojené s kódující sekvencí thymidin kinasy viru Herpes simplex (HSV TK). Transfekované buňky byly citlivé vůči gancicloviru. Navíc i růst nádorů v nudě myších vyvolaný podkožní injekcí transfekovaných buněk byl inhibován opakovanými intraperitoneálními injekcemi gancicloviru. Nedávno však bylo zjištěno, že gen karcinoembryonálního antigenu je exprimován v normální střevní sliznici, což omezuje použitelnost těchto regulačních sekvencí jakožto nádorově specifických regulačních oblastí (Osaka et al., supra). Přetrvává tedy potřeba vývoje vektorů pro genovou terapii, které by specificky exprimovaly genové produkty v nádorových buňkách.

3. Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobů a prostředků pro indukci selektivní exprese heterologních genů v nádorových buňkách. Vynález se zejména týká polynukleotidů obsahujících regulační sekvence funkčně spojené s heterologními geny, jimiž se dá docílit nádorově specifická exprese heterologních genů. Konkrétněji, sekvence regulující transkripci je odvozena z genomově imprintovaného genu, který je specificky exprimován v rakovinných buňkách, jako např. gen H19 nebo P3 a P4 promotory genu IGF-2, a heterologní gen kóduje cytotoxický protein nebo cytostatický genový produkt. V jiném provedení vynálezu je k heterolognímu genu funkčně připojený IGF-1 promotor tak, aby docházelo k nádorově specifické expresi genu.

• ····· ·· ··· · · · • · ···· ···· ····· ·· ·· · · · ·

- 6 Regulační sekvence budou řídit expresi v řadě různých rakovinných buněčných typů. Takovéto způsoby a prostředky jsou použitelné při léčbě mnoha různých typů rakoviny a hyperproliferačních stavů.

Jedním aspektem vynálezu jsou expresní vektory obsahující polynukleotidy zahrnující takovéto regulační oblasti, které jsou funkčně spojené s heterologními geny. Mezi obzvláště vhodné regulační oblasti patří regulační oblasti genu H19, tj. promotorové a enhancerové sekvence, IGF-2 promotory P3 a P4, a promotor IGF-1. H19 enhancer a jeho aktivní části mohou být použity v jakékoli kombinaci s H19 promotorem, IGF-1 promotorem, IGF-2 P3 promotorem nebo IGF-2 P4 promotorem. Vynález také zahrnuje hostitelské buňky obsahující takovéto vektory. V tomto ohledu může být expresní konstrukt obsahující heterologní gen pod kontrolou H19 promotoru aH19 enhanceru, nebo bez H19 enhanceru, zaveden do buňky společně s dalším konstruktem, který obsahuje heterologní gen pod kontrolou IGF-1 promotoru nebo IGF-2 P3 nebo P4 promotoru v kombinaci s H19 enhancerem. V jiném aspektu poskytuje vynález způsoby využití takovýchto vektorů k expresi heterologních genů v nádorových buňkách. Ještě jiným aspektem vynálezu je léčba rakoviny genovou terapii s využitím vektorů podle vynálezu.

4. Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1A-1C. Nukleotidová sekvence promotorové oblasti lidského H19. Obrázek ukazuje promotorovou oblast od nukleotidové pozice -837 do -7 (relativně k začátku transkripce) (SEQ ID NO:1)

Obrázek 2. Schéma vektorů použitých k expresi heterologního genu pod kontrolou regulačních sekvencí H19.

Obrázek 3A-3E. Regulační sekvence H19 řídí expresi heterologního genu (CAT) v liniích rakovinných buněk močového • · • ··· měchýře. Specifická aktivita CAT (cpm/pg proteinu) je vynesena pro pět různých uvedených buněčných linií jako funkce vektoru použitého k transfekci. Obrázek 3A: HT-1376 buňky. Obrázek 3B: EJ28 buňky. Obrázek 3C: T24P buňky. Obrázek 3D: 1197 buňky. Obrázek 3E: UM5 UC-3 buňky. Následující vektory jsou podrobněji popsány níže v části 6: (1) pCAT-basic; (2) pCAT-control; (3) pH19E; (4) pH19EH19D; a (5) pH19EH19R.

Obrázek 4A-4E. Promotory P3 a P4 IGF-2 řídí expresi heterologního genu (luciferasy) v liniích rakovinných buněk močového io měchýře. Specifická aktivita luciferasy (jednotky/pg proteinu) je vynesena pro pět různých uvedených buněčných linií jako funkce IGF2 promotoru použitého v transfekovaném konstruktu k aktivaci exprese luciferasy. Obrázek 4A: T24P buňky. Obrázek 4B: 1376 buňky. Obrázek 4C: UM-UC3 buňky. Obrázek 4D: 1197 buňky.

Obrázek 4E: EJ28 buňky. Vektory jsou popsány podrobněji níže v části 10.

Obrázek 5. Nukleotidová sekvence promotorového fragmentu lidského H19 (SEQ ID NO:2).

Obrázek 6. Nukleotidová sekvence 0,9 kb enhancerového 20 fragmentu H19 (SEQ ID NO:3).

Obrázek 7A a 7B. Nukleotidová sekvence 2 kb enhancerového fragmentu H19 (SEQ ID NO:4).

Obrázek 8A-8C. Nukleotidová sekvence 4 kb enhancerového fragmentu H19 (SEQ ID NO:5).

Obrázek 9A-9C. Exprese luciferasy v nádorových buňkách po transfekci s vektory obsahujícími různé kombinace H19 regulační oblasti a P4 promotoru. Obrázek 9A: 5637 buňky. Obrázek 9B: Huh7 buňky. Obrázek 9C: 293T buňky.

Obrázek 10A-10E. Exprese luciferasy v nádorových buňkách po transfekci s vektory obsahujícími H19 regulační oblasti. Obrázek • *·· • · · · · ···· «· «· · · ·· ··

10A: 293T buňky. Obrázek 10B: T24P buňky. Obrázek 10C: Huh7 buňky. Obrázek 10D: 5637 buňky. Obrázek 10E: RT112 buňky.

5. Podrobný popis vynálezu

Vynález částečně vychází z objevu, že k cílené expresi žádoucích kódujících sekvencí v rakovinných buňkách lze využít regulačních oblastí z genomově imprintovaných genů, jež jsou exprimovány v rakovinných buňkách. Konkrétně bylo zjištěno, že exprese H19 je aktivována v širokém spektru karcinomů, jež zahrnují, io ale bez omezení, karcinom močového měchýře, hepatocelulární karcinom, hepatoblastom, rabdomyosarkom, ovariální karcinom, cervikální karcinom, karcinom plic, karcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk na hlavě a krku, karcinom jícnu, karcinom štítné žlázy, astrocytom, ganglioblastom a neuroblastom. Dále bylo zjištěno, že v nádorových buňkách jsou specificky aktivovány rekombinantní DNA konstrukty, jež obsahují oblasti H19 promotoru funkčně spojené s heterologním genem, nebo promotor P3 nebo P4 genu IGF-2 funkčně spojený s heterologním genem, nebo konstrukty obsahující takovýto promotor v kombinaci se spodním (downstream) H19 enhancerem. V jiném aspektu vynálezu se k řízení exprese heterologního genu využívá IGF-1 promotor.

V jednom ze svých aspektů tedy vynález poskytuje způsoby a prostředky pro změnu fenotypu rakovinných buněk nebo pro jejich selektivní zabití. Tohoto cíle je dosaženo tím, že do buněk se vpraví polynukleotid zahrnující regulační oblasti z genomově imprintovaných genů, jež jsou exprimovány v rakovinných buňkách, funkčně spojené s heterologním genem. Heterologní gen může kódovat například cytostatikum nebo cytotoxické agens (např. toxin, antisense RNA nebo ribozym).

• AA AAAA AAAA

AAAA AAA ««AA

AAA A A AAA A A A 4

A AAAAA AA AAA AA A

A A AAAA AAAA

AAAAA A A · · AA AA

Regulační oblasti genomově imprintovaných genů, jež jsou exprimovány v rakovinných buňkách zahrnují, ale bez omezení, H19 promotor a enhancer, a IGF-2 promotor P3 a P4.

Pro účely vynálezu zde popsaného, výraz “funkčně spojený“ 5 znamená, že nukleotidová sekvence je připojená k regulační sekvenci způsobem umožňujícím, aby exprese nukleotidové sekvence byla řízená regulační sekvencí.

“Heterologní“ genová sekvence se týká, v bezprostředním smyslu, genové sekvence, jež normálně není funkčně spojená io s regulačními sekvencemi genu H19. Obecně, heterologní genové sekvence zahrnují sekvence, jež kódují cytostatické nebo cytotoxické genové produkty.

Výraz “exprese“, jak se zde užívá, se týká transkripce určité DNA, a dále sestřihu, opracování, stability a případně translace odpovídajícího mRNA transkriptu. V závislosti na struktuře vnesené molekuly DNA může být exprese přechodná nebo kontinuální.

5.1. Regulační sekvence genu H19, promotorů P3 a P4 genu IGF-2 a promotoru IGF-1

Níže jsou popsány regulační sekvence H19, jež mohou být použity k specifické aktivaci exprese heterologní kódující sekvence v nádorové buňce. Tyto H19 regulační sekvence zahrnují H19 promotorovou oblast nad genem (upstream) a/nebo spodní (downstream) H19 enhancerovou oblast. Nukleotidová sekvence jedné

H19 promotorové oblasti je ukázána v obrázku 1A-1C (SEQ ID NO:1).

Tato 830 bp dlouhá nukleotidová sekvence sahá od nukleotidové pozice -837 k pozici -7, počítáno od místa čepičky (jak popsali Brannan at al., supra). Konsenzní TATA sekvence se nachází mezi nukleotidy -27 a -35. Dvě konsenzní AP2 vazebná místa (shoda 8/9) se nacházejí přibližně -500 a -40 nukleotidů nad místem iniciace

- 10 • ·· 99 99

9 9 9 9 9

9 · · ΦΦΦΦ • 9 Φ · 9 · · · • · · · ·

9 9 9 9 9 9 9 transkripce. Jak je podrobněji diskutováno níže, předřazení přibližně 830 bp regulační oblasti před kódující sekvenci heterologního genu postačuje k expresi funkčně připojeného heterologního genu v rakovinných buňkách, jež také exprimují endogenní H19. Kromě toho i další oblast promotoru H19, nacházející se mezi nukleotidy -819 až +14 (Obrázek 5, SEQ ID NO:2), postačuje k expresi funkčně připojeného heterologního genu v rakovinných buňkách.

Do konstruktu s H19 promotorem a heterologním genem může být případně přidána spodní enhancerová oblast lidského H19 genu, io aby se dosáhlo vyšší hladiny nádorově specifické exprese. Jak je zevrubněji popsáno níže a ilustrováno příkladem v části 6. tato spodní enhancerová oblast je obsažena v Sací restrikčním fragmentu sahajícím od +6kb k +11 kb vzhledem k počátku transkripce. Jak se očekává od enhancerové sekvence i tento spodní enhancer působí bez ohledu na orientaci, tzn. může být umístěn v opačné nebo stejné orientaci (vzhledem k orientaci H19 enhanceru v endogenním H19 genu) za kódující oblast heterologního genu pod kontrolou H19 promotoru. Fragmenty tohoto enhanceru, obsahující sekvence ukázané na Obr. 6, 7A, 7B a 8A-8C (SEQ ID NO:3-5), rovněž mohou napomáhat genové expresi.

Exprese IFG-1 genu je spojována s rakovinou plic a s rakovinou prsu. IGF-1 promotor se nachází mezi nukleotidy 1 - 1630 v sekvenci lidského genu IGF-1 (přírůstkové číslo databáze Genbank M12659 M77496 a je zde zahrnut odkazem; Rotwein et al., 1986, J. Biol.

Chem. 261:4828-4832).

Při expresi IGF-2 genu se využívá jednoho ze čtyř různých promotorů. Tři z těchto promotorů jsou imprintovány a jsou exprimovány v embryonálních tkáních; promotor P1 je však aktivován pouze v dospělých tkáních (Sussenbach et al., 1992, Growth Reg.

2:1-9). P3 promotor hraje roli v hepatokarcinomu. Rovněž bylo zjištěno, že imprintovaný promotor P4 (nukleotidová sekvence -546 až • ·♦ ♦· 11 11 11 1111 111 1111 11 1 1 1111 1 11 1 1 11111 11 191 11 1

1 1111 1111 111 19 11 11 11 11 + 102 genu IGF-2) a promotor P3 (nukleotidová sekvence -1229 až +140 genu IGF-2) jsou aktivovány v lidských rakovinných buňkách močového měchýře a mohou být využity k směrování exprese funkčně spojeného heterologního genu do nádorových buněk. Promotory P3 a P4 genu IGF-2 mohou být použity v kombinaci s H19 enhancerem nebo s jeho aktivními fragmenty.

Tyto regulační sekvence z genomově imprintovaných i neimprintovaných genů, jež jsou exprimovány v rakovinných buňkách, mohou být dále analyzovány, aby se stanovily minimální regulační io sekvence nutné k dosažení žádoucí nádorově specifické exprese. Promotorové oblast může být například pozměněna adicemi, substitucemi nebo delecemi a testována na funkčnost v nádorově specifické expresi. Různé části spodního H19 enhanceru mohou být jednotlivě analyzovány co do schopnosti zvyšovat transkripci zH19 promotoru.

Změny v regulačních sekvencích lze provést pomocí řady chemických a enzymatických metod, které jsou dobře známy v oboru. Například úseky sekvencí vymezené restrikčními místy mohou být deletovány. Místně cílenou mutagenezou lze definovaným způsobem měnit sekvenci a/nebo vnášet do specifických úseků sekvence restrikční místa. Deleční mutanty mohou být generovány i s použitím DNA nukleas jako jsou Bal31 nebo Exolll a S1 nukleasa. Progresivně větších delecí v regulačních sekvencích se dosahuje inkubací DNA s nukleasami po delší dobu (pro přehled technik používaných k mutageneze, viz Ausubel et al., 1989, Current Protocols for Molecular Biology).

Pozměněné sekvence se vyhodnocují podle schopnosti aktivovat nádorově specifickou expresi heterologních kódujících sekvencí ve vhodných hostitelských buňkách, zejména v buňkách, které jsou odvozené z karcinomů exprimujících H-19 (např. buňky karcinomu močového měchýře, jako jeden příklad). Jakékoli

94

- 12 4*4 49 99

9 9 4 4 4 4

4 9 4 9 444

4 4 4 4 4

444 49 44 »4 pozměněné regulační sekvence, jež mají zachovanou schopnost řídit nádorově specifickou expresi budou zahrnuty do rekombinantních expresních vektorů pro další využití, a spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Pod kontrolou těchto regulačních sekvencí mohou být exprimovány mnohé různé heterologní geny, jako například geny kódující toxické genové produkty, potenciálně toxické genové produkty a genové produkty s antiproliferační nebo cytostatickou aktivitou. Mohou se exprimovat i markerové geny, včetně enzymů (např. CAT, io beta-galaktosidasa, luciferasa), fluorescenčních proteinů, jako je zelený fluorescenční protein, nebo antigenních markérů.

Cytotoxické genové produkty zahrnují, v širší definici, jak toxiny tak činitele indukující apoptosu. Pro účely vynálezu se kromě toho mezi cytotoxické genové produkty zahrnují enzymy metabolismu, které konvertují prekursor na cytotoxický produkt. Příklady cytotoxických genových produktů, které mohou být podle vynálezu použity, zahrnují záškrtový toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, PE40 a nádorové supresorové geny jako jsou gen retinoblastomu a p53. Vedle toho mohou být použity sekvence kódující apoptické peptidy,

2o které indukují buněčnou apoptosu. Takovéto apoptické peptidy zahrnují A β peptid u Alzheimerovy choroby (viz LaFerla et al., 1995, Nat. Genet. 9:21-30), atriální natriuretický peptid (viz Wu et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:14860-14866), peptid podobný calcitoninu (viz Sakuta et al., 1996, J. Neuroimmunol. 67:103-109), jakož i další známé nebo dosud neobjevené apoptické peptidy.

Mezi metabolické enzymy, které konvertují prekursory na cytotoxický produkt, patří thymidinkinasa (z viru herpes simplex nebo varicella zoster), cytosindeaminasa, nitroreduktasa, cytochrom P-450 2B1, thymidinfosforylasa, purinnukleosidfosforylasa, alkalická fosfatasa, karboxypeptidasa A a G2, linamarasa, laktamasa • ··· φ ·φφ φφ φ· φφφ φφ φ φ · φφφφ φφφφ φφφφφ φφ φφ φ· φφ

- 13 a xanthinoxidasa (viz Rigg a Sikora, August 1997, Mol. Med. Today, str.359-366).

Expresními konstrukty zde popsanými lze do rakovinných buněk vnášet i antisense, antigenní nebo aptamerní oligonukleotidy. V rakovinné buňce mohou být dále exprimovány ribozymy nebo jednořetězcové RNA s cílem inhibovat expresi konkrétních genů. Cílové geny pro zásah těmito antisense nebo ribozymovými molekulami jsou geny, jejichž produkty jsou nezbytné pro přežití buňky nebo pro udržení rakovinového fenotypu. Takovéto cílové geny zahrnují, ale bez omezení, cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDI, cyklinE, cyklinA a cdk4.

Do buněk se například zavádějí vektory, které pod kontrolou regulačních sekvencí imprintovaných genů nebo pod kontrolou promotoru IGF-1, aktivních v rakovinných buňkách, exprimují antisense RNA molekuly nebo ribozymy specifické vůči transkriptům onkogenních forem p53, c-fos, c-jun, K-ras a/nebo Her2/neu,_i aby se zastavila exprese endogenních genů. Nádorové buňky, v nichž je exprimován H19 a které tedy mohou aktivovat H19 regulační sekvence (nebo které specificky aktivují promotory IGF-1, IGF-2 P3 nebo P4) mohou být specifickými terči pro expresi antisense RNA nebo ribozymové RNA.

Přístupy využívající antisense techniku zahrnují návrh oligonukleotidů (v tomto případě mRNA) komplementárních k cílové mRNA. Antisense oligonukleotidy se budou vázat ke komplementárním cílovým mRNA transkriptům a bránit jejich translaci. Absolutní komplementarita, byť výhodná, není nutná. Výraz sekvence “komplementární“ k části RNA, jak se zde užívá, znamená sekvenci komplementární natolik, že je schopná hybridzovat k RNA a tvořit s ní stabilní duplex. Schopnost hybridizovat bude záviset jak na stupni komplementarity tak na délce antisense nukleové kyseliny. Obecně, čím delší je hybridizující nukleová kyselina, tím více nepárujících baží φφ φφ ·· ·· • φφφ · * φ φ φ φ φφφφ φ φφ φ φφφ φφ φφφ φφ φ φ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ Φ·

- 14 • φφ vůči RNA může obsahovat a přesto s ní může vytvářet stabilní duplex (nebo triplex, podle okolností). Osoba zběhlá v oboru může určit tolerovatelný stupeň nekomplementarity pomocí standardních postupů na stanovení teploty tání hybridizovaného komplexu.

V inhibici translace by měly být nejúčinnější oligonukleotidy, jež jsou komplementární k 5' konci cílové mRNA, např. k 5' nepřekládané sekvenci až po (a včetně) iniciační AUG kodon. V nedávné době se však prokázalo, že i sekvence komplementární k 3' nepřekládaným sekvencím molekul mRNA účinně inhibují translaci. Viz, obecně, io Wagner, 1994, Nátuře 372:333-335. Oligonukleotidy komplementární k 5'- nebo 3'- nepřekládaným nekódujícím oblastem transkriptů cílových genů mohou tedy být použity v tomto “antisense“ přístupu k inhibici translace endogenních genů. Oligonukleotidy komplementární k 5' nepřekládané oblasti mRNA by měly zahrnovat komplement iniciačního kodonu AUG. Antisense oligonukleotidy komplementární ke kódujícím oblastem mRNA jsou méně účinnými inhibitory translace, mohly by ale v souladu s vynálezem být použity. Antisense nukleové kyseliny, ať již mají hybridizovat k 5', 3' nebo kódující oblasti cílové mRNA, by měly mít délku alespoň šest nukleotidů, s výhodou od 6 do asi 50 nukleotidů. Ve specifických aspektech je délka oligonukleotidu alespoň 10 nukleotidů, alespoň 17 nukleotidů, alespoň 25 nukleotidů nebo alespoň 50 nukleotidů.

Bez ohledu na volbu cílové sekvence je výhodné provést nejprve in vitro pokusy, aby se kvantitativně vyjádřila schopnost antisense oligonukleotidu inhibovat genovou expresi. V těchto studiích by měly být i kontroly na rozlišení inhibice genu antisense oligonukleotidem od nespecifických biologických účinků oligonukleotidů. Je rovněž výhodné, aby se v těchto studiích porovnaly hladiny cílové RNA nebo proteinu s hladinami RNA nebo proteinu vnitřní kontroly.

Translaci cílové mRNA lze také bránit použitím molekul ribozymu navrženého tak, aby katalyticky štěpil příslušný cílový gen.

- 15 »· ·· ·· ·· • ··« ··«· • · · ··· · · · · ··* ·· 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 • ·♦ (Viz např. PCT International Publication WO90/11364, publikovanou

4.října 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). Je-li ribozym specifický pro genový transkript kódující protein, který je nezbytný pro růst rakovinné buňky, může takový ribozym vyvolat ztrátu fenotypu rakovinné buňky. K cílenému zničení molekul mRNA mohou být použity ribozymy, které štěpí tyto mRNA ve specifických rozpoznávacích místech, avšak výhodnější je použití “hammerhead“ ribozymů. Hammerhead ribozymy štěpí molekuly mRNA v místech diktovaných ohraničujícími oblastmi, jež tvoří komplementární páry io baží s cílovou mRNA. Jediným požadavkem je, aby mRNA měla následující sekvenci dvou baží: 5'-UG-3'. Konstrukce a produkce hammerhead ribozymů je dobře známá v oboru a je podrobněji popsána v práci Haseloff a Gerlach, 1988, Nátuře 334:585-591. Ribozym se s výhodou konstruuje tak, aby rozpoznávané štěpící místo leželo blízko 5'konce cílové mRNA; tedy tak, aby se zvýšila účinnost a minimalizovala akumulace nefunkčních mRNA transkriptů.

Ribozymy pro použití podle vynálezu také zahrnují RNA endoribonukleasy (dále v textu “ribozymy Čechova typu“), jejichž prototyp se vyskytuje přirozeně vTetrahymena thermophila (známé jako IVS nebo L-19 IVS RNA), a které podrobně popsal Thomas Cech se spolupracovníky (Zaug et al., 1984, Science 224:574-578; Zaug a Cech, 1986, Science 231:470-475; Zaug et al., 1986, Nátuře 324:429-433; publikovaná Mezinárodní Patentová Přihláška WO

88/04300 University Patents lne.; Been a Cech, 1986, Cell 47:20725 216). Ribozymy Čechova typu mají aktivní místo o osmi párech baží, které hybridizuje k sekvenci cílové RNA, načež nastává štěpení cílové RNA. Vynález předpokládá použití těch ribozymů Čechova typu, jejichž 8 bp sekvence aktivního místa hybridizuje k sekvencím přítomným v cílových genech.

5.2 Aktivace genů v nádorových buňkách

- 16 • φφ *· ·* ·* φφ

Φφ · · · φ · φ φ * φ ·· φ φ φφφφ φ φφ φ φ φφφ φφ · φ φφφ φφ φ φ φ φφφφ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φφ φφ

Buňky, ve kterých dochází k reaktivaci exprese imprintovaného genu budou též schopné specificky aktivovat expresi heterologního genu z vektoru obsahujícího regulační oblasti takovéhoto imprintovaného genu funkčně spojené s heterologním genem.

Takovéto buňky, zejména nádorové buňky jsou vhodným terčem pro postupy genové terapie podle vynálezu. Exprese specifická pro H19 a IGF-2 P3 a P4 může být stanovena v nádorech i v buněčných liniích technikami analýzy RNA, in šitu hybridizace a s použitím konstruktů obsahujících reportérové geny. Podobně mohou být zjištěny nádorové buňky, v nichž je aktivována exprese IGF-1 genu, a při genové terapii využít IGF-1 promotor k aktivaci exprese heterologního genu.

Ve většině aplikací RNA analýzy se používá značená sonda, specficky hybridizující s transkriptem sledovaného genu, kterou lze připravit kteroukoli z technik dobře známých v oboru. Značená sonda může obsahovat alespoň 15-30 baží komplementárních k H19 nukleotidové sekvenci, výhodněji obsahuje alespoň 50 až 150 baží komplementárních k H19 transkriptu. Obzvláště výhodnou hybridizační sondou pro H19 expresi je polynukleotid komplementární ke 3' konci H19 mRNA v úseku přibližně 800 nukleotidů nad polyadenylačním místem až po póly A místo.

Ve specifickém provedení vynálezu, jež je níže ilustrováno příkladem, se značená antisense RNA sonda připravila in vitro s použitím T7 nebo T3 expresního plasmidu. H19 sondy se dají též značit s použitím náhodných primerů a značeného nukleotidu, například se soupravou Prime-lt (Stratag.ene, La Jolla, CA; katalog, č. 300392). Jinak lze připravit značenou sondu i pomocí PCR reakce s použitím cDNA klonu obsahujícím kódující oblast H19 a primerů navržených tak, aby se amplifikovala část kódující oblasti. Další možností je standardní reakce posunu jednořetězcového zlomu (“nick translation“).

• ··

- 17 »· ·· ·» ·* • ··· · * t · • * · · · · · « · · • · ♦ ·· 9 9 9 9 9 · • · · · 9 9 9 9 9

99 99 99

Vhodný způsob označení polynukleotidových sond zahrnuje nukleotidy obsahující radioaktivní izotopy (jako jsou ³⁵S a ³²P), fluorescentní, luminiscentní a barevné značky, a enzymové molekuly.

Značená sonda se in šitu hybridizuje k buňce nebo k vzorku 5 tkáně s použitím standardních technik, jak je popsáno níže příkladem a ve spolupodané US patentové přihlášce poř.č. 08/704,786, která je zde zahrnuta odkazem. Je-li k dispozici dostatečné množství příslušných buněk, lze stanovení hladiny exprese mRNA sledovaného genu provést standardní RNA analýzou (jako je např. northernová io analýza, chránění před RNAsou, nebo extense primeru).

Takovéto analýzy genové exprese je možné provádět též “in sítu“, tzn. přímo v tkáňových řezech (fixovaných a/nebo zmražených) připravených ze vzorků tkání pacientů, odebraných při biopsiich nebo resekcích, takže není nutná purifikace nukleových kyselin. K těmto in šitu postupům se mohou použít sondy a/nebo primery popsané výše. (Viz např. Nuovo,G.J., 1992, “PCR In Šitu Hybridization: Protocols And Applications“, Raven Press, NY).

Jinou možností jak určit, zda v buněčném typu nebo nádoru bude možná specifická aktivace expresních konstruktů obsahujících konkrétní regulační oblasti funkčně spojené s heterologním genem, je přímá transfekce takovýchto expresních konstruktů do buňky. Pro tyto účely je výhodné, aby heterologní gen byl markerový gen. Pozitivní výsledek testu na produkt markerového genu znamená, že buňka nebo buněčná linie jsou schopné aktivovat expresi z použitých regulačních oblastí.

Příklady typů nádorů s aktivovanou expresí H19, zjištěné pomocí shora uvedených technik, jsou:

A. Pevné nádory u dětí

1. Wilmsův nádor

Hepatoblastom

- 18 • ·· ·· ·· ·· ·· ···« ··· · · · · • ca · · »·· ··«· • ····· « a ··· · a · • ««aa aaa· aaa aa aa a· aa aa

3. Embryonální rabdomyosarkom

B. Nádory zárodečných buněk a trofoblastu

1. Nádory zárodečných buněk testes

2. Nezralý teratom vaječníku

3. Sakrokokcygeální nádor

4. Choriokarcinom

5. Nádory trofoblastu přivráceného k placentě

C. Epiteliální nádory u dospělých

1. Karcinom močového měchýře

2. Hepatocelulární karcinom

3. Karcinom vaječníku

4. Cervikální karcinom

5. Karcinom plic

6. Karcinom prsu

7. Karcinom dlaždicových buněk na hlavě a krku

8. Karcinom jícnu

9. Karcinom štítné žlázy

D. Neurogenní nádory

1. Astrocytom

2. Ganglioblastom

3. Neuroblastom

Shora uvedené rakoviny jsou tedy léčitelné způsobem podle vynálezu. Vlastně jakýkoliv nádor, který aktivuje expresi H19 je možné léčit způsobem podle vynálezu.

Aplikací shora uvedených technik lze určit i nádory, které aktivují IGF-1 a promotory P3 a P4 genu IGF-2. Takovéto nádory jsou rovněž • ·· ·♦ ·· ·· ·· ··«· · · * β··· • · · · · ··♦ · · · · φ ··· · · ·· · · · ·· · • · · · · · ····

- 19 - *·· ^<β ·· ** ** *· léčitelné způsoby podle vynálezu. Například IGF-2 je aktivován v nádorech dětského věku, jako jsou Wilmsův nádor, rabdomyosarkomy, neuroblastomy a hepatoblastomy.

5.3 Způsoby jak vnášet do hostitelských buněk polynukleotidy, jež jsou pod kontrolou regulačních sekvencí

Vynález se rovněž vztahuje na hostitelské buňky transfekované polynukleotidy, jež obsahují regulační oblasti funkčně spojené io s heterologním genem. Takovéto hostitelské buňky se mohou udržovat v kultuře nebo mohou být součástí zvířete, s výhodou savce. Uvedené polynukleotidy se typicky ligují do kteréhokoli z široké škály vektorů, které se pak následně vnášejí do buněk s použitím zde presentovaných postupů a materiálů. Takovéto vektory mohou být konstruovány s použitím dobře zavedených technik molekulární biologie (viz obecně, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, sv. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; a Current Protocols in Molecular Biology, 1989, John Wiley & Sons, všechny svazky tohoto manuálu a jejich pravidelné doplňky jsou zde zahrnuty odkazem). V případech, kdy je požadována i translace, bude heterologní gen konstruován tak, aby obsahoval i vhodný 3' polyadenylační signál.

5.3.1 Kultivované buňky

Hostitelské buňky transfekované polynukleotidy obsahujícími regulační oblasti imprintovaného genu funkčně spojené s heterologním genem mohou být jakékoli prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Ligace polynukleotidu do genového konstruktu, jako je vektor, a transformace nebo transfekce do hostitelských buněk, buď eukaryotických (kvasinky, buňky ptačí, hmyzí nebo savčí) nebo • · • · · · • · • · prokaryotických (bakteriální buňky), jsou standardní postupy široce používané v mikrobiálních technologiích nebo v kultivaci tkáňových kultur.

Vektory vhodné pro kultivaci předmětných polynukleotidů v bakteriálních buňkách, jako jsou E. coli, zahrnují plasmidy následujících typů: plasmidy odvozené od pBR322, plasmidy odvozené od pEMBL, plasmidy odvozené od pEX, plasmidy odvozené od pBTac, a plasmidy odvozené od pUC. V kvasinkách S. cerevisiae se jako užitečné klonovací a expresní vektory pro vnášení genetických konstruktů uplatňují plasmidy YEP24, YIP5, YEP51, pYES2 aYRP17 (viz například Broach et al., 1993 v Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye, Academie Press, str. 83). Tyto vektory se mohou replikovat jak v E. coli, díky přítomnosti replikačního počátku ori z pBR322, tak i v kvasinkách, díky přítomnosti počátku replikace z kvasinkového 2μΐτι plasmidu. Kromě toho mohou být použity markéry resistence k antibiotikům, jako např. k ampicilinu.

Podobně i výhodné savčí vektory pro nukleotidy podle vynálezu obsahují prokaryotické sekvence, které umožňují namnožení vektoru v bakteriích. Takovéto vektory pro transfekci do savčích buněk se mohou konstruovat tak, aby se integrovaly do savčího chromosomu a získaly tak dlouhodobou stabilitu; pro tento účel mají připojený selektovatelný markerový gen. Pro transientní expresi je možné použít deriváty virů, jako jsou např. bovinní papillomavirus (BPV-1) nebo virus Epsteina-Barrové. Různé metody používané při přípravě plasmidů a jejich transformaci do hostitelských organismů jsou dobře známy v oboru. Další vhodné vektorové systémy, jakož i obecné postupy rekombinantní technologie uvádí Sambrook et al., supra.

5.3.2 Genová terapie • · · • ·

Vynález rovněž zahrnuje využití polynukleotidů, obsahujících regulační oblast genu funkčně spojenou s heterologním genem, v genové terapii rakoviny a hyperproliferačních onemocnění. Pro účely genové terapie se mohou expresní konstrukty podle vynálezu podávat v jakémkoli biologicky účinném nosiči, např. jakémkoli přípravku nebo prostředku schopném účinně dopravit rekombinantní gen do buněk in vivo. Přístupy zahrnují inserci předmětného genu do virových vektorů, včetně rekombinantních retrovirů, adenoviru, adenoasociovaného viru a viru herpes simplex-1, nebo do rekombinantních bakteriálních nebo eukaryotických plasmidů. Virové vektory transfekují buňky přímo; plasmidová DNA může být vpravena do buněk např. pomocí kationických polymerů, kationických liposomů (např. lipofectinu, derivátů cholesterolu jako D.D.A.B. a kationických fosofolipidů) nebo derivatizovaných (např. s protilátkou konjugovaných) konjugátů polylysinu, gramicidinu S, umělých virových obálek nebo jiných takovýchto nitrobuněčných nosičů, jakož i přímou injikací holého genového konstruktu, elektroporací nebo CaPO₄ koprecipitací. Současný přehled pojednávající o přenosu genů a expresních systémech při genové terapii rakoviny podává Cooper,

1996, Seminars in Oncology 23:172-187.

Transduce vhodných cílových buněk je prvním důležitým krokem při genové terapii; je zřejmé, že volba konkrétního gen-vnášejícího systému bude záviset na faktorech jako jsou fenotyp uvažovaného cíle a způsob aplikace, např. místní nebo systémové. Je rovněž jasné, že konkrétní genové konstrukty poskytované pro in vivo transdukci expresních konstruktů jsou použitelné i pro in vitro transdukci buněk, jako např. pro použití v ex vivo tkáňových kulturách popsaných shora.

Výhodný způsob jak zavést do buňky in vivo nukleovou kyselinu je použít virový vektor obsahující nukleovou kyselinu, např. konkrétní cytotoxický gen pod kontrolou H19 regulačních sekvencí. Infekce buněk virovým vektorem je výhodná tím, že nukleová kyselina se

- 22 dostane do velké části použitých buněk. Další výhodou je, že molekuly, např. cDNA kódované virovým vektorem, jsou v těchto buňkách, do nichž se dostane virový vektor, účinně exprimovány. Vhodné vektory, jež mohou být vnášeny do buněk s použitím zde uvedených způsobů a prostředků zahrnují, ale bez omezení, vektory na bázi viru herpes simplex, adenoviru, adeno-asociovaného viru, retrovirů, viru pseudorabies, alfa-herpes viru, a podobně. Podrobný přehled virových vektorů, zejména virových vektorů vhodných k modifikaci nereplikujících se buněk, jakož i způsoby užití těchto vektorů v souvislosti s expresí požadovaných polynukleotidů, lze nalézt v knize “Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications“, ed. Caplitt and Loewy, Academie Press, San Diego (1995).

Bylo prokázáno, že infekční spektrum virů a tedy i vektorů odvozených z virů lze omezit, modifikují-li se obalové proteiny na povrchu virové částice (viz např. publikace PCT WO93/25234 a W094/06920). Strategie používané k modifikaci infekčního spektra retrovirových vektorů například zahrnují: připojení protilátek specifických vůči antigenům buněčného povrchu k virovému env

2o proteinu (Roux et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:9079-9083; Julan et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:3251-3255; a Goud et al., 1983, Virology 163:251-254); nebo připojení ligandu buněčného povrchového receptoru k virovým env proteinům (Nedá et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:14143-14146). Připojení může být formou chemického kovalentního přisíťování proteinu nebo jiné molekuly (např. laktosy, čímž se env protein převede na asialoglykoprotein), jakož i vytvořením fúzovaných proteinů (např. fúzované proteiny typu jednořetězcová protilátka/env). Touto technikou mohou být například nasměrovány rekombinantní viry na nádorové buňky tak, že k povrchu rekombinantního viru se připojí protilátky namířené proti nádorovým povrchovým proteinům nebo proti molekulám asociovaným s nádorem. Tato technika je použitelná nejen k omezení tropismu virových částic φ φ

ΦΦΦΦ na určité buněčné typy, ale i ke konverzi ektotropního vektoru na vektor amfotropní.

Výhodný virový gen-vnášející systém, užitečný v předkládaném vynálezu, využívá vektory odvozené z adenoviru. Genom adenoviru se dá modifikovat takovým způsobem, že kóduje a exprimuje požadovaný genový produkt, ale jeho schopnost replikace v normálním lytickém životním cyklu je inaktivována. Viz například Berkner et al., 1988, BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431434; a Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155. Vhodné adenovirové io vektory odvozené z adenoviru kmene AD typu 5 d1324 nebo jiných adenovirových kmenů (např. Ad2, Ad3, Ad7 atd) jsou dobře známy osobám zběhlým v oboru. Výhoda rekombinantních adenovirů může za jistých okolností spočívat v tom, že jsou použitelné k infekci širokého spektra buněčných typů, včetně epitelu dýchacích cest (Rosenfeld et al., 1992, supra), endoteliálních buněk (Lemarchand et al., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:6482-6486), hepatocytů (Herz a Gerard, 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:2812-2816) a svalových buněk (Quantin et al., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:2581-2584). Dále, virové částice jsou relativně stálé, lze je purifikovat a koncentrovat a mohou být modifikovány za účelem ovlivnění spektra infektivity. Kromě toho, vnesená adenovirová DNA (a cizí DNA v ní obsažená) se neintegruje do genomu hostitelské buňky, nýbrž zůstává episomální, čímž se lze vyhnout potenciálním problémům, jež mohou nastat v důsledku inserční mutageneze v případech, kdy se vnesená DNA integruje do hostitelského genomu (např. retrovirová DNA). Dále, “volná“ kapacita adenovirového genomu pro cizí DNA je v porovnání s jinými vektory pro vnášení genů velká (až 8 kb) (Berkner et al., supra, Haj-Ahmand a Graham, 1986, J. Virol. 57:267). Většina replikačně-defektních adenovirových vektorů v současnosti používaných, a proto předkládaným vynálezem upřednostňovaných, mají zcela nebo zčásti deletovány virové geny E1 a E3, ponechávají si však až 80% adenovirového genetického materiálu (viz např. Jones et

- 24 al., 1979, Cell 16:683; Berkner et al., supra^-, a Graham et al., v Methods in Molecular Biology, E. J. Murray, Ed. (Humana, Clifton NJ, 1991) sv. 7, str. 109-127).

Jiný virový vektorový systém použitelný k vnášení předmětných expresních konstruktů je adeno-asociovaný virus (AAV). Adenoasociovaný virus je přirozeně se vyskytující defektní virus, který pro účinnou replikaci a produktivní životní cyklus vyžaduje jiný, pomocný virus, jako např. adenovirus nebo herpes virus. (Pro přehled viz Muzyczka et al., 1992, Curr. Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97io 129). Je též jedním z mála virů, jež mohou integrovat svoji DNA do nedělících se buněk, a který vykazuje vysokou frekvenci stálé integrace (viz například Flotte et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-354; Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828; a McLaughlin et al., 1989, J. Virol. 63:1963-1973). Vektory obsahující pouhých 300 bp AAV sekvence jsou schopné zabalení a mohou se integrovat. Místo pro exogenní DNA je omezeno na zhruba 4,5 kb. K zavedení DNA do buněk může být použit AAV vektor, který popisují Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260. Pomocí AAV vektorů byly do buněk různých typů zavedeny mnohé různé nukleové kyseliny (viz například Hermonat et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 4:20722081; Wondisford et al., 1988, Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al., 1984, J. Virol. 51:611-619; a Flotte et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:3781-3790).

Vedle metod přenosu DNA pomocí virů, například uvedených shora, se pro řízenou expresi žádaného heterologního genu ve tkáni zvířete používají i nevirové metody. Většina nevirových metod přenosu genů využívá normálních mechanismů používaných savčími buňkami pro vychytávání a intracelulámí transport makromolekul. Ve výhodných provedeních vynálezu se uplatňují nevirové systémy vnášení genů, které k vychytání a pohlcení předmětných expresních konstruktů • · • · · · • · • ·

- 25 terčovou buňkou využívají endocytosu. Příklady takovýchto genvnášejících systémů zahrnují systémy odvozené z liposomů, polylysinové konjugáty a umělé virové obaly.

Při klinickém použití mohou být terapeutické expresní konstrukty vnášeny do pacienta jakýmkoli z mnoha způsobů, jež jsou dobře známy v oboru. Například, farmaceutický prostředek obsahující gen-vnášející systém může být zaváděn systémově, např. nitrožilní injekcí, přičemž k specifické expresi konstruktu v cílových buňkách dochází převážně na základě specifity transfekce dané buněčnou nebo tkáňově specifickou expresí, vyplývající z regulačních sekvencí předřazených heterolognímu genu, nebo z kombinace regulačních sekvencí s gen-vnášejícím systémem namířeným na konkrétní typy buněk. V jiných provedeních je počáteční vnesení rekombinantního expresního konstruktu do zvířete omezenější, neboť je místně lokalizováno. Gen-vnášející systém může být například zaveden prostřednictvím katétru (viz US Patent 5,328,470) nebo stereotaktické injekce (např. Chen et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:30543057). Expresní konstrukt podle vynálezu může být pro genovou terapii vnesen též pomocí elektroporace s použitím technik popsaných například v Dev et al., 1994, Cancer Treat. Rev. 20: 105-115.

Farmaceutický preparát konstruktu pro genovou terapii může v podstatě sestávat z gen-vnášejícího systému v přijatelném ředícím roztoku, nebo může obsahovat gen-vnášející systém zakotvený v matrici, odkud se pomalu uvolňuje. V případech, kdy rekombinantní buňky mohou produkovat kompletní gen-vnášející systém, např. retrovirové vektory, může farmaceutický prostředek zahrnovat jednu nebo více buněk, jež produkují gen-vnášející systém.

5.3.3 Terapeutické použití a dávkování • · • · • · · ·

- 26 • · 9 • · ··

Je zřejmé, že z hlediska lékaře nebo pacienta je žádoucí každé zabránění nebo zmírnění nepříznivých symptomů doprovázejících nádorové onemocnění (např. bolesti, citlivost, úbytek váhy a podobně). Dále je žádoucí jakékoli snížení nádorové masy nebo rychlosti růstu nádoru, jakož i zlepšení histopatologického obrazu nádoru. Pro účely této přihlášky se budou tedy zde používané výrazy “léčba“, “terapeutické využití“, nebo “lékařské využití“ týkat jakýchkoli a všech využití nárokovaných prostředků, jež jakýmkoli způsobem napravují stav nemoci nebo symptomy, nebo jinak zamezují, brání, io brzdí nebo obracejí postup choroby nebo jiných nežádoucích symptomů.

Účinné dávkování a postup při léčbě může být stanoven obvyklým způsobem, přičemž se začíná s nízkou dávkou u laboratorních zvířat, postupně se dávky zvyšují a sledují se účinky a současně se systematicky pozměňuje dávkovači schéma. Studie na zvířatech, s výhodou na savcích, se běžně používají ke stanovení nejvyšší tolerované dávky bioaktivního agens na kilogram hmotnosti. Osoby znalé oboru extrapolují dávky pro další druhy, včetně člověka tak, aby byly účinné a přitom netoxické.

2o Před zahájením zkoušek účinnosti na lidech se provádí klinické studie Fáze I na normálních jedincích k určení bezpečných dávek. Při určování optimální dávky pro daného jedince musí klinici vzít do úvahy četné faktory. Hlavní roli hrají toxicita a biologický poločas konkrétního heterologního genového produktu. Další faktory zahrnují hmotnost pacienta, jeho stáří, celkový stav, konkrétní nádorové onemocnění a jeho vážnost, přítomnost jiných použitých léků, in vivo aktivita genového produktu a podobně. Zkušební dávkování se zvolí na základě výsledků studií na zvířatech a údajů v klinické literatuře.

3o Například, typická lidská dávka adenovirového vektoru, který obsahuje regulační oblast H19 funkčně spojenou s heterologním ·· ·« • · • · · · • · • * · • · · · · • · ·· ·· ·· ·· ► · · 4 ► · · <

- 27 genem kódujícím cytotoxický produkt jako je např. thymidinkinasa, je od 1 x 10⁷ pfu do 1 x 1O¹⁰ pfu injikovaných denně, přímo do nádorové masy. Výhodnější denní dávka takovéhoto adenovirového vektoru injikovaného přímo do nádoru je mezi 1 x 10⁸ pfu a 1 x 1O¹⁰ pfu, v závislosti na velikosti nádoru. Samozřejmě, u adenovirového vektoru obsahujícího H19 regulační oblast funkčně spojenou s heterologním genem pro cytotoxický produkt s jinou mírou toxicity, budou tyto hodnoty příslušně upraveny. Podobné dávky se mohou použít jako doporučený výchozí bod v případě adenovirového vektoru io obsahujícího IGF-2 promotor P4 funkčně spojený s heterologním genem, kódujícím cytotoxický produkt jako je např. thymidinkinasa.

Různé biochemické složky podle vynálezu mají mít s výhodou, zejména pro in vivo použití, vysokou čistotu a být v podstatě prosty potenciálně škodlivých kontaminujících látek a vyhovovat jakostním normám např. alespoň jakosti NF (National Food grade, tj. národní potravinové normě), obecně alespoň analytické jakosti, a s výhodou alespoň farmaceutické jakosti). Pokud musí být daná sloučenina před použitím nejdříve syntetizována, měl by výsledkem takovéto syntézy nebo následné purifikace s výhodou být produkt, jenž je v podstatě prost jakýchkoli potenciálně toxických látek, jež mohly být použity v průběhu syntetických nebo purifikačních postupů.

Pro použití k léčbě pacienta s rakovinou poskytuje vynález v jednom ze svých aspektů rovněž soupravu nebo balíček ve formě sterilně plněné lahvičky nebo ampule, jež obsahuje polynukleotidový vektor, který obsahuje H19 regulační oblast funkčně spojenou s heterologním genem kódujícím cytotoxický produkt, nebo buňku, jež uvolňuje takovýto vektor. V jednom provedení souprava obsahuje polynukleotidový vektor, který obsahuje H19 regulační oblast funkčně spojenou s heterologním genem kódujícím cytotoxický produkt, a to jako přípravek připravený k aplikaci, s jednou nebo více dávkami, přičemž součástí balení je návod k použití při léčbě rakoviny.

« ·

Alternativně, a podle jiného provedení vynálezu, balíček poskytuje sterilně plněnou lahvičku nebo ampuli obsahující buňku nebo buněčnou linii uvolňující takovýto vektor. Vektor-uvolňující buňky nebo buněčná linie by měly být skladovány a převáženy ve zmraženém stavu. Souprava může také obsahovat médium a reagencie potřebné ke kultivaci vektor-uvolňujících buněk nebo buněčné linie.

Po popisu vynálezu následují příklady, jež slouží k ilustraci a nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

6. Příklad: Regulační sekvence H19 napomáhají expresi heterologního genu v nádorových buněčných liniích

Tato část popisuje konstrukci různých expresních vektorů obsahujících CAT reportérový gen umístěný pod kontrolou H19 regulačních sekvencí, a jejich přenos do několika různých linií rakovinných buněk močového měchýře.

6.1 Materiály a metody

6.1.1 Buněčné linie a transfekce

Linie rakovinných buněk močového měchýře HT-1376, EJ28, T24P, 1197 a UM-UC-3 byly získány z americké sbírky buněčných linií ATCC a byly udržovány podle doporučení ATCC.

Transientní transfekce byly prováděny postupem používajícím kalcium fosfátový precipitát. Precipitáty (obsahující 7 μg plasmidu) byly přidávány v 1 ml média k 0,3 x 10⁶ buněk v 30 mm miskách. Po 16 hodinách bylo transfekční médium odstraněno a vyměněno za čerstvé médium. Buňky byly sklízeny 24-96 hodin po transfekci a CAT aktivita byla stanovena postupem používajícím extrakci butyryl-CoA do organické fáze (Sambrook et al., 1989). Alikvot horní organické fáze

- 29 *· 44 ► »4 I *4 · ·

4 4 • · · · · • ·

494 «<

(100 μΙ) byl přenesen do scintilační lahvičky obsahující 3 ml scintilační kapaliny a byla změřena radioaktivita vzorku.

6.1.2 Konstrukce expresních vektorů

Plasmidy pCAT-basic (obsahující CAT reportérový gen, jemuž předchází mnohočetné klonovací místo), pCAT-promoter (obsahující CAT reportérový gen pod kontrolou SV40 promotoru), pCAT-enhancer (obsahující SV40 enhancer pod CAT reportérovým genem a mnohočetné klonovací místo pro inserci promotoru nad CAT reportérovým genem) a pCAT-control (obsahující CAT reportérový gen pod kontrolou promotoru i enhanceru z SV40) jsou komerční produkty firmy Promega (Madison, Wl).

Pro konstrukci plasmidu pH19E, obsahujícího CAT reportérový gen pod kontrolou H19 promotoru, byla nejprve promotorové oblast H19 (SEQ ID NO:1) klonována do plasmidu pBluescript II SK⁺ (Promega). Polynukleotid obsahující H19 promotorovou sekvenci byl amplifikován z DNA lidské placenty s použitím následujícího páru primerů,

ESPCR21: CGGTTCCCCACTTCCCCAGTTT (SEQ ID NO:6) a ESPCR22: CGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT (SEQ ID NO:7).

Konce PCR produktu byly zatupeny pomocí Klenowova enzymu a klonovány do EcoRV místa plasmidu pBluescriptllSK+. Správnost DNA insertu byla potvrzena přítomností štěpících míst pro restrikční enzymy Pvull, EcoRI aApal. Promotor byl orientován opačně vůči kódující oblasti lacZ vektoru. Promotorová oblast pak byla vyštěpena enzymy Hindlll a Pstl a výsledný 0,9 kb fragment byl klonován mezi Hindlll-Pstl místa plasmidu pCAT-basic, za vzniku pH19E.

Expresní plasmidy, které obsahují H19 enhancerovou oblast v obou orientacích pod segmentem H19 promotor/CAT reportérový ♦ «

1111 gen, byly konstruovány následujícím způsobem: 5 kb Sací fragment obsahující H19 “spodní“ enhancer (vymezený oblastí +6kb až +11 kb vzhledem k začátku transkripce genu H19) byl klonován do Sací místa plasmidu pUC19. Tento enhancer pak byl vyštěpen jako fragment

EcoRI-HindlII a ligován mezi EcoRI-Hind111 místa plasmidu pBluescript II SK⁺ za vzniku pBhH19En-Sa. Plasmid pBhH19En-Sa byl parciálně štěpen enzymem BamHI a 5 kb fragment obsahující H19 enhancer (a interní BamHI místo) byl klonován do BamHI místa plasmidu pH19E pod segment H19 promotor/CAT reportérový gen. Takto byly získány io plasmidy obsahující H19 enhancer v obou orientacích, přímé (pH19EH19D, direct) a opačné (pH19EH19R, reversní).

6.2 Výsledky a diskuse

Pět různých linií rakovinných buněk močového měchýře, HT1376, EJ28, T24P, 1197 a UM-UC-3 bylo transfekováno plasmidem pCAT-basic (v Obr. 2 označeným P-E), plasmidem pCAT-control (v Obr. 2 označeným pSV40ESV40), plasmidem pH19E, plasmidem pH19EH19D a plasmidem pH19EH19R. Výsledky exprese pro každý konstrukt jsou uvedeny v Obr. 3A-3E. V každé buněčné linii byla pozorována nejvyšší hladina CAT aktivity s plasmidem pCAT-control, který obsahuje jak SV40 enhancer, tak SV40 promotor. Tento konstrukt sloužil jako pozitivní kontrola, neboť regulační sekvence SV40 představují osvědčené prvky pro indukci genové exprese.

Avšak SV40 regulační sekvence nejsou ve své schopnosti indukovat genovou expresi specifické pro nádorové buňky. Buněčné linie transfekované plasmidem pH19E, který obsahuje CAT reportérový gen pod kontrolou H19 promotoru, rovněž vykazovaly expresi CAT významně zvýšenou nad pozadí. Hladina CAT aktivity indukované

H19 promotorem se pohybovala od pětinásobku v HT-1376 buněčné linii do desetinásobku v buněčné linii UM-UC-3. Přítomnost H19

Φ 9 enhanceru v konstruktech obsahujících H19 promotor/CAT reportérový gen dále zvýšila hladinu exprese v některých buněčných liniích. Například v liniích EJ28, T24P a 1197 enhancer H19 významně zvyšuje expresi konstruktu H19 promotor/CAT reprotérový gen. Orientace enhanceru však dala v různých buněčných liniích odlišné výsledky. V buněčných liniích HT-1736 a UM-UC-3 pak enhancer měl na expresi malý nebo žádný účinek.

Výsledky ukázaly, že lidský H19 promotor aktivuje expresi funkčně spojeného heterologního reportérového genu v širokém spektru buněčných linií odvozených z karcinomu močového měchýře. V některých z těchto linií může expresi reportérového genu pod kontrolou H19 promotoru ještě dále zvýšit H19 enhancer.

7. Příklad: Gen toxinu pod kontrolou H19 regulačních sekvencí

7.1 Materiály a metody

Expresní konstrukty popsané shora v části 6 se modifikovaly tak, aby místo CAT exprimovaly toxický produkt nebo prekursor toxického produktu. Použitím standardních klonovacích postupů, jež jsou dobře známy v oboru, se například odstranily sekvence kódující produkt genu CAT a nahradily se sekvencí kódující thymidinkinasu viru herpes simplex (HSV-TK).

Expresní plasmidy H19/HSV-TK se transfekují do buněčných linií odvozených z karcinomu močového měchýře jak bylo popsáno v části 6. Po transfekci do linií rakovinných buněk močového měchýře, expresní plasmid H19/HSV-TK indukuje v přítomnosti gancicloviru cytotoxicitu specifickou pro rakovinné buňky močového měchýře.

8. Příklad: Exprese H19 v myším modelu chemicky indukovaného karcinomu močového měchýře * · ·

- 32 ·♦ ·· ·· »· ♦ ♦ · Φ » 9 » * · * · · f ig · • · ·· · · · · φ «

8.1 Materiály a metody

Sedmdesát samic myší kmene C3H/He (Charles River), 5 týdnů starých, bylo umístěno po 6 v klecích a ponecháno, aby se adaptovaly na klimatizovanou místnost s 12 hodinovým cyklem světlo/tma. Pokus byl zahájen v 8 týdnech věku, kdy byly myši náhodně rozděleny do kontrolní (10 myší) a experimentální (60 myší) skupiny. Experimentální skupina dostávala k pití ad libitum vodu obsahující 0,05% N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamin (BBM) (Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd., Tokyo, Japonsko). Myši kontrolní skupiny dostávaly vodovodní vodu. Zvířata z obou skupin byla po 4, 8, 12, 16, 20 a 26 týdnech od začátku experimentu usmrcena a jejich močové měchýře byly standardním postupem vyříznuty, fixovány a zality do parafinu.

8.1.1 Příprava sondy

2.1 kb fragment obsahující kódující oblast myšího H19 byl subklonován do plasmidu pBluescript II KS (Stratagene, La Jolla, CA) za vazebná místa pro T7 a T3 RNA polymerasu. Po štěpení plasmidu enzymem HindiII, byla z linearizované plasmidové DNA in vitro připravena s použitím T7 RNA polymerasy (Boehringer Mannheim) a Amersham RPN 2006 soupravy [³⁵S]-značená antisense H19 RNA. Takto připravený transkript měl specifickou aktivitu 10⁷ cpm/gg. Jako kontrolní sonda byla z EcoRI-linearizovaného templátu a s použitím T3 RNA polymerasy (Boehringer Mannheim) připravena sense H19 RNA.

8.1.2 In šitu hybridizace

Parafinové řezy (5gm) tkání fixovaných formalinem byly přichyceny na mikroskopická podložní skla potažená 3-aminopropyltriethoxylanem (Tespa, Sigma) a vysušeny přes noc při 37°C. Řezy byly zbaveny parafinu xylenem, fixovány 4% paraformaldehydem a poté enzymaticky opracovány proteinasou K

9 9

- 33 ·· ** 99 * * · * 9 9 99 * 9 · * · ·

9· 99

9 9 · • · • · (Sigma). Skla byla acetylována, aby se snížila nespecfická vazba sondy, a nakonec dehydratována promytím vzestupnou ethanolovou řadou.

[³⁵S]-značené RNA sondy (o aktivitě 50 000 cpm/μΙ) byly hybridizovány jak popisuje Rangini et al., 1991, Mech. Dev. 35:13-24, s vynecháním thio-AMP kroku. Skla byla přiložena k filmu na 10 dnů a poté vybarvena hematoxylinem a eosinem. Skla byla prohlížena a fotografována pod mikroskopem Polyvar (Reichert Jung) ve světlém a tmavém poli. Kontroly zahrnovaly hybridizaci se sense RNA sondou a předhybridizační působení RNAsou. Vedle toho sloužily jako negativní kontroly řezy močových měchýřů z dospělých zdravých myší (které neexprimují H19) a jako pozitivní kontroly řezy z myších embryonálních močových měchýřů (které exprimují H19).

8.2 Výsledky a diskuse

Do 26 týdnů se u všech přežívajících myší experimentální skupiny vytvořily pohmatem zjistitelné nádory močového měchýře. V těchto chemicky indukovaných nádorech močového měchýře byla pozorována vysoká exprese H19. Naproti tomu žádná exprese H19 nebyla detegována v normálních dospělých močových měchýřích. Uvedený myší model chemicky indukované rakoviny močového měchýře tedy může být použit jako zvířecí model k průkazu nádorově specifické in vivo cytotoxicity genových konstruktů obsahujících regulační oblasti H19 funkčně spojené s genem toxinu.

9.

Příklad:

Genová terapie využívající H19 regulačních sekvencí k expresi heterologního genu v myším modelu karcinomu močového měchýře

Plasmidy exprimující H19/toxin nebo H19/prekursor toxinu se pro in vivo vnesení do myšího močového měchýře zabudují do • · A

- 34 » A ♦ · ♦ A A • AAAA

A A * A A

A A A A • AA AA AA ·* ·· AA ♦ · A A • · · · » · · • · · ·

A« AA liposomů jak popisují Takashita et al., 1993, J. Clin. Invest. 93:652651 (zahrnuto zde odkazem). Myši pro tento experiment mají chemicky indukované nádory močového měchýře jak popsáno shora v části 8.

Ve stručnosti, 50 μ9 plasmidové DNA rozpuštěné v 500 μΙ

Optimenova bezsérového média (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) se přidalo k 250 μΙ Lipofectaminu a 250 μΙ vody.

Směs se inkubovala 30 min při pokojové teplotě a pak se zředila v 10 ml vyváženého roztoku solí (BSS(-): 140 mM NaCI, 5,4 mM KCI, 10 io mM Tris-HCI, pH 7,6). Roztok se centrifugoval (30 min, 15 000 ot/min) a peleta obsahující liposomy resuspendovala v 1 ml BSS(-) obsahujícím 1 mM CaCÍ2. Myším s chemicky indukovanými nádory močového měchýře se pomocí katetru podalo přibližně 0,2 ml koncentrovaných liposomů. Kontrolní skupina myší s nádory močového měchýře obdržela liposomy bez DNA nebo s konstruktem, který pod kontrolou H19 regulačních sekvencí nesl irelevantní gen.

V definovaných časových bodech byly myši z každé skupiny obětovány a močové měchýře vyříznuty, fixovány a zality do parafinu standardními postupy. Střídajícící se řezy byly zpracovány pro in šitu hybridizaci, při které byla použita buď H19 sonda, popsaná shora, nebo sonda specifická pro kódující sekvenci genu toxinu z Pseudomonas. Kontrolní a experimentální skupiny byly kromě toho porovnány z hlediska velikosti, počtu a nekrosy nádorů. V nádorech močového měchýře myší z experimentální skupiny byla prokázána kolokalizace exprese toxinu Pseudomonas a H19. Kromě toho byly nádory močového měchýře myší experimentální skupiny menší a nekrotické ve srovnání s nádory myší kontrolní skupiny.

10. Příklad: Exprese v nádorových buněčných liniích řízená promotory P3 a P4 genu IGF-2

- 35 ·· ·* φ φ φ • 9 ··♦ • · Φ Φ • Φ Φ Φ ·· · · • φ ©· * φ Φ Φ

9 9 ·

Φ · Φ 9

9 9 ·

9 ΦΦ

10.1 Materiály a metody

V tomto pokuse byly sestrojeny různé expresní konstrukty obsahující luciferasový reportérový gen umístěný pod kontrolou jednoho ze čtyř různých promotorů genu IGF-2 a ty byly vneseny do 5 několika různých linií rakovinných buněk močového měchýře.

Sestrojeny byly následující konstrukty obsahující lidský ÍGF-2 promotor a gen luciferasy:

Plasmid	Nukleotidová sekvence IGF-2 genu	Promotor
Hupl	-980 až +54	Promotor 1
Hup2	-379 až +271	Promotor 2
Hup3	-1229 až +140	Promotor 3
Hup4	-546 až +102	Promotor 4

Sekvence IGF-2 promotoru jsou popsány v Sussenbach et al., 1992, io Growth Reg. 2:1-9, a jsou zde zahrnuty odkazem. Vektor s luciferasovým reportérovým genem je komerčně dostupný od firmy

Promega, Madison, Wl (katalogové č. E1641).

10.2 Výsledky a diskuse

Expresní plasmidy byly transfekovány do lidských linií rakovinných buněk močového měchýře HT-1376, EJ28, T24P, 1197 a UM-UC-3 jak bylo popsáno shora v části 6. Luciferasová aktivita byla stanovena s použitím komerčně dostupného kitu (Promega, Madison, Wl, katalog.č. E1500). Výsledky uvedené v Obr. 4A-4E ukazují, že P4 promotor IGF-2 aktivuje expresi luciferasového reprotérového genu v každé testované linii rakovinných buněk močového měchýře. V buněčné linii 1197 aktivoval expresi luciferasového reprotérového • · • · ♦ ·

- 36 ♦ · * · 9 • · ··♦ • 9 9 * · 9

99

9 • · « · • a genu též P3 promotor IGF-2. V následujících experimentech bylo zjištěno, že P3 a P4 IGF-2 promotory aktivují expresi luciferasového genu v dalších nádorových buněčných liniích, včetně buněk choriokarcinomu a rabdomyosarkomu.

11. Příklad: H19 promotor a IGF-2 promotor s H19 enhancerem napomáhají expresi heterologního genu

11.1 Materiály a metody io Čtyři luciferasové vektory, pGL3-Basic, pGL3-Promoter, pGLEnhancer a pGL3-Control, byly získány od firmy Promega. Tyto vektory byly transfekovány do buněk s použitím řady různých transfekčních reagencií zahrnujících lipofetamin (Gibco/BRL), fugene (Boehringer), Perfect Transfection Kit s 8 různými lipidickými činidly (Invitrogen), TFX-10, TFX-20 transfast (Promega) a kalcium fosfátový postup (Gorman et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051).

H19 promotor klonovaný do EcoRV místa plasmidu pBluescript II SK (pbh19p#1) je popsán v části 6.1, supra. H19 promotor byl vyštěpen restrikčními enzymy Smál a Hindlll a výsledný 0,9 kb fragment byl vnesen do Smal-Hindlll míst vektoru pGL3-Basic za vzniku konstruktu Luc-pbh19.

H19 promotorové oblast pokrývající nukleotidy -818 až +14 byla amplifikována z plasmidu pbh19p#1 pomocí PCR s použitím primerů 5'-ATATGGTACCGACAACCCTCACCAAAG-3' (horní, SEQ ID

NO:8) a 5'-ATATAAGCTTCTTCTCCCTCACCCTGCTC-3' (spodní,

SEQ ID NO:9). Výsledný PCR produkt byl štěpen enzymy Kpnl a Hindlll a ligován do Kpnl-Hindlll míst vektoru pGL3-Basic za vzniku konstruktu Luc-PBH19. Tento H19 promotor získaný pomocí PCR byl sekvenován z obou řetězců na automatickém sekvenátoru (ABT Prism

377 DNA Sequencer, Perkin Elmer). Nukieotidová sekvence H19

- 37 promotoru (SEQ ID NO:2), který byl generován pomocí PCR, je ukázána na Obr. 5.

kb spodní H19 enhancer, popsaný v části 6 shora, byl štěpen enzymem BamHI za vzniku dvou fragmentů o velikosti 4,1 kb a 0,9 kb na 3' konci. Insercí 0,9 kb BamHI fragmentu H19 enhanceru do BamHI místa plasmidu Luc-PBH19 vznikl konstrukt Luc-PBH19-0.9EH19 a insercí 4,1 kb BamHI fragmentu H19 enhanceru do BamHI místa plasmidu Luc-PBH19 vznikl konstrukt Luc-PBH19-4EH19. Enhancerové sekvence byly tímto klonováním umístěny pod sekvenci ίο H19 promotor/luciferasový gen směrem k 3' konci.

BamHI enhancerový fragment o velikosti 0,9 kb byl ligován do BamHI místa vektoru pGL-Basic za vzniku vektoru Luc-0.9EH19. Z plasmidu pbh19p#1 byi enzymy Kpnl a BamHI vyštěpen H19 promotor a poté ligován do Kpnl-Bglll míst konstruktu Luc-0.9EH19, čímž vznikl expresní konstrukt Luc-pbh19-0.9EH19, který obsahoval promotor popsaný v části 6 shora a 0,9 kb enhancer umístěný pod H19/Luc reportérovým genem.

Expresní vektory označené Hup-1, Hup-2, Hup-3 a Hup-4, které obsahují luciferasový gen pod kontrolou lidského IGF-2 promotoru P1, resp. P2, resp. P3, resp. P4, byly konstruovány jak je popsáno v Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9. Z konstruktu Hup-4 byla pomocí primerů 5'-ACAGGTACCTCTAGAGTCGACCT-3' (horní, SEQ ID NO:10) a 5'-ATATAAGCTTGCTCCCATCCTGCA-3' (spodní, SEQ ID NO:11) amplifikována 512 bp oblast promotoru P4. Výsledný PCR produkt byl štěpen enzymy Kpnl a HindiII a ligován do do Kpnl-Hindlll míst vektoru pGL3-Basic nesoucím reportérový gen, za vzniku vektoru Luc-P4.

Rovněž byly připraveny expresní vektory obsahující IGF-2 P4 promotor a H19 enhancer. Enhancerový 2 kb BamHI fragment

3o odvozený z 4,1 kb fragmentu popsaného výše, byl klonován do BamHI místa konstruktu Luc-P4, čímž vznikl expresní vektor Luc-P4-2EH19.

999 *9

Sekvence H19 enhancerových 0,9 kb, 2 kb a 4,1 kb fragmentů byly určeny automatickým DNA sekvenováním. Nukleotidová sekvence 0,9 kb enhanceru je ukázána na Obr. 6 (SEQ ID NO:3). Nukleotidová sekvence 2 kb enhanceru je ukázána na Obr. 7A a 7B (SEQ ID NO:4).

Nukleotidová sekvence 4,1 kb enhanceru je ukázána na Obr. 8A-8C (SEQ ID NO:5).

11.2 Výsledky a diskuse

K zavedeni čtyř vektorů obsahujících luciferasový gen do buněčných linií bylo použito několika transfekčních protokolů, přičemž io u většiny buněčných linií poskytl nejvyšší účinnost transfekce postup využívající kalcium fosfátový preicipitát. Proto byl tento postup použit při následných transfekcích různých expresních vektorů. Navíc, zvyšování koncentrace plasmidové DNA nesnižovalo transfekční účinnost ani v koncentracích přesahujících platě.

Buněčná linie 5637 karcinomu močového měchýře, buněčná linie Huh7 hepatocelulárního karcinomu (HCC) a buněčná linie 293T ledvinného nádoru byla každá transfekována různými konstrukty obsahujícími luciferasový reportérový gen pod kontrolou promotoru H19 nebo IGF-2 P4 v kombinaci s H19 enhancerem.

2o Buňky transfekované plasmidy Luc-ph19 a Luc-PH19, které obsahují reportérový gen a H19 promotor, vykazovaly zvýšenou genovou expresi nad pozadí (Obr. 9A-9C). Konstrukt Luc-PH19 obsahující promotor získaný PCR amplifikací měl ve všech testovaných buněčných liniích vyšší aktivitu než konstrukt Luc-ph19.

Přidání 0,9 kb H19 enhancerového fragmentu do Luc-ph19 vektoru (Luc-ph19-0.9EH19) zvýšilo dále dvakrát, resp. čtyřikrát hladinu exprese v buněčných liniích 5637 a 293T.

IGF-2 P4 promotor rovněž zvýšil ve všech buněčných liniích expresi luciferasy nad pozadí. Přidání 2 kb H19 enhancerového

3o fragmentu do Luc-P4 expresního vektoru vedlo k zvýšení *·

- 39 ·» ♦» ·♦ ** > · · · 9 9 « » 9 999 · « « > · · · · · « « 9 *999 9 9 9 9

99 99 99

P4 promotorové aktivity. Hladina indukce luciferasové aktivity 2 kb enhancerovým fragmentem se pohybovala v rozmezí dvojnásobku pro buněčnou linii 293T až šestinásobku pro buněčnou linii Huh7, zatímco v buněčné linii 5637 bylo zvýšení promotorové aktivity účinkem enhanceru pouze marginální.

Obrázek 10A-10E ukazuje expresi z konstruktu Luc-ph194EH19, který obsahuje jak H19 promotor získaný pomocí PCR amplifikace, tak 4,1 kb H19 enhancerový fragment. Enhancer výrazně zvyšuje aktivitu promotoru, a to v rozmezí 3-28 krát podle buněčné linie, s výjimkou buněčné linie 5637.

12.

ULOZENIKLONU

Následující plasmid byl deponován u American Type Cuiture Collection (ATCC), Manassas, VA, v souladu s podmínkami Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložených mikroorganismů pro účely patentového řízení:

Klon

ATCC přírůstk. číslo Datum uložení pH19EH19

209322

2. října 1997

EKVIVALENTY

Předchozí písemná specifikace postačuje, aby osoba zběhlá v oboru mohla provádět vynález. Různé modifikace shora popsaných způsobů provádění vynálezu, které jsou zřejmé osobám zběhlým v oboru molekulární biologie, medicíny a příbuzných oborů, spadají do rozsahu následujících nároků.

Všechny publikace zde citované jsou zahrnuty v úplnosti odkazem.

• ·· • · · ♦ ··

SEZNAM SEKVENCÍ <110? Yissim Research. Deveicp-.enf Ccmpany of The Eeňrew University of Jerusalem <120? MSTRODS AND COMPOSITIONS FCR INDUCING TUMOR-SRRCTFTC CYTOTCX1CITY tn b) b)

<130?	5457-0014-223
<140?	PCT/IL98/00436
<141?	• 1953-10-04
<150?	US 09/135,240
<151?	1993-10-01
<150?	US 03/943,308
<151?	1997-10-03
<ieo?	11
<170?	FastSRO for Windows Version 2.0
<210?
<211?	830
<212?	DNA
<213?	Home sapien
<400?	T.
	CCaciCác.U'-'- - — — — wdáa^ 23	ccaaggcgcr.	— iccgacgga	cocacagcgg	60
	ggagccgaaa cccgccagtc	tzccaccccac	cccaaacccc	ggcgccccac	120
	gagacr^ct^gu gc.ggccgccc	accgcccgzc	agcagagcgc	gcccgcgagc	180
C gcasgcaca	gcooggcaac acgcggrcrt	cagacaggaa	agcggccgcg	aatgggaccg	240
CCC CgC CCSCf	gactcúgccc	cgcggaaacc	goggtgacga	goacaagctc	300
cctcaactc^	atgggaatcg gccrgggggg	ccggcaccgc	gcccaccagg	gggttcgcgg	360
cactcccczc	Cgcocctoag caccccaccc	cracccccca	cgaacgcgag	gccrgagccg	420
tgacggcggc	aggaaggggc cccc-.gagcc	acccgagccc	ccagggaccc	crcagc *—ggcc	430
c aca^ccaj	tgcaaagcac g-gcagggcg	ccggcaggca‘	gggagcagca	ggcatggtgt	540
ccacagaggg	gagacagtgg cccgggaggg	agaggccccg	gaccccgagg	gaggtgacgg	. 600
ggcaatgctc	agccctgtct ccggatgcca	aaggaggggr	gcggggaggc	cgtctttgga	660
gaanrccagg	acgggagccg ggtgagagag	acgtgtgccg	gaactgtoca	gggcggaggt	720
gggccccgcg	ggggccctcg ggagggcccc	gctctgactg	gccggcacgg	caggggcggg	780
aatcc-ggcg	cgccacccca gccagaaaaa	gcccgggcca	ggaccgagga		830

<210? 2 <211? S33 <212? DNA <213? Hcrr.o sapien <400? 2

gacaaccccc	accaagggcc	aacgcggtga	ccgacggacc	cacagcgggg	tggccggggg	60
agtcgaaacc	cgccagcccc	cactccaccc	ccaaccgtcc	tgccccacgc	gggcccggga	12 0
gagcccgtga	ggccgcccac	cgcccgtxcag	tagagtgcgc	ccgcgagccg	caagcacagc	180
ccggcaacat	gccgcctcca	gacaggaaag	tggcogcgaa	tgggaccggg	gagcccagcg	240

φφ

ΦΦ ·· ·Φ * » φ • · · · · • · · φ * · » φ ·· ·· φ φ φφ φ

φ •

φ

gcagagggga	ccccgccccg	cggaaaccgc	ggcgacgagc	acaageccgg	ccaaccggae	300
gggaaacggc	ccggggggct	ggcaccgcgc	ccaccaggcg	gcccgcggca	ccacccacag	350
cccctcacca	ccccaccccc	accccccagg	aacgcgagcc	ccgagccgcg	acggcggcag	420
gaaggggccc	tccgcgccat	ccgagccccc	agggacccgc	agccggcccc	cagccaacCg	480
caaagaaagc	gcagcgcgcc	cgcaggcagg	gagcagcagg	cacggcgccc	cccgagggga	540
gacagaggac		aagtcccggc	cccgagggag	9-gacggggc	aacgcccagc	600
ccagacaccg	gacgccaaag	gaggggtgcg	gggaggccgc	ccccggagaa	ccccaggacg	550
ggagcaggga	gagagagacg	tgtgccggaa	ccgcccaggg	cggaggcggg	cccCgcgggg	720
gcccacggga	STSsCCCCgcc	ccgactggcc	ggcagggcag	gggcgggaat	accgggcggg	780
gccaccccag	ccagaaaaag	cccgggccag	gaccgaggag	cagggcgagg	gag	833

<21θ> 3 <211> 877 <212> DNA <213 > Eomo sapien <400> 3

caaggacacg	gaacttcgga	ccctctgccc	ccaccctctc	tgcagagcca	aggaacctct	60
gagcagcagg	aaggcccagg	gtctagagcc	tagaaatgga	cccccacgcc	cacctgccca	120
gcccagaccc	ccagcacaga	agggcggtca	gacttcctgt	gagacgaagc	cactaagcgg	180
gacggacacc	atcgcccact	ccacccggcc	cagcccagcc	cagccaagac	cagcccagac	240
cagcccagcc	cagccctacc	cagccccgcc	cagcccagcc	catccccgcc	ctacccagcc	300
cagccccgcc	ζζσζζζζςζζ	cagcccagcc	cagcccagcc	ccgccccgcc	ccgccccgcc	350
ccccccagcc	zzz&zzzzzz	cagccccgcc	cagcccagca	cacccccgcc	ccacccagcc	420
cagccccgcc	zzgzzzzzzz	ccgccccgcc	cagccctacc	cagcccagcc	cagcccagcc	480
ctgcccagct	cagcccagcc	caccccagcc	cagcccagcc	cagcacgcgc	tcacacgatg	540
O u-Cag 72—άμ	gcccgacccc	agaaagaggc	Cggcaacgag	ggccgaggcc	accaggccac	500
tgggcgccca	cgggccagac	aagcccagag	cccgcccccc	tgccacgggt	cggggcagac	6 6 0
accgccagca	cgccgcggac	gcgcacggcc	ccagggctgc	tggcaccagg	ctgcccccgc	720
czzzzzzzzz	gaggccaccc	caaaa-.agaa	acgaaccccg	tgccacaccc	accccagagc	780
	cccgccgccc	gcacc— c —g	duCHLCCCCC	tgc_ -.-cccc	a ac t c >—
tagcaacgaa	ggggagcccg	aa - —«. ·—	gcccggg			377

<210> 4 <211> 1950 <212> DNA <213 > Ecrr.o saaien <400> 4

ccgggaaccg	agcacccagg	aaga t aaa tg	aaatccacca'	'cacaagagaa	cggcgaggga	60
tcagagcaca	cagagccaag	ggcgcagcgg	gaccgggcgg	gggcccacca	cgcccccccc	120
aacatgcggg	ccaggaggtc	agccccccaa	ccacgacccc	ggctgggtca	cagggaatgg	180
tcacccccag	tggcccagca	tgcttgtgtt	ttcagatggg	tgtgcatggg	tgtgtgtgtg	240
tgagagtgag	tgagagtgag	tgtgtgtgtg	tgagacgcct	gacaagcccc	agagagccaa	300
agacctgagt	ggagatcttg	tgacttctca	aaagggccaa	tggaacgttc	gagaaagagc	360
agaggacagc	cttgcactac	cttaaggctg	tggtaaccac	actaggcata	gcacaggcct	420
gcgccccgac	cctccttccc	tcctzccgcgc	cactcctttc	tctttctccc	cccactaccc	480
cgcaccctgg	cctgctcctg	gcgacaccgc	tggccccctt	ccagcgcaga	gggaagccag	540
cgggggcccc	ttccagaaag	cccacctgca	ggccggcttg	cagggaaggg	gctgctctcg	600
cagaggcacc	cgcccgccca	gcagccgctt	cctccaagca	gtcgcagagg	gtattctgtt	660
cctcgacagc	actgtgcttg	caaagaaagc	agacactgtg	ceccaagccc	ctagggagcc	720
ccgcaccatc	acccaacacc	tggccggaca	caggcgggag	gcccggtccg	cggggagcgg	780
cgcggggctg	gggccggacc	accaaacaca	ca-=3gcgcc	aggcactgca	ggctcctcca	840
ccacctcctg	cccagcgcct	ctgcccacag	gcacgtgcca	agcccctagg	ccaggaggcc	900
agcagaggca	gcagaacaag	ctcccgggaa	SSSSstgcac	ggcggacccc	cgggcagaag	960
cgcaggcagg	gctgaggggg	acgccgaccg	tJSíccccac	gatgcagaaa	actggntgcc	1020

I . *· ·· • 4 4 * * 4 4 · • · · 4 ♦ · * 4 *· 44 •

cggctggaag	atgggggaga	tgccaagcct	cagaggcagc	acgagcaggg	cgcaaggagg	1080
cccgggcgcg	gggaggctgc	accgcagcac	gcaccacaaa	gcccanaggg	agtggagacc	1140
aggcaccgga	atcgagaagt	agaaaggcgg	caaggaggcc	tcggaaccgg	ctgaccccca	1200
acagagtggg	tczccagcct	ggctctgccc	cgaagaaggc	czcczczccz	cateacaagg	1260
cczagagcs	ccagtcccgg	tggcccccag	ccagagggcc	aacgg cctca	ccctgggccg	1320
cgggacagag	ggcacgttca	tcaagagtgg	c c cccaaggg	acet gt gg c	gatcgcagtc	1330
cacaggaagc	azccgagata	aggagccrgt	tcccccagcg	ggcacggagc	cagcaggggg	144 0
gccgtggggc	agcccaggg“	gcaaggccag	gctgcggggc	tgcagccgcc	tcgggcccca	1500
cucacaggac	tctgcgggag		9?a?í-ggca	gctgcacagt	ggccccaggc	1560
gaggctcrca	gctccagtcg	ccctccgggc	gggcagccca	agagggcctg	gccgagcctc	1620
ccacatccgg	gaccccacca	cccaacaac*	taacúaaggc	tgaatctcac	gtgccctgag	1680
acxagg3Cag	acaaagcccc	tgtccaaagg	ggcagccagc	ccaaggcagt	ggggacggcg	1740
tgggcggcgg	gcgacggggg	agatggacaa	caggaccgag	ggcgtgcggg	cgacggggga	1800
gacggacaac	aggaccgagg	gagtgcgggc	gatgggggac	acggacaaca	ggaccgaggg	1860
cgcgcgggac	acgcatgtca	ctcatgcacg	ccaatggggg	gcgtgggagg	ctggggagca	1320
gacagaccgg	gctgggctgg	gcgggaagga	cgggcagatg			1960

<210> 5 <211> 4035 <212> DUA.

<212 > Koma sapien <400> 5

ccgggcaccg	agctcccagc	aaga taaa tg	atttcctcct	ctctagagat	ggggctggga	60
cccgagcacc	cagagccaag	ggcgcagtgg	gtccgcgcgc	gggccctcct	cggccctccc	120
aacacggggg	ccaggaggtc	agcccctcaa	cccggacccc	ggctgggtct	cagggaatgg	180
tctcccccag	tcccccacct	fcgcútgtgtt	ttcagatggg	tgtgcatggg	tgtgtgtgtg	240
cgtgtgcgcg	tgtgtctgtg		tgtgatgcct	gacaagcccc	agagagccaa	200
agacctgagc	ggagatcttg	tgacttccca	aaagggggat	tggaaťgzcc	gagaaagagc	5o0
		Ct _a.a=----	tdaccac	·- -a. ι- ά
gcgccccgaa	CCCCSEECCC	tcctccgcgc	ctctcctttc	tcttcctccc	ccctccacc:	430
cgctcaaagg	cctcctcctg	ctgacaccgt	tggccccctt	ccagggctga	gggaagccag	540
cgggggcccc	ctcctgaaag	cccacccgca	ggccggcttg	ccgggaaggg	gctgctctcc	600
cagaggcccc	cgcccgccct	gcagccgttt	cctggaagca	gtcgctgtgg	gtattctgtt	ti ó U
ccctgacagc	actgtgcttg	caaagaaagc	agacactctg	ccccttgtcc	ttagcgagcc	720
ccgctccacc	acccaacacc	tggctggaca	caggcgggag	gccgggtccg	cggggagcgg	780
cgcggggctg	gggccggacc	au*aaacacs	cacgggcgcc	sggcaccgca	ggctcctcct	840
ccaccccctg	cccagcgccc	ctgctcacag	gcacgtgcca	acccccta^g	ccaggacccc	900
agcagtgggt	gcagaacaag	ctcctgggaa	gggggtgcag	ggcggacccc	cggggagaag	960
ggctggcagg	gctgtggggc	acgctgaccg	tgggccccac'	g t tg cagaaa	actgcntgcc	1020
tggctcgaag	atgggggaga	tgccaagcct	ctgagccagc	acgagcaggg	tgcacggagg	1080
ccggggcgcg	gggaggctgc	actgcagcat	gcaccccaaa	gcccaxiaggg	agtggagacc	1140
aggccccgga	atcgagaagt	agaaaggcgg	cttggaggcc	ttggaaccgg	ctgacctcca	1200
acagagtggg	gccggccctg	gaggcaaaga	ggtgcccggg	gtccggccct	gcccggggga	1260
gctatgtgtc	atccgcaagc	cacagcatat	gtacccccct	ctgagcctat	ggacccaggg	1320
cagggctgca	aggcagggca	ggggagacag	cacgggggag	caaggagcag	agagggggca	1380
tcaggctctc	ccaggaggaa	cattctcccg	acaggaggaa	gagacggccc	aggggtgacc	1440
gcggggagcc	atggtggcag	ctggggtcgt	cgcagatggg	agagaggctg	gcgaggtgaa	1500
cgtgcagggg	tcagggctct	ggggcccaca	tgcctctggg	agcaggcagg	cccagggctc	1560
tccgccactc	cccactcccg	cttcgctcat	acgctcggcc	caacggtggg	g-cgggatgag	1620
caggagatgg	ggcccagcgg	gcaagcaggg	ccccaaagac	a 11 tagaaaa	accggcttac	1680
gcaggcagca	ttcacagcag	gcggcgtgcg	ťS-cgggggc	cctgggagca	cagagaggca	1740
cacgtagggc	ccccgagggg	ctccccattg	gccggcagtg	acstcacccc	tgtgccaaca	1800
gtgatgtctc	cagctcccgc	cagccagggt	ttatggagcg	agacccagcc	cggcctcggc	1860
cctcactccc	caggcccaca	cactagccca	ctcttcaccc	tccggggtgg	cggcacggcc	1920
tgcgggtcct	ggcaccgctg	ctcctctgcc	caccctaact	tcccggcatc	gcggcrgccc	1980

···

cstctgagcg	tcoocaacca	^zaazz^zzc	ggcccagcag	gcctgcegtc	ctcctcctct	2040
tsccctctag	SC3.CSel3C« w	ggaggcccng	gggctggggg	cgctcacagc	cctgtgacae	2100
aggtgcatgg	gg~caggggt	cccagaatgg	cccctgggaa	ggaceccagc	cgggccggcc	2160
gctcaaggct	tcaggggtcr	gcccccacag	gggntagccc	ctcccagace	tctgtgaagc	2220
cagtacgggc	ctcccctccc	tgccccgtgc	tctgtccggt	gcttcctgga	ctgcactgcg	2280
ggccactggt	gagagggcgg	acagggaagg	gccgccgtgg	tgcctgtccc	tgcccacctg	2340
gctgngtggt	cccctccaag	tagggacaac	ccttctgagg	gcttcggggc	acc etggggt	2400
tgccagggcc	tcccagagcc	ctgtgagccc	ctgggcggtc	tggcctgatg	čccccctcca	2460
cgnccagggc	cggczgtggc	ccagaaccec	agcctcccag	caggccggtg	tgcggtggtg	2520
acccaggaga	cgcctLcgcct	ccactgaggg	gccaccgacc	tctgccagac	cacagagacc	2580
cccaaggagt	ctgaaggctg	gagacccggg	gctgggacca	ggtgggactc	tcccaccgag	2640
ccgtccccag	gcccagctgg	gcacacgtcc	cccttctctc	cagacacacc	ctgcctgcca	2700
ceaggacaca	ccgccctgtt	gggggtctct	tttaagtgct	tgccactctg	aggtgactgt	2760
ccctttccaa	agaggcttct	ggggcccagg	tcggatgcgt	cggcctgagc	aggaggatct	2820
gggccgccag	S^Scngggga	ctgtctcctg	gggaaggaag	cgcctgggag	cgtgtgtgct	2880
gacccaggác	catccaggga	ggcccgtctg	tggggcaagc	gggaagggag	cggctggaga	2940
ggctcggccg	cccccgccct	ccctcccatt	ccttagctcc	atgcctgtca	acctctgtca	3000
cccagtgagt	gatgtccagg	ggccctggaa	aggtcacagc	atgtttgagc	cgggtgagag	3060
agaagggaaa	gccgggggcg	gggaaaagta	cgtggaggaa	cctttaggcc	caaggaagga	3120
gacagggttc	tgggagggag	cgagccactg	gggccgccgg	gaaggtceet	gcttgctgct	3180
gceacccaga	accctcgcct	cttagczagc	ccccgcagcc	ccagcctttc	tggcntgtgg	3240
CCCtCtCCCC	catocccacg	tgtcctgtgc	aac caggccc	tggacccaaa	ccctcccgcc	3300
cccncctctc	zzzzczzacc	czzczaazzc	agtggtctxcc	agcccggctc	tgccctgccg	3360

caggcccccc	cccctcatta	ccaggcctag	agccxccagc	cccggrggcc	cccagcccga	3420
gggrgaacgg	cctcaccctg	^ccgcggga	cagagggcac	gctcaccaag	agtggctccc	3480
aagagaco-c^	tggctgtttg	cag“wCacag	gaagcattcg	agacaaggag	cttgttttcc	3540
cagtgggcac	ggagccagca	S^gSsCtgt:	9S9gcagccc	agggtgcaag	gccaggctgt	3600
ggggctgcag	ccgcettcgg	ccccactccc	a.ggcctt.t:gc	999'aS'^”S'9'5·	aggcgggagg	3660
ccgcagctge	acagcggccc	caggcgaggc	tctcagcccc	agtcgcrcirc	cgggtgggca	3720
gcccaagagg	gcetggctga	gcctcccas·?	cccgggaccc	catcacccaa	caacttaatt	3730
aaggctgaae	tccacgcgtc	ctzgtgacccg	ggcagacaaa		aaaggggcag	3840
ccagcctaac	g		SaCSsifCgaC	gggggaga~g	gacaacagga	3900
cegagggtga	gcgggcgaúg		acaacaggac		cgggcgatgg	3960
gggagatgga	caa.caggacc	CaCCCZgZZC	gggacacgca	tgtcacccac	gcacgccaat	4020
ccggggcgtg	gg<iggcTxggg	gagcagacag	accgggctgg	gCwgggcggg	aaggacgggc	4080
ágatg						4085

<210? 6 <211> 22 <212> DNA <213 > Ηοσ.ο sapien <400? 6 cggttcccca ctnccccagt tt <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Koso sapien <400> 7 cggaagtcga caaccctcac caaacgccaa g:

<210? 8 <211? 27 <212? DNA • ·· • · · • ··· • · »·· ·· • · · • · · · · • · · • · · ·· ·· ·· ·· ·· » · • · • · » · <213 > Komo sapien

DNA

Ecrr.o sapien <400> S atatgjcacc gacaaccctc accaaag 27 <210>

<211>

<212>

<213>

<400>

atataacctt cttccccctc accctgctc 29 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Koso sapien <400> 10 acacgtaccn ctagagtcga cct 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213 > Home sapien <400> 11 atacaagcac gc:c:catcc tgea 24

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob exprese heterologní sekvence v nádorové buňce, vyznačující se tím,že do nádorové buňky se
2. 5 zavede polynukleotid obsahující regulační sekvenci funkčně spojenou s heterologní sekvencí, jež kóduje cytotoxický genový produkt, přičemž regulační sekvence je odvozena z genomově imprintovaného genu, který je specificky exprimován v nádorové

   10 2. buňce. Způsob podle nároku 1, vyznačující t í m , ž e regulační sekvence je H19 regulační sekvence. s e 15 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující t í m , ž e regulační sekvence je IGF-2 P4 promotor. s e 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující t í m , ž e regulační sekvence je IGF-2 P3 promotor. s e 20 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , ž e nádorová buňka je buňka nádoru močového měchýře.

   Způsob podle nároku 5, vyznačující se t í m , ž e buňka nádoru močového měchýře je vybrána ze skupiny sestávající z Ht-1376, EJ28, T24P, 1197 a UM-UC-3.

   ·· • · *·· · ·· ··
3. 7. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že H19 regulační sekvence jsou H19 promotor, H19 enhancer, nebo H19 promotor i H19 enhancer.
4. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , ž e heterologní sekvence je vybrána ze skupiny sestávající z kódujících sekvencí pro β-galaktosidasu, difterický toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, gen retinoblastomu, p53, thymidinkinasu viru herpes simplex, thymidinkinasu viru varicella zoster, cytosindeaminasu, nitroreduktasu, cytochrom p-450 2B1, thymidinfosforylasu, purinnukleosidfosforylasu, alkalickou fosfatasu, karboxypeptidasu A a G2, linamarasu, β-laktamasu a xanthinoxidasu.
5. 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , ž e heterologní sekvence je antisense sekvence, jež specificky hybridizuje k sekvenci kódující gen vybraný ze skupiny zahrnující cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDI, cycIinE, cycIinA, cdk4, onkogenní formy p53, c-fos, c-jun, Kr-ras a Her2/neu.
6. 10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , ž e heterologní sekvence kóduje ribozym, který specificky štěpí RNA kódovanou genem vybraným ze skupiny zahrnující cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDI, cycIinE, cycIinA, cdk4, onkogenní formy p53, c-fos, c-jun, Kr-ras a Her2/neu.
7. 11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m , ž e nádorová buňka je v pacientovi.

   - 47 • · ·
8. 12. Způsob podle nároku 11, v y z n a č u j í c í se tím,že pacient má nádor vybraný ze skupiny zahrnující karcinom močového měchýře, hepatocelulární karcinom, hepatoblastom,

   5 rabdomyosarkom, karcinom vaječníku, cervikální karcinom, karcinom plic, karcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk na hlavě a krku, karcinom jícnu, karcinom štítné žlázy, astrocytom, ganglioblastom a neuroblastom.

   io 13. Způsob podle nároku 7, vyznačující se t i m , ž e H19 promotor zahrnuje nukleotidy 1 až 830 sekvence SEQ ID NO:1.

   Způsob podle nároku 7, vyznačující se t i m , ž e H19 promotor zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:2.
9. 15. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že H19 enhancer zahrnuje sekvenci H19 enhanceru klonovaného v plasmidu pH19EH19 (deposit č. 209322 v ATCC).

   Způsob podle nároku 7, vyznačující se t i m , ž e H19 enhancer zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:3.

   Způsob podle nároku 7, vyznačující se t i m , ž e H19 enhancer zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:4

   Způsob podle nároku 7, vyznačující se t i m , ž e H19 enhancer zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:5.

   • · · • · *

   - 48 19. Způsob podle nároku 7, vyznačující se t í m , že umístění H19 enhanceru je 3' vzhledem k heterologní sekvenci.
10. 20. Vektor pro expresi sekvence v nádorové buňce, kde vektor obsahuje polynukleotid, který obsahuje regulační sekvenci funkčně spojenou s heterologní sekvencí kódující cytotoxický genový produkt, přičemž regulační sekvence je z genomově io imprintovaného genu, jenž je specificky exprimován v rakovinných buňkách.
11. 21. Vektor podle nároku 20, kde regulační sekvence je H19 regulační sekvence.
12. 22. Vektor podle nároku 20 kde regulační sekvence je IGF-2 P4 promotor.
13. 23. Vektor podle nároku 20, kde regulační sekvence je IGF-2 P3

    20 promotor.
14. 24. Vektor podle nároku 21, kde H19 regulační sekvence zahrnují H19 promotor a H19 enhancer a heterologní sekvence kóduje protein vybraný ze skupiny zahrnující β-galaktosidasu, difterický
15. 25 toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, gen retinoblastomu, p53, thymidinkinasu viru herpes simplex, thymidinkinasu viru varicella zoster, cytosindeaminasu, nitroreduktasu, cytochrom p-450 2B1, thymidinfosforylasu, purinnukleosidfosforylasu, alkalickou fosfatasu, karboxypeptidasu A a G2, a xanthinoxidasu.

    linamarasu, β-laktamasu

    25. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 20.
16. 26. Způsob léčby pacienta s rakovinou, vyznačující se t í m , ž e pacientovi je podáván polynukleotid kódující cytotoxický nebo cytostatický genový produkt funkčně spojený s regulační sekvencí odvozenou z genomově imprintovaného io genu, který je specificky exprimován v rakovinných buňkách.
17. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se t í m , ž e regulační sekvence je H19 regulační sekvence.

    15
18. 28. Způsob podle nároku 26, vyznačující se t í m , ž e regulační sekvence je IGF-2 P4 promotor.
19. 29. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím,že regulační sekvence je IGF-2 P3 promotor.
20. 30. Způsob podle nároku 26, vyznačující se t í m , ž e cytotoxický genový produkt je vybrán ze skupiny zahrnující difterický toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, gen retinoblastomu a p53.
21. 31. Způsob podle nároku 27, vyznačující se t í m , ž e H19 regulační sekvence jsou H19 promotor, H19 enhancer nebo H19 promotor spolu s H19 enhancerem.

    - 50 • · • « • ·
22. 32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se t í m , ž e H19 promotor zahrnuje nukleotidy 1 až 830 sekvence SEQ ID NO:1.
23. 33. Způsob podle nároku 31, vyznačující se t í m , ž e H19 promotor zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:2.
24. 34. Způsob podle nároku 31, vyznačující se io tím, že H19 enhancer zahrnuje sekvenci H19 enhanceru klonovaného v plasmidu pH19EH19 (deposit č. 209322 v ATCC).

    Způsob podle nároku 31, vyznačující se t í m , ž e H19 enhancer zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:3.

    Způsob podle nároku 31, vyznačující se t í m , ž e H19 enhancer zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:4.

    Způsob podle nároku 31, vyznačující se t í m , ž e H19 enhancer zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:5.
25. 38. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím,že umístění H19 enhanceru je 3' vzhledem k heterologní sekvenci.

    25
26. 39. Způsob podle nároku 31, vyznačující se t í m , ž e rakovina je vybrána ze skupiny zahrnující karcinom močového měchýře, hepatocelulární karcinom, hepatoblastom, rabdomyosarkom, karcinom vaječníků, cervikální karcinom,

    -.51 • · • · karcinom plic, karcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk na hlavě a krku, karcinom jícnu, karcinom štítné žlázy, astrocytom, ganglioblastom a neuroblastom.

    5
27. 40. Způsob exprese heterologní sekvence v nádorové buňce, vyznačující se tím,že do nádorové buňky se zavede polynukleotid obsahující IGF-1 promotor funkčně spojený s heterologní sekvencí, jež kóduje cytotoxický genový produkt.
28. 41. Vektor pro expresi heterologní sekvence v nádorové buňce, kde vektor obsahuje polynukleotid, který obsahuje IGF-1 promotor funkčně spojený s heterologní sekvencí kódující cytotoxický genový produkt.