JPH01500480A - ヒト細胞における複数薬剤耐性に関連するｄｎａ配列を含むクローンの組成および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「ヒト細胞における複数薬剤耐性に関連するＤＮＡ配列を含むクローンの組成お よび方法」本件は、　１９８６年３月２８日に掃出された出願番号８４５，６１ ０の一部′ｍ続出１頭である。

本発明は、一般に診断材料ならびに方法に関し□より具体的には複数薬剤耐性腫 瘍細胞を検出する材料および方法に関する。

植物塩基あるいは抗腫瘍抗生物質に対する耐性を有する補乳動物細胞の選択を行 うと、しばしば元の選択物質に対して構造および作用モードが無関係の別の薬剤 に対する交差耐性が生じる。Ｂｉｅｄｌｅｒ等、　ＱヒｅｒＲｅＳ、、」ル、、 、　１１７４　（１９７０）。複数薬剤耐性現象は最も一般的に使用されている 抗癌剤のいくつかに対する耐性が関連するので、癌化学療法において重大な問題 である。

はとんどの場合、複数薬剤耐性は１おそらく形質膜内の変化によって、細胞内薬 剤蓄積が低下するために生しるものと思われる。　Ｂｉｅｄｌｅｒ等、　並匹肛 」ｒｅａｔ、　Ｒｅｐ、、　６７、８５９　（１９８３）。

Ｌｉｎｇ等、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔ、　Ｒｅｐ、、、、　６７、８６９　 （１９８３）、　Ｒａｍｕ等、　Ｃａｎ−ｃｅ、ｒＴｒｅａｔ、　ＲｅＰ−＋　 ６７、８９５　（１９８３）、およびＢｅｃｋ等、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、。

３９　、２０７０　（１９７９）。

幾つかのハムスター、マウスおよびヒトの複数薬剤耐性細胞系において、耐性は 分子量１７０，０００の脱糖タンパク質（Ｐ−糖タンパク質）あるいは分子量１ ９，０００のサイトツルタンパク質の過剰発現と相関関係がある。Ｋａｒｔｎｅ ｒ等、　５ｃｉｅｎｃｅ、２２］、　１２８５−１２８８　（１９８３）、Ｂｉ ｅｄｌｅｒ等、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔ、　Ｒｅｐ、、　６７、８５９　（ １９８３）。ヒト癌愚者から採取した細胞にイムノブロノテイグ手法を適用する と、進行した非反応性の卵巣癌のいくつかの症例においては、高レベルのＰ−糖 タンパク質が存在することが分かる。

Ｂｅ目等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　０ｎｃｏ１．、３．３１１−３１５　（１９８ ５）。

複数薬剤耐性のチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ）ｔｏ）細胞系に対して性成さ れ且つヒト細胞系と交差反応するＰ−糖タンパク質特異華りローン性抗体は、そ れらの薬剤耐性の程度に相関する程度はど複数薬剤耐性腫瘍細胞と結合するよう に思われる。

Ｋａｒｔｎｅｒ等、　ｊｉａｔｕｒｅ、　３１６．　８２０−８２３　（１９８ ５）。これらの単クローン性抗体は全て、提示されたＰ−糖タンパク質ポリペプ チドの、チャイニーズハムスター卵巣細胞からｊＬｄされており、サザーンブロ ソティング手順を用いたところ、これらのクローンには、ハムスター、マウスお よびヒトの複数薬剤耐性細胞におい一〇Ｐ−ｆｉタンパク質ｃＤＮＡクローンを ＲＮＡのレベルでヒＩ−Ｐ−［タンパク質遺伝子の発現を検出するのに用いるこ とができるかどうかについては、何も示唆していない。

複数薬剤耐性の検査の別の方法において、　ＤＮＡのある共通領域が、コルヒチ ンあるいはアドリアマイシンのいずれかに対する耐性を有するものとして選択さ れた２つの異なる複数薬剤耐性チャイニーズハムスターの細胞系内で増幅される ことがわか、　３３７　（１，９８６）。しかし、ハムスターのｍｄｒ　ｉｆｆ 伝子から得たプローブはヒト細胞にとっては有用なプローブではない。なぜなら 、これらのプローブはヒｌ−ＤＮＡとバイブリドをつくる（実施例２に例示する 。下文参照）が、複数薬剤耐性に関する研究会についての幸浸告書ＣＫｏｌａｔ ａ、　５ｃｉｅｎｃｅ、２３１．２２０−２２１　（＋９８６）　）から得られ る印象とは違って、これらのプローブはで、化学療法の前あるいは療法中に、ヒ ト腫瘍中に複数薬剤耐性細胞が存在することを検出するだめの信頼性の高い方法 が必要である。

子の華離核酸配列を（１供する。

本発明の現在望ましい実施態様は、下記のグループから選択されたＭ乱積製核酸 を提供する。前述のグループとは。

（ａ）　ｐＨＤＲ４，４（ＡＴＣＣ４０２２７）、　ｐＨＤＲ４，５（ＡＴＣＣ ４０２２８）、　ｐＨＤＲ５Ａ　（ＡＴＣＣ６７０４０）、ｐＨＤＲ５Ｂ　（Ａ ＴＣＣ６７０４１）、ｐＨＤＲｌｏ　（ＡＴＣＣ６７０４２）　およびｐＨＤＲ ｌｏ４　（ＡＴＣＣ６７１５６）中の、第４表、第５表に示す連続したヌクレオ チド配列から成るグループのひとつのメンバーである核酸、（ｂ）　（ａ）に述 べた連続したヌクレオチド配列の少なくとも１つとバイブリドを形成するか、あ るいは（ａ）に述べた連続したヌクレオチド配列のひとつとして同じヒト由来の ｍＲ〜八分多分子いはｃＤＮ’ｉ分子内に含まれるヌクレオチド配列をなす核酸 、　（ｃ）　（ｂ）に述べたいずれのヌクレオチドともバイブリドを形成するヌ クレオチド配列を成す核酸、および（ｄ）　ｉＪＬ伝暗号の同義性がなければ、 　（ａ）、　（ｂ）あるいは（ｃ）に述べた連続したヌクレオチド配列の少な（ とも１つとバイブリドを形成するヌクレオチド配列を成す核酸である。ここで「 ハイブリダイゼーションｊの有無を認識する標準条件は、最終洗浄時に、温度６ ５℃において４　Ｘ５ＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で行うで反応である。望まし い実施態様に従う核酸プローブも、これらの核酸の１つと関連するラベルを含ん でもよい。これらの核酸によってコードを定められたポリペプチドは１発現され るか５化学的に合成することが可能であり、当業者には周知である様々な希釈剤 、アジュバントあるいは担体と共に用いて、単クローン性抗体あるいは多クロー ン性抗体を生成させ、また患者の免疫応答を引き出すことができる。このような 抗体は、現在使用可能な様々な免疫診断技法を用いる診断用試薬として利用した り、また免疫療法剤として用いることが可能である。

図面の簡単な説明 第１図は、チャイニーズハムスター細胞から単離した転写ドクローンｐＨＤＩ＋ ４．４およびｐＨＤＲ４，５の部分制限マツプを示す。

第３図は、り刀−配列を含むファージｃＤＮＡクローンλＨＤＲ５゜λＨＤＲ１ ０，λＨＤＲ６２，）ＨＤＲ２８，λＨＤＲ６９Ａ、λＨＤＲ１０３，λＨＤ　 Ｒ１０４およびλＨＤＲ１０５の部分制限マツプを示す。

本発明に従って弘クローンを得ること、ならびにその使用についての予告が、　 １９８６年１月２０日〜２月１５日の分子生物学および細胞生物学に関するｔｌ ｃＬＡシンポジウムにおいて発明者によってなされた。Ｒｏｎ　１ｎｓｏｎ等、 　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２９　（補１ｊｉ１０Ａ）、　１２ ．　Ａ１８　（１９８６）、　Ｐａ５ｔ、ａｎ等、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、、　２９　、　（最近公表されたＪｏｈｎ　Ｒ，Ｒｉｏｒｄａｎによ るｒ＠乳動物細胞系の複数薬剤耐性および決定基糖タンパク質ｒｌＮＡの単ｄＪ と題する欧州特許出願番号第１．７４．１８０号は、　Ｐ−Ｆタンパク譬に特異 なチャイニーズハムスシーｃＤＮＡクローンの単離について述べており、細胞の 複数薬剤耐性を判定するプローブとしてＰ−［タンパク質特異ｃＤＮＡを用いる ことを示唆している。ハムスターｃＤＮＡとヒトゲノムＤＮＡのサザンブロソト ハイプリダイゼーションだけが説明されているが、　ＲｉｏｒｄａｎのＥＰＡ　 １７４，８１０の請求の範囲第１８項は、「チャイニーズハムスター卯巣細胞、 マウス細胞およびヒト細胞から成るグループから選択したソースから得た」Ｐ４ ｔ！タンパク質特異ＤＮＡ分子に関するものである。ここに記載するｍａｒクロ ーンがヒ）　Ｐ−ｍタンパク質遺伝子配列を表すならば。

そしてこのことは下記の実施例１０において説明するようにまず間違いないと思 われるのであるが＋　ＲｉｏｒｄａｎのＥＰＡ　１７４，８１０は、ヒトｍｄｒ 　ｉｆ伝子あるいはその一部をも全く開示していないことに注意する必要がある 。

実際に、　ＲｉｏｒｄａｎのＥＰＡ　１７４，８１０は、チャイニーズハムスタ イニーズハムスターの弘遺伝子全体の単離が発表されたれたチャイニーズハムス ターのＰ−Ｗタンパク質遺伝子の部分的なｃＤＮＡクローンとは対照をなすもの であった。ＲｉｏｒｄａｎのＥＰＡ１７４、８１０は、チャイニーズハムスター のクローンがヒトＰ−Ｗタンパク質ｍＲＮＡの発現を検出する能力があることの 証拠を何も示していない。さらに、腫瘍細胞の複数薬剤耐性を検出するプローブ としてＰ−［タンパク１ｃＤＮＡを使用することは、　ＲｉｏｒｄａｎのＥＰＡ 　１７４，８１０おいては、増幅されたＰ−糖タンパク質遺伝子の検出について のみ述べられており、　Ｐ−糖タンパク質ｍＲＮＡの発現の増大の検出には関し てはｉホベられていない。下記の実施例７で述べるように、　ｍＲＮＡの発現の 増大は、遺伝子の増幅よりもずっと有用な複数薬剤耐性に対する診断マーカーと なるものである。さらに、ヒト由来のｐ−１タンパク質ｃＤ＼Ａ配列を請求して いるにもかかわらず、　ＲｉｏｒｄａｎのＥＰＡ　１７４，８１０は、このよう な配列がどのようにして得られるかという点については、たとえば。

ヒトＤＮＡあるいはＲＮＡのソース、あるいはチャイニーズハムスターのプロー ブを用いたヒ１−ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングのストリ ンジエンシー条件等について、全く言及していない。下記の実施例２に示すよう に、ハムスターとヒトの各史遺伝子は、遺伝子の少なくとも５゛半分においては 。

相同性が低く、これはヒ）　ｍａｒ　ＤＮＡ配列のｔ諦においてがなりの技術的 な問題となるものである。

下記の実施例では、ヒトｍｄｒ遺伝子の核酸クローンおよび史クローンのヌクレ オチド配列の使用について説明する。実施例１では７チヤイニーズハムスターの ＩＬクローンを用いて、ヒ）　Ｄ）；Ａとバイブリドを形成する配列を同定する 。実施例２では、ヒｌ−ｍｄｒ遺伝子を成ず゛削？−Ａ配列の同定および華舗に ついて述べる。実施例３では、ヒト薬剤耐性細胞におけるすＬｊ１伝子の増幅を 実証する。実施例４においては、　ｍａｒ配列を含むクローンの特性把握につい て述べる。実施例５では、ルセー遺伝子に関連するＤＮＡの転位を検討する。実 施例６では、ヒト細胞におけるｒｄｒｌｉｆｆ伝子の転写を実証する。実施例７ では、ヒト細胞内での複数薬剤耐性の発生段階における閃１配列の発現レベルの 研究について述べる。実施例８では、ｉｌ伝子の増幅に比例しない耐二遺伝子の 発現を実証する。実施例９では、す６１伝子のセグメントを含むゲノムクローン の説明を行う。実施例１０では、観旦遺伝子のｃＤＮへクローンと、ヒト閃旦遺 伝子のｃＤＮＡ配列について開示する。実施例】１では９本発明に従うプローブ を用いた診断ならびに療法手順について説明する。

実施例１ ヒ１−ＫＢ細胞の複数薬剤耐性サプラインの誘導ならびに特性把握については、 どこか他のところに記載されている＊　Ａｋｉｙａｍａ等、　Ｓｏｍａｔ、、　 Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、、　１１．１１７　（１９８５）、Ｆｏｊｏ 等、（匹肛」ｅｓ、、　４５．３００２　（１９８５）、およびＲｉｃｈｅｒｔ 等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、−Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　８２．２３ ３０　（１９８５）　、複数薬剤耐性表現型は、はとんどの高耐性ラインにおい て不安定であり、薬剤が存在しない状態で増殖する場合には耐性が低下する。ゲ ル内ＤＮＡサプラインは、４幅されたＤＮＡ配列を含むことがわかっており、ま た核型分析によって、これらの細胞内に微小な染色体対が８２．７６６１　（１ ９８５）　。

コルヒチン、ビンブラスチンあるいはアドリアマイシンに対する耐性を有するも のとして選択されたヒトＫＢ癌細胞のサプライン［Ａｋｉｙａｍａ等、　ｌＪＲ ，Ｆｏｊｏ等、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、上Ｍ、　Ｒｉｃｈｅｒｔ等・上喝およ び５ｈｅｎ等、　５ｃｉｅｎｃｅ、２３２．６４３−６４５　（１９８６）　） は、複数薬剤耐性表現型を示す。これらのサプラインのいくつかを第１表に示す 。Ｆｏｊｏ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ４．　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　 ８２＋７６６１　（１９８５）　、第１表において、’ｎ／ｄＪは測定されてい ないことを意味する。′！ｔＢ胞系ＫＢ−８−５−１１．　ＫＢ−８−５〜１１ −２４．　ＫＢ−Ｃ３およびＫＢ−Ｃ４は、それぞれアドリアマイシン１００　 ｎｇ／ｍ　Ｃ１μｇ／ｖａ　１，３μｇ／ｍ　１および４μｇ／ｍ　βによって 選択されたサブクローンである。相対的な耐性は、親細胞ＫＢ−３−１のＤｌ。

に下記の薬剤に対する相対的な耐性 ＫＢ−８−５−１１４０２３５１ ＫＢ−８−５−１１−２４１２８２６２０ＫＢ−Ｃ３４８７１４１２０６ ＫＢ−Ｃ４１７５０２５４１５９ ＫＢ−Ｃ１−Ｒ１６３４ ＫＢ−Ｖｌ　１７１　４２２　２１３ ＫＢ−Ａ１１９　９７　４３ ＫＢ−Ａ２　ｎ／ｄ　１４０　ｎ／ｄ これらの複数薬剤耐性ヒ）ＫＢ細胞系を用いて、ハムスターの弘遺伝子に相同な りＮＡ配列がヒトゲノム中に存在するが調べた。この研究に用いたチャイニーズ ハムスターのｍａｒ　ＤＮＡ配列は、ハムスターのｍａｒ遺伝子の５゛セグメン トを含むコスミドクローンｃｏｓＤＲ３Ａから得た。制限酵素Ｘｂａ　Ｉおよび に、Ｂｇ−１によって消化した後、このコスミドの１．５〜６キロ塩基対（ｋｂ ）のそれぞれの制限フラグメントは、ウィスコンシン州マジソンに所在する　Ｐ ｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃが市販しているｐＳＰ６５プラスミドベクターにサ ブクローンするか、あるいは３２ｐによる標識付けの前にゲル精製を行った。ｐ ＤＲ４，７と名付けた４、７　ｋｂのＸｂａフラグメントを含むベクターは、ヒ ）　ＩＩＮＡとバイブリド形成するＤＮＡ配列を有していた。

第１図に、コスミドクローンｃｏｓＤＲ３Ａの部分制限エンドヌクレアーゼマツ プを示す。前述のクローンは、複数薬剤耐性のチャイニーズハムスター細胞内で 増幅した転写ｍｄｒｉｉＮ域の５゛部位を含む。マツプとともに示す点線は、　 ｐＤＲ４，７にハイブリダイズするＲＯ５Ｄｌ’１３Ａの部分を示す。第１図に おいて、Ｘは部位Ｘｂａ　１を表し、且つＫは部位■ｎｌを示す。この領域のク ローニング韮、顕、　３３７　（１９８６）に記載されている。

大流±１ ヒ）ｍａｒ遺伝子を含むＤＮＡセグメントを同定ならびに単離するために、ハム スターのクローン化した弘遺伝子の１．５〜６キロ塩基対（ｋｂ）のそれぞれの 大きさのフラグメントを。

ＰｒＯｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃが市販し且つＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ技報 Ｎｏ、　１３およびＭｅｌｔｏｎ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｕ生、　１２． ７０５５−７０５６　（１９８４）に記載されたｐＳＰ６４ブラスミドヘクター 中に一連の組換え体サブクローンとして単離した。次に９個々のサブクローンを ３２ｐで標識し、制限訂素で消化したヒトＤＮＡを用いるサザンブロソトハイプ リダイゼーションのプローブとして使用した。

さらにこれらのザブクローンを、ヒＩ・ゲノムＤＮＡの制限消化物を用いるハイ ブリダイゼーションのプローブとして用いた。

はとんどのプローブは、低ハイブリダイゼーションストリンジエンシー条件で用 いた場合には、ハイブリダイゼーションシグナルあるいはヒト反復Ｄ！ｉＡ配列 とのクロスハイブリダイゼーションを示す連続スミアのいずれも生じなかった。

しかし。

ｐＤ１７４．７と名付けた第１図に示すサブクローンの１つは、低ストリンジエ ンシー条件の下でハイブリダイズした際に、明確なバンドを生した。

サブクローンｐＤＲ４，７は、明確なハイブリダイゼーションシグナルを発生し たので１　このサブクローンは、ヒト史遺伝子に相同なハムスターＤＮＡ配列を 含んだ。ｐＤｉ！４．７は、ヒトＤＮＡの２つの主な互いに相違するＥｃｏ　Ｒ １制限フラグメントとハイブリダイズしたが、いくつかの実験において、さらに ９個ものＥｃｏ　Ｒ１フラグメントを検出することができた。

実施例３ 籾二ｉＪｉ伝子が、複数薬剤耐性ヒト細胞中で増幅されるが否かを確認するため に、Ｇｒｏｓ−Ｂｅ１ｌａｒｄ等、旦犯Ｘニジ−、ＢｉｏｃＪ＋ｑ、、　３６＋ ３２　（１９７８）の手順によって親ＫＢ−３−１細胞および第１表に示された 様々な薬剤耐性サプラインから抽出したＤＮＡをＥｃｏ　Ｒ１あるいはＨｊｎｄ ｌｌｌを用いて消化し、アガロースゲル電気泳動にか＋Ｊ、さらにサザンの手順 （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８．５０３゜（１，９ ７５）　）によってｐＤＲ４，７プローブにハイブリダイズした。

複数薬剤耐性ＫＢ細胞のＥｃｏ　ｌ’ｌＩ分解ＤＮＡを用いたｐＤｌ’１４．７ のサザンハイブリダイゼーションにおいて、　ＤＮＡは先に述べたように抽出さ れた（Ｇｒｏｓ−Ｂｅｌ　１ａｒｄ等、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 　３６．３２　（１９ｐｇのＤＮＡを各レーンにおいた。電気泳動を行った後、 　ＤＮＡをナイロン（Ｂｉｏｄｙｎｅ）膜に移したＣ　Ｓ　ｏ　ｕ　ｔ　ｈ　ｅ 　ｒ　ｎ　、　ｌ　ＪＪｉｉ　）　＊プラスミドル［）Ｒ４，７はυｙａ　＋で 消化し、挿入物はゲル精製を行い、さらに３２ｐを用いて、オリゴラベリングに より３　ＸＩＯ９ｄｐｍ／μｇの比活性にラベルした（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ等、　 Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３２＋　６　（１，９８３）　１１゜ ハイブリダイゼーションは、６５℃において。

５　Ｘ５ＳＰＥ、　５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　０．２％ＳＯ５，変性サ ケ精子ＤＮＡ５００μｇ／ｍ　１において行った。ハイブリダイゼーションの後 、膜は、　４　ｘＳＳＣ，０，５％ＳＤＳを用いて６５℃で洗浄し、オートラジ オグラフィーを行った。

サブクローンｐＤＩ’！４．７は、フィルターを低ストリンジエンシー条件（４ Ｘ５ＳＣ，６５℃）のもとで洗浄する場合に、　ＫＢ−３−Ｉ　ＤＮＡ中の大き さが１３．５　ｋｂと４．５　ｋｂの２つのＥｃｏ　Ｒ１フラグメントに、そし て大きさが１．０．５　ｋｂ　と４．４　ｋｂの２つの皿ＩＩＩ　フラグメント にハイブリダイズする。中間ストリンジエンシー条件（ＩＸべてのフラグメント は、コルヒチン耐性サプライン８Ｂ−８−５−１１、ＫＢ−８−５−１１，−２ １，ＫＢ−Ｃ３およびＫＢ−Ｃ４中で増幅された。

復帰変異株サプラインＫＢ−Ｃ１−Ｒ１中では、　１３．５　ｋｂフラグメント に対応するバンドあるいは４．４　ｋｂフラグメントに対応するバンドの増幅は いずれも検出されなかった。コルヒチンによって選択されたサプラインとは異な り、ビンブラスチン中で選択さば、アドリアマイシン耐性細胞ＸＢ−ＡＩおよび ＫＢ−Ａ２においてもの新しい増幅バンドを含んだ。同じバンドは、　ＫＢ−Ｖ Ｉ　ＤＮＡ中に存在するが、それらの強度はこれらのバンドが増幅されていない ことを示唆した。この大きさのバンドは、ＩＫＢ−３−Ｉ　ＤＮＡにおいては検 出されておらず、これらのバンドが明らかにＤＮＡ転位の結果生じたことを示し ている。

異なるサプラインにおいてハムスターの弘プローブにハイブリダイズする２種類 のバンドの異なる増幅パターンは１　これらのバンドが、１つの隣接したハイブ リダイジング領域の２つの異なる部分ではなく、１つの多重遺伝子族の異なるメ ンバーであると考えられる関連する２つの異なるＤＮＡ配列に対応するブリダイ ゼーションシグナルの強度を比較することによって推員主人 増幅の程度 ＫＢ−８−５−］、１　７−８　７−８ＫＢ−８−５−１１−２４９９ ＫＢ−Ｃ３２０２０ ＫＢ−Ｃ４３０３０ ＫＢ−ＣＩ−Ｒ１１１ ＫＢ−Ｖｌ　１００　１　＊ ＫＢ−Ａｌ　７０　３０　＊ 第１表と第２表とを比較すれば、　４０〜７００倍のコルヒチン耐性があるもの として選択されたサプラインにおいて、薬剤耐性の増大側ｍａｒ配列のコピー数 とのあいだに、一般的ではあるが明確ではない相関関係があることがわかる。耐 性の程度は。

ｍａｙ遺伝子増幅の程度よりも、　ｍｄｒ　ＲＮＡの発現とのほうがより明確に 対応するかもしれない。ｍｄｒｌおよび弓配列は、これらの細胞においては、同 様な程度までで増幅されるようにみえる。コルヒチン耐性細胞系の復帰変異株内 における増幅立配列の喪失は、弘遺伝子の増幅が高耐性細胞中における複数薬剤 耐性の基礎を成すことの強力な連線証拠である。ビンブラスチンあるいはアドリ アマイシンに対する耐性を有するものとして選択された細胞中のｍｄｒｌの増幅 程度は、コルヒチンに対して選択された同し程度の耐性をもつ細胞よりも高いよ うに思われる。

実施例４ を含むクローンをコルヒチン耐性サプラインＫＢ−Ｃ３のＤＮＡからムスターｐ ＤＲ４，７ブローブを用いたプラークハイブリ、ド法によＡｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 、　１２．７０３５　（１９８４）　）　、それぞれｐＨＤＲ４，４およびｐＨ ＤＲ４，５と名付けたプラスミドクローンを得た。プラスミドクローンｐＨＤＩ ？４．４は＋　１２３０１．　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ、　Ｍａｒｙ−１ａｎｄに所在するＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに、　１９８６年３月２１日に寄託物第４０２ ２７号として寄託された。同様に、プラスミドクローンｐ）ｌＤＲ４，５は＋　 １２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒ ｙｌａｎｄに所在するＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎに。

１９８６年３月２１日に寄託物第４０２２８号として寄託された。これらのクロ ーンの部分制限地図を第２図に示す。第２０において、対応する制限エンドヌク レアーゼによる消化の部位は下記のように示す。’Ａ　Ｊ、　Ａｖａｌ、’Ｂ　 Ｊ、　ＢａｍＨＩ。’Ｅ　Ｊ　、　Ｅｃ。

Ｒ１，’Ｇ　Ｊ　、　Ｂｇｌ　Ｔｌ。’ＨＪ　、　ＨｉｎｄｌｌＴ。’Ｊ　Ｊ　 、　Ｈａｅ　ＩＩ。ｒＰＪ、Ｐｓｔｌ。’Ｖ　Ｊ　Ｉ　Ｐｖｕ　Ｉｌ、および’ Ｘ　Ｊ　Ｉ　Ｘｂａ　Ｉ　。

第２図において１黒色の横棒は、高度反復配列を含むフラグメントを示す。これ らのフラグメントは、クローン化したＤＮＡの制＠消化物を含むサザンブロノ１ −と、　０．３５Ｘ１０’　ｄｐｍ／ｃＪのｆｆ２ｐラヘル付全ヒトゲノムＤＮ Ａとのハイブリダイゼーションによって同定した。点線は、ゲル精製ｐＤＲ４， ，７挿入物とのサザンハイブリダイゼーションによって決定した。　ｐＤＲ４， ７クローンにハイブリダイズする［］ＮＡ配列を示す。

ｐＤｌ’１４．７ハムスタープローブは、複数薬剤耐性ハムスター細胞中に発現 した転写活性配列を含むことが知られているのでる可能性が大きい。ハムスター ｐＤｌ？４．７１０−ブは、複数薬剤耐性ヒト細胞から得たｍＲＮＡにはほとん どハイブリダイズせず、したがってヒト細胞中のｍｄｒ遺伝子を検出するプロー ブとしては使用することはできなかった。その結果、　ｐＤＲ４，７にハイブリ ダイズした双方のクローンの反復なしフラグメントを、プラスミドベクターｐＳ Ｐ６４にサブクローン化した。ベクターのＳｍａ　１部をｐＭＤＲ２と名付けた 。これら２つのクローンは、低ハイブリダイゼーションストリンジエンシー条件 のもとて互いにクロスハイブリダイズすることがわかった。このことは、　ｍｄ ｒｌとｍｄｒ２が関連したＤＮＡ配列を表すことの追加的な証拠である。

実施例５ ＫＢ−ＶｌおよびＫＢ−ＡＩ　の転位バンドが、料旦あるいはｍａｒ７と対応す るか否かを確定するために、異なるサプラインから得たＤＮＡを箪Ｉｌ！で消化 し、ハムスターのｐＤＲ４，７プローブ、またはヒトのｐＭＤＲｌあるいはｐ！ １ＤＲ２プローブのいずれかにハイブリダイズした。ゲル精製を行ったプラスミ ドｐｒｌＲ４，７の挿入物とのハイブリダイゼーションを、低ストリンジエンシ ー条件（４ｘＳＳＣ，０，５％ＳＤＳ、　６５℃）のもとで行った。つぎに、高 ストリンジエンシー条件（０，Ｉ　Ｘ５ＳＣ，０，５％ＳＤＳ、　６５°Ｃ）の もとで、同しプロットをプラスミドｐＭＤＲ１およびｐＭＤｌ＋２のゲル精製挿 入物と再度ハイブリダイズし、１旦およびｍｄｒ２配列のクロスハイブリダイゼ ーションによるシグナルを最小限とした。

この実験によって、サプラインＫＢ−ＡＩおよびＫＢ−Ｖｌの双方の転位バンド はｍａｒ２に対応することが実証された。新しいハントの移動性は、　ＫＢ−Ｖ ｌおよびＭＢ−ＡＩ　ＤＮＡのいくつかの異なる制限消化物中で同じであるよう に思われ、双方の別個に選択さカ、たサプラインにおいて同様な転位が起きた可 能性があることを示唆した。しかしながら、転位バンドは、　ｋＢ−ＡＩ中では 増幅されるが、　ＫＢ−Ｖｌ細胞中では増幅されないように思われる。さらに、 双方のタイプの細胞とも、耐婬の非転移対立遺伝子に対応するバンドを含んでお り、これは増幅されない、　ＫＢ−ＡＩ細胞中の、転位はしたが親細胞ではない １叱バンドの増幅は、　ＤＮＡ転位は、これらの細胞中で、遺伝子増幅の開始に 先行するか、または同時に発生したことを示唆している。ＫＢ−１７１の場合に は。

閃亘および閃すの展開的に保存された領域が転写配列を含むか否かを判断するた めに、プローブとしてｐＭＤＲｌおよびｐＭＤＲ２を用いて、実施例５に述べる 高ハイブリダイゼーションストリンジエンシーの条件の下で、親ＫＢ−３−１細 胞および複数薬剤耐性ＫＢ−Ｃ２，５細胞から抽出したポリ　（Ａ）”　ＲＮＡ 　（Ａｋｉｙａｍａ等、上聞、　ＦｏｊＱ等、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、＋　上 聞、　Ｒｉｃｈｅｒｔ等、上聞および５ｈｅｎ等、」〕　とのノーザンハイブリ ダイゼーションをＴｈｏｍａｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　（ＵＳＡ）、　７７、５２０１−５２０５　（１９８０）の手順にしたが って実施した。ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡは、　Ｃｈｉｒ４ｗｉｎ等＋　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ。

、　１８．５２９４　（１９７９）に記載されたとおりに、薬剤感受性親ＫＢ− ３−１細胞、ならびにコルヒチン耐性ＫＢ−Ｃ２，５サプラインから抽出した。

各Ｒ〜Ａ　３１５製物１マイクログラムを、１．５％グリオキサ州ボスストンに 所在するＮｅ１ｉ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒがら入手可能なＧｅｎｅ　 ５ｃｒｅｅｎ　ＰｌｕｓＴＭ膜に導入した。これらの膜は、　３　ＸＩＯ’　ｄ ｐｍ／ｄのｐｌＩＤＲｌあるいはｐＭＤＩ１２プローブとハイブリダイズした。

ハイブリダイゼーションは、　ｌ　Ｍ　ＮａＣｌ、　１０％デキストラン硫酸。

１％ＳＯ３，５０％ホルムアミド、および変性サケ精子ＤＮＡ　１００μｇ１ｍ ｌ中テ４２℃で行ツタ。コノ膜を０．］、　Ｘ　ＳＳＣ，０，５％ＳＤＳを用い て６５℃で洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。ＲＮＡハンドの大きさは 、２８Ｓおよび１８Ｓ　リポソームＲＮＡの位置と比較して測定した。

プローブｐＭＤＲ１は、薬剤耐性細胞中で高い発現を示す４．５　ｋｂのｍＲＮ □ＡＲＮＡハンドリダイズする。このｍＲＮＡは親細胞ＫＢ−３−１中では検出 することができず、プローブを二フクトランスレーションあるいはオリボラへリ ングのいずれかによってラベルした場合には殆どあるいは全く発現しないことを 示唆している。

しかし、　ｐＭＤＲ２をプローブとして用いた場合には、明確なハンドを検出す ることができなかった。さらに、　ｐＭＤ［１２に加えて。

プローブとしてｐＨＤＲ４，５の別の反復なしサブフラグメントを用いたが、ハ ンドは表れなかった。これらの結果からは、紋りの別の領域に転写活性配列が存 在すること、あるいは非常に低いの転写は、ノーザンハイブリダイゼーションに よっては検出されない。

複数薬剤耐性ヒト腫瘍細胞中におけるチャイニーズハムスターに遺伝子に相同な りへ“へ配列の増幅および過剰発現は、ヒト細胞および間両類細胞のいずれにお いても、同様な機構が複数薬剤耐性の原因となる可能性があることを示している 。ｍｄｒ遺伝子によってコードを決定されるタンパク質の性質はまだわかってい ない。ｍｄｒｌ　ｍＲＮＡの大きさは、それが種々の複数薬剤耐性細胞系で過剰 発現する１７０ｋｄの糖タンパク質のコードを決定する可能性と矛盾しない（Ｂ ｉｅｄｌｅｒ等、上聞、　Ｌｉｎｇ等、す退。

Ｒａｍｕ等、１ｍ、　ＢｅＣｋ等、　ｋＱ、Ｋａｒｔｎｅｒ等、　５ｃｉｅｎｃ ｅ、−２２１＋に、試験管内において、および化学療法過程において、ヒト腫瘍 細胞による？！数薬剤耐性の発生に同じ機構が用いられるか否かは不明である。

ヒｉ−細胞中にｍａｒ　ＤＮＡの転写を検出できるクローン化プローブが得られ るようになったので、いまでは複数薬剤耐性腫瘍の臨床試料中でのこれらの配列 の発現を調べることが可能となった。

害去ｌ津り 複数薬剤耐性が生しる際の弘配列の発現レベルを調べるために、ヒト腫瘍細胞の 複数薬剤耐性サプライン、および由来の異なる別の２つのヒト複数薬剤耐性細胞 系を調べた。

幾つもの段階を経て異なるザブラインを選択するのに用いた薬剤は、コルヒチン 、アドリアマイシンならびにビンブラスチンであった。コルヒチンによる選択の 最初の２段階において。

エチルメタンスルホン酸（ＥｌＩＳ）を用いて最初に細胞集団に突然変異を誘起 した場合に限ってクローンが得られた。同様に、アドリアマイシンあるいはビン ブラスチンに対する耐性があるものとして別々に選択したＫＢ細胞系［Ａｋｉｙ ａｍａ等、　１１１％、　Ｆｏｊｏ等、　リ四ｃｅｒ　Ｒｅｓ、、Ｉ瓜、　Ｒｉ ｃｂｅｒｔ等、ｆ［、およびＳ　ｈ　ｅ　ｎ等、上聞〕は１最初の段階でＥＭＳ を用いた突然変異誘起を行った場合に限って得られた。その後の選択は、非常に 高い耐性レベルに至るまで、突然変異誘起を行わすとも行うことができ、また高 頻度で起きた。

ヒト複数薬剤耐性ＫＢ癌細胞系の草地およびその幾つかの性質については、これ までに　Ａｋｉｙａｍａ　等、上Ｑ、　Ｆｏｊｏ等、　Ｃａｎｃｅｒ」竺、、よ 度、およびＲｉｃｂｅｒｔ等、土星に記載されている。この研究に用いたＫＢ細 胞系、それらの選択方法、ならびに様々な薬剤に対するそれら細胞系の相対的耐 性を第３表に示す。ＣＥＭは、　Ｂｅｃｋの！−１ｔ’１ｌｉｉｊｘ咽、＃＋＋ ４３歩＋　２２＋　Ｇ、　Ｗｅｂｅｒｔｇｇ　（Ｐｅｒｇａ＋ａｏｎＰｒｅｓｓ 、　０ｘｆｏｒｄ、　１９８４）、　２０７に記載された細胞系であり、また２ ７８０ば、　Ｒｏｇａｎ等、　５ｃｉｅｎｃｅ、２２４．９９４　（１９８４） に記載された細胞系である。

１Ｌ￥配列がこれらの細胞系で発現する程度、ならびに対応するＲＮＡの大きさ を判断するために、これらの細胞から採取した全ＲＮＡおよびポリ　（Ａ）’− Ｒ〜へを用いて、ノーザンハイブリダイゼーションを行った。２８Ｓ　リポソー ムＲＮＡ　ＩｉＭのすぐ下を移動する４、５キロ塩基対ＲＮＡは、耐性系から採 取した全ＲＮＡあるいはポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを含むレーンの全てにおいて見 ることができたが、感受性細胞系のいずれにも見られなかった。

全ＲＮＡのスロットプロットハイブリダイゼーションを用いて、種々の感受性お よび耐性細胞系における１旦の発現を定量した。上記のとおりに調製したＲＩｆ Ａを、　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒａ　５ｃｈｕｅ！１のスロソトブロフド装置を用 いてフィルターに添加した。あるいは１３．４％ホルムアルデヒドを含む１％ア ガロース中で電気泳動にかげた後に、プロッティングによっておこなった。ｐＭ ［］Ｒ１クローンから採取したゲル精製挿入物をプローブとして使用するために ３２Ｐのラベルを付けた。ニトロセルロースフィルターは、ヘークし、　５０％ ホルムアミド、　５　Ｘ５ＳＣ，ＩＯＸ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ　溶液、０．１％Ｓ ＤＳおよびサケ精子ＤＮＡ　１００８ｇ　７ｍ　Ｉｌ　中で、４２℃で４〜６時 間にわたって前保温した。フィルターは、３２Ｐラベル付プローブを含む上記の 溶液中で一晩ハイブリダイズした。フィルターは、室温において、２　Ｘ５ＳＣ ，０，１％ＳＤＳ中で１０分間のあいだ３回洗浄し１　さらに５０℃において、 　０．Ｉ　Ｘ　ＳＳＣ，０゜１％ＳＤＳ中で２０分間のあいだ３回洗浄した。ｍ ａｒ１発現のレベルは、オートラジオダラムの濃度を計測してめた。ピークのト レーシングを切出し、計量し、さらに任意に（ＬｉＦ２と定めたビークＫＢ−８ と比較した。この結果は、研究に用いたヒト白血病リンパ芽球細胞系、およびヒ ト卵巣癌細胞系の相対的な薬剤耐性とともに第３表に示す。第３表において、　 ＮＤは「検出されず」の省略である。

栽濱 ＫＢ−３−１親ＫＢ　１　１　１　１）’ＤＫＢ−８コルヒチン、　５　ｎｇ／ ｍ　Ｉ−２，１１，１１，，２１ＫＢ−８−５コルヒチン、　１．０　ｎｇ／ｍ 　Ｒ３，８３，２６，３３ＫＢ−８−５−１１コルヒチン、１１００ｎ／ｎ＋ｊ ！　４．０　２３　５１．　８０ＫＢ−Ｃ１コルヒチン、ｌμｇ／ｍ＃　２６０ 　１６０　９６　２７０ＫＢ−Ｃ１−ＲＩ　ＶＪ３−ＣＩ（ハ）切弱遁株　６　 ３　４　１ＫＢ−Ｃ１，５コルヒチン、　１．５　ｐｇ　７ｍ　ｉ！　３２０− １４０　３４０鼎−防　コルヒチン、６μｇ／ｍｌ　２１００　３２０　３７０ 　８２０ＫＢ−Ａｌ　アドリアマイシン、１μｇ／ｍ＃　１９　９７　４３　２ ７０ＫＢ−Ｖｌ　ビンブラスチン、１μｇ／ｍｊ２　１７０　４２０　２１０　 ３２０ＣＥＭ　親旧抱、白血病　１　１　１　印ＣＥＭ−Ｖｌｂｌ　Ｇｏ　ビン プラスチ７　４５　１２０　４２０　２５０２７８０　親旧瓶卯巣　１　１　１ 　ＮＤ２７８０−Ａｄ　アドリアマイシン　−１７０１５２６０第３表に示すよ うに、複数薬剤耐性の程度と１１特異ｍＲＮＡのあいだには十分な相関があった 。さらに第３表に見られるように、薬剤感受性親細胞系にはｍｄｒｌ配列の発現 は殆どあるいは全く見られないが、細胞系が薬剤に対する耐性を強めると発現が 増大する。コルヒチン耐性細胞系ＫＢ−ＣＩからコルヒチンが存在しない状態の もとてサブクローン化した復帰変異株細胞系ＫＢ−Ｃ１−Ｒ１は、その低Ｉ／ベ ルの複数薬剤耐性と矛盾しない低レベルでなお１旦配列を発現する。

１７、ＲＮＡからのハイブリダイゼーションシグナルが弱ずぎるので、親細胞系 と比較した耐性細胞系での発現増加の正確な程度は計算することができない。し かし、　ＫＢ−８細胞系に対する発現程度は計算したので１　これらのデータを 第３表に示す。発現は、　ＸＢ細胞における全ての選択段階について、増大する 薬剤耐性と十分に相関するように思われ、我々が有する最も耐性の高いＫＢ細胞 系では非常に高い発現レベルに達する。

第３表に要約したデータは、複数薬剤耐性を有するものとして選択された由来の 異なる２つのその他のヒト細胞系も高レベルの４．５　ｋｂ　ｌｌＲＮＡを発現 することを示している。このＲＮＡは。

親細胞系では殆どあるいは全く検出されなかった。ビンブラスチンに対する耐性 を有するものとして選択したヒト白血病リンパ芽球細胞系ＣＥ！１　（Ａ、Ｔ、 Ｃ，Ｃ，ＣＣＬＩ］、９）およびその耐性誘導体ＣＥＭ−ＶＬＢ＋ｏｏ　（Ｓｔ 、　Ｊｕｄｅ’ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌの−、Ｂｅｃｋの寄贈物）　（Ｂｅｃｋ。

上喝）、ならびにアドリアマイシンに対する耐性を有するものとして選択した卯 巣細胞系２７８０およびその耐性誘導体２７８０−Ａｄ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　ＨｅａｌｔｈのＴ、　ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＲ，０ ｚｏｌｓの寄贈物）　（Ｒｏｇａｎ等、上掲）は、いずれも高レベルの４．５　 ｋｂ　ｍＲＮＡ発現を示した。低レベルの細胞複数薬剤耐性でさえも腫瘍が臨床 的に治療不応となる可能性があることから。

低レベル（２〜６倍）の相対的薬剤削性を有するサプラインでは起きるが、親薬 剤耐性細胞系では起きないｍｄｒｌ　ｍＲＮＡの発現は特に興味深いものである 。これに関して、第３表に示す結果か性の診断に用いることが出来る可能性があ ることがわかる。

較するために、ゲノムＤＮＡを実施例６に述べた全ての細胞系から、＃馴した。

Ｈｉｎｄｌｌｌによる消化の後に、飢１の増幅をサザンブロソト分析によって調 べた。

上記の実施例３に述べた仕方で調製したＤＮＡを、■ｎｄｌｌＴでン肖化し２次 に、Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎＰｌｕｓ　”　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ ｌｅａｒ）にザザン法によって固定を行う前に０．８％アガロースゲル中で電気 泳動にかけた。これらのプロットを、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ，１％Ｓ ＤＳにさらにサケ精子ＤＮＡ　１００μｇ／鴎２を含むものの中で、４２℃で１ ８時間にわたってｐＭＤＲ１プローブを用いてハイブリダイズした。次に、プロ ットは、オートラジオグラフィーを行う前に、　２　Ｘ５ＳＣを用いて室温で１ ０分間、　’ｌ　ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて４２℃で６０分間、さらに０． １　ｘｓｓＣを用いて室温で６０分間のあいだ洗浄した。

耐性が低レベルのＫＢ細胞系（ＫＢ−８，ＫＢ−８−５および耐性サブラるいは アドリアマイシン中で選択されたＫＢ［胞の高耐性サブライン、ならびにＣＥ′ Ｉ−νＬＢ、。。および２７８０−Ａｄ細胞系に検出された。後の２つのサプラ インにおいては、遺伝子増幅の程度は、イ店度測定によ一、７．２７８０−ＡＤ にツイテは約５〜１０倍、またＣＥＭ−ＶＬＢｌ。０については１０〜１５倍と 推定された。

すべての場合において、　ｍＲＮＡ発現の増大は、増幅の程度を明らかに上回る ものであった。これらの結果は、これら細胞系の進化には発現が遺伝子増幅と釣 り合わずに増大する１つの段階あるいは複数の段階が含まれることを示唆してい る。ρｙ１遺伝子の増幅と発現の同様な解離が、試験管内でのメト）　ｌ／キセ ートに対する耐性を持つものとして選択されたヒト癌細胞に関しこの点において チャイニーズハムスターのＶ７９細胞とは異なっている。前述のチャイニーズハ ムスター細胞においては、低いこれらの研究は、異なる細胞障害薬剤に対する耐 性を持つものとして選択した由来の異なる５つの別々に誘導したヒト細胞、ヒト 細胞系における複数薬剤耐性の共通の機構を表す可能性がある。少なくともいく つかのケースにおいて、剋１の全史の増加が遺伝子増幅を伴わずに最初に起こる が、複数薬剤耐性の発生の必要条件であるかもしれない。このような見解は、化 学療法過程でのヒト腫瘍による複数薬剤耐性の発生において１１遺伝子が果たす 役割の分析に特に関連があると考えられ、また診断に使用出来る可能性もある。

ｌ１１ｍ細胞は比較的に低い耐性を有すると予測されるために、このような分析 では、腫瘍試料になることが考えられる。

８０）　）　、酵素チェーンターミネーション塩基配列決定法〔Ｓａｎｇｅｒｍ ｄｒｌ遺伝子のセグメントの塩基配列を決定した。塩基配列決定を容易にするた めに、　ｐＭＤＲｌはＨａｅ　ＩＩＩおよびＲｓａ　Ｉでマンブし、　ｐＭＤＲ ｌの２２０〜２４０　ｂｐの個々のフラグメントをｐＵｃ１８プラスミドヘクタ −（Ｍａｒｙｌａｎｄ州、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅに所在するＢｅｔｈｅｓｄａＲ ｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にサブクローンした。ｐＭＤＲｌ の配列は、双方の鎖の塩基配列を決定することによって確認した。

ｐＭＤＲｌの完全な配列を第４表に示す。下記の実施例１０の対応するｃＤＮＡ クローン配列と比較したところ、　ｐＭＤＲｌは、ヌクレオチド１−１．１１お よび６５３−８０７から成る２つのタンパク質コード化配列（エキソン）セグメ ント、ならびにｍＲＮＡとしては発現せず且つヌクレオチド１１２−６５２から 成る介在配列（イントロン）セグメントを含むことが判明した。第４表は、　ｐ ＭＤＲｌ内のエキソンに対応するアミノ酸配列を示す。したがってこのアミノ酸 配列２０１表 Ｉ　Ｔ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＡＴＡ　ＣＡＣＡＡＡ　ＡＴＴ　ＡＧＡ　Ａ ＡＡ　ＣＡＧ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＣＡＴ　ｃｃＴＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｉｃ ｅ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　ｌｌｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｈｉ ｓ　Ａｌａ４４　ＡＴＡ　ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＣＡＩＩ；　ＧＡＧ　ＡＴＡ　ＧＧ ＣＴＧＧ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　ＣＡＣＧＡＴ　ＧＴＴｌｌｅ　ＭＥＴ　Ａ ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｇａｙ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｈ ｉｓ　Ａｓｐ　Ｖａ１８６　ＧＧＧ　ＧＡＧ　ＣＴＴ　ＡＡＣＡＣＣＣＧＡ　Ｃ ＴＴ　ＡＣＡ　ＧＡＧａｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ 　Ｔｈｒ　Ａｓ１１２　ＧＴＡＡＧＴＡＴＴ　ＴＡＧＴＴＴＴＡＴＧ　ＴＴＧＡ ＡＣＴＴＧＧ　ＧＴＧＴＣＧＴＴＣＴ１５１　ＴＡＴＣＣＴＴＡＧＴ　ＡＡＡＡ ＴＧＡＡＡＴ　ＡＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＣＡＴＣＴＧＴＴＡ　ＧＧＡＧＧＴＧＴ Ｔ八２０１　へＴＧＴＡＴＣＡＴＴ　ＣＡＡＡＧＧＴＡＣＴ　ＴＡＴＧＡＧＡＣ ＡＡ　ＡＡＴＴＣＣＴＴＣＴ　ＡＡＧＣＡＧＣへＡＣ２５１ＡＡＴＧＴＣＧＴＧ Ｔ　ＧＣＡＴＣＣＴＴＴＴ　ＧＴＴＣＣＣＡＧＴＧ　ＣＣＴＴＧＡＣＡＧＧ　Ｇ ＴＡＴＧＧＧＧＧＧ３０１　ＡＣＣＴＧＣＡＴＧＡ　ＣＴＡＧＣＡＴＴＡＡ　Ａ ＴＧＡＡＧＧＡＣ丁　ＧＧＧＣＴＴＴＣＣＡ　ＧＡＡＴＧＡＡＧＡＡ３５１　Ａ ＴＣＣＴＣＴＧＡＧ　ＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴ　ＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴ ＡＣＴＴＴ　ＣＴ［；ＡＧＧＡＡＡＴ４０１　ＴＴＣＴＧＡＧＣＡＡ　ＴＴＴＧ ＡＡＡＴＴＣＣＴＡＧＧＴＴＧＡＡ　ＴＡＣＴＴＣＴＴＧＴ　ＧＴＡＣＡＣＧＡ ＴＧ４５１　ＴＣＣＡＴＴＴＣＣＴ　ＧＧＧＧＣＣＡＴＧＴ　ＧＧＣＴＡＴＧＧ へＴ　ＴＴＴＴＧＴＴｆ’；ＴＴ　ＡＡＴＧＡＣＡＡＡＴ５０１　ＡＴＣＣＴＡ ＧＴＡＧ　ＡＡＡＣ丁ＴＣＴＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＡＴ　ＡへＡＡＣＡＡＡＧＣ ＡＴＡＧＧＣＡＣＡＡ５５１　ＡＡＴＡＣＴＣＴＡＧ　ＣＣＡＴＡＡＡＣＴＡ　 ＣＣＣＴＡＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴ　ＴＣＡＣＧＡＧＡＡＡ６０１　Ａ ＧＴＴＧＡＴＧＴＴ　ＴＡＣＡＡＴＴＣ丁Ｇ　ＡＣＡＡＴＴＡＴＴＴ　ＣＴＡＡ ＣＡＣＴＡＴ　ＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣ６５１ＡＧ ６５３　Ｔ　ＧＵＴ　ＧＴＣＴＣＴ　ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＣＴＴ 　ＡＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡＣＡＡＡ　ＡＴＴ　ＧＧＡｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ 　Ｌｙｓ　ｌｌｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ 　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ６９６　ＡＴＧ　ＴＴＣＴＴＴ　ＣＡＧ　ＴＣＡ　ＡＴＧ　Ｇ ＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＴ　ＴＴＣＡＣＴ　ＧＧＧ　ＴＴＴ　ＡＴへＭＥＴ　Ｐｈｅ 　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ＭＥＴ　Ａｈａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ 　Ｇａｙ　Ｐｈｅ　１ｌｅ７３８　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＣＧＴ　 ＧＧＴ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　ＣＴＡ　ＡＣＣＣＴＴ　ＧＴＧ　ＡＴＴ　ＴＴＧＶａ Ｉ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇａｙ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈ ｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｃｅ　Ｌｅｕ７８０　ＧＣＣＡＴＣＡＧＴ　ＣＣＴ　Ｇ ＴＴ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　Ｇ　８０７Ａｈａ　ｌｌｅ　Ｓｅｒ　 Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ実施例ＩＱ ヒチンを用いて選択したサプラインＫＢ−Ｃ２，５がらポリ　（Ａ）’　ＲＮＡ をｓ離した。ｃＤＮＡライブラリーは、二重鎖ｃＤＮＡの合成、プラントエンデ ィング、　Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ−の結合、ならびにファージベクター７！ｇｔｌ ｌへの挿入の各遍程を用いて作製した（Ｙｏｕｎｇおよび　Ｄａｖｉｓ、、ＪＪ Ｊ６．　Ｈｕｙｎｈ等、　ＤＮＡクローニング技法、実際的なアプローチ、　Ｄ 、　Ｇｌｏｖｅｒ　Ｈ纂、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、（１９８５ ン）　＠　ＣＤＮＡライブラリーは、プローブｐＭＤＲ１を用いたプラークハイ ブリッド法（Ｂｅｎｔｏｎ等、上弗）によってスクリーニングした。約１２０ａ の陽性クローンが草地された。これらのクローンのうちの５個（λＨＤＲ５，λ ｌＩＤＲ１０，λＨＤＲ２８，λ１ＩＤＲ６２および／１ＩＤＲ６９）からの挿 入物を、プラスミドベクターｐＧＥｌ’ｌｌおよびｐＧＥ？Ｉ４（Ｐｒｏｍｅｇ ａ　Ｂｉｏｔｅｃ、）に再クローン化した。これらのクローンの部分制限マツプ を第３図に示す。Ｊ　）ｌＤｌ？５のＤＮＡをＥｃｏ　Ｒ１で処理したところ、 ２つのフラグメントが得られたので、　５Ａおよび５Ｂと名付けた。これらのフ ラグメンＩ・をｐｃｐｈｉのＥｃｏ　Ｒ１部位にサブクローンした結果、プラス ミドｐＨＤＲ５ＡとｐＨＤＲ５Ｂが得られ、これらのプラスミドは＋　１２３０ １　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄに所在するＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎに１９８６年３月ゴ８日に寄託され、それぞれ受入番号ＡＴ ＣＣ６７０４０おた。このプラスミドは、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄ ｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

ＭａｒｙＩａｎｄに所在するＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎに１９８６年３月］り日、寄託番号６７０４２として寄託さ れた。

すｒｌ　ｃＤＮＡの残りの部分を単翻するために、第３図に縞模様棒線で示した クローンλＨＤＲ５のフラグメントを用いて。

同じｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンのうちのλＨＤ Ｒ１０３，λｌＩ［１ｌＩｌ１１０４およびλ１ＩＤＲ１０５と名付けた３つか ら得た挿入物を、プラスミドベクターｐＧＥＭ１およびｐＧＥＭ４の恥ム１７１ 部位に再クローンしたところ、それぞれｐＨＩ）Ｒ１０３，ｐ［ｌＲ＋０４およ びｐＨＤＲｌ、０５と名付けたプラスミドが得られた。プラスミドｐ　ｆｌ　Ｄ 　ＲＩ　Ｏ４は、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖ ｉｌｌｅ、　ＭａｒｙＩａｎｄに所在するＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに１９８６年７月１６日、寄託番号６７１５６ として寄託された。

個々のクローンの制限マツプを比較したところ１例えばクローンメＩＩＩＩＩＲ ＩＯ，λＨＤＲ２８およびλＨＤＲ６９にｃＤＮＡ構造の相違が見られる。これ らのクローンの中で保存性の最も高い領域は。

２７０　ｂｐ　Ｐｖυｉｔフラグメントに代表されるものであり、これはｐ？１ ＤＲ１のエキメン領域に対応するものであり、第３図においては、線の」二側の 実棒線で示す。クローンλ１１　Ｄ　Ｒ６２およびλ）ＩＤＲＩ０５に特異な変 異体配列はＤＮＡ塩基配列決定によって検出され、これらは第３図の対応する線 の下側に実棒線で示す。第３図において、対応する制限エンドヌクレアーゼによ って消化される部位は下記のように示す。’Ａ　Ｊ　Ｉ　Ａｃａｌ、ｒＥＪ　Ｉ 　Ｅｃｏ　Ｒ１゜「ＨＪ　Ｉ　Ｈ＋ｎｄｌＴＩ　ｅ　’Ｎ　Ｊ　ｌ×ｍｎ＋、’ Ｐ　Ｊ　、　Ｐｖｕｌ！　、’Ｓ　Ｊ　、　５ｔｕｌａ　’Ｔ　Ｊ　Ｉ　５ｓｔ １．　’Ｖ　Ｊ　Ｉ　Ａｖａｌ、および’Ｘ　Ｊ　Ｉ　Ｘｂａ＋。

ｃＤＮＡクローン、λ）ＩＤＲ１０，ノＨＤＲ５およびλＩ（ＤＩ？１０４は、 挿入物を１１３フアージベクターにサブクローンしくＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｍｅｔ ｈ。

」Ｕ憇旦０．」侃、　２０．１９８３）　、一連の重複欠失サブクローンを産生 じ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、　Ｇｅｎｅ、　２８．３５Ｌ　１９８４　）　、さらに 酵素チェーンターミネーション塩基配列決定性ムこよってそれらのＤＮＡ配１０ ｉ３　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＡＣＡ ＭＥＴ　Ａｌａ　Ｔｈｒ １０５５　ＧＧＴ　ＴＧＧ　ＡＡＧ Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　１．ｙｓ １０９７　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＣＴＧ Ｌｅｕ　Ｇａｙ　Ｌｅｕ １１３９　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＧＡＴ Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ １１８１　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＧＡＡ Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ １２２３　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＧＧ八 へｈｅ　Ｇａｙ　Ｇｌｙ １２６５　ＴＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ １３０７　ＧＣＣＡＡＴ　Ａ１’Ｔ Ａｌａ　Ａｓｎ　ｌ１ｅ １３４９　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＧＣＴ Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ ＴＴＴ　ＴＴＣＡＣＴ　ＧＧＧ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　Ａ ＣＡ　ＣＧＴ　１０５４Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｉｃｅ　Ｖ ａｔ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇｉ　ＣＴＡ　ＡＣＣＣＴＴ　ＧＴＧ　Ａ ＴＴ　ＴＴＧ　ＧＣＣＡＴＣＡＧＴ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　１０９６：　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖ ａｌ：ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＴＣＴＧＧ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　ＣＴ Ａ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　１１３８（Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａ ｌａ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ゛　八ＡＡ　ＧＡＡ　ＣＴＣＴ ＴＡ　ＧＣＧ　ＴＡＴ　ＧＣＡ　へへＡ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＧＣＡ　１１８０ｒ 　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｈａ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ 　Ｇｌｙ　ＡｌａＩ　ＧＡＧ　ＧＴＣＴＴＧ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＡＧＡ 　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＡＴＴ　ＧＣＡ　１２２２ｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａ ｌａ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｉ］、ｅ　Ａｌａｔ　ＣＡＡ 　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＡＧＧ　ＴＡＣＡＡＣＡＡＡ　Ａ ＡＴ　１２６４１　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ 　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＮ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＧＧ Ｇ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＡＣＡ　１３０６ｕ　Ａ］、ａ 　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｌｉｅ 　Ｔｈｒｒ　ＴＣＴ　ＡＴＡ　ＧＧＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ 　ＡＴＣＴＡＴ　ＧＣＡ　１３４８ｅ　Ｓｅｒ　、Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｈａ　Ａ ｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　ＡｌａＴ　ＣＴＧ　ＧＣＣＴ ＴＣＴＧＧ　ＴＡＴ　ＧＧＧ　ＡＣＣＡＣＣＴＴＧ　ＧＴＣＣＴＣ］、３９０ａ 　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇａｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｌ、ｅ ｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ１３９１　ＴＣＡ　ＧＧＧ　ＧＡＡ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ １４３３　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＴＴＡ Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ １４７５　八ＧＣＡＴＴ　ＧＡＡ Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ １５１７　ＡＴＣＴＴＣＡＡＧ ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ １５５９　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＡＧＴ Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　５ｅｒ １６０１　ＧＡＡ　ＴＴＣＡＧＡ Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ １６４３　ＧＴＴ　ＡＡＧ　ＡＴＣ Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ｌ１ｅ １６８５　ＣＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＧ Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ １７２７　八ＣＡ　ＡＣＡ　ＧＴＣ ＴＡＴ　ＴＣＴ　ＡＴＴ　ＧＧＡ　ＣＡＡ　ＧＴＡ　ＣＴＣＡＣＴ　ＧＴＡ　Ｔ ＴＣＴＴＴ　１４３２Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ、　Ｌ ｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　ＰｈｅＡＴＴ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＡＧ Ｔ　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　１４７４１１ｅ　Ｇｌ ｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａ１．ａ　Ｓｅｒ　Ｐ ｒ。

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ＡＣＴ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣＡＡＡ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　Ｃ ＴＣ３９５２Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇａｙ　Ｔｈ ｒ　Ｇｌｎ　ＬｅｕＡＡＡ　ＣＡＡ　ＣＧＣＡＴＴ　ＧＣＣＡＴＡ　ＧＣＴ　Ｃ ＧＴ　ＧＣＣＣＴＴ　３９９４Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　ｉｌ、ｅ　Ａｈａ　Ｉ ｌｅ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｈａ　ＬｅｕＣＡＴ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＣＴＴ　ＴＴ Ｇ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＧＣＣＡＣＧ　ＴＣ八　４０３６４０３７　ＧＣＴ　ＣＴ Ｇ　ＧＡＴ Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ ４．０７９　ＧＡＣＡＡＡ　ＧＣＣ Δｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ ４１２１　ＣＧＣＣＴＧ　ＴＣＣ Ａｒｇ　Ｌｅｕ　５ｅｒ ４１６３　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＧＧＣ Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ ４２０５　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡＧ Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ ４２４７　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＡ Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ ４２６８　ＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧ　１ ４３１８　ＡＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡ ４３６８　ＣＴＧＴＴＴＡＡＣＡ　１ ４４１８　ＴＡＡＡＧＧ八八ＣＡ　へへ４４６８　ＡＡＣＴＧＣＡＴＴＡ　１ ４５１８　ＡＡＴＧＴＧＴＡＡＴ　１ ４５６８　ＴＧＣＴＡＡＡＡＧＡ　１ ４６１８　ＴＧＴＣＴＡＴＡＡＴ　＃ ４６６８　八Ａ ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＧＴＴ　ＧＴＣＣＡＡ　ＧＡＡ　Ｇ ＣＣＣＴＧ　４０７８Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａ ｌ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＬｅｕＡＧＡ　ＧＡＡ　ＧＧＣＣＧＣＡＣＣＴＧ ＣＡＴＴ　ＧＴＧ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＣＡＣ４１２０Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　 Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｉｃｅ　Ａｌａ　Ｈ４５ＡＣＣＡＴ ＣＣＡＧ　ＡＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＣＴＴＡ　ＡＴＡ　ＧＴＧ’ＧＴＧ　ＴＴＴ　 ４１６２Ｔｈｒ　Ｔｉｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　 Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＰｈｅＡＧＡ　ＧＴＣＡＡＧ　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＧＧＣＡＣＧ 　ＣＡＴ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　４２０２Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ 　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　ＬｅｕＡＡＡ　ＧＧＣＡ ＴＣＴＡＴ　ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＧＴＣＡＧＴ　ＧＴＣＣＡＧ　４２４６ Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＭＥＴ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　 Ｖａｌ　ＧｉｎＡＡＧ　ＣＧＣＣＡＧ　ＴＧ八　４２６７Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｉ ｎ　ＴＥＲ ＴＡＴＧＡＧＡＴＧＴ　ＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴ　ＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧ　ＴＴＴ ＡＧＡＴＡＴＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡ　ＧＣＡＡＡＣＡＣＴＴ　ＡＣＡＧＡＡＴ ＴＡＴ　ＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＴＴＴＣＣＴＣＡＧＴ　ＣＡＡＧＴＴＣＡＧＡ　 ＧＴＣＴＴＣＡＧＡＧ　ＡＣＴＴＣＧＴＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＡＧＡ　ＣＡＴＣ ＡＴＣＡＡＧ　ＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡ　ＴＣＡＴＡＧＴＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴ ＡＴ　ＡＡＣＡＧＡＡＴＴＡ　ＡＡＧＴＡＧＡＴＴＴ　ＴＡＡＡＡＧＡＴＡＡＴ ＴＴＧＴＴＴＡＴＡ　ＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴ　ＴＧＧＡＣＴＧＴＡＡ　ＣＴＧＡ ＣＴＧＣＣＴＴＴＡＴＡＧＡＡＧＴ　ＡＧＣＡＡＡＡＡＧＴ　ＡＴＴＧＡＡＡＴ ＧＴ　ＴＴＧＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＡ　４八 ＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ第５表に示したアミノ酸配列を分析す ると、閃旦遺伝子生成物はトランスメンブランタンパク質である可能性が大きい ことがわかる。このタンパク質は、互いにかなりの配列相同性をもつ２つのほぼ 同じ大きさの部分から成るものと考えられ、弘遺伝子が内部重複の結果進化した 可能性が大きいことを示唆するものである。タンパク質の各半分は、疎水性部分 と親水性部Ｊ、　Ｍｏｌ。

って確認し たところ、６つのトランスメンプラン領域を含む。双方の親水性部分；よ、いく つかの周知の酵素のＡＴＰ結合部位と高レベルのアミノ酸相同性を有する２つの 領域を含む。最も高い相同性は、細菌ペリプラズム結合タンパク質依存性輸送シ ステムの周辺膜成分のＡＴＰ結合部位とのあいだに見られた（Ｈｉｇｇｉｎｓ等 。

旦艷Ｗ工Ｊ、、　４．１０３３−１０４０　（１９８４））。タンパク質配列中 にトランスメンプラン領域が存在し、且つグリコジル化反応部位が存在すると考 えられることは、上述したように、１旦タンパク質がｐ−１タンパク質と関係が あることと矛盾しない。

Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ等、上ｌのアリゴリズムによる第５表に示すＤＮＡおよびタ ンパク質配列情報の分析は、細胞膜の外側に位置するタンパク質領域を予測する のに用いることができる。これらのタンパク質領域は２化学合成あるいは適切な ベクターシステムにおける発現によって産生ずることが可能であり、また実施例 １１に述べるように、　ｍｄｒｌｉｆｔ伝子生成物を発子生成物胞に対する抗体 を産生ずるのに用いることができる。

去範ｍ１２↓ 本発明による組換えプラスミドｐ！１ＤＲ］およびｐｌＩＤＲ組換えプラスミド ｐ＋１［ＩＲ４，４お１よびｐＨＤＩｌ’４．５の異なる個々のフラグメントあ るいは後者のプラスミドの全体あるいは　ｃＤＮＡクローン、λＨＤＲ５，λＩ ＩＤＲＩＯ，／　１ＩＤＲ６２，λＨＤＲ２８およびλ１ｌＤＩ’１６９あるい はその他の配列を診断ツールとして使用し、化学療法剤に対する耐性があるヒト 腫瘍細胞の検出を行うことができる。これらのプラスミドは１例えばＲｉｇｂｙ 等、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１１３．２３７−２５１、　（１，９７７）あ るいはＦｅｉｎｂｅｒｇ等、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１３２２−６ −１３（１，９８３）の手順にしたがって放射性同位体を用いて直接ラベルを付 けることができる。あるいは、これらのプラスミドは１例えばＬｅａｒｙ等、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａム」恒−己叩−△−’）、　８０．４０４５− ４０４９（１９８３）の手順にしたがって非放射性化学タグを用いてラベルを付 けることができる。さらに、これらのプラスミドは、ラベルを付けたＲＮＡプロ ーブの合成の制御に用いることができる〔例えば、　Ｍｅｌｔｏｎ等、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２．７０３５−７０５５　（１９８４）の 手順による〕。その後、ラベル付のプローブを用いて、ノーザンハイプリダイゼ ーション法（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

とし　孤塾）、コム°５２０１−５２０５　（１９８０）による〕１あるいはド ツトプロットまたはスロットプロットハイブリダイゼーション〔Ｋａｆａｔｏｓ 等、　籾虹肌ＣＡＣ１ｄＳ旺ｄ、、　７．　１５４１−１５５２　（１９７９） およびＢｒｏｗｎ等、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．旦ｊｏ１．．３．１０９７−１１ ０７　（１９８３）による〕、あるいばｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法〔例 えば、　ＢｒａｈｉＣ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）、　７５．　６］２５−６１２９　（１９７８）の手法に従う〕のい ずれかにより、腫瘍細胞中の相同ＲＮＡ配列の存在を検出するのに用いるここと ができるｅ恒しＮし梗−ハイブリ７ド形成法は、生検試料中の少数（１０００個 あたり１個あるいはもっと少ないもの）の複数薬剤耐性細胞を検出する特に感受 性の高い手法をもたらすものと予測される。

子生成物に対する多クローン性抗体あるいは単クローン性抗体（Ｙｅｌｔｏｎ等 、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５０．６５７−６８０　（１９ ８１））を得るのに用いることができる。

第１の方策では、実施例１０に述べたような弘遺伝子のｃ　Ｄ　：ｉ　Ａ配列の 決定が関与する。　ｃＤＮＡ配列は５対応するタンパク譬配列を演鐸するのに用 いることができる。ｍａｒタンパク質の異なる部分に対応し、且つ望ましくは少 なくとも１５〜２０個のアミノ酸残基から成るペプチドを、固相法によって化学 合成することができる（Ｍａｒｇｌｉｎ等、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、、　３９．８４］−８６６（１９７０）　）。その上で、前述のペプチド を用いて、特異な多クローン性抗体および華クローン性抗体を誘導することがで きる（Ｌｅｒｎｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９９．５９２−５９６　（１９８２ ）、Ｎｉｍａｎ等１旦ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　８０．４９４９−４９５３　 （１９８３）　）　、第５表に示すように、閃ｒｌ　ｃＤＮＡ配列の全長が分る ので、潜在的細胞質膜外領域をも含むｍｄｒｌクンバク質の異なる領域に対応す る潜在的免疫原性ペプチドのデザインが大幅に容易になる。

第２の方策は、プラスミド、ファージあるいはウィルス発現ベクターを用いて、 細菌、酵母あるいは咄乳動物の発現システム中で完全なあるいは部分的なｍａｒ 遺伝子生成物を発現することに関与する（Ｖｉｅｉｒａ等、　Ｇｅｎｅ、　１９ ．２５９−２６８　（１９８２）、　Ｙｏｕｎｇ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　８０．１１９４−１１９８　（１９８ ３）。

Ｂｉｔｔｅｒ等、　Ｇｅｎｅ、　３２．２６３−２７４　（１９８４）、　Ｃｅ ｐｋｏ等、並置。釘。

１０５３−６２　（１９８４）、およびＧｏｒｍａｎ等、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ、２．１０４４−　１０５１　（１９８２）　）。発現したタンパ ク質は精製して、ワクチンに使用したり、また特異抗体の産生に用いることもで きる。

ｍａｒ遺伝子生成物に対する抗体は、薬剤耐性細胞を検出するための別の診断ツ ールとして用いることができる。最後に、このる可能性がある。この方策では１ 例えば、特定の複数薬剤耐性腫瘍細胞を取り除くために、抗弘抗体と放射性同位 体あるいは化学的毒物との接合を行う。このアプローチは、化学療法と組み合わ せて用いる場合には特に有効であろう。あるいは、抗ｍａｒ抗体と、弘遺伝子生 成物を発現する細胞との結合は、たとえ抗体媒介細胞毒性が存在しない場合でも 、十分に複数薬剤耐性表現型を逆向きにすることが可能であり、したがって化学 療法剤細胞致死性に対する感受性を腫瘍細胞に持たせることができる。

さらに、完全なまたは部分的な弘遺伝子生成物をワクチンとして用いることによ って愚者に複数薬剤耐性腫瘍細胞に対する免疫反応を誘起することができる。

本発明をその望ましい実施態様について説明したが９本発明を考察すれば、当業 者には変更ならびに変更ＦＥ　ｔｉが容易であろうと考えられる。したがって、 全てのそのような均等の変更ならびに変更態様は、請求する本発明の範囲に入る ものとする。

…………１　ＱＭＤＲＩ ＦＩＧ、　２ 国際調査報告 Ｖｌ、０８ＳＥＲＶＡＴＩＯＮＳ　ＷＨＥＲＥ　ＵＮＩＴＹ　ＯＦ　ＩＮＶＥ！ ｆＴＩＯＮ　ＩＥ　ＬＡＣＫＩＮＧ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト細胞内における複数薬剤耐性に関連するヒトｍｄｒ遺伝子の単離核酸配 列。
2. ２．（ａ）第４表に示したヌクレオチドの連続配列，第５表に示したヌクレオチ ドの連続配列，ｐＨＤＲ４．４（ＡＴＣＣ４０２２７）に作製したヌクレオチド の連続配列， ｐＨＤＲ４．５（ＡＴＣＣ４０２２８）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ａ（ＡＴＣＣ６７０４０）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ｂ（ＡＴＣＣ６７０４１）に作製したヌクレオチドの連続酷列， ｐＨＤＲ１０（ＡＴＣＣ６７０４２）に作製したヌクレオチドの連続配列，およ び， ｐＨＤＲ１０４（ＡＴＣＣ６７１５６）に作製したヌクレオチドの連続配列 から成るグルーブの１メンバーである核酸，（ｂ）（ａ）に定めたヌクレオチド の連続配列の少なくとも１つとハイブリダイズするか，あるいは（ａ）に定めた ヌクレオチドの連続配列の少なくとも１つとして，ヒト由来の同じｍＲＮＡ分子 あるいはヒト由来のｃＤＮＡ分子に含まれるヌクレオチド配列から成る核酸， （ｃ）（ｂ）に述べたヌクレオチド配列のいずれかとハイプリダイズするヌクレ オチド配列から成る核酸，さらに（ｄ）遺伝暗号の縮重がなければ，（ａ），（ ｂ）あるいは（ｃ）に定めるヌクレオチド連続配列の少なくとも１つをハイプリ ダイズするヌクレオチド配列から成る核酸，から成るグルーブから選択された核 酸。
3. ３．（ａ）第４表に示したヌクレオチドの連続配列，第５表に示したヌクレオチ ドの連続配列，ｐＨＤＲ４．４（ＡＴＣＣ４０２２７）に作製したヌクレオチド の連続配列， ｐＨＤＲ４．５（ＡＴＣＣ４０２２８）作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ａ（ＡＴＣＣ６７０４０）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ｂ（ＡＴＣＣ６７０４１）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ１０（ＡＴＣＣ６７０４２）に作製したヌクレオチドの連続配列，およ び， ｐＨＤＲ１０４（ＡＴＣＣ６７１５６）に作製したヌクレオチドの連続配列 から成るグルーブの１メンバーである核酸，（ｂ）（ａ）に定めたヌクレオチド の連続配列の少なくとも１つとハイプリダイズするか，あるいは（ａ）に定めた ヌクレオチドの連続配列の少なくとも１つとして，ヒト由来の同じｍＲＮＡ分子 あるいはヒト由来のｃＤＮＡ分子に含まれるヌクレオチド配列から成る核酸， （ｃ）（ｂ）に述べたヌクレオチド配列のいずれかとハイプリダイズするヌクレ オチド配列から成る核酸，さらに（ｄ）遺伝暗号の縮重がなければ（ａ），（ｂ ）あるいは（ｃ）に定めるヌクレオチド連続配列の少なくとも１つをハイブリダ イズするヌクレオチド配列から成る核酸，および前述のポリヌクレオチドに関連 するラベル，から成る核酸プローブ。
4. ４．（ａ）第４表に示したヌクレオチドの連続配列，第５表に示したヌクレオチ ドの連続配列，ｐＨＤＲ４．４（ＡＴＣＣ４０２２７）に作製したヌクレオチド の連続配列， ｐＨＤＲ４．５（ＡＴＣＣ４０２２８）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ａ（ＡＴＣＣ６７０４０）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ｂ（ＡＴＣＣ６７０４１）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ１０（ＡＴＣＣ６７０４２）に作製したヌクレオチドの連続配列，およ び， ｐＨＤＲ１０４（ＡＴＣＣ６７１５６）に作製したヌクレオチドの連続配列 から成るグルーブの１メンバーである核酸，（ｂ）（ａ）に定めたヌクレオチド の連続配列の少なくとも１つとハイプリダイズするか，あるいは（ａ）に定めた ヌクレオチドの連続配列の少なくとも１つとして，ヒト由来の同じｍＲＮＡ分子 あるいはヒト由来のｃＤＮＡ分子に含まれるヌクレオチド配列から成る核酸， （ｃ）（ｂ）に述べたヌクレオチド配列のいずれかとハイプリダイズするヌクレ オチド配列から成る核酸，さらに（ｄ）遺伝暗号の縮重がなければ，（ａ），（ ｂ）あるいは（ｃ）に定めるヌクレオチド連続配列の少なくとも１つをハイブリ ダイズするヌクレオチド配列から成る核酸。 から成るグルーブから選択された核酸によってりコードを決定されたアミノ酸の 連続配列から成るポリペプチド。
5. ５．請求の範囲第４項に示すポリペプチド，ならびに適合可能希釈剤，アジュバ ントあるいは担体から成る，ワクチンあるいは特異抗体の誘導抗原として有効な 組成。
6. ６．（ａ）第４表に示したヌクレオチドの連携配列，第５表に示したヌクレオチ ドの連続配列，ｐＨＤＲ４．４（ＡＴＣＣ４０２２７）に作製したヌクレオチド の連続配列， ｐＨＤＲ４．５（ＡＴＣＣ４０２２８）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ａ（ＡＴＣＣ６７０４０）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ｂ（ＡＴＣＣ６７０４１）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ１０（ＡＴＣＣ６７０４２）に作製したヌクレオチドの連続配列，およ び， ｐＨＤＲ１０４（ＡＴＣＣ６７１５６）に作製したヌクレオチドの連続配列 から成るグルーブの１メンバーである核酸，（ｂ）（ａ）に定めたヌクレオチド の連続配列の少なくとも１つとハイプリダイズするか，あるいは（ａ）に定めた ヌクレオチドの連続配列の少なくとも１つとして，ヒト由来の同じｍＲＮＡ分子 あるいはヒト由来のｃＤＮＡ分子に含まれるヌクレオチド配列から成る核酸， （ｃ）（ｂ）に述べたヌクレオチド配列のいずれかとハイプリダイズするヌクレ オチド配列から成る核酸，さらに（ｄ）遺伝暗号の縮重がなければ，（ａ），（ ｂ）あるいは（ｃ）に定めるヌクレオチド連続配列の少なくとも１つをハイプリ ダイズするヌクレオチド配列から成る核酸。 から成るグルーブから選択された核酸によってコードを決定されたアミノ酸の連 続配列から成るポリペプチドに対する抗体。
7. ７．（ａ）第４表に示したヌクレオチドの連続配列，第５表に示したヌクレオチ ドの連続配列，ｐＨＤＲ４．４（ＡＴＣＣ４０２２７）に作製したヌクレオチド の連続配列， ｐＨＤＲ４．５（ＡＴＣＣ４０２２８）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ａ（ＡＴＣＣ６７０４０）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ｂ（ＡＴＣＣ６７０４１）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ１０（ＡＴＣＣ６７０４２）に作製したヌクレオチドの連続配列，およ び， ｐＨＤＲ１０４（ＡＴＣＣ６７１５６）に作製したヌクレオチドの連続配列 から成るグルーブの１メンバーである核酸，（ｂ）（ａ）に定めたヌクレオチド の連続配列の少なくとも１つとハイプリダイズするか，あるいは（ａ）に定めた ヌクレオチドの連続配列の少なくとも１つとして，ヒト由来の同じｍＲＮＡ分子 あるいはヒト由来のｃＤＮＡ分子に含まれるヌクレオチド配列から成る核酸， （ｃ）（ｂ）に述べたヌクレオチド配列のいずれかとハイプリダイズするヌクレ オチド配列から成る核酸，さらに（ｄ）遺伝暗号の縮重がなければ，（ａ），（ ｂ）あるいは（ｃ）に定めるヌクレオチド連続配列の少なくとも１つをハイプリ ダイズするヌクレオチド配列から成る核酸，および前述の単クローン性抗体に関 連するラベル，から成るグルーブから選択された核酸によってコードを決定され たアミノ酸の連続配列からなるポリペプチドに対する抗体から成る診断用試薬。
8. ８．（ａ）第４表に示したヌクレオチドの連続配列，第５表に示したヌクレオチ ドの連続配列，ｐＨＤＲ４．４（ＡＴＣＣ４０２２７）に作製したヌクレオチド の連続配列， ｐＨＤＲ４．５（ＡＴＣＣ４０２２８）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ａ（ＡＴＣＣ６７０４０）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ５Ｂ（ＡＴＣＣ６７０４１）に作製したヌクレオチドの連続配列， ｐＨＤＲ１０（ＡＴＴＣＣ６７０４２）に作製したヌクレオチドの連続配列，お よび， ｐＨＤＲ１０４（ＡＴＣＣ６７１５６）に作製したヌクレオチドの連続配列 から成るグルーブの１メンバーである核酸，（ｂ）（ａ）に定めたヌクレオチド の連続配列の少なくとも１つとハイプリダイズするか，あるいは（ａ）に定めた ヌクレオチドの連続配列の少なくとも１つとして，ヒト由来の同じｍＲＮＡ分子 あるいはヒト由来のｃＤＮＡ分子に含まれるヌクレオチド配列から成る核酸， （ｃ）（ｂ）に述べたヌクレオチド配列のいずれかとハイプリダイズするヌクレ オチド配列から成る核酸，さらに（ｄ）遺伝暗号の縮重がなければ，（ａ），（ ｂ）あるいは（ｃ）に定めるヌクレオチド連続配列の少なくとも１つをハイブリ ダイズするヌクレオチド配列から成る核酸。 から成るグルーブから選択された核酸によってコードを決定されたアミノ酸の連 続配列から成るポリペプチドに対する抗体から成る免疫療法調製物。
9. ９．前述の抗体と接合する細胞致死性薬剤を含む請求の範囲第８項記載の免疫療 法調製物。