JP2001309787A - 脂肪組織の同定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】脂肪組織の同定方法を提供する。 【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を有する遺伝子の発現産物を検出することを特徴とする
脂肪組織の同定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、脂肪組織の同定方
法等に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】脂肪
組織は、生体内の余剰の脂肪を蓄積する機能を担う組織
と考えられてきた。最近の研究により、脂肪組織が外界
からの刺激に応じてホルモンを分泌する内分泌器官とし
ての役割をも有していることが示唆され、該ホルモン分
泌に関連する疾病の改善薬等の医薬品の開発を目指した
研究が盛んに行われるようになってきている。被験組織
に存在する脂肪組織の機能について調べようとする場
合、まず、被験組織中の脂肪組織を同定し、他の組織と
識別することが必要である。現在、脂肪組織の同定方法
としては、組織標本中の細胞の形態観察法、脂肪組織を
構成する細胞中に蓄積した脂肪滴の生化学的染色法など
が知られている（最新医学、48(6), 827-835 (199
3)）。しかし、形態観察法は、組織標本が不出来である
と用を成さず、組織標本作製技術が未熟な者には同定が
困難という問題があった。また、生化学的染色法は、脂
肪組織を構成する細胞中の脂肪滴の蓄積が少ない場合に
は感度に劣るという不満があった。そこで、簡便で感度
高く脂肪組織を同定する方法が求められていた。

【０００３】

【課題を解決するための手段】このような状況下で、本
発明者は鋭意検討した結果、ヒト脂肪組織において特異
的に発現する遺伝子を見出すことに成功し、本発明を完
成した。すなわち、本発明は、（１）配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子
の発現産物を検出することを特徴とする脂肪組織の同定
方法（以下、本発明同定方法と記す。）、（２）発現産
物が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有するｍＲＮＡである（１）に記載の同定方
法、（３）下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基
配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド（以
下、本ポリヌクレオチドと記す。）と被検組織とを接触
させることによって、該被検組織における脂肪組織中の
配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を有するｍＲＮＡを検出することを特徴とする脂肪組
織の同定方法、 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列のうちの１０塩基以上の部分塩基配列 （ｃ）配列番号２で示される塩基配列 （ｄ）配列番号２で示される塩基配列のうちの１０塩基
以上の部分塩基配列 （４）発現産物が、配列番号１で示されるアミノ酸配列
を有する蛋白質である（１）に記載の同定方法、（５）
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を認
識し得る抗体と被検組織とを接触させることによって、
該被検組織における脂肪組織中の前記蛋白質を検出する
ことを特徴とする脂肪組織の同定方法、（６）下記
（ｅ）〜（ｋ）のいずれかに記載の塩基配列を有するポ
リヌクレオチド、 （ｅ）配列番号１のアミノ酸番号１〜２３で示されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列 （ｆ）配列番号１のアミノ酸番号１〜２３で示されるア
ミノ酸配列をコードする塩基配列のうちの１０塩基以上
の部分塩基配列 （ｇ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列 （ｈ）配列番号２の塩基番号１〜４０２で示される塩基
配列 （ｉ）配列番号２の塩基番号１〜４０２で示される塩基
配列のうちの１０塩基以上の部分塩基配列 （ｊ）配列番号２で示される塩基配列 （ｋ）（ｅ）〜（ｊ）のいずれかに記載の塩基配列に相
補的な塩基配列 （７）（６）に記載のポリヌクレオチドを含有するベク
ター（以下、本発明ベクターと記す。）、（８）（６）
に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入されてなる
形質転換体（以下、本発明形質転換体と記す。）、
（９）宿主細胞が微生物由来の細胞である（８）に記載
の形質転換体、（１０）宿主細胞が哺乳動物由来の細胞
である（８）に記載の形質転換体、（１１）配列番号１
で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、本発明
蛋白質と記す。）、（１２）（１１）に記載の蛋白質を
コードするポリヌクレオチドが発現可能な形で宿主細胞
に導入されてなる形質転換体を培養する工程を含むこと
を特徴とする前記蛋白質の製造方法、および（１３）
（１１）に記載の蛋白質を認識し得る抗体（以下、本発
明抗体と記す。）、を提供するものである。

【０００４】

【発明の実施の形態】以下、詳細に本発明を説明する。

【０００５】配列番号１で示されるアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子は、脂肪組織において特異的に発現する。
よって、被検組織における該遺伝子の発現産物を検出す
ることにより、該発現産物の検出された組織を脂肪組織
であると同定し他の組織と識別することができる。該発
現産物としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有するｍＲＮＡ、または本発明蛋
白質を挙げることができる。

【０００６】（ｍＲＮＡを検出する本発明同定方法）ま
ず、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有するｍＲＮＡを検出する本発明同定方法につ
いて説明する。

【０００７】（ポリヌクレオチドの調製）配列番号１で
示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｍ
ＲＮＡは、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基
配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列のうちの１０塩基以上の部分塩基配列 （ｃ）配列番号２で示される塩基配列 （ｄ）配列番号２で示される塩基配列のうちの１０塩基
以上の部分塩基配列と被検組織とを接触させて、該ｍＲ
ＮＡと本ポリヌクレオチドとをハイブリダイスさせるこ
とによって検出することができる。本ポリヌクレオチド
としては、例えば、配列番号１のアミノ酸番号１〜２３
で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番
号１のアミノ酸番号１〜２３で示されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列の部分塩基配列、配列番号１のアミ
ノ酸番号１〜１６５で示されるアミノ酸配列をコードす
る塩基配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列、配列番号２の塩基番号１〜４０２で示
される塩基配列、配列番号２の塩基番号１〜４０２で示
される塩基配列の部分塩基配列、配列番号２の塩基番号
１〜８３０で示される塩基配列、配列番号２で示される
塩基配列等の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリ
ヌクレオチドを挙げることができる。ここで、配列番号
１のアミノ酸番号１〜２３で示されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列の部分塩基配列に相補的な塩基配列を
有するポリヌクレオチド、配列番号２の塩基番号１〜４
０２で示される塩基配列の部分塩基配列に相補的な塩基
配列を有するポリヌクレオチドとしては、例えば約10塩
基以上の、好ましくは約15塩基以上の、さらに好ましく
は約20塩基以上の鎖長を有するポリヌクレオチドを挙げ
ることができる。なお、ここでいうポリヌクレオチドと
は、DNAもしくはRNAを示し、当該DNAもしくはRNAは一本
鎖として存在しても良くまたはその塩基配列に相補的な
塩基配列を有するポリヌクレオチドとともに二本鎖を形
成していても良い。

【０００８】本ポリヌクレオチドは、例えば、J.Sambro
ok, E.F.Frisch, T.Maniatis著；モレキュラークローニ
ング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コー
ルドスプリング ハーバーラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載の通常の遺
伝子工学的方法に準じて調製することができる。即ち、
脂肪組織、例えばヒトの脂肪組織から調製されるｃDNA
もしくはゲノムDNAを鋳型とするPCRまたはハイブリダイ
ゼーションによって調製することができる。以下に一例
として、脂肪組織から調製されるｃDNAを鋳型とするＰ
ＣＲによって本ポリヌクレオチドを調製する方法を示
す。

【０００９】具体的には、まず全RNAを回収する。例え
ば、ヒトの脂肪組織の一部を液体窒素中で凍結させた
後、乳鉢などにより物理的に磨砕し、これに塩酸グアニ
ジンとフェノールとを含む溶液をもしくはSDSとフェノ
ールとを含む溶液を添加して全RNAを回収する方法、前
述の磨砕物にグアニジンチオシアネートを含む溶液を添
加して、さらにCsClを加え遠心分離することにより全RN
Aを沈澱させる方法等を用いればよい。該調製操作に
は、例えばISOGEN（ニッポンジーン社製）、RNeasy Tot
al RNA Purification Kit（QIAGEN社製）などの市販の
キットを用いることもできる。次いで、全RNAからmRNA
を調製する。例えば、セルロースまたはラテックスに結
合されたオリゴdT鎖とmRNAのポリA鎖とのハイブリダイ
ゼーションを利用した方法等を用いることができる。該
操作にはmRNA Purification Kit（アマシャムファルマ
シア社製）、OligotexTM−dT30〈Super〉（宝酒造社
製）の市販のキットを用いることができる。次いで、得
られたmRNAに、例えばオリゴdT鎖またはランダムプライ
マーをアニールさせた後に逆転写酵素を作用させること
により、 cDNAを作製することができる。またさらに、
例えばRNaseH、DNA PolymeraseIを作用させることによ
り、2本鎖cDNAを作製することができる。該操作にはSMA
RTTM PCR cDNA Synthesis Kit（クロンテック社製）、c
DNA Synthesis Kit（宝酒造社製）、cDNA Synthesis Ki
t（アマシャムファルマシア社製）を用いることができ
る。

【００１０】得られたcDNAを鋳型にして、例えば、配列
番号４で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドと
配列番号５で示される塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドとをプライマーとして用いて、例えば94℃、1分間、
次いで60℃、１分間、さらに72℃、2分間の保温を１サ
イクルとして、これを20から40サイクルＰＣＲを行うこ
とにより、配列番号２の塩基番号３３５〜１２７６で示
される塩基配列に相補的な塩基配列を有する本ポリヌク
レオチドを増幅することができる。また、例えば、配列
番号６で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドと
配列番号７で示される塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドとをプライマーとして用いて、前記と同じ条件でＰＣ
Ｒを行うことにより、配列番号２の塩基番号１〜１６５
４で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有する本ポ
リヌクレオチドを増幅することができる。また、例え
ば、配列番号２の塩基番号１２５３〜１２７２で示され
る塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号２の塩
基番号１５７４〜１５９３で示される塩基配列と相補す
る塩基配列を有するポリヌクレオチドとをプライマーと
して用いて、前記と同じ条件でＰＣＲを行うことによ
り、配列番号２の塩基番号１２５３〜１５９３で示され
る塩基配列に相補的な塩基配列を有する本ポリヌクレオ
チドを増幅することができる。さらに、配列番号2で示
される塩基配列に基いて適宜設計される一組のポリヌク
レオチドをプライマーとして用い同様にしてＰＣＲを行
うことによって、配列番号2で示される塩基配列に相補
的な塩基配列のうちの所望する一部分を有するポリヌク
レオチドを増幅することがきる。該PCRには、例えばAdv
antage cDNA PCR Kit（クロンテック社製）、TAKARA Ex
Taq（宝酒造社製）等を用いることができる。尚、上記
のようなプライマーに用いられるポリヌクレオチドの5
末端側に、制限酵素認識配列等を付加してもよい。上記
のようにして増幅された本ポリヌクレオチドは、通常の
方法に準じてベクターにクローニングすることができ
る。用いるベクターとしては例えば、pBlueScriptIIベ
クター（Stratagene社製）、pUC18/19ベクター（宝酒造
社製）、TAクローニングベクター（Invitrogen社製）等
が挙げられる。また、クローニングされた本ポリヌクレ
オチドの塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxa
m,A.M&W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560,
(1977)等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F.&
A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94,441, (1975)、Sanger,
F,& NicklenandA.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,74, 5463,(1977)等に記載される）等により解析する
ことができる。この際、例えば市販のTermo Seqenase I
I dye terminator cycle sequencing kit（アマシャム
ファルマシア社製）、Dye Terminator Cycle Sequencin
g FS Ready Reaction Kit（PEバイオシステムズジャパ
ン社製）等を用いることができる。

【００１１】また、別の一例として、脂肪組織から調製
されるcDNAを鋳型とするハイブリダイゼーションによっ
て本ポリヌクレオチドを調製する方法を示す。

【００１２】前記のようにして作製されたcDNAを、例え
ば、pUC118等のプラスミドベクター、λgt11等のファー
ジベクター等に挿入することによってcDNAライブラリー
を作製することができる。pUC118を用いる場合、HincII
等制限酵素で開裂したpUC118等と上記二本鎖ｃDNAとを
常法によりライゲーションし、得られたベクターを大腸
菌例えばE.coliJM109へ導入することによりcDNAライフ゛ラリー
を作製することができる。また、λgt11を用いる場合、
EcoRI 等制限酵素で開裂したλgt11と上記二本鎖ｃDNA
とを常法によりライゲーションし、得られたベクターを
大腸菌例えばE.coliJM109へ導入することによりｃDNAラ
イブラリーを作製することができる。

【００１３】次に、該ｃDNAライブラリーから本ポリヌ
クレオチドを含むクローンを選抜する。例えば、配列番
号２で示される塩基配列のうちの少なくとも一部分の塩
基配列を有するポリヌクレオチド、さらに具体的には、
配列番号２の塩基番号１２５３〜１５９３で示される塩
基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２の塩基番
号１〜４０２で示される塩基配列を有するポリヌクレオ
チド等を化学合成あるいは前記のPCR法により調製して
これを標識し、これをプローブに用いてハイブリダイゼ
ーションを行う。該プローブのラジオアイソトープによ
る標識には、例えば、Random Primed DNA Labelling Ki
t（ベーリンガー社製）、Random PrimerDNA Labelling
Kit Ver.2（宝酒造社製）等を用いることができる。ま
た、該プローブの蛍光標識には、例えば、ECL Direct N
ucleic Acid Labelling and Detection System（アマシ
ャムファルマシア社製）を用いることができる。cDNAラ
イブラリーがファージライブラリーの場合には、前記cD
NAをプラークとしてプレート上に発現させ、これらを例
えばナイロンフィルターHybond-N+（アマシャムファル
マシア社製）にブロッティングすればよい。得られたナ
イロンフィルターを用いて、前記の標識を行ったプロー
ブを用いてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダ
イゼーションの条件は用いるプローブによっても異なる
が、例えば450〜900mMの塩化ナトリウム、45〜90mMのク
エン酸ナトリウム、0.1〜1.0％のドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）および0〜200μg/mlの変性させた仔牛胸腺DNA
を含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリ
ビニルピロリドン等をそれぞれ0〜0.2%の濃度で含んで
いてもよいプレハイブリダイゼーション溶液、好ましく
は、900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウ
ム、1%のSDSおよび100μg/mlの変性させた仔牛胸腺DNA
を含むプレハイブリダイゼーション溶液を、前記ナイロ
ンフィルター1cm2当り50〜200μlの割合で準備し、該溶
液に前記ナイロンフィルターを浸して42〜68℃で1〜4時
間、好ましくは、55℃で2時間保温する。次いで、例え
ば、450〜900mMの塩化ナトリウム、45〜90mMのクエン酸
ナトリウム、0.1〜1.0％のSDSおよび0〜200μg/mlの変
性させた仔牛胸腺DNAを含み、場合によってはアルブミ
ン、フィコール、ポリビニルピロリドン等を0〜0.2%の
濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液、
好ましくは、900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸
ナトリウム、1%のSDSおよび100μg/mlの変性させた仔牛
胸腺DNAを含むハイブリダイゼーション溶液と前記の標
識したプローブ（ナイロンフィルター1cm2当り1.0×104
〜2.0×106cpm相当量）とを混合した溶液をナイロンフ
ィルター1cm2当り50〜200μlの割合で準備し、該溶液に
ナイロンフィルターを浸し42〜68℃で4〜20時間、好ま
しくは、55℃で16時間保温しハイブリダイゼーション反
応を行う。該ハイブリダイゼーションの後、ナイロンフ
ィルターを取り出し、15〜300mMの塩化ナトリウム、1.5
〜30mMのクエン酸ナトリウム、0.1〜1.0%のSDS等を含む
42〜68℃の洗浄溶液等、好ましくは、300mMの塩化ナト
リウム、30mMのクエン酸ナトリウムおよび1%のSDSを含
む55℃の洗浄溶液で、10〜60分間のナイロンフィルター
洗浄を1〜4回、好ましくは15分間の洗浄を2回行う。さ
らに、ナイロンフィルターを2×SSC溶液（300mM 塩化ナ
トリウム、30mM クエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ
のち乾燥させる。このナイロンフィルターを、例えば、
オートラジオグラフィー、イメージアナライザー（富士
フィルム社製）などに供して、用いたプローブがナイロ
ンフィルター上のｃＤＮＡとハイブリダイズしたことを
示すシグナルを検出することによって、本ポリヌクレオ
チドを含むクローンを選抜する。

【００１４】得られた本ポリヌクレオチドを含むクロー
ンを、例えばMolecular Cloning 2nd edition（J.Samb
rook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1989年）に記載の方法に準じてNZYM
液体培地（GIBCOBRL社製）で培養し、該培養液から、市
販のLambda-TRAP PLUS DNA Isolation Kit（Clontech社
製）等を用いてクローンの保有するファージのDNAを抽
出することができる。得られたファージDNAから、ベク
ターに挿入されたDNAを回収し、これをDNA調製や解析が
容易なベクター、例えば市販のpUC118ベクター（宝酒造
社製）、pUC119ベクター（宝酒造社製）、pBlueScriptI
Iベクター（Stratagene社製）等にサブクローニングす
るすることができる。ベクターにサブクローニングされ
たDNAの塩基配列は、前記と同様にして解析することが
できる。

【００１５】（本発明同定方法に使用されるプローブの
調製）次いで、本発明同定方法に使用するプローブを以
下のようにして調製することができる。RNAである本ポ
リヌクレオチドをもとにプローブを調製する場合には、
まず、例えば配列番号２で示される塩基配列もしくは配
列番号２で示される塩基配列の連続する一部分の塩基配
列を有するDNA等の本ポリヌクレオチドを、SP6RNAポリ
メラーゼプロモーター、T7RNAポリメラーゼプロモータ
ー、T3RNAポリメラーゼプロモーター等を持ったベクタ
ー（例えばStratagene社のBluescript、Promega社のｐG
EMなど）に組み込む。得られた組換えベクターを導入し
た宿主細胞、例えば大腸菌等を培養して得られる菌体か
ら、前記組換えベクターを調製することができる。次い
で、センスRNA（ネガティブコントロール用）、アンチ
センスRNA（ハイブリダイゼーション用）ができるよう
にベクターを制限酵素で切断する。得られたDNAを鋳型
とし、放射性標識の場合はα-³⁵Ｓ-UTP等、非放射性標
識の場合はディゴキシゲニンUTPあるいはフルオレセイ
ン修飾UTP等を基質として、SP6RNAポリメラーゼ、T7RNA
ポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼ等を用いて標識され
たRNAを合成することができる。該標識RNAをアルカリ加
水分解等によりハイブリダイゼーションに適したサイズ
に切断することによって、RNAプローブを調製すること
ができる。なお、これらの方法に基づいたキットとして
は、例えば、放射性標識用にはRNAラベリングキット
（アマシャム社製）が、非放射性標識用にはDIG RNAラ
ベリングキット（ベーリンガー・マンハイム社製）やRN
Aカラーキット（アマシャム社製）が市販されている。

【００１６】また、DNAである本ポリヌクレオチドを基
にプローブを調製する場合には、例えば、³²Ｐ等で標識
した放射性ヌクレオチドもしくはビオチン、ディゴキシ
ゲニンあるいはフルオレセインで標識したヌクレオチド
を、ニックトランスレーション法あるいはランダムプラ
イム法（Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd
ed.,10,6-10,12,Cold Spring Harbor Lab.1989）によっ
て取り込ませることによって、例えば配列番号２で示さ
れる塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２で
示される塩基配列の連続する一部分の塩基配列を有する
ポリヌクレオチド等の放射性もしくは非放射性物質で標
識された本ポリヌクレオチドを調製することができる。
これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射
性標識用にはニックトランスレーションキット（アマシ
ャム社製）やランダムプライマーDNAラベリングシステ
ム（アマシャム社製）が、非放射性標識用にはDIG DNA
標識キット（ベーリンガー・マンハイム社製）、DNAカ
ラーキット（アマシャム社製）等が市販されている。

【００１７】（ハイブリダイゼーションによる被検組織
中のｍRNAの検出）被検組織は、以下のようにして作製
される被検組織標本として本発明同定方法に使用するこ
とができる。被検組織標本の作製は、通常の方法、例え
ば、Heiles,H. et al., Biotechniques, 6, 978, (198
8)、遺伝子工学ハンドブック（羊土社）278 (1991)、細
胞工学ハンドブック（羊土社）214,(1992)、細胞工学ハ
ンドブック（羊土社）222,(1992)等に記載される方法に
準じて行うことができる。即ち、被検組織を3.7%ホルマ
リン液、100%メタノール、100%エタノール、4%パラホル
ムアルデヒド溶液、1%グルタールアルデヒド溶液等で固
定し、パラフィン等の包埋材に包埋した後、包埋された
被検組織の薄切切片を作製しスライドグラスに張り付け
ることにより、被検組織標本を得る。使用できる被検組
織としては、ヒト、マウス等の哺乳類から得られる筋肉
組織、腸管膜等の組織を挙げることができる。

【００１８】被検組織標本中から、使用されるプローブ
と非特異的に反応する物質を除去するために、被検組織
標本をプロテイナーゼＫ処理し、次いでトリエタノール
アミン等によりアセチル化する。該被検組織標本に、前
記のようにして調製されたプローブをハイブリダイズ
（例えば、該プローブを90℃で3分間加熱した後ハイブ
リダイゼーション溶液で希釈し、スライドグラス切片上
に滴下してフィルムでおおい、モイスチャーチャンバー
中で45℃、16時間保温することにより、ハイブリダイズ
させる。）させた後、非特異的吸着あるいは未反応プロ
ーブを洗浄等（RNAプローブを用いた場合はRNase処理も
加える）により除去する。ハイブリッドを各標識に応じ
た方法によって検出する。³⁵Ｓあるいは³²Ｐ等で標識し
た放射性プローブを用いる場合は、ハイブリダイズした
スライドグラス切片をエマルジョン（コダック社製NTB3
あるいはNTB10等）液に浸した後固化し、感光暗箱に入
れ4℃で2-5日感光させ、現像に続いてトルイジンブル−
染色することによりシグナルを検出する。ビオチン化ヌ
クレオチドで標識した非放射性プローブを用いる場合
は、ストレプトアビジンを介してビオチン化アルカリホ
スファターゼによる酵素標識後、基質であるニトロブル
ーテトラゾリウム（NBT）および５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルリン酸を加え、酵素反応による基質
の発色を顕微鏡観察して、ｍＲＮＡとハイブリダイズし
たプローブのシグナルを検出する。また、ディゴキシゲ
ニンあるいはフルオレセインで標識した非放射性プロー
ブを用いる場合は、アルカリホスファターゼ等の酵素で
標識した抗ディゴキシゲニン抗体あるいは抗フルオレセ
イン−アルカリホスファターゼ複合体を介して酵素標識
後、上記と同様に酵素反応による基質の発色を顕微鏡観
察して、ｍＲＮＡとハイブリダイズしたプローブのシグ
ナルを検出する。上記のようにすることによってシグナ
ルが検出された部位を脂肪組織と同定することができ
る。

【００１９】（本発明蛋白質を検出する本発明同定方
法）次に、本発明蛋白質を検出する本発明同定方法につ
いて説明する。

【００２０】（本発明蛋白質の製造）まず、本発明蛋白
質は、本ポリヌクレオチドである配列番号１で示される
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレ
オチドを利用することによって、通常の遺伝子工学的方
法、例えばJ.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著；モ
レキュラー クローニング第2版（Molecular Cloning 2
nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989
年等に記載の等に記載の方法に準じて製造することがで
きる。配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有する本ポリヌクレオチドが宿主細胞中で発
現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入され
てなる本発明形質転換体を培養して増殖させ、該本発明
形質転換体から本発明蛋白質を取り出すことができる。

【００２１】本発明蛋白質の製造に使用され得るベクタ
ーは、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的
に増殖できるものであって、配列番号１で示されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を有する本ポリヌクレオ
チドを発現ベクターに発現可能な形で挿入したベクター
であればよい。また、宿主細胞からの単離・精製が容易
であり、検出可能なマーカーをもつことが望ましい。な
お、発現ベクターは各種のものが既に市販されており、
これに該本ポリヌクレオチドを導入するために用いられ
る発現ベクター切断用制限酵素も市販されている。例え
ば、大腸菌での発現には、lac,tac,trpなどのプロモー
ターを含む発現ベクター（これらは、発現ベクターとし
てあるいはプロモーターカートリッジとしてファルマシ
アＰＬ社より市販されている）を用いることができる。
さらには該本ポリヌクレオチドを挿入する部位の上流に
リボゾーム結合領域を連結することにより、より高発現
が可能となる場合がある。リボゾーム結合領域としては
Guarente.Lら（Cell 20 p543(1980)） の報告や谷口ら
（Genetics of Industrial Microorganisms p202 (198
2) 講談社）の報告に記載のリボゾーム結合領域を使用
することができる。使用される宿主細胞としては、大腸
菌等の原核微生物由来の細胞、酵母等の真核微生物由来
の細胞、哺乳類、昆虫等の動物等由来の細胞を挙げるこ
とができる。該宿主細胞に上記組換えベクターを通常の
遺伝子工学的方法を用いて本発明形質転換体を作製する
ことができる。本発明形質転換体の製造は、通常の方法
に準じて、以下のようにすればよい。例えば、宿主細胞
が大腸菌等の原核微生物由来の細胞、酵母等の真核微生
物由来の細胞である場合、適当な炭素源、窒素源および
ビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養すれば
よい。固体培養、液体培養のいずれでも可能であるが、
好ましくは、液体培地を用いる通気撹拌培養法をあげる
ことができる。また、例えば宿主細胞がヒト等の哺乳
類、昆虫等の動物由来の細胞である場合、炭素源、窒素
源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で液
体培養を行えばよい。本発明形質転換体からの本発明蛋
白質の調製は、適宜通常の蛋白質の単離・精製方法を組
み合わせて実施すれば良く、例えば、前記培養により得
られた遺伝子組換体を遠心分離等で集め、破砕または溶
菌せしめ、イオン交換，疎水，ゲルろ過等の各種クロマ
トグラフィーを用いた工程を組み合わせて精製すれば良
い。さらに必要であれば、蛋白質の高次構造を復元する
操作、例えばリフォールディング等の操作を行ってもよ
い。

【００２２】（本発明蛋白質の検出方法または定量方
法）被検試料中に含まれる本発明蛋白質は、後述する本
発明抗体を用いて、通常の免疫学的方法、例えば細胞工
学ハンドブック，羊土社，207,(1992)等に記載のイムノ
ブロット法、免疫沈降による分離法、間接競合阻害法
（ELISA 法）等の方法に準じて検出または定量すること
ができる。該被検試料は、例えば体液、筋肉組織等の組
織、培養細胞等の生体試料から、通常の方法、例えば、
Heiles,H. et al., Biotechniques, 6, 978, (1988)、
遺伝子工学ハンドブック 羊土社 278 (1991)、細胞工
学ハンドブック，羊土社，214,(1992)、細胞工学ハンド
ブック，羊土社，222,(1992)等に記載される方法に準じ
て調製することができる。例えば筋肉組織等の組織の場
合、該組織をホモジネイザー、超音波、浸透圧ショック
などにより破砕し、これを被検試料とすることができ
る。必要に応じてデオキシコール酸ナトリウム、トリト
ンX100などの界面活性剤を添加する可溶化処理を行って
もよい。

【００２３】（本発明抗体の作製）本発明抗体は、本発
明蛋白質を特異的に認識し結合する能力を有していれば
よい。本発明抗体の調製には、例えば前記のようにして
精製される本発明蛋白質を抗原として用いることができ
る。あるいは本発明蛋白質のアミノ酸配列のうち特有な
部分アミノ酸配列を含む抗原性ペプチドを高分子量化す
る方法または直接もしくはスペーサーを介して間接的に
高分子量担体分子に結合させる方法によって得られる複
合体を抗原として用いることもできる。前記抗原性ペプ
チドは、たとえば、抗ペプチド抗体実験プロトコール
（秀潤社刊）に記載の蛋白質中のエピトープ予測法を用
いて得ることができる。該抗原性ペプチドとしては、通
常、10〜20個のアミノ酸から成るペプチドを用いればよ
い。また、純度の高いものが好ましく、高速液体クロマ
トグラフィー等の通常の方法により精製することができ
る。該抗原性ペプチドを高分子量化する方法としては、
例えばTamらの考案したMAP(Multuple antigen peptide)
法(Proc. Natl.Acad.Sci. USA, vol.85, p.5409, 1988)
がある。枝分かれしたリジン残基が結合した状態のMAP
用樹脂（NOVA-BIO CHEM社製）等が市販されているの
で、これに前記抗原性ペプチドの各アミノ酸を、通常の
ペプチド合成方法で順次結合させてペプチド鎖を伸長さ
せれば良い。前記抗原性ペプチドを直接またはスペーサ
ーを介して間接的に高分子量担体分子に結合した複合体
を得るばあい、該抗原性ペプチドを結合するのに用いら
れる高分子量担体分子は、抗原性ペプチドまたはスペー
サーに結合させた抗原性ペプチドとの連結に利用可能な
反応基、例えば反応性アミノ基を有し、かつ連結される
ことにより抗原性ペプチドに免疫原性を付与し得るか、
もしくは既に存在する免疫原性を高め得る担体分子であ
ればよい。高分子量担体分子としては、例えば、分子量
が約１万〜約１５万のリジンに富む蛋白質等をあげるこ
とができ、具体的には、ウシ血清アルブミン（BSA：分
子量 66200)、ヒト血清アルブミン（HSA：分子量 5800
0)、ウサギ血清アルブミン（RSA：分子量 68000)、ヤギ
血清アルブミン（GSA：分子量 68000)またはキーホール
カサガイヘモシアニン（KLH：分子量＞1000000)等があ
げられる。

【００２４】前記抗原を用いて、例えば、マウス、ハム
スター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ
等の哺乳動物を免疫するには、例えば、J. ASSOC. OFF.
ANAL. CHEM. 70(6) 1025-1027 (1987) 等に記載される
W.H.Newsome 等の通常の免疫の方法を用いて行うことが
できる。抗原は、１回または複数回、好ましくは3〜６
回投与することができる。複数回投与する場合、例えば
7〜30日、好ましくは12〜16日間隔で投与するのがよ
い。抗原の投与量は、１回につき、例えば約0.05mg〜約
2mg程度、好ましくは約0.1mg〜約1mg程度であればよ
い。最初の抗原投与の後２回目の抗原投与の前に、該哺
乳動物の血液を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体
価を測定することによって、抗体価の上昇を確認してお
くのがよい。投与経路としては、皮下投与、皮内投与、
腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を選択するこ
とができ、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に行われうる
注射による投与が好ましい。さらに皮下注射と腹膜腔内
注射とを組合せた投与が特に好ましい。なお抗原は、適
当な緩衝液、例えばナトリウム系リン酸緩衝液、生理食
塩水等に溶解して用いられるが、投与経路や条件等によ
っては、RAS［MPL (Monophosphoryl Lipid A) TDM (Sy
nthetic Trehalose Dicorynomycolate) + CWS (Cell Wa
ll Skeleton) アジュバントシステム］、水酸化アルミ
ニウム等の通常用いられるアジュバントを使用すること
もできる。ここでアジュバントとは抗原とともに投与し
たとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強す
る物質を意味する。最後の抗原投与の約1〜約2週間後に
免疫された前記哺乳動物から通常の方法により血液を採
取して、該血液から、例えば遠心分離、硫酸アンモニウ
ムまたはポリエチレングリコールを用いることによる分
画、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロ
マトグラフィー等の通常の方法を適宜組み合わせて行う
ことによって本発明抗体を分離・精製することができ
る。また、上記の免疫感作した哺乳動物から免疫適格Ｂ
細胞を単離し、該免疫適格Ｂ細胞を連続的に細胞分裂し
得る腫瘍細胞と融合し、所望の抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞をクローン化することができる。該ハイブリ
ドーマ細胞を試験管内または生体内で培養することによ
り、高度の特異性および親和性を有する本発明抗体であ
るモノクローナル抗体を製造することもできる。

【００２５】（被検組織における脂肪組織中の本発明蛋
白質の検出）前記のようにして作製された本発明抗体と
被検組織とを接触させることによって、被検組織におけ
る脂肪組織中の本発明蛋白質を検出することができる。
具体的には、例えば、本発明抗体（以下、第一抗体と記
す。）を標識した後、これと被検組織とを接触させて、
被検組織における脂肪組織中の本発明蛋白質を特異的に
認識し結合させることによって検出してもよく、あるい
は、第一抗体と被検組織とを接触させた後、第一抗体を
特異的に認識し結合しうる抗体（以下、第二抗体と記
す。）を標識し、これと被検組織とを接触させて、被検
組織における脂肪組織中の本発明蛋白質を検出してもよ
い。以下に、さらに説明する。

【００２６】被検組織は、以下のようにして作製される
被検組織標本として本発明同定方法に使用することがで
きる。被検組織標本の作製は、通常の方法、例えば、He
iles,H. et al., Biotechniques, 6, 978, (1988)、遺
伝子工学ハンドブック 羊土社 278 (1991)、細胞工学
ハンドブック，羊土社，214,(1992)、細胞工学ハンドブ
ック，羊土社，222,(1992)等に記載される方法に準じて
行うことができる。即ち、被検組織を3.7%ホルマリン
液、100%メタノール、100%エタノール、4%パラホルムア
ルデヒド溶液、1%グルタールアルデヒド溶液等で固定
し、パラフィン等の包埋材に包埋した後、包埋された被
検組織の薄切切片を作製しスライドグラスに張り付ける
ことにより、被検組織標本を得ることができる。標識さ
れた第１抗体を利用する方法では、被検組織標本を約30
分間から約24時間、4℃で、標識された第１抗体ととも
にインキュベートすることによって、該被検組織標本中
に存在する本発明蛋白質を認識し結合させた後、遊離の
状態にある第１抗体を洗浄によって除去する。該第１抗
体が、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリン
エステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナー
ゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等
の酵素等で標識されている場合には、本蛋白質に結合し
た第一抗体に標識酵素の基質を作用させて、発色等を測
定することによって第一抗体を検出することができる。
例えば、ペルオキシダーゼで標識される場合には、基質
としての過酸化水素、および発色試薬としてのジアミノ
ベンジジンもしくはＯ−フェニレンジアミンを組み合わ
せて褐色または黄色を生じさせることができる。また、
例えば、グルコースオキシダーゼで標識される場合に
は、基質として、例えば２，2'−アシド−ジ−（３−エ
チルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ABTS）等を用
いることができる。第一抗体および標識された第二抗体
を使用する方法の場合には、被検組織標本を約30分間か
ら約24時間、4℃で、第一抗体とともにインキュベート
した後、遊離の状態にある第一抗体を洗浄によって除去
する。次いで、標識された第二抗体とインキュベートさ
れる。第二抗体としては、第１抗体に対する抗体をあげ
ることができ、具体的な例としては、第１抗体としてウ
サギ抗血清を使用する場合、抗ウサギ免疫グロブリン
（IgG）ヤギ免疫グロブリン（IgG）を好ましくあげるこ
とができる。第２抗体の標識には、例えばペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭
酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾ
チーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコール−６−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ等の酵素を用いることが
できる。なお、ペルオキシダーゼを結合したウサギIgG
ヤギIgGはDAKO社等から市販されており、容易に入手可
能である。第二抗体の検出には、上記の標識された第１
抗体を検出する場合と同様な方法をあげることができ
る。以上のようにして、脂肪組織中の本蛋白質に結合し
た第一抗体もしくは第二抗体を発色により検出すること
によって、被検組織における脂肪組織を同定し、他の組
織と識別することができる。

【００２７】

【実施例】本発明を更に以下の実施例で説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。

【００２８】実施例１ （ヒト脂肪組織からの全RNAの
抽出） ヒト脂肪組織20gを、PBS（0.1Mリン酸緩衝液，ｐH7.0）
で洗浄した後、20mlのTRIzol（GIBCO BRL社製）に懸濁
した。これをglass-Teflonホモゲナイザー（POLITRON
CH6010型 KINEMATIKA社製）にてホモゲナイズし、室温
にて5分間放置した。この液に1/5容量のクロロホルムを
加え、Vortexミキサーにて混合した後、遠心分離（1200
0xｇ，15分間 ,4℃）を行った。上層を別のチューブに
移し、該上層と同量のイソプロピルアルコールを加え室
温にて10分放置した後、遠心分離（12000xｇ，10分間 ,
4℃）を行った。得られた沈殿を、75%(v/v)エタノール
で洗浄し、風乾した後、diethyl pyrocarbonate（DEP
C)水溶液で溶解し、全RNAを抽出した。

【００２９】実施例２ （cDNAライブラリーの作製） 実施例１で得られた全RNAから、Oligotex-ｄT super
（宝酒造社製）によりpolyARNAを調製した。得られたpo
lyARNAを0.3M酢酸ナトリウムを含有する70％エタノール
中で沈殿させ、蒸留水で溶解した。polyARNA 2μｇ相
当を含有する水溶液 25μｌを、第１鎖合成のため10分
間76℃で加熱変性した後、反応緩衝液（50mM Tris-HCl
(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂、10mM DTT）、0.5mM dN
TPおよび25μｇ／mlオリゴdT存在下で200ユニットの逆
転写酵素MMLV-H-RT（東洋紡社製）を添加し、37℃で30
分間インキュベートした後、反応チューブを氷上に移す
ことにより反応を停止した。次に第２鎖の合成は、この
反応液に、20mM Tris-HCl(pH7.5)、4mM MgCl₂、10mM 硫
安、100mM KCl、50μｇ／mlBSAおよび250μＭ βNADを
含む反応緩衝液 100μｌ、0.5mM dNTP 10μｌ、E.coli
リガーゼ（宝酒造社製）15ユニット、E.coliポリメラー
ゼ（宝酒造社製）40ユニット、およびE.coli RNaseH
（ファルマシア社製）1.5ユニットを添加し、これを16
℃で2時間反応させた。該反応液から、フェノールクロ
ロフォルム抽出、エタノール沈殿によって二本鎖ｃDNA
を得た。該二本鎖ｃDNAに、50mM Tris-HCl(pH8.0),5mM
MgCl₂および0.5mMdNTPを含む反応緩衝液 100μlおよび
E.coliポリメラーゼ（宝酒造社製）5ユニットを添加
し、37℃で5分間反応した。続いて、得られた反応液か
らフェノールクロロフォルム抽出、エタノール沈殿によ
り該二本鎖ｃDNAを回収し、これに、20mM Tris-HCl(pH
7.5)、4mM MgCl₂、1mM DTTおよび1mM ATPを含む反応緩
衝液 100μｌおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製）10ユニットを添加し、37℃で30分間反応させ
た。さらに該反応液をフェノールクロロフォルム抽出、
エタノール沈殿により該二本鎖ｃDNAを回収し、これを
プラスミドベクターpUC19HincII/BAP処理済（宝酒造社
製）50ｎｇとともにライゲーションキット（宝酒造社
製）を用いて16℃で2時間反応させることによりプラス
ミドベクターpUC19に挿入し、該ベクターを大腸菌JM109
に形質転換し、cDNAライブラリーを作製した。

【００３０】実施例３ （ベクターの調製） 実施例２で得られたcDNAライブラリーのcDNAクローンを
LB（トリプトン1％(W/V)、酵母エキス0.5％(W/V)、NaCl
0.5％(W/V)）にアンピシリンを終濃度50μｇ／ｍｌにな
るように添加した培地３ｍｌを用いてそれぞれ培養し、
各菌体を調製した。得られた菌体から、FlexPrep Kit
（ファルマシア社製）を用いてそれぞれベクターを調製
した。

【００３１】実施例４ （ノザンハイブリダイゼーショ
ン） 実施例１で調製したヒト脂肪組織全RNA20μｇを1.2%変
性アガロースゲル電気泳動で分画し、10ｘSSC（1.5M塩
化ナトリウム、300mMクエン酸ナトリウム）中、キャピ
ラリーブロッティング法でナイロンフィルターHybond-N
（アマシャム社製）にブロッティングした。ブロッティ
ング後、フィルターを風乾し、80℃で2時間ベーキング
することによってDNAを固定した。このフィルターおよ
びヒト組織ＲＮＡブロット（Multipul Tissue Northern
(MTN) Blots Clontech社製）をハイブリダイゼーション
液（DIG-EASYHYB ベーリンガーマンハイム社製）に浸し
て、40℃で1時間保温した。実施例3で得られたベクター
をそれぞれ鋳型にして、〔α−³²Ｐ〕dCTPを用いたラン
ダムプライム法によりラベル化したプローブを調製し
た。これらのプローブ300万cpm分、10mlのハイブリダイ
ゼーション液およびフィルターをそれぞれハイブリバッ
クに封入し、40℃で1晩保温した。ハイブリダイゼーシ
ョン後、2xSSC/0.1%SDS中25℃で10分洗浄した。この洗
浄を２回繰り返し、さらに0.1xSSC/0.1%SDS中で50℃で2
0分洗浄した。フィルターをイメージングプレートで15
時間露光後、BAS2000（富士フイルム社製）を用いて解
析し、図２に示したように脂肪組織特異的に高発現して
いるクローンを選抜し、これを、プラスミドpP1D8（図
１参照）と命名した。

【００３２】実施例５ （挿入ポリヌクレオチドの塩基
配列の決定） 該プラスミドpP1D8の挿入ポリヌクレオチドの塩基配列
を、Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit 及びTaq Dy
e Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied B
iosystems 製) を用いてApplied Biosystems製の373Ａ
ＤＮＡ Sequencerにより解析した結果、配列番号３で
示される塩基配列（340塩基）を有していることがわか
った。

【００３３】実施例６ （ヒト脂肪組織cDNAライブラリ
ーのスクリーニング） （１）スクリーニング用フィルターの作製 LB（トリプトン 1％(W/V)、酵母エキス 0.5％(W/V)、Na
Cl 0.5％(W/V)）に、10mM MgSO₄および2％寒天を添加し
て作製したプレートに、50000pfuのヒトfatcDNAライブ
ラリー（Clontech社製）ファージを蒔き、37℃で8時間
培養した。このプレートを4℃に冷やした後、表面にニ
トロセルロースフィルター（Colony/PlaqueScreen デュ
ポン社製）を1分間密着させて、ファージをフィルター
に吸着させた。次にフィルターをアルカリ処理（0.5N N
aOH、2分ｘ2回）してファージを溶解させ、中和処理
（１M Tris-HCl pH8.0、２分ｘ2回）を行った後、風乾
し2分間UV照射することによりDNAをフィルターに固定し
た。

【００３４】（2）プラークハイブリダイゼーション 上記のようにして作製したフィルターをハイブリバック
に入れ、ハイブリダイゼーション液（DIG-EASYHYB ベー
リンガー社製）を入れて、40℃で１時間保温し、プレハ
イブリダイゼーションを行った。一方、実施例４で得ら
れたプラスミドｐP1D8を鋳型にして、〔α−³²Ｐ〕dCTP
を用いたランダムプライム法によりラベル化したプロー
ブを調製した。このプローブ300万cpm、ハイブリダイゼ
ーション液10mlおよび前記フィルターをハイブリバック
に封入し、40℃で1晩保温した。ハイブリダイゼーショ
ン反応後、2xSSC/0.1%SDS中25℃で10分洗浄した。この
洗浄を２回繰り返し、さらに0.1xSSC/0.1%SDS中で50℃
で20分洗浄した。フィルターをイメージングプレートで
15時間露光後、BAS2000（富士フイルム社製）を用いて
解析した。シグナルが検出された位置に相当する寒天を
5mm角にプレートからくり抜き、50μlのSMバッファーに
浸して、ファージを溶出させた。このファージ懸濁液２
枚の新しいプレートに1プレート当たり数百pfuのファー
ジを蒔き、37℃で8時間培養した。（１）の記載と同様
にしてフィルターを作製し、同様にしてハイブリダイゼ
ーションを行い、ポジティブシグナルをイメージアナラ
イザーで検出するファージクローン株の単離を行った。
さらに上記と同様にしてもう一度単離操作を繰り返し
た。このファージクローンよりJ.Sambrook,E.F.Frisch,
T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Mo
lecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング
ハーバー ラボラトリー（Cold Spring HarborLabora
tory）発行、1989年等記載の方法でファージＤＮＡを調
製し、1.6Kbpの挿入部分をpUC19へライゲーションし、
プラスミドｐUCP1D8を得た（図3参照）。

【００３５】実施例７ （ポリヌクレオチドの塩基配列
の決定） 実施例６で得られたプラスミドｐUCP1D8の挿入ポリヌク
レオチドの塩基配列を、Taq Dye Primer Cycle Sequenc
ing Kit 及びTaq Dye Deoxy Terminator CycleSequenci
ng Kit (Applied Biosystems 製) を用いてApplied Bio
systems製の373A DNA Sequencerにより解析した結果、
配列番号２で示される塩基配列（1654塩基）からなるこ
とがわかった。また、配列番号３で示される塩基配列を
含んでいた。オープンリーディングフレームを検索した
結果、配列番号２の塩基番号335番から1279番目まで
が、オープンリーディングフレームであることが判明し
た。このオープンリーディングフレームは942塩基から
なり、配列番号１で示される314個のアミノ酸残基から
なる分子量35220の本発明蛋白質をコードしていること
がわかった。

【００３６】実施例８ （本発明蛋白質の相同性） 実施例７で決定された本発明遺伝子の塩基配列およびこ
れにコードされている本発明蛋白質のアミノ酸配列を、
データベースEMBLおよびNBRFで検索した。その結果本発
明蛋白質のアミノ酸配列はヒトガレクチン８（Accessio
n No.000214）と約30％の相同性を示した。

【００３７】実施例９ （in situハイブリダイゼーシ
ョン法） ヒト組織片を、氷冷した4％(w/v)のパラホルムアルデヒ
ドを含むPBS緩衝液（130mM NaCl、7mM Na2HPO₄および3m
M NaH₂PO₄を含む）を用いて、4℃で6時間浸漬し固定す
る。該固定組織片を30%(w/v) sucrose/PBS緩衝液に移
し、4℃で4時間ゆっくり振盪する。該固定組織片を、液
滴を除去した後、包埋材（O.C.T.compoundMiles社製）
に入れ、軽くかき混ぜる。包埋された該固定組織片をド
ライアイス／エタノールで急速凍結した後、クリオスタ
ットを用いて固定組織片から凍結切片を作製する。凍結
切片をゼラチンコートしたスライドグラスに張り付け、
直ちにドライヤーの温風にさらして乾燥させる。37℃で
1時間風乾後、45℃で2時間乾燥することによって被検組
織標本を得る。実施例６で得られたプラスミドｐUCP1D8
を制限酵素 EcoRIおよびHindIIIで切断後、1.5Kbpの断
片を調製する。次いでこの断片を1%(w/v) SDSおよび200
μｇ/mlプロテイナ−ゼＫを含む溶液200μｌ中、37℃で
30分間処理する。これに5M NaCl溶液を20μｌ加えた
後、フェノール／クロロフォルム抽出を行い、続いてエ
タノール沈澱を行う。風乾後、TE溶液（10mM Tris-HCl
(pH8.0)、0.1mM EDTA）に溶解し、これをテンプレート
とする。DIG RNAラベリングキット（ベーリンガー社
製）を用いて、テンプレート１μｌに、NTPラベリング
ミックス2μｌ、RNaseインヒビター20units、およびRNA
ポリメラーゼ40unitsを添加し、37℃で2時間反応を行
う。つづいて、該反応液に前記キット添付のRNaseフリ
ーtRNA10μｇ，RNaseフリーDNase30unitsを加え、37℃1
0分間反応し、テンプレートDNAを除去する。該反応液に
エタノールを添加して、得られる沈澱を乾燥後、10mM D
TT溶液50μｌに溶かす。この溶液に前記キット添付の加
水分解緩衝液（80mM NaHCO3, 120mM Na₂CO₃, 10mM DTT
を含む）５０μｌを加え、60℃で20分間加水分解する。
反応終了後、エタノールを添加して、沈殿物としてプロ
ーブを得る。前記被検組織標本を、0.35%(w/v)トリトン
ーX（5分間）、PBS（5分間、3回）、0.2N HCl（120分
間）、1μｇ／ml プロテイナーゼＫ（37℃、5分間）、
ＰＢＳ（５分間、３回）、4%(w/v) パラホルムアルデヒ
ド（5分間）、2mg/mlグリシン（15分間、2回）および50
%(w/v) 脱イオン化ホルムアミド（1時間）に、この順で
浸して前処理を行う。85℃で保温したハイブリダイゼー
ション溶液［50%ホルムアミド、10mM Tris-HCl(pH7.
6)、1mM EDTA、600mM NaCl,10mM DTT、1xデンハルト
（0.02%(W/V)フィコール、 0.02%(w/v)ポリビニルピロ
リドン、0.02%(w/v)ウシ血清アルブミン）、0.25%(w/v)
SDS、10%(w/v) Dextransulfateおよび200μｇ/ml E.co
li tRNAを含む］で100倍に希釈した前記プローブを、前
処理された被検組織標本上に滴下した後、これをパラフ
ィルムでおおい、50℃で16時間保温する。次いで、1)2x
SSC.50%ホルムアミド(v/v),50mMDTT,50℃、30分間、2)1
0mMTris-HCl(pH7.6),500mMNaCl,1mMEDTA,37℃、15分
間、3)10mMTris-HCl(pH7.6)、500mMNaCl、1mMEDTA、25
μ/mlRNaseA 37℃、30分間、4)10mMTris-HCl)pH7.6), 5
00mMNaCl,1mMEDTA37℃、10分間、5)2xSSC 50℃、20分間
2回、6)0.2xSSC 50℃、20分間2回に、この順で浸漬し洗
浄する。さらに、1)DIG緩衝液１（100mMTris-HCl(pH7.
5),150mMNaCl） 2分間、2)1.5%ブロッキング液（ベー
リンガー社製）60分間、3)DIG緩衝液で5000倍希釈したa
nti-DIGアルカリフォスファターゼ−ディゴキシゲニン
抗体を添加し、30分間、4)DIG緩衝液1で15分2回洗浄す
る、5)DIG緩衝液3（100mMTris-Hcl(pH9.5),100mMNaCl,5
0mMMgCl₂）で5分間洗浄し、6)337.5μｇ/ml NBTを添加
し、37℃、1時間発色させる、7)10mMTris-HCl(pH7.5),1
mMEDTA溶液で反応を停止する、の操作をこの順で行う。
以上の処理によって、脂肪組織のみが選択的に着色され
ることによって、顕微鏡観察下、ヒト組織片の脂肪組織
を同定することができる。

【００３８】実施例10 （抗原の調製） 実施例6で作製したプラスミドpUCP1D8を鋳型にして、配
列番号4で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ドおよび配列番号5で示される塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いて、94℃、1分
間、次いで60℃、１分間、さらに72℃、2分間の保温を
１サイクルとして、これを30サイクル行う条件下でPCR
を行ったのち増幅されたＤＮＡをNdeIとBamHIで消化
し、発現ベクターpET3a（Novagen社製）のNdeI-BamHIサ
イトにサブクローニングし、発現プラスミドpET3a-P1D8
（図４参照）を得た。次に、pET3a-P1D8で大腸菌DE3株
（Novagen社製）を形質転換し、本発明形質転換体を得
た。該形質転換体を、LB培地にて、37℃でOD600が0.6に
なるまで培養し、誘導剤として終濃度が1mMになるよう
にIPTGを添加し、さらに一晩培養した。次いで、遠心分
離操作により集菌し、得られる菌体を100mM Tris-HCl
（pH7.6）、5mM EDTA・2Na、5mM DTT、および1mM PMSFを
含むバッファー（以下、バッファーAと記す。）に懸濁
して、超音波処理（氷冷下、5分間ｘ3回）して菌体を破
砕した。この破砕液を12,000ｘg、15分間、4℃の遠心分
離に供し、沈殿を回収して封入体画分とした。該封入体
画分に、バッファーAに尿素を終濃度2Mとなるように加
えた溶液を添加し、懸濁後、超音波処理（氷冷下、5分
間）を行う。この液を遠心分離（12,000ｘg、15分間、4
℃）して沈殿を得る。得られた沈殿に、バッファーAに
尿素を終濃度4Mとなるように加えた溶液を添加して、上
記の懸濁、超音波処理および遠心分離の各操作を再度行
い、沈殿を得る。さらに、得られた沈殿に、バッファー
Aに尿素を終濃度6Mとなるように加えた溶液を添加し
て、上記の懸濁、超音波処理および遠心分離の各操作を
再度行い、沈殿を得る。得られた沈殿を20ｍＭ Tris-HC
l（pH8.5）、2mM DTTおよび8M尿素を含むバッファーに
懸濁し、遠心分離（12,000ｘg、15分間、4℃）を行い、
上清を分取する。得られた上清を、HiLoad Superdex 20
0pg（ファルマシア社製）を用いたゲルろ過クロマトグ
ラフィー、およびMonoQ HR10/10を用いたイオン交換ク
ロマトグラフィー（ファルマシア社製）を行い、SDS-PA
GEにて分析することにより約３５ｋＤａのバンドが見出
される本発明蛋白質を含む画分を集める。該画分をセン
トリコン（グレースジャパン社、分画分子量30,000）を
用いて、本発明蛋白質濃度が1mg／mlになるように濃縮
する。このようにして調製された画分に、100mM Tris-H
Cl（pH8.5）を、尿素の終濃度が6Mとなるようにゆるや
かに攪拌しながら添加し、さらに、室温で一晩、緩やか
に攪拌する。次いで、該画分を18,000ｘg、20min、4℃
にて遠心分離して上清を回収し、これに、2M尿素、20mM
Tris-HCl（pH8.5）、4mM還元型グルタチオンおよび0.4
mM酸化型グルタチオンを含む溶液を尿素の終濃度が2.5M
となるように加えて緩やかに攪拌する。この溶液を分画
分子量が25,000の透析チューブに入れ、1000倍容量の2M
尿素、20mM Tris-HCl（pH8.5）、4mM還元型グルタチオ
ンおよび0.4mM酸化型グルタチオンを含む溶液に対し
て、4℃で約8時間透析する。次に、1000倍容量の20mM T
ris-HCl（pH8.5）、2mM還元型グルタチオンおよび0.2mM
酸化型グルタチオンを含む溶液に対して、4℃で一晩透
析し、最後に、1000倍容量の20mM Tris-HCl（pH8.5）に
対して4℃で一晩透析する。

【００３９】実施例１１ （哺乳動物の免疫感作化工程
および本発明抗体取得工程） 実施例10の方法で調製された蛋白質を抗原として、ウサ
ギに投与し、抗体を取得する。初回の投与は、抗原1.0
ｍｇをキャリアータンパク（PIERCE社製）と混合し、ウ
サギの皮下に投与する。以後2週間ごとに４回、同様の
方法で抗原を投与する。さらに1週間後、該ウサギの血
清を耳静脈から少量サンプリングし、抗体価を測定す
る。その後さらに1回、抗原の投与を行い、１週間後、
該ウサギから血液を採取する。該血液を遠心分離（3000
xg、10分間）することにより血清画分を取得する。該画
分を100倍容量の50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH
7.0）に対して4℃で一晩透析し、透析した血清をProtei
nA(ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに供
する。該カラムを50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH
7.0）で充分洗浄した後、100mMクエン酸バッファー（pH
4.0）で吸着画分を溶出し、溶出液に直ちに1M Tris-HCl
（pH9.0）を添加して中和して、ポリクローナル抗体液
を得る。

【００４０】実施例１２ （本発明抗体を用いたイムノ
ブロット法による脂肪組織の検出） ヒト組織片を、氷冷した4％(w/v)のパラホルムアルデヒ
ドを含むPBS緩衝液（130mM NaCl、7mM Na₂HPO₄および3m
M NaH₂PO₄を含む）を用いて、4℃で6時間浸漬し固定す
る。該固定組織片を30%(w/v) sucrose/PBS緩衝液に移
し、4℃で4時間ゆっくり振盪する。該固定組織片を、液
滴を除去した後、包埋材（O.C.T.compoundMiles社製）
に入れ、軽くかき混ぜる。包埋された該固定組織片をド
ライアイス／エタノールで急速凍結した後、クリオスタ
ットを用いて固定組織片から凍結切片を作製する。凍結
切片をゼラチンコートしたスライドグラスに張り付け、
直ちにドライヤーの温風にさらして乾燥させる。37℃で
1時間風乾後、45℃で2時間乾燥することによって被検組
織標本を得る。該被検組織標本を、0.05%(V/V)Tween20
を含む TBS溶液〔20mM Tris-HClおよび500mM NaClを含
む。〕で軽く洗浄した後、３％(w/v) スキムミルク（森
永乳業社製）を含むTBS 溶液で１時間、室温下でインキ
ュベートする。次いで、被検組織標本を、0.1%(V/V)のT
ween20 を含む TBS溶液で軽く洗浄した後、実施例11で
得られたポリクローナル抗体液を１％(w/v)BSAを含むTB
S 溶液で200倍に希釈した液（第１抗体調製液）5ml中
に、10時間、4℃でインキュベートする。次いで、被検
組織標本を0.1%(V/V)Tween20 を含むTBS 溶液で3回（各
10分間）洗浄した後、「ペルオキシダーゼ(HRP) を結合
したロバ抗ウサギ免疫グロブリン」（IgG、アマシャム
社製）を3%(w/v) スキムミルク（森永乳業社製）を含む
TBS 溶液で5000倍に希釈した溶液（第２抗体調製液）20
ml中に、30分間、室温下でインキュベートする。を0.1%
(V/V)Tween20 を含む TBS溶液で15分間で1回、5分間ず
つ4回洗浄した後、ECL 発色キット（アマシャム社製）
を用いて発色反応を行う。顕微鏡観察によって被検組織
標本における脂肪組織中の本発明蛋白質を検出すること
によって脂肪組織を同定する。

【００４１】

【発明の効果】本発明により、脂肪組織の同定方法等が
提供可能となる。

【００４２】「配列表フリーテキスト」 配列番号４ ＰＣＲのために設計されたポリヌクレオチドプライマー 配列番号５ ＰＣＲのために設計されたポリヌクレオチドプライマー 配列番号６ ＰＣＲのために設計されたポリヌクレオチドプライマー 配列番号７ ＰＣＲのために設計されたポリヌクレオチドプライマー

【００４３】

【配列表】 <110> Sumitomo Chemical Co. Ltd. <120> Detection method of adipose tissue <130> P151214 <160> 7 <210> 1 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Pro Gly Glu Lys Leu Asp Pro Ile Pro Asp Ser Phe Ile Leu 1 5 10 15 Gln Pro Pro Val Phe His Pro Val Val Pro Tyr Val Thr Thr Ile Phe 20 25 30 Gly Gly Leu His Ala Gly Lys Met Val Met Leu Gln Gly Val Val Pro 35 40 45 Leu Asp Ala His Arg Phe Gln Val Asp Phe Gln Cys Gly Cys Ser Leu 50 55 60 Cys Pro Arg Pro Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro Arg Phe His Thr 65 70 75 80 Thr Lys Pro His Val Ile Cys Asn Thr Leu His Gly Gly Arg Trp Gln 85 90 95 Arg Glu Ala Arg Trp Pro His Leu Ala Leu Arg Arg Gly Ser Ser Phe 100 105 110 Leu Ile Leu Phe Leu Phe Gly Asn Glu Glu Val Lys Val Ser Val Asn 115 120 125 Gly Gln His Phe Leu His Phe Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Ser His Val 130 135 140 Asp Thr Leu Gly Ile Phe Gly Asp Ile Leu Val Glu Ala Val Gly Phe 145 150 155 160 Leu Asn Ile Asn Pro Phe Val Glu Gly Ser Arg Glu Tyr Pro Ala Gly 165 170 175 His Pro Phe Leu Leu Met Ser Pro Arg Leu Glu Val Pro Cys Ser His 180 185 190 Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ser Pro Gly Gln Val Ile Ile Val Arg Gly 195 200 205 Leu Val Leu Gln Glu Pro Lys His Phe Thr Val Ser Leu Arg Asp Gln 210 215 220 Ala Ala His Ala Pro Val Thr Leu Arg Ala Ser Phe Ala Asp Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ala Trp Ile Ser Arg Trp Gly Gln Lys Lys Leu Ile Ser Ala Pro 245 250 255 Phe Leu Phe Tyr Pro Gln Arg Phe Phe Glu Val Leu Leu Leu Phe Gln 260 265 270 Glu Gly Gly Leu Lys Leu Ala Leu Asn Gly Gln Gly Leu Gly Ala Thr 275 280 285 Ser Met Asn Gln Gln Ala Leu Glu Gln Leu Arg Glu Leu Arg Ile Ser 290 295 300 Gly Ser Val Gln Leu Tyr Cys Val His Ser 305 310 314 <210> 2 <211> 1654 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (335)...(1279) <400> 2 cggctgcaat ggccatgtgc tgcagacccg gagtgggtag ttagttggtt aatgccagtc 60 ttcctcccct ggacactgag ttctgctgac agcccccgcc cagccagagc tctgctgtat 120 accaccggga gtggggctgg tgtggagcct ggaggtcgcc cgctgccctc ctagggctgc 180 tccagacagc attaaaacgc tgcaggtcgc aggtgagact aacagctggg agagctgctc 240 caggcattta ggaccctgac tggggcagat gagtcagccc agtgggggca gggctcctgg 300 aacgaggatc tacagttgga gttgccccac tgtc atg tca cct gga gaa aaa ctg 355 Met Ser Pro Gly Glu Lys Leu 1 5 gac cca att cct gac agc ttc att ctg caa cca cca gtc ttc cac ccg 403 Asp Pro Ile Pro Asp Ser Phe Ile Leu Gln Pro Pro Val Phe His Pro 10 15 20 gtg gtt cct tat gtc acg acg att ttt gga ggc ctg cat gca ggc aag 451 Val Val Pro Tyr Val Thr Thr Ile Phe Gly Gly Leu His Ala Gly Lys 25 30 35 atg gtc atg ctg caa gga gtg gtc cct cta gat gca cac agg ttt cag 499 Met Val Met Leu Gln Gly Val Val Pro Leu Asp Ala His Arg Phe Gln 40 45 50 55 gtg gac ttc cag tgt ggc tgc agc ctg tgt ccc cgg cca gat atc gcc 547 Val Asp Phe Gln Cys Gly Cys Ser Leu Cys Pro Arg Pro Asp Ile Ala 60 65 70 ttc cac ttc aac cct cgc ttc cat acc acc aag ccc cat gtc atc tgc 595 Phe His Phe Asn Pro Arg Phe His Thr Thr Lys Pro His Val Ile Cys 75 80 85 aac acc ctg cat ggt gga cgc tgg caa agg gag gcc cgg tgg ccc cac 643 Asn Thr Leu His Gly Gly Arg Trp Gln Arg Glu Ala Arg Trp Pro His 90 95 100 ctg gcc ctg cga aga ggc tcc agc ttc ctc atc ctc ttt ctc ttc ggg 691 Leu Ala Leu Arg Arg Gly Ser Ser Phe Leu Ile Leu Phe Leu Phe Gly 105 110 115 aat gag gaa gtg aag gtg agt gtg aat gga cag cac ttt ctc cac ttc 739 Asn Glu Glu Val Lys Val Ser Val Asn Gly Gln His Phe Leu His Phe 120 125 130 135 cgc tac cgg ctc cca ctg tct cat gtg gac acg ctg ggt ata ttt ggt 787 Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Ser His Val Asp Thr Leu Gly Ile Phe Gly 140 145 150 gac atc ctg gta gag gct gtt gga ttc ctg aac atc aat cca ttt gtg 835 Asp Ile Leu Val Glu Ala Val Gly Phe Leu Asn Ile Asn Pro Phe Val 155 160 165 gag ggc agc aga gag tac cca gct gga cat cct ttc ctg ctg atg agc 883 Glu Gly Ser Arg Glu Tyr Pro Ala Gly His Pro Phe Leu Leu Met Ser 170 175 180 ccc agg ctg gag gtg ccc tgc tca cat gct ctt ccc cag ggt ctc tcg 931 Pro Arg Leu Glu Val Pro Cys Ser His Ala Leu Pro Gln Gly Leu Ser 185 190 195 cct ggg cag gtc atc ata gta cgg gga ctg gtc ttg caa gag ccg aag 979 Pro Gly Gln Val Ile Ile Val Arg Gly Leu Val Leu Gln Glu Pro Lys 200 205 210 215 cat ttt act gtg agc ctg agg gac cag gct gcc cat gct cct gtg aca 1027 His Phe Thr Val Ser Leu Arg Asp Gln Ala Ala His Ala Pro Val Thr 220 225 230 ctc agg gcc tcc ttc gca gac aga act ctg gcc tgg atc tcc cgc tgg 1075 Leu Arg Ala Ser Phe Ala Asp Arg Thr Leu Ala Trp Ile Ser Arg Trp 235 240 245 ggg cag aag aaa ctg atc tca gcc ccc ttc ctc ttt tac ccc cag aga 1123 Gly Gln Lys Lys Leu Ile Ser Ala Pro Phe Leu Phe Tyr Pro Gln Arg 250 255 260 ttc ttt gag gtg ctg ctc ctg ttc cag gag gga ggg ctg aag ctg gcg 1171 Phe Phe Glu Val Leu Leu Leu Phe Gln Glu Gly Gly Leu Lys Leu Ala 265 270 275 ctc aat ggg cag ggg ctg ggg gcc acc agc atg aac cag cag gcc ctg 1219 Leu Asn Gly Gln Gly Leu Gly Ala Thr Ser Met Asn Gln Gln Ala Leu 280 285 290 295 gag cag ctg cgg gag ctc cgg atc agt gga agt gtc cag ctc tac tgt 1267 Glu Gln Leu Arg Glu Leu Arg Ile Ser Gly Ser Val Gln Leu Tyr Cys 300 305 310 gtc cac tcc tga ggatggttcc aggggaaata ccgccagaaa acaagaaggt 1319 Val His Ser 314 cagcccactc ccagggcccc actctcctcc cctcattaaa ccatccacct gacaccagca 1379 catcaggcct ggttcacctc tggggtcacg agactgagtc tacaggagct ttgggcctga 1439 gggaaggcac aagagtgcaa aggttcctcg aactctgcac cttcctccac caggagcctg 1499 ggatatggct ccatctgcct tcagggcctg gactgcactc acagaggcaa gtgttgtata 1559 ctaacaaaga tactccaaaa tacaatggct taaagaatgt ggtcatttat tctttattat 1619 ttatttattt gtggtcaaat aaataaataa ggtta 1654 <210> 3 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtc cag ctc tac tgt gtc cac tcc tga ggatggttcc agggaaatac cgccagaaaa 57 Val Gln Leu Tyr Cys Val His Ser 1 5 8 caagaaggtc agcccactcc cagggcccca ctctcctccc ctcattaaac catccacctg 117 acaccagcac atcaggcctg gttcacctct ggggtcacga gactgagtct acaggagctt 177 tgggcctgag ggaaggcaca agagtgcaaa ggttcctcga actctgcacc ttcctccacc 237 aggagcctgg gatatggctc catctgcctt cagggcctgg actgcactca cagaggcaag 297 tgttgtagac taacaaagat actccaaaat acaatggctt aaa 340 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 4 catatgtcac ctggagaaaa actgg 25 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 5 ggatcctcag gagtggacac agtagagct 29 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 6 cggctgcaat ggccatgtgc tgcag 25 <210> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 7 taaccttatt tatttatttg accac 25

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＰ１Ｄ８を示す図である。

【図２】ヒト脂肪組織由来ＲＮＡおよびヒト組織ＲＮＡ
ブロットに対する本ポリヌクレオチドをプローブとした
ノザンハイブリダイゼーションの結果を示した図であ
る。

【図３】本発明ベクターであるプラスミドｐＵＣＰ１Ｄ
８を示す図である。

【図４】本発現ベクターであるプラスミドpET3a-P1D8を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 BA61 BA80 CA04 CA12 DA02 DA06 EA04 GA11 GA19 HA03 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ43 QQ52 QQ53 QQ79 QR31 QR48 QR51 QR56 QS33 QS34 4B064 AG01 AG26 CA02 CA10 CA19 CC24 DA13 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 DA76 DA86 EA50 FA72 FA73 FA74 HA05

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１で示されるアミノ酸配列をコー
   ドする塩基配列を有する遺伝子の発現産物を検出するこ
   とを特徴とする脂肪組織の同定方法。
2. 【請求項２】発現産物が、配列番号１で示されるアミノ
   酸配列をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡである請
   求項１に記載の同定方法。
3. 【請求項３】下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩
   基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと
   被検組織とを接触させることによって、該被検組織にお
   ける脂肪組織中の配列番号１で示されるアミノ酸配列を
   コードする塩基配列を有するｍＲＮＡを検出することを
   特徴とする脂肪組織の同定方法。 （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
   塩基配列 （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
   塩基配列のうちの１０塩基以上の部分塩基配列 （ｃ）配列番号２で示される塩基配列 （ｄ）配列番号２で示される塩基配列のうちの１０塩基
   以上の部分塩基配列
4. 【請求項４】発現産物が、配列番号１で示されるアミノ
   酸配列を有する蛋白質である請求項１に記載の同定方
   法。
5. 【請求項５】配列番号１で示されるアミノ酸配列を有す
   る蛋白質を認識し得る抗体と被検組織とを接触させるこ
   とによって、該被検組織における脂肪組織中の前記蛋白
   質を検出することを特徴とする脂肪組織の同定方法。
6. 【請求項６】下記（ｅ）〜（ｋ）のいずれかに記載の塩
   基配列を有するポリヌクレオチド。 （ｅ）配列番号１のアミノ酸番号１〜２３で示されるア
   ミノ酸配列をコードする塩基配列 （ｆ）配列番号１のアミノ酸番号１〜２３で示されるア
   ミノ酸配列をコードする塩基配列のうちの１０塩基以上
   の部分塩基配列 （ｇ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする
   塩基配列 （ｈ）配列番号２の塩基番号１〜４０２で示される塩基
   配列 （ｉ）配列番号２の塩基番号１〜４０２で示される塩基
   配列のうちの１０塩基以上の部分塩基配列 （ｊ）配列番号２で示される塩基配列 （ｋ）（ｅ）〜（ｊ）のいずれかに記載の塩基配列に相
   補的な塩基配列
7. 【請求項７】請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有
   するベクター。
8. 【請求項８】請求項６に記載のポリヌクレオチドを宿主
   細胞に導入されてなる形質転換体。
9. 【請求項９】宿主細胞が微生物由来の細胞である請求項
   ８に記載の形質転換体。
10. 【請求項１０】宿主細胞が哺乳動物由来の細胞である請
    求項８に記載の形質転換体。
11. 【請求項１１】配列番号１で示されるアミノ酸配列を有
    する蛋白質。
12. 【請求項１２】請求項１１に記載の蛋白質をコードする
    ポリヌクレオチドが発現可能な形で宿主細胞に導入され
    てなる形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とす
    る前記蛋白質の製造方法。
13. 【請求項１３】請求項１１に記載の蛋白質を認識し得る
    抗体。