JP2634833B2 - ヒト細胞における複数薬剤耐性に関連するｄｎａ配列を含むクローンの組成および方法 - Google Patents

ヒト細胞における複数薬剤耐性に関連するｄｎａ配列を含むクローンの組成および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本件は,1986年３月28日に提出された出願番号845,610
の一部継続出願である。
背景 本発明は，一般に診断材料ならびに方法に関し，より
具体的には複数薬剤耐性腫瘍細胞を検出する材料および
方法に関する。
植物塩基あるいは抗腫瘍抗生物質に対する耐性を有す
る哺乳動物細胞の選択を行うと，しばしば元の選択物質
に対して構造および作用モードが無関係の別の薬剤に対
する交差耐性が生じる。Biedler等，Csncer Res.,30,11
74（1970）。複数薬剤耐性現象は最も一般的に使用され
ている抗癌剤のいくつかに対する耐性が関連するので，
癌化学療法において重大な問題である。
ほとんどの場合，複数薬剤耐性は，おそらく形質膜内
の変化によって，細胞内薬剤蓄積が低下するために生じ
るものと思われる。Biedler等，Csncer Treat.Rep.，6
7,859（1983）,Ling等、Cancer Treat.Rep.，67,869（1
983）,Ramu等，Csncer Treat.Rep.，67,895（1983），
およびBeck等，Csncer Res.,39,2070（1979）。
幾つかのハムスター，マウスおよびヒトの複数薬剤耐
性細胞系において，耐性は分子量170,000の膜糖タンパ
ク質（Ｐ−糖タンパク質）あるいは分子量19,000のサイ
トソルタンパク質の過剰発現と相関関係がある。Kartne
r等，Science, 221,1285−1288（1983）,Biedler等，Can
cer Treat.Rep.，67,859（1983）。ヒト癌患者から採取
した細胞にイムノブロッティグ手法を適用すると，進行
した非反応性の卵巣癌のいくつかの症例においては，高
レベルのＰ−糖タンパク質が存在することが分かる。Be
ll等，J.Clin.Oncol.,3,311−315（1985）。
複数薬剤耐性のチャイニーズハムスター卵巣（CHO）
細胞系に対して生成され且つヒト細胞系と交差反応する
Ｐ−糖タンパク質特異単クローン性抗体は，それらの薬
剤耐性の程度に相関する程度ほど複数薬剤耐性哺乳類細
胞と結合するように思われる。Kartner等，Nature，31
6,820−823（1985）。これらの単クローン性抗体は全
て，提示されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドのＣ末端
細胞内領域と結合する可能性がある。Kartner等，Natur
e，316,820−823（1985）。Ｐ−糖タンパク質特異cDNA
クローンは，チャイニーズハムスター卵巣細胞から単離
されており，サザーンブロッティング手順を用いたとこ
ろ，これらのクローンには，ハムスター，マウスおよび
ヒトの複数薬剤耐性細胞においてＰ−糖タンパク質遺伝
子の増幅が見られた。Riordan等，Nature，316,817−81
9（1985）。しかし,Riordan等は，ハムスターのＰ−糖
タンパク質cDNAクローンをRNAのレベルでヒトＰ−糖タ
ンパク質遺伝子の発現を検出するのに用いることができ
るかどうかについては，何も示唆していない。
複数薬剤耐性の検査の別の方法において,DNAのある共
通領域が，コルヒチンあるいはアドリアマイシンのいず
れかに対する耐性を有するものとして選択された２つの
異なる複数薬剤耐性チャイニーズハムスターの細胞系内
で増幅されることがわかった。Roninson等，Nature，30
9,626（1984）。この領域は，ここにmdrと名付ける転写
単位を含むことがわかった。mdr mRNAの発現は，ハムスター細胞における複数薬剤耐
性に相関する。Gros等，J.Cell.Biochem.,9C,（補遺）,
16,A1167（1985），およびGros等，Proc.Natl.Acad．Sc
i.(USA)，83,337（1986）。しかし，ハムスターのmdr遺
伝子から得たプローブはヒト細胞にとっては有用なプロ
ーブではない。なぜなら，これらのプローブはヒトDNA
トハイブリドをつくる（実施例２に例示する，下文参
照）が，複数薬剤耐性に関する研究会についての報告書
〔Kolata,Science, 231,220−221（1986）〕から得られ
る印象とは違って，これらのプローブはヒトmdrmRNAと
効率的にハイブリドな形成しないからである。
したがって，ヒトmdr遺伝子発現を調べるプローブが
ないので，化学療法の前あるいは療法中に，ヒト腫瘍中
に複数薬剤耐性細胞が存在することを検出するための信
頼性の高い方法が必要である。
発明の要旨 本発明は，ヒト細胞の複数薬剤耐性に関連するヒトmd
r遺伝子の単離核酸配列を提供する。
本発明の現在望ましい実施態様は，下記のグループか
ら選択された単離精製核酸を提供する。前述のグループ
とは， （ａ）第４表および第５表に示し、pHDR4.4（ATCC 4022
7）,pHDR4.5（ATCC 40228）,pHDR5A（ATCC 67040）,pHD
R5B（ATCC 67041）,pHDR10（ATCC 67042）およびpHDR10
4（ATCC 67156）中に作製したヌクレオチドの連続配列
から成るグループのひとつのメンバーを含む核酸，
（ｂ）（ａ）に記載のヌクレオチドの連続した配列の少
なくとも１つとハイブリダイズするか、あるいは（ａ）
に記載のヌクレオチドの連続配列の少なくともひとつと
同じ、ヒト由来のmRNA分子あるいはヒト由来のcDNA分子
内に含まれるヌクレオチド配列を含む核酸，（ｃ）
（ｂ）に記載のヌクレオチド配列のいずれかとハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列を含む核酸，および（ｄ）
遺伝番号の縮重がなければ，（ａ），（ｂ）あるいは
（ｃ）に記載のヌクレオチドの連続配列の少なくとも１
つとハイブリダイズするヌクレオチドの配列を含む核酸
である。ここで『ハイブルダイゼーション』の有無を認
識する標準条件は，最終洗浄時に，温度65℃において４
×SSCおよび0.5％SDS中で行われる反応である。望まし
い実施態様に従う核酸プローブも，これらの核酸の１つ
と会合するラベルを含んでもよい。これらの核酸によっ
てコードされるポリペプチドは，発現されるか，化学的
に合成することが可能であり，当業者には周知である様
々な希釈剤，アジュバントあるいは担体と共に用いて，
単クローン性抗体あるいは多クローン性抗体を生成さ
せ，また患者の免疫応答を引き出すことができる。この
ような抗体は，現在使用可能な様々な免疫診断技法を用
いる診断用試薬として利用したり，また免疫療法剤とし
て用いることが可能である。
図面の簡単な説明 第１図は，チャイニーズハムスター細胞から単離した
転写mdr領域の５′部位を含むコスミドクローンcosDR3A
の部分制限マップである。
第２図は，それぞれmdr1配列およびmdr2配列を含むプ
ラスミドクローンpHDR4.4およびpHDR4.5の部分制限マッ
プを示す。
第３図は，mdr1配列を含むファージcDNAクローンλHD
R5,λHDR10,λHDR62,λHDR28,λHDR69A,λHDR103,λHDR
104およびλHDR105の部分制限マップを示す。
詳細な説明 本発明に従ってmdr1クローンを得ること，ならびにそ
の使用について予告が,1986年１月20日〜２月15日の分
子生物学および細胞生物学に関するUCLAシンポジウムに
おいて発明者によってなされた。Roninson等，J.Cell.B
iochem.,29（補遺10A）,12,A18（1986）,Pastan等，J.C
ell.Biochem.,29（補遺10A）,9,A13（1986）,Clark等，
J. Cell.Biochem.,29（補遺10A）,49,A130（1986）およ
びCornwell等，J. Cell.Biochem.,29（補遺10A）,50,A13
1（1986）。
最近公表されたJohn R.Riordanによる『哺乳動物細
胞系の複数薬剤耐性および決定基糖タンパク質DNAの単
離』と題する欧州特許出願番号第174,180号は,P−糖タ
ンパク質に特異なチャイニーズハムスターcDNAクローン
の単離について述べており，細胞の複数薬剤耐性を判定
するプローブとしてＰ−糖タンパク質特異的cDNAを用い
ることを示唆している。ハムスターcDNAとヒトゲノムDN
Aのサザンブロットハイブリダイゼーションだけが説明
されているが,RiordanのEPA174,810の請求の範囲第18項
は，『チャイニーズハムスターの卵巣細胞，マウス細胞
およびヒト細胞から成るグループから選択したソースか
ら得た』Ｐ−糖タンパク質特異的DNA分子に関するもの
である。ここに記載するmdrクローンがヒトＰ−糖タン
パク質遺伝子配列を表すならば，そしてこのことは下記
の実施例10において論じるようにまず間違いないと思わ
れるのであるが,RiordanのEPA174,810は，ヒトmdr遺伝
子あるいはその一部をも全く開示していないことに注意
する必要がある。
実際に,RiordanのEPA174,810は，チャイニーズハムス
ターのmdr領域セグメントのクローニングについて述べ
たRoninson等のNature，309,626（1984）の発行よりも
日付が後である。Roninson等，Nature，309,に記載され
た研究に続いて，チャイニーズハムスターのmdr遺伝子
全体の単離が発表された〔Gros等，J.Cell.Biochem．お
よびProc. Nat′l.Acad.Sci.(USA)，上掲〕。これはRioe
danのEPA174,810に記載されたチャイニーズハムスター
のＰ−糖タンパク質遺伝子の部分的なcDNAクローンとは
対照をなすものであった。RioedanのEPA174,810は，チ
ャイニーズハムスターのクローンがヒトＰ−糖タンパク
質mRNAの発現を検出する能力があることの証拠を何も示
していない。さらに，腫瘍細胞の複数薬剤耐性を検出す
るプローブとしてＰ−糖タンパク質cDNAを使用すること
は,RioedanのEPA174,810おいては，増幅されたＰ−糖タ
ンパク質遺伝子の検出についてのみ述べられており,P−
糖タンパク質mRNAの発現の増大の検出には関しては述べ
られていない。下記の実施例７で述べるように,mRNAの
発現の増大は，遺伝子の増幅よりもずっと有用な複数薬
剤耐性に対する診断マーカーとなるものである。さら
に，ヒト由来のＰ−糖タンパク質cDNA配列を請求してい
るにもかかわらず,RiordanのEPA174,810は，このような
配列がどのようにして得られるかという点については，
たとえば，ヒトDNAあるいはRNAのソース，あるいはチャ
イニーズハムスターのプローブを用いたヒトcDNAまたは
ゲノムライブラリーのスクリーニングのストリンジェン
シー条件等について，全く言及していない。下記の実施
例２に示すように，ハムスターとヒトの各mdr遺伝子
は，遺伝子の少なくとも５′半分においては，相同性が
低く，これはヒトmdrDNA配列の単離においてかなりの技
術的な問題となるものである。
下記の実施例では，ヒトmdr遺伝子の核酸クローンお
よびmdrクローンのヌクレオチド配列の使用について説
明する。実施例１では，チャイニーズハムスターのmdr
クローンを用いて，ヒトDNAとハイブリダイスする配列
を同定する。実施例２では，ヒトmdr遺伝子を含むDNA配
列の同定および単離について述べる。実施例３では，ヒ
ト薬剤耐性細胞におけるmdr遺伝子の増幅を実証する。
実施例４においては，mdr配列を含むクローンの特性決
定について述べる。実施例５では，mdr遺伝子に関連す
るDNAの転位を検討する。実施例６では，ヒト細胞にお
けるmdr1遺伝子の転写を実証する。実施例７では，ヒト
細胞内での複数薬剤耐性の発生段階におけるmdr1配列の
発現レベルの研究について述べる。実施例８では，遺伝
子の増幅に比例しないmdr遺伝子の発現を実証する。実
施例９では，mdr1遺伝子のセグメントを含むゲノムクロ
ーンの説明を行う。実施例10では，mdr1遺伝子のcDNAク
ローンと，ヒトmdr1遺伝子のcDNA配列について開示す
る。実施例11では，本発明に従うプローブを用いた診断
ならびに治療方法について説明する。
実施例１ ヒトKB細胞の複数薬剤耐性サブラインの誘導ならびに
特性決定については，どこか他のところに記載されてい
る。Akiyama等，Somat.Cell Mol.Genet.,11,117（198
5）,Fojo等，Cancer Res.,45,3002（1985），およびRic
hert等，Proc.Natl. Acad.Sci. (USA)，82,2330（198
5）。複数薬剤耐性表現型は，ほとんどの高耐性ライン
において不安定であり、薬剤が存在しない状態で増殖す
る場合には耐性が低下する。ゲル内DNA再生技法を用い
ることによって〔Roninson,Nucleic Acids Res.，11,541
3（1983）〕,KB細胞のいくつかの複数薬剤耐性サブライ
ンは，増幅されたDNA配列を含むことがわかっており，
また核型分析によって，これらの細胞内に微小な染色体
対があることがわかる。Foji等，Proc.Natl.Acad.Sci.
(USA)，82,7661（1985）。
コルヒチン，ビンブラスチンあるいはアドリアマイシ
ンに対する耐性を有するものとして選択されたヒトKB癌
細胞のサブライン〔Akiyama等，上掲,Fojo等,Cancer Re
s.上掲,Richert等，上掲およびShen等，Science, 232,64
3−645（1986）〕は，複数薬剤耐性表現型を示す。これ
らのサブラインのいくつかを第１表に示す。Fojo等，Pr
oc.Natl.Acad．Sci.USA，82,7661（1985）。第１表にお
いて，『n/d』は測定されていないことを意味する。細
胞系KB−８−５−11,KB−８−５−11−24,KB−C3および
KB−C4は，それぞれアドリアマイシン100ng/ml,1μg/m
l,3μg/mlおよび４μg/mlによって選択されたサブクロ
ーンである。相対的な耐性は，親細胞KB−３−１のD10
に対する耐性細胞系のD10の比としてあらわす。Akiyama
等，上掲。
これらの複数薬剤耐性ヒトKB細胞系を用いて，ハムス
ターのmdr遺伝子に相同なDNA配列がヒトゲノム中に存在
するか調べた。この研究に用いたチャイニーズハムスタ
ーのmdrDNA配列は，ハムスターのmdr遺伝子の５′セグ
メントを含むコスミドクローンcosDR3Aから得た。制限
酵素XbaＩおよびKpnＩによって消化した後，このコスミ
ドの1.5〜６キロ塩基対（kb）のそれぞれの制限フラグ
メントは，ウィスコンシン州マジソンに所在するPromeg
a Biotecが市販しているpSP65プラスミドベクターにサ
ブクローンするか，あるいは32Pによる標識付けの前に
ゲル精製を行った。pDR4.7と名付けた4.7kbのXbaフラグ
メントを含むベクターは，ヒトDNAとハイブリダイスす
るDNA配列を有していた。
第１図に，コスミドクローンcosDR3Aの部分制限エン
ドヌクレアーゼマップを示す。前述のクローンは，複数
薬剤耐性のチャイニーズハムスター細胞内で増幅した転
写mdr領域の５′部位を含む。マップとともに示す点線
は,pDR4.7にハイブリダイズするROS DR3Aの部分を示
す。第１図において,XはXbaＩ部位を表し，且つＫはKpn
Ｉ部位を示す。この領域のクローニングおよび特性決定
については,Gros等，Pros.Natl.Acad.Sci.USA，83,337
（1986）に記載されている。
実施例２ ヒトmdr遺伝子を含むDNAセグメントを同定ならびに単
離するために，ハムスターのクローン化したmdr遺伝子
の1.5〜６キロ塩基対（kb）のそれぞれの大きさのフラ
グメントを,Promega Biotecが市販し且つPromega Biote
c技報No.13およびMelton,Nucleic Acids Res.，12,7055
−7056（1984）に記載されたpSP64プラスミドベクター
中に一連の組換え体サブクローンとして単離した。次
に，個々のサブクローンを32Pで標識し，制限酵素で消
化したヒトDNAを用いるサザンブロットハイブリダイゼ
ーションのプローブとして使用した。
さらにこれらのサブクローンを，ヒトゲノムDNAの制
限消化物を用いるハイブリダイゼーションのプローブと
して用いた。ほとんどのプローブは，低ハイブリダイゼ
ーションストリンジェンシー条件で用いた場合には，ハ
イブリダイゼーションシグナルあるいはヒト反復DNA配
列とのクロスハイブリダイゼーションを示す連続スミア
のいずれも生じなかった。しかし,pDR4.7とな名付けた
第１図に示すサブクローンの１つは，低ストリンジェン
シー条件の下でヒトDNAとハイブリダイズした際に，明
確なバンドを生じた。
サブクローンpDR4.7は，明確なハイブリダイゼーショ
ンシグナルを発生したので，このサブクローンは，ヒト
mdr遺伝子に相同なハムスターDNA配列を含んだ.pDR4.7
は，ヒトDNAの２つの主な互いに相違するEcoRI制限フラ
グメントとハイブリダイズしたが、いくつかの実験にお
いて，さらに９個ものEco RIフラグメントを検出するこ
とができた。
実施例３ mdr遺伝子が，複数薬剤耐性ヒト細胞中で増幅される
か否かを確認するために,Gros−Bellard等，Eur.J.Bioc
he.,36,32（1978）の手順によって親KB−３−１細胞お
よび第１表に示された様々な薬剤耐性サブラインから抽
出したDNAをEcoRIあるいはHindIIIを用いて消化し，ア
ガロースゲル電気泳動にかけ，さらにサザンの手順〔So
uthern,J.Mol.Biol.，98,503,（1975）〕によってpDR4.
7プローブにハイブリダイズした。
複数薬剤耐性KB細胞のEcoRI消化DNAを用いたpDR4.7の
サザンハイブリダイゼーションにおいて,DNAは先に述べ
たように抽出された〔Gros−Bellard等，Eur.J.Bioche
m.，36,32（1978）〕。EcoRI消化DNAの濃度は，ジフェ
ニルアミン反応〔Giles等，Nature，206,93（1965）〕
によって測定し,5μｇのDNAを各レーンにおいた。電気
泳動を行った後,DNAをナイロン（Biodyne）膜に移した
〔Southern,上掲〕。プラスミドpDR4.7はXbaＩで消化
し，挿入物はゲル精製を行い，さらに32Pを用いて，オ
リゴラベリングにより３×109dpm/μｇの比活性に標識
した〔Feinberg等，Analyt.Biochem.，132,６（198
3）〕。ハイブリダイゼーションは、65℃において,5×S
SPE,5×Denhardt′s,0.2％SDS,変性サケ精子DNA500μg/
mlにおいて行った。ハイブリダイゼーションの後，膜
は,4×SSC,0.5％SDSを用いて65℃で洗浄し，オートラジ
オグラフィーを行った。
サブクローンpDR4.7は，フィルターを低ストリンジェ
ンシー条件（４×SSC;65℃）のもとで洗浄する場合に,K
B−３−1DNA中の大きさが13.5kbと4.5kbの２つのEcoRI
フラグメントに，そして大きさが10.5kbと4.4kbの２つ
のHindIIIフラグメントにハイブリダイズする。中間ス
トリンジェンシー条件（１×SSC;65℃）においては,10.
5kbのEcoRIとフラグメントと4.4kbのHindIIIフラグネン
トが検出されただけであった。これらすべてのフラグメ
ントは，コルヒチン耐性サブラインKB−８−５−11,KB
−８−５−11−24,KB−C3およびKB−C4中で増幅され
た。
復帰変異株サブラインKB−C1−R1中では,13.5kbフラ
グメントに対応するバンドあるいは4.4kbフラグメント
に対応するバンドの増幅はいずれも検出されなかった。
コルヒチンによって選択されたサブラインとは異なり，
ビンブラスチン中で選択されたサブラインKB−V1は、1
3.5kbのEcoRIバンドおよび4.4kbのHindIIIバンドの増幅
だけを示す。これらの２つのバンドは，アドリアマイシ
ン耐性細胞KB−A1およびKB−A2においても増幅された。
さらに,KB−A1は，EcoRI消化物中に大きさが7kbの新し
い増幅バンドと，HindIII消化物中に大きさが6.5kbの新
しい増幅バンドを含んだ。同じバンドは,KB−VI DNA中
に存在するが，それらの強度はこれらのバンドが増幅さ
れていないことを示唆した。この大きさのバンドは、親
KB−３−1 DNAにおいては検出されておらず，これらの
バンドが明らかにDNA転位の結果生じたことを示してい
る。
異なるサブラインにおいてハムスターのmdrプローブ
にハイブリダイズする２種類のバンドの異なる増幅パタ
ーンは，これらのバンドが,1つの隣接したハイブリダイ
ジング領域の２つの異なる部分ではなく,1つの多重遺伝
子族の異なるメンバーであると考えられる関連する２つ
の異なるDNA配列に対応する可能性があることを示して
いる。13.5kbのEcoRIフラグメントおよび4.4kbのHindII
Iフラグメントと対応するDNA配列はmdr1と名付け,4.5kb
のEcoRIフラグメントおよび10.5kbのHindIIIフラグメン
トと対応する配列はmdr2と名付けた。
異なる複数薬剤耐性サブライン中におけるmdr配列の
増幅の程度は，異なる細胞のDNAの一連の希釈EcoRI消化
物からのハイブリダイゼーションシグナルの強度を比較
することによって推定した。異なるサブライン中のmdr
配列の推定コピー数を第２表に示す。第２表において
は，＊はmdr2DNA配列の転位を示す。
第１表と第２表とを比較すれば,40〜700倍のコルヒチ
ン耐性があるものとして選択されたサブラインにおい
て，薬剤耐性の増大とmdr配列のコピー数とのあいだ
に，一般的ではあるが明確ではない相関関係があること
がわかる。耐性の程度は，mdr遺伝子増幅の程度より
も，mdrRNAの発現とのほうがより明確に対応するかもし
れない。mdr1およびmdr2配列は，これらの細胞において
は，同様な程度までで増幅されるようにみえる。コルヒ
チン耐性細胞系の復帰変異株内における増幅mdr配列の
喪失は，mdr遺伝子の増幅が高耐性細胞中における複数
薬剤耐性の基礎を成すことの強力な追加証拠である。ビ
ンブラスチンあるいはアドリアマイシンに対する耐性を
有するものとして選択された細胞中のmdr1の増幅程度
は，コルヒチンに対して選択された同じ程度の耐性をも
つ細胞よりも高いように思われる。
実施例４ ヒトmdr遺伝子の性質を調べるために，mdr1およびmdr
2配列を含むクローンをコルヒチン耐性サブラインKB−C
3のDNAから単離した。このために,KB−C3 DNAの完全なE
coRIあるいはHindIII消化物を含有する２つのファージ
ライブラリーを調製した。EcoRIライブラリーは，λgt1
1ファージベクターのEcoRI部位への挿入によって作り，
またHindIIIライブラリーは，シャロン28のHindIII部位
への挿入によって作った〔Young等，Proc.Natl.Acad.Sc
i.(USA)，80,1194（1983）,RImm等，Gene，12,301（198
0）〕。いずれのライブラリーも,Benton等，Science,19
6,180（1977）の手順に従い，チャイニーズハムスターp
DR4.7プローブを用いたプラークハイブリタイセーショ
ンによってスクリーニングを行った。4.4kbのHindIIIフ
ラグメント（mdr1）を含むクローンをHindIIIライブラ
リーから単離し，さらに4.5kbのEcoRIフラグメント（md
r2）を含むクローンをEcoRIライブラリーから単離し
た。続いて両方の挿入物をプラスミドベクターpSP64に
再クローン化し〔Melton等，Nucleic Acids Res.，12,7
035（1984）〕，それぞれpHDR4.4およびpHDR4.5と名付
けたプラスミドクローンを得た。プラスミドクローンpH
DR4.4は,12301 Parklawn Drive,Rockville,Merylandに
所在するAmerican Type Culture Collectionに,1986年
３月21日に寄託物第40227号として寄託された。同様
に，プラスミドクローンpHDR4.5Rは,12301 Parklawn Dr
ive,Rockville,Marylandに所在するAmerican Type Cult
ure Collectionに,1986年３月21日に寄託物第40228号と
して寄託された。これらのクローンの部分制御地図を第
２図に示す。第２図において，対応する制限エンドヌク
レアーゼによる消化の部位は下記のように示す。
『Ａ』，AvaＩ。『Ｂ』，BamHI。『Ｅ』，EcoRI。
『Ｇ』，BglII。『Ｈ』，HindIII。『Ｊ』，HaeII。
『Ｐ』，PstＩ。『Ｖ』，PvuII。および『Ｘ』，Xba
Ｉ。
第２図において，黒色の横棒は，高度反復配列を含む
フラグメントを示す。これらのフラグメントは，クロー
ン化したDNAの制限消化物を含むサザンブロットと,0.35
×105dpm/cm2の32P標識全ヒトゲノムDNAとのハイブリダ
イゼーションによって同定した。点線は，ゲル精製pDR
4.7挿入物とのサザンハイブリダイゼーションによって
決定した,pDR4.7クローンにハイブリダイズするDNA配列
を示す。
pDR4.7ハムスタープローブは，複数薬剤耐性ハムスタ
ー細胞中に発現した転写活性配列を含むことが知られて
いるので〔Gros等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)，上
掲〕，保存されたヒトmdr配列は，転写研究のための便
利なプローブを提供する可能性が大きい。ハムスターpD
R4.7プローブは，複数薬剤耐性ヒト細胞から得たmRNAに
はほとんどハイブリダイズせず，したがってヒト細胞中
のmdr遺伝子を検出するプローブとしては使用すること
はできなかった。その結果、pDR4.7にハイブリダイズし
た双方のクローンの反復なしフラグメントを，プラスミ
ドベクターpSP64にサブクローン化した。ベクターのSma
Ｉ部位に挿入された,pHDR4.4の0.75kbPvuIIフラグメン
トを含むクローンをpMDRIと名付けた。ベクターのPstＩ
部位に挿入された,pHDR4.5の1.0kbPstＩフラグメントを
含むクローンをpMDR2と名付けた。これら２つのクロー
ンは，低ハイブリダイゼーションストリンジェンシー条
件のもとで互いにクロスハイブリダイズすることがわか
った。このことはmdr1とmdr2が関連したDNA配列を表す
ことの追加的な証拠である。
実施例５ KB−V1およびKB−A1の転位バンドが，mdr1あるいはmd
r2と対応するか否かを確定するために，異なるサブライ
ンから得たDNAをHindIIIで消化し，ハムスターのpDR4.7
プローブ，またはヒトのpMDR1あるいはpMDR2プローブの
いずれかとハイブリダイズした。ゲル精製を行ったプラ
スミドpDR4.7の挿入物とのハイブリダイセーションを，
低ストリンジェンシー条件（４×SSC,0.5％ SDS,65
℃）のもとで行った。つぎに，高ストリンジェンシー条
件（0.1×SSC,0.5％ SDS,65℃）のもとで，同じブロッ
トをプラスミドpMDR1およびpMDR2のゲル精製挿入物と再
度ハイブリダイズし，mdr1およびmdr2配列のクロスハブ
リダイゼーションによるシグナルを最小限とした。
この実験によって，サブラインKB−A1およびKB−V1の
双方の転位バンドはmdr2に対応することが実証された。
新しいバンドの移動度は,KB−V1およびKB−A1 DNAのい
くつかの異なる制限消化物中で同じであるように思わ
れ，双方の別個に選択されたサブラインにおいて同様な
転位が起きた可能性があることを示唆した。しかしなが
ら、転位バンドは、KB−A1中では増幅されるが、KB−VI
細胞中では増幅されないように思われる。さらに，双方
のタイプの細胞とも，mdr2の非転位対立遺伝子に対応す
るバンドを含んでおり，これは増幅されない。KB−A1細
胞中の，転位はしたが親細胞ではないmdr2バンドの増幅
は,DNA転位は，これらの細胞中で，遺伝子増幅の開始に
先行するか、または同時に発生したことを示唆してい
る。KB−V1の場合には，mdr2の転位がmdr1の増幅に関係
するかどうかは不明である。
実施例６ mdr1およびmdr2の進化的に保存された領域が転写配列
を含むか否かを判断するために，プローブとしてpMDR1
およびpMDR2を用いて，実施例５に述べる高ハイブリダ
イゼーションストリンジェンシーの条件の下で，親KB−
３−１細胞および複数薬剤耐性KB−C2.5細胞から抽出し
たポリ(A)2RMA〔Akiyama等 上掲,Foji等，Cancer Re
s.,上掲,Richert等，上掲およびShen等，上掲〕とのノ
ーザンハイブリダイゼーションをThomas,Proc.Natl.Aca
d.Sci.(USA)，77,5201−5205（1980）の手順にしたがっ
て実施した。ポリ(A)+RNAは,Chirgwin等，Biochem.，1
8,5294（1979）に記載されたとおりに，薬剤感受性親KB
−３−１細胞，ならびにコルヒチン耐性KB−C2.5サブラ
インから抽出した。各RNA調製物１マイクログラムを,1.
5％グリオキサルアガロールゲル〔McMaster等，Proc,Na
tl.Acad.Sci. (USA)，74,4835（1977）〕中で電気泳動に
かけ，マサチューセッツ州ボストンに所在するNew Engl
and Nuclearから入手可能なGone Screen PlusTM膜に移
した。これらの膜は,3×105dpm/cm2のpMDR1あるいはpMD
R2プローブとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーシ
ョンは,1M NaCl,10％デキストラン硫酸,1％SDS,50％ホ
ルムアミド，および変性サケ精子DNA 100μg/ml中で42
℃で行った。この膜を0.1×SSC,0.5％SDSを用いて65℃
で洗浄し，オートラジオグラフィーにかけた。RNAバン
ドの大きさは,28Sおよび18SリボソームRNAの位置と比較
して測定した。
プローブpMDR1は，薬剤耐性細胞中で高い発現を示す
4.5kbのmRNAバンドにハイブリダイズする。このmRNAは
親細胞KB−３−１中では検出することができず，プロー
ブをニックトランスレーションあるいはオリゴラベリン
グのいずれかによって標識した場合には殆どあるいは全
く発現しないことを示唆している。しかし,pMDR2をプロ
ーブとして用いた場合には，明確なバンドを検出するこ
とができなかった。さらに,pMDR2に加えて，プローブと
してpMDR4.5の別の反復なしサブフラグメントを用いた
が，バンドは表れなかった。これらの結果からは，mdr2
の別の領域に転写活性配列が存在すること，あるいは非
常に低いレベルでのmdr2の転写の可能性は否定すること
は出来ないが，チャイニーズハムスターのmdr遺伝子に
相同なmdr2の増幅領域の転写は，ノーザンハイブリダイ
ゼーションによっては検出されない。
複数薬剤耐久ヒトKB癌細胞中におけるチャイニーズハ
ムスターmdr遺伝子に相同なDNA配列の増幅および過剰発
現は，ヒト細胞および齧歯類細胞のいずれにおいても，
同様な機構が複数薬剤耐性の原因となる可能性があるこ
とを示している。mdr遺伝子によってコードされるタン
パク質の性質はまだわかっていない。mdr1mRNAの大きさ
は，それが種々の複数薬剤耐性細胞系で過剰発現する17
0kdの糖タンパク質をコードしている可能性と矛盾しな
い〔Biedler等，上掲,Ling等，上掲,Ramu等，上掲,Beck
等，上掲,Kartner等，Scinece, 221,1285（1983）,Deben
ham等，Mol.Cell.Biol.，2,881（1982）,Robertson等，
Mol,Cell.Biol.，4,500（1984）〕。さらに，試験管内
において，および化学療法過程において，ヒト腫瘍細胞
による複数薬剤耐性の発生に同じ機構が用いられるか否
かは不明である。ヒト細胞中にmdrDNAの転写を検出でき
るクローン化プローブが得られるようになったので，い
までは複数薬剤耐性腫瘍の臨床試料中でのこれらの配列
の発現を調べることが可能となった。
実施例７ 複数薬剤耐性が生じる際のmdr1配列の発現レベルを調
べるために，ヒトKB癌細胞の複数薬剤耐性サブライン，
および由来の異なる別の２つのヒト複数薬剤耐性細胞系
を調べた。
幾つもの段階を経て異なるサブラインを選択するのに
用いた薬剤は，コヒルチン，アドリアマイシンならびに
ビンブラスチンであった。コルヒチンによる選択の最初
の２段階において，エチルメタンスルホン酸（EMS）を
用いて最初に細胞集団に突然変異を誘起した場合に限っ
てクローンが得られた。同様に，アドリアマイシンある
いはピンブラスチンに対する耐性があるものとして別々
に選択したKB細胞系〔Akiyama等，上掲,Fojo等，Cancer
Res.,上掲,Richert等，上掲，およびShen等，上掲〕
は，最初の段階でEMSを用いた突然変異誘起を行った場
合に限って得られた。その後の選択は，非常に高い耐久
レベルに至るまで，突出変異誘起を行わずとも行うこと
ができ、また高頻度で起きた。
ヒト複数薬剤耐性KB癌細胞系の単離およびその幾つか
の性質については，これまでにAkiyama等，上掲,Fojo
等，Cancer Res.,上掲，およびRichert等，上掲に記載
されている。この研究に用いたKB細胞系，それらの選択
方法，ならびに様々な薬剤に対するそれら細胞系の相対
的耐性を第３表に示す。CEMは,Beckの酵素調節における
進歩，22,G.Weber編纂（Porgamon Press,Oxford, 198
4）,207に記載された細胞系であり、また2780は,Rogan
等，Science, 224,994（1984）に記載された細胞系であ
る。
mdr1配列がこれらの細胞系で発現する程度，ならびに
対応するRNAの大きさを決定するために，これらの細胞
から採取した全RNAおよびポリ(A)+−RNAを用いて，ノー
ザンハイブリダイゼーションを行った。28SリボソームR
NA標識のすぐ下を移動する4.5キロ塩基対RNAは、耐性系
から採取した全RNAあるいはポリ(A)+RNAを含むレーンの
全てにおいて見ることができたが，感受性細胞系のいず
れにも見られなかった。
全RMAのスロットブロットハイブリダイゼーションを
用いて，種々の感受性および耐性細胞系におけるmdr1の
発現を定量した。上記のとおりに調製したRNAを,Schlei
cherとSchuellのスロットブロッド装置を用いてフィル
ターに添加した。あるいは13.4％ホルムアルデヒドを含
む１％アガロース中で電気泳動にかけた後に，ブロッテ
ィングによっておこなった。pMDR1クローンから採取し
たゲル精製挿入物をプローブとして使用するために32P
で標識した。ニトロセルロースフィルターは，ベーク
し、50％ホルムアミド,5×SSC,10X Denhardt溶液,0.1％
SDSおよびサケ精子DNA100μg/ml中で,42℃で４〜６時間
にわたってプレインキュベートした。フィルターは，32
P標識プローブを含む上記の溶液中で一晩ハイブリダイ
ズした。フィルターは，室温において,2×SSC,0.1％SDS
中で10分間のあいだ３回洗浄し，さらに50℃において,
0.1×SSC,0.1％SDS中で20分間のあいだ３回洗浄した。m
dr1発現のレベルは，オートラジオグラムの濃度を計測
して求めた。ピークのトレーシングを切出し，計量し，
さらに任意に値１と定めたKB−８ピークと比較した。こ
の結果は，研究に用いたヒト白血病リンパ芽球細胞系，
およびヒト卵巣癌細胞系の相対的な薬剤耐性とともに第
３表に示す。第３表において,NDは『検出されず』の省
略である。
第３表に示すように，複数薬剤耐性の程度とmdr1特異
mRNAのレベルのあいだには良い相関があった。さらに第
３表に見られるように，薬剤感受性親細胞系にはmdr1配
列の発現は殆どあるいは全く見られないが，細胞系が薬
剤に対する耐性を強めると発現が増大する。コルヒチン
耐性細胞系KB−C1からコルヒチンが存在しない状態のも
とでサブクローン化した復帰変異株細胞系KB−C1−R1
は，その低レベルの複数薬剤耐性と矛盾しない低レベル
でなおmdr1配列を発現する。
親RNAからのハイブリダイゼーションシグナルが弱す
ぎるので，親細胞系と比較した耐性細胞系での発現増加
の正確な程度は計算することができない。しかし、KB−
８細胞系に対する発現程度は計算したので，これらのデ
ータを第３表に示す。発現は,KB細胞における全ての選
択段階について，増大する薬剤耐性と十分に相関するよ
うに思われ，我々が有する最も耐性の高いKB細胞系では
非常に高い発現レベルに達する。
第３表に要約したデータは，複数薬剤耐性を有するも
のとして選択された由来の異なる２つのその他のヒト細
胞系も高レベルの4.5kb mRNAを発現することを示してい
る。このRNAは，親細胞系では殆どあるいは全く検出さ
れなかった。ビンブラスチンに対する耐性を有するのと
して選択したヒト白血病リンパ芽球細胞系CEM（A.T.C.
C.CCL119）およびその耐性誘導体CEM−VLB100（St.Jud
e′s HospitalのW.Beckの寄贈物）（Beck,上掲），なら
びにアドリアマイシンに対する耐性を有するものとして
選択した卵巣細胞系2780およびその耐性誘導体2780−Ad
（National Institute of HealthのT.HamiltonおよびR.
Ozolsの寄贈物）（Rogan等、上掲）は，いずれも高レベ
ルの4.5kb mRNA発現を示した。低レベルの細胞複数薬剤
耐性でさえも腫瘍が臨床的に治療不応となる可能性があ
ることから，低レベル（２〜６倍）の相対的薬剤耐性を
有するサブラインでは起きるが，親薬剤感受性細胞系で
は起きないmdr1 mRNAの発現は特に興味深いものであ
る。これに関して，第３表に示す結果から，mdr1 mRNA
発現の定量な，臨床的な腫瘍検体の複数薬剤耐性の診断
に用いることが出来る可能性があることがわかる。
実施例８ mdr1 mRNAの発現レベルをゲノムmdr1配列の増幅の程
度と比較するために，ゲノムDNAを実施例６に述べた全
ての細胞系から単離した。HindIIIによる消化の後に，m
dr1の増幅をサザンブロット分析によって調べた。
上記の実施例３に述べた仕方で調製したDNAを，HindI
IIで消化し，次に，Gene ScreenPlisTM（New England N
uclear）へサザン法によって移す前に0.8％アガロース
ゲル中で電気泳動にかけた。これらのブロットを,50％
ホルムアミド,5×SSC,1％SDSにさらにサケ精子DNA100μ
g/mlを含むものの中で,42℃で18時間にわたってpMDR1プ
ローブとハイブリダイズした。次に，ブロットは，オー
トラジオグラフィーを行う前に,2×SSCを用いて室温で1
0分間,2×SSC,1％SDSを用いて42℃で60分間，さらに0.1
×SSCを用いて室温で60分間のあいだ洗浄した。
耐性が低レベルのKB細胞系（KB−8,KB−８−５および
耐性サブラインKB−C1−R1）においては，mdr1 mRNAの
発現レベルは上昇したが，mdr1の増幅は見られなかっ
た。したがって，ヒト細胞におけるmdr1配列の高い発現
は，遺伝子増幅の前に起こると考えられる。mdr1遺伝子
の増幅は，コルヒチン，ビンブラスチンあるいはアドリ
アマイシン中で選択されたKB細胞の高耐性サブライン，
ならびにCEM-VLB100および2780−Ad細胞系に検出され
た。後の２つのサブラインにおいては，遺伝子増幅の程
度は，濃度測定によって2780−Adについては約５〜10
倍，またはCEM-VLB100については10〜15倍と推定され
た。
すべての場合において,mRNA発現の増大は，増幅の程
度を明らかに上回るものであった。これらの結果は，こ
れら細胞系の進化には発現が遺伝子増幅に比例しないで
増大する１つの段階あるいは複数の段階が含まれること
を示唆している。dhfr遺伝子の増幅と発現の同様な解離
が，試験管内でのメトトレキセートに対する耐性をもつ
ものとして選択されたヒト癌細胞に関して報告されてい
る。〔Frei等，Prog.Natl.Acad.Sci.(USA)，81,2873（1
984）,Wolman等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，80,807
（1983）〕。ヒトKB細胞中の複数薬剤耐性の発生は，こ
の点においてチャイニーズハムスターのV79細胞とは異
なっている。前述のチャイニーズハムスター細胞におい
ては，低い（５〜７倍）相対的薬剤耐性に，mdr DNAの
５〜10倍の増幅がともなう〔Roninson等、上掲，および
Gros等，上掲〕。
これらの研究は，異なる細胞障害薬剤に対する耐性を
持つものとして選択した由来の異なる５つの別々に誘導
したヒト細胞系におけるmdr1遺伝子の発現と複数の薬剤
に対する耐性の発生との相関関係を実証するものであ
る。したがってmdr1の発現は，ヒト細胞系における複数
薬剤耐性の共通の機構を表す可能性がある。少なくとも
いくつかのケースにおいて，mdr1の発現の増加が遺伝子
増幅を伴わずに最初に起こるが，複数薬剤耐性の発生の
必要条件であるかもしれない。このような見解は，化学
療法過程でのヒト腫瘍による複数薬剤耐性の発生におい
てmdr1遺伝子が果たす役割の分析に特に関連があると考
えられ，また診断に使用出来る可能性もある。腫瘍細胞
は比較的に低い耐性を有すると予測されるために，この
ような分析では，腫瘍試料中での遺伝子増幅よりもむし
ろmdr1 RNA発現の定量を行うことになることが考えられ
る。
実施例９ 化学的分解手順〔Maxam等，Meth．Enzymol.，65,499,
（1980）〕，酵素チェーンターミネーション塩基配列決
定法〔Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74,5463,
（1977）〕および鋳型として超らせんプラスミドDNA〔Z
agursky等，Gene Anal. Techn.,2,89,（1985）〕を用い
て,pMDR1にクローン化したmdr1遺伝子のセグメントの塩
基配列を決定した。塩基配列決定を容易にするために,p
MDR1はHae IIIおよびRsa Iでマップし,pMDR1の220〜400
bpの個々のフラグメントをpUC18プラスミドベクター（M
aryland州,Rockvilleに所在するBethesda Research Lab
oratories）にサブクローンした。pMDR1の配列は，双方
の鎖の塩基配列を決定することによって確認した。pMDR
1の完全な配列を第４表に示す。下記の実施例10の対応
するcDNAクローンの配列と比較したところ,pMDR1は，ヌ
クレオチド１−111および653−807を含む２つのタンパ
ク質コード化配列（エキソン）セグメント，ならびにmR
NAとしては発現せず且つヌクレオチド112−652を含む介
在配列（イントロン）セグメントを含むことが判明し
た。第４表は,pMDR1内のエキソンに対応するアミノ酸配
列を示す。したがってこのアミノ酸配列がmdr1タンパク
質生成物のセグメントを決定する。
実施例10 mdr1遺伝子のcDNAクローンを単離するために,Chirgwi
n等，Biochemistry，18,5294（1979）ならびにAviv等，
Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)．69,1408（1972）に記載さ
れた仕方で，コルヒチンを用いて選択したサブラインKB
−C2.5からポリ(A)+RNAを単離した。cDNAライブラリー
は，二重鎖cDNAの合成，ブラントエンディング，EcoRI
リンカーの結合，ならびにファージベクターλgt11への
挿入の各過程を用いて作製した〔YoungおよびDavis,上
掲,Huynh等,DNAクローニング技法，実際的なアプロー
チ,D.Glover編纂,IRL Press,Oxford,（1985）〕。cDNA
ライブラリーは，プローブpMDR1を用いたプラークハイ
ブリダイゼーション（Benton等，上掲）によってスクリ
ーニングした。約120個の陽性クローンが単離された。
これらのクローンのうちの５個（λHDR5,λHDR10,λHDR
28,λHDR62およびλHDR69）からの挿入物を，プラスミ
ドベクターpGEM1およびpGEM4（Promega Biotec.）に再
クローン化した。これらのクローンの部分制限マップを
第３図に示す。λHDR5のDNAをEcoRIで処理したところ,2
つのフラグメントが得られたので,5Aおよび5Bと名付け
た。これらのフラグメントをpMDR1のEcoRI部位にサブク
ローンした結果，プラスミドpHDR5AとpHDR5Bが得られ，
これらのプラスミドは,12301 Parklawn Drive,Rockvill
e,Marylandに所在するAmerican Type Culture Collecti
onに1986年３月18日に寄託され，それぞれ受入番号ATCC
67040およびATCC 67041を受けた。同様に，λHDR10をE
coRIで処理し,pGEM1のEcoRI部位にクローンして，プラ
スミドpHDR10を得た。このプラスミドは、12301 Parkla
wn Drive,Rockville,Marylandに所在するAmerican Type
Culture Collectionに1986年３月18日，寄託番号67042
として寄託された。
mdr1 cDNAの残りの部分を単離するために，第３図に
縞模様棒線で示したクローンλHDR5のフラグメントを用
いて，同じcDNAライブラリーをスクリーニングした。陽
性クローンのうちのλHDR103,λHDR104およびλHDR105
と名付けた３つから得た挿入物を，プラスミドベクター
pGEM1およびpGEM4のEcoRI部位に再クローンしたとこ
ろ，それぞれpHDR103,pHDR104およびpHDR105と名付けた
プラスミドが得られた。プラスミドpHDR104は,12301 Pa
rklawn Drive,Rockville,Marylandに所在するAmerican
Type Culture Collectionに1986年７月16日，寄託番号6
7156として寄託された。
個々のクローンの制限マップを比較したところ，例え
ばクローンλHDR10,λHDR28およびλHDR69にcDNA構造の
相違が見られる。これらのクローンの中で保存性の最も
高い領域は,270 bp Pvullフラグメントに代表されるの
であり，これはpMDR1にエキソン領域に対応するもので
あり，第３図においては，線の上側の実棒線で示す。ク
ローンλHDR62およびλHDR105に特異的な変異体配列はD
NA塩基配列決定によって検出され，これらは第３図の対
応する線の下側に実棒線で示す。第３図において，対応
する制限エンドヌクレアーゼによって消化される部位は
下記のように示す。『Ａ』,AccI。『Ｅ』,Eco RI。
『Ｈ』,HindIII。『Ｎ』,XmnI。『Ｐ』,PvuII。『Ｓ』,
StuI。『Ｔ』,SstI。『Ｖ』,AvaI。および『Ｘ』,Xba
l。
cDNAクローン，λHDR10,λHDR5およびλHDR104は，挿
入物をM13ファージベクターにサブクローニングし〔Mes
sing,Meth. Enyzmol.,101,20,1983〕，一連の重複欠失サ
ブクローンを産生し〔Henikoff,Gene，28,351,1984〕，
さらに酵素チェーンターミネーション塩基配列決定法に
よってそれらのDNA配列を決定する〔Sanger等，上掲〕
方法を用いて，それらすべての塩基配列決定を行った。
cDNA配列の一部は，鋳型として超らせんプラスミドDNA
を使用する〔Zagursky等，上掲〕特異的プライマー誘導
DNA配列決定によって確定した〔Strauss等，Anal.Bioch
em.，154,353 1986〕。クローンλHDR10,λHDR5および
λHDR104の重複領域は同一であることがわかった。した
がってこれらのクローンは，同じcDNAの異なる部分を表
すものと想定される。クローンλHDR10,λHDR5およびλ
HDR104の結合したcDNA配列を第５表に示す。さらにこの
表は，同じcDNA配列から得られたmdr1遺伝子生成物のア
ミノ酸配列を示す。
第５表に示したアミノ酸配列を分析すると，mdr1遺伝
子生成物は貫膜タンパク質である可能性が大きいことが
わかる。このタンパク質は，互いにかなりの配列相同性
をもつ２つのほぼ同じ大きさの部分から成るものと考え
られ，mdr1遺伝子が内部重複の結果進化した可能性が大
きいことを示唆するものである。タンパク質の各半分
は，疎水性部分と親水性部分から成る。各々の疎水性部
分は,Eisenberg等〔J.Mol. Biol.,179,125−142（198
4）〕のアルゴリズムによって確認したところ,6つの貫
膜ドメインを含む。双方の親水性部分は，いくつかの周
知の酵素のATP結合部位と高レベルのアミノ酸相同性を
有する２つの領域を含む。最も高い相同性は，細菌ペリ
プラズム結合タンパク質依存性輸送システムの周辺膜成
分のATP結合部位とのあいだに見られた〔Higgins等，EM
BO J.,4,1033−1040（1984）〕。タンパク質配列中に貫
膜ドメインが存在し，且つグリコシル化反応部位が存在
すると考えられることは、上述したように，mdr1タンパ
ク質がＰ−糖タンパク質と関係があることと矛盾しな
い。
Eisenberg等，上掲のアリゴリズムによる第５表に示
すDNAおよびタンパク質配列情報の分析は，細胞膜の外
側に位置するタンパク質領域を予測するのに用いること
ができる。これらのタンパク質領域は，化学合成あるい
は適切なベクターシステムにおける発現によって産生す
ることが可能であり、また実施例11に述べるように，md
r1遺伝子生成物を発現する細胞に対する抗体を産生する
のに用いることができる。
実施例11 本発明による組換えプラスミドpMDR1およびpMDR2なら
びに組換えプラスミドpHDR4.4およびpHDR4.5の異なる個
々のフラグメントあるいは後者のプラスミドの全体ある
いはcDNAクローンλHDR5,λHDR10,λHDR62,λHDR28およ
びλHDR69あるいはその他の配列を診断ツールとして使
用し，化学療法剤に対する耐性があるヒト腫瘍細胞の検
出を行うことができる。これらのプラスミドは，例えは
Rigby等，Mol.Biol.，113,237−251（1977）あるいはFe
inberg等，Anal.Biochem.，132,６−13（1983年）の手
順にしたがって放射性同位体を用いて直接標識すること
ができる。あるいは，これらのプラスミドは，例えばLe
ary等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 80,4045−4049（198
3）の手順にしたがって非放射性化学タグを用いて標識
することができる。さらに、これらのプラスミドは，標
識したRNAプローブの合成のために用いることができる
〔例えば,Melton等，Nucleic Acids Res.，12,7035−70
55（1984）の手順による〕。その後，標識したプローブ
を用いて，ノーザンハイブリダイゼーション法〔Thoma
s,Proc.Natl,Acad. Sci (USA)．77,5201−5205（1980）に
よる〕，あるいはドットブロットまたはスロットブロッ
トハイブリダイゼーション〔Kafatos等，Nucleic Acids
Res. 7,1541−1552（1979）およびBrown等，Mol.Cell.B
iol.，3,1097−1107（1983）による〕，あるいはin sit
uハイブリダイゼーション〔例えば,Brahic等，Proc.Nat
l.Acad.Sci.(USA)，75,6125−6129（1978）の手法に従
う〕のいずれかにより，腫瘍細胞中の相同RNA配列の存
在を検出するのに用いるこことがでる。in situハイブ
リダイゼーションは，生検試料中の少数（1000個あたり
１個あるいはもっと少ないもの）の複数薬剤耐性細胞を
検出する特に感受性の高い手法をもたらすものと予測さ
れる。
mdrクローンは,2つの方策のいずれかを用いて，mdr遺
伝子生成物に対する多クローン性抗体あるいは単クロー
ン性抗体〔Yelton等，Ann.Rev.Biochem.，50,657−680
（1981）〕を得るのに用いることができる。
第１の方策では，実施例10に述べたようなmdr遺伝子
のcDNA配列の決定が関与する。cDNA配列は，対応するタ
ンパク質配列を演繹するのに用いることができる。mdr
タンパク質の異なる部分に対応し，且つ望ましくは少な
くとも15〜20個のアモノ酸残基を含むペプチドを，固相
法によって化学合成することができる〔Marglin等，An
n.Rev.Biochem.，39,841−866（1970）。その上で，前
述のペプチドを用いて，特異的な多クローン性抗体およ
び単クローン性抗体を誘導することができる〔Lerner,N
ature，299,592−596（1982）,Niman等、Proc.Natl.Aca
d.Sci(USA)，80,4949−4953（1983）〕。第５表に示す
ように，mdr1cDNA配列の全長が利用できるので，潜在的
細胞質膜外領域（extracytopl asmic domains）をも含
むmdrlタンパク質の異なる領域に対応する潜在的免疫原
性ペプチドの設計が非常に容易になる。
第２の方策は，プラスミド，ファージあるいはウイル
ス発現ベクターを用いて，細菌，酵母あるいは哺乳動物
の発現システム中で完全なあるいは部分的なmdr遺伝子
生成物を発現することに関与する〔Vieira等，Gene，1
9,259−268（1982）,Young等，Proc.Natl.Acad.Sci.(US
A)，80,1194−1198（1983）,Bitter等，Gene，32,263−
274（1984）,Cepko等，Cell，37,1053−62（1984），お
よびGorman等，Mol.Cell.Biol. 2,1044−1051（198
2）〕。発現したタンパク質は精製して，ワクチンに使
用したり，また特異抗体の産生に用いることもできる。
mdr遺伝子生成物に対する抗体は，薬剤耐性細胞を検出
するための別の診断ツールとして用いることができる。
最後に，このような抗体は新しい癌免疫療法の基礎とし
て用いることが出来る可能性がある。この方策では，例
えば，特に複数薬剤耐性腫瘍細胞を取り除くために，抗
mdr抗体と放射性同位体あるいは化学的毒物との結合を
行う。このアプローチは，化学療法と組み合わせて用い
る場合には特に有効であろう。あるいは，抗mdr抗体
と，mdr遺伝子生成物を発現する細胞との結合は，たと
え抗体媒介細胞毒性が存在しない場合でも，十分に複数
薬剤耐性表現型を変えることが可能であり，したがって
化学療法剤の細胞致死性に対する感受性の腫瘍細胞に持
たせることができる。
さらに、完全なまたま部分的なmdr遺伝子生成物をワ
クチンとして用いることによって患者に複数薬剤耐性腫
瘍細胞に対する免疫反応を誘起することができる。
本発明をその望ましい実施態様について説明したが、
本発明を考察すれば，当業者には変更ならびに変更態様
が容易であろうと考えられる。したがって，全てのその
ような均等の変更ならびに変更態様は，請求する本発明
の範囲に入るものとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パスタン，アイラ エイチ. アメリカ合衆国 20854 メリーランド ポトマツク ビール マウンテン ロ ード 11710 (72)発明者 ゴテスマン，マイケル エム. アメリカ合衆国 20817 メリーランド ベセスダ メイデン レイン 6400

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）第４表に記載のヌクレオチドの連続配
    列またはそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド、 ｂ）第５表に記載のヌクレオチドの連続配列またはその
    RNA等価物を含むポリヌクレオチド、 ｃ）pHDR4.4（ATCC 40227）に存在するDNA挿入断片また
    はそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド、 ｄ）pHDR5A（ATCC 67040）に存在するDNA挿入断片また
    はそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド、 ｅ）pHDR5B（ATCC 67041）に存在するDNA挿入断片また
    はそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド、 ｆ）pHDR10（ATCC 67042）に存在するDNA挿入断片また
    はそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド、および ｇ）pHDR104（ATCC 67156）に存在するDNA挿入断片また
    はそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド から成るグループから選択された、ヒト細胞内における
    複数薬剤耐性に関連するヒトmdr1遺伝子の単離された核
    酸、またはその相補体。
  2. 【請求項２】核酸プローブであって、該プローブに会合
    した標識を有し、 ａ）第４表に記載のヌクレオチドの連続配列またはその
    RNA等価物を含むポリヌクレオチド、 ｂ）第５表に記載のヌクレオチドの連続配列またはその
    RNA等価物を含むポリヌクレオチド、 ｃ）pHDR4.4（ATCC 40227）に存在するDNA挿入断片また
    はそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド、 ｄ）pHDR5A（ATCC 67040）に存在するDNA挿入断片また
    はそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド、 ｅ）pHDR5B（ATCC 67041）に存在するDNA挿入断片また
    はそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド、 ｆ）pHDR10（ATCC 67042）に存在するDNA挿入断片また
    はそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド、および ｇ）pHDR104（ATCC 67156）に存在するDNA挿入断片また
    はそのRNA等価物を含むポリヌクレオチド から成るグループから選択された、ヒト細胞内における
    複数薬剤耐性に関連するヒトmdr1遺伝子の単離された核
    酸、またはその相補体から作製された前記核酸プロー
    ブ。
  3. 【請求項３】第４表の１〜111または653〜807の配列を
    含むヌクレオチド配列を有する単離された核酸。
  4. 【請求項４】第５表の425〜4267の配列を含むヌクレオ
    チド配列を有する単離された核酸。
  5. 【請求項５】核酸プローブであって、該プローブに会合
    した標識を有し、第４表のヌクレオチド１〜111または6
    53〜807を含む単離された核酸から作製された前記核酸
    プローブ。
  6. 【請求項６】核酸プローブであって、該プローブに会合
    した標識を有し、第５表のヌクレオチド425〜4267を含
    む単離された核酸から作製された前記核酸プローブ。
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