JPS61500469A - 化学反応を触媒する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は１９８３年１１月２９８に出願された米国＃奸出Ｗ１第５５６．０１６ 号の一部継続出願であり、よってその出願の内容は参照のために本出願に組み入 れられる。

本発明は化学反応を触媒する（　ｃａｔａｌｙｚｅ　）ためのモノクローナル抗 体の使用に関する。モノクローナル抗体はハイプリドーマ組胞が産生ずる免役グ ロブリベある。モノクローナル抗体は単一の抗原決定基と反応し、従来の血清由 来抗体く比べてよりそのような抗体の調製を容易に惺準化しうる。

モノクローナル抗体を産生する方法は当業者に周知である。例えばコブロタスキ ー。エッチ、　（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　＊　Ｈ）ら、　１９８０年４月１日付発 行の米国特許第４，１９６，２６５号中襠与。

モノクローナル抗体による抗原識別は免役グロブリン（Ｉｇ）分子のＮ−末端域 における特異結合部位に帰凶する。Ｉｇ分子は、全てのタンノ９クータンパク相 互作用に特有な同型の近距離力を介して抗原と反応すると考えられている。抗原 −抗体相互ゆ 作用は、対応する抗原決定基即ちエピトープと抗体結合部位とが相補的な三次元 形状を示すために極めて特異的でろる。

前記相補的−形状により、分子が互いに近接して近づき実質的よりはるかに大き い。

モノクローナル抗体の用途は知られている。その１つが診断法に使用することで ある、例えはデーピッド、ジー、　（ＤａｖｉｃＬａ、　）およびグリーン、エ ッチ、　（Ｇｒｅｅｎｅ、　ｋ３．　）　、１９８３年３月８日付発行米国な許 第４．３７６．１１０号≠日秤、モノクローナル抗体は、免疫吸着クロマトグラ フィーによって物質を回収するためにも用いられてきた。例えばばルシュタイ７ ．　’ｙ　＋、（ｌｖｌｉｌｓｔｅｉｎ＋　Ｃ，）、　１９８０．サイエンディ フィック・アメリカン（５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　）　２４３ 　＃　６Ｌ　７０゜しかしながら、モノクローナル抗体が化学反応を触媒するた メニ使用されうることは示唆されていない。事実、触媒作用（ｃａｔａｌｙｓｉ ｓ　）の分野における開発は免疫学の分野とは別個に行なわれてきた。抗体と触 媒として使用した試みの唯一の報告例については本出願人らも熟知しているが、 その試みでは所望の反応の連破を大きくさせることはできなかった、ジー、ビー 。

ロイヤー（Ｇ、　Ｐ、　Ｒｏｙｅｒ　）　、　１９８０．７ドパンシス　イン　 ヵタリシス（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　）　２９　；　１ ９７−２２７゜化学反応のなかで、反応体は異なる状態を逼る一連の遷移を介す るこれら通移は結合長さ、角度などの変化をもたらす。反応体から生成物への遷 移は生成物を缶底すべく分解する中間体の形成を含むものとして考えられうる。

反応全体の速度を、反応体、中間体および生成物の間の平衡を４！似づける平衡 定数で表わすことができる。

触媒作用は、反応体の状態１ｃＢしては中間体の安定化としてみなされうる。触 Ｗ、は反応速度を増加させる物質であり１反応の最後には実質的に化学的１７Ｒ 化をうけないまま回収される、触媒は消費されない妙ζ触媒が反応に関与するこ とは一般に認められている。

触媒作用が産業上Ｘ要であるにもかかわらす、簡単な化学的触媒作用や酵素的触 媒作用には多くの制限がある。化学的に触媒させた方法ではしばしば所望の生成 物を高収率で製造しえない。前記方法では副反応から不純物が生じることもよく あり売。

また、多くの重要な化学反応に対する化学的触媒は知られていなり０他の制限と しては、比較的高い触媒コスト、化学的活性化の必要性、大気条件中あるいは少 量の水の存在下での有用性欠如、および大気中の酸素の存在下での可燃性や爆発 性が含まれる。酵素的触媒作用は、特定の反応を行うために必要な適度の特異性 と触媒機能を有する天然に存在する酵素の存在と発見に依存する。多くの化学反 応に対する酵素は知られていない。

本発明は、触媒作用に対する新規なアプローチを提供することによってこれらの 制限を解決する。本発明は、触媒の分野では今まで得ることのできなかった作用 効率と特異性とをある程度有する便利で容易に入手可能で安価な触媒としてのモ ノクローナル抗体の調製および使用方法を提供する。

発明の要約 本発明は、少なくとも１種の反応体から少なくとも１種の生クローナル抗体を含 む方法に関する。

応体を適当なモノクローナル抗体と接触させる。１種以上の複合体化された反応 体を生成物へ変換し、生成物を複合体から週なさせる、 一具体例では、本発明はオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、加水分解 酵素、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガせるのに有用である。他の具体例では 、本発明は、触媒酵素が知られていない化学反応の反応速度を増加させるために 有用である。そのような反応の中には、特に酸化、還元、付加、ｋＭ合。

脱離、置換、開裂および転徨が含まれる。

不発明によれば、化学反応の速度を１００倍以上に、好プしくは１万倍以上に増 加させることができる。

抗体−反応体複合体の形成に適した状態は、約６．０〜約８．０、好ましくは約 ６．０〜約７．５のｐＨ１ｃ維持されかつ約４Ｃ〜約５０Ｃ１好ましくは約２０ Ｃ〜約４５Ｃの温度に維持されたプロト応系により与えられる、イオン強度μ＝ ＋Σｅｉｚ”１（式中、Ｃは一度であり、２はイオン性溶質の電荷である）。そ れは、１リツトルあたり２０モル以下、好ましくは１リツトルあたり約０１〜１ ．５モルの値に維持されなけｎはならない。本発明方法は減圧あるいは加圧下で 実施されうるが、好ましくは大気圧下で実施する。

特徴づけられる。前記Ｋ　＝　ｋｒ　／　ｋｐ　（式中、　ｋｒは反応体に対す るモノクローナル抗体の親和性（アフィニティー）定数であり、ｋｐは生成物に 対するモノクローナル抗体の親和性定数である）。モノクローナル抗体は更Ｋ　 ｒｌ　＞　ｒＱ　（式中、ｒｌは抗体と反応体との台金体形成速度であり、ｒｏ はモノクローナル抗体の非存在下での化学反応速度である）、ｒ２〉！ｂ（式中 、ｒ、は複合体化された反応体から複合体化された生成物への変換速度である） およびｒ３）ｒ（１（式中、ｒ３は複合体からの生成物の遊離速度である）によ って特徴づけられる。

適当なモノクローナル抗体を産生ずる方法も開示されている。

−具体例では、当業者に周知の方法を変更してつくったハイブリドーマ細胞を仕 切４）点て１男ＩＩりで、適当なモノクローナル抗別の具体例では、抗−イディ オタイプモノクローナル抗体を公知の酵素−基質系に対してつくる。抗−イディ オタイプモノクローナル抗体は、基質を生成なへ変換する速度を増加させるため に使用可能であり、アロステリック制御をうけない。

発明の詳細な説明 上述した様に、本発明は少なくとも１つの反応体から少な行）中にコブロウスキ ー（Ｋｏｐｒｏｖｓｋｉ　）等によって開示されている技術を改良したものによ って調製される。これについての詳細は通常の知識を有する当業者には公知のも のである。本発明の１具体例に於いて、適当な条件下で反応体に対する一連のモ ノクローナル抗体が調製されろ。これくは、まず最初にＢＡＬＢ／Ｃマウスを適 当な抗原で免疫感作することを含む。抗原は、所望の反応体かあるいはペプチド 又は他のキャリア分子に結合した所望の反応体か、あるいは反応中間体Ｄ・又は 反応体、生成物もしくは反応中間体の類似物であり得る。本明細書中で使用され る類似物（アナログ石という用語は、その類似物に対して生産された抗体がその 類似物の反応を必ずしも駒株しないが反応体と免疫学的反応を引き起し得るよう に、化学構造の点に於いてその反応体に充分似ている異性体、同族体及び他の化 合物を包含する０例えば、触媒されるべき反応が。−二トロフェニルーβ−Ｄ− ガラクトシドの開裂である場合は、抗原は例えばアオガイヘモシアニン（ｋｅｙ ｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｐｍｏｃｙａｎｉｎ　＠ＫＬＨ）のよ５なキャリア に結合した類似物ジニ）ｏフェノ−々であり得、又抗原はその反応体すなわち０ −ニトロンエニルーも５１つの例として、触媒されるべき反応がアミルブリ／酸 ２分子からボルホビリノーゲンを生ずる縮合である場合、αχＦ　αχＦ 抗原は類似物である３−グリシル−４−ヒドロキシ−４−メチル−１，５−へパ タンニ酸であり得る。

その後免疫感作？されたマウスの肺臓から抗体産生リンパ球を取り出し、５Ｐ２ １０細胞のようなミエローマ細胞と融合させて融合ａ胞（ｈ’ｙｂｒｉｄｏｍａ 　ｃａｌｌｓ　）を作成する。

これらの融合細＠をその後マイクロタイタープレートのウェル上に播（、この融 合細胞によって産生される一連のモノクローナル抗体に対して適度な条件下でス フニーリングを行ない、適度な条件下で所望の反応を触媒するモノクローナル抗 体を同定する。スクリーニングは、反応体の標準溶液をマイクロタイターのウェ ルから採取した一定量の培氾〆で処理し、従来の機器手段によって所望の生成物 の存在庫を測定することによって便利に行ない得る。この測定は、例えば分光光 度計法、ガス液体クロマトグラフィ又は高圧液体クロマトグラフィによって容易 に行ない得る。所望の生成物又は反応体の標進化試料との比較によって、反応速 度が定量化され得る。この方法によって、触媒作用をもつモノクローナル抗体を 産生ずる融合ａ胞を含んでいるウェルな同定する。次いで、こうして選択された 融合細胞がコロニーを形成するまで培譬する。

これらのコロニーはインビトロ（江ｖｉｔｒｃ）又はインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ 　）のシステムで更に増殖させることもできる、後者の場合は、選択された融合 細＠を同系ＢＡＬＢ／Ｃマウスのようなマウスの腹腔内に移植すると通常２〜３ 週内に腫瘍を形成する。

この腫瘍に伴って所望のモノクローナル抗体を含む腹水が生成される。その後、 このモノクローナル抗体は、限外ｒ過、超遠心、透析及び免疫アフィニティーク ロマ・トゲラフイー等の従来の方法によって腹水から分離回収される。

本発明のモノクローナル抗体は以下の式によって４１付けら式（１１に於いて、 Ｋは、反応体に対するモノクローナル抗体のアフィニティ一定数外の、生成物に 対するモノクローナル抗体のアフィニティ一定数ｋ　に対する比と定義される。

この式は、このモノクローナル抗体が生成物よりも反応体に対してよいるゎ従っ て、反応体が化学修飾を受け生成物を形成した結果、複合体を形成した分子に対 するモノクローナル抗体の結合アフィニティーが低下して生成物分子が該複合体 から遊離し、それによって遊離のモノクローナル抗体触媒が再生される。好まし くはＫは１０２より大である。

式（２１、＋３１及び（４）は本発明１；角用な不モノクローナル抗体の速度論 的特性を示している。

式（２）は、抗体−反応体間の複合体形成速度として定義されるｒ、がモノクロ ーナル抗体がないときの化学反応速度ｒ、よりも犬でなければならないというこ とを表している０式（３）は、複合体を形成した反応体が複合体を形成している 生成物に変換する速度として定義されるｒｌがｒ、よりも大でなければならない ことを表している。式（４）は、複合体からの生成物の遮湿速度として定義され るｒ３がｒ、よりも大でなければならないということを表している・ｒ　６　＊ 　ｒ　ｔ　＋　ｒユ及びｒ３は公知の方法によって直接又は間接的に便利に決定 され得ることは当業者には理解されるところである。

これらの特徴の結果、不発明のモノクローナル抗体によって化学反応の速度を好 ましくは１０２倍以上更に好ましくは１０４倍以上に早くすることができる。

複合体形成のための適当な条件は問題になっているその特定の施され得る。より 特定的にはり合体形成のための適当な条件は、好ましくは約６．０〜約７．５で 温度が約り１℃〜約５０℃、好ましくは約り０℃〜約４５℃に保たれているもの である。イオン強度、ａｍ％ΣＣ１！ｉ２（ここでＣは濃度、２はイオン性溶質 の電荷である。）は約２．０　ｍｏｌｅ／　ｅより小さく、好ましくは０．１〜 １．５　ｍｏｌｅ　／　ｌに維持すべきである。本発誓摩減圧又は加圧下で行な い得るが、大気圧で行なうのが好ましい。溶液相及び乳濁反応システムに加えて 、モノクローナル抗体が付着される支持物を用いることも適当な条件として含ま れる。このような支持物は、モノクローナル抗体をそれに付着させる方法と共に 通常の知識を有する当業者には艮〈矧られている。

本発明方法はどのような化学反応の速度′ｆｔ箭めるのにも広く雇用本宅＋効− で３２る。例えば、本発明方法は１つの反応体から１つの生成物への変換を含む 化学反応に適用し得る。このような反応はα−ケト酸からα−アミノ酸への変換 を含ル、インドールピルビン酸のＬ−）リブトファンへの変換によって例示され 得る。もう１つの例としては環状ポリヌクレオチドから鎖状ポリヌクレオチドへ の変換がある。ここで“ポリヌクレオチド／）内ル という用語はポリ及びオリゴヌクレオチドを含む。

本発明方法はもつと複雑な化学量論の化学反応にも適用され得る。例えば、２つ の反応体からの１つの生成物への変換を含む反応の速度も本発明によって扁めら れ得ろ。このような反応の例としてアミルプリン酸２分子からのボルホビリノー ゲン１分子への変疹がある・ 本方法は、１つの反応体から２つの生成物への変換を含む反応にも石吊廿含そ→ ｔで少ろ。このような反応は、β−Ｄ−ガラクトシドからのＤ−ガラクトースと 第２の生成物への変換、ボここで用いられる“ポリペプチド及び１ポリサツカラ イドという用語は、それぞれポリ及びオリゴペプチド並びにポリ及びオリゴサツ カライドを含む。

本方法は更に１つの反応体から多数の生成物への変換を含む化学反応の速度を高 めることに有用である。このような反応はポリヌクレオチド、ポリペプチド及び ポリサッカライドからのローナル抗体と接触させる。この抗体の各々は反応体の 異なるるものであるときは、特定のポリヌクレオチドフラグメントを該反応体か ら開裂し得る。

本方法は２つの反応体から２つの生成物への変換を含む反−１１」 速度ｔｔ冨めるのにも用？゛′イる。このような反応は１つの反応体と２番目の 反応体との間での官能基の交換によって２つの新しい生成物を生じる、例えばエ ステル交換反応を含む。

前述し１こところの化学量論の列挙は限定的なものではな（、むしろ本発明の広 範囲に恒る有用性を指適し、本方法がいま問題にされている反応の化学量論に限 定されないということを示すつもりのものである。

前述の議論及び実例によっても明らかなように、本発明の方法は酸化、還元、付 加、縮合、脱離、置換、開裂及び転位その他これらの実例は本発明の触媒特異性 が高いということもまた例証するものである。例えば本発明の実施に際して、ポ リヌクレオチドのある特定なヌクレオチド配列だけ、又はペプチドのある特定な アミノ酸配列だけと相互作用するモノクローナル抗体ｔｔ調製し得る。

本発明の方法は酵素によっても触媒され得る反応の速度を高めることに用い得る 。例えば酵素としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ 、キサンチンオキシダーゼ、ジヒドロウラシルデヒドロゲナーゼ若しくはＬ−ア ミノ酸オキシダーゼのような酸化還元酵素、グアニジノ酢酸メチルトランスフェ ラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ若しくはアスパラギン酸ア ミノトランスフェラーゼのような転移酵素、アセチルコリンエステラーゼ、グル コース−６−ホスファターゼ若しくはホスホジェステラーゼのような加水分解酵 素、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルドラーゼ若しくはヒスチジンアンモニ ア−リアーゼのようなリアーゼ、リブロースリン酸エピメラーゼのようなイソメ ラーゼ又はチロシル−１ＲＮＡシンターゼ若しくはアセチルＣＯＡカルボキシラ ーゼのようなりガーゼが考えられる。

前記した様に本方法は、自然にはアミルプリン酸デヒドラターゼという酵素によ って触媒される反応であるアミルプリン酸２分子からボルホビリノーゲン１分子 への変換、自然にはホスホジェステラーゼ（制限）＃素によって触媒されるポリ ヌクレオチド中の特定なホスホジエステル結合の開裂を含む反応である、環状ポ リヌクレオチドから鎖状ポリヌクレオチドへの変換又は鎖状ポリヌクレオチドか ら２つ以上のそれの７ラグメントへの変換、自然にはトランスアミナーゼ酵素に よって触媒インドールピルビン酸のよ５なα−ケト酸からＬ−）リプトファンの ようなα−アミノ酸への変換、及び自然にはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼによって 触媒されるβ−Ｄ−ガラクトシド結合の開裂を含む反応であるβ−Ｄ−ガラクト シドからのＤ−ガラクトース及び第２生成物への変換、の速度を高めるのに用い ることができる。

本発明のその他の態様においては、ある酵素の既知の基質である抗原に対するモ ノクローナル抗体を調製し基質な生成物に変換する速度を増加させるために使用 する。本方法は例えば、酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質として公知の０− ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドの０−二トロフェノールとＤ−ガラクト ースへの分解（変換）の速度を増加させるのに有用である。本方法においては、 該酵素をＢＡＬＢ／Ｃマウスに接種し、件下でスクリーニングし、酵素の活性部 位に結合する第１七ノる抗体なスクリーニングすることによって同定し得る。こ のスクリーニング工程は１例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような酵素 結合活性を測定する慣用の方法により行うのが便利である。このようにして同定 した第１モノクローナル抗体を１４ＬＢ／ｃ／ 一般的方法により分離回収し、新たな酊万ｑブスに接種するのに使用する。一般 的方法に従い、第１モノクローナル抗体に対する一連のモノクローナル抗体を生 成する。Ｄ・＜シて生成された抗体ｆｔ′″抗−イディオタイブモノクローナル 抗体と称する。

２？亀く、 ′−”ｉの抗−イディオタイプモノクローナル抗体を一般的方法に従ってスクリ ーニングし、至適条件下で抗原（基質）に結合しそれを生成物に変換する抗−イ ディオタイプモノクローナル抗体を同定する。“（適切な）至適条件１とは曇２ ｂ会抗体−反て生成され１分ｐ回収された抗−イブイオタ・・プモノクローナル 抗体は本発明に従い、基質を生成物に変換する速度を増加するために使用し得る 。

本発明のこの冥施態様において酵素の代りにこのようなモノクローナル抗体を使 用することは、６！−素がアロステリックな場合特に有利である。アロステリッ ク酵素は、基質、生成物あるいは他の分子であり得ろモジュレータ−分子により 活性化あるのあるいはその後の生成物の濃度の増加に従い減少する。これにより このような酵素の多くの用途での使用は制限され、生成な抗−イディオタイプモ ノクローナル抗体を使用でることによってアロステリック性の問題及び制限？打 破し得る。

本９明は、以慄コファクター（補因子）と称する非タンパク用し得ることもまた 考えちれろ。コファクターとは例えば、ビリドギサールリンラセ、ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデプエンザイムＢ１ ２．及びコエンザイムＡＩである。例えばピリドキサールリン酸によって触媒さ れ得る反応にはα−ケト酸及びα−アミノ酸の相互変換（１ｎｔｅｒ−ｃｏｎｖ ｅｒｓｉｏｎ　）があろ・コファクターのみによって触媒される反応は他のもの も含めて比較的遅い反応で、また非選択的である。コファクターのみを使用した 時に遭遇する問題を打破するために、コファクターのみの比較的効率の悪い触媒 能力と高度に特異的で効率の高いモノクローナル抗体の有利砕宴結合する本発明 に従ってモノクローナル抗体ｔｔ詐製し得る。そのようなモノクローナル抗体を 調製するためには１反応体あるいは反応体又は生成物の類似物に結合したコファ クターをマウスに接種し、その後前述したコブロウスキー（３ｏｐｒｏｗｓｋｉ 　）の一般的方法を行な５１仄に一般的方法により一連のハイプリドーマ細胞ヲ ｖ＠製して、遊離コファクター及び反応体と複合化し、化学反応の速度を増加し 、生成物を解放（遊離）し得るモノクローナル抗体の生成に関してスクリーニン グする。例えばインドールピルビン酸−ピリドキサミンリン酸イミンに対するそ の様なモノクローナル抗体は、インドールピルビン酸のアミノ酸トリプトファン への変換の速度を選択的に増加させる０本発明のこの′ｆｉ３様の実施において は。

モノクローナル抗体と少なくとも等モル景の適当なコファクターな反応混合物に 加えることが好ましい。

本発明の特定実Ｐｌ態様の説明のため、実施例な以下に記載する。

材料及び方法 以下の奥ね例で使用した化学的、生物学的試桑は下記の市販先より入手した。Ｏ −ニトロフェニル−−〇−ガラクトシダーゼ及びバッファーはシグマケミカル社 （Ｓｉｇｍａ　ＣｈｓｅｉＣａｌＣＯ６，セントルイス、ミズーリ）より入手し た。ジニトロフエ／　−ル（Ｄ　ｈ　Ｐ　）　Ａ　ヒジニトロベンゼンスルホン 酸塩はイーストマンコダック社（ＥａｓｔｐＡｎ　Ｋｎｃｉａ“Ｃｏ、、　ｏチ ェスター、ニューヨーク）より入手した。ホースラディッシュベＡ・オキシド標 識ヤギ抗マウスイムノグロブリン及び２，２′−アジノージ（３−エチルベンズ チアゾリンスルホンＤ）（ＡＢＴＳ）はＫＦ’Ｌラボラトリ−（ＫｐＬＬａｂＯ ｒａｔＱｒｌｅＳ　＊　Ｉｎｃ、　＃ゲザーズバーグ。

メリーランド）より入手した。マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ　ｎ ■）はダイナチック（Ｄｙｎａｔｓｃｈ　、アレキサンドリア、バージニア）よ り入手した。カッマイシンはジブコラボラトリーズ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク）より入手した。牛胎児血清及 びアオガイヘモシアニン及び他のタンパク質はカルバイオケムーベーリング（Ｃ ａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、サンジエゴ、カリフォルニア）より入手 し得る。細胞生長培地及び添加物はエムニーバイオプロダクツ（Ｍ、Ａ、Ｂｉｏ ｐｒｏｄｕｃｔｓ　、ウォーカーズビル、メリーランド）クビル、メリーランド ）より入手した。他の試薬１例えばＯ−ニトロフェニル−β−ｐ−ガラクトシド 、５−アミルピユリン酸、過酸化水素、フェノール、硫酸マグネシウム、重炭酸 ナカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、セントルイス、ミズー リ）より入手し得ろ。ＢＡＬＢ／Ｃマウスはナショナルカンサーインステイテユ ート、フレデリックリサーチフ了シリティ尖 （Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　ＦｒｅｄｅｒＬｃ ｋ　Ｒｅ５ｅｒｃｈＦ　ａｃ　１１　ｉ　ｔ７　ｍフレトリック、メリーランド ）より入手した。アＲＮＡは９例えばＭ’ｌ”Ｖ　ＡＴＣＣＶＲ−７３１（アメ リカンタブ１）ＩＣＩＯＦ−９のＯ−二トロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトシド（ ０１ｑｐＧ）￥静脈内接看キ１竿す曾右叢１２ｑの０ＮｐＧを腹腔内接種した。

０ＮＰＧはｐＨ７，３の０．１Ｍリン酸バッファーに２５ｍＱ／Ｉｆの濃度で溶 解し、３７℃に加温した。某３３日目のマウスに、不完全フロインドアジュバン ト中の０ＮＰ（１’１２．５η腹腔内接種した・０ＮＰＧＩＪンシバツフア−溶 液は等容量の不完本化インドアジュバントと混合し、接種に先立ち乳化させた。

第５４８目に各マウスから血部料を採取した。血液サンプルから遠心分離により 血ヨ嘴ヲ分離し４℃で保存した。

実施例１の接種マウスの９１１日目、アオガイヘモシアニン（ｘＬｑ）に結合さ せ不完全フロインドアジュバント中に乳化させたジニトロフェノール（ＤＮＰ） を腹腔内接枝した。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ　）の方法（１９７６ 、アナルーバイオケムＣＡ、ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）工２：２４Ｂ）によ り測定したところ　＊Ｆ、　Ｓ物は１ｏＴｎＱのタンパク質を含有していた。ジ ニトロフェノールのＫＬＨへの結合はリトル及びエイセン（Ｌｉｔｔｌｅ。

Ｅｉｓｅｒ’　）の方法（１９６７、メン・イムツル・イムツク゛ム〔）うｅ” ｂｈ、１ｍｌ！１ｕｎＣ４，ＩｍｍｕｎＯｅｈｅｍ、］　１　：　１２　）によ り行なった・Ｄ　Ｎ　Ｐ　−Ｋ　Ｌ　Ｗ接種を鎖１０１０目に繰り返した。接ね 物は第９１Ｂ１の接１重′吻について記載したように調製した＊　ａ　１０５日 目に各マウスから血液サンプルな得、遠心分離により血清を分離し４℃で保存し た。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃマウス（表１のブルーフ゛２）に左しＯ日月にｌ完全プ ロインドアジュバント中に乳化した５０ｒ：ｖｊあるいは１００〜のｏ　：ｒ　 Ｐ　Ｇな腹腔内に、第３０８目にｐＨ７，３の０．１　Ｍリン酸バッファー中の ０ＮＰＧＩＯ〜を静脈内に、第６３６目に不完全フロインドアジュバント中の０ ＮＰＧ　（２５ｎＱ／ｌｌ　）　１２．５Ｆ−？改シ を翳腔内にそれぞれ接ねした。９日径にマウスから採血し、遠心分離により血清 な分離して４℃で保存した。

実施例４ ジニトロフェノールーアオガイヘモシアニン結合体によるマウｌヱゴシ辷直 実施例３の接種マウスの第１２１８目及び第１３１日月に。

不完全フロインドアジュバントに乳化したＤＨ？−ＫＬＨ’ｔ１０〜腹腔内埠禮 し、算１３５日月に採血した。遠心分なにより血清を公卿し４°Ｃで保存し１こ 。

炭９（バッファー中に０ＮＰＧ（］’々！７７ｉｔ）を含有する浴液５ｏｌｔＪ ￥ポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。４℃で１８時間 後溶液を除去し、ウェルを０．０５％Ｔｖｅｅｎ　−２０を含有するリン酸緩衝 生理食塩水（ＰＢＳ−ＴＷｅｌｅＩｍ　）で４回洗浄した。次に、ウェルに１％ ウシ血清アルブミｙ　（Ｂ　Ｓ　Ａ　）　ｆ含有するＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ 　ｆ：入れ、１２０分間３７”テインキュベ−）１．、て０ＮＰＧ−コートウェ ルをブロック実施例１及び３において採集した血清及び免疫化していないマウス の血ｉ’ｌ＃を、１％ＢＳＡ％：含有するＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｖｅｅｎで種々の程 度に希釈した。かくして得られた溶液試料を上記のよ５に調製した０ＮＰＧコー トイ→４ウエルに加え、３７℃で１２０スラデイツシユペルオキシダーゼに利金 した抗−マクスヤギイムノグロブリンを使用するエングバＡ／　（ＥＨｇｖａｌ ｌ　）及びバールマン（ＰｅｒＬｍａｎ　）の方法（１９７１，イムノケム（ｉ ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ。

ウス抗体を除去した後、２　、２’−アジノージ（３−エチルベンズチアゾリン スルホン酸）（ＡＢＴ８）及び過酸化水素ヲもウニこしし ルに加え１５〜２０分間接触させた。０ＮＰＧで免疫化したマウスから得た血清 の１：１０〜１：３２０の希釈液と接触した０ＮＰＧを接種したマウスから祷ら れた血清の少くとも２倍以上の量娶である一〇　Ｎ　Ｐ　Ｃで免疫化されていな いマウスから得た血清は、特ツセ３においては着色生成物化生成しＴＬかった。

これ等の結果は、ＤＮＰＧで免疫化されたマウスから得た血清０ＮＰＧと反応す る抗体の触媒活性を下記σ）ようにして測定した。実施例１及び３において上記 したように得六ニマウス血清の希釈物の５０ａｌを、１％ＢＳＡ７含有するｐＢ Ｓ−Ｔｖａｅｎバッファー中の０Ｈｐａ　ｓ　ｏ　ｔｔ（ｌと２３℃で１８時間 接かさゼた。

同様に、５ｏａｌのＰＢＳ−Ｔ’ｗｅｅ１１−　ＢＳＡバッファー午の５０ｎｇ の酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼｔｔＯＮＰＣ）溶液と接触させ試料中にも検出 されなかった。予想されたように＃素β−Ｄ−ガラクトシダーゼは触媒活性を有 していた。

次に実施例２及び４で採集された。ＫＬＨに結合したＤ　ｌｉ　Ｐ　％ｌ’さら に接種されたマウスから得られた血清について測定した。

該血清につき上記した方法により０ＮＰＧに結合１３抗体の存在を試験した。免 疫化マウスより得た血清が抗−〇ＰＮＧ抗体を含有することが示された。１：５ ，１２０の希釈血清が、抗−０ＮＰＣ）抗体の存在に対して陽性の反応を示した 。このことは。

ＫＬＨに結合された類似体による追加の免疫化が、血清中の抗−０ＮＰＣ抗体の 濃度の増加をもたらしたことを示しているＯ免疫化していないマウスから得られ た血清を使用すると何の反応も見られなかった。

実施例２及び４で採集された血清中の血清抗体の触媒活性を上記のようにして試 験した。

結果を表１に示すが、免疫化されたマウスからの血清試料中において触媒活性が 検知されたことを示している。

（以下余白） 表　１ マウス血清及びβ−〇−ガラクトシダーゼの触媒活性４０５ｎｌｌＯの吸光度１ ＯＮＰＧ抗血清 １：１０　．０１９　．０２３　．００４１：２０　．００５　．００３　．０ ００１　二　４０　．００Ｂ　、０１０　．００２グループ２鵞よ ＯＮ　ＰＧ　抗血清 １：１０　．００６　．０３１　．０２５１：２０　．００４　．０４２　．０ ３８１：４０　．００６　．００９　．００３正常マウス血清 １：１０　．００３　．００９　．００６１：２０　．０００　．０００　．０ ００１　二　４０　．００５　．００７　．００２β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ５０ｎ、！ｉ＋　、２２９　．３６２　．１３３５ｎ、！ｉ’　、０２９　．４ ９６　．４６７０．５ｎＪ　、０００　．１１２　．１１２１、血清の吸光度に 対して修正した。

２１０分と１８時間の値の差。

λ実施例２で得た血清。

表冥り例４で得た血清。

実施例６ ０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド°°で免疫感作することによる融合 （ハイブリダイゼーション）用肺臓細胞のｖ４製実施例４と同様に免疫感作し、 実施例５と同様にアッセイした抗体産生マウスを殺し、七の胛縁す摘出する。１ ０匹のマウスの膵臓ｔｚｒ：４静゛しＭｆｅｔ、細いナイロンスクリーンな通過 させてリンパ球（肺臓細胞）懸濁液を得ろ。この慰濁液な血清を含有しないＲＰ ＭＩ　−１６４０で３回洗浄する。

５Ｐ２１０系由来の骨髄腫細胞を、２％牛脂仔血清、ペニシリン及びストレプト マイシンを補ったＨＢＩＯＩ培地（完全ＨＢ１０１）中で増殖させる。５Ｐ２１ ０細胞は細胞融合に使用する面に３日間毎日継代培養し、１０５細胞／１ｉｌｆ ｊｔ超えない濃度で接種する。８Ｐ２１０細胞は融合前にＲＰＭ！−１６４０で 一口洗細胞をペレット状にし１次いで１．６Ｘ１０’ｌＪンパ球に対して１ａの 割合でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１４５０　（イーストマンーコダック （Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ　）　、　ａチェスター（ＲｏｃｈｅＳｔｅｒ　 ）　、　ＮＹ　）　ｆｊ液（ＦＩＰＭＩ−１６４０中に５０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　ｗｔ ／ｖｏｌを含有）を細胞ペレットに流加する。ＰＥＧ溶液で細胞融合した後、細 胞懸濁液を２００　ｘｆ！で５分間遠心する。上清を除去し、最終濃度１０’　 ＠＠、１１となるように細胞を完全ＨＢ１０１中に静かに懸濁する。次いで、９ ６−ウェルマイクロタイタープレートのウェル中にこの最終ａ胞懸濁物を１００ １ｔｌの容量で分配し、３７℃で培！する。次いで、２４時間後に各ウェルに１ ００１１１のＨＡＴ培地（ＩＸＩＯ−’Ｍヒボキサンチン、　４．ＯＸ　１０− ’　Ｍアミノプテリン及び１．６Ｘ１０″″５Ｍチミジンｆｔ補った完全Ｈｐｘ ｏｘ）ｆｊｔ添加する。各ウェルから約１００　ｕｇの培地を吸引し、新しいＨ ＡＴ培地ｔｏｏｕｇ’ｖ添加することにより２〜３日毎に細胞に栄養を与える。

ＨＡ、　Ｔ培地中での培養の週１の間に、親の骨髄腫細胞とリンパ球はほとんど 死亡するのがＲ察される。

インキュベーションｔ、）ｌＯ〜１５日後に、ハイブリダイゼーションが成功し たことを示すＨＡＴ培地中での細胞の増殖が観実施例９ 触媒釣上ツクローナル抗体な産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニング 実施例８に従って調製した。０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドから０ −ニトロフェノールとＤ−ガラクトースへの開裂を触媒しうる抗体を産生するハ イブリドーマ細胞を含むマイクロタイターウニ）ｖｆ次のよ５にアッセイする： 各つェルがＱ−二トロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトシドの０゜０５Ｍ溶液を含有 している第２の９６−ウェルマイクロタイタープレート（アッセイプレート）を ｖ４製し、３７℃に維持する。第１プレート（ハイブリドーマプレート）の各ハ イブリドーマ含有ウェルの内容物のアリコート１００　ｔｔｌを取り出し、アッ セイプレートの対応ウェルに移丁、Ｑ−二）Ｃ２フェノールの存在は分光光度計 で測定するのが好ましい。又、移した各５分後にアッセイプレートウェルのアリ コート５０／１ｌｆｔ生成物の１つ又は両者の存在についてＨＰＬＣで分析てる 。Ｑ−ニトロフェノールとＤ−ガラクトースを含むことが判明した各アッセイプ レートウェルを同定し、対応するハイブリドーマプレートウェルにハイブリドー マＩＩ！５胞の培養 失ゲ５σＢｊｇで同定した各触媒的ノーイブ１１ドーマ細胞懸濁物の一部を新し い１イクロタイタープレートの各ウェルに４番ペイジ。

ハイブリッド細胞のコロニー形成率は５０％であろ（ｆなわち。

幡種した細胞の５０％が増殖してコロニーを形成する）。この操作により、２週 間以内に８０〜１００％のウェルでノ・イブリッド細胞のコロニーが得られろ。

実施例９に記載の方法により。

再度ハイブリドーマ細胞の触媒的抗体の産生について調べる０胸賢リンパ球支持 日＠す用い、但し、３つのウェル虫りノ・イブリッド級胞１つの濃度で、触媒的 抗体を産生じ続けているバイプリドーマ細胞な再びクローン化する。特異的な組 入合せからのクローンの９０％未満が抗体を産生するときには常にこの操作を繰 り返す。

実施例１１ インビボ（ｉｎ　ｖｉｖａ　）での触媒的モノクローナル抗体□ 実施例９に従って選択した・〜イブリッド細胞１０６個な同系れらの腫Ｓは腹水 の産生（マウス坐１１Ｏ，Ｓ〜３　ａｒｔ：　）を伴う。ノ・イブリドーマを有 ｆるマウスの腹水及び血清中の免疫グロブリン濃度は放射免疫拡散アッセイで測 定する。個々のｉウスの血清及び腹水中のモノクローナル抗体の濃度はほぼ等し く、各々１当り５〜５０ｎＱの抗体を含有している。次に、ゲｔｗ濾過又は限外 ｅ過のような通常の方法で、血清又は腹水からＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ ラクトシドの開裂を触媒しつるモノクローナル抗体を採取する。

実施例１２ ０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドの開裂な触媒スるモノクローナル抗 体の使用 一一一時 ０．５Ｍリン酸バッファでｐＨ６Ｊに緩衝し３７℃に維持した蒸也゛水１００Ｑ Ｉｌ′ｌｅ中に３０．１２ｇ（１００ミリモル）の〇−ニトロフェニルーβ−Ｄ −ガラクトシドな含有する溶液に、実施例６に従ってヨ１製したモノクローナル 抗体１０〜を加える。反応混合物な２時間計Ｄ・に攪拌する。次いで、限外濾過 により反応混合物ｔ・らモノクローナル抗体を回収する。次に、Ｐ液も′１０℃ に冷却し１重炭酸ナトリウム９．２ｇ（１１０ミリモル）で処理する。Ｐ液？ジ エチルエーテＮ１００ｄ３部で抽出する・二とによりｐ−ガラクトースを回収す る。エーテル部分を合せて、］、ＯＮ重炭酸重炭酸ナトツウ回洗浄し、硫酸マグ ネシウム上で乾燥させ、ｅ過し、減圧下に濃縮してＤ−ガラクトースな得る０次 いで水性部分と重炭酸ソーダ洗液とを合せ、５Ｎ塩酸の灼加によりｐＨ３へと酸 性化する。次に、酸性化した水性部分をエーテルで３回抽出する。エーテル抽出 物な合せ、硫酸イネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下に濃縮してＯ−二トロ フェノールを得る。ＨＰＬＣ又は再結晶によりＯ−ニトロフェノール及びＤ−ガ ラクトースを更にｎ製してもよい。

実施例１３ ボルホビ１ノーゲン（ｐＢＧ　牛用　媒酌モノクローナル抗体の調製 ＢＡＬＢ／Ｃマウスを３−グリシル−４−ヒト０ロキシー４−例６の方法に従っ て　／％イブリダイゼーション用牌肺臓胞を調製する。実施例７に従って骨髄＠ ａ胞な調製する。次に、実施彎マ 例８の方法に従って晴臓ａ胞と骨舘論胞な融合させて／％−ｊ）゛リドーマ細胞 を生じさせる。次いで、アッセイ基質がアミルプリン酸（０，０５Ｍ）であり、 アッセイがＰＢＧに対応するＨＰＬＣ−ピークの出現について試験するものであ る。実施例９の方法の変法によりＩ・イブリドーマ細＠なスクリーニングする。

七のように同定したノ・イブリッド細胞な実施例１０の方法に従って培養し、実 施例１１の方法に従つ℃マウスう゛ら得る・実施例１４ ＰＢＧの産生な触媒するためのモノクローナル抗体の使用０．５Ｍリン酸バッフ ァでｐＨ６，８に緩衝し、３７℃に維持した蒸留水１０００ｄ中に１３．１ｇ（ １００ミリ％ル）の７ミルブリン酸を含有する溶液に、実施例１３に従って調製 したモノクローナル抗体３０即を添加する。反応混合物な２時間静かに攪拌する 。次いで、限外濾過により反応混合物からモノクローナル抗体な回収する。反応 混合物を凍結乾燥し、残留物なりロマトグラフイーにかけ精製ＰＢＣ）ｔｒ得る 。

実施例１５ 三−リヱ上乙２遣圭皿ａ呻’％／たにｌ土ａｓｏｐｇ窒素雰囲気下、無水メタノ ール中で２−０３　ｇ（１０ミリモル）のインド−／Ｌ／−３−ピルビン酸と２ ．６５９（ＩＱミリモル）のピリドキサミンリン酸と３ｇの乾供した４久のεＬ トラーン７゛とケ混合することによりシック塩基な調製する。反応混合物Ｖ　− 晩静かに攪拌し、濾過し、減圧下で濃縮してシック塩基を得る。

ＢＡＬＢ／Ｃマウスをシップ塩基で免疫感作する以外＋１実施例６胞を、実施例 ７に従って調製した骨髄腫細胞と実施例８の方法に従って融合させる。次いで、 基質がインドール−３−ビルビン酸（０，０５Ｍ）とピリドキサミン−５−リン 酸（０，０５Ｍ）との混合物であり、アッセイによりＬ−トリプトファンに対応 する）！ＰＬＣビークの出現について試験する。実施例９の方法の変法によりハ イプリドーマ細胞なスクリーニングする。このように同定したハイプリドーマ細 胞ヲ、実施例１０の方法に従って培養し、実施例１１の方法に従ってマウスから 得る。

ｘ盃±」」 Ｌ−トリプトファン産生を触媒　るためのモノクローナル抗の使用 ０．５Ｍリン酸バッファーでｐＨ６，５に緩衝し、３７℃に維持した蒸留水１０ ００ｄ中にインドール−３−ピルビン酸２０．３ｇ（１００ミリモル）とピリド キサミン５−リン［２６，５ｇ（１００ミリモル）とを含有する溶液に、実施例 １５に従って調製したモノクローナル抗体５０■を添加する。反応混合物を２時 間静かに攪拌する。次いで、限外濾過によりモノクローナル抗体 ル抗体な回収する０反応流合物を透析した後凍結乾燥するとＬ−トリプトファン が得られる。

五五丘ユ］ 囚　抗原の調製 冷水（８ｄ）中に溶解し、０．ＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨ〆、５に滴定した牛 血清アルブミン（ＢｓＡ）（ｓｏｗ）の溶液Ｋ。

ｌ−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド　メト−ｐ −）ルエンスルホネート（ｍｏｒｐｈｏ　ＣＤＩ　）な添加し、直後にマウス乳 腺腫瘍ウィルス３５ＳＲＮＡ（５ｏＩＩＩｙ）を添加する。反応混合物な室温ま で加温し０周期的に静かに攪拌しながら１８時間保存する。次いで反応混合物を ０．０５Ｍ重炭酸アンモニウムに対して（４回変えて）、その後、水に対し合体 （ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）促凍結乾燥し、バイアル中に秤量して入れ。

−７７℃の窒素雰囲気下で保存する。又、ＢｓＡＱ代りにアオガイヘモシ丁二ン （ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＡ）及びウサギ自消アルブミンＣＲＡ）ｔｔ使 ５こともできる。これらの蛋白質は全てカルバイオケム（Ｃａ１ｂｉｏｃｈｅｉ 　）から入手できるウション用肺臓細胞を調製する。実施例７に従って骨髄腫細 胞な調製する。次いで、実施例８の方法に従って、膵臓ａ＋胞と骨髄イ［ｇ吃 腫細胞な融合しバイブリド−Ｗ得る。

０．９％Ｈａ（Ｊ！を含有する０、５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ６，１）中の３５ ８ＲＮＡとマイクロタイターウェル内容物のアリコートとな３フ℃で種々の時間 インキュベートすることにより、このように得られたＩ・イブリドーマ細胞なス クリーニングする。

次いで、フェノール抽出によりＲＮＡ７精製製する。抗体開裂により発止したフ ラグメントの数を２次元ポリアクリルアミトゲ！・−気泳ミで測定し、各開裂部 位のヌクレオチド配列を解明する。シ１定はいずれもシュワルツ（５ｃｈｖｒａ ｒ”、ｚ　）らがセル（Ｃｅｌｌ）３２二８５３−８６９（１９８Ｂ）に記載し た方法に従って行う。各マイクロタイターウェルの内容物により誘導されたＲＮ Ａ１：ｆ１裂で得たフラグメントとＥｃｏ　Ｒｒで誘導されたフラグメントとを 比較することにより、ｗｃｏｎｘ８裂部位でのＦＬＮＡ開裂のみを触媒しうろモ ノクローナル抗体ｆｔ産生ずるノ・イブリドーマ細胞が選択される。このように 同定したノ・イブリドーマ細＠を実施例１０の方法に従って培養し、実施例１１ の方法に従ってマウスから得る。

実施例１８ ＥｃＯＲｉ部位でのＲＮＡ開裂を触媒　るためのモノクロ−ぜ抗体の使用 ０．９％ＮａＣｇ　ｆｔ含有する０、５Ｍリン酸バッファでｐＨ６−１に緩衝し 、３７℃に維持した蒸留水１００ｍにマウス乳腺腫瘍ウィルス３５８ＲＮＡ（５ ０■）を加える。実施例１７に従って調製したモノクローナル抗体（ｓ＃）ｔｔ 反応混合物に添加し１次いで３０分間静かに攪拌しながらインキュベートする。

次にフェノール抽出でＲＮＡ７精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動でフラ グメントｔｙｒＩＩ！！！スる。

ＢＡＬＢ／Ｃマウスを酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼで免疫感作する以外は実施 例６の方法に従ってノ〜イブリダイゼーション用肺臓細胞を調製する。実施例７ に従って骨髄腫細胞を調製する。次いで実施例８の方法に従って膵臓細胞と骨髄 腫細胞を融合し・・イブリドーマ細胞を得る。このようにして得たＩ・イブ及び 放射標識したＯ−ニトロフェニル−β−ｐ−ガラクトシドとに対スるマイクロタ イターウェル内容物の競合阻害の１’ｌｌＡアッセイによりスクリーニングする と便利である。次いで、このように選択したハイプリドーマ細ｌｌ＠ヲ実施例１ ０の方法に従って培養し、実施例１１の方法に従ってマウスから大量に得る。

（至）抗イデイオタイプモノクローナル　体の！聚上記囚に従って調製し選択し たモノクローナル抗体でＢＡＬＢ／Ｃマウスな免疫感作する以外は実施例６の方 法に従ってハイブリダイゼーション用肺臓細胞を調製する。骨髄腫細胞は又実施 例７の方法に従って調製する。実施例８の方法に従って、膵臓細胞と骨髄腫細胞 を融合してハイブリドーマ細胞を得る。このように得たハイプリドーマ細胞は先 ず実施例９の方法リーニングする。こｄｃＩｊ、実施例９に従い、但し１周期的 に、化ターから反応速度な計算できる。筏々の量の反応体の存在下に又９種々の 量の測定するものではない生成物と共にアッセイを繰り返すと、抗体の動力学的 動態の変化を検出できる。この方法で、アロステリックな調節馨示Ｊ抗イディオ タイプモノクローナル抗体が排除できる。非アロステリックな抗イデイオタイプ モノクローナル抗体な産生ずるＩ・イブリドーマ細胞を、実施例１０の方法に従 って培養し、実施例１１の方法に従ってマウス中での増殖により得る。

０　抗イデイオタイプモノクローナル抗体の使用■で得た抗イデイオタイプモノ クローナル抗体な実施例Ｉ２の方法に従って用いることができる。

国際調査報告

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１種の反応体から少なくとも１種の生成物への変換を含む化学反 応の速度を増加させる方法であつて、反応体とこれに対する少なくとも１種の適 当なモノクローナル抗体との複合体の形成、反応体から生成物への変換，および 生成物の複合体からの遊離を可能にする適切な条件下で前記反応体を前記モノク ローナル抗体に接触させることからなり、前記モノクローナル抗体の特徴がＫ＞ １（ただしＫ＝ｋｒ／ｋｐであり、ｋｒは反応体に対するモノクローナル抗体の アフイニテイー定数であり、ｋｐは生成物に対するモノクローナル抗体のアフイ ニテイー定数である）、ｒ１＞ｒ０（ただし、ｒ１は抗体と反応体との複合体の 形成速度デあり、ｒ０はモノクローナル抗体が存在しないときの化学反応の速度 である）、ｒ２＞ｒ０（ただし、ｒ２は複合体を形成した反応体から複合体を形 成している生成物への変換速度である）、およびｒ３＞ｒ０（ただし、ｒ３は生 成物の複合体からの遊離速度である）である方法。
2. ２．反応が酵素によつて触媒され得る反応であることを特徴とする請求の範囲第 １項に記載の方法。
3. ３．反応がアミノレブリン酸からポルホビリノーゲンヘの変換を含んでおり、酵 素がアミノレブリン酸デヒドラターゼデあることを特徴とする請求の範囲第２項 に記載の方法。
4. ４．反応が反応体から生成物へのアミノ基の交換を含んでおり、酵素がトランス アミナーゼ酵素であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
5. ５．反応がポリリボヌクレオチド内のホスホジエステル結合の開裂を含んでおり 、酵素が制限酵素であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
6. ６．反応がガラクトシル結合の開裂を含んでおり、酵素がβ−ガラクトシダーゼ てあることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
7. ７．反応が非タンパク性有機分子によつて触媒され得る反応であることを特徴と する請求の範囲第１項に記載の方法。
8. ８．非タンパク性有機分子が補因子ピリドキサールリン酸であることを特徴とす る請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．反応が１つの反応体から１つの生成物への変換からなることを特徴とする請 求の範囲第１項に記載の方法。
10. １０．反応体がα−ケト酸であり、生成物がα−アミノ酸であることを特徴とす る請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．α−ケト酸がインドールピルビン酸であり、α−アミノ酸がＬ−トリプト フアンであることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．反応体が環状ポリヌクレオチドであり、生成物が線状ポリヌクレオチドで あることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の方法。
13. １３．反応が２つの反応体から１つの生成物への変換からなることを特徴とする 請求の範囲第１項に記載の方法。
14. １４．反応体が２分子のアミノレブリン酸であり、生成物が１分子のポルホビリ ノーゲンであることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．反応が２つの反応体から２つの生成物への変換からなることを特徴とする 請求の範囲第１項に記載の方法。
16. １６．反応が１つの反応体から２つの生成物への変換からなることを特徴とする 請求の範囲第１項に記載の方法。
17. １７．反応体がβ−ガラクトシであり、２つの生成物の少なくとも１つがガラク トースであることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の方法。
18. １８．反応体がポリヌクレオチドであり、２つの生成物がそれから誘導された断 片であることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の方法。
19. １９．反応が１つの反応体から多数の生成物への変換からなることを特徴とする 請求の範囲第１項に記載の方法。
20. ２０．反応体がポリサツカライドであり、生成物がそれから誘導されたサツカラ イドであることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の方法。
21. ２１．反応体がポリヌクレオチドであり、生成物がそれから誘導されたヌクレオ チド断片であることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の方法。
22. ２２．各々が反応体の異たる決定基に対するモノクローナル抗体２種以上に反応 体を接触させることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
23. ２３．反応体がポリヌクレオチドであり、モノクローナル抗体がポリヌクレオチ ド内部の異なるヌクレオチド配列に対するものであることを特徴とする請求の範 囲第２２項に記載の方法。
24. ２４．有効量の適当な補因子が存在することを特徴とする請求の範囲第１項に記 載の方法。
25. ２５．補因子がピリドキサールリン酸であることを特徴とする請求の範囲第２４ 項に記載の方法。
26. ２６．適切な条件が水溶液からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の 方法。
27. ２７．適切な条件がエマルジヨンからなることを特徴とする請求の範囲第１項に 記載の方法。
28. ２８．適切な条件が約６．０〜約８．０のｐＨ値からなることを特徴とする請求 の範囲第１項に記載の方法。
29. ２９．適切な条件が約２．０モル／ｌ未満のイオン強度からなることを特徴とす る請求の範囲第１項に記載の方法。
30. ３０．適切な条件が約４°〜約５０℃の温度からなることを特徴とする請求の範 囲第１項に記載の方法。
31. ３１．適切な条件が周囲圧力からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載 の方法。
32. ３２．Ｋ＞１０２であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
33. ３３．モノクローナル抗体の存在下での反応速度の増加が１０２より大きいこと を特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
34. ３４．増加が約１０４より大きいことを特徴とする請求の範囲第３３項に記載の 方法。
35. ３５．ある酵素に対する既知の基質である抗原に対するモノクローナル抗体の製 造方法であつて、 （ａ）前記酵素に対する一連のモノクローナル抗体を適切な条件下で調製し、 （ｂ）こうして生成した一連のものを適切な条件下でスクリーニングして適当な 条件下で抗原の酵素への結合を阻害する第一のモノクローナル抗体を同定し、 （ｃ）この第一のモノクローナル抗体を別個に回収し、（ｄ）前記第一の抗体に 対する一連の抗−イデイオタイプモノクローナル抗体を生成し、 （ｅ）こうして生成した一連のモノクローナル抗体を適切な条件下でスクリーニ ングして適当な条件下で抗原と結合する第二のモノクローナル抗体を同定し、 （ｆ）この第二のモノクローナル抗体を別個に回収することからなる方法。
36. ３６．抗原がβ−ガラクトシドであり、酵素がガラクトシダーゼであることを特 徴とする請求の範囲第３５項に記載の方法。
37. ３７．請求の範囲第３５項に従つて少たくとも１種のモノクローナル抗体を製造 することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
38. ３８．化学反応体上の抗原決定値に対するものであり前記化学反応体から生成物 への変換を触媒し得るモノクローナル抗体の製造方法であつて、 （ａ）前記反応体に対する一連のモノクローナル抗体を適切な条件下で調製し、 （ｂ）こうして調製した一連のものを適切な条件下でスクリーニングして適当な 条件下で所望の反応を触媒するモノクローナル抗体を同定し、 （ｃ）このモノクローナル抗体を適切な条件下で別個に回収する ことからなる方法。
39. ３９．反応体がｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドであり、生成物がＤ −ガラクトースとｏ−ニトロフエノールであることを特徴とする請求の範囲第３ ８項に記載の方法。