CZ294694B6 - Polynukleotid, vektor, buňka a farmaceutický prostředek - Google Patents
Polynukleotid, vektor, buňka a farmaceutický prostředek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ294694B6 CZ294694B6 CZ20001201A CZ20001201A CZ294694B6 CZ 294694 B6 CZ294694 B6 CZ 294694B6 CZ 20001201 A CZ20001201 A CZ 20001201A CZ 20001201 A CZ20001201 A CZ 20001201A CZ 294694 B6 CZ294694 B6 CZ 294694B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- sequence
- polynucleotide
- expression
- enhancer
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 32
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 32
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 133
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 86
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 74
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 59
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 16
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 140
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 55
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 41
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 32
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 24
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 18
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 17
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 17
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 9
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 9
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 8
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 claims description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 6
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 208000006359 hepatoblastoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 claims description 4
- -1 varicella zase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 101100005789 Caenorhabditis elegans cdk-4 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 101150090188 Cdk8 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 3
- 241000514744 Cyclina Species 0.000 claims description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004459 Nitroreductase Human genes 0.000 claims description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims description 3
- 102100027584 Protein c-Fos Human genes 0.000 claims description 3
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 claims description 3
- 101710132082 Pyrimidine/purine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 claims description 3
- 101150112625 SSN3 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100150415 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) srb10 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 claims description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 101150073031 cdk2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 108020001162 nitroreductase Proteins 0.000 claims description 3
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 108010020076 Cytochrome P-450 CYP2B1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 claims description 2
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 claims 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims 2
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 claims 2
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 claims 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims 2
- 102000013537 Thymidine Phosphorylase Human genes 0.000 claims 2
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 claims 2
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 claims 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims 2
- 108010079940 cyanogenic beta-glucosidase Proteins 0.000 claims 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 2
- 108010062699 gamma-Glutamyl Hydrolase Proteins 0.000 claims 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 claims 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 claims 1
- 101900150902 Varicella-zoster virus Thymidine kinase Proteins 0.000 claims 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 40
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 19
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 19
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 13
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 13
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 12
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 10
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 7
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 4
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 4
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 4
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 3
- 206010048909 Boredom Diseases 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 3
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 3
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 3
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- DIKPQFXYECAYPC-UHFFFAOYSA-N N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine Chemical compound CCCCN(N=O)CCCCO DIKPQFXYECAYPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOILPRCCOREWQE-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-7h-purine Chemical compound COC1=NC=NC2=C1NC=N2 GOILPRCCOREWQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002723 Atrial Natriuretic Factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000017631 Calcitonin-like Human genes 0.000 description 1
- 108050005865 Calcitonin-like Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101100084900 Drosophila melanogaster Rpn11 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000002494 Endoribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010017708 Ganglioneuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100286576 Homo sapiens IGF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004412 RNA 3' Polyadenylation Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 description 1
- 102100031372 Thymidine phosphorylase Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102100028509 Transcription factor IIIA Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002215 arabinonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N butyryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000012191 childhood neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M didecyl(dimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCC UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- IUAYMJGZBVDSGL-XNNAEKOYSA-N gramicidin S Chemical compound C([C@@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1)C(C)C)=O)CC(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 IUAYMJGZBVDSGL-XNNAEKOYSA-N 0.000 description 1
- 229950009774 gramicidin s Drugs 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000000415 mammalian chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000003757 neuroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 101150061422 yip5 gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Řešení se týká specifické exprese heterologních sekvencí v nádorových buňkách; jedná se zejména o geny kódující cytotoxické produkty pod kontrolou regulačních sekvencí, kterými jsou promotory zahrnují regulační sekvence genu H19. Dále poskytuje expresní konstrukty, vektory a prostředky pro podávání takovýchto expresních konstruktů, přičemž prostředky jsou využitelné při léčbě rakoviny.ŕ
Description
Vynález se týká oblasti nádorové buněčné biologie a léčby rakoviny. Konkrétně se vynález týká specifické exprese heterologních genů v nádorových buňkách, zejména genů kódujících cytotoxické produkty.
Dosavadní stav techniky
GenH19
Gen H19 je jedním z mála genů, o nichž se ví, že jsou u člověka imprintovány (Hurst et al., 1996, Nátuře Genetics 12:234-237). Na samém začátku embryogeneze je H19 exprimován zobou chromosomálních alel (DeGroot et al., 1994, Trophoblast 8:285-302). Krátce poté však dochází k umlčení otcovské alely a transkribuje se pouze alela zděděná od matky.
H19 je vysoce exprimován během embiyogeneze a poprvé byl identifikován jako gen, který je v játrech koordinovaně regulován společně s alfa-fetoproteinem účinkem /rans-působícího lokusu raf (Pachnis et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:5523-5527). H19 byl vedle toho nezávisle nakloňován řadou laboratoří, které se zabývaly izolací genů exprimovaných během diferenciace tkání. Například Davis et al. (1987, Cell 51:987-1000) identifikovali myší homolog H19 při vyhledávání genů aktivních v časných fázích diferenciace buněk C3H10T1/2. Pourier et al. (1991, Development 113:1105-1114) zjistili, že myší H19 se exprimuje při diferenciaci kmenových buněk a v době implantace. Transkripce lidského H19 genu byla rovněž pozorována v diferencujícím se cytotrofoblastech z lidské placenty (Rachmilewitz et al., 1992, Molec. Reprod. Dev. 32:196-202).
Zatímco v průběhu fetálního života dochází k transkripci H19 RNA v řadě různých embryonálních tkání, po narození je exprese H19 zastavena. Avšak ve stavu v játrech dospělých myší (Brunkow a Tilgman, 1991, Genes & Dev. 5:1092-1101) byla zjištěna určitá relativně nízká hladina transkripce H19. Postnatálně je H19 aktivován rovněž v nádorových buňkách. Ariel et al. (1997, Molec. pathol. 50:34-44) prokázali expresi H19 v řadě nádorů vzniklých v tkáních, ve kterých je H19 exprimován prenatálně. Dále tito autoři zjistili H19 RNA v nádorech odvozených z neurálních tkání, zejména v astrocytomech a ganglioneuroblastomech, o nichž není známá asociace s expresí H19. Vzhledem k velkému množství nádorů exprimujících H19 RNA tito autoři uvažovali o možnosti, že H19 je onkofetální RNA a navrhli výzkum H19 jako nádorového markéru pro lidské neoplazie.
Lidský i myší H19 gen byl nakloňován a sekvenován (Brannan et al., 1990, Molec. Cell. Biol. 10:28-36). Srovnání lidského a myšího genu H19 ukázalo celkovou 77% identitu nukleotidové sekvence. Navzdory této mezidruhové homologii na nukleotidové úrovni aminokyselinové sekvence odvozené z otevřených čtecích rámců obou genů vykazovaly nízkou identitu (Id.). Dále, ačkoliv H19 RNA je transkribována RNA polymerázou II, dochází u ní k sestřihu a polyadenylaci, zdá se, že není překládána. Namísto toho bylo zjištěno, že H19 RNA asociuje s 28S cytoplazmatickou RNA, což vedlo k úvahám, že H19 RNA by mohla působit jako RNA složka ribonukleoproteinového komplexu (Id.).
Skutečná fyziologická role H19 není zcela jasná. H19 může působit jako dominantně letální gen; vysoká ektopická exprese H19 transgenu u myší je příčinou letality krátce před narozením (Brunkow et al., supra). Tento časový úsek letality se shoduje s dobou, kdy nastává represe transkripce H19 genu. Na druhé straně však nebyl pozorován žádný defekt u myší nesoucích heterozygotní nebo homozygotní knockout H19 alely (alel) (Leighton et al., 1995, Nátuře 375:34-39). Knoc
-1 CZ 294694 B6 kout mateřské alely brání imprintingu geneticky vázaného a opačně imprintovaného IGF-2 genu; výsledné myši jsou při narození větší než jejich sourozenci z vrhu díky zvýšené prenatální expresi IGF-2 (Id.). Jelikož tyto dva opačně imprintované geny sdílejí cz.s-působící regulační sekvence, Leighton se spolupracovníky uvažovali o možnosti, že H19 by mohl hrát roli v imprintingu IGF-2 genu.
Produktu H19 genu je dále též přisuzována funkce nádorové supresorové RNA. Hao et al. (1993, Nátuře 365:764-767) popsali, že transfekce dvou embryonálních nádorových buněčných linií, RD a G401, DNA konstruktem exprimujícím H19, vedla k retardaci buněčného růstu, k morfologickým změnám a ke snížení tumorigenity v nudě myších. Takováto nádorová supresorová aktivita je v souladu s pozorovanou letalitou ektopické exprese (Hao et al., supra), jakož i se zvětšenou velikostí myší majících knockout mateřské alely H19 (Leighton et al., suppra). Představa, že H19 je nádorový supresor však zůstává kontroverzní. Některé výsledky nebyly údajně reprodukovány a případný jiný nádorový supresorový gen může existovat v těsné vazbě k H19 (Ariel et al., supra). Navrhovaná funkce H19 jako nádorového supresoru je také v rozporu s experimentálními údaji, podle kterých dochází k aktivaci H19 v širokém spektru nádorových buněk (viz například Lustig-Yariv et al., 1997, Oncogene 23:169-177).
Geny růstového faktoru podobného inzulínu (Inzulin-like Growth Factor, IGF)
IGF-2 je další imprintovaný gen, jehož exprese závisí na tom, z kterého rodiče pochází. Avšak na rozdíl od H19 je IGF-2 mateřsky imprintován, jak u myší, tak u lidí, a proto je exprimován z otcovské alely (Rainier et al., 1993, Nátuře 363-747-749). Lidský IGF-2 gen vykazuje komplikovaný transkripční profil. Existují čtyři IGF-2 promotory, jež jsou tkáňově a vývojově specificky aktivovány. Pouze tři z promotorů, P2, P3 a P4 jsou imprintovány a jsou aktivní během fetálního vývoje a v rakovinných tkáních. Čtvrtý promotor, Pl, není imprintován a je aktivován pouze u dospělých játrech a v choroidální pleteni (viz Holthuizer et al., 1993, Mol. Reprod. Dev. 35:391-393). P3 promotor IGF-2 genu snad hraje roli v progresi jatemí cirhózy ahepatocelulárního karcinomu (Kim a Park, 1998, J. Korean Med. Sci 13:171-178).
Ztráta imprintingu IGF-2 byla zjištěna v případě Wilmsova nádoru (Ogawa et al., 1993, Nátuře 363:749-751). Toto pozorování vedlo mnoho badatelů k představě, že ztráta imprintingu a bialetická exprese imprintovaných genů může hrát roli v poruchách růstu a ve vývoji rakoviny (viz také Rainer et al., 1993, Nátuře 362:747-749; Glassman et al., 1996, Cancer Genet. Cytogenet. 89:69-73).
Nádorově specifická genová terapie
Regulační oblasti genů asociovaných s nádory se používají k cílené selektivní expresi sebevražedného genu v buňkách odvozených z nádorů. Například v hepatocelulárním karcinomu je indukována exprese alfa-fetoproteinu. Huber et al., (1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:8039-8043) použili regulačních sekvencí genů albuminu nebo alfa-fetoproteinu k cíleně expresi thymidin kinázy viru varicella-zoster (\,rZN TK) v buňkách hepatomu. Hepatomové buňky infikované in vitro retrovirovým vektorem obsahujícím jeden z těchto expresních konstruktů exprimovaly VZV TK a staly se citlivé vůči normálně netoxickému 6-methoxypurin arabinonukleosidu (araM). Kaneko et al. (1995, Cancer Res. 55:5283-5287) sestrojili adenovirový vektor exprimující HSV TK pod kontrolou regulačních sekvencí alfafetoproteinu. Rekombinantní adenovirové částice obsahující tento vektor byly přímo injikovány do nádorů odvozených z hepatocelulárního karcinomu, vytvořených v bezthymových „nudě“ myších. Následné intraperitoneální injekce gancicloviru způsobily regresi nádorů odvozených z heptatocelulámího karcinomu.
Osaki et al. (1994, Cancer Res. 54:5258-5861) transfekovali plicní karcinomové buňky A54 expresním vektorem, který obsahoval regulační sekvence genu pro antigen plicního embryonálního karcinomu spojené s kódující sekvencí thymidin kinázy viru Herpes simplex (HSV TK). Transfekované buňky byly citlivé vůči gancicloviru. Navíc i růst nádorů v nudě myších vyvolaný
-2CZ 294694 B6 podkožní injekcí transfekovaných buněk byl inhibován opakovanými intraperitoneálními injekcemi gancicloviru. Nedávno však bylo zjištěno, že gen karcinoembryonálního antigenu je exprimován v normální střevní sliznici, což omezuje použitelnost těchto regulačních sekvencí jakožto nádorově specifických regulačních oblastí (Osaka et al., supra). Přetrvává tedy potřeba vývoje vektorů pro genovou terapii, které by specificky exprimovaly genové produkty v nádorových buňkách.
Podstata vynálezu
Vynález se týká prostředků pro indukci selektivní exprese heterologních genů v nádorových buňkách. Vynález se zejména týká polynukleotidů obsahujících regulační sekvence funkčně spojené s heterologními geny, jimiž se dá docílit nádorově specifická exprese heterologních genů. Konkrétněji, sekvence regulující transkripci je odvozena z genomově imprintovaného genu, který je specificky exprimován v rakovinných buňkách a kterých je gen H19, a heterologní gen kóduje cytotoxický protein nebo cytostatický genový produkt. Regulační sekvence budou řídit expresi v řadě různých rakovinných buněčných typů. Takovéto prostředky jsou použitelné při léčbě mnoha různých typů rakoviny a hyperproliferačních stavů.
Jedním aspektem vynálezu jsou expresní vektory obsahující polynukleotidy zahrnující takovéto regulační oblasti genu H19, tj. promotorové a enhancerové sekvence, které jsou funkčně spojené s heterologními geny. H19 enhancer a jeho aktivní části mohou být použity v jakékoli kombinaci s H19 promotorem. Vynález také zahrnuje hostitelské buňky obsahující takovéto vektory. V tomto ohledu může být expresní konstrukt obsahující heterologní gen pod kontrolou H19 promotoru a H19 enhanceru, nebo bez H19 enhanceru, zaveden do buňky. V jiném aspektu poskytuje vynález použité takovýchto vektorů k expresi heterologních genů v nádorových buňkách. Ještě jiným aspektem vynálezu je využití vektorů podle vynálezu pro léčbu rakoviny genovou terapií.
Podrobný popis vynálezu
Vynález částečně vychází z objevu, že k cílené expresi žádoucích kódujících sekvencí v rakovinných buňkách lze využít regulační oblastí z genomově imprintovaných genů, jež jsou exprimovány v rakovinných buňkách. Konkrétně bylo zjištěno, že exprese H19 je aktivována v širokém spektru karcinomů, jež zahrnují, ale bez omezení, karcinom močového měchýře, hepatocelulámí karcinom, hepatoblastom, rabdomyosarkom, ovariální karcinom, cervikální karcinom, karcinom plic, karcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk na hlavě a krku, karcinom jícnu, karcinom štítné žlázy, astrocytom, ganglioblastom a neuroblastom. Dále bylo zjištěno, že v nádorových buňkách jsou specificky aktivovány rekombinantní DNA konstrukty, jež obsahují oblasti H19 promotoru funkčně spojené s heterologním genem, nebo konstrukty obsahující takovýto promotor v kombinaci se spodním (downstream) H19 enhancerem. V jiném aspektu vynálezu se k řízení exprese heterologního genu využívá IGF-1 promotor.
V jednom ze svých aspektů tedy vynález poskytuje způsoby a prostředky pro změnu fenotypu rakovinných buněk nebo pro jejich selektivní zabití. Tohoto cíle je dosaženo tím, že do buněk se vpraví polynukleotid zahrnující regulační oblasti z genomově imprintovaných genů, jež jsou exprimovány v rakovinných buňkách, funkčně spojené s heterologním genem. Heterologní gen může kódovat například cytostatikum nebo cytotoxické agens (např. toxin, antisense RAN nebo ribozym).
Regulační oblasti genomově imprintovaných genů, jež jsou exprimovány v rakovinných buňkách zahrnují H19 promotor a enhancer.
-3 CZ 294694 B6
Pro účely vynálezu zde popsaného, výraz „funkčně spojený“ znamená, že nukleotidová sekvence je připojená k regulační sekvenci způsobem umožňujícím, aby exprese nukleotidové sekvence byla řízená regulační sekvencí.
„Heterologní“ genová sekvence se týká, v bezprostředním smyslu, genové sekvence, jež normálně není funkčně spojená s regulačními sekvencemi genu H19. Obecně, heterologní genové sekvence zahrnují sekvence, jež kódují cytostatické nebo cytotoxické genové produkty.
Výraz „exprese“, jak se zde užívá, se týká transkripce určité DNA, a dále sestřihu, opracování, stability a případně translace odpovídajícího mRNA transkriptu. V závislosti na struktuře vnesené molekuly DNA může být exprese přechodná nebo kontinuální.
Regulační sekvence genu H19
Níže jsou popsány regulační sekvence H19, jež mohou být použity k specifické aktivaci exprese heterologní kódující sekvence v nádorové buňce. Tyto H19 regulační sekvence zahrnují H19 promotorovou oblast nad genem (upstream) a/nebo spodní (downstream) H19 enhancerovou oblast. Nukleotidová sekvence jedné H19 promotorové oblasti je ukázána v obrázku 1A-1C (SEQ ID NO:1). Tato 830 bp dlouhá nukleotidová sekvence sahá od nulkeotidové pozice -837 k pozici -7, počítáno od místa čepičky (jak popsali Brannan at al., supra). Konsenzní TATA sekvence se nachází mezi nukleotidy -27 a -35. Dvě konsenzní AP2 vazebná míst (shora 8/9) se nacházejí přibližně -500 a -40 nukleotidů nad místem iniciace transkripce. Jak je podrobněji diskutováno níže, předřazení přibližně 830 bp regulační oblasti před kódující sekvenci heterologního genu postačuje k expresi funkčně připojeného heterologního genu v rakovinných buňkách, jež také exprimují endogenní H19. Kromě toho i další oblast promotoru H19, nacházejí se mezi nukleotidy -819 až +14 (Obrázek 5, SEQ ID NO:2), postačuje k expresi funkčně připojeného heterologního genu v rakovinných buňkách.
Do konstruktu sH19 promotorem a heterologním genem může být případně přidána spodní enhancerová oblast lidského H19 genu, aby se dosáhlo vyšší hladiny nádorově specifické exprese. Jak je zevrubněji popsáno níže a ilustrováno příkladem v části 6. Tato spodní enhancerová oblast je obsažena v Sací restrikčním fragmentu sahajícím od +6kb k +1 lkb vzhledem k počátku transkripce. Jak se očekává od enhancerové sekvence i tento spodní enhancer působí bez ohledu na orientaci, tzn. může být umístěn v opačné nebo stejné orientaci (vzhledem k orientaci H19 enhanceru v endogenním H19 genu) za kódující oblast heterologního genu pod kontrolou H19 promotoru. Fragmenty tohoto enhanceru, obsahují sekvence ukázané na Obr. 6, 7A, 7B a 8A-8C (SEQ ID NO: 3-5), rovněž mohou napomáhat genové expresi.
Tyto regulační sekvence z genově imprintovaných a ineimprintovaných genů, jež jsou exprimovány v rakovinných buňkách, mohou být dále analyzovány, aby se stanovily minimální regulační sekvence nutné k dosažení žádoucí nádorově specifické exprese. Promotorová oblast může být například pozměněna adicemi, substitucemi nebo delecemi a testována na funkčnost v nádorově specifické expresi. Různé části spodního H19 enhanceru mohou být jednotlivě analyzovány co do schopnosti zvyšovat transkripci z H19 promotoru.
Změny v regulačních sekvencích lze provést pomocí řady chemických a enzymatických metod, které jsou dobře známy z oboru. Například úseky sekvencí vymezené restrikčními místy mohou být deletovány. Místně cílenou mutagenezou lze definovaným způsobem měnit sekvenci a/nebo vnášet do specifických úseků sekvence restrikční místa. Deleční mutanty mohou být generovány i s použitím DNA nuleas jako jsou Bal31 nebo Exolll a S1 nukleasa. Progresivně větších delecí v regulačních sekvencích se dosahuje inkubací DNA s nekleasami po delší dobu (pro přehled technik používaných k mutageneze, viz Ausubel et al., 1989, Current Protocols for Molecular Biology).
-4CZ 294694 B6
Pozměněné sekvence se vyhodnocují podle schopnosti aktivovat nádorově specifickou expresi heterologních kódujících sekvencí ve vhodných hostitelských buňkách, zejména v buňkách, které jsou odvozené z karcinomů exprimujících H-19 (např. buňky karcinomu močového měchýře, jako jeden příklad). Jakékoli pozměněné regulační sekvence, jež mají zachovanou schopnost řídit nádorově specifickou expresi budou zahrnuty do rekombinantních expresních vektorů pro další využití, a spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Pod kontrolou těchto regulačních sekvencí mohou být exprimovány mnohé různé heterologní geny, jako například geny kódující toxické genové produkty, potenciálně toxické genové produkty a genové produkty s antiproliferační nebo cytostatickou aktivitou. Mohou se exprimovat i markerové geny, včetně enzymů (např. CAT, beta-galaktosidasa, luciferasa), fluorescenčních proteinů, jako je zelený fluorescenční protein, nebo antigenních markérů.
Cytotoxické genové produkty zahrnují, v širší definici, jak toxiny, tak činitele indukující apoptosu. Pro účely vynálezu se kromě toho mezi cytotoxické genové produkty zahrnují enzymy metabolismu, které konvertují prekurzor na cytotoxický produkt. Příklady cytotoxických genových produktů, které mohou být podle vynálezu použity, zahrnují záškrtový toxin, toxin Pseudomonas, rici, cholerový toxin, PE40 a nádorové supresorové geny jako jsou gen retinoblastomu a p53. Vedle toho mohou být použity sekvence kódující apoptické peptidy, které indukují buněčnou apoptosu. Takové apoptické peptidy zahrnují A β peptid u Alzheimerovy choroby (viz LaFerla et al., 1995, Nat. Genet. 9:21-30), atriální natriuretický peptid (viz Wu et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:14860-14866), peptid podobný calcitoninu (viz Sakuta et al., 1996, J. Neuroimmunol. 67:103-109), jakož i další známé nebo dosud neobjevené apoptické peptidy.
Mezi metabolické enzymy, které konvertují prekurzory na cytotoxický produkt, patří thymidinkináza (z viru herpes simplex nebo variacella zoster), cytosindeaminasa, nitroreduktasa, cytochrom P-450 2B1, thymidinfosforylasa, purinnukleosidfosforylasa, alkalická fosfatasa, karboxypeptidasa A a G2, linamarasa, laktamasa a xanthinoxidasa (viz Regg a Sikora, August 1997, Mol. Med. Today, str. 359—366).
Expresními konstrukty zde popsanými lze do rakovinných buněk vnášet i antisense, antigenní nebo aptamerní oligonukleotidy. V rakovinné buňce mohou být dále exprimovány ribozymy nebo jednořetězcové RNA s cílem inhibovat expresi konkrétních genů. Cílové geny pro zásah těmito antisense nebo ribozymovými molekulami jsou geny, jejichž produkty jsou nezbytné pro přežití buňky nebo pro udržení rakovinného fenotypu. Takové cílené geny zahrnují, ale bez omezení, cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyklinE, cyklinA a cdk4.
Do buněk se například zavádějí vektory, které pod kontrolou regulačních sekvencí imprintovaných genů nebo pod kontrolou promotoru IGF-1, aktivních v rakovinných buňkách, exprimují antisense RNA molekuly nebo ribozymy specifické vůči transkriptům onkogenních forem p53, c-fos, c-jun, K-ras a/nebo Her2/neu, aby se zastavila exprese endogenních genů. Nádorové buňky, v nichž je exprimován H19 a které tedy mohou aktivovat H19 regulační sekvence mohou být specifickými tercí pro expresi antisense RNA nebo ribozymové RNA.
Přístupy využívají antisense techniku zahrnující návrh oligonukleotidů (v tomto případě mRNA) komplementárních k cílové mRNA. Antisense oligonukleotidy se budou vázat ke komplementárním cílovým mRNA transkriptům a bránit jejich translaci. Absolutní komplementarita, byť výhodná, není nutná. Výraz sekvence „komplementární“ k části RNA, jak se zde užívá, znamená sekvenci komplementární natolik, zeje schopná hybridizovat k RNA a tvořit s ní stabilní duplex. Schopnost hybridizovat bude záviset jak na stupni komplementarity tak na dálce antisense nukleové kyseliny. Obecně, čímž delší je hybridizující nukleová kyselina, tím více nepárujících bází vůči RNA může obsahovat a přesto s ní může vytvářet stabilní duplex (nebo triplex, podle okolností). Osoba zběhlá v oboru může určit tolerovatelný stupeň nekomplementarity pomocí standardních postupů na stanovení teploty tání hybridizovaného komplexu.
-5CZ 294694 B6
V inhibici translace by měly být nejúčinnější oligonukleotidy, jež jsou komplementární k 5' konci cílové mRNA, např. k 5' nepřekládané sekvenci až po (a včetně) iniciační AUG kodon. V nedávné době se však prokázalo, že i sekvence komplementární k 3' nepřekládaným sekvencím molekul mRNA účinně inhibují translaci. Viz, obecně, Wagner, 1994, Nátuře 372:333-335. Oligonukleotidy komplementární k 5'- nebo 3'- nepřekládaným nekódujícím oblastem transkriptů cílových genů mohou tedy být použity v tomto „antisense“ přístupu k inhibici translace endogenních genů. Oligonuleotidy komplementární k 5' nepřekládané oblasti mRNA by měly zahrnovat komplement iniciačního kodonu AUG. Antisense oligonukleotidy komplementární ke kódujícím oblastem mRNA jsou méně účinnými inhibitory translace, mohly by ale v souladu s vynálezem být použity. Antisense nukleové kyseliny, ať již mají hybridizovat k 5', 3' nebo kódující oblasti cílové mRNA, by měly mít délku alespoň šest nukleotidů, s výhodou od 6 do asi 50 nukleotidů. Ve specifických aspektech je délka oligonukleotidu alespoň 10 nukleotidů, alespoň 17 nukleotidů, alespoň 25 nukleotidů nebo alespoň 50 nukleotidů.
Bez ohledu na volbu cílové sekvence je výhodné provést nejprve in vitro pokusy, aby se kvantitativně vyjádřila schopnost antisense oligonukleotidu inhibovat genovou expresi. V těchto studiích by měly být i kontroly na rozlišení inhibice genu antisense oligonukleotidem od nespecifických biologických účinků oligonukleotidů. Je rovněž výhodné, aby se v těchto studiích porovnaly hladiny cílové RNA nebo proteinu s hladinami RNA nebo proteinu vnitřní kontroly.
Translace cílové mRNA lze také bránit použitím molekul ribozymu navrženého tak, aby katalyticky štěpil příslušný cílový gen. (Viz např. PCT Intemational Publication WO90/11364, publikovanou 4. října 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). Je-li ribozym specifický pro genový transkript kódující protein, který je nezbytný pro růst rakovinné buňky, může takový ribozym vyvolat ztrátu fenotypu rakovinné buňky. K cílenému zničení molekul mRNA mohou být použity ribozymy, které štěpí tyto mRNA ve specifických rozpoznávacích místech, avšak výhodnější je použití „hammerhead“ ribozymů. Hammerhead ribozymy štěpí molekuly mRNA v místech diktovaných ohraničujícími oblastmi, jež tvoří komplementární páry bází s cílovou mRNA. Jediným požadavkem je, aby mRNA měla následující sekvenci dvou bází: 5-UG-3'. Konstrukce a produkce hammerhead ribozymů je dobře známá v oboru a je podrobněji popsána v práci Haseloff a Gerlach, 1988, Nátuře, 334:585-591. Ribozym se s výhodou konstruuje tak, aby rozpoznávané štěpící místo leželo blízko 5'konce cílové mRNA; tedy tak, aby se zvýšila účinnost a minimalizovala akumulace nefunkčních mRNA transkriptů.
Ribozymy pro použití podle vynálezu také zahrnují RNA endoribonukleasy (dále v textu „ribozymy Čechova typu“), jejichž prototyp se vyskytuje přirozeně v Tetrahymena thermophila (známé jak oIVS nebo L-lí IVS RNA), a které podrobně popsal Thomas Cech se spolu-pracovníky (Zaug et al., 1984, Science 224:574-578; Zaug a Cech, 1986, Science 231:470-475; Zaug et al., 1986, Natura 324:429-433; publikovaná Mezinárodní Patentová Přihláška Wo 88/04300 University patents lne.; Been a Cech, 1986, Cell 47:207-216). Ribozymy Čechova typu mají aktivní místo o osmi párech bází, které hybridizuje k sekvenci cílové RNA, načež nastává štěpení cílové RNA. Vynález předpokládá použití těch ribozymů Čechova typu, jejichž 8 bp sekvence aktivního místa hybridizuje k sekvencím přítomným v cílových genech.
Aktivace genů v nádorových buňkách
Buňky, ve kterých dochází k reaktivaci exprese imprintovaného genu budou též schopné specificky aktivovat expresi heterologního genu z vektoru obsahujícího regulační oblasti takovéhoto imprintovaného genu funkčně spojené s heterologním genem. Takovéto buňky, zejména nádorové buňky jsou vhodným terčem pro postupy genové terapie podle vynálezu. Exprese specifická pro H19 může být stanovena v nádorech i v buněčných liniích technikami analýzy RNA, in šitu hybridizace a s použitím konstruktů obsahujících reportérové geny.
-6CZ 294694 B6
Ve většině aplikací RNA analýzy se používá značená sonda, specificky hybridizující s transkriptem sledovaného genu, kterou lze připravit kteroukoli z technik dobře známých v oboru. Značená sonda může obsahovat alespoň 15 až 30 bází komplementárních k H19 nukleotidové sekvenci, výhodněji obsahuje alespoň 50 až 150 bází komplementárních kH19 transkriptu. Obzvláště výhodnou hybridizační sondou je H19 expresi je polynukleotid komplementární ke 3' konci H19 mRNA v úseku přibližně 800 nukleotidů nad polyadenylačním místem až po póly A místo.
Ve specifickém provedení vynálezu, jež je níže ilustrováno příkladem, se značená natisense RNA sonda připravila in vitro spoužitím T7 nebo T3 expresního plazmidu. H19 sondy se dají též značit s použitím náhodných primerů a značeného nukleotidu, například se soupravou Prime-It (stratagene, La Jolla, CA; katalog, č. 300392). Jinak lze připravit značenou sondu i pomocí PCR reakce s použitím cDNA klonu obsahujícím kódující oblast hl9 a primerů navržených tak, aby se amplifikovala část kódující oblasti. Další možností je standardní reakce posunu jednořetězcového zlomu („nick translation“).
Vhodný způsob označení polynukleotidových sond zahrnuje nukleotidy obsahující radioaktivní izotopy (jako jsou 35S a 32P), fluorescentní, luminiscentní a barevné značky, a enzymové molekulyZnačená sonda se in šitu hybridizuje k buňce nebo k vzorku tkáně s použitím standardních technik, jak je popsáno níže příkladem a ve spolupodané US patentové přihlášce poř.č. 08/704,786, která je zde zahrnuta odkazem. Je-li k dispozici dostatečné množství příslušných buněk, lze stanovení hladiny exprese mRNA sledovaného genu provést standardní RNA analýzou (jako je např. northernová analýza, chránění před RNAsou, nebo extense primerů).
Takovéto analýzy genové exprese je možné provádět též „in šitu“, tzn. přímo v tkáňových řezech (fixovaných a/nebo zmražených) připravených ze vzorků tkání pacientů, odebraných při biopsiích nebo resekcích, takže není nutná purifikace nukleových kyselin. K těmto in šitu postupům se mohou použít sondy a/nebo primery popsané výše. (Viz např. Nuovo, G. J. 1992, „PCRIn Šitu Hybridization: Protocols And Applications“, Raven Press, NY).
Jinou možností jak určit, zda v buněčném typu nebo nádoru bude možná specifická aktivace expresních konstruktů obsahujících konkrétní regulační oblasti funkčně spojené s heterologním genem, je přímá transfekce takovýchto expresních konstruktů do buňky. Pro tyto účely je výhodné, aby heterologní gen byl markerový gen. Pozitivní výsledek testu na produkt markerového genu znamená, že buňka nebo buněčná linie jsou schopné aktivovat expresi z použitých regulačních oblastí.
Příklady typů nádory saktivovanou expresí H19, zjištěné pomocí shora uvedených technik, jsou :
A. Pevná nádory u dětí
1. Wilmsův nádor
2. Hepatoblastom
3. Embryonální rabdomyosarkom
B. Nádory zárodečných buněk a trofoblastu
1. Nádory zárodečných buněk testes
2. Nezralý teratom vaječníku
3. Sakrokokcygeální nádor
4. Choriokarcinom
5. Nádory trofoblastu přivráceného k placentě
-7 CZ 294694 B6
C. Epiteliální nádory u dospělých
1. Karcinom močového měchýře
2. Hepatocelulární karcinom
3. Karcinom vaječníku
4. Cervikální karcinom
5. Karcinom plic
6. Karcinom prsu
7. Karcinom dlaždicových buněk na hlavě a krku
8. Karcinom jícnu
9. Karcinom štítné žlázy
D. Neurogenní nádory
1. Astrocytom
2. Ganglioblastom
3. Neuroblastom
Shora uvedené rakoviny jsou tedy léčitelné způsobem podle vynálezu. Vlastně jakýkoliv nádor, který aktivuje expresi H19 je možné léčit způsobem podle vynálezu.
Aplikací shora uvedených technik lze určit i nádory, které aktivují IGF-1 a promotory P3 a P4 genu IGF-2. Takovéto nádory jsou rovněž léčitelné způsoby podle vynálezu. Například IGF-2 je aktivován v nádorech dětského věku, jako jsou Wilmsův nádor, rabdomyosarkomy, neuroblasty a hepatoblastomy.
Způsoby jak vnášet do hostitelských buněk polynukleotidy, jež jsou pod kontrolou regulačních sekvencí
Vynález se rovněž vztahuje na hostitelské buňky transfekované polynukleotidy, jež obsahují regulační oblasti funkčně spojené s heterologním genem. Takovéto hostitelské buňky se mohou udržovat v kultuře nebo mohou být součástí zvířete, s výhodou savce. Uvedené polynukleotidy se typicky ligují do kteréhokoli z široké škály vektorů, které se pak následně vnášejí do buněk s použitím zde presentovaných postupů a materiálů. Takovéto vektory mohou být konstruovány s použitím dobře zavedených technik molekulární biologie (viz obecně, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, sv. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; a Current Protocols in Molecular Biology, 1989, John Wiley & sons, všechny svazby tohoto manuálu a jejich pravidelné doplňky jsou zde zahrnuty odkazem). V případech, kdy je požadována i translace, bude heterologní gen konstruován tak, aby obsahoval i vhodný 3' polyadenylační signál.
Kultivované buňky
Hostitelské buňky transfekované polynukleotidy obsahujícími regulační oblasti imprintovaného genu funkčně spojení s heterologním genem mohou být jakékoli prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Ligace polynukleotidu do genového konstruktu, jako je vektor a transformace nebo transfekce do hostitelských buněk, buď eukaryotických (kvasinky, buňky ptačí, hmyzí nebo savčí), nebo prokaryotických (bakteriální buňky), jsou standardní postupy široce používané v mikrobiálních technologiích nebo v kultivaci tkáňových kultur.
Vektory vhodné pro kultivaci předmětných polynukleotidů v bakteriálních buňkách, jako jsou
E. coli, zahrnují plazmidy následujících typů: plazmidy odvozené od pBR322, plazmidy odvozené od pEMBL, plazmidy odvozené od pEX, plazmidy odvozené od pBTac, a plazmidy odvozené od pUC. V kvasinkách S. cerevisiae se jako užitečné klonovací a expresní vektory pro vnášení genetických konstruktů uplatňují plazmidy YEP24, YIP5, YEP51, pYES2 a YRP17 (viz napřík
-8CZ 294694 B6 lad Broach et al., 1993 v Experimental Manipulation od Gene Expression, ed. M. Inouye, Academie Press, str. 83). Tyto vektory se mohou replikovat jak v E. coli, díky přítomnosti replikačního počátku ori z pBR322, tak i v kvasinkách, díky přítomnosti počátku replikace z kvasinkového 2μηι plazmidu. Kromě toho mohou být použity markéry resistence k antibiotikům, jako např. k ampicilinu.
Podobně i výhodné savčí vektory pro nukleotidy podle vynálezu obsahují prokaryotické sekvence, které umožňují namnožení vektoru v bakteriích. Takovéto vektory pro transfekci do savčích buněk se mohou konstruovat tak, aby se integrovaly do savčího chromosomu a získaly tak dlouhodobou stabilitu; pro tento účel mají připojený selektovatelný markerový gen. Pro transientní expresi je možné použít derivátů virů, jako jsou např. bovinní papillomavirus (BPV-1) nebo viru Sepsteina-Barrové. Různé metody používané při přípravě plazmidů a jejich transformaci do hostitelských organismů jsou dobře známy v oboru. Další vhodné vektorové systémy, jakož i obecné postupy rekombinantních technologií uvádí Sambrook et al., supra.
Genová terapie
Vynález rovněž zahrnuje využití polynukleotidů, obsahujících regulačních oblast genu funkčně spojenou s heterologním genem, v genové terapii rakoviny a hyperproliferačních onemocnění. Pro účely genové terapie se mohou expresní konstrukty podle vynálezu podávat v jakémkoli biologicky účinném nosiči, např. jakémkoli přípravku nebo prostředku schopném účinně dopravit rekombinantní gen do buněk in vivo. Přístupy zahrnují inserci předmětného genu do virových vektorů, včetně rekombinantních retrovirů, adenoviru, adenoasociovaného viru a viru herpes simplex-1, nebo do rekombinantních bakteriálních nebo eukaryotických plazmidů. Virové vektory transfekují buňky přímo; plazmidová DNA může být vpravena do buněk např. pomocí kationických polymerů, kationických liposomů (např. lipofectinu, derivátů cholesterolu jako D.D.A.B a kationických fosofolipidů) nebo derivatizovaných (např. s protilátkou konjugovaných) konjugátů polylysinu, gramicidinu S, umělých virových obálek nebo jiných takovýchtonitrobuněčných nosičů, jakož i přímou injikací holého genového konstruktu, elektroporací nebo CaPO4 konprecipitací. Současný přehled pojednávající o přenosu genů a expresních systémech při genové terapii rakoviny podává Cooper, 1996, Seminars in Oncology 23:172-187.
Transduce vhodných cílových buněk je prvním důležitým krokem při genové terapii; je zřejmé, že volba konkrétního gen-vnášejícího systému bude záviset na faktorech jako jsou fenotyp uvažovaného cíle a způsob aplikace, např. místní nebo systémové. Je rovněž jasné, že konkrétní genové konstrukty poskytované pro in vivo transfukci expresních konstruktů jsou použitelné i pro in vivo transdukci buněk, jako např. pro použití v ex vivo tkáňových kulturách popsaných shora.
Výhodný způsob jak zavést do buňky in vivo nukleovou kyselinu je použít virový vektor obsahující nukleovou kyselinu, např. konkrétní cytotoxický gen pod kontrolou H19 regulačních sekvencí. Infekce buněk virovým vektorem je výhodná tím, že nukleová kyselina se dostane do velké část použitých buněk. Další výhodou je, že molekuly, např. cDNA kódované virovým vektorem, jsou v těchto buňkách, do nichž se dostane virový vektor, účinně exprimovány. Vhodné vektory, jež mohou být vnášeny do buněk s použitím zde uvedených způsobů a prostředků zahrnují, ale bez omezení, vektory na bázi viru herpes simplex, adenoviru, adeno-asociovaného viru, retrovirů, viru pseudorabies, alfa-herpes viru, a podobně. Podrobný přehled virových vektorů, zejména virových vektorů vhodných k modifikaci nereplikujících se buněk, jakož i způsoby užití těchto vektorů v souvislosti s expresí požadovaných polynukleotidů, lze nalézt v knize „Viral Vectors: Gene Therapy and neuroscience Apolications“, ed. Caplitt and Loewy, Academie Press, San Diego(1995).
Bylo prokázáno, že infekční spektrum virů a tedy i vektorů odvozených z virů lze omezit, modifikují-li se obalové proteiny na povrchu virové částice (viz např. publikace PCT WO93/25234 a W094/06920). Strategie používané k modifikaci infekčního spektra retrovirových vektorů například zahrnují: připojení protilátek specifických vůči antigenům buněčného povrchu k virovému
-9CZ 294694 B6 env proteinu (Roux et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:9079-9083; Junal et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:3251-255; a Gould et al., 1983, Virology 163:251-254); nebo připojení ligandu buněčného povrchového receptorů k virovým env proteinům (Nedá et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:14143-14146). Připojení může být formou chemického kovalentního přisíťování proteinu nebo jiné molekuly (např. laktosy, čímž se env protein převede na asialoglykoprotein), jakož i vytvořením fúzovaných proteinů (např. fúzované proteiny typu jednořetězcová protilátka/env). Touto technikou mohou být například nasměrovány rekombinantní viry na nádorové buňky tak, že k povrchu rekombinantního viru se připojí protilátky namířené proti nádorovým povrchovým proteinům nebo proti molekulám asociovaným s nádorem. Tato technika je použitelná nejen k omezení tropismu virových částic na určité buněčné typy, ale i ke konverzi ektotropního vektoru na vektor amfotropní.
Výhodný virový gen-vnášející systém užitečný v překládaném vynálezu, využívá vektory odvozené z adenoviru. Genom adenoviru se dá modifikovat takovým způsobem, že kóduje a exprimuje požadovaný genový produkt, ale jeho schopnost replikace v normálním lytickém životním cykluje inaktivována. Viz např. Berkner et al., 1988, Bio Techniques 6:616; Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; a Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155. Vhodné adenovirové vektory odvozené z adenoviru kmene AD typu 5 dl324 nebo jiných adenovirových kmenů (např. Ad2, Ad3, Ad7 atd) jsou dobře známy osobám zběhlým v oboru. Výhoda rekombinantních adenovirů může za jistých okolností spočívat v tom, že jsou použitelné k infekci širokého spektra buněčných typů, včetně epitelu dýchacích cest (Rosenfeld et al., 1992, supra), endoteliálních buněk (Lemarchand et al., 1992, Proč. Nati. Acad., Sci. USA 90:2812-2816) a svalových buněk (Quantin et al., 1992, proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:2581-2584). Dále, virové částice jsou relativně stálé, lze je purifíkovat a koncentrovat a mohou být modifikovány za účelem ovlivnění spektra infektivity. Kromě toho, vnesená adenovirová DNA (a cizí DNA v ní obsažená) se neintegruje do genomu hostitelské buňky, nýbrž zůstává episomální, čímž se lze vyhnout potenciálním problémům, jež mohou nastat v důsledku inserční mutageneze v případech, kdy se vnesená DNA integruje do hostitelského genomu (např. retrovirová DNA). Dále, „volná“ kapacita adenovirového genom pro cizí DNA je v porovnání s jinými vektory pro vnášení genů velká (až 8 kb) (Berkner et al., supra', Haj-Ahmand a Graham, 1986, J. Virol. 57:267). Většina replikačně-defektních adenovirových vektorů v současnosti používaných, a proto předkládaných vynálezem upřednostňovaných, mají zcela nebo zčásti deletovány virové geny El a E3, ponechávají si však až 80 % adenovirového genetického materiálu (viz např. Jones et al., 1979, Cell 16:683; Berkner et al., supra', a Graham et al., v Methods in Molecular Biology, E. J. Murray, Ed. (Humana, Clifton NJ, 1991)sv. 7, str. 109-127).
Jiný virový vektorový systém použitelný k vnášení předmětných expresních vektorů je adenoasociovaný virus (AAV). Adenoasociovaný virus je přirozeně se vyskytující defektní virus, který pro účinnou replikaci a produktivní životní cyklus vyžaduje jiný, pomocný virus, jako např. adenovirus nebo herpes virus. (Pro přehled viz Muzyczka et al., 1992, Curr. Topics in Microbiol. and Immunol. 158-97-129). Je též jedním z mála virů, jež mohou integrovat svoji DNA do nedělících se buněk, a který vykazuje vysokou frekvenci stálé integrace (viz například Flotte et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-354; Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828; a McLaughlin et al., 1989, J. Virol. 63:1963-1973);. Vektory obsahující pouhých 300 bp AAV sekvence jsou schopné zabalení a mohou se integrovat. Místo pro exogenní DNA je omezeno na zhruba 4,5 kg. K zavedení DNA do buněk může být použit AAV vektor, který popisují Transchin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260. Pomocí AAV vektorů byly do buněk různých typů zavedeny mnohé různé nukleové kyseliny (viz například Hermonat et al., 1984, proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Transchin et al., 1985, Mol. Cell. Bio.. 4:2072-2081; Windisford et al., 1988, Mol. Endocrinol. 2:32-39; Transchin et al., 1984; J. Virol. 51:611-619; Flotte et al., 1993, J. Biol. Chem. 268-3781-3790).
Vedle metod přenosu DNA pomocí virů, například uvedených shora, se pro řízenou expresi žádaného heterologního genu ve tkáni zvířete používají i nevirové metody. Většina nevirových metod přenosu genů využívá normálních mechanismů používaných savčími buňkami pro vychy
- 10CZ 294694 B6 távání a intracelulární transport makromolekul. Ve výhodných provedeních vynálezu se uplatňují nevirové systémy vnášení genů, které k vychytání a pohlcení předmětných expresních konstruktů terčovou buňkou využívají endocytosu. Příklady takovýchto gen-vnášejících systémů zahrnují systémy odvozené z liposomů, polylysinové konjugáty a umělé virové obaly.
Při klinickém použití mohou být terapeutické expresní konstrukty vnášeny do pacienta jakýmkoli z mnoha způsobů, jež jsou dobře známy v oboru. Například, farmaceutický prostředek obsahující gen-vnášející systém může být zaváděn systémově, např. nitrožilní injekcí, přičemž k specifické expresi konstruktu v cílových buňkách dochází převážně na základě specifity transfekce dané buněčnou nebo tkáňově specifickou expresí, vyplývající z regulačních sekvencí předřazených heterolognímu genu, nebo z kombinace regulačních sekvencí s gen-vnášejícím systém namířeným na konkrétní typy buněk. V jiných provedeních je počáteční vnesení rekombinantního expresního konstruktu do zvířete omezenější, neboť je místně lokalizováno. Gen-vnášející systém může být například zaveden prostřednictvím katétru (viz Patent US 5 328 470) nebo stereotaktické injekce (např. Chen et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). Expresní konstrukt podle vynálezu může být pro genovou terapii vnesen též pomocí elektroporace s použitím technik popsaných například v Dev et al., 1994, Cancer Treat. Řev. 20: 105-115.
Farmaceutický preparát konstruktu pro genovou terapii může v podstatě sestávat z gen-vnášejícího systému v přijatelném ředicím roztoku, nebo může obsahovat gen-vnášející systém zakotvený v matrici, odkud se pomalu uvolňuje. V případech, kdy rekombinantní buňky mohou produkovat kompletní gen-vnášející systém, např. retrovirové vektory, může farmaceutický prostředek zahrnovat jednu nebo více buněk, jež produkují gen-vnášející systém.
Terapeutické použití a dávkování
Je zřejmé, že z hlediska z hlediska lékaře nebo pacienta je žádoucí každé zabránění nebo zmírnění nepříznivých symptomů doprovázejících nádorové onemocnění (např. bolesti, citlivost, úbytek váhy a podobně). Dále je žádoucí jakékoli snížení nádorové masy nebo rychlosti růstu nádoru, jakož i zlepšení histopatologického obrazu nádoru. Pro účely této přihlášky se budou tedy zde používané výrazy „léčba“, „terapeutické využití“, nebo „lékařské využití“ týkat jakýchkoli a všech využití nárokovaných prostředků, jež jakýmkoli způsobem napravují stav nemoci nebo symptomy, nebo jinak zamezují, brání, brzdí nebo obracejí postup choroby nebo jiných nežádoucích symptomů.
Účinné dávkování a postup při léčbě může být stanoven obvyklým způsobem, přičemž se začíná s nízkou dávkou u laboratorních zvířat, postupně se dávky zvyšují a sledují se účinky a současně se systematicky pozměňuje dávkovači schéma. Studie na zvířatech, s výhodou na savcích, se běžně používají ke stanovení nej vyšší tolerované dávky bioaktivního agens na kilogram hmotnosti. Osoby znalé oboru extrapolují dávky pro další druhy, včetně člověka tak, aby byly účinné a přitom netoxické.
Před zahájením zkoušek účinnosti na lidech se provádí klinické studie Fáze I na normálních jedincích k určení bezpečných dávek. Při určování optimální dávky pro daného jedince musí klinici vzít do úvahy četné faktory. Hlavní roli hrají toxicita a biologický poločas konkrétního heterologního genového produktu. Další faktory zahrnují hmotnost pacienta, jeho stáří, celkový stav, konkrétní nádorové onemocnění a jeho vážnost, přítomnost jiných použitých léků, in vivo aktivita genového produktu a podobně. Zkušební dávkování se zvolí na základě výsledků studií na zvířatech a údajů v klinické literatuře.
Například, typická lidská dávka adenovirového vektoru, který obsahuje regulační oblast H19 funkčně spojenou s heterologním genem kódujícím cytotoxický produkt jako je např. thymidinkináza, je od 1 x 107 pfu do 1 x 1010 pfu injikovaných denně, přímo do nádorové masy. Výhodnější denní dávka takovéhoto adenovirového vektoru injikovaného přímo do nádoru je mezi 1 x 108 pfu a 1 x 1010 pfu, v závislosti na velikosti nádoru. Samozřejmě, u adenovirového vektoru
- 11 CZ 294694 B6 obsahujícího H19 regulační oblast funkčně spojenou s heterologním genem pro cytotoxický produkt s jinou mírou toxicity, budou tyto hodnoty příslušně upraveny. Podobné dávky se mohou použít jako doporučený výchozí bod v případě adenovirového vektoru obsahujícího IGF-2 promotor P4 funkčně spojený s heterologním genem, kódujícím cytotoxický produkt jako je např. thymidinkináza.
Různé biochemické složky podle vynálezu mají mít s výhodou, zejména pro in vivo použití, vysokou čistotu a být v podstatě prosty potenciálně škodlivých kontinujících látek a vyhovovat jakostním normám např. alespoň jakosti NF (National Food grade, tj.národní potravinové normě), obecně alespoň analytické jakosti, a s výhodou alespoň farmaceutické jakosti). Pokud musí být daná sloučenina před použitím nejdříve syntetizována, měl by výsledkem takovéto syntézy nebo následné purifíkace s výhodou být produkt, jež je v podstatě prost jakýchkoli potenciálně toxických látek, jež mohly být použity v průběhu syntetických nebo purifikačních postupů.
Pro použití k léčbě pacienta s rakovinou poskytuje vynález v jednom ze svých aspektů rovněž soupravu nebo balíček ve formě sterilně plněné lahvičky nebo ampule, jež obsahuje polynukleotidový vektor, který obsahuje H19 regulační oblast funkčně spojenou s heterologním genem kódujícím cytotoxický produkt, nebo buňku, jež uvolňuje takovýto vektor. V jednom provedení souprava obsahuje polynukleotidový vektor, který obsahuje H19 regulační oblast funkčně spojenou s heterologním genem kódujícím cytotoxický produkt, a to jako přípravek připravený k aplikaci, s jednou nebo více dávkami, přičemž součástí balení je návod k použití při léčbě rakoviny. Alternativně, a podle jiného provedení vynálezu, balíček poskytuje sterilně plněnou lahvičku nebo ampuli obsahující buňky nebo buněčnou linií uvolňující takovýto vektor. Vektor-uvolňující buňky nebo buněčná linie by měla být skladována a převáženy ve zmraženém stavu. Souprava může také obsahovat médium a reagencie potřebné ke kultivaci vektor-uvolňujících buněk nebo buněčné linie.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1A-1C. Nukleotidová sekvence promotorové oblasti lidského H19. Obrázek ukazuje promotorovou oblast od nukleotidové pozice -837 do -7 (relativně k začátku transkripce) (SEQ ID NO:1)
Obrázek 2. Schéma vektorů použitých k expresi heterologního genu pod kontrolou regulačních sekvencí H19.
Obrázek 3A-3E. Regulační sekvence H19 řídí expresi heterologního genu (CAT) v liniích rakovinných buněk močového měchýře. Specifická aktivita CAT (cpm/pg proteinu) je vynesena pro pět různých uvedených buněčných linií jako funkce vektoru použitého k transfekci. Obrázek 3 A: HT-1376 buňky. Obrázek 3B: EJ28 buňky. Obrázek 3C: T24P buňky. Obrázek 3D: 1197 buňky. Obrázek 3E: UM-UC-3 buňky. Následující vektory jsou podrobněji popsány níže v části 6: (1) pCAT-basic; (2) pCAT-control; (3) pH19E; (4) pH19EH19D; a (5) pH19EH19R.
Obrázek 4A-4E. Promotory P3 a P4 IGF-2 řídí expresi heterologního genu (luciferasy) v liniích rakovinných buněk močového měchýře. Specifická aktivita luciferasy (jednotky/pg proteinu) je vynesena pro pět různých uvedených buněčných linií jako funkce IGF-2 promotoru použitého v transfekovaném konstruktu k aktivaci exprese luciverasy. Obrázek 4A: T24P buňky. Obrázek 4B: 1376 buňky. Obrázek 4C: UM-UC3 buňky. Obrázek 4D: 1197 buňky. Obrázek 4E:EJ28 buňky. Vektory jsou popsány podrobněji níže v části 10.
Obrázek 5. Nukleotidová sekvence promotorového fragmentu lidského H19 (SEQ ID NO:2).
Obrázek 6: Nukleotidová sekvence 0,9 kb enhancerového fragmentu H19 (SEQ ID NO:3).
- 12CZ 294694 B6
Obrázek 7A a 7B. Nukleotidová sekvence 2 kb enhancerového fragmentu H19 (SEQ ID NO:4).
Obrázek 8A-8C. Nukleotidová sekvence 4 kb enhancerového fragmentu H19 (SEQ ID NO:5).
Obrázek 9A-9C. Exprese luciferasy v nádorových buňkách po transfekci s vektory obsahujícími různé kombinace H19 regulační oblasti a P4 promotoru. Obrázek 9A: 5637 buňky. Obrázek 9B: Huh7 buňky. Obrázek 9C: 293T buňky.
Obrázek 10A-10E. Exprese luciferasy v nádorových buňkách po transfekci s vektory obsahujícími H19 regulační oblasti. Obrázek 10A. 293T buňky. Obrázek 10B: T24P buňky. Obrázek 10C: Huh7 buňky. Obrázek 10D: 5637 buňky. Obrázek 10E: ET 112 buňky.
Po popisu vynálezu následují příklady, jež slouží k ilustraci a nijak neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Regulační sekvence H19 napomáhají expresi heterologního genu v nádorových buněčných liniích
Tato část popisuje konstrukci různých expresních vektorů obsahujících CAT reportérový gen umístěný pod kontrolou H19 regulačních sekvencí, a jejich přenos do několika různých linií rakovinných buněk močového měchýře.
Materiály a metody
Buněčné linie a transfekce
Linie rakovinných buněk močového měchýře HT-1376, EJ28, T24P, 1197 a UM-UC-3 byly získány z americké sbírky buněčných linií ATCC a byly udržovány podle doporučení ATCC.
Transientní transfekce byly prováděny postupem používajícím kalcium fosfátový precipitát. Precipitáty (obsahující 7 pg plazmidů) byly přidány v 1 ml média k 0,3 x 106 buněk v 30 mm miskách. Po 16 hodinách bylo transfekční médium odstraněno a vyměněno za čerstvé médium. Buňky byly sklízeny 24 až 96 hodin po transfekci a CAT aktivita byla stanovena postupem používajícím extrakci butyryl-CoA do organické fáze (Sambrook et al., 1989). Alikvotní horní organické fáze (100 pl) byl přenesen do scintilační lahvičky obsahující 3 ml scintilační kapaliny a byl změřena radioaktivita vzorku.
Konstrukce expresních vektorů
Plazmidy pCAT-basic (obsahující CAT reportérový gen, jemuž předchází mnohočetné klonovací místo), pCAT-promoter (obsahující CAT reportérový gen pod kontrolou SV40 promotoru), pCAT-enhancer (obsahující SV40 enhancer pod CAT reportérovým genem a mnohočetné klonovací místo pro inserci promotoru nad CAT reportérovým gehem) a pCAT-control (obsahující CAT reportérový gen pod kontrolou promotoru i enhanceru z SV40) jsou komerční produkty firmy Promega (Madison, WI).
Pro konstrukci plazmidů pH19E, obsahujícího CAT reportérový gen pod kontrolou H19 promotoru, byla nejprve promotorová oblast H19 (SEQ ID NO: 1) klonování do plazmidů pBluescript II SK+ (Promega). Polynukleotid obsahující H19 promotorovou sekvenci byl aplikován z DNA lidské placenty s použitím následujícího páru primerů.
ESPCR21: CGGTTCCCCACTTCCCCAGTTT (SEQ ID NO:6) a
ESPCR22: CGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT (SEQ IDNO:7).
- 13 CZ 294694 B6
Konec PCR produktu byly zatupeny pomocí Klenowova enzymu a klonovány do EcoRV místa plazmidů pBluescriptIISK+. Správnost DNA insertu byla potvrzena přítomností štěpících míst pro restrikční enzymy PvuII, EcoRI a Apal. Promotor byl orientován opačně vůči kódující oblasti lacZ vektoru. Promotorová oblast pak byla vyštěpena enzymy HindlII a Pstl a výsledný 0,9 kb fragment byl klonován mezi HindlII-Pstl místa plazmidů pCAT-basic, za vzniku pH19E.
Expresní plazmidy, které obsahují H19 enzancerovou oblast v obou orientacích pod segmentem H19 promotor/CAT reportérový gen, byly konstruovány následujícím způsobem: 5 kb Sací fragment obsahující H19 „spodní“ enhancer (vymezený oblastí +6kb až +11 kb vzhledem k začátku transkripce genu H19) byl klonován do Sací místa plazmidů pUC19. Tento enhancer pak byl vyštěpen jako fragment EcoRI-HindlI a ligován mezi EcoRI-HindlII místa plazmidů pBuescript II SK+ za vzniku pBhH19En-Sa. Plazmid pBhH19En-Sa byl parciálně štěpen enzymem BamHI a 5 kb fragment obsahující H19 enhancer (a interní BamHI místo) byl klonován do BamHI místa plazmidů pH19E pod segment H19 promotor/CAT reportérový gen. Takto byly získány plazmidy obsahující H19 enhancer v obou orientacích, přímé (pH19EH19D, direct) a opačné (pH19EH19R, reversní).
Výsledky a diskuse
Pět různých linií rakovinných buněk močového měchýře. HT-1376, EJ28, T24P, 1197 a UMUC-3 bylo transfekováno plazmidem pCAT-Basic (v Obr. 2 označeným P-E), plazmidem pCAT-control (v Obr. 2 označeným pSV40ESV40), plazmidem pH19E, plazmidem pH19EH19D a plazmidem pH19EH19R. Výsledky exprese pro každý konstrukt jsou uvedeny v Obr. 3A-3E. V každé buněčné linii byla pozorována nejvyšší hladina CAT aktivity s plazmidem pCAT-control, který obsahuje jak SV40 ehnancer, tak SV40 promotor. Tento konstrukt sloužil jako pozitivní kontrola, neboť regulační sekvence SV40 představují osvědčené prvky pro indukci genové exprese. Avšak SV40 regulační sekvence nejsou ve své schopnosti indukovat genovou expresi specifické pro národové buňky. Buněčné linie transfekované plazmidem pH19E, který obsahuje CAT reportérový gen pod kontrolou H19 promotoru, rovněž vykazovaly expresi CAT významně zvýšenou nad pozadí. Hladina CAT aktivity indukované H19 promotorem se pohybovala od pětinásobku v HT-1376 buněčné linií do desetinásobku v buněčné linii UM-UC3. Přítomnost H19 enhanderu v konstruktech obsahujících H19 promotor/CAT reportérový gen dále zvýšila hladinu exprese v některých buněčných liniích. Například v liniích EJ28, T24P a 1197 enhancer H19 významně zvyšuje expresi konstruktu H19 promotor/CAT reportérový gen, Orientace enhanceru však dala v různých buněčných liniích odlišné výsledky. V buněčných liniích HT-1736 a UM-UC-3 pak enhancer měl na expresi malý nebo žádný účinek.
Výsledky ukázaly, že lidský H19 promotor aktivuje expresi funkčně spojeného heterologního reportérového genu v širokém spektru buněčných linií odvozených z karcinomu močového měchýře. V některých z těchto linií může expresi reportérového genu pod kontrolou H19 promotoru ještě dále zvýšit H19 enhancer.
Gen toxinu pod kontrolou H19 regulačních sekvencí
Materiály a metody
Expresní konstrukty popsané shora v části 6 se modifikovaly tak, aby místo CAT exprimovaly toxický produkt nebo prekurzor toxického produktu. Použitím standardních klonovacích postupů, jež jsou dobře známy v oboru, se například odstranily sekvence kódující produkt genu CAT a nahradily se sekvencí kódující thymidinkinázu viru herpes simplex (HSV-TK).
Expresní plazmidy Hl/HSV-TK se transfekují do buněčných linií odvozených z karcinomu močového měchýře jak bylo popsáno v části 6. Po transfekci do linií rakovinných buněk močo
-14CZ 294694 B6 vého měchýře, expresní plazmid H19/HSV-TK indukuje v přítomnosti gancicloviru cytotoxicitu specifickou pro rakovinné buňky močového měchýře.
Exprese H19 v myším modelu indukovaného karcinomu močového měchýře
Materiály a metody
Sedmdesát samic myší kmene C3H/HE (Charles River), 5 týdnů starých, bylo umístěno po 6 v klecích a ponecháno, aby se adaptovaly na klimatizovanou místnost s 12 hodinovým cyklem světlo/tma. Pokus byl zahájen v 8 týdnech věku, kdy byly myši náhodně rozděleny do kontrolní (10 myší) a experimentální (60 myší) skupiny. Experimentální skupina dostávala k pití ad libitum vodu obsahující 0,05% N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamin (BBM) (Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd., Tokyo, Japonsko). Myši kontrolní skupiny dostávaly vodovodní vodu. Zvířata z obou skupin byla po 4, 8, 12, 16, 20 a 26 týdnech od začátku experimentu usmrcena a jejich močové měchýře byly standardním postupem vyříznuty, fixovány a zality do parafinu.
Příprava sondy
2,1 kb fragmentu obsahující kódující oblast myšího H19 byl subklonován do plazmidu pBluescript II KS (Stratagene, La Jolla, CA) za vazebná místa pro T7 a T3 RNA polymerasu. Po štěpení plazmidu enzymem HindlII, byla z linearizované plazmidové DNA in vitro připravena s použitím T7 RNA polymerasy (Boehringer Mannheim) a Amersham RPN 2006 soupravy [35S]-značená antisense H19 RNA. Takto připravený traskript měl specifickou aktivitu 107 cpm/pg. Jako kontrolní sonda byla z EcoRI-linearizovaného templátu a s použitím T3 RNA polymerasy (Boehringer Mannheim) připravena sense H19 RNA.
In šitu hybridizace
Parafinové řezy (5μηι) tkání fixovaných formalinem byla přichyceny na mikroskopická podložní skla potažená 3-aminopropyltriethoxylanem (Tespa, Sigma) a vysušeny přes noc při 37 °C. Řezy byly zbaveny parafinu xylenem, fixovány 4% paraformaldehydem a poté enzymaticky opracovány proteinasou K (Sigma). Skla byla acetylována, aby se snížila nespecifická vazba sondy, a nakonec dehydratována promytím vzestupnou ethanolovou řadou.
[35S]-značené RNA sondy (o aktivitě 50 000 cpm/μΐ) byly hybridizovány jak popisuje Rangini et al., 1991, Mech. Dev. 35:13-24, s vynecháním thio-AMP kroku. Skla byla přiložena k filmu na 10 dnů a poté vybarvena hematoxylinem a eosinem. Skla byla prohlížena a fotografována pod mikroskopem Polyvar (Reichert Jung) ve světlém a tmavém poli. Kontroly zahrnovaly hybridizaci se sense RNA sondou a předhybridizační působení RNAsou. Vedle toho sloužily jako negativní kontroly řezy močových měchýřů z dospělých zdravých myší (které neexprimují H19) a jako pozitivní kontroly řezy z myších embryonálních močových měchýřů (které exprimují H19).
Výsledky a diskuse
Do 26 týdnů se u všech přežívajících myší experimentální skupiny vytvořily pohmatem zjistitelné nádory močového měchýře. V těchto chemicky indukovaných nádorech močového měchýře byla pozorována vysoká exprese H19. Naproti tomu žádná exprese H19 nebyla detegována v normálních dospělých močových měchýřích. Uvedený myší model chemicky indukované rakoviny močového měchýře tedy může být použit jako zvířecí model k průkazu nádorově specifické in vivo cytotoxicity genových konstruktů obsahujících regulační oblasti H19 funkčně spojené s genem toxinu.
- 15CZ 294694 B6
Genová terapie využívající H19 regulačních sekvencí k expresi heterologního genu v myším modelu karcinomu močového měchýře
Plazmidy exprimující H19/toxin nebo H19/prekurzor toxinu se pro in vivo vnesení do myšího močového měchýře zabudují do liposomů jak popisují Takashita et al., 1993, J. Clin. Invert. 93:652-651 (zahrnuto zde odkazem). Myší pro tento experiment mají chemicky indukované nádory močového měchýře jak popsáno shora v části 8.
Ve stručnosti, 50 pg plazmidové DNA rozpuštěné v 500 μΐ Optimenova bezsérového média (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) se přidalo k 250 μΐ Lipofectaminu a 250 μΐ vody. Směs se inkubovala 30 min při pokojové teplotě a pak se zředila v 10 ml vyváženého roztoku soli (BSS(-): 140 mM NaCl, 5,4 mM KC1, lOmM Tris-HCl, pH 7,6). Roztok se centrifugoval (30 min, 15 000 ot/min) a peleta obsahující liposomy resuspendovala v 1 ml BSS(-) obsahujícím 1 mM CaCh- Myším s chemicky indukovanými nádory močového měchýře se pomocí katétru podalo přibližně 0,2 ml koncentrovaných liposomů. Kontrolní skupina myší s nádory močového měchýře obdržela liposomy bez DNA nebo s konstruktem, který pod kontrolou H19 regulačních sekvencí nesl irelevantní gen. V definovaných časových bodech byly myši z každé skupiny obětovány a močové měchýře vyříznuty, fixovány a zality do parafinu standardními postupy. Střídající se řezy byly zpracovány pro in šitu hybridizaci, při které byla použita buď H19 sonda, popsaná shora nebo sonda specifická pro kódující sekvenci genu toxinu z Pseudomonas. Kontrolní a experimentální skupiny byly kromě toho porovnány z hlediska velikosti, počtu a nekrosy nádorů. V nádorech močového měchýře myší z experimentální skupiny byla prokázána kolokalizace exprese toxinu Pseudomonas a H19. Kromě toho byly nádory močového měchýře myší experimentální skupiny menší a nekrotické ve srovnání s nádory myší kontrolní skupiny.
H19 promotor a IGF-2 promotor s H19 enhancerem napomáhají expresi heterologního genu
Materiály a metody
Čtyři luciferasové vektory, pGL3-Basic, pGL3-Promoter, pGL-Enhancer a pGL3-Control, byly získány od firmy Promega. Tyto vektory byly transfekovány do buněk s použitím řady různých transfekčních reagencií zahrnujících lipofetamin (Gibco/BRL), fugene (Boehringer), Perfect Transfection Kit s 8 různými lipidickými činidly (Invitrogen), TFX-10, TFX-20 transfast (Promega) a kalcium fosfátový postup (Gorman et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051).
H19 promotor klonovaný do EcoRV místa plazmidu pBluescript II SK (pbhl9p#l) je popsán v části 6.1, supra. H19 promotor byl vyštěpen restrikčními enzymy Smál a HindlII a výsledný 0,9 kb fragment byl vnesen do Smal-HindlII míst vektoru pGL3-Basic za vzniku konstruktu Luc-pbhl9.
H19 promotorová oblast pokrývající nukleotidy -818 až +14 byla amplifikována z plazmidu pbhl9p#l pomocí PCR spoužitím primerů 5-ATATGGTACCGACAACCCTCACCAAAG-3' (horní, SEQ ID NO:8) a 5'-ATATAAGCTTCTTCTCCCTCACCCTGCTC-3' (spodní SEQ ID NO:9). Výsledný PCR produkt byl štěpen enzymy KpnI a HindlII a ligován do KpnlHindlII míst vektoru pGL3-Basic za vzniku konstruktu Luc-PBH19. Tento H19 promotor získaný pomocí PCR byl sekvenován z obou řetězců na automatickém sekvenátoru (ABT Prism 377 DNA Sequencer, Perkin Elmer). Nukleotidová sekvence H19 promotoru (SEQ ID NO:2), který byl generován pomocí PCR, je ukázána na Obr. 5.
kb spodní H19 enhancer, popsaný v části 6 shora, byl štěpen enzymem BamHI za vzniku dvou fragmentů o velikosti 4,lkb a 0,9 kb na 3' konci. Insercí 0,9 kb BamHI fragmentu H19 enhanceru do BamHI místa plazmidu Luc-PBH19 vznikl konstrukt LUC-PBH19-0,9EH19 a insercí 4,1 kb BamHI fragmentu H19 enhanceru do BamHI místa plazmidu Luc-PBH19 vznikl konstrukt Luc
- 16CZ 294694 B6
PBH19-4EH19. Enhancerové sekvence byly tímto klonováním umístěny pod sekvencí H19 promotor/luciferasový gen směrem k 3' konci.
BamHI enhancerový fragment o velikosti 0,9 kb byl ligován do BamHI místa vektoru pGL-Basic za vzniku vektoru Luc-0,9EH19. Z plazmidu pbhl9p#l byl enzymy KpnI a BamHI vyštěpen H19 promotor a poté ligován do Kpnl-BglII míst konstruktu Luc-0,9EH19, čímž vznikl expresní konstrukt Luc-pbhl9-0,9EH19, který obsahoval promotor popsaný v části 6 shora a 0,9 kb enhancer umístěný pod H19/Luc reportérovým genem.
Expresní vektory označené Hup-1, Hup-2, Hup-3 a Hup-4, které obsahují luciferasový gen pod kontrolou lidského IGF-2 promotoru Pí, resp. P2, resp. P3, resp. P4, byly konstruovány jak je popsáno v Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9. Z konstruktu Hufr4 byla pomocí primerů 5-ACAGGTACCTCTAGAGTCGACCT-3' (horní SEQ ID NO: 10) a 5-ATATAAGCTTGCTCCCATCCTGCA-3' (spodní, SEQ ID NO:11) amplifíkována 512 bp oblast promotoru P4. Výsledný PCR produkt byl štěpen enzymy KpnI a HindlII a ligován do KpnI-HindlII míst vektoru pGL3-Basic nesoucím reportérový gen, za vzniku vektoru Luc-P4.
Rovněž byly připraveny expresní vektory obsahující IGF-2 P4 promotor a H19 enhancer. Enhancerový 2 kb BamHI fragment odvozený z 4,1 kb fragmentu popsaného výše, byl klonován do BamHI místa konstruktu Luc-P4, čímž vznikl expresní vektor Luc-P4-2EH19.
Sekvence H19 enhancerových 0,9 kg, 2 kb a 4,1 kb fragmentů byly určeny automatickým DNA sekvenováním. Nukleotidová sekvence 0,9 kb enhanceru je ukázána na Obr. 6 (SEQ ID NO:3). Nukleotidová sekvence 2 kb enhanceru je ukázáno na Obr. 7A a 7B (SEQ ID NO: 4). Nukleotidová sekvence 4,1 kb enhanceru je ukázána na Obr. 8A-8C (SEQ ID NO:5).
Výsledky a diskuse
K zavedení čtyř vektorů obsahujících luciferásový gen do buněčných linií bylo použito několika transfekčních protokolů, přičemž u většiny buněčných linií poskytl nejvyšší účinnost transfekce postup využívající kalcium fosfátový precipitát. Proto byl tento postup použít při následných transfekcích různých expresních vektorů. Navíc, zvyšování koncentrace plazmidové DNA nesnižovalo transfekční účinnost ani v koncentracích přesahujících plato.
Buněčná linie 5637 karcinomu močového měchýře, buněčná linie Huh7 hepatocelulárního karcinomu (HCC) a buněčná linie 293T ledvinového nádoru byla každá transfekována různými konstrukty obsahujícími luciferasový reportérový gen pod kontrolou promotoru H19 nebo IGF-2 P4 v kombinaci s H19 enhancerem.
Buňky transfekované plazmidy Luc-phl9 a Luc-PH19, které obsahují reportérový gen aH19 promotor, vykazovaly zvýšenou genovou expresi nad pozadí (Obr. 9A-9C). Konstrukt LucPH19 obsahující promotor získaný PCR amplifikací měl ve všech testovaných buněčných liniích vyšší aktivitu než konstrukt Luc-phl9. Přidání 0,9 kb H19 enhancerového fragmentu do LucPH19 vektoru (Luc-pH19-0,9EH19) zvýšilo dále dvakrát, resp. čtyřikrát hladinu exprese v buněčných liniích 5637 a 293 T.
IGF-2 P4 promotor rovněž zvýšil ve všech buněčných liniích expresi luciferasy nad pozadí. Přidání 2 kb H19 enhancerového fragmentu do Luc-P4 expresního vektoru vedlo k zvýšení P4 promotorové aktivity. Hladina indukce luciferasové aktivity 2 kb enhancerovým fragmentem se pohybovala v rozmezí dvojnásobku pro buněčnou linii 293T až šestinásobku pro buněčnou linii Huh7, zatímco v buněčné linii 5637 bylo zvýšení promotorové aktivity účinkem enhanceru pouze marginální.
Obrázek 10A-10E ukazuje expresi z konstruktu Luc-phl9-4EH19, který obsahuje jak H19 promotor získaný pomocí PCR amplifíkace, tak 4,1 kb H19 enhancerový fragment. Enhancer
- 17CZ 294694 B6 výrazně zvyšuje aktivitu promotoru, a to v rozmezí 3 až 28 krát podle buněčné linie, s výjimkou buněčné linie 5637.
Uložení klonu
Následující plazmid byl deponován u Američan type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, v souladu s podmínkami Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložených mikroorganismů pro účely patentového zařízení:
Klon ATCC přírůstek číslo Datum uložení pH19EH19 209322 2. října 1997
Ekvivalenty
Předchozí písemná specifikace postačuje, aby osoba zběhlá v oboru mohla provádět vynález. Různé modifikace shora popsaných způsobů provádění vynálezu, které jsou zřejmé osobám zběh15 lým v oboru molekulární biologie, medicíny a příbuzných oborů, spadají do rozsahu následujících nároků.
Všechny publikace zde citované jsou zahrnuty v úplnosti odkazem.
-18CZ 294694 B6
SEZNAM SEKVENCÍ <110=· Yissia Rasearch Deve2.cp-sr.o Ccn=:any co Tíze Hahrew University of leousaleir.
<12 0> MSTHODS AND COMPOSITSONS FCF. INDUCXNG TUMOF.TS=ECXFXC CYTQTCXSCxTY <X30> 9457-0014-223 <140> FCT/2158/00436 <141> 1998-10-04 <150=· US 09/155,240 <151=» 1998-10-01 <150=> US 08/543,608 <1S1> 1997-1Q-03 <l = 0> 11 <2 70> FastSSQ í=r Wintsws v=osior. 3.0 <210> 1 <211> 830 <212> DNA.
<213 > H=-.= sapier.
<400> 1 r:Ljc=7cjc:= coaaoaaooo zrsicaaacc zzs.a.^=zz^z gaoogacgga cooacagcgg50 ggagoogaaa c:;?:ííc;c oooaooooao cz::aac=c: gwgacccsc120
9099====== gagagorogo 93=9=====0 ε.ζζ=ζζζ·=ζζ agoagagtgc gocogcgagc190 cg=as9=a=a goooggoaac 3===9=^=== cacaoaggaa agoggcogcg aatcejaccc240 gggogcccag 099==9=999 ga===-g=== ====gaaao= goggogacga gcacaaccoc300 cjt:aa:z=9 a===95---= 900=999=99 009903009= jczcaccagg 999===9=99350 cacma=:c ==co====ag cac===ao== coaoocoooa ggaac==gag g=o=gagc=g420
09329===== a==aa===s= 000029=9== aooogagooo c=a=99ac== 9=39=099==420 cooagooaog tgoaaagoat 909=3999=9 00=90399=3· gggagoagca ggoatggtgo540 coooogaggg gagacagogg ooogggaggg agaggtcoog gacootgagg gaggtgatgg600 ggcaatg==c agcoo===o= 0=993=9==^ aacgaggggo gcggggaggc 09=====993660
933====399 3=999=9=09 gg==agagag 3=90909=09 gaac=gtcca 999099399=720 gggcooogtg cgggcootcg 993=9===== gotoogacog googgoaggg caggggcggg730 aa=”ogg== ggcoacoooa gooacaaaaa gcoogggcoa ggacogagga830 <2L0> 2 <21i> 833 <212> DNA <213 > H=-= sapier.
<400> 2 gacaacoctc a==aag==co 3399=99=93 agocgsaaco 09=039=00= caotocacoo gag=====ga =9=0900=30 c====g=cag ccggcaacat ===9=0=003 gaosggaaag
0=93=993=0 ==33=09=99 tagagogcgo tggctgcgaa cacagcgggg -gc===acgc cogcgagcog 099930=99= =990=99999 gggcctggga taagcacagc gtgctcagcg
120
180
240
- 19CZ 294694 B6 gccgrgggga ccecacagca caaggggccc caaagtacgc gacagzggcc cccgaccccg cgxgcccrgga gccc-cggga gcoaccceag c-cccjccíxs ccccacccct tctgtgccat gcagggcgcc cgggacggag c-acgccaaac gagagagacg gggccczgoc a tcagaaaaag cggaaaccgc ggcaccgagc: ac-c-csagg cc^a«zcc*c ggcaggcagg aactscx^c gaggggcgcg tcrccrcxccraa czgaczggcc ggcgacgagc ccacsaggcg aacgcgagaz agggacccgc cagcagcagg caagagggag gggaggccgc ctrčtccacgg ggcacggccag caccgaggag
aacgcccagc
ctccaggacg cxatggagaa ccgaggtggg gggcgggaat cagggagagg
gag
300
360
420
5 C
540
600 cóO 720 780
833
| <210 > | 3 |
| <211> | 877 |
| <212> | DNA |
| <213* | Hcrao sapíen |
<400> 3 caaggacatg gaatttccgga ccttcctrg-cc ccaccctc— ts-cteaccat: accaacctcgagcagcagg aaggecxxgg gcctcagagcc tagaaaegga c===čacgtc cáčetgccca ccszagaccc ccagcattga aggg”ggtca gaczzcccg- cacacgaagc caccaagcgg gacggacacc atcgcccaco ccacccggcc cagcacagcc csgcsaagx:; cagcccagsc cagcccagcc czgcccw.zcc ccízzgzc cagcczagcz c^cccccgcc ctacccsccc caccccagac ccgccczgca cagcacagac cagcccaccc ccgcecxgcc ccgccccgcc c----ca-·— CvCac--.cc cagccccgcc cagcccagc- caizcctjcc ciaccsaccc ccgcccagc- cagccotgcc caccccagca cagcccajcc cagcacgčga cczczggaig czgagcracag gcc^gacccx agaaagaggc tggcaacgag ggcagaggcc accaggccac **7 ** 'w·'—C« χί 22 2Ϊ NwSOSC <κ..3.£Γκ»» Z Z S-OttC* ZZZ^TZZZZOZ Ζ™ί*τ***ρ £>«ζ*>,·»»>.,··£^··· .·· a==g=cagca tgczgzggaa gcgcazggcc -oagggct™ tčgc-cčagg ctgccčccgč cszz=zzzzz gaggccaccc czzzz^z=zz azgaaccptg zgccacraccc accccagacrc tgrca=cg== cctcgcogcct gcacoxzatg agcagcc=c= zzzzzzzzzz szzzzzzzzZ cagcaaggaa ggggagcacg aaz-acrgca cccccca-
120
130
240
300
380
420
480
540
800
680
720
7S0 = 40 <2L0> 4 <211> 2.3SQ <212> DNA <213 > Hc“o sapies <400> 4 ecgggcaccg tccgagcaca aaca—ggggg tccscccaag agacczgagc tgcggtcagc gcgcccagpc cgc-cecsgg CG*'»·» *~»g hÍ C w*?** cagaggczcc c c x i» g * σ 3 c ccgczccatxc cgcgggcczg agcagzgggz ggcz^gcagg agczcccagg aagatxaaacg žtzccc.ccz' czctxagaga“ cagagccaac cgagcagccg gzcegggcgg gggccczccz ccacgagozc agcccczcaa cczggacccc ggctgggxcc tggqacagcx cccc^gicgat tzcagatggg cgcgcacggg tgcg-gcgtcg rgcgcg-jgcg tgzgacgacc gacaagcacc ggagazcttg tgaczcccsa aaaggggga: cggaaggtcc cccgctctcc ceeaaggcag Sggcaaccac acxaggcaca cczcczílccz zcctxccgccc czcccczzzc fccttxcxccc cczgctccog ttccsgaaag C ««7 C CT «32? C ** C Z accg~gctxg acccaacacc cggccggace cecagcgccí gcacaacaag gctcgzggggg gzgacaccgx cccaccpgca gcagccgcts caaagaaagc tcggotcggaca acsaaacaca crgcxcacag ctaccaggaa acgc-gaccg tggcccccxt cctggaagca agacacxgxg cacgcgggag caagggcgcc gcacgtgcca ggggcxccac ígggccccac csagggctga czgggaaggg gtcgctgxgg cxccxigxccc gccgggtcccg aggcacpgea agcccctagg ggcggacccc gesgcagaaa cagggaatgg tgcgcgtgxg agagagccaa gagaaagagc gcacaggcca ccczctaccc gggaagccag gccgctcscg gcatctccegtc tsagggagcc cggggagcgg ggctcctccc ccaggaggec cggggagaag atcggnagca
120
330
240
300
360
420
430
540
600
660
720
730
840
900
960
1020
-20CZ 294694 B6 c=5955=5=5 agg====gga acagagzggg cczacaccs: =gggacagag cacaggaagc 9==5=5555= c===cagg== gaggc==z=a ccaca==gg ac==5ggxac ==93==5=33 gazggacaaz =9=5=3333= cacagaczgg
3==9=993=3 95=355==5= accgagaagz cczccacccí ccagccccgg ggcacgxzca azzcgagata agcccagggz zzzgcgggag gzzccagzcg gaczccazca acaaagcccc 5==ac=5=55 aggaccgagg acgcaz^zca 5==955===5 cgccaagzzz ac:cíacca: agaaaggcgg ggczzzgzzc tcgcc==cag Zzaagagcgg aggagczzgz gcaaggccag 5=555355== c=a=c=ggg= cccaacaac“ tgzccaaagg agazggacaa ========== czcacgcacg gcgggaagga czgaggcagc g=ac===aaa ===5=3=5== tgczgzaggz ====3===== c-c=zaaggg tzzczcagzg ========== 55355=55=3 cggca===ca taazíaaggz ==cag==£== cacgaccgag gazggggcag ==aazg===g cgggcagazg azgagcaggg gczzar.aggg c===aaczgg czcczccecz aacggcczza a=acgzgg=z =g=ac==a== zgcagocgcz cctgcaeagc 3=3======= zgaazzzcac ctaaggzagc 55=5=5=555 azggacaaca 5=5=5=gagg cgcacggagg agzggagacz ctgaccccca catcaccagg ccccgggzcg gzccgcagtz cagcaggggg ==355====3 ggccscacgc gczgagcczc gtgccczgcg 5S=9a=9=c= cgacggggga ggaccgaggg c=55=gagca
2030 2240 2200 12o 0 2320 2330 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1300 1960 1920 1260 <2153 5 <211> 4085 <212> DNA <223 > Hctr.3 sapian <40C> 5 ==555=3===: =c==ag=a== aacacggggg cczccczzag “g=5=5-3-= agaczzgagz —3 - 33=—a 5 a =cgccc==z= cgczzcczgg =55555==== cagaggczcc czztgccagc cagczzcacz =5==555==5 cczcczczzg agcagzgggz 55==5==agg cggctggaag c=5=55c5=3 aggccccgga acacagtggg =czaz=Z5== cagggczgca tcagcctszc 5=555535== ggzgcagggg tczgccaczc caggagatgg gcacgcagca cacgragggc gtgacgtzzg cczcactccc =55555==== agctcccagz cagaczcaag ccaggacgzc cggcccagct =5=5=5=5=5 ggagazczzg ========== ========== c==g=zc==g =z==z=aaa=
3==5=5===5 acccaaca.cc: 555==553== cccagcgccz gcagaacaag 5==5=55555 3=5=533353 533355==5= azcgagaagz ========== azgggcaagc 355=3=55=3 ccaggaggaa acggzggcag tcagggctsz cccaczcccg ggcccacggg txcagagcag ccccgacggg cagczccggc cacgcccaca ggcaccgczg aagazaaszg 5==5=3?=5= agcczczcaa =5===5=5== =3-5=3-5-3 ==aczzz==a c==aa====g ========== g==aca==== c==a===g=a g=a====ztz caaagaaagc cggczggaca a=z=aa=a=a czgczcacag =====5=533 acgczgaccg cgccaagcct aczgcagcaz agaaaggcgg gaggcaaaca cacacgacaz ggggagacag cat=c=cc=g ==5555==5= 5555===3=3 czzggcccat ccaagzaggg 5=55=5=3=5 czccccazzg cagccagggz caccacccza attzczzzzz 3-==333=5= zgtgazgzcz aaagggggazggzaaccac ========== 55==55===g czzggaagza agazazzgzg cacgcgggac -3===g==c= ccacgzgcca 55555===35 ========3=' CZgaggcagc gcaczzcaaa ===5=3=5== 5========= gtagcczgzc acaggaggaa ggcagazggg ========3= acgczgggcz ccccaaagac =55===55== gczggcagtg ctatggaccg czgzzzaggg caccczaacz ctc=a==gaz ========== 55==555=== ===5=3=55= gacaagcccc cggaaggzzc aczaggcaza ========== ccagggczga czgggaaggg 5==5==3=33 ========== 5==5=====5 aggcxczgca ag==zzcagg 55===ac=== gzzgcagaaa acgagcaggg ====ar.ag== ===gaacc=g ========== czgagczzaz caaggagcag gagacggccc acagaggczg agcaggcagg caagggzggg azizcagaaaa cczgggagca acazcacccc agacczagcc zcccggcazc
5=555=5553 cggc=c==== cagggaazgg tg=g=g=5== agagagccaa gagaaagagc gcazaggccz ccczczaccc gggaagccag ========== g=azzc=g=z tzagggagcc =55=535=3= ========== c=asgag5C= =55=535335 ac=gg==H=c zgcazggagg agtggagacc ctgacctcca 5===55555= ggacczagcg 3gaggggg== 355=3=-3== gcgacgzgaa cccagggctc g=ggga=gag ac=55===a= cagagaggca =gtg==aaca cggzccgggc cggcatggcz g=cgc=gccc
120
130
240
00 = 0
420
430
540
600
560
720
7S0
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1250 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1S00 1860 1520 1S80
-21 CZ 294694 B6 cctctjacsg· tccccaacca gcaag-tgcgg ggccaagcac ctcctcctct z==ctzczag agagaaacgc ggaggtcczg gggtcggggg cgctcacacc cctgtgacac aggtgcazgg ggzcacgggt cczagaacgg ctcatgggaa ggaccteagc tgggccggcg cctcxacjíC tcac^sct g'=-gcacag gggacagcca ctcccagact tczgtgaagc cagcacgggc c-cccccccc tgccccgtgc tctgzccggc gcttcczgga ctgcactgcg ggccactggt Sagagggtgg acagggaagg gccgccgtgg tgccc=xz== tgcccacttg gcrgzgtggt cccczccaag tagggacaac ctttctgagg ccztgggggc accttggggt tgccaggg=c tíccacaccc czgtgagcac c-=sggg=^c tggcctgatg cccccctcca cgzctacgg- cggezgzggc ccagaaczcc agcttcczag caggccggzg cgcggtggcg acscaggaga ggcczzgccz ccaczgaggg gccaccgact tczgzcagac cacagagaec cccaaggagt czgaaggctg gagacccggg gccgccacca ggtgggactt ttccacggag ccgtccccag gcccagctgg ggacacgttc cccstctcte cagacacaec czgcctgčca ccaggaeaca ccggcctgzt gggggtctct tztaagtgzt tgccactezg aggzgactgt cccrtzccaa agaggzttct ggggcccagg tgggatgcgz cggcccgagc aggaggatzcz cggccgczag gggczgggga czgtztcctg gggaacgaag cgcczgggag cgcgtgtgcz gaczcaggác catccaggga cgcccgcctg tggggeaagc ggjaagggag cggctggaga ggcttggecg cztczgccct gcctcccatt c=ttag=zc= atgcacgtca aectctgxca cccagtgagt gatgzctagg ggccttggaa aggtzacagc atgttzgagc csáaz$a.aa£ agaggggaaa ggcgggggcg gggaaaagza cgtggaggaa gztztaggcz caaggaagga cacaccjítzc· agggagggag ggagccactg gggtcgczgg gaaggzectz gcttgctgct cczaczcaga accczcgtcz cztaczzagc cctegcagcc ctagcczztc tggcnzgtgg ccílccccí: cazcczcagg tgtctzgzzc aaccaggczc tggacccaaa ccctcczgcc ccjuact::: cczcctzacz ctzzcaatgc agtggzcazc agcccggzzc tgzcctgccg caggzcccct czczzcatta czaggtczag agzizztagz cccggzggct czcagcccga cggzgaacgg cczzactctg ggtegtggga cagagggcac gztcazcaag agtggctccc aagggaca-g tggczgtzzg cagzzzacag gaagzatzcg agataaggag cttgtzztcc cagzgggeac ggagzzagca ggggggztgz ggggzagccc acggtgcaag gccaggczgz ggggczgcag czgczttggg c::;acc=cz aggcctztgc cggaggzggg aggcgggagg cggzagctgz acagtggzcz caggzgaggc tczzagcccc ag-cgczzzc cgggtgggca gc-caagagg gzztggczga gcctcccati ottgggaczc catcacczaa caacttaatt aaggccgaaz zzcacgzgzc czgtgacctg ggzacacaaa gczzccgzcc aaaggggcag ccagcczaag gcagzggcga cggcgtgggz Sš=£=g=ga= cggggagazg gacaacagga czgagggzgt gtgggcgazg ggggagatgg acaacaggaa cgagggzgzg cgggcgatgg gggagatgga caazaggacc gagggtgtgc gggacacgca tgtcactzaz gcacgecaat ggggggcgzg ggaggccggg cagcagacag atzgggctgg gctgggcggg aaggacgggc aga tg
2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2320 2S3O 2340 2700 2760 2920 2980 2940 3000 3060 3120 3130 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 366C 3720 3730
54 0 3900 3990
020 4080 4095 <210? 6 <211? 22 <212> DNA <213 > Hcir.o sapien <400> 6 cggttcccca cztccccagt tt <210> 7 <211? 33 <212? DNA <213? Hoxc sapien <400? 7 cggaagtaga caaccctaac caaaggzzaa cgt <210? 8 <211? 27 <212? DNA
-22CZ 294694 B6 <213> Hcrac sanien <4G0> S acatcj-acc gacaacccts accaaag 27 <21Q> 9 <2X1> 29 <212> DMA <213 > Herno sapien <400? 9 aCataaceet cetcrcocee accceccec 29 <210? 10 <211> 23 <212> DNA <213> Herno sapien <400? 10 acajílacsn czacageeea ccc <210> 11 .
<211> 24 <212> DNA <213 > Horné sapien <400? 11 atacaace“ ccrcccaecc ccca
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (24)
1. Polynukleotid, obsahující regulační sekvenci H19 funkčně spojenou s heterologní sekvencí, jež kóduje cytotoxický genový produkt, pro použití pro expresi heterologní sekvence v nádorové buňce.
2. Polynukleotid podle nároku 1, kde H19 regulační sekvence je zvolena ze skupiny H19 promotor, H19 enhancer, nebo H19 promotor i H19 enhancer.
3. Polynukleotid podle nároku 1, kde heterologní sekvence je vybrána ze skupiny sestávající z kódujících sekvencí pro β-galaktosidasu, difterický toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, gen retinoblastomu, p53, thymidinkinázu viru herpes simplex, thymidinkinázu viru varicella zoster, cytosindeaminasu, nitroreduktasu, cytochrom p-450 2B1, thymidinfosforylasu, purinnukleosidfosforylasu, alkalickou fosfatasu, karboxypeptidasu A a G2, linamarasu, β-laktamasu a xanthinoxidasu.
4. Polynukleotid podle nároku 1, kde heterologní sekvence je antisense sekvence, jež specificky hybridizuje k sekvenci kódující gen vybraný ze skupiny zahrnující cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyklinDl, cyclinE, cyclinA, cdk4, onkogenní formy p53, c-fos, c-jun, Kr-ras a Her2/neu.
5. Polynukleotid podle nároku 1, kde heterologní sekvence kóduje ribozym, který specificky štěpí RNA kódovanou genem vybraným ze skupiny zahrnující cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyclinE, cyclinA, cdk4, onkogenní formy p53, c-fos, c-jun, Kr-ras a Her2/neu.
-23 CZ 294694 B6
6. Polynukleotid podle nároku 2, kde H19 promotor zahrnuje nukleotidy 1 až 830 sekvence SEQ ID NO:1.
7. Polynukleotid podle nároku 2, kde H19 promotor zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:2.
8. Polynukleotid podle nároku 2, kde H19 enhancer zahrnuje sekvenci H19 enhanceru klonovaného v plazmidů pH19EH19 uloženém pod č. 209322 a ATCC.
9. Polynukleotid podle nároku 2, kde H19 enhacer zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:3.
10. Polynukleotid podle nároku 2, kde H19 enhancer zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:4.
11. Polynukleotid podle nároku 2, kde H19 enhancer zahrnuje sekvenci SEQ ID NO:5.
12. Polynukleotid podle nároku 2, kde umístění H19 enhanceru je 3' vzhledem kheterologní sekvenci.
13. Vektor pro expresi sekvence v nádorové buňce, kde vektor obsahuje polynukleotid, podle nároku 1.
14. Vektor podle nároku 13, kde H19 regulační sekvence zahrnují H19 promotor a H19 enhancer a heterologní sekvence kóduje protein vybraný ze skupiny zahrnující β-galaktosidasu, difterický toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, gen retinoblastomu, p53, thymidinkinázu viru herpes simplex, thymidinkinázu viru varicella zoster, cytosindeaminasu, nitroreduktasu, cytochrom p-450 2B1, thymidinfosforylasu, purinnukleosidfosforylasu, alkalickou fosfatasu, karboxypeptidasu A a G2, linamarasu, β-laktamasu a xanthinoxidasu.
15. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 14.
16. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a jako účinnou složku polynukleotid podle některého z nároků 1 až 12.
17. Farmaceutický prostředek podle nároku 16, vy z n a č uj í c í se tím, že cytotoxický genový produkt je vybrán ze skupiny zahrnující difterický toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, gen retinoblastomu a p53.
18. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a jako účinnou složku vektor podle nároku 13 nebo 14.
19. Použití polynukleotidu podle některého z nároků 1 až 12 pro výrobu farmaceutického prostředku pro expresi sekvence v rakovinné buňce.
20. Použití vektoru podle některého z nároků 13 a 14 pro výrobu farmaceutického prostředku pro expresi sekvence v rakovinné buňce.
21. Použití podle některého z nároku 19 nebo 20, kde nádorová buňka je v pacientovi.
22. Použití podle některého z nároku 19 nebo 20, kde rakovina je vybrána ze skupiny zahrnující karcinom močového měchýře, hepatocelulární karcinom, hepatoblastom, rabdomyosarkom, karcinom vaječníku, cervikální karcinom, karcinom plic, karcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk na hlavě a krku, karcinom jícnu, karcinom štítné žlázy, astromytom, ganglioblastom aneuroblastom.
-24CZ 294694 B6
23. Použití podle nároku 22, kde nádorová buňka je buňka nádoru močového měchýře.
24. Použití podle nároku 23, kde buňka nádoru močového měchýře je vybrána ze skupiny sestávající z Ht-1376, EJ28, T24P, 1197 a Um-UC-3.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US94360897A | 1997-10-03 | 1997-10-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20001201A3 CZ20001201A3 (cs) | 2000-09-13 |
| CZ294694B6 true CZ294694B6 (cs) | 2005-02-16 |
Family
ID=25479934
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2004741A CZ294941B6 (cs) | 1997-10-03 | 1998-10-04 | Farmaceutický prostředek pro expresi heterologní sekvence v nádorové buňce a vektor |
| CZ20001201A CZ294694B6 (cs) | 1997-10-03 | 1998-10-04 | Polynukleotid, vektor, buňka a farmaceutický prostředek |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2004741A CZ294941B6 (cs) | 1997-10-03 | 1998-10-04 | Farmaceutický prostředek pro expresi heterologní sekvence v nádorové buňce a vektor |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6087164A (cs) |
| EP (1) | EP1019499B1 (cs) |
| JP (3) | JP5153031B2 (cs) |
| KR (1) | KR100524262B1 (cs) |
| CN (1) | CN1229496C (cs) |
| AT (1) | ATE407948T1 (cs) |
| AU (1) | AU755774B2 (cs) |
| BR (1) | BR9812717B1 (cs) |
| CA (1) | CA2308124C (cs) |
| CZ (2) | CZ294941B6 (cs) |
| DE (1) | DE69840001D1 (cs) |
| HU (1) | HU228470B1 (cs) |
| IL (1) | IL135430A0 (cs) |
| NO (2) | NO328470B1 (cs) |
| PL (1) | PL339949A1 (cs) |
| RU (1) | RU2214280C2 (cs) |
| WO (1) | WO1999018195A2 (cs) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040006220A1 (en) * | 2002-07-02 | 2004-01-08 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of insulin-like growth factor 2 expression |
| US7041654B2 (en) * | 1997-10-03 | 2006-05-09 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity |
| DE19956568A1 (de) * | 1999-01-30 | 2000-08-17 | Roland Kreutzer | Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens |
| EP1169480A4 (en) * | 1999-04-14 | 2005-02-02 | Musc Found For Res Dev | TISSUE-SPECIFIC AND PATHOGENIC TOXIC SUBSTANCES AND RIBOZYMES |
| DE19928342A1 (de) * | 1999-06-21 | 2000-12-28 | Deutsches Krebsforsch | Vektoren zur gentherapeutischen Tumorbehandlung |
| US7829693B2 (en) * | 1999-11-24 | 2010-11-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
| WO2002046449A2 (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | The Penn State Research Foundation | Selection of catalytic nucleic acids targeted to infectious agents |
| US8546143B2 (en) | 2001-01-09 | 2013-10-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene |
| US20040005567A1 (en) * | 2002-07-02 | 2004-01-08 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of cyclin-dependent kinase 4 expression |
| WO2003102186A1 (fr) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Medinet Co., Ltd. | Adn induisant l'expression specifique des cellules cancereuses et vecteur d'expression specifique des cellules cancereuses |
| US20040180844A1 (en) * | 2003-03-10 | 2004-09-16 | Fesik Stephen W. | Method of killing cancer cells |
| US20040219099A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-04 | Jasbir Sandhu | Method for the treatment of tumors |
| US20040220085A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-04 | Jasbir Sandhu | Compositions for nucleic acid delivery |
| US7482156B2 (en) * | 2003-10-15 | 2009-01-27 | Cell Genesys, Inc. | Hepatocellular carcinoma specific promoter and uses thereof |
| US7063947B2 (en) * | 2004-04-08 | 2006-06-20 | Promogen, Inc. | System for producing synthetic promoters |
| US7429482B2 (en) * | 2005-01-13 | 2008-09-30 | United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Screening tools for discovery of novel anabolic agents |
| AU2006267841B2 (en) | 2005-07-07 | 2011-12-15 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Nucleic acid agents for downregulating H19, and methods of using same |
| WO2007034487A1 (en) | 2005-09-22 | 2007-03-29 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Nucleic acid constructs, pharmaceutical compositions and methods of using same for treating cancer |
| ATE548454T1 (de) * | 2007-01-16 | 2012-03-15 | Yissum Res Dev Co | Nukleinsäurewirkstoffe zur stilllegung von h19 zwecks behandlung rheumatoider arthritis |
| JP2010540534A (ja) | 2007-09-28 | 2010-12-24 | イントレキソン コーポレーション | 生体治療分子の発現のための治療遺伝子スイッチ構築物およびバイオリアクター、ならびにその使用 |
| EP2203187B1 (en) * | 2007-10-25 | 2012-08-29 | Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem, Ltd. | Constructs containing multiple expression cassettes for cancer therapy |
| EP2298866A4 (en) * | 2008-07-02 | 2013-11-20 | Otsuka Pharma Co Ltd | ARTIFICIAL KIDNEY PRECURSOR AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME |
| WO2010084488A1 (en) | 2009-01-20 | 2010-07-29 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Mir-21 promoter driven targeted cancer therapy |
| EA016223B1 (ru) * | 2009-10-07 | 2012-03-30 | Учреждение Российской Академии Наук Институт Молекулярной Генетики Ран | Способ и генная конструкция для высокоспецифичного ингибирования нежелательного роста клеток |
| CN107735079A (zh) | 2015-05-05 | 2018-02-23 | 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 | 核酸‑阳离子聚合物组合物及其制备和使用方法 |
| AU2019261982A1 (en) * | 2018-04-30 | 2020-10-15 | Amicus Therapeutics, Inc. | Gene therapy constructs and methods of use |
| CN110714075B (zh) * | 2018-07-13 | 2024-05-03 | 立森印迹诊断技术（无锡）有限公司 | 一种用于检测肺肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用 |
| CN111206093A (zh) * | 2018-11-21 | 2020-05-29 | 立森印迹诊断技术（无锡）有限公司 | 一种用于检测浸润性膀胱癌的标志物及其应用 |
| CN109609505A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-04-12 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种体内筛选的剪切rna的锤头状核酶 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2699191B1 (fr) * | 1992-12-16 | 1995-02-10 | Univ Paris Curie | Nouveaux vecteurs rétroviraux, lignées cellulaires les contenant, et leur utilisation dans le traitement des tumeurs. |
| US5631236A (en) * | 1993-08-26 | 1997-05-20 | Baylor College Of Medicine | Gene therapy for solid tumors, using a DNA sequence encoding HSV-Tk or VZV-Tk |
| IL108879A (en) * | 1994-03-07 | 2000-08-31 | Yissum Res Dev Co | Diagnostic assay for malignancies using the H19 gene and kit |
| FR2723697B1 (fr) * | 1994-08-17 | 1996-09-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de traitement de la restenose par la therapie genique |
| FR2725213B1 (fr) * | 1994-10-04 | 1996-11-08 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique |
-
1998
- 1998-10-01 US US09/165,240 patent/US6087164A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 WO PCT/IL1998/000486 patent/WO1999018195A2/en active IP Right Grant
- 1998-10-04 CN CNB988118335A patent/CN1229496C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 KR KR10-2000-7003609A patent/KR100524262B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-10-04 BR BRPI9812717-9A patent/BR9812717B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-10-04 DE DE69840001T patent/DE69840001D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 PL PL98339949A patent/PL339949A1/xx unknown
- 1998-10-04 HU HU0003745A patent/HU228470B1/hu unknown
- 1998-10-04 EP EP98947759A patent/EP1019499B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 IL IL13543098A patent/IL135430A0/xx active IP Right Grant
- 1998-10-04 JP JP2000514993A patent/JP5153031B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 CA CA002308124A patent/CA2308124C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-04 CZ CZ2004741A patent/CZ294941B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-10-04 CZ CZ20001201A patent/CZ294694B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-10-04 AT AT98947759T patent/ATE407948T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-10-04 AU AU94571/98A patent/AU755774B2/en not_active Expired
- 1998-10-04 RU RU2000111553/14A patent/RU2214280C2/ru active
-
2000
- 2000-03-31 NO NO20001684A patent/NO328470B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-05-10 US US09/568,059 patent/US6306833B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-05-24 JP JP2006144648A patent/JP2006304801A/ja not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-10-18 JP JP2007270777A patent/JP2008136480A/ja active Pending
-
2009
- 2009-10-22 NO NO20093194A patent/NO331723B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ294694B6 (cs) | Polynukleotid, vektor, buňka a farmaceutický prostředek | |
| Pass et al. | Inhibition of hamster mesothelioma tumorigenesis by an antisense expression plasmid to the insulin-like growth factor-1 receptor | |
| WO1999028469A1 (en) | Compositions and methods for inducing gene expression | |
| US20110257250A1 (en) | Treating Insulin Secreting Cells | |
| KR20080036015A (ko) | 글루코오스 유도성 인슐린 발현 및 당뇨병 치료 방법 | |
| EP0943003B1 (en) | Insulin-like growth factor i (igf-i) expression system and methods of use | |
| US7041654B2 (en) | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity | |
| WO2017087828A1 (en) | Method to modulate smooth muscle cell differentiation | |
| EP0999278B1 (en) | Vascular specific regulatory elements contained in the desmin 5' flanking region | |
| Zhang et al. | Generation of ribozyme-adenoviral vector against K-ras mutant human lung cancer cells | |
| WO2009026445A2 (en) | Methods and compositions for post-transcriptional gene silencing | |
| WO1999050411A2 (en) | Tumour-specific expression control region and the use thereof | |
| IL135430A (en) | Use of a polynucleotide capable of expressing a cytotoxic gene product in the production of a pharmaceutical composition for treating tumors | |
| MXPA00003251A (en) | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity | |
| WO2000036919A1 (en) | Bone sialoprotein based toxic gene therapy for the treatment of calcified tumors and tissues | |
| US20020152486A1 (en) | Vascular specific regulatory elements contained in the desmin 5' flanking region | |
| AU2002343189A1 (en) | Methods and compositions for inducing tumor-specific cytotoxicity | |
| WO2003006621A2 (en) | Super osteocalcin promoter for the treatment of calcified tumors and tissues |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20181004 |