ES2907684T3 - Método de tratamiento genético utilizando el virus AAV-XBP1s/GFP y utilización del mismo en la prevención y el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica - Google Patents

Abstract

La presente invención presenta el método y uso del virus AAV- XBP1 s/GFP, en la prevención y tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, tal como se presenta en los estudios ¡n vivo en la figura 6/9.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de tratamiento genético utilizando el virus AAV-XBPIs/GFP y utilización del mismo en la prevención y el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica

Campo técnico de esta invención

Esta invención tiene aplicación en el campo de la medicina, concretamente en la prevención y el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, preferentemente la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), mediante el uso de virus adenoasociados (VAA) que sobreexpresan el factor de transcripción XBP1s en las neuronas del sistema nervioso central (SNC), preferentemente en las motoneuronas y en la médula espinal, lo que mejora la capacidad de adaptación de las neuronas y previene el desarrollo de la ELA.

Antecedentes y descripción del estado de la técnica

La investigación científica sobre las enfermedades del sistema nervioso central ha sido de gran interés en los últimos años, sobre todo las enfermedades relacionadas con las alteraciones motoras. En la actualidad, el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la motricidad no cuenta con estrategias terapéuticas genéticas que hagan disminuir los síntomas.

Una de las enfermedades neurodegenerativas motoras más características es la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Esta enfermedad progresiva afecta a las células nerviosas motoras del cerebro y de la médula espinal, lo que conduce a la parálisis y la muerte. El plegamiento erróneo y la agregación de la proteína superóxido dismutasa 1 (SOD1) están asociados a la aparición de formas esporádicas y familiares de la ELA. Aunque el principal mecanismo responsable de la pérdida progresiva de motoneuronas en la ELA sigue sin conocerse, los últimos resultados destacan la contribución de las alteraciones de la proteostasis o del equilibrio proteico a nivel de cantidad y calidad en el proceso de la enfermedad. Uno de los eventos detectados en una etapa presintomática temprana de la ELA en los modelos de ratón es la presencia de proteínas de respuesta al estrés en el retículo endoplásmico (RE) de las motoneuronas secundarias.

El estrés en el retículo endoplásmico (RE) se ve amortiguado por la activación de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR), una red de señalización homeostática que orquesta la recuperación de la función del orgánulo. Por otro lado, la falta de adaptación al estrés del RE da como resultado la disfunción neuronal y la apoptosis. La señalización de la UPR se basa en la regulación/activación de tres factores de transcripción principales conocidos como proteína de fijación a X-box 1 (XBP1), un factor que activa el factor de transcripción 6 (ATF6) y el factor de transcripción 4 (ATF4). Juntos, XBP1s, ATF6 y ATF4 permiten la adaptación al estrés o, en el caso del ATF4, la eliminación de las células que han sido dañadas irreversiblemente por la apoptosis.

Las terapias farmacológicas y genéticas que existen en la actualidad están dirigidas principalmente a la capacidad de adaptación celular para restaurar la proteostasis del retículo endoplásmico (RE) a través de la expresión de genes de la UPR. Estos estudios se han llevado a cabo en modelos preclínicos de enfermedades neurodegenerativas con resultados satisfactorios.

La terapia génica con virus recombinantes se está utilizando en nuestro laboratorio como una estrategia atractiva para administrar los componentes de la UPR activa en áreas específicas del cerebro. Este método también puede evitar los posibles efectos pleiotrópicos de la administración sistémica y crónica de compuestos con el objetivo de controlar el estrés en el RE. Los virus adenoasociados (VAA) son una de las opciones para la administración de los genes terapéuticos en el cerebro y en la médula espinal debido a su perfil de seguridad, tal y como se ha demostrado en los ensayos clínicos.

La línea de investigación y desarrollo para el tratamiento y/o la prevención de la ELA es amplia y oscila desde compuestos de tipo molécula pequeña (p. ej., derivados del 1,3-benzoatiazol, tal como el riluzol) que pueden ayudar a retrasar el tiempo hasta la ventilación asistida mediante el bloqueo de los canales de sodio sensibles a la tetrodotoxina (Rilutek™), a estrategias genéticas como el IGF-1 (factor de crecimiento insulínico de tipo 1) a través del virus VAA4 (serotipo 4 del virus adenoasociado) dado a conocer en el documento de patente europea EP 2489733 A2; o la construcción HIFl1-a (factor inducible de la hipoxia 1, subunidad a) y un virus adenoasociado general dado a conocer en el documento de patente europea EP 2497500 A1, entre otros.

Forma parte de esta patente la información contenida, en su más variada gama, en la solicitud de patente CL 3590­ 2014. La solicitud de patente mencionada anteriormente describió un VAA que contiene el XBP1s para mejorar la memoria, específicamente en las células neuronales del hipocampo, sin restringirse solo a esta secuencia específica del XBP1. Existen depósitos de material biológico del plásmido pAAV-XBP1s-HA con fecha del 5 de noviembre de 2014 en la agencia internacional de depósitos de material biológico, American Type Culture Collection (ATCC), con el número de depósito PTA-121708.

Compendio de la invención

La invención es tal como se define en las reivindicaciones.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) aparece como resultado de la pérdida de motoneuronas en el sistema nervioso central y, en consecuencia, la pérdida de la capacidad locomotora. La invención se refiere a la expresión de un nuevo gen en diferentes regiones del cerebro, pero principalmente en la corteza frontal del cerebro y en la médula espinal, donde se produce el plegamiento incorrecto y la agregación de la SOD1 y de otras proteínas. El estrés en el RE resultante de lo anterior aparece como un evento temprano en la etapa asintomática de la enfermedad. La activación endógena de la UPR mediada por el estrés en el RE es insuficiente para garantizar la protección celular, por lo que se mueren estas motoneuronas. Este mecanismo ha sido señalado como uno de los principales a la hora de corregir el funcionamiento del plegamiento de las proteínas en el RE entre muchos otros factores involucrados. En la búsqueda de los diferentes reguladores de la expresión de la UPR, el XBP1s era uno de los tres activadores funcionales identificados como componente clave de la respuesta contra las proteínas mal plegadas.

Sorprendentemente, la sobreexpresión de XBP1s en el SNC en los ratones transgénicos (como modelo animal de la ELA) mediante la administración (intracerebroventricular) directa mediada por virus consigue que aumente la supervivencia de estos modelos murinos de la ELA (al aumentar el estadio presintomático), sin atenuación de la etapa sintomática de la enfermedad.

Un hecho relevante en esta invención es el grado de homología entre la secuencia de XBP1 de los ratones y de los seres humanos, que está por encima del 75 %, preferiblemente del 83 %. La secuencia de XBP1s de los ratones y del XBP1s de los humanos se puede observar en las tablas número IV y II, respectivamente.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un vector para su uso en la prevención, el tratamiento y/o el retraso de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un mamífero, en donde el vector induce la sobreexpresión neuronal de la proteína X-Box 1 (XBP1) en el sistema nervioso central (SNC) del mamífero, y en donde el vector es un vector de tipo virus adenoasociado (VAA).

Un segundo aspecto de esta invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende un vector según se define en el primer aspecto y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para ser usado en la prevención, el tratamiento y/o el retraso de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un mamífero.

El virus induce la sobreexpresión neuronal del XBP1s en un margen de dosis de 16 a 130 unidades víricas por individuo.

La descripción que viene a continuación también presenta la secuencia del plásmido con el fragmento de ácido nucleico del virus y un inserto con una secuencia de nucleótidos descrita en la Tabla I o cualquier variante de este fragmento que codifica y sobreexpresa el factor de transcripción neuronal XBP1, preferiblemente el XBP1s humano, tal como la secuencia descrita en la tabla II.

Descripción detallada

Cabe señalar que el uso y el método, aquí, en la lista de reivindicaciones y en todo el texto, que el singular no excluye el plural, a menos que el contexto lo implique claramente. Entonces, por ejemplo, la referencia a un "uso o método", es una referencia a uno o más usos o métodos, e incluye equivalentes conocidos por los que conocen el tema (la técnica). De manera similar, como otro ejemplo, la referencia a "un paso", "una etapa" o "un método" es una referencia a uno o más pasos, etapas o métodos y puede incluir subpasos, etapas o métodos, implícitos y/o sobrevenidos.

Todas las conjunciones utilizadas deben entenderse en su sentido menos restrictivo y más inclusivo posible. Así, por ejemplo, la conjunción "o" debe entenderse en su sentido lógico ortodoxo y no como un "o excluyente", a menos que el texto lo necesite o lo indique específicamente. Las estructuras, materiales y/o elementos descritos deben entenderse referidos también a los equivalentes desde el punto de vista funcional y así se evitan las interminables enumeraciones restrictivas.

Las expresiones utilizadas para indicar las aproximaciones o las conceptualizaciones deben entenderse así, salvo que el contexto exija una interpretación diferente.

Todos los nombres y términos técnicos y/o científicos empleados aquí tienen el significado habitual que les da cualquier persona cualificada en la materia, salvo que se indique lo contrario.

Se describen los métodos, técnicas, elementos, compuestos y composiciones, aunque los métodos, técnicas, compuestos y composiciones similares y/o equivalentes a los descritos pueden usarse o preferirse en la práctica y/o en las pruebas de esta descripción.

Esta descripción describe virus adenoasociados basados en los serotipos VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11, entre ellos los VAA pseudotipificados capaces de intervenir, de manera eficiente, en la transferencia de genes al cerebro, preferiblemente a las motoneuronas, cuando se administran localmente.

La administración sistémica de estos vectores también conduce al envío eficiente de genes tanto al cerebro como a las neuronas motoras. Aunque el suministro de los genes mediado por el vector de tipo VAA2 es más eficaz, el suministro en el caso de la administración sistémica no se limita únicamente al cerebro ni a las motoneuronas. Esta descripción da a conocer un VAA2 que flanquea al promotor del factor de transcripción y XBP1 para la generación de la respuesta en un agolpamiento inespecífico de factores de interés en el cerebro y específicamente en las células nerviosas motoras. En concreto, la administración local del vector de tipo VAA2 que incluye un casete de expresión en el que la expresión codificada para el XBP1s puede estar bajo el control de uno o varios promotores dentro del grupo de cmv, Pgk 1, CamKII y Thy 1, ChAT, cva, entre otros, preferentemente el promotor del citomegalovirus cmv, tal y como se observa con la adición de la proteína fluorescente verde (GFP) delatora, que se puede encontrar regulada por las regiones de promotores tales como EF-1a, Pgk 1, cmv, cba, CamKII y Thy 1, preferiblemente EF-1a, consigue un retraso en la aparición sintomática de la ELA mediante la mejora de las células nerviosas motoras del sistema nervioso en los individuos sanos in vivo. Puede estar presente esta región que codifica la proteína GFP, al igual que podría existir otra región de nucleótidos aleatoria no codificante o una secuencia de ADN desordenada (ADN de control negativo).

Por otra parte, el vector de tipo VAA del serotipo 2 (VAA2) es el mecanismo de material genético que permite la especificidad por el tejido blanco, tales como las motoneuronas asociadas a dicho fallo, en la ELA.

I. Definición de términos y expresiones generales

Las palabras "virus adenoasociado", "virus VAA", "virión del VAA", "partícula vírica del VAA" y "partícula de VAA," tal y como se usan en este documento son intercambiables, se refieren a un vector vírico que consiste en al menos una proteína de la cápsida del VAA (preferiblemente de todas las proteínas de la cápsida de un serotipo de VAA en concreto) y un polinucleótido del genoma encapsidado del VAA. Si la partícula consiste en un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto del genoma nativo del VAA, tal como un transgén para ser administrado a la célula de un mamífero) flanqueado por las repeticiones terminales invertidas del VAA, se conoce típicamente como un "vector de partículas de VAA" o "vector de tipo VAA". El VAA se refiere a un virus que pertenece al género Dependovirus de la familia Parvoviridae . El genoma del VAA tiene una longitud aproximada de 4,7 kilobases y está formado por ácido desoxirribonucleico monocatenario (ssDNA) que puede ser objeto de censura estadística como positivo o negativo. El genoma consiste en las repeticiones terminales invertidas (iTr ) en ambos extremos de la cadena del ADN, y dos marcos de lectura abiertos (ORF): REP y CAP (replicasa y cápsida). El marco estructural de REP está formado por cuatro genes solapantes que codifican las proteínas REP (REP 78, REP 68, REP 52 y REP 40) requeridas para el ciclo de vida del VAA. El marco estructural de CAP contiene nucleótidos solapantes de 20 secuencias de proteínas de la cápsida: VP1, VP2 y VP3, que interaccionan entre sí para formar una cápsida de simetría icosaédrica.

En la actualidad se han descrito unos 11 serotipos de VAA de humanos y unos 100 VAA de primates que pueden utilizarse como vectores. Cada serotipo presenta ventajas y desventajas en cuanto a estabilidad, productividad, inmunogenia, biodisponibilidad, tropismo, etc. Sin embargo, muchos laboratorios han desarrollado vectores pseudotipados, es decir, VAA modificados que contienen proteínas de cobertura de diferentes serotipos, para así obtener las ventajas de diferentes serotipos y evitar las desventajas de algunas proteínas de cobertura de algunos serotipos.

El término "ITR de virus adenoasociado" o "ITR de VAA", tal y como se usa aquí, se refiere al extremo invertido que se repite y está presente en ambos extremos de la cadena de ADN del genoma de un virus adenoasociado. Las secuencias ITR son necesarias para la expresión eficaz del genoma del VAA. Otra característica de estas secuencias es su capacidad para formar una cadena complementaria. Esta característica contribuye a su autocopia, lo que permite la síntesis primaria independiente de la segunda cadena del ADN. Las ITR también se mostraron necesarias tanto para la integración del VAA de tipo nativo del ADN en el genoma de la célula hospedadora y de su rescate, como para la encapsulación eficiente del a Dn del VAA combinado con la generación de su ensamblaje completo.

El término "VAA2", tal y como se usa en esta descripción, se refiere al serotipo 2 de virus adenoasociado con una secuencia genómica como la definida en el número de acceso de GenBank: AF043303.1

El término "vector de tipo VAA", tal y como se usa en esta descripción, también se refiere a un vector que consiste en uno o más polinucleótidos de interés (o transgenes) que están flanqueados por las secuencias repetitivas terminales de VAA (ITR). Estos vectores de tipo VAA pueden replicarse y empaquetarse en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula hospedadora que ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa los genes de REP y de CAP (es decir, las proteínas REP y CAP del VAA), y en donde la célula hospedadora ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa una proteína del marco de lectura E4orf6 de adenovirus. Cuando un vector de tipo VAA se incorpora a un polinucleótido más grande (por ejemplo, en un cromosoma o en otro vector, tal como un plásmido utilizado para la clonación o la transfección), entonces el vector de tipo VAA se denomina típicamente "provector". El provector se puede "rescatar" por replicación y encapsidación en presencia de las funciones de empaquetamiento del VAA y las funciones auxiliares necesarias proporcionadas por E4orf6.

Las palabras "sitio de unión específico para la región reguladora de la transcripción de XBP1", tal y como se usan en esta descripción, se refieren a una secuencia de ácido nucleico que sirve de promotor (es decir, regula la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada, unida operativamente al promotor) y que afecta a la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada en las células de tejidos específicos, tal como las células nerviosas. El sitio de unión específico para la región reguladora de la transcripción del tejido neuronal puede ser constitutivo o inducible.

Las palabras "gen de CAP" o "gen de CAP de VAA", tal y como se usan en esta descripción, se refieren a un gen que codifica una proteína CAP. Las palabras "proteína CAP", tal y como se usan aquí, se refieren a un polipéptido que tenía la actividad de al menos una actividad funcional de la proteína CAP de un v Aa nativo (VP1, VP2, VP3). Ejemplos de actividades funcionales de las proteínas VP1, VP2 y VP3 incluyen la capacidad de inducir la formación de una cápsida, facilitar la acumulación del ADN monocatenario, facilitar el empaquetamiento del ADN del VAA en la cápsida (es decir, la encapsidación), unirse a los receptores celulares y facilitar la entrada del virión a un huésped.

El término "cápsida", tal y como se usa en esta descripción, se refiere a la estructura en la que se empaqueta el genoma vírico. Una cápsida consiste en una estructura oligomérica con subunidades estructurales de las proteínas CAP. Por ejemplo, el VAA tiene una cápsida icosaédrica formada por la interacción de tres proteínas de la cápsida: VP1, VP2 y VP3.

Las palabras "composición de células", tal y como se usan en este documento, se refieren a un material de tipo compuesto que consiste en las células de la descripción y al menos otro componente. La composición se puede formular como una única formulación o puede presentarse como formulaciones separadas de cada uno de los componentes, que pueden combinarse para un uso conjunto como una preparación combinada. La composición puede ser un kit de partes, en donde cada uno de los componentes se formula y se envasa individualmente.

Las palabras "promotor constitutivo", tal y como se utilizan en esta descripción, se refieren a un promotor cuya actividad se mantiene a un nivel relativamente constante por todo el organismo, o durante la mayoría de las etapas experimentales, con poca o ninguna consideración de las condiciones ambientales y externas de la célula.

La palabra "potenciador", tal y como se usa aquí, se refiere a un elemento de la secuencia del ADN al que se unen los factores de transcripción para incrementar la transcripción de los genes.

Las palabras "casete de expresión", tal y como se utilizan aquí, se refieren a una construcción de ácido nucleico generada por recombinación o sintéticamente, con una serie de elementos específicos de los ácidos nucleicos, que permite la transcripción de un ácido nucleico en concreto en una célula diana.

Las palabras "genes que proporcionan funciones de ayuda", tal y como se usan aquí, se refieren a los genes que codifican polipéptidos, que ejecutan funciones de las que depende el VAA para la replicación (es decir, "funciones de ayuda"). Las funciones auxiliares incluyen las funciones que son necesarias para la replicación del VAA, incluidos los fragmentos involucrados en la activación de la transcripción de los genes del VAA, las etapas específicas del ayuste del ARNm del VAA, la replicación del ADN del VAA, la síntesis de los productos de CAP y el montaje de la cápsida del VAA. Las funciones víricas accesorias pueden derivarse de cualquiera de los virus auxiliares conocidos, tales como adenovirus, virus del herpes, lentivirus y virus de la variolovacuna. Las funciones auxiliares incluyen, sin limitación, el lentivirus WHV.

Las palabras "operativamente unido", tal y como se describe en este documento, se refieren a la relación funcional y la localización de una secuencia promotora con respecto a un polinucleótido de interés (por ejemplo, un promotor o potenciador conectado operativamente a una secuencia codificante que afecta a la transcripción de dicha secuencia). Generalmente, un promotor conectado operativamente es contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión.

Las palabras "administrado localmente", tal y como se usan aquí, significan que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos y/o composiciones farmacéuticas de la descripción se administran al sujeto en o cerca de un sitio específico.

Las palabras "sustancias de arrastre farmacéuticamente aceptables", "diluyentes farmacéuticamente aceptables", "excipientes farmacéuticamente aceptables" o "vehículo farmacéuticamente aceptable", son intercambiables en este documento, se refieren a un diluyente sólido, semisólido o líquido de relleno que no es tóxico, o material de encapsulación o una formulación auxiliar para cualquier tipo convencional. Una sustancia de arrastre farmacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxica para los envases usados en las dosis y concentraciones, y es compatible con otros ingredientes de la formulación. El número y naturaleza de los vehículos farmacéuticamente aceptables depende de la forma de administración deseada. Se conocen los vehículos farmacéuticamente aceptables y pueden prepararse mediante los métodos bien conocidos en la técnica.

La palabra "promotor", tal y como se usa aquí, se refiere a una región de ácido nucleico cuya función es controlar la transcripción de uno o más polinucleótidos, situada delante de la secuencia del polinucleótido, y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de fijación del ADN dependiente de la ARN polimerasa, los sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluidos, entre ellos, pero sin limitarse a ellos, los sitios de fijación de los factores de transcripción, sitios de fijación de las proteínas represoras y activadoras, y cualquier otra secuencia de nucleótidos que se conoce en la técnica que actúan directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a cargo del promotor. Un promotor "específico de tejido" solo se activa en determinados tipos de células o de tejidos diferenciados.

La palabra "polinucleótido", tal y como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, que contiene desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, respectivamente. El ácido nucleico puede ser bicatenario, monocatenario, o contener secuencias tanto bicatenarias como monocatenarias. La palabra "polinucleótido" incluye, pero sin limitación, secuencias de ácidos nucleicos con capacidad para codificar un polipéptido y secuencias de ácidos nucleicos parcial o totalmente complementarias a un polinucleótido endógeno de la célula o del sujeto tratado con el mismo, de manera que, tras su transcripción, genera una molécula de ARN (por ejemplo, microARN, shARN, siARN) capaz de hibridarse e inhibir la expresión del polinucleótido endógeno.

En este documento la palabra "cadena" se refiere a una secuencia de nucleótidos continuos (que incluye o no nucleótidos naturales modificados o no naturales). Las dos o más hebras pueden ser, o cada una formar parte de, moléculas independientes, o pueden estar interconectadas covalentemente, por ejemplo, por medio de un acoplador, por ejemplo un conector como el polietilenglicol, para formar una molécula. Al menos una de las cadenas puede incluir una región que sea suficientemente complementaria a un ARN diana.

Una segunda cadena del agente de tipo dsRNA que comprende una región complementaria a la cadena antisentido se denomina "cadena sentido". Sin embargo, también se puede formar un agente de tipo siRNA basado en una sola molécula de ARN que es al menos parcialmente autocomplementario, que forma, por ejemplo, una estructura de horquilla o de ojal que incluye una región bicatenaria. En el futuro, estos últimos se denominarán ARN ahorquillados pequeños o shRNA. En este caso, la palabra "cadena" se refiere a una de las regiones de la molécula de ARN que es complementaria a otra región de la misma molécula de ARN.

El término "región reguladora postranscripcional", tal y como se usa aquí, se refiere a cualquier polinucleótido que facilita la expresión, estabilización o localización de las secuencias contenidas en el casete o producto génico resultante.

Las palabras "genoma vírico recombinante", tal y como se usan aquí, se refieren a un genoma de VAA en el que se inserta al menos un casete de polinucleótido no relacionado con la expresión en el genoma nativo del VAA.

Las palabras "gen de rep" o "gen de rep de VAA", tal y como se usan aquí, se refieren a un gen que codifica una proteína Rep. Las palabras "proteína Rep", tal y como se usan aquí, se refieren a un polipéptido que tiene al menos una actividad funcional de una proteína Rep nativa del VAA (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78). Una "actividad funcional" de una proteína Rep (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78) es cualquier actividad asociada a la función fisiológica de la proteína, que incluye facilitar la replicación del ADN mediante el reconocimiento, fijación y corte del origen de replicación del ADN del VAA, así como la actividad helicasa de ADN. Las funciones adicionales incluyen la modulación de la transcripción de los promotores del VAA (u otros heterólogos) y la integración específica de sitio del ADN del VAA en un cromosoma del hospedador.

El término "sujeto", tal y como se usa aquí, se refiere a un individuo, planta, mamífero o animal, tal como un ser humano, un primate no humano (por ejemplo, un chimpancé u otro simio y especies de monos), un animal (por ejemplo, aves, peces, vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos), un mamífero (por ejemplo, perros y gatos) o un animal de laboratorio (por ejemplo, roedores, tales como ratas, ratones, ratones con genes silenciados (ratones genosuprimidos), ratones que sobreexpresan un gen (ratones transgénicos) y conejillos de India). La palabra no denota una edad o sexo en concreto. La palabra "sujeto" incluye un embrión y un feto.

Las palabras "administrado sistémicamente" y "administración sistémica", tal y como se usan en este documento, significan que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos o composiciones farmacéuticas de esta descripción se administran a un sujeto de manera no localizada. La administración sistémica de los polinucleótidos, vectores, polipéptidos o composiciones farmacéuticas de la descripción puede llegar a varios órganos o tejidos de todo el cuerpo del sujeto, o puede llegar a órganos o tejidos específicos nuevos del sujeto. Por ejemplo, la administración intravenosa de una composición farmacéutica de la descripción puede dar como resultado la transducción en más de un tejido u órgano en un sujeto.

Las palabras "región reguladora de la transcripción", tal y como se usan aquí, se refieren a un fragmento de ácido nucleico capaz de regular la expresión de uno o más genes. Las regiones reguladoras de los polinucleótidos de la descripción incluyen un promotor y, opcionalmente, un potenciador.

La palabra "transducción", tal y como se usa aquí, se refiere al proceso mediante el cual se introduce una secuencia de nucleótidos foránea dentro de la célula en un vector vírico.

La palabra "transfección", tal y como se usa en este documento, se refiere a la introducción de ADN en las células eucariotas receptoras.

La palabra "vector", tal y como se usa aquí, se refiere a una construcción capaz de administrar, y opcionalmente expresar, uno o más polinucleótidos de interés en una célula hospedadora. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a ellos, vectores víricos, vectores de expresión de ADN o ARN desnudo, plásmido, vectores de tipo cósmido o fago, vectores de expresión de ARN o ADN asociados a agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, tales como células de producción. Los vectores pueden ser estables y pueden autorreplicarse. No existen limitaciones en cuanto al tipo de vector que se puede utilizar. El vector puede ser un vector de clonación, adaptado para la propagación y obtención de polinucleótidos, construcciones génicas o vectores de expresión incorporados en diversos organismos heterólogos. Los vectores adaptados incluyen vectores de expresión procariotas, fagos y vectores lanzadera, y vectores de expresión eucariotas basados en vectores víricos (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, así como retrovirus y lentivirus), así como vectores no víricos, tales como el pSilencer 4.1-CMV.

Los métodos y composiciones de la descripción, por ejemplo, los métodos y composiciones del virus de tipo VAA con el inserto de XBP1s-GFP, pueden usarse con cualquier dosificación y/o formulación descrita en esta descripción, así como con cualquier medio de administración descrito en esta descripción.

Los "agentes de tipo siRNA o siRNA" son palabras utilizadas para describir los fragmentos bicatenarios de ARN de entre 15 y 25 pares de bases, preferiblemente de 19 a 21 pares de bases, de longitud.

Las palabras "ADNc" o "ADN complementario" se refieren a una secuencia de ADN totalmente complementaria a un ARN, a partir del cual se sintetiza por RT-PCR.

Tal y como se usa en este documento, la palabra "complementario" se usa para indicar un grado suficiente de complementariedad, tal que tiene lugar una fijación estable y específica entre un compuesto y una molécula de ARN destinataria; la fijación específica requiere un grado de complementariedad suficiente para evitar la fijación inespecífica del compuesto oligomérico a secuencias no destinatarias en las condiciones en las que se desea la fijación específica, es decir, en las condiciones fisiológicas en el caso de los ensayos in vivo o de tratamiento terapéutico, o en el caso de pruebas in vitro, en las condiciones en las que se han realizado las pruebas.

Ligandos

Las características de un virus, incluidas sus características farmacológicas, pueden verse influidas y adaptadas, por ejemplo, mediante la introducción de ligandos. Además, las características farmacológicas de un agente vírico pueden mejorarse mediante la incorporación de un ligando en una formulación del agente y un virus.

Los ligandos se pueden unir a una amplia variedad de entidades, por ejemplo, ligandos que se unen a un agente vírico, o que se pueden usar como conjugado o aditivo de formulación, por ejemplo, con el vehículo de una subunidad monomérica conjugada con el ligando. Los ejemplos se describen a continuación en el contexto de una subunidad monomérica conjugada con un ligando, pero eso es solo lo preferido, y las entidades pueden acoplarse con un virus en otros puntos.

Un ligando altera la distribución, dirección o ciclo de vida de un agente vírico en el que está incorporado. En las modalidades preferidas, un ligando mejora la afinidad por un objetivo seleccionado, por ejemplo, una molécula, célula o tipo de célula, un compartimento, por ejemplo, un compartimento celular u órgano, un tejido o región del cuerpo, por ejemplo, cómo se compara con una especie en la que este ligando está ausente.

Los ligandos pueden mejorar las características de transporte, hibridación y especificidad de la molécula diana, para esta descripción, del virus.

En general, los ligandos pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo, para mejorar la absorción de la molécula en el individuo; compuestos de diagnóstico o grupos indicadores, por ejemplo, para controlar la distribución; agentes de reticulación; fracciones que confieren resistencia a las reacciones inmunitarias; y bases nitrogenadas naturales o inusuales.

Los ejemplos generales incluyen moléculas lipófilas, lípidos, lectinas (por ejemplo, hecogenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivado de epifriedelanol), vitaminas, glúcidos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano), polímeros sintéticos (por ejemplo, oligolactato de 15 unidades) y polímeros naturales (por ejemplo, de masa molecular baja y media, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico), proteínas, agentes de fijación a proteínas, moléculas dirigidas a las integrinas, policationes, péptidos, poliaminas y peptidomiméticos. Otros ejemplos incluyen los ligandos de receptores de células epiteliales o de ácido fólico, tales como la transferrina.

El ligando puede ser una molécula que esté presente de forma natural o recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen polilisina (PLL), ácido poli-L-aspártico, ácido poli-L-glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli-(lácticocoglicólico), copolímero de diviniléter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxi-propil)-metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinilvinílico (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenamina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, poliamina pseudopeptídica, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, fracciones catiónicas, por ejemplo, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido a-helicoidal.

Los ligandos también pueden incluir grupos orientadores, por ejemplo, un agente orientador hacia una célula o tejido, por ejemplo, tirotropina, melanotropina, proteína A tensioactiva, glúcido de mucina, un ácido de poliamina glucosilada, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato o un péptido de Arg-Gly-Asp (RGD), o un peptidomimético de RGD.

Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glucoproteínas, lipoproteínas, por ejemplo, lipoproteínas de baja densidad (LDL), o albúminas, por ejemplo, seroalbúmina o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo que se fija a un tipo específico de célula. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, mañosa multivalente o fucosa multivalente.

El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco que puede incrementar la absorción del agente vírico dentro de la célula, por ejemplo, mediante la alteración del citoesqueleto de la célula, por ejemplo, mediante la alteración de los microtúbulos, de los microfilamentos y/o de los filamentos intermedios de la célula.

En un aspecto, el ligando es un lípido o una molécula de tipo lipídico. Este lípido o preferiblemente esta molécula de tipo lipídico está conectado a una proteína sérica, por ejemplo, la seroalbúmina.

En una modalidad alternativa, el virus estará empaquetado.

Para la preparación de las soluciones inyectables del virus, estas se preparan diluyendo la concentración del virus necesario en PBS (solución salina tamponada con fosfato) cuya formulación es la siguiente:

PBS1x

1. Disolver la dosis de virus en 800 ml de agua destilada con:

8 g de NaCl

0,2 g de KCl

1,44 g de Na²HPO⁴

0,24 g de KH²PO⁴

2. Ajustar el pH a 7,4 con HCl.

3. Ajustar el volumen a 1 l con agua destilada adicional

4. Esterilizar y someter a autoclave.

Diseño y selección

El control de la síntesis de proteínas y la inducción de la expresión génica es la clave para el tratamiento de la ELA. La palabra "ELA", tal y como se utiliza aquí, es una enfermedad que afecta a las motoneuronas de manera mortal, al generar un daño progresivo en el cerebro y en la médula espinal (1). La mayoría de las veces, esta enfermedad se presenta de forma esporádica (ELAe); solo el 10% de los casos tienen una etiología genética familiar (ELAf) causada por numerosas variantes en los genes (2). Genéticamente, las causas más habituales de la ELAf son la expansión por repetición de un hexanucleótido en la región intrónica de C9orf72 y mutaciones en los genes, tales como el de la superóxido dismutasa (SOD1) (3). La enfermedad de la ELA aparece principalmente en los adultos, donde el período sintomático es breve. Al parecer, la aparición de trastornos del RE y su proteostasis son la base para la generación de la enfermedad (4).

Las palabras "retículo endoplasmático (RE)" se consideran como un compartimento implicado en el plegamiento de las proteínas y en su control de calidad (5). Se han descrito una serie de marcadores de estrés que tienen lugar en el RE y esto se ha relacionado con la incidencia de la ELA en los humanos y en los modelos de animales transgénicos (6), y es uno de los primeros eventos que se detectan antes de que la ELA sea sintomática (7). La respuesta a proteínas desplegadas (UPR) ha sido manipulada farmacológica y genéticamente con el fin de hacer frente al estrés del RE y se ha demostrado que tiene consecuencias favorables y funcionales para el control de la ELA (8-10).

La respuesta a proteínas desplegadas (UPR) la desencadenan principalmente tres sensores del estrés IRE 1, PERK y ATF6.

La IRE 1 es una proteína con actividad cinasa y endorribonucleasa que, tras su activación, cataliza el corte y ayuste del ARNm que codifica un factor de transcripción proteico que se une al X-Box (XBP1), convirtiéndolo en un poderoso activador de numerosos genes sensibles a la UPR, que se denomina XBP1s (11). Por su parte, el XBP1s está implicado en el control de la expresión de los genes que controlan el plegamiento, la secreción, el control de calidad de las proteínas y la degradación por parte del RE (ERAD) (12, 13).

Por otro lado, la activación de PERK también desencadena la inhibición de la traducción de las proteínas en el RE y, por lo tanto, se reduce la carga de proteínas mal plegadas en el RE. Por su parte, la PERK desencadena la expresión del ATF4 que, en situaciones de estrés prolongado en el RE, genera un efecto proapoptósico. (14, 15) Finalmente, tras los episodios de estrés del RE, el ATF6 es transportado al Golgi, donde se escinde y se libera un fragmento citosólico, el ATF6f, que actúa como un factor de transcripción que regula los genes de la ERAD (5, 6). En otras palabras, el control de estos tres factores de transcripción tiene respuestas únicas en la UPR donde afectan a la vida o la muerte celulares. (17)

La relación del estrés del RE y la enfermedad de la ELA (ELAf y ELAe) se ha visto en las autopsias de humanos en los que se ha notificado la activación de la UPR (18 a 22). También se han descrito los factores de transcripción XBP1 y ATF4 en la médula espinal de los pacientes con ELA (23). Por otro lado, en los modelos de animales con la ELAf se ha observado la presencia de estrés en el RE (9, 24 a 33). El potencial terapéutico de la UPR como diana para el tratamiento de la ELA aún no está claro. Un análisis por disección con láser a un grupo de neuronas muertas al principio del curso de la enfermedad y a otro grupo de neuronas resistentes a la neurodegeneración (7) demostró que solo las motoneuronas de la ELAf se vieron afectadas en los modelos de ratón que eran selectivamente propensos al estrés crónico del RE, convirtiendo el estrés del RE en uno de los primeros marcadores moleculares detectados, incluso antes de la desnervación en los animales presintomáticos. Por otra parte, se ha comprobado que los cultivos de las motoneuronas humanas generadas a partir de células iPS derivadas de los pacientes con la ELAf portadores de una mutación en la SOD1 generan estrés en el RE de forma espontánea como respuesta a una actividad fisiológica alterada (34). También se observan alteraciones en la proteostasis en las motoneuronas derivadas de las iPSC de los pacientes que expresan la mutación en C9orf72 (la más frecuente de la ELAf) (34). Finalmente, estos estudios sugieren que un mal plegamiento de las proteínas es una característica destacada en las neuronas de los pacientes con la ELA (35).

Durante la presente descripción, se desarrolló un modelo de ratón genosuprimido para investigar y comprobar el papel de XBP1 en el sistema nervioso motor relacionado con la ELA. En este caso, se esperaría que la supresión del factor de transcripción de la UPR aumentara la gravedad de la ELA; sin embargo, se observó sorprendentemente lo contrario en la ELA experimental debido a la alteración de la adaptación al estrés dado el plegamiento de las proteínas. Se observó que estos ratones eran más resistentes a desarrollar la enfermedad, lo que sugirió que este efecto se daba como un efecto compensatorio sobre la red de proteostasis que potenciaba los niveles de autofagia, lo que mejoraba la supervivencia y atenuaba los signos de enfermedad en el modelo de ratón (37). Por otro lado, se demostró que los ratones deficientes en el ATF4 son más resistentes a desarrollar la ELA, posiblemente por la reducción de la expresión de los factores proapoptósicos de estrés del RE, tales como CHOP y BIM (38). A su vez, una deficiencia de BIM retrasa la aparición de la ELA (39). En general, varios estudios postularon que el estrés en el RE contribuye a la disfunción de las motoneuronas en la ELA, y que las estrategias farmacológicas y genéticas sobre la UPR alteran la progresión de la enfermedad en los modelos de ratones con ELA in vivo (7, 30, 40 y 41). Además, el tratamiento de los ratones transgénicos mutantes para la SOD1 con atenuantes del estrés del r E, tales como el guanabenz o el salubrinal (42 y 43), reduce la traducción de las proteínas en el RE al mejorar la fosforilación del elF2a (44), lo que retrasa la enfermedad.

Todos estos estudios presentan la complejidad de la UPR, en donde la consecuencia de la modificación de sus componentes específicos puede tener efectos opuestos y diferentes en la evolución de la enfermedad (8 y 45), como se puede apreciar en la figura 1/9.

Para esta descripción, la UPR se manipuló durante el desarrollo con el uso de modelos de ratones genosuprimidos con el fin de desarrollar respuestas en la red de homeostasis de las proteínas para generar fenotipos que no reflejen la participación directa del estrés del RE en la ELA. La genoterapia mediada por el VAA se está convirtiendo en una plataforma terapéutica atractiva, por ejemplo, para administrar los componentes activos de la UPR a tejidos concretos. Esta estrategia evita los efectos pleiotrópicos de la administración sistémica y tópica de los compuestos dirigidos contra el estrés del RE (8), lo que evita así las barreras fisiológicas terapéuticas, tales como la barrera hematoencefálica. Una opción genética en la administración de estos factores son los virus adenoasociados (VAA), ya que han mostrado unos perfiles terapéuticos seguros (46).

Para explorar la participación del XBP1, sobre todo del XBP1s, en las funciones motoras del SNC, comprobamos la capacidad celular de restablecer la proteostasis mediante la activación de la UPR. En presencia de una lesión motora medular inducida, se ha conseguido una mejoría motora y una mayor supervivencia de los oligodendrocitos gracias a la inyección de los VAA en la médula espinal para forzar la expresión de XBP1s (47). Por otra parte, se comprobó que disminuía la agregación de la huntignina mutante en el cuerpo estriado in vivo mediante una inyección estereotáxica de AAV-XBP1s/GFP (Corea de Huntington) (48).

Desarrollo de los vectores (de tipo VAA) para expresar activamente el XBP1s.

Para analizar la función del XBP1 in vivo, se generaron construcciones para producir virus adenoasociados que expresaban el casete de xbpl. El casete de xbp1 se separó del pcDNA3-XBP-1s como el fragmento Mfel/Sphl y se insertó en el plásmido prevírico pAAVsp70 que contiene el VAA de serotipo 2 (VAA-2) con las correspondientes ITR. El vector tiene un casete de expresión para EGFP que sirve de marcador fluorescente para identificar las células infectadas. Este vector se denomina también AAV-XBP1s/GFP como puede verse en la figura 2/9.

El vector recombinante AAV-XBP1s/GFP se produjo por una triple transfección de las células T239 con el uso de un plásmido con rep/cap y pHelper, para luego ser purificado por una columna de afinidad cromatográfica (50). Para purificar y concentrar las partículas del VAA, las células T239 (infectadas previamente) se lisaron con tripsina y nucleasa seguido de la cromatografía de intercambio iónico que usa hidroxiapatita cerámica y DEAE-Sefarosa, en combinación con la cromatografía de afinidad con sulfato de celulosa. Como control para este vector se utilizó el vector AAV-Mock/GFP, como se puede apreciar en la figura 2/9.

El título de los virus se determinó en tiempo real mediante la prueba de PCR con TaqMan con separadores específicos para la secuencia de poliA de BGH. La metodología seleccionada utilizó las dos construcciones descritas en la figura 2/9 y se confirmaron sus concentraciones por medición directa del contenido de ADN (51). Dichas concentraciones se presentan en la Tabla V:

Tabla V

Se ensayaron dos sistemas para realizar las calificaciones, el primero a través de Genzyme y el segundo en el laboratorio de los inventores (Hetz).

Se coexpresó la EGFP en la identificación de las células transformadas, un control para estas células es infectar las células que promueven la sobreexpresión de la EGFP con AAV-Mock/GFP, sin el gen diana. Este control es importante para eliminar los efectos víricos inespecíficos que se producen en este tipo de procedimientos. De esta forma, los efectos biológicos específicos se pueden medir de forma fiable al aplicar el AAV-XBP1s/GFP y su actividad transcripcional.

Para verificar la infectividad y los niveles de expresión, se realizó una medición de los niveles del ARNm de gfp/actina y Xbpls/actina por qPCR donde se ejecutaron diferentes diluciones entre 1:2500 a 1:80000, tanto para AAV-Mock/GFP (control), como para AAV-XBP1s/g Fp . Esto confirmó la eficacia de la infección con AAV-XBP1s/GFP en las células HEK 293. Estos resultados se presentan en la figura 3/9, lo que confirma la alta transducción de la construcción AAV-XBP1s/GFP.

Al ver los excelentes resultados in vitro en las células HFK 293, se llevó a cabo un estudio in vivo con ratones recién nacidos para comprobar la eficiencia de la transducción después de la inyección intracerebroventricular (ICV) de un título equivalente para ambos VAA, tal como se presenta en la figura 4/9. Esta inyección conduce a la difusión de las partículas víricas a través del líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que genera una transducción global significativa de las células nerviosas en el sistema nervioso central que se puede detectar en un patrón conservado en el hipocampo, corteza cerebral, células ependimales, cerebelo, y tramos corticoespinales en la médula espinal (52 y 53). La eficiencia de la transducción en el sistema nervioso central fue similar para ambas construcciones de VAA. La especificidad de la expresión se obtuvo gracias a un serotipo específico del virus VAA, el serotipo VAA2, que mostró un alto tropismo por las células nerviosas (54). Con el uso de esta estrategia, se verificó la transducción de grandes regiones del cerebro y de la médula espinal (50). Los estudios presentados en esta patente confirmaron el alto tropismo por las células nerviosas motoras que tiene el virus de serotipo 2 del VAA.

La mayoría de las células transducidas de los ratones son células de Purkinje del cerebelo; por lo tanto, este tejido se utilizó para demostrar el éxito de cada tratamiento. Este punto se demostró aún más por los altos niveles de los ARNm de Xbp1 ygfp. La transducción positiva en los ratones fue de aproximadamente del 95 % y no se observaron cambios significativos de muerte perinatal en los ratones después de la inyección de los VAA.

La siguiente etapa en el desarrollo de esta descripción fue ver los niveles en el sistema nervioso central (SNC) que presentaban los ARNm de Xbpls y gfp en los ratones tratados perinatalmente con AAV-XBP1s/GFP. Para ello, los niveles de los ARNm de Xbpls y gfp se cuantificaron en la corteza frontal del cerebro, en la médula espinal y en el cerebelo en los ratones silvestres de 90 días de edad o P90, inyectados perinatalmente con el AAV-XBP1s/GFP. Los procesos de extracción de ARN, síntesis de ADNc y PCR fueron los convencionales para producir XBP1s, y su digestión a partir del ADNc más Pstl reveló solo una tendencia a incrementar los niveles del ARNm de Xbp1s en la corteza frontal de los ratones tratados con el AAV-XBP1s/Gfp en comparación con el control, como se puede ver en la figura 5/9 arriba a la izquierda.

Por otro lado, se presenta la evaluación por qPCR de los niveles del ARNm de Xbpls, en donde se confirmó la tendencia, figura 5/9 superior derecha. Sin embargo, cuando se evaluó el ARN del cerebelo (figura 5/9 abajo a la izquierda), el aumento del ARNm en X bpls era evidente y significativo (aproximadamente el doble). Sorprendentemente, los niveles del ARNm de X bp ls en la médula espinal (figura 5/9 abajo a la derecha) eran más evidentes que en la corteza frontal (aproximadamente 2,3 veces). Todos estos resultados confirmaron la amplitud de la sobreexpresión del ARNm de X bpls en los ratones tratados con el AAV-XBP1s/Gfp.

Desarrollo del virus adenoasociado (VAA)

Con respecto al desarrollo del virus adenoasociado (VAA), este comprende el genoma del virus que consiste en un casete de expresión que incluye una región reguladora transcripcional constitutiva ligada operativamente al polinucleótido de interés.

De acuerdo con esta descripción, el virus adenoasociado (VAA) incluye cualquier serotipo conocido de los 42 tipos y se deriva del parvovirus. En general, los diferentes serotipos de VAA son secuencias genómicas con una importante homología a nivel de aminoácidos y de ácido nucleico, que proporcionan funciones genéticas idénticas, proporcionan vibriones que son esencialmente idénticos en términos funcionales y físicos, y su replicación y ensamblaje utilizan prácticamente los mismos mecanismos.

En concreto, en esta descripción se utilizó el VAA de serotipo 2 (por ejemplo, como los mencionados en el número de acceso de GenBank AF043303.1 (AAV 2)), como se presenta en la tabla III.

De acuerdo con esta descripción, el genoma del VAA normalmente consiste en un actuador en cis en 5' y una secuencia de repetición terminal invertida en 3', y un casete de expresión. Las secuencias de ITR o de LTR tienen 141 pares de bases de longitud. Preferiblemente, en la molécula se usa la secuencia completa de las LTR y solo se permiten ligeras modificaciones de su secuencia. En una forma preferida de esta descripción, el genoma recombinante del VAA comprende las LTR en 5' y 3' de VAA. En otra forma preferida de esta descripción, las LTR de VAA en 5' y 3' derivan del VAA de serotipo 2. En otra forma más preferida de esta divulgación, el genoma recombinante del VAA carece del marco de lectura abierto de Rep y de Cap.

Por otro lado, las ITR pueden provenir de otros serotipos de VAA.

El VAA de esta descripción comprende una cápsida de cualquier serotipo. Para esta descripción en concreto, se prefiere la cápsida derivada de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9. Aunque preferentemente se desea la cápsida del VAA de serotipo 2.

En algunas realizaciones, se puede generar una cap del VAA para ser usada en el método de la descripción mediante mutagénesis (es decir, inserciones, deleciones o sustituciones) de una de las cap del VAA o de sus ácidos nucleicos codificantes. En algunas realizaciones, la cap de VAA tiene una similitud de al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % o más con una o más de las cap mencionados del VAA.

En algunas realizaciones, la cap del VAA es quimérica, comprende los dominios de dos, tres, cuatro o más de las cap de VAA mencionadas. En algunas realizaciones, la cap del VAA es un mosaico de los monómeros VP1, VP2, VP3 y procede de dos o tres VAA diferentes o de un VAA recombinante (VAAr). En algunas realizaciones, una composición de VAAr incluye más de una de las CAP mencionadas.

En algunas realizaciones, un VAA con CAP para su uso en una composición de VAAr está diseñado para contener una secuencia heteróloga u otra modificación. Por ejemplo, una secuencia de péptido o proteína que confiera una focalización selectiva o la evasión inmunitaria puede ser por ingeniería genética en una proteína Cap. Como alternativa, o adicionalmente, la Cap puede estar modificada químicamente para que la superficie del VAAr presente modificaciones químicas específicas, como por ejemplo, polietilenglicol, que pueden facilitar la evasión inmunitaria. La proteína Cap también se puede generar mutagenizada (por ejemplo, para eliminar su fijación natural al receptor o para enmascarar un epítopo inmunógeno).

En una realización, el vector de tipo VAA contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de al menos una secuencia del XBP1 que puede seleccionarse de la siguiente tabla: Tabla IV (Xbpls) (Secuencia de referencia del NCBI NM_001271730.1). La referencia de las secuencias se obtuvo de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/411147450?report=genbank&log$=nucltop&blastrank=1&RID=7TM54X2201R (Xbpls).

En una realización, el vector de tipo VAA contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de X bp ls que se puede seleccionar de la tabla IV, quedando como se presenta en la tabla I.

En una realización, el vector de tipo VAA contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que tiene una homología del 85 % con una secuencia diana seleccionada de la lista mencionada anteriormente, tabla IV.

En una realización, el vector de tipo VAA contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de Xbpls, que se puede seleccionar de la tabla II.

En una realización, el vector de tipo VAA contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que tiene una homología del 85 % con una secuencia diana seleccionada de la lista mencionada anteriormente, tabla II.

En una realización, el vector de tipo VAA contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que es un equivalente funcional con una secuencia diana seleccionada de las tablas mencionadas.

La región reguladora de la transcripción puede incluir un promotor y, opcionalmente, una región potenciadora. Preferiblemente, el promotor se selecciona de esta lista: CMV, EF-1a, PGK1, CAMKII, THY1, ChAT entre otros. El potenciador no necesita ser específico para el tejido neuronal.

En una realización, el promotor es específico para Xbp1s, por ejemplo, el del citomegalovirus, también conocido como CMV.

En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, el de la calcio calmodulina cinasa 2, también conocido como CAMKII.

En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, también conocido como Thy1.

En otra realización, el casete de expresión que forma parte del VAA de la descripción también incluye una región de regulación postranscripcional.

El casete de expresión que forma parte del VAA según la descripción incluye un "polinucleótido de interés". En una realización preferida, el polinucleótido de interés codifica una proteína que actúa sistémicamente. En otra realización, el polinucleótido de interés codifica una proteína que actúa dentro de una célula nerviosa. En una realización preferida, la proteína que actúa dentro de esa célula nerviosa es la XBP1s.

El límite del tamaño que pueden contener los vectores de tipo VAA se limita al tamaño del genoma del VAA de tipo silvestre que varía de tamaño según el serotipo de VAA (es decir, entre 4087 a 4767). Por ejemplo, el VAA2 nativo tiene un tamaño de genoma de 4680 pares de bases. En algunas formas de realización, la capacidad de clonación del vector para el ARN recombinante puede ser escasa y una secuencia codificante deseada puede implicar la sustitución completa de 4,8 kilobases del genoma del virus. Por lo tanto, los genes de gran tamaño pueden no ser adecuados para su uso en un vector recombinante estándar de VAA, en algunos casos. El experto medio apreciará que hay opciones disponibles en la técnica para superar el límite de la capacidad de codificación. Por ejemplo, la IRT de VAA de dos genomas pueden hibridarse para formar concatémeros de extremo con extremo, casi duplicando la capacidad del vector. La inserción de los sitios de ayuste permite la eliminación de la IRT después de la transcripción. Otras opciones para superar los límites de la capacidad de clonación serán evidentes para el experto en el tema.

Vías de administración

Las vías de administración del virus dependen de que el virus pase la barrera hematoencefálica para infectar las células nerviosas deseadas o de que se inyecte directamente.

Para lograr este propósito en esta descripción, se han definido dos vías de administración.

La primera de estas vías es la nasal (18), generalmente los medicamentos administrados por la nariz pueden entrar en la sangre a través de la circulación general, pueden penetrar directamente en el cerebro o, en algunos casos, pueden seguir ambas vías. Sin embargo, muchos de los factores que controlan el flujo del fármaco a través de cada una de estas vías no están completamente definidos. En general, hay tres vías por las que puede viajar un fármaco administrado en la cavidad nasal. Estas vías incluyen la entrada directa en la circulación sistémica de la mucosa nasal, la entrada en el bulbo olfatorio mediante el transporte axónico a través de las células nerviosas, y la entrada directa en el cerebro. Las pruebas que respaldan la función de cada una de estas vías para una serie de sustratos modelo se resumen a continuación para diferentes tipos de virus.

Esta tabla no pretende ser completa por naturaleza, sino que destaca algunos de los solutos de diferentes clases que han demostrado seguir una o más vías.

La segunda vía es directa en el sistema nervioso central. La inyección directa en los espacios líquidos, como el intracerebroventricular (ICV); el humor vítreo del ojo; o en el líquido cerebral de la médula espinal por diferentes vías, intraventricular o intratecal (**) para su envío al plexo coroideo, las capas ependimarias/meníngeas y desde allí al cerebro adyacente a través de las prolongaciones que se extienden dentro de estas capas; y su paso a través de la barrera hematoencefálica o las barreras hematotumorales mediante la inyección intraarterial combinada con una interrupción temporal osmótica o farmacológica.

La inyección ICV requerida se definirá más adelante en la descripción de los materiales y métodos.

Cálculo de la dosis

Según Ulusoy et al (20), el título del vector requiere un margen entre 109 a 1013 copias del genoma (CG) por mililitro con una dosis probada entre 2,9 * 1012 y 4,5 * 1012 CG/ml. Por otro lado, cualquier tasa de dilución de los vectores a titular debe tener un margen bajo-medio de 1011 CG/ml, lo que se traduce en la desaparición de la toxicidad.

Dosis en los humanos:

El margen de dosificación en los humanos se encuentra en el margen entre 109 y 1030 genomas víricos/kg de peso, sin restringir este margen a la aplicación en diferentes grupos de edad o con volúmenes de distribución modificados por la edad o las enfermedades.

La concentración o nivel máximo de una sustancia, encontrada experimentalmente o por observación, es la que no causa alteraciones adversas detectables en la forma, capacidad funcional, crecimiento, desarrollo o duración de la vida de los organismos diana, distinguibles de los observados en los organismos normales (control) de la misma especie y cepa, en las condiciones definidas de la exposición.

Descripción de las figuras

Figura 1/9

En esta figura vemos un esquema de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR) y las estrategias genéticas y farmacológicas en modelos de ratón con ELA (ALS).

En la figura también se muestra una representación esquemática de los eventos de señalización de la UPR.

Figura 2/9

En el panel A de esta figura se presentan los diagramas de los vectores utilizados: AAV-Mock/GFP y AAV-XBP1s/GFP. Por otro lado, en el panel B se presenta la secuencia completa de AAV CMVmXBP1-EF1aegfp de 7206 pares de bases en un diagrama del plásmido.

En donde a continuación se detallan las posiciones de los diferentes componentes de la secuencia:

ITR en 5': 7010-7153

Promotor de EF1a: 1-1100

eGFP: 1139-1858

Señal de poliadenilación de SV40: 1937-2134

Cepa complementaria

Señal de poliadenilación de BGH: 2165-2369

mXBP1s: 2499-3614

Promotor de CMV: 3686-4302

ITR en 3': 4449-4585

Figura 3/9

En esta figura, a la izquierda, se presenta la eficiencia de la infección al medir por qPCR los niveles del ARNm de X bp ls normalizados con los niveles del ARNm de la actina, después de la infección de células HEK 293 con AAV-Mock/GFP y con AAV-XBP1s/GFP. En la figura de la derecha se mide la eficacia de la infección al medir por qPCR los niveles del ARNm de Xbpls normalizados con los niveles del ARNm de la actina, después de la infección de las células HEK 293 con AAV-Mock/GFP y con AAV-XBP1s/GFP. Las células HEK 293 también se tratan con 1,0 pg del factor estresante del RE Tunicamicina (Tm) durante 8 h como control de la qPCR.

Figura 4/9

En esta figura, en el lado izquierdo, se presenta un diagrama y una fotografía de la inyección manual de una solución concentrada de VAA en los ventrículos cerebrales de los ratones recién nacidos. En este diagrama se muestra el ángulo con el que debe entrar la aguja para una inyección representativa y correcta. En la fotografía se presenta el lugar de la inyección. En el diagrama de la derecha se presenta un resumen de la metodología.

Figura 5/9

En esta figura, en su parte superior izquierda, se muestran los niveles relativos por PCR convencional de los ARNm de Xbp1s, Xbp1 u, gfp y la actina a partir del ARNm del cerebelo de los ratones tratados con AAV-XBP1s.

En la parte superior derecha de la figura se presentan los resultados de los niveles relativos del ARNm de X bp ls en la corteza frontal.

En la parte inferior izquierda de la figura se presentan los resultados de los niveles relativos del ARNm de X bp ls en el cerebelo.

En la parte inferior derecha de la figura se presentan los resultados de los niveles relativos del ARNm de Xbpls en la médula espinal.

Estos resultados se obtuvieron mediante el tratamiento con AAV-XBP1s en los ratones mediante una qPCR.

Los niveles del ARNm de Xbpls se normalizaron con los niveles del ARNm de la actina.

N.S., no significativo.

*, p < 0,05. N = 3 por grupo.

Figura 6/9

En general, estas figuras representan el tratamiento mediante inyecciones ICV de la terapia génica con AAV-XBP1s, en donde aumenta la supervivencia de SOD1G86R y en donde se retrasa la aparición de la enfermedad.

En el diagrama central superior se muestra una curva de Kaplan-Meyer donde se muestra la supervivencia obtenida por ambos grupos de SOD1G86R en los ratones transgénicos tratados con AAV-Mock/GFP o con AAV-XBP1s/GFP. Ambos tratamientos de los ratones No-Tg no presentaron muertes en ese momento y fueron excluidos del grupo para una mejor visualización.

La curva de Kaplan-Meyer en el diagrama central izquierdo se definió por la aparición de la pérdida de peso corporal calculada mediante la reducción del 5 % del peso total.

La curva de Kaplan-Meyer en el diagrama central a la derecha midió la duración de la fase sintomática según el peso corporal inicial y la curva de supervivencia en función de los datos de cada uno de los animales por separado.

La curva de Kaplan-Meyer en el diagrama inferior izquierdo está definida por el comportamiento de la prueba de Rotarod. En la curva de Kaplan-Meyer del diagrama inferior derecho se muestra el cálculo de la duración de la enfermedad en función de la determinación de la aparición de la enfermedad por la pérdida de peso corporal.

Algunos ratones no pasaron los criterios del período de entrenamiento y fueron excluidos del análisis.

Estadística: Prueba de Mantel Cox para las curvas de supervivencia.

t de Student para la prueba de la columna en grupos.

d: día

N = 7-11 por grupo

Barras de las gráficas: desviación estándar

N. S. = no significativo

Figura 7/9

En la figura superior se muestra la cuantificación de las células nerviosas motoras por inmunofluorescencia con tinción de NeuN y la segregación por tamaño en las células nerviosas del asta ventral de la médula espinal.

En la figura inferior se representa la cuantificación de la intensidad de la GFP en el asta ventral de un corte transversal de la médula espinal de un estado final de un ratón tratado con AAV-XBP1s/GFP y el vector de control.

N = 3-4 por grupo

Barras de las gráficas: desviación estándar

t de Student * = p < 0,05

N.S., no significativo

Escala de la barra: 200 pm

Figura 8/9

En la figura se muestra, en su parte superior izquierda, el resultado de una prueba de transferencia de tipo Western de los oligómeros de SOD1 a partir de un extracto de proteínas de la corteza frontal en condiciones no reductoras. Se usó un anticuerpo contra la actina como control de carga de las proteínas.

En el diagrama de la parte superior derecha se muestra la cuantificación de la agregación de SOD1 normalizada con la proteína de la actina.

En la fotografía del centro a la izquierda se presenta el resultado de una prueba de transferencia de tipo Western de los oligómeros de SOD1 de un extracto de proteínas de la médula espinal en condiciones no reductoras. Se usó un anticuerpo contra la actina como control de carga.

El diagrama del centro a la derecha corresponde a la cuantificación de la agregación de SOD1 normalizada con los niveles de la proteína HSP90.

La fotografía inferior izquierda corresponde a un experimento con las mismas muestras de los resultados presentados en la fotografía del centro a la izquierda con una trampa filtrante. La transferencia de tipo Western de los monómeros se ejecutó a partir de las mismas muestras utilizadas también como control de carga.

En el diagrama inferior derecho se presenta la cuantificación de los oligómeros de SOD1 retenidos por las pruebas de la trampa filtrante.

HWM: alto peso molecular

t de Student * = p < 0,05

N = 3 por grupo

N.S., no significativo

Figura 9/9

En esta figura se presentan los niveles del ARNm de XBP1s para los genes diana Edem y Erdj4 en el SNC en la fase presintomática (P90) y sintomática tardía en el tratamiento con AAV-XBP1s/GFP de los ratones con SOD1G86R. En los diagramas superiores de la derecha y de la izquierda se presentan los niveles relativos del ARNm de Edem y Erdj4 en la corteza frontal y la médula espinal de los ratones presintomáticos con SOD1G86R tratados con XBP1s, obtenidos por qPCR. Se cuantificaron los niveles de los ARNm y se normalizaron con los niveles de actina.

En los diagramas inferiores derecho e izquierdo se presentan los niveles relacionados con el ARNm de Edem y Erdj4 en la corteza frontal y la médula espinal de los ratones sintomáticos con SOD1G86R tratados con XBP1s, obtenidos por qPCR. Se cuantificaron los niveles de los ARNm y se normalizaron con los niveles de actina.

t de Student * = p < 0,05

N.S., no significativo

N = 3 por grupo

Ejemplo de aplicación

Prueba experimental 1

Para determinar los efectos terapéuticos de la expresión de XBP1s para el tratamiento de la ELA y/o para la reparación de los defectos en la proteostasis del RE, se administró el XBP1s a los ratones de la misma camada, al SNC de un mutante SOD1G86R de ratones transgénicos y a un ratón no transgénico (No-TG). El efecto del tratamiento con AAV-XBP1s/GFP y con AAV-Mock GFP sobre la progresión de la ELA se controló con crías de animales independientes. Extraordinariamente, el tratamiento de los ratones mutantes transgénicos con SOD1G86R con AAV-XBP1s/GFP dio como resultado un aumento sustancial de la supervivencia. (Figura 6/9 centro superior).

El aumento en la esperanza de vida de los ratones tratados con el XBP1s fue espectacular y aumentó en aproximadamente 60 días en comparación con el grupo de control al que se le inyectó AAV-Mock/GFP, lo que representa un fuerte efecto de protección en comparación con otros estudios del estado de la técnica (7, 23 y 38). La progresión de la enfermedad se vigiló con el registro de la pérdida de peso, la disminución de la actividad motora mediante la prueba de Rotarod y el registro de otros signos de la enfermedad (parálisis, temblores, curvatura de la médula espinal, etc.) que en conjunto ayudaron a saber cuando comenzó el estado sintomático de la enfermedad. El inicio de la etapa sintomática de la enfermedad se definió como una pérdida del 5 % de la masa corporal a partir de un peso máximo medido fuera del momento de la prueba. En la figura central 6/9 se muestra que los animales tratados con AAV-XBP1s/GFP experimentaron un retraso significativo en la aparición de la enfermedad en comparación con el mutante de SOD1 de la misma camada tratado con el virus AAV-Mock/GFP de control.

El inicio de la enfermedad mediante pruebas aceleradas de Rotarod se definió por la disminución del 50 % en la velocidad de la medición, por el tiempo promedio empleado en la tarea antes de fracasar. Este análisis confirmó un retraso significativo en la aparición de las alteraciones motoras en los ratones con la ELA en comparación con los ratones tratados con el AAV-Mock/GFP, tal y como se presenta en la figura 6/9 que viene más adelante.

Se calculó la duración de la fase sintomática mediante el uso de la supervivencia y el inicio de la recuperación de las enfermedades. En estos experimentos, la fase sintomática no fue significativamente diferente entre los grupos inoculados con AAV-XBP1s/GFP y con AAV-Mock/GFP (figura 6/9 centro derecho e inferior derecho).

Se obtuvieron los mismos resultados cuando el marcador de la enfermedad se definió mediante la observación visual. Por otro lado, la inyección del vehículo (PBS) o del control del VAA en los animales No-Tg no desencadenó ninguna novedad fenotípica en ninguna de las pruebas.

Prueba experimental 2

Un análisis del número de agregados de proteínas en las células nerviosas motoras y la astrocitosis en los ratones con SOD1G86R tratados con XBP1s se realizó durante la fase sintomática.

El análisis reveló que el retraso en el inicio de la enfermedad está asociado a los cambios de las características de la ELA, como astrogliosis, pérdida de células nerviosas motoras y/o agregación de las proteínas en los ratones con la SOD1 mutante. Para poder cuantificar este problema se realizó un análisis del tejido de la corteza frontal del cerebro y de la médula espinal del mismo ratón evaluado en las curvas de supervivencia a la vista de su funcionamiento mediante los análisis histológicos y bioquímicos de las características de la ELA.

Disminución de la pérdida de las células nerviosas motoras según se cuantificó por inmunofluorescencia mediante la detección de las células nerviosas con el anticuerpo anti-NeuN y la exclusión por tamaño mediante el programa informático ImageJ, para así analizar específicamente las motoneuronas, que presentan un mayor tamaño del soma que las interneuronas. El tratamiento de los ratones con SOD1G86R con AAV-XBP1s/GFP mostró una disminución de las células nerviosas grandes ubicadas en el asta ventral, lo que también se observó en los mismos ratones tratados con AAV-Mock/GFP. De hecho, no existen diferencias significativas entre los grupos experimentales de los ratones con SOD1G86R , tal y como se muestra en la parte superior de la figura 7/9. Sorprendentemente, la sobreexpresión de la proteína XBP1s en los ratones transgénicos con s OD1G86R conduce a una reducción casi completa de la astrogliosis en el asta central de los ratones sintomáticos, tal y como se muestra en la parte inferior de la figura 7/9. Estos resultados confirman los efectos beneficiosos del tratamiento con XBP1s en los astrocitos de la médula espinal en los ratones con SOD1G86R .

Otra característica del modelo de ratón con la ELA utilizado es la presencia de agregados de SOD1 en la corteza frontal del cerebro y en la médula espinal, observados en el análisis de transferencia de tipo Western. El análisis de estos ratones reveló una disminución significativa de los oligómeros y agregados en los mutantes de SOD1 en la corteza frontal, en los animales tratados con AAV-XBP1s/GFP en comparación con sus controles de AAV-Mock/GFP, como se puede observar en la parte superior izquierda y en la superior derecha de la figura 8/9. Sorprendentemente, las muestras de proteínas de la médula espinal del mismo ratón no mostraron ninguna reducción significativa de los agregados de SOD1 en los ratones tratados con XBP1s. Esto se puede ver en el centro derecha e izquierda de la figura 8/9. Para profundizar en este resultado, se decidió cambiar la estrategia y cuantificar los agregados proteicos mediante la prueba de la trampa con filtro. Se ejecutó la prueba de la trampa con filtro seguida de una transferencia para SOD1, lo que reveló la tendencia a la disminución de las especies de SOD1 de alto peso molecular en los ratones con SOD1G86R tratados con AAV-XBP1s/GFP (estos resultados se pueden ver en la fotografía y en el diagrama inferior izquierdo y derecho, respectivamente).

Por lo tanto, el aumento de la expresión de XBP1s en el SNC tiene dos impactos fundamentales relacionados con la ELA y asociados a una mayor esperanza de vida y a una mejora en el funcionamiento motor, tales como:

(i) La reducción de los agregados de SOD1

(ii) La reducción de las reacciones astrocíticas adversas.

Otro estudio realizado para confirmar los resultados obtenidos en las pruebas anteriores fue el análisis transcripcional en la etapa presintomática y en la etapa sintomática en los ratones perinatales inyectados con los AAV-XBP1s.

Una sobreexpresión temprana y sostenida de XBP1s en el SNC y un retraso en el inicio de la enfermedad sugieren cambios transcripcionales asociados a la activación posterior de las dianas de la UPR. Una posible diana de la reducción asociada a la XBP1 sobre la agregación de las proteínas SOD1 es un aumento en la maquinaria de degradación de proteínas en el RE. Un marcador clásico de este evento es la proteína EDEM. Mediante el análisis por qPCR de los niveles del ARNm de EDEM en la corteza frontal total o en la médula espinal de los ratones con SOD1G86R con 90 días de edad perinatal tratados con AAV-XBP1s/GFP se reveló un aumento significativo solo en las muestras de la médula espinal, tal y como se presenta en la figura 9/9 superior izquierda y derecha.

Otro posible efecto de XBP1 es la activación de las proteínas que corrigen las proteínas mal plegadas, tales como las chaperonas y las proteínas acompañantes de las chaperonas. Erdj4 es una cochaperona que se activa directamente con XBP1. Sorprendentemente, se observó un aumento significativo de los niveles del ARNm de Erdj4 en las muestras de la corteza frontal y de la médula espinal de los ratones con SOD1G86R tratados con XBP1 al compararlos con el resto de los grupos experimentales analizados, tal como se puede observar en la figura 9/9 superior izquierda y derecha.

Para la fase sintomática, el tratamiento con XBP1s no mostró diferencias significativas entre AAV-Mock/GFP o AAV-XBP1s/GFP en los ratones con SOD1G86R que recibieron las inyecciones, como se puede ver en la figura 9/9 abajo a la izquierda y a la derecha.

Experimentalmente, el tratamiento utilizado consistió en la administración intracerebroventricular (ICV) [2] de 2 pl del VAA que contiene la secuencia codificante de XBP1s de ratones, cuya expresión está regulada por el promotor constitutivo del ef1 (factor de elongación 1), en cinco neonatos diferentes de la misma camada de padres SOD1G86R * SOD1WT, es decir, entre los días P0 a P2.

Además, este vector contiene la secuencia codificante de la proteína GFP que se expresa gracias al promotor constitutivo de cmv. Esto corresponde a AAV-XBP1s (concentración de 2,9 x 1012 PRD/ml). Los ratones utilizados como control serán los ratones a los que se inyectó por vía ICV 2 pl del VAA que contiene la secuencia codificante de la proteína GFP regulada por el control del promotor de cba a cinco crías diferentes de padres SOD1G86R * SOD1WT. Esto corresponde a AAV-GFP (concentración de 1,22 x 1012 PRD/ml). También se vigilaron los ratones con SODWT y SOD1G86R que no recibieron ninguna inyección. Se utilizaron los VAA del serotipo 2 ya que se había probado que este serotipo posee un alto tropismo por las células nerviosas motoras.

Materiales y métodos

Animales y procedimientos de inoculación:

Para estudiar el efecto sobre la capacidad locomotora, sobre el peso corporal y sobre la supervivencia que tiene la sobreexpresión de XBP1s en el sistema nervioso central con el uso de los VAA en los ratones con el SOD1G86R mutante, se utilizaron ratones de la línea transgénica C57BL/6j para SOD1, en este caso con una mutación que cambia el residuo de la glicina 86 por uno de arginina (SOD1G86R). Esta mutación es equivalente a la mutación SODG85R encontrada en los humanos.

Los ratones con SOD1G86R presentan los marcadores clásicos de la ELA o ALS, tal como la presencia de agregados proteicos de alto peso molecular de la proteína SOD1, así como la astrogliosis, ambos en un estado sintomático tardío.

El tratamiento consiste en la administración ICV de 2 pl de los VAA que contienen la secuencia codificante de XBP1s de los ratones, cuya expresión está regulada por el promotor constitutivo de ef1 (factor de elongación 1) en cinco crías diferentes de padres SODG86R * SOD1WT, entre los días P0 y P2. Este vector también contiene la secuencia codificante de la proteína GFP que se expresa gracias al promotor constitutivo de cmv. Esto corresponde a AAV-XBP1s (concentración de 2,9 x 1012 PRM/ml).

A los ratones de control también se les inyectó ICV con 2 pl del VAA que contiene la secuencia codificante de la proteína GFP regulada por el control del promotor de cba a cinco crías diferentes de padres SODG86R * SOD1WT. Esto corresponde a AAV-GFP (concentración de 1,22 * 1012 PRM/ml). También se vigilaron los ratones con SODG86R y SOD1WT que no recibieron ninguna inyección.

Se utilizaron los VAA del serotipo 2 ya que este serotipo tiene un alto tropismo por las motoneuronas [55].

Se siguió la metodología de la inyección ICV según los protocolos indicados en las referencias.

Transcurridos 21 días desde la inyección ICV, se determinó el sexo de los ratones, se destetaron y se genotiparon. Después de establecer los ratones experimentales, se observan tres veces por semana para determinar el peso corporal, los cambios de fenotipo asociados al inicio de la etapa sintomática de la ELA o ALS mediante observaciones visuales y su capacidad locomotora utilizando la Rotarod.

Se utilizó un criterio de observación visual establecido para determinar el tiempo del sacrificio de los ratones sintomáticos con SODG86R. Además, se incluyó el sacrificio de un compañero de camada SODWT. El inicio o la edad equivalente al comienzo de la etapa sintomática se determinan arbitrariamente según la observación de un cambio drástico de un parámetro medido.

En este caso, el inicio del peso corporal se establece como la disminución del 5 % del peso del ratón con respecto a su peso máximo, siempre en un contexto de adelgazamiento, es decir, para establecer el inicio, al menos deben haberse registrado tres medidas previas de disminución del peso.

El comienzo de Rotarod se ha determinado como una disminución del 50 % del máximo del tiempo de Rotarod, también en el mismo contexto decreciente.

Para todos los experimentos con los animales presentados en este desarrollo se utilizaron las directrices establecidas por el comité de cuidado y uso de los animales de la Universidad de Chile (Chile).

Para el análisis de los niveles de agregación de la proteína SOD1 mutada, el número de motoneuronas y la astrogliosis en la médula espinal de los ratones SODG86R inyectados con AAV-XBP1s en un estado sintomático tardío, se utilizaron los análisis bioquímicos estándares del laboratorio del investigador.

El nivel de la agregación de la proteína de SOD1 y la expresión de los transgenes GFP y XBP1s se detectaron por transferencia de tipo Western; también se estudió la presencia del ARN que codifica la XBP1s, tal y como se describió previamente [56].

Pruebas de comportamiento:

Todos los experimentos se realizaron con anonimato y se utilizaron diferentes cohortes de animales para cada prueba.

Rotarod

Los ratones se colocaron en una barra que gira a 4 rpm durante un minuto de aclimatación. La varilla se aceleró a 0,1 rpm/s hasta 40,0 rpm. La prueba se continuó durante dos minutos. Se midió la latencia en la caída y las rpm en el momento de la caída de cada ratón. Se ejecutaron tres pruebas con cada ratón y se promediaron.

Criterios de las observaciones visuales

Este criterio para determinar el inicio de la enfermedad a través de las observaciones visuales [56] se produce cuando se observa un lomo claramente arqueado, desaliño personal y parálisis de las patas traresas del ratón.

Producción de los virus adenoasociados

Las partículas del vector de VAA del serotipo 2 (VAA2) se produjeron por la transfección de las células HEK293 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y se purificaron en un gradiente de yodixanol seguido de una cromatografía en columna de afinidad. Las partículas de VAA resultantes, así como su infectividad en las células HEK293T, se determinaron mediante las pruebas de qPCR de tipo TaqMan.

Preparación del plásmido del VAA con transgén (pAAV) para XBP1s.

El casete de expresión del gen murino de Xbp1s se aisló del plásmido pcDNA3-XBP-1s como un fragmento Mfel/Sphl y se insertó en el plásmido prevírico pAAVsp70 que contiene las repeticiones terminales invertidas (ITR). El vector contiene el casete de expresión de GFP que sirve de marcador de las células transducidas, aunque se podrían utilizar otros como Egfp, Flag, Gfp, His y Myc, entre otros. En el caso de la proteína GFP, fue descubierta en una especie de medusa llamada Aequorea victoria. Para mejorar la estabilidad de la proteína a la temperatura de los mamíferos (37 °C), se realizó una mutación a la secuencia que codifica la proteína GFP (F64L), que le otorgaba mayor estabilidad a la temperatura corporal. Esta nueva proteína se denomina EGFP (GFP mejorada) y es una proteína utilizada en este desarrollo. El virus recombinante AAV2-XBP1s se produjo por triple transfección de las células HEK-293T con los plásmidos con rep/cap y pHelper (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.), y se purificó mediante cromatografía en columna de afinidad, tal y como se describió anteriormente [1]. Para obtener las partículas víricas puras y concentradas, los lisados víricos de las células HEK-293T se trataron con tripsina y nucleasa seguido de una cromatografía de intercambio iónico usando hidroxiapatita cerámica y DEAE-Sepharose en combinación con la cromatografía de sulfato de Cellufine™. El título de los virus se determinó mediante PCR en tiempo real con una sonda de tipo TaqMan, con divisores específicos para la secuencia de poliA de BGH.

Inyecciones intracerebroventriculares

La inyección intracerebroventricular es un método ampliamente utilizado para obtener una alta transducción vírica en todo el sistema nervioso central (Castillo, K., et al, Measurement of autophagy fluxin the nervous system in vivo. «Cell death and disease», 2013. 4: p. e917, Glascock, J. J., et al., Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) andintravenous (IV) injection in mice. Journal of visualized experiments: JoVE, 2011(56)) y comentada recientemente por nuestro laboratorio (Matus, S., V. Valenzuela y C. Hetz A new method to measure autophagy flux in the nervous system. «Autophagy», 2014. 10(4); págs. 710-4).

Protocolo de la inyección intracerebroventricular

Materiales:

Alícuota del VAA en hielo

1 ml de PBS en hielo

FastGreen al 1 % (tinción)

Jeringa de insulina

Cinta adhesiva

P200 y micropipeta P20, consejos

Tablero de corcho recubierto con papel de aluminio, con un poco de almohada de papel de aluminio para la cabeza de la cría de animal

Bolsa de hielo

Parafilm (película de parafina sólida)

Luz fría

Marcador de punta fina

Este protocolo debe ejecutarse en una instalación especial para virus.

Preparación del VAA:

1. Diluir 2 pl de FastGreen en 28 pl de PBS.

2. Añadir 2,5 pl de la dilución de FastGreen a 10 pl de VAA.

3. La inyección de carga es de 2,5 pl por cría de animal.

4. La cantidad de virus utilizada en cada inyección corresponde a 2 pl del título vírico del VAA de menor concentración (AAV-GFP), es decir, 2,44 * 10⁷⁸⁹ partículas víricas. Por tanto, previamente, los AAV-XBP1s deben diluirse 2,3 veces para así tener un título vírico equivalente al del control AAV-GFp .

Preparación del contador de inyección:

1. Prepare la luz fría y el panel de corcho frente al lugar de trabajo. Ponga el hielo en el panel de corcho para mantenerlo frío.

2. Coloque un trozo de parafina sólida pegado en el lugar de trabajo, al lado del tablero de corcho, dibuje un círculo en el parafilm. Este círculo será el lugar donde colocar la gota de preparación del VAA. Coloque la gota de preparación del VAA (2,5 pl) en el círculo dibujado y luego cárguela con cuidado en la jeringa de insulina para evitar burbujas. 3. Separe la cría de animal de su madre. Esta etapa es crucial. La retirada de la cría de animal de su madre es muy importante para evitar el estrés de la madre (la madre se da cuenta de que hay una cría, esto es una situación estresante para ellos).

En primer lugar, los guantes del investigador se impregnan del olor del lecho antes y después de recoger la cría de animal. Para recoger la cría del animal, golpee la jaula en el punto opuesto al nido para obligar a la madre a abandonar el nido. Cuando ocurra esto, solo se retira una cría del animal cada la vez. Luego coloque la cría del animal en el hielo para anestesiarla. Espere hasta que ya no se mueva (entre 2 y 4 minutos).

4. Cuando el ratón esté completamente anestesiado, coloque la cría de animal en el tablero de corcho (con el lado dorsal hacia arriba) y sujételo suavemente con dos tiras de cinta adhesiva, una sobre la espalda y la otra sobre la nariz.

5. Dibuje un punto en el bregma y luego un punto en la distancia promedio entre el bregma y un globo ocular (yo uso el lado izquierdo, para personas diestras), este es el punto de inyección.

6. Coloque la jeringa cargada en el punto de inyección, tenga en cuenta que el bisel debe estar apuntando hacia la línea media, luego gire la posición de la jeringa aproximadamente 10 grados hacia la derecha (exterior) y 10 grados hacia usted (véase la figura). Luego inserte la jeringa entre 3 y 4 mm en la dirección del eje de la jeringa e inyecte el contenido suavemente, y después retire la jeringa con cuidado. Debe ver la difusión del colorante por ambos ventrículos laterales, a veces se puede ver a su paso por la parte posterior del cerebro. La inyección ha fallado cuando se observa la tinción con distribución subcutánea.

7. Coloque la cría del animal en un recipiente caliente hasta que comience a abrir la boca (esto es después del primer movimiento de las extremidades), lo que se toma aproximadamente 20 segundos. Luego coloque la cría del animal nuevamente en la jaula, específicamente en el lugar opuesto al nido de la madre, medio enterrada, luego "llame" a su madre golpeando la jaula, la madre comenzará a buscarla. Es una buena señal cuando la madre toma la cría y la coloca en el nido.

8. Todos los residuos que hayan tenido contacto con el virus deben ser eliminados en un contenedor especial. Preparación de los tejidos para el análisis bioquímico.

Los ratones se sacrificaron mediante la narcosis de CO² , se les retiró el cerebro, luego se diseccionaron rápidamente la corteza y la médula espinal, de ambos hemisferios, en una placa de plástico enfriada con hielo. A continuación, el tejido se homogeneiza (médula espinal o corteza cerebral) en PBS, un tampón de fosfato, y luego el homogeneizado se divide en dos fracciones:

1) Homogeneización de proteínas; y

2) Homogeneizado en Trizol para extraer el ARN.

El homogeneizado de proteínas se vuelve a dividir para dejar la mitad en el tampón RIPA, tampón que se utiliza para observar las proteínas en general; y la otra mitad en una solución al 1 % de Tritón en PBS, detergente más suave para conservar los agregados proteicos. La cantidad de proteína de cada muestra se cuantifica mediante el protocolo de BCA y los geles se cargan con las siguientes muestras:

1) Muestras en Triton X-100 al 1 % sin DTT en un gel de poliacrilamida al 15 %. Este gel se utiliza para observar los agregados proteicos, en este caso, agregados de la proteína SOD1.

2) Muestras en el tampón RIPA con DTT en dos geles de poliacrilamida al 8 % para observar las proteínas indicadoras de tipo GFP y la XBP1s por separado.

Extracción de ARN y PCR en tiempo real

El ARN total se aisló de la médula espinal y de la corteza cerebral total. El resto del homogeneizado en Trizol se utiliza para extraer el ARN. Se ejecutará una síntesis del ADNc a partir del RNA. Luego se ejecutará la prueba de PCR para amplificar un fragmento correspondiente al ADNc de Xbp1s. A continuación, este producto de PCR se incubará con la enzima de restricción Pstl, que digiere exclusivamente el fragmento que corresponde a la forma no procesada de Xbp1; por lo tanto, esta prueba permite resolver de manera adecuada las formas procesadas (Xbp1s) y sin procesar (Xbp1u) de Xbp1 en un gel de agarosa al 2,5 % en una electroforesis [6]. En concreto, el ADNc se sintetizó con un kit de ADNc de transcripción inversa de alta capacidad (Applied Biosystems). Se utilizaron SYBR Green y un sistema de qPCR Mx3005P (Stratagene) para la RT-PCR cuantitativa. La cantidad relativa del ARNm se calculó mediante el método que compara el ciclo de umbral con la p-actina como control.

Transferencia de tipo Western de tejido

La extracción de las proteínas del tejido de los ratones se realizó en el tampón RIPA (20 mM de Tris pH 8,0, NaCl a 150 mM, 0,1 % de SDS, desoxicolato al 0,5 %, 0,5 % de Triton X-100) que contiene una mezcla de inhibidores de proteasas y una mezcla de inhibidores de fosfatasas (Sigma, EE. UU.). Un ejemplo de esta cuantificación se realizó con el kit de prueba de BCA (Pierce, EE. UU.). Los extractos celulares totales se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Se usaron los siguientes anticuerpos para el análisis de inmunotransferencia: Hsp90 (1:3000, Calbiochem 574597).

Preparación del tejido y análisis histológico

Los ratones se sacrificaron por narcosis de CO2 y se perfundieron con paraformaldehído al 4 %. Se les extrajo el cerebro, que luego se fijó durante la noche a 4 °C en la misma solución y posteriormente se colocaron al 30 % de sacarosa (Merck, EE. UU.) a 4 °C durante 48 h. Se congelaron los cerebros en un compuesto óptimo para su corte a una temperatura adecuada (Tissue Tek, EE. UU.), se cortaron secciones transversales de 25 pm de la médula espinal en un criostato (Leica, Alemania) y luego se montaron en los portaobjetos y se llevaron a cabo las incubaciones con los anticuerpos correspondientes para identificar las células nerviosas o los astrocitos. La cantidad de la transducción vírica se determinará en varios tejidos del sistema nervioso central (cerebro, médula espinal y nervio ciático) mediante la observación de la fluorescencia de la proteína indicadora GFP en un microscopio de fluorescencia. Para determinar los cambios celulares asociados al tratamiento se realizará la inmunofluorescencia con anticuerpos para identificar los diferentes tipos celulares, tales como las células nerviosas (anti-NeuN, MAB377, Millipore Bioscience Research Reagents, Billerica, MA, EE. UU.), los astrocitos (N1506, Dako, Glostrup, Dinamarca) y la microglía (MCA74G, Serotec, Morphosys, Oxford, Reino Unido).

Protocolo de inmunofluorescencia de cortes de la médula espinal montados en portaobjetos

Materiales

Cajas de incubación (cámara húmeda)

Acoplamiento de la incubación

Anticuerpos

Tampón de bloqueo

Fluoromount®

Preparación del tampón de bloqueo:

Seroalbúmina bovina (SAB) al 5 % en Tritón al 0,05 %.

Procedimiento

Los portaobjetos se lavan tres veces con PBS durante 10 min cada uno.

Se bloquean con el tampón de bloqueo durante 1 h en una cámara húmeda.

El anticuerpo primario diluido en el tampón de bloqueo se coloca durante 2-3 h o durante una noche en la cámara húmeda.

Se realizan 3 lavados de 10 min con PBS.

El anticuerpo secundario diluido en el tampón de bloqueo se coloca durante 2 h en la cámara húmeda.

Se realizan 3 lavados de 10 min con PBS.

Los cortes se montan con el Fluoromount y se sellan los portaobjetos con esmalte.

Los portaobjetos se mantienen en la caja de incubación seca a 4 °C.

Los niveles de transducción del virus se determinaron en diferentes tejidos del sistema nervioso central (cerebro, médula espinal y nervio ciático) mediante la observación de la fluorescencia de la proteína indicadora GFP en un microscopio de fluorescencia. Para determinar los cambios celulares asociados al tratamiento se llevará a cabo la inmunofluorescencia con anticuerpos para identificar los diferentes tipos celulares, tales como las células nerviosas (anti-NeuN, MAB377, Millipore Bioscience Research Reagents, Billerica, MA, EE. UU.), los astrocitos (N1506, Dako, Glostrup, Dinamarca) y la microglía (MCA74G, Serotec, Morphosys, Oxford, Reino Unido).

Estadística

Los datos se expresan como la media y el EEM. Dependiendo de los experimentos, los resultados se compararon estadísticamente con la prueba de la t de Student o la prueba de Mann-Whitney, de ANOVA de dos vías seguida de la prueba post-hoc de Holm-Sidack o de Bonferroni, o ANOVA de una vía de Kruskal-Wallis en rangos seguida por la prueba post-hoc del método de Dunn o de Bonferroni.

Referencias

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Tabla I

ORIGEN

1 CCGGTGCCTA GAGAAGGTGG CGCGGGGTAA ACTGGGAAAG TGATGTCGTG TACTGGCTCC

61 GCCTTTTTCC CGAGGGTGGG GGAGAACCGT ATATAAGTGC AGTAGTCGCC GTGAACGTTC 121TTTTTCGCAA CGGGTTTGCC GCCAGAACAC AGGTAAGTGC CGTGTGTGGTTCCCGCGGGC 181 CTGGCCTCTTTACGGGTTAT GGCCCTTGCG TGCCTTGAAT TACTTCCACC TGGCTGCAGT 241 ACGTGATTCT TGATCCCGAG CTTCGGGTTG GAAGTGGGTG GGAGAGTTCG AGGCCTTGCG

301 CTTAAGGAGC CCCTTCGCCT CGTGCTTGAG TTGAGGCCTG GCCTGGGCGC TGGGGCCGCC

361 GCGTGCGAAT CTGGTGGCAC CTTCGCGCCT GTCTCGCTGC TTTCGATAAG TCTCTAGCCA 421 TTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGC l i l i l í ICTG GCAAGATAGTCTTGTAAATG 481 CGGGCCAAGA TCTGCACACT GGTATTTCGG TTTTTGGGGC CGCGGGCGGC GACGGGGCCC

541 GTGCGTCCCA GCGCACATGT TCGGCGAGGC GGGGCCTGCG AGCGCGGCCA CCGAGAATCG

6G1 GACGGGGGTA GTCTCAAGCT GGCCGGCCTG CTCTGGTGCC TGGCCTCGCG CCGCCGTGTA

661 TCGCCCCGCC CTGGGCGGCA AGGCTGGCCC GGTCGGCACC AGTTGCGTGA GCGGAAAGAT

721 GGCCGCTTCC CGGCCCTGCT GCAGGGAGCT CAAAATGGAG GACGCGGCGC TCGGGAGAGC

781 GGGCGGGTGA GTCACCCACA CAAAGGAAAA GGGCCTTTCC GTCCTCAGCC GTCGCTTCAT

841 GTGACTCCAC GGAGTACCGG GCGCCGTCCA GGCACCTCGA TTAGTTCTCG AGCTTTTGGA 901 GTACGTCGTCTTTAGGTTGG GGGGAGGGGTTTTATGCGAT GGAGTTTCCC CACACTGAGT 961 GGGTGGAGAC TGAAGTTAGG CCAGCTTGGC ACTTGATGTA ATTCTCCTTG GAATTTGCCC 1021TTTTTGAGTT TGGATCTTGG TTCATTCTCA AGCCTCAGAC AGTGGTTCAA AGI I I I I I IC 1081TTCCATTTCA GGTGTCGTGA GGAATTAGCTTGGTACTAGA GGATCCCCGG TCGCCACCAT 1141 GGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG

1201 CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG

1261CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT 1321 CGTGACCACC CTGACCTACG GCGTGCAGTG CTTCAGCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA

1381 GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT 1441 CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT

1501 GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA

1561 GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG

1621 CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA

1681 CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCCG ACAACCACTA

1741 CCTGAGCACC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT

1801 GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAAG

1861 CGGCCAAATC GTACGCCTAG GTGATCAAGA TCTGCTAGCT TAATTAACCC GGGACTAGTG

1921 CGGCCGCCAC CGCGGGGATC CAGACATGAT AAGATACATT GATGAGTTTG GACAAACCAC

1981AACTAGAATG CAGTGAAAAA AATGCTTTAT TTGTGAAATT TGTGATGCTA TTGCTTTATT 2041TGTAACCATT ATAAGCTGCA ATAAACAAGT TAACAACAAC AATTGCATTC ATTTTATGTT 2101 TCAGGTTCAG GGGGAGGTGT GGGAGGTTTT TTCGGATCCT CTAGAGTCGA CCGGACCGCT

2161 GCAGGCATGC CTGCTATTGT CTTCCCAATC CTCCCCCTTG CTGTCCTGCC CCACCCCACC 2221 CCCCAGAATA GAATGACACC TACTCAGACA ATGCGATGCA ATTTCCTCAT TTTATTAGGA 2281 AAGGACAGTG GGAGTGGCAC CTTCCAGGGT CAAGGAAGGC ACGGGGGAGG GGCAAACAAC

2341 AGATGGCTGG CAACTAGAAG GCACAGTCGA GGTGATCAGC GGGTTTAAAC GGGCCCTCTA

2401GTAACGGCCG CCAGTGTGCT GGAATTCGCC CTTCAGGCCT ATGCTATCCT CTAGGCAATG 2461 TGATGGTCAG GGAAAGGGGC CCAGTGTTAT GTGGCTCTTT AGACACTAAT CAGCTGGGGG

2521 AAAAGTTCAT TGGCAAAAGT ATCCTCCCAG GAGTGGTCTG TACCAAGTGG AGAAGACATG

2581 TCACTGAAGG GAGAAGGGGA GCCCTCATAT CCACAGTCAC TGTGAGCGTC CAGCAGGCAA

2641 GAAGGTGGTC TCAGACAATG GCTGGATGAA AGCAGGTTTG AGATGCCCAG CTCTGGGATG

2701 AAGTCATCTT CCAAAGGCTC TTTCTTCACT GAGACAATGA ATTCAGGGTG ATCCTCTTCT 2761 GAAGAGCTTA GAGGTGCTTC CTCAATTTTC ACTACCACGT TAGTTTGACT CTCTGTCTCA 2821 GAGGGGATCT CTAAAACTAG AGGCTTGGTG TATACATGGT CAAAACGAAT GAGTTCATTA

2881 ATGGCTTCCA GCTTGGCTGA TGAGGT CCCC ACTGACAGAG AAAGGGAG6C TGGTAAGGAA

2941 CTAGGTCCTT CTGGGTAGAC CTCTGGGAGT TCCTCCAGAC TAGCAGACTC TGGGGAAGGA

3001 CATTTGAAAA ACATGACAGG GTCCAACTTG TCCAGAATGC CCAAAAGGAT ATCAGACTCA

3061 GAATCTGAAG AGGCAACAGT GTCAGAGTCC ATGGGAAGAT GTTCTGGGGA GGTGACAACT

3121 GGGCCTGCAC CTGCTGCGGA CTCAGCAGAC CCGGCCACCA GCCTTACTCC ACTCCCCTTG 3181 GCCTCCACCT CTGGAACCTC GTCAGGATCC AGCGTGTCCA TTCCCAAGCG TGTTCTTAAC 3241 TCCTGGTTCT CAACCACAAG GCCGTGAGTT TTCTCCCGTA AAAGCTGATT TTCTAGCTGG 3301 AGTTTGTGGT TCTCTTCTTC CAAATCCACC ACTTGCTGCT CCAGCTCGCT CATCCGGGCT 3361 TTCTTTCTAT CTCGAGCAGT CTGCGCTGCT ACTCTGTTTT TCAGTTTCCT CCGCAGCGCT 3421 TTCTCCTCCG GGCTCAGGTG CGTGAGCCGC TGCCGCTTGC GAGCCTGCGG TGTCCCGCTC 3481 GCCTCCGACC CTGCTGCCCG CGGACCGGGT ACCATGAGCG GCAGCGCCCG GCCGCCGGAG

3541 GCGGGCTGGC CAGATAAGAG TAGCACTTTG GGGGCCGCCG TGGCCGCGCT CGGCGCCGCT

3601 GCCACCACCA CCATAGCCAG GAAGCTTAAG TTTAAACGCT AGCCAGCTTG GGTCTCCCTA 3661 TAGTGAGTCG TATTAATTTC GATAAGCCAG TAAGCAGTGG GTTCTCTAGT TAGCCAGAGA

3721 GCTCTGCTTATATAGACCTC CCACCGTACA CGCCTACCGC CCATTTGCGT CAATGGGGCG 3781 GAGTTGTTAC GACATTTTGG AAAGTCCCGTTGATTTTGGT GCCAAAACAA ACTCCCATTG 3841 ACGTCAATGG GGTGGAGACT TGGAAATCCC CGTGAGTCAA ACCGCTATCC ACGCCCATTG

3901 ATGTACTGCC AAAACCGCAT CACCATGGTA ATAGCGATGA CTAATACGTA GATGTACTGC 3961 CAAGTAGGAA AGTCCCATAA GGTCATGTAC TGGGCATAAT GCCAGGCGGG CCATTTACCG

4021 TCATTGACGT CAATAGGGGG CGTACTTGGC ATATGATACA CTTGATGTAC TGCCAAGTGG

4081 GCAGTTTACC GTAAATACTC CACCCATTGA CGTCAATGGA AAGTCCCTAT TGGCGTTACT 4141 ATGGGAACAT ACGTCATTAT TGACGTCAAT GGGCGGGGGT CGTTGGGCGG TCAGCCAGGC

4201 GGGCCATTTA CCGTAAGTTA TGTAACGCGG AACTCCATAT ATGGGCTATG AACTAATGAC

4261 CCCGTAATTG ATTACTATTA ATAACTAGTC AATAATCAAT GTCAACGCGT ATATCTGGCC 4 321 CGTACATCGC GAAGCAGCGC AAAACGCCTA ACCCTAAGCA GATTCTTCAT GCAATTGCCT 4381 AGTTCGAAGC CACGCGTCCG AAGGGCGAAT TGTAGATAAG TAGCATGGCG GGTTAATCAT

4441 TAACTACAAG GAACCCCTAG TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTGCGCG CTCGCTCGCT 4501 CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGGC TTTGCCCGGG CGGCCTCAGT

4561 GAGCGAGCGA GCGCGCAGAG AGGGACAGAT CTGCCGGTCT CCCTATAGTG AGTCGTATTA

4621 ATTTCGATAA GCCAGGTTAA CCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT

4681 TTGCGTATTG GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG 4741 CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG

4801 GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG

4861 GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA 4921 CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT

4981 GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC 5041 TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CAATGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG 5101 GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC

5161 TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA 5221 CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG

5281TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGG A CAGTATTTGG TATCTGCGCT 5341 CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC

5401 ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA

5461TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA 5521 CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT 5581 TAAAAATG AA GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TG ACAGTTAC 5641 CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT 5701 GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC TGGCCCCAGT

5761 GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG

5821 CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT

5881 ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT 5941 GTTGCCATTG CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC 6001 TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT

6061 AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG 6121 GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG 6181 ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATAGTGTA TGCGGCGACC GAGTTGCTCT

6241 TGCCCGGCGT CAATACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC

6301 ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT GAGATCCAGT

6361 TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT 6421 TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG

6481 AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT 6541 TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG

6601 CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC GTCTAAGAAA CCATTATTAT CATGACATTA 6661 ACCTATAAAA ATAGGCGTAT CACGAGGCCC TTTCGTCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT 6721 GAAAACCTCT GACACATGCA GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC

6781 GGGAGCAGAC AAGCCCGTCA GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG GGGCTGGCTT

6841 AACTATGCGG CATCAGAGCA GATTGTACTG AGAGTGCACC ATATGGACAT ATTGTCGTTA

6901 GAACGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC ACATACGATT TAGGTGACAC 6961 TATAGAACTC GAGCAGCTGA AGCTTGAATT CATCGATGAT ATCAGATCTG GGCCACTCCC 7021 TCTCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGGC

7081 TTTGCCCGGG CGGCCTCAGT GAGCGAGCGA GCGCGCAGAG AGGGAGTGGC CAACTCCATC

7141 ACTAGGGGTT CCTGGAGGGG TGGAGTCGTG ACAATTCGCC CTTGGGCCTA GGCAATTGGA

7201 TCCGCC

Tabla II

Xbpls (Humano) (SEQ ID NO: 2)

ORIGEN

1 GGCGCTGGGC GGCTGCGGCG CGCGGTGCGC GGTGCGTAGT CTGGAGCTAT GGTGGTGGTG 61 GCAGCCGCGC CGAACCCGGC CGACGGGACC CCTAAAGTTC TGCTTCTGTC GGGGCAGCCC 121 GCCTCCGCCG CCGGAGCCCC GGCCGGCCAG GCCCTGCCGC TCATGGTGCC AGCCCAGAGA 181 GGGGCCAGCC CGGAGGCAGC GAGCGGGGGG CTGCCCCAGG CGCGCAAGCG ACAGCGCCTC 241 ACGCACCTGA GCCCCGAGGA GAAGGCGCTG AGGAGGAAAC TGAAAAACAG AGTAGCAGCT 301 CAGACTGCCA GAGATCGAAA GAAGGCTCGA ATGAGTGAGC TGGAACAGCA AGTGGTAGAT 361 TTAGAAGAAG AGAACCAAAA ACTm G CTA GAAAATCAGC TTTTACGAGA GAAAACTCAT 421 GGCCTTGTAG TTGAGAACCA GGAGTTAAGA CAGCGCTTGG GGATGGATGC CCTGGTTGCT 481 GAAGAGGAGG CGGAAGCCAA GGGGAATGAA GTGAGGCCAG TGGCCGGGTCTGCTGAGTCC 541 GCAGCAGGTG CAGGCCCAGT TGTCACCCCT CCAGAACATC TCCCCATGGA TTCTGGCGGT 601 ATTGACTCTT CAGATTCAGA GTCTGATATC CTGTTGGGCA TTCTGGACAA CTTGGACCCA 661 GTCATGTTCTTCAAATGCCC TTCCCCAGAG CCTGCCAGCC TGGAGGAGCT CCCAGAGGTC 721 TACCCAGAAG GACCCAGTTC CTTACCAGCC TCCCTTTCTC TGTCAGTGGG GACGTCATCA 781 GCCAAGCTGG AAGCCATTAA TGAACTAATT CGTTTTGACC ACATATATAC CAAGCCCCTA 341 GTCTTAGAGA TACCCTtTGA GACAGAGAGC CAAGCTAATG TGGTAGTGAA AATCGAGGAA 901 GCACCTCTCA GCCCCTCAGA GAATGATCAC CCTGAATTCA TTGTCTCAGT GAAGGAAGAA 961 CCTGTAGAAG ATGACCTCGT TCCGGAGCTG GGTATCTCAA ATCTGCTTTC ATCCAGCCAC 1021TGCCCAAAGC ^{c a tc ttc c tg c c t a c t g g a t g c t t a c a g t g a c t g t g g a t a c g g g g g t t c c} 1081 CTTTCCCCAT TCAGTGACAT GTCCTCTCTG CTTGGTGTAA ACCATTCTTG GGAGGACACT

1141 ^{tt tg c c a a tg a a c t c t t t c c c c a g c t g a t t a g t g t c t a a g g a a t g a t c c a a t a c t g t t g c} 1201 CCTTTTCCTT GACTATTACA CTGCCTGGAG GATAGCAGAG AAGCCTGTCT GTACTTCATT 1261 CAAAAAGCCA AAATAGAGAG TATACAGTCC TAGAGAATTC CTCTATTTGT TCAGATCTCA 1321 TAGATGACCC CCAGGTATTG TCTTTTGACA TCCAGCAGTC CAAGGTATTG AGACATATTA 1381 CTGGAAGTAA GAAATATTAC TATAATTGAG AACTACAGCT TTTAAGATTG TACTTTTATC 1441 TTAAAAGGGT GGTAGTTTTC CCTAAAATAC TTATTATGTA AGGGTCATTA GACAAATGTC 1501 TTGAAGTAGA CATGGAATTT ATGAATGGTT CTTTATCATT TCTCTTCCCC CTTTTTGGCA 1561 TCCTGGCTTG CCTCCAGTTT TAGGTCCTTT AGTTTGCTTC TGTAAGCAAC GGGAACACCT 1621 GCTGAGGGGG CTCTTTCCCT CATGTATACT TCAAGTAAGA TCAAGAATCT TTTGTGAAAT 1681 TATAGAAATT TACTATGTAA ATGCTTGATG GAATTTTTTC CTGCTAGTGT AGCTTCTGAA 1741 AGGTGCTTTC TCCATTTATT TAAAACTACC CATGCAATTA AAAGGTACAA TGCAAAAAAA 1801 AAAAAAAAAA

Tabla III

Virus adenoasociado 2, genoma completo (SEQ ID NO: 3)

GenBank: AF043303.1

ORIGEN

1TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC 61 CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG AGAGGGAGTG

121 GCCAACTCCA TCACTAGGGG TTCCTGGAGG GGTGGAGTCG TGACGTGAAT TACGTCATAG

181 GGTTAGGGAG GTCCTGTATT AGAGGTCACG TGAGTGTTTT GCGACATTTT GCGACACCAT 241 GTGGTCACGC TGGGTATTTA AGCCCGAGTG AGCACGCAGG GTCTCCATTT TGAAGCGGGA

301 GGTTTGAACG CGCAGCCGCC ATGCCGGGGT TTTACGAGAT TGTGATTAAG GTCCCCAGCG

361 ACCTTGACGA GCATCTGCCC GGCATTTCTG ACAGCTTTGT GAACTGGGTG GCCGAGAAGG

421 AATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGG ATCTGAATCT GATTGAGCAG GCACCCCTGA 481 CCGTGGCCGA GAAGCTGCAG CGCGACTTTC TGACGGAATG GCGCCGTGTG AGTAAGGCCC

541 CGGAGGCCCTTTTCTTTGTG CAATTTGAGA AGGGAGAGAG CTACTTCCAC ATGCACGTGC 601 TCGTGGAAAC CACCGGGGTG AAATCCATGG TTTTGGGACG TTTCCTGAGT CAGATTCGCG 661 AAAAACTGAT TCAGAGAATT TACCGCGGGA TCGAGCCGAC TTTGCCAAAC TGGTTCGCGG

721 TCACAAAGAC CAGAAATGGC GCCGGAGGCG GGAACAAGGT GGTGGATGAG TGCTACATCC

781 CCAATTACTT GCTCCCCAAA ACCCAGCCTG AGCTCCAGTG GGCGTGGACT AATATGGAAC 841 AGTATTTAAG CGCCTGTTTG AATCTCACGG AGCGTAAACG GTTGGTGGCG CAGCATCTGA 901 CGCACGTGTC GCAGACGCAG GAGCAGAACA AAGAGAATCA GAATCCCAAT TCTGATGCGC

961 CGGTGATCAG ATCAAAAACT TCAGCCAGGT ACATGGAGCT GGTCGGGTGG CTCGTGGACA

1021 AGGGGATTAC CTCGGAGAAG CAGTGGATCC AGGAGGACCA GGCCTCATAC ATCTCCTTCA

1081 ATGCGGCCTC CAACTC6CGG TCCCAAATCA AGGCTGCCTT GGACAATGCG GGAAAGATTA

1141 TGAGCCTGAC TAAAACCGCC CCCGACTACC TGGTGGGCCA GCAGCCCGTG GAGGACATTT

1201 CCAGCAATCG GATTTATAAA ATTTTGGAAC TAAACGGGTA CGATCCCCAA TATGCGGCTT 1261 CCGTCTTTCT GGGATGGGCC ACGAAAAAGT TCGGCAAGAG GAACACCATC TGGCTGTTTG

1321 GGCCTGCAAC TACCGGGAAG ACCAACATCG CGGAGGCCAT AGCCCACACT GTGCCCTTCT

1381 ACGGGTGCGT AAACTGGACC AATGAGAACT TTCCCTTCAA CGACTGTGTC GACAAGATGG

1441 TGATCTGGTG GGAGGAGGGG AAGATGACCG CCAAGGTCGT GGAGTCGGCC AAAGCCATTC

1501 TCGGAGGAAG CAAGGTGCGC GTGGACCAGA AATGCAAGTC CTCGGCCCAG ATAGACCCGA

1561 CTCCCGTGAT CGTCACCTCC AACACCAACA TGTGCGCCGT GATTGACGGG AACTCAACGA

1621 CCTTCGAACA CCAGCAGCCG TTGCAAGACC GGATGTTCAA ATTTGAACTC ACCCGCCGTC 1681 TGGATCATGA CTTTGGGAAG GTCACCAAGC AGGAAGTCAA AGACTTTTTC CGGTGGGCAA

1741 AGGATCACGT GGTTGAGGTG GAGCATGAAT TCTACGTCAA AAAGGGTGGA GCCAAGAAAA

1801 GACCCGCCCC CAGTGACGCA GATATAAGTG AGCCCAAACG GGTGCGCGAG TCAGTTGCGC

1861 AGCCATCGAC GTCAGACGCG GAAGCTTCGA TCAACTACGC AGACAGGTAC CAAAACAAAT

1921 GTTCTCGTCA CGTGGGCATG AATCTGATGC TGTTTCCCTG CAGACAATGC GAGAGAATGA

1981ATCAGAATTC AAATATCTGC TTCACTCACG GACAGAAAGA CTGTTTAGAG TGCTTTCCCG 2041 TGTCAGAATC TCAACCCGTT TCTGTCGTCA AAAAGGCGTA TCAGAAACTG TGCTACATTC 2101 ATCATATCAT GGGAAAGGTG CCAGACGCTT GCACTGCCTG CGATCTGGTC AATGTGGATT

2161TGGATGACTG CATCTTTGAA CAATAAATGATTTAAATCAG GTATGGCTGC CGATGGTTAT 2221 CTTCCAGATT GGCTCGAGGA CACTCTCTCT GAAGGAATAA GACAGTGGTG GAAGCTCAAA

2281 CCTGGCCCAC CACCACCAAA GCCCGCAGAG CGGCATAAGG ACGACAGCAG GGGTCTTGTG

2341 CTTCCTGGGT ACAAGTACCT CGGACCCTTC AACGGACTCG ACAAGGGAGA GCCGGTCAAC

2401 GAGGCAGACG CCGCGGCCCT CGAGCACGAC AAAGCCTACG ACCGGCAGCT CGACAGCGGA

2461 GACAACCCGT ACCTCAAGTA CMCCACGCC GACGCGGAGT TTCAGGAGCG CCTTAAAGAA

2521 GATACGTCTT TTGGGGGCAA CCTCGGACGA GCAGTCTTCC AGGCGAAAAA GAGGGTTCTT

2581 GAACCTCTGG GCCTGGTTGA GGAACCTGTT AAGACGGCTC CGGGAAAAAA GAGGCCGGTA

2641 GAGCACTCTC CTGTGGAGCC AGACTCCTCC TCGGGAACCG GAAAGGCGGG CCAGCAGCCT

2701 GCAAGAAAAA GATTGAATTT TGGTCAGACT GGAGACGCAG ACTCAGTACC TGACCCCCAG

2761 CCTCTCGGAC AGCCACCAGC AGCCCCCTCT GGTCTGGGAA CTAATACGAT GGCTACAGGC

2821 AGTGGCGCAC CAATGGCAGA CAATAACGAG GGCGCCGACG GAGTGGGTAA TTCCTCGGGA

2881 AATTGGCATT GCGATTCCAC ATGGATGGGC GACAGAGTCA TCACCACCAG CACCCGAACC

2941 TGGGCCCTGC CCACCTACAA CAACCACCTC TACAAACAAA TTTCCAGCCA ATCAGGAGCC 3001 TCGAACGACA ATCACTACTTTGGCTACAGC ACCCCTTGGG GGTATTTTGA CTTCAACAGA 3061 TTCCACTGCC ACTTTTCACC ACGTGACTGG CAAAGACTCA TCAACAACAA CTGGGGATTC 3121 CGACCCAAGA GACTCAACTT CAAGCTCTTT AACATTCAAG TCAAAGAGGT CACGCAGAAT 3131 GACGGTACGA CGACGATTGC CAATAACCTT ACCAGCACGG TTCAGGTGTT TACTGACTCG

3241 GAGTACCAGCTCCCGTACGT CCTCGGCTCG GCGCATCAAG GATGCCTCCC GCCGTTCCCA 3301 GCAGACGTCT TCATGGTGCC ACAGTATGGA TACCTCACCC TGAACAACGG GAGTCAGGCA

3361 GTAGGACGCT CTTCATTTTA CTGCCTGGAG TACTTTCCTT CTCAGATGCT GCGTACCGGA 3421 AACAACTTTA CCTTCAGCTA CACTTTTGAG GACGTTCCTT TCCACAGCAG CTACGCTCAC 3481 AGCCAGAGTC TGGACCGTCT CATGAATCCT CTCATCGACC AGTACCTGTA TTACTTGAGC 3541 AGAACAAACA CTCCAAGTGG AACCACCACG CAGTCAAGGC TTCAGTTTTC TCAGGCCGGA

3601 GCGAGTGACA TTCGGGACCA GTCTAGGAAC TGGCTTCCTG GACCCTGTTA CCGCCAGCAG

3661 CGAGTATCAA AGACATCTGC GGATAACAAC AACAGTGAAT ACTCGTGGAC TGGAGCTACC

3721 AAGTACCACC TCAATGGCAG AGACTCTCTG GTGAATCCGG GCCCGGCCAT GGCAAGCCAC

3781 AAGGACGATG AAGAAAAGTT TTTTCCTCAG AGCGGGGTTC TCATCTTTGG GAAGCAAGGC

3841 TCAGAGAAAA CAAATGTGGA CATTGAAAAG GTCATGATTA CAGACGAAGA GGAAATCAGG

3901 ACAACCAATC CCGTGGCTAC GGAGCAGTAT GGTTCTGTAT CTACCAACCT CCAGAGAGGC

3961 AACAGACAAG CAGCTACCGC AGATGTCAAC ACACAAGGCG TTCTTCCAGG CATGGTCTGG

4021 CAGGACAGAG ATGTGTACCT TCAGGGGCCC ATCTGGGCAA AGATTCCACA CACGGACGGA 4081 ^{c a tt ttc a c c c c tc tc c g g t c a t g g g t g g a t t c g g a c t t a} AACACCCTCC TCCACAGATT 4141 CTCATCAAGA ACACCCCGGT ACCTGCGAAT CCTTCGACCA CCTTCAGTGC GGCAAAGTTT 4201 GCTTCCTTCA TCACACAGTA CTCCACGGGA CAGGTCAGCG TGGAGATCGA GTGGGAGCTG

4261 CAGAAGGAAA ACAGCAAACG CTGGAATCCC GAAATTCAGT ACACTTCCAA CTACAACAAG

4321 TCTGTTAATG TGGACTTTAC TGTGGACACT AATGGCGTGT ATTCAGAGCC TCGCCCCATT 4381 GGCACCAGAT ACCTGACTCG TAATCTGTAA TTGCTTGTTA ATCAATAAAC CGTTTAATTC 4441 GTTTCAGTTG AACTTTGGTC TCTGCGTATT TCTTTCTTAT CTAGTTTCCA TGGCTACGTA 4501 GATAAGTAGC ATGGCGGGTT AATCATTAAC TACAAGGAAC CCCTAGTGAT GGAGTTGGCC

4561 ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGT CGCCCGACGC

4621 CCGGGCTTTG CCCGGGCGGC CTCAGTGAGC GAGCGAGCGC GCAGAGAGGG AGTGGCCAA

Tabla IV

Xbpls (Ratón) (SEQ ID NO: 4)

ORIGEN

1 CTAGGGTAAA ACCGTGAGAC TCGGTCTGGA AATCTGGCCT GAGAGGACAG CCTGGCAATC 61 CTCAGCCGGG GTGGGGACGT CTGCCGAAGA TCCTTGGACT CCAGCAACCA GTGGTCGCCA 121 CCGTCCATCC ACCCTAAGGC CCAGTTTGCA CGGCGGAGAA CAGCTGTGCA GCCACGCTGG 181 ACACTCACCC CGCCCGAGTT GAGCCCGCCC CCGGGACTAC AGGACCAATA AGTGATGAAT 241 ATACCCGCGC GTCACGGAGC ACCGGCCAAT CGCGGACGGC CACGACCCTA GAAAGGCTGG 301 GCGCGGCAGG AGGCCACGGG GCGGTGGCGG CGCTGGCGTA GACGTTTCCT GGCTATGGTG 361 GTGGTGGCAG CGGCGCCGAG CGCGGCCACG GCGGCCCCCA AAGTGCTACT CTTATCTGGC 421 CAGCCCGCCT CCGGCGGCCG GGCGCTGCCG CTCATGGTAC CCGGTCCGCG GGCAGCAGGG 481 TCGGAGGCGA GCGGGACACC GCAGGCTCGC AAGCGGCAGC GGCTCACGCA CCTGAGCCCG 541 GAGGAGAAAG CGCTGCGGAG GAAACTGAAA AACAGAGTAG CAGCGCAGAC TGCTCGAGAT 601 AGAAAGAAAG CCCGGATGAG CGAGCTGGAG CAGCAAGTGG TGGATTTGGA AGAAGAGAAC 661 CACAAACTCC AGCTAGAAAA TCAGCTTTTA CGGGAGAAAA CTCACGGCCTTGTGGTTGAG 721 AACCAGGAGT TAAGAACACG CTTGGGAATG GACACGCTGG ATCCTGACGA GGTTCCAGAG 781 GTGGAGGCCA AGGGGAGTGG AGTAAGGCTG GTGGCCGGGT CTGCTGAGTC CGCAGCAGGT 841 GCAGGCCCAG TTGTCACCTC CCCAGAACAT CTTCCCATGG ACTCTGACAC TGTTGCCTCT 90 1 TCAGATTCTG AGTCTGATAT CCTTTTGGGC ATTCTGGACA AGTTGGACCC TGTCATGTTT 96 1 TTCAAATGTC CTTCCCCAGA GTCTGCTAGT CTGGAGGAAC TCCCAGAGGT CTACCCAGAA 1021 GGACCTAGTT CCTTACCAGC CTCtCTTTCT CTGTCAGTGG GGACCTCATC AGCCAAGCTG 1081 GAAGCCATTA ATGAACTCAT TCGTTTTGAC CATGTATACA CCAAGCCTCT AGTTTTAGAG 1141 ATCCCCTCTG AGACAGAGAG TCAAACTAAC GTGGTAGTGA AAATTGAGGA AGCACCTCTA 1201 AGCTCTTCAG AAGAGGATCA CCCTGAATTC ATTGTCTCAG TGAAGAAAGA GCCTTTGGAA 1261 GATGACTTCA TCCCAGAGCT GGGCATCTCA AACCTGCTTT CATCCAGCCA TTGTCTGAGA 1321 CCACCTTCTT GCCTGCTGGA CGCTCACAGT GACTGTGGAT ATGAGGGCTC CCCTTCTCCC 1381TTCAGTGACA TGTCTTCTCC ACTTGGTACA GACCACTCCT GGGAGGATAC TTTTGCCAAT 1441 GAACTTTTCC CCCAGCTGAT TAGTGTCTAA AGAGCCACAT AACACTGGGC CCCTTTCCCT 1501 GACCATCACA TTGCCTAGAG GATAGCATAG GCCTGTCTCT TTCGTTAAAA GCCAAAGTAG 1561 AGGCTGTCTG GCCTTAGAAG AATTCCTCTA AAGTATTTCA AATCTCATAG ATGACTTCCA 1621 AGTATTGTCG TTTGACACTC AGCTGTCTAA GGTATTCAAA GGTATTCCAG TACTACAGCT 1681 TTTGAGATTC TAGTTTATCT TAAAGGTGGT AGTATACTCT AAATCGCAGG GAGGGTCATT 1741 TGACAGTTTT TTCCCAGCCT GGCTTCAAAC TATGTAGCCG AGGCTAGGCA GAAACTTCTG 1801 ACCCTCTTGA CCCCACCTCC CAAGTGCTGG GCTTCACCAG GTGTGCACCT CCACACCTGC 1861 CCCCCCGACA TGTCAGGTGG ACATGGGATT CATGAATGGC CCTTAGCATTTOTTCTCCA 1921 CTCTCTGCTT CCCAGGTTTC GTAACCTGAG GGGGCTTGTT TTCCCTTATG TGCATTTTAA 1981ATGAAGATCA AGAATCTTTG TAAAATGATG AAAATTTACT ATGTAAATGC TTGATGGATC 2041 TTCTTGCTAG TGTAGCTTCT AGAAGGTGCT TTCTCCATTT ATTTAAAACT ACCCTTGCAA 2101 TTAAAAAAAA AGCAACACAG CGTCCTGTTC TGTGATTTCT AGGGCTGTTG TAATTTCTCT 2161TTATTGTTGG CTAAAGGAGT AATTTATCCA ACTAAAGTGA GCATACCACTTTTTAAAGTC 2221 AAAAAAAAAA AAAAAAAA

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un vector para usar en la prevención, el tratamiento y/o el retraso de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un mamífero, en donde el vector induce la sobreexpresión neuronal de la proteína de la X-Box 1 (XBP1) en el sistema nervioso central (SNC) del mamífero, y en donde el vector es un vector de tipo virus adenoasociado (VAA).

2. El vector para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho vector de tipo VAA comprende una secuencia vírica recombinante adenoasociada que comprende un casete de expresión que comprende un elemento regulador de la transcripción para la expresión en los tejidos neuronales unido operativamente a un polinucleótido que codifica la XBP1.

3. El vector para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho elemento regulador de la transcripción comprende un promotor.

4. El vector para uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste en EF-1, cmv, cba, Pgk1, Cam2, CamIIK, ChAT y Thy1.

5. El vector para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde dicha secuencia vírica recombinante adenoasociada comprende además las repeticiones terminales invertidas (ITR) del VAA.

6. El vector para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dichas ITR se derivan de un serotipo del VAA seleccionado del grupo que consiste en VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11.

7. El vector para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dichas ITR se derivan del serotipo VAA2.

8. El vector para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde dicho polinucleótido que codifica la XBP1 actúa sistémicamente, cerca o dentro de las células neuronales.

9. El vector para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho polinucleótido que codifica la XBP1 es específico para las células en la corteza y la médula espinal, y/o las células de Purkinje en el cerebelo.

10. El vector para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho vector genera una reducción de la astrogliosis en el mamífero.

11. El vector para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho vector retrasa la fase sintomática del fenotipo de la esclerosis lateral amiotrófica en el mamífero.

12. El vector para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho mamífero es un ser humano.

13. El vector para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en donde el polinucleótido comprende una secuencia como la que se define en la SEQ ID NO: 2.

14. El vector para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vector de tipo VAA comprende una secuencia polinucleotídica como la que se define en la SEQ ID NO: 1.

15. Una composición farmacéutica que comprende un vector como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, para usar en la prevención, el tratamiento y/o el retraso de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un mamífero.