WO2002070701A2 - Nouveau recepteur gnrh humain - Google Patents

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WO2002070701A2
WO2002070701A2 PCT/FR2002/000741 FR0200741W WO02070701A2 WO 2002070701 A2 WO2002070701 A2 WO 2002070701A2 FR 0200741 W FR0200741 W FR 0200741W WO 02070701 A2 WO02070701 A2 WO 02070701A2
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Eric Ferrandis
Christophe Thurieau
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Definitions

  • the present invention relates to a gene coding for a new human receptor GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone Receptor or receptor for the gonadotropin releasing hormone). It also relates to genetically modified host cells which express said receptor, as well as their use for evaluating and screening GnRH products and analogs involved in the activation, regulation and decoupling of said receptor.
  • GnRH Gonadotropin Releasing Hormone Receptor or receptor for the gonadotropin releasing hormone
  • GnRH receptors GnRH-R family receptors
  • GnRH receptor subtypes have been isolated from the same species (see for example, for the toad, McCann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001), 98 ( 1), 361-366). It has been shown in vertebrates that these receptors are found expressed at least in the pituitary gland and the brain. In humans, there is currently only one known GnRH receptor, namely that isolated by S. Kakar and his collaborators (Kakar et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 189, 289 -295).
  • GnRH-R2 The Applicant has now just found a new human GnRH receptor, hereinafter designated by GnRH-R2.
  • the invention relates firstly to an isolated GnRH-R2 receptor, which comprises the amino acid sequence SEQ. LD. NO. 4.
  • Said sequence SEQ. ID. NO. 4 is as follows:
  • said receptor consists of the amino acid sequence SEQ. LD. NO. 4.
  • the invention also relates to an isolated GnRH receptor encoded by a nucleotide sequence such that it hybridizes with the polynucleotide of sequence SEQ. ID. NO. 3 (described later).
  • said isolated GnRH receptor is coded by a nucleotide sequence such that it hybridizes under conditions of high stringency with said polynucleotide of sequence SEQ. ID. NO. 3.
  • said isolated polynucleotide consists of a nucleotide sequence comprising the nucleotide sequence SEQ. ID. NO.3. Even more preferably, said isolated polynucleotide consists of the nucleotide sequence SEQ. ID. NO.3.
  • the invention also includes polynucleotides whose sequence is at least 75% homologous, preferably at least 85% and even more preferably at least 90% or even 95%, to the sequence SEQ. ID. NO.3. This also applies mutatis mutandis to the other polynucleotides, peptides and proteins of the invention.
  • the invention therefore also comprises the isolated polynucleotide consisting essentially of either the nucleotide sequence SEQ. ID. NO.5, or in the sequence complementary to said nucleotide sequence SEQ. ID. NO.5.
  • This sequence SEQ. ID. NO.5 is as follows:
  • This sequence corresponds to an isolated GnRH-R2 receptor which essentially consists of the amino acid sequence SEQ. ID. NO.6, which is as follows:
  • the invention likewise relates to an isolated polynucleotide which codes for a natural GnRH receptor, said polynucleotide comprising a nucleotide sequence such that it hybridizes with an isolated polynucleotide comprising the nucleotide sequence SEQ. LD. NO. 3 or SEQ. LD. NO. 5 or the sequence complementary to said sequence of nucleotides SEQ. LD. NO. 3 or SEQ. LD. NO. 5.
  • the invention also relates to an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence coding for a polypeptide of amino acid sequence SEQ. LD. NO. 4 or SEQ. LD. NO. 6.
  • the subject of the invention is also an isolated polynucleotide which codes for a natural GnRH receptor, said polynucleotide being capable of hybridizing with an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence coding for a polypeptide of amino acid sequence SEQ. LD. NO. 4 or SEQ. LD. NO. 6 ..
  • the invention also relates to an isolated polynucleotide which codes for a natural GnRH receptor, said polynucleotide being capable of being obtained by a process comprising the following successive steps: a) polymerase chain reaction (PCR) on a human cDNA bank of brain or pituitary tissue with 0.5 ⁇ M of primer FI (of sequence SEQ. LD. NO. 1) and primer RI (of sequence SEQ. ID. NO.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the invention also relates to the isolated GnRH receptor encoded by a polynucleotide capable of being obtained by the method which has just been described.
  • a further object of the invention is a recombinant vector containing the nucleotide sequence of one of the polynucleotides described above.
  • the invention further relates to a recombinant vector containing the nucleotide sequence of one of said polynucleotides associated with a regulatory nucleotide sequence containing transcriptional and translational regulatory information which controls expression of the nucleotide sequence in a host cell.
  • the invention also provides a genetically modified cell containing the nucleotide sequence of one of the polynucleotides described above. It also provides a genetically modified cell containing the nucleotide sequence of one of said polynucleotides associated with a regulatory nucleotide sequence containing transcriptional and translational regulatory information which controls the expression of the nucleotide sequence in a host cell.
  • the invention also relates to the use of one of the receptors defined above for the discovery of therapeutic agents, and in particular for the discovery of therapeutic agents intended for treating pathologies dependent on gonadal steroids, and in particular: - in women: endometriosis, fibroma, gonadotropic pituitary desensitization during assisted reproductive procedures, breast cancer in pre-menopausal women, polycystic ovary syndrome, ovarian cancer and cancer the endometrium; - in men: benign prostatic hyperplasia and prostate cancer;
  • the subject of the invention will also be the use of one of the receptors defined above for the discovery of therapeutic agents for the discovery of therapeutic agents intended to protect the ovaries in women who are subjected to chemotherapy or to treat gonadotropic adenoma.
  • the invention also relates, as a medicament, to one of the receptors defined above or to a biologically active fragment of one of them. It also relates to a pharmaceutical composition containing, as active principle, one of the receptors defined above or a biologically active fragment of one of these. It also relates to the use of said receptors or biologically active fragments thereof for preparing a medicament intended for treating pathologies dependent on gonadal steroids, and in particular:
  • the invention also further relates to the use of one of the receptors defined above or of a biologically active fragment of one of them for preparing a medicament intended to protect the ovaries in women who are subjected to chemotherapy or to treat gonadotropic adenoma.
  • the human GnRH-R2 receptor can be cloned and expressed.
  • GnRH-R2 is characterized by seven trans-membrane segments characteristic of receptors coupled to G proteins; but, unlike the GnRH-R receptor, GnRH-R2 has a C-terminal intracellular end with in final sequence the presence of a PDZ domain anchoring to the cytoskeleton (PSD-95 / large discs / ZO-1, described in Kornau et al., Science (1995), 269, 1737-1740).
  • GnRH-R2 produced here can be used to assess and screen GnRH products and analogs involved in the activation, regulation or decoupling of GnRH-R2.
  • DNA from GnRH-R2, sense or antisense ohgonucleotides, GnRH-R2, peptide fragments thereof, or antibodies to it can be used in diagnostic and / or therapeutic methods .
  • the coding nucleic acid sequence (SEQ. ID. NO. 3 or SEQ. ID. NO. 5) and the deduced amino acid sequence (SEQ. ID. NO. 4 or SEQ. ID. NO. 6) for the Human receptor GnRH-R2 are described in the present application.
  • the complete open reading phase codes for a protein of 354 or 379 amino acids of approximately 39,000 daltons.
  • the hydrophobicity analysis of the deduced protein reveals 7 portions composed of highly hydrophobic amino acids.
  • GnRH-R2 has a long C-terminal end with the presence of a PDZ recognition motif (ITSI-Stop) at the end of the C-terminal chain.
  • ITSI-Stop PDZ recognition motif
  • the present invention relates to isolated polynucleotides or polypeptides.
  • a polynucleotide or a polypeptide is said to be “isolated” if it is taken out of its original environment.
  • a polynucleotide or a polypeptide is isolated if it is separated from the biological material with which it coexists in the natural system.
  • sequences which code for GnRH-R2 and fragments or fusion proteins of GnRH-R2 can be used to generate recombinant DNA molecules which direct the expression of GnRH-R2, or of a active portion of it, in appropriate host cells.
  • sequences which hybridize with portions of the GnRH-R2 sequences can also be used in nucleic acid hybridization tests, Southern blot, Northern blot, etc. Due to the degeneration of the genetic code, other DNA sequences encoding substantially for the amino acid sequence of GnRH-R2 can be used for cloning and expression of GnRH-R2.
  • Such DNA sequences include those capable of hybridizing the GnRH-R2 sequences under certain stringency conditions which can be adjusted in several ways. For example, during a polymerase chain reaction (PCR), the temperature at which the primers hybridize to the matrix or the concentrations of MgCl 2 in the reaction buffer can be adjusted. When using radio-labeled DNA fragments, or oligonucleotides to probe membranes, the stringency can be adjusted by changing the ionic strengths of the washing solutions or by carefully controlling the washing temperature.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the invention particularly includes polynucleotides having at least 75% homology with the polynucleotide of sequence SEQ. ID. NO. 3 or SEQ. ID. NO. 5.
  • the degree of homology expressed in% is calculated as follows: 100 - 100 x (N7N) with N 'representing the number of nucleotides modified relative to the sequence SEQ. LD. NO. 3 or SEQ. ID. NO. 5 and N the number of nucleotides of SEQ. LD. NO. 3 or SEQ. ID. NO. 5.
  • such a homologous nucleotide sequence hybridizes specifically with the sequence complementary to the sequence SEQ. ID. NO. 3 or SEQ. LD. NO. 5 under stringent conditions.
  • the parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (T.J.
  • T m is defined by the relation:
  • T m 81.5 + 0.41 x (% G + C) + 16.6 x log [cations] - 0.63 x (% formamide) - (600 / number of bases)
  • the stringency conditions will be said to be “strong” when a hybridization temperature of 10 ° C. is used below T m and hybridization buffers containing a solution 6 ⁇ SSC (sodium chloride 0 , 9 M and 0.09 M sodium citrate). Under such conditions, the polynucleotides of aspecific sequences will not hybridize with the polynucleotide of the sequence complementary to the sequence SEQ. ID. NO. 3 or SEQ. LD. NO. 5.
  • Altered DNA sequences which can be used in accordance with the present invention include deletions, additions or substitutions of different nucleotide residues resulting in a sequence which codes for the same gene product or equivalent function.
  • the gene product may also contain deletions, additions or substitutions of amino acid residues in the GnRH-R2 sequence, which result in so-called silent changes, thereby producing a GnRH-R2 of equivalent function.
  • Such amino acid substitutions can be made on the basis of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or the amphipatic nature of the residues involved.
  • negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid
  • positively charged amino acids include lysine and farginine
  • amino acids with polar groups having similar hydrophobicity values include leucine, isoleucine, valine; glycine, alanine; asparagine, glutamine; serine, threonine; phenylalanine, tyrosine.
  • a receptor having a function equivalent to GnRH-R2 refers to a receptor which fixes GnRH but not necessarily with the same affinity of its native equivalent GnRH-R2.
  • DNA sequences of the present invention can be modified to alter the sequence encoding GnRH-R2 for a number of reasons including, but not limited to, alterations which modify the process and expression of the gene product.
  • mutations can be introduced using techniques well known to those skilled in the art, for example site-directed mutagenesis, insertion of new restriction sites, alteration of glycosylations, phosphorylation, etc.
  • the host cell can over-glycosylate the gene product.
  • a modified GnRH-R2 or GnRH-R2 sequence linked to a heterologous sequence to encode a fusion protein is also within the scope of the disclosure of the present invention.
  • the fusion protein can be modified to contain a cleavage site located between the sequence of GnRH-R2 and the sequence of the heterologous protein, such that GnRH-R2 can be cleaved from the heterologous portion.
  • GnRH-R2 which forms part of the present invention, can be synthesized entirely or in part using chemical methods well known to those skilled in the art who may in particular refer to publications following: Caruthers et al., Naked. Acids Res. Symp. Ser. (1980), 7, 215-233; Created and Horn, Naked. Acids Res., 9 (10), 2331; Matteucci and Caruthers, Tetrahedron Lett. (1980), 21, 719; and Chow and Kempe, Naked. Acids Res. (1981), 9 (12), 2807-2817.
  • the protein itself can be produced using chemical methods to synthesize the amino acid sequence of GnRH-R2 in whole or in part.
  • the nucleotide sequence coding for GnRH-R2 or a functional equivalent as described above is inserted into an appropriate expression vector, ie, a vector containing the necessary elements for transcription and translation of the inserted coding sequence.
  • the GnRH-R2 gene products as well as host cells or cell lines transfected or transformed with the recombinant expression vector GnRH-R2 can be used in many cases which include but are not limited to the generation of antibodies ( ie monoclonal or polyclonal) which bind the receptor, including those which competitively inhibit the binding of GnRH and neutralize its activity, the screening and selection of GnRH analogs or products which act via the GnRH-R2 receptor, etc. .
  • a variety of host / expression vector systems can be used to express the sequence encoding GnRH-R2.
  • Said systems include but are not limited to microorganisms such as bacteria transformed by recombinant bacteriophage DNA, plasmid or cosmid DNA vectors containing the sequence coding for GnRH-R2, yeasts transformed with expression vectors containing the coding sequence for GnRH-R2, insect cell systems infected with a viral expression vector (for example a baculovirus) containing the coding sequence for GnRH-R2, plant cells infected with a viral expression vector (for example the cauliflower mosaic virus (CaMN) or the tobacco mosaic virus (TMN)) or transformed by a plasmid expression vector (by example Ti plasmid) containing the sequence coding for GnRH-R2, or an animal cell system infected with a recombinant viral expression vector (for example adeno virus or vaccinia virus).
  • a viral expression vector for example
  • promoters that are derived from the genome of mammalian cells (e.g., a metallothionein promoter) or from mammalian viruses (e.g. the late adenovirus promoter ( adenovirus late promoter) or the vaccinia virus promoter 7.5 K) can be used.
  • mammalian cells e.g., a metallothionein promoter
  • mammalian viruses e.g. the late adenovirus promoter ( adenovirus late promoter) or the vaccinia virus promoter 7.5 K
  • the invention further relates to the cloning of the cDNA of GnRH-R2 into an expression vector pCDNA 3.1.
  • HEK cells can be transfected with the vector / GnRH-R2 construct transiently or stably using an Effectene reagent according to the manufacturer's recommendations (Qiagen).
  • GnRH-R2 For the production of antibodies, different species of animals can be immunized by injection of GnRH-R2 (including, in particular, rabbits, mice, rats, etc.).
  • Adjuvants can be used to increase the immunological response, depending on the host species, in particular the Freund's reagent, mineral gels like aluminum hydroxide, substances with activated surfaces like lysoelicithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, mineral oils, dinitrophenol, etc.
  • Monoclonal antibodies against GnRH-R2 can be prepared using any technique which allows the production of antibody molecules in cell line cultures such as, for example, the hybridoma techniques originally described by Kohler and Milstein (Nature (1975), 256, 495-497), the B cell hybridoma technique (Kosbor et al., Immunology Today (1983), 4, 72; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1983 ), 80, 2026-2030).
  • Antibody fragments recognizing the specific binding sites of GnRH-R2 can be generated by standard techniques well known to those skilled in the art. Such fragments include in particular the F (ab ') 2 fragments which can be obtained by tryptic digestion of the antibody molecule.
  • GnRH-R2 DNA, antisense ohgonucleotides, GnRH-R2 expression products, antibodies and host cell lines expressing GnRH-R2 described above are useful in the diagnostic field and in therapy, but also for pharmacological research and drug discovery.
  • the DNA sequence of GnRH-R2 can be used in biopsy hybridization assays to diagnose an abnormal expression of GnRH-R2, for example analysis by Southern and Northern techniques, including assays of in situ hybridization.
  • antisense molecules defined on the basis of the DNA sequence of GnRH-R2 can be used to block the transport and expression of GnRH-R2.
  • GnRH-R2 DNA can be used in gene therapy to introduce the recombinant normal gene into defective cells or to correct mutations in order to reconstruct GnRH-R2 and its function.
  • specific antibodies against GnRH-R2 can be used to determine the expression profile of the receptor in tissue biopsies, or to allow diagnostics from medical imaging carried out in vivo.
  • an antibody coupled to a detection entity in imaging can be administered to a patient to localize the distribution of GnRH-R2 in vivo.
  • the GnRH-R2 receptor or a fragment thereof containing its binding site, can be administered in vivo.
  • the free receptor or the peptide fragment thereof can compete for the binding of GnRH and inhibit its interaction with the native receptor in vivo.
  • PCR polymerase chain reaction
  • SEQ sequences. ID. NO. 1 and SEQ. ID. NO. 2 of the primers FI and RI are the following:
  • the reaction conditions include 0.5 ⁇ M of FI (of sequence SEQ. ID. NO. 1) and of RI (of sequence SEQ. ID. NO. 2), 200 ⁇ M of deoxynucleotides triphosphate (or dNTPs: dATP, dCTP, dGTP and dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 and 0.5 U Taq DNA polymerase in a final volume of 50 ⁇ l.
  • the thermal cycle parameters include denaturation at 94 ° C for 30 s, hybridization of primers at 60 ° C for 1 minute and polymerization extension at 72 ° C for 30 s (with a final extension of 5 minutes).
  • PCR products are then separated on 1% agarose gel and visualized by staining with ethidium bromide.
  • the nucleic acid sequence thus obtained contains the HindIII restriction sites in the 5 'part and EcoRI in the 3' part, allowing insertion directly into an expression vector, for example an expression vector of pCDNA3.1 type ( Invitrogen).
  • the products are subjected to HindIII and EcoRI hydrolysis in order to release ends containing these sequences and then purified from the agarose gel by electroelution.
  • the sequence obtained is then inserted into an expression vector such as for example pCDNA3.1 (InNifrogen).
  • pCDNA3.1 InNifrogen
  • Analysis by digestion with suitable restriction enzymes of different bacterial clones having received said expression vector makes it possible to isolate the bacterial clones containing the new construction "expression vector / polynucleotide coding for GnRH-R2".
  • the preparation in large quantities of these plasmid constructs is carried out using a plasmid DNA purification kit (Qiagen).
  • the cells are recovered 48 h after transfection by a treatment with trypsin.
  • the membranes of the cells transfected with the human GnRH-R2 receptor are diluted to the concentration of 100 ⁇ g / ml in the reaction buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM of MgCl 2 , 100 ⁇ g / ml bacitracin and 0.1% bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the membranes are incubated with 0.2 nM [ 125 L] D-Trp6-GnRH (NEN) in a final volume of 200 ⁇ l for 1 hour at 4 ° C.
  • the reaction is stopped by rapid filtration on 96-well filters GF / 1 preloaded to 0.5% polyethyleneimine.
  • the filters are then washed three times at 4 ° C. with washing buffer containing 50 mM Tris (pH 7.4) using a Packard 96-well filtration station.
  • the filters thus dried are submerged with 40 ⁇ l of scintillating cocktail (Microscint O, Packard) and are subject to counting on the Topcount (Packard).
  • the non-specific activity is determined in the presence of 100 nM of D-Trp6-GnRH.
  • a dose-response curve is generated for D-Trp6-GnRH (0.001 nM to 100 nM) and makes it possible to show the affinity of GnRH for the GnRH-R2 receptor.
  • Inositol Phosphate (LP) stimulated by GnRH is determined according to the method of Davidson et al., Endocrinology (1990), 126, 80-87.
  • the cells transfected with GnRH-R2 are incubated for 18 h in the presence of [H3] Inositol and stimulated with 100 nM of GnRH in the presence of lithium chloride.
  • the reaction is stopped by the addition of 0.1 M formic acid at 4 ° C.
  • the Inositol Phosphates are separated on an ion exchange column (Biorad) and counted. The results obtained make it possible to appreciate the modulation of the production of Inositol Phosphate by the GnRH-R2 receptor.

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Abstract

La présente invention concerne un gène codant pour un nouveau récepteur humain GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone Receptor), ci-après nommé GnRH-R2. Les séquences d'ADN objet de la présente invention peuvent être placées dans des systèmes d'expression en vue d'une production de GnRH-R2 et/ou des lignées cellulaires qui expriment GnRH-R2 et de préférence répondent aux signaux de transduction induits par GnRH. De telles lignées cellulaires peuvent avantageusement être utilisées pour le criblage et l'identification de nouveaux agonistes et antagonistes de GnRH. Selon d'autre aspects de l'invention, L'ADN codant pour GnRH-R', des séquences oligonucléotidiques anti-sens, des produits d'expression de GnRH-R2, des anticorps contre de tels produits peuvent être utilisés dans le cadre de méthodes de diagnostic ou pour la thérapie de désordres associés à une expression anormale de GnRH-R2, par exemple une sur-expression, une sous-expression ou une expression d'un récepteur mutant. Des animaux transgéniques contenant le transgène GnRH-R2 peuvent être utilisés comme modèles d'évaluation d'analogues de GnRH in vivo.

Description

Nouveau récepteur GnRH humain
La présente invention concerne un gène codant pour un nouveau récepteur humain GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone Receptor ou récepteur pour l'hormone libératrice de gonadotropine). Elle a également pour objet des cellules hôtes génétiquement modifiées qui expriment ledit récepteur, ainsi que leur utilisation pour évaluer et cribler des produits et des analogues de GnRH impliqués dans l'activation, la régulation et le découplage dudit récepteur.
Un grand nombre de récepteurs de la famille GnRH-R (récepteurs GnRH) ont été identifiés récemment dans de nombreuses espèces. Bien souvent, un certain nombre de sous-types de récepteurs GnRH ont été isolés chez une même espèce (cf. par exemple, pour le crapaud, McCann et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001), 98(1), 361-366). Il a été montré chez les vertébrés que ces récepteurs se trouvent exprimés au moins dans l'hypophyse et le cerveau. Chez l'homme, il n'existe actuellement qu'un seul récepteur GnRH connu, à savoir celui isolé par S. Kakar et ses collaborateurs (Kakar et coll., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 189, 289-295).
La demanderesse vient à présent de trouver un nouveau récepteur GnRH humain, ci-après désigné par GnRH-R2.
L'invention concerne tout d'abord un récepteur GnRH-R2 isolé, lequel comprend la séquence d'acides aminés SEQ. LD. NO. 4. Ladite séquence SEQ. ID. NO. 4 est la suivante :
1 MSAGNGTPWG VEVEGSELPT FSAAAKVRVG VTIV FVSSA GGNLAV SV
51 TRREPSQLRP SPVRRLFIH AAADLLVTFV VMPLDATWNI TVQWLAVDIA
101 CRT MF KLM ATYSAAF PV VIG DRQAAV NP GSRSGV RK LGAAWG
151 SFL AFPDPF TQCVTKGSFK AQWQETTYN FTFCCLF P LTAMAICYSR
201 IV SVSRPQT RKGSHAPAGE FALPRSFDNC PRVR RALRL AL ILLTFIL 251 CWTPYYLLGM YWFSPTM T EVPPSLSHIL F LGLLNAPL DPLLYGAFT
301 GCRRGHQELS IDSSKEGSGR MLQEEIHAFR QLEVQKTVTS RRAGETKGIS 351 ITSI
De préférence, ledit récepteur consiste en la séquence d'acides aminés SEQ. LD. NO. 4. L'invention concerne aussi un récepteur GnRH isolé codé par une séquence nucléotidique telle qu'il s'hybride avec le polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 3 (décrite plus loin). De préférence, ledit récepteur GnRH isolé est codé par une séquence nucléotidique telle qu'il s'hybride dans des conditions de forte stringence avec ledit polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 3.
Elle a de plus pour objet un polynucléotide isolé comprenant soit la séquence de nucléotides SEQ. ID. NO. 3, soit la séquence complémentaire à ladite séquence de nucléotides SEQ. ID. NO. 3. Cette séquence SEQ. ID. NO. 3 est la suivante :
1 tttctctcca ggccaccatg tctgcaggca acggcacccc ttggggagtg 51 gaggtggagg gctcagagct gcccaccttc tcggcagcag ccaaggtccg
101 agtgggagtg accattgtgc tgtttgtttc ttcggctgga gggaacctgg
151 cagtcctgtg gtcagtgaca cggcgggaac ccagccagct ccgcccctct
201 ccggtcagga gactcttcat ccatttagca gccgccgact tactagtcac
251 ttttgtggtt atgcccctag atgccacctg gaatatcact gttcaatggc 301 tggctgtgga catcgcatgt cggacactga tgttcctgaa actaatggcc
351 acgtattctg cagctttcct gcctgtggtc attggattgg accgccaggc
401 agcagtactc aacccgcttg gatcccgttc aggtgtaagg aaacttctgg
451 gggcagcctg gggacttagt ttcctgcttg ccttccccga ccctttcact
501 cagtgtgtca ccaaaggcag cttcaaggct caatggcaag agaccaccta 551 taacctcttc accttctgct gcctctttct gctgccactg actgccatgg
601 ccatctgcta tagccgcatt gtcctcagtg tgtccaggcc ccagacaagg
651 aaggggagcc atgcccctgc tggtgaattt gccctccccc gctcctttga
701 caattgtccc cgtgttcgtc tccgggccct gagactggcc ctgcttatct
751 tgctgacctt catcctctgc tggacacctt attacctact gggtatgtgg 801 tactggttct cccccaccat gctaactgaa gtccctccca gcctgagcca
851 catccttttc ctcttgggcc tcctcaatgc tcctttggat cctctcctct
901 atggggcctt cacccttggc tgccgaagag ggcaccaaga acttagtata
951 gactcttcta aagaagggtc tgggagaatg ctccaagagg agattcatgc
1001 ctttagacag ctggaagtac aaaaaactgt gacatcaaga agggcaggag 1051 aaacaaaagg catttctata acatctatct gatcctaaca gagtatgtag
1101 gaacagaata gtaagtcttt agtgccataa gatcttaaca tctcacttct 1151 actcctgctc tcctagttcc cccc
De préférence, ledit polynucléotide isolé consiste en une séquence de nucléotides comprenant la séquence de nucléotides SEQ. ID. NO.3. Encore plus préférentiellement, ledit polynucléotide isolé consiste en la séquence de nucléotides SEQ. ID. NO.3.
L'invention comprend également les polynucléotides dont la séquence est homologue au moins à 75 %, de préférence au moins à 85 % et encore plus préférentiellement au moins à 90 % voire 95 %, à la séquence SEQ. ID. NO.3. Cela s'applique également mutatis mutandis aux autres polynucléotides, peptides et protéines de l'invention.
L'invention comprend donc également le polynucléotide isolé consistant essentiellement soit en la séquence de nucléotides SEQ. ID. NO.5, soit en la séquence complémentaire à ladite séquence de nucléotides SEQ. ID. NO.5. Cette séquence SEQ. ID. NO.5 est la suivante :
1 tttctctcca ggccaccatg tctgcaggca acggcacccc ttgggggtca
51 gcagcggggg aggaggtctg ggctggatca ggagtggagg tggagggctc
101 agagctgccc accttctcgg cagcagccaa ggtccgagtg ggagtgacca
151 ttgtgctgtt tgtttcttcg gctggaggga acctggcagt cctgtggtca
201 gtgacacggc gggaacccag ccagctccgc ccctctccgg tcaggagact 251 cttcatccat ttagcagccg ccgacttact agtcactttt gtggttatgc
301 ccctagatgc cacctggaat atcactgttc aatggctggc tgtggacatc 351 gcatgtcgga cactgatgtt cctgaaacta atggccacgt attctgcagc 401 tttcctgcct gtggtcattg gattggaccg ccaggcagca gtactcaacc 451 cgcttggatc ccgttcaggt gtaaggaaac ttctgggggc agcctgggga 501 cttagtttcc tgcttgcctt ccccgacctg ttcctgttcc acacggtcca 551 ccgagctggc ccagaccctt tcactcagtg tgtcaccaaa ggcagcttca 601 aggctcaatg gcaagagacc acctataacc tcttcacctt ctgctgcctc 651 tttctgctgc cactgactgc catggccatc tgctatagcc gcattgtcct 701 cagtgtgtcc aggccccaga caaggaaggg gagccatgcc cctgctggtg 751 aatttgccct cccccgctcc tttgacaatt gtccccgtgt tcgtctccgg 801 gccctgagac tggccctgct tatcttgctg accttcatcc tctgctggac 851 accttattac ctactgggta tgtggtactg gttctccccc accatgctaa 901 ctgaagtccc tcccagcctg agccacatcc ttttcctctt gggcctcctc 951 aatgctcctt tggatcctct cctctatggg gccttcaccc ttggctgccg
1001 aagagggcac caagaactta gtatagactc ttctaaagaa gggtctggga
1051 gaatgctcca agaggagatt catgccttta gacagctgga agtacaaaaa
1101 actgtgacat caagaagggc aggagaaaca aaaggcattt ctataacatc
1151 tatctgatcc taacagagta tgtaggaaca gaatagtaag tctttagtgc
1201 cataagatct taacatctca cttctactcc tgctctccta gttcccccc
Cette séquence correspond à un récepteur GnRH-R2 isolé qui consiste essentiellement en la séquence d'acides aminés SEQ. ID. NO.6, laquelle est la suivante :
1 MSAGNGTPWG SAAGEEV AG SGVEVEGSΞL PTFSAAAKVR VGVTIVLFVS
51 SAGGNLAVLW SVTRRΞPSQL RPSPVRRLFI H AAADLLVT FW P DATW
101 NITVQWLAVD IACRTLMFLK LMATYSAAFL PWIG DRQA AV NP GSRS
151 GVRKLLGAAW GLSFLLAFPD FLFHTVHRA GPDPFTQCVT KGSFKAQ QE
201 TTYNLFTFCC LFLLP TAMA ICYSRIV SV SRPQTRKGSH APAGΞFALPR
251 SFDNCPRVR RALRLALLIL LTFILC TPY YLLGMWYWFS PTMLTEVPPS
301 SHILFLLGL LNAPLDP Y GAFTLGCRRG HQE SIDSSK EGSGRMLQEE
351 IHAFRQ EVQ KTVTSRRAGE TKGISITSI
L'invention concerne de même un polynucléotide isolé qui code pour un récepteur GnRH naturel, ledit polynucléotide comprenant une séquence nucléotidique telle qu'il s'hybride avec un polynucléotide isolé comprenant la séquence de nucléotides SEQ. LD. NO. 3 ou SEQ. LD. NO. 5 ou la séquence complémentaire à ladite séquence de nucléotides SEQ. LD. NO. 3 ou SEQ. LD. NO. 5.
L'invention a également pour objet un polynucléotide isolé comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ. LD. NO. 4 ou SEQ. LD. NO. 6.
L'invention a encore pour objet un polynucléotide isolé qui code pour un récepteur GnRH naturel, ledit polynucléotide étant susceptible de s'hybrider avec un polynucléotide isolé comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ. LD. NO. 4 ou SEQ. LD. NO. 6..
L'invention concerne aussi un polynucléotide isolé qui code pour un récepteur GnRH naturel, ledit polynucléotide étant susceptible d'être obtenu par un procédé comportant les étapes successives suivantes : a) réaction de polymérisation en chaîne (PCR) sur une banque d'ADNc humain de tissus de cerveau ou d'hypophyse avec 0,5 μM d'amorce FI (de séquence SEQ. LD. NO. 1) et d'amorce RI (de séquence SEQ. ID. NO. 2), 200 μM de déoxynucléotides triphosphate (ou dNTPs : dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM de MgCl2 et 0,5 U de Taq ADN polymérase dans un volume final de 50 μl, les paramètres de cycles thermiques comprenant une dénaturation à 94° C pendant 30 s, une hybridation des amorces à 60° C pendant 1 minute et une extension de polymérisation à 72° C pendant 30 s (avec une extension finale de 5 minutes) ;
b) hydrolyse des séquences HindIII et EcoRI ; et
c) séparation sur gel d'agarose 1%.
L'mvention se rapporte également au récepteur GnRH isolé codé par un polynucléotide susceptible d'être obtenu par le procédé qui vient d'être décrit.
Un objet supplémentaire de l'invention est un vecteur recombinant contenant la séquence nucléotidique de l'un des polynucléotides décrits précédemment. L'invention concerne de plus un vecteur recombinant contenant la séquence nucléotidique de l'un desdits polynucléotides associée à une séquence nucléotidique de régulation contenant des informations de régulation transcriptionnelle et traductionnelle qui contrôlent l'expression de la séquence nucléotidique dans une cellule hôte.
L'invention offre également une cellule génétiquement modifiée contenant la séquence nucléotidique de l'un des polynucléotides décrits précédemment. Elle offre encore une cellule génétiquement modifiée contenant la séquence nucléotidique de l'un desdits polynucléotides associée à une séquence nucléotidique de régulation contenant des informations de régulation transcriptionnelle et traductionnelle qui contrôlent l'expression de la séquence nucléotidique dans une cellule hôte.
L'mvention concerne en outre l'utilisation de l'un des récepteurs définis précédemment pour la découverte d'agents thérapeutiques, et en particulier pour la découverte d'agents thérapeutiques destinés à traiter les pathologies dépendantes des stéroïdes gonadiques, et en particulier : - chez la femme : l'endométriose, le fibrome, la désensibilisation hypophysaire gonadotrope lors des protocoles de procréation médicalement assistée, le cancer du sein chez la femme pré-ménopausée, le syndrome des ovaires polykystiques, le cancer de l'ovaire et le cancer de l'endomètre ; - chez l'homme : l'hyperplasie bénigne de la prostate et le cancer de la prostate ;
- la puberté précoce masculine ou féminine.
Par ailleurs, l'invention aura encore pour objet l'utilisation de l'un des récepteurs définis précédemment pour la découverte d'agents thérapeutiques pour la découverte d'agents thérapeutiques destinés à protéger les ovaires chez la femme qui est soumise à une chimiothérapie ou à traiter l'adénome gonadotrope.
L'invention concerne encore, en tant que médicament, l'un des récepteurs définis précédemment ou un fragment biologiquement actif d'un de ceux-ci. Elle concerne également une composition pharmaceutique contenant, à titre de principe actif, l'un des récepteurs définis précédemment ou un fragment biologiquement actif d'un de ceux-ci. Elle concerne en outre l'utilisation desdits récepteurs ou fragments biologiquement actifs de ceux-ci pour préparer un médicament destiné à traiter les pathologies dépendantes des stéroïdes gonadiques, et en particulier :
- chez la femme : l'endométriose, le fibrome, la désensibilisation hypophysaire gonadotrope lors des protocoles de procréation médicalement assistée, le cancer du sein chez la femme pré-ménopausée, le syndrome des ovaires polykystiques, le cancer de l'ovaire et le cancer de l'endomètre ;
- chez l'homme : l'hyperplasie bénigne de la prostate et le cancer de la prostate ;
- la puberté précoce masculine ou féminine. L'invention concerne encore par ailleurs l'utilisation d'un des récepteurs définis précédemment ou d'un fragment biologiquement actif d'un de ceux-ci pour préparer un médicament destiné à protéger les ovaires chez la femme qui est soumise à une chimiothérapie ou à traiter l'adénome gonadotrope.
D'autres objets et intérêts de la présente invention deviendront encore évidents à la lumière de la description détaillée qui suit.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Selon la présente invention, le récepteur GnRH-R2 humain peut être clone et exprimé. GnRH-R2 est caractérisé par sept segments trans-membranaires caractéristiques des récepteurs couplés aux protéines G ; mais, contrairement au récepteur GnRH-R, GnRH-R2 possède une extrémité intra-cellulaire C-terminale avec en séquence finale la présence d'un domaine PDZ d'ancrage au cytosquelette (PSD-95/discs large/ZO-1, décrit dans Kornau et coll., Science (1995), 269, 1737-1740).
GnRH-R2 produit ici peut être utilisé pour évaluer et cribler des produits et des analogues de GnRH impliqués dans l'activation, la régulation ou le découplage de GnRH-R2. Alternativement, l'ADN de GnRH-R2, des ohgonucléotides sens ou anti-sens, GnRH-R2, des fragments peptidiques de celui-ci, ou des anticorps dirigés contre celui-ci peuvent être utilisés dans des méthodes de diagnostic et/ou thérapeutiques.
La séquence d'acides nucléiques codante (SEQ. ID. NO. 3 ou SEQ. ID. NO. 5) et la séquence en acides aminés déduite (SEQ. ID. NO. 4 ou SEQ. ID. NO. 6) pour le récepteur humain GnRH-R2 sont décrites dans la présente demande. La phase de lecture ouverte complète code pour une protéine de 354 ou 379 acides aminés d'environ 39 000 daltons. L'analyse d'hydrophobicité de la protéine déduite révèle 7 portions composées d'acides aminés hautement hydrophobes. Contrairement au premier récepteur humain GnRH-R découvert, GnRH-R2 possède une longue extrémité C-terminale avec la présence d'un motif de reconnaissance PDZ (ITSI-Stop) en bout de chaîne C-terminale.
La présente invention a pour objet des polynucléotides ou polypeptides isolés. Un polynucléotide ou un polypeptide est dit « isolé » s'il est pris hors de son environnement original. En particulier, un polynucléotide ou un polypeptide est isolé s'il est séparé du matériel biologique avec lequel il coexiste dans le système naturel.
Selon l'invention, les séquences qui codent pour GnRH-R2 et des fragments ou des protéines de fusion de GnRH-R2 peuvent être utilisés pour générer des molécules d'ADN recombinant qui dirige l'expression de GnRH-R2, ou d'une portion active de celui-ci, dans des cellules hôtes appropriées. Alternativement, des séquences qui s'hybrident avec des portions des séquences de GnRH-R2 peuvent également être utilisées dans des essais d'hybridation d'acides nucléiques, Southern blot, Northern blot, etc. A cause de la dégénération du code génétique, d'autres séquences d'ADN codant substantiellement pour la séquence en acides aminés de GnRH-R2 peuvent être utilisées pour le clonage et l'expression de GnRH-R2. De telles séquences d'ADN incluent celles capables d'hybrider les séquences de GnRH-R2 dans certaines conditions de stringence qui peuvent être ajustées de plusieurs manières. Par exemple, lors de réaction de polymérisation en chaîne (PCR), la température à laquelle s'hybrident les amorces à la matrice ou les concentrations de MgCl2 dans le tampon réactionnel, peuvent être ajustés. Lors de l'utilisation de fragments d'ADN radio-marqués, ou d'oligonucléotides pour sonder des membranes, la stringence peut être ajustée en changeant les forces ioniques des solutions de lavage ou en contrôlant avec précaution la température de lavage.
L'invention comprend en particulier les polynucléotides présentant une homologie d'au moins 75 % avec le polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 3 ou SEQ. ID. NO. 5. Le degré d'homologie exprimé en % est calculé comme suit : 100 - 100 x (N7N) avec N' représentant le nombre de nucléotides modifiés par rapport à la séquence SEQ. LD. NO. 3 ou SEQ. ID. NO. 5 et N le nombre de nucléotides de SEQ. LD. NO. 3 ou SEQ. ID. NO. 5.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue s'hybride spécifiquement avec la séquence complémentaire à la séquence SEQ. ID. NO. 3 ou SEQ. LD. NO. 5 dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent (T.J.
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, et d'après Sambrook et coll. (Molecular cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Tm est définie par la relation :
Tm = 81,5 + 0,41 x (% G+C) + 16,6 x log[cations] - 0,63 x (% formamide) - (600 / nombre de bases)
Pour la présente invention, les conditions de stringence seront dites « fortes » lorsque l'on utilise une température d'hybridation de 10° C en dessous de Tm et des tampons d'hybridation contenant une solution 6 x SSC (chlorure de sodium 0,9 M et citrate de sodium 0,09 M). Dans de telles conditions, les polynucléotides de séquences aspécifiques ne s'hybrideront pas avec le polynucléotide de la séquence complémentaire à la séquence SEQ. ID. NO. 3 ou SEQ. LD. NO. 5. Des séquences d'ADN altérées qui peuvent être utilisées en accord avec la présente invention incluent des délétions, des additions ou des substitutions de différents résidus nucléotidiques résultant dans une séquence qui code le même produit du gène ou de fonction équivalente. Le produit du gène peut également contenir des délétions, des additions ou des substitutions de résidus d'acides aminés dans la séquence de GnRH-R2, qui résultent dans des changements dits silencieux, produisant ainsi un GnRH-R2 de fonction équivalente.
De telles substitutions en acides aminés peuvent être réalisés sur la base de la polarité, de la charge, de la solubilité, de l'hydrophobicité, de l'hydrophilicité, et/ou de la nature amphipatique des résidus impliqués.
Par exemple, des acides aminés chargés négativement incluent l'acide aspartique et l'acide glutamique, des acides aminés chargés positivement incluent la lysine et Farginine, des acides aminés avec des groupements polaires ayant des valeurs d'hydrophobicité voisines incluent la leucine, l'isoleucine, la valine ; la glycine, l'alanine ; l'asparagine, la glutamine ; la serine, la thréonine ; la phénylalanine, la tyrosine. Un récepteur ayant une fonction équivalente à GnRH-R2 réfère à un récepteur qui fixe GnRH mais pas nécessairement avec la même affinité de son équivalent natif GnRH-R2.
Les séquences d'ADN de la présente invention peuvent être modifiées pour altérer la séquence codant pour GnRH-R2 pour de nombreuses raisons incluant de manière non limitative des altérations qui modifient le processus et l'expression du produit du gène. Par exemple, des mutations peuvent être introduites en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple la mutagénèse dirigée, l'insertion de nouveaux sites de restriction, l'altération des glycosylations, la phosphorylation, etc.
En particulier, dans certains systèmes d'expression comme la levure, la cellule hôte peut sur-glycosyler le produit du gène. Dans un tel système, il est préférable d'altérer la séquence codante de GnRH-R2 pour éliminer les sites de glycosylation. Dans l'étendue de la divulgation de la présente invention figurent également une séquence GnRH-R2 ou GnRH-R2 modifiée liée à une séquence hétérologue pour coder une protéine de fusion. La protéine de fusion peut être modifiée pour contenir une site de clivage localisé entre la séquence de GnRH-R2 et la séquence de la protéine hétérologue, de telle sorte que GnRH-R2 peut être clivé de la partie hétérologue.
La séquence codant pour GnRH-R2, qui fait partie de la présente invention, peut être synthétisée entièrement ou en partie en utilisant des méthodes chimiques bien connues de l'homme du métier qui pourra notamment se référer aux publications suivantes : Caruthers et coll., Nue. Acids Res. Symp. Ser. (1980), 7, 215-233 ; Créa et Horn, Nue. Acids Res., 9(10), 2331 ; Matteucci et Caruthers, Tetrahedron Lett. (1980), 21, 719 ; et Chow et Kempe, Nue. Acids Res. (1981), 9(12), 2807-2817.
Alternativement, la protéine elle-même peut être produite en utilisant des méthodes chimiques pour synthétiser la séquence en acides aminés de GnRH-R2 entièrement ou en partie.
Dans le but d'exprimer le récepteur GnRH-R2 biologiquement actif, la séquence nucléotidique codant pour GnRH-R2 ou un équivalent fonctionnel comme décrit ci-dessus, est insérée dans un vecteur d'expression approprié, i.e., un vecteur contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence codante insérée. Les produits du gène GnRH-R2 ainsi que les cellules hôtes ou les lignées cellulaires transfectées ou transformées avec le vecteur d'expression recombinant GnRH-R2 peuvent être utilisés dans de nombreux cas qui incluent mais ne sont pas limités à la génération d'anticorps (i.e. monoclonaux ou polyclonaux) qui fixent le récepteur, y compris ceux qui inhibent de manière compétitive la fixation de GnRH et neutralisent son activité, le criblage et la sélection d'analogues de GnRH ou des produits qui agissent via le récepteur GnRH-R2, etc.
Des méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour construire des vecteurs d'expression contenant la séquence codant pour GnRH-R2 et les signaux de contrôles de transcription/traduction. Ces méthodes incluent les techniques in vitro d'ADN recombinant, les techniques synthétiques et les recombinaisons génétiques (cf. par exemple les techniques décrites dans Maniatis et coll., Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) et Ausubel et coll., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates et Wiley Interscience (1989), New York).
Une variété de systèmes hôtes/vecteur d'expression peut être utilisée pour exprimer la séquence codant pour GnRH-R2. Lesdits systèmes incluent mais ne sont pas limités aux microorganismes comme une bactérie transformée par un ADN recombinant de bactériophage, des vecteurs d'ADN de plasmides ou cosmides contenant la séquence codant pour GnRH-R2, des levures transformées avec des vecteurs d'expression contenant la séquence codant pour GnRH-R2, des systèmes de cellules d'insectes infectées par un vecteur d'expression viral (par exemple un baculovirus) contenant la séquence codant pour GnRH-R2, des cellules de plantes infectées par un vecteur d'expression viral (par exemple le cauliflower mosaic virus (CaMN) ou le tobacco mosaic virus (TMN)) ou transformées par un vecteur d'expression plasmidique (par exemple Ti plasmid) contenant la séquence codant pour GnRH-R2, ou un système de cellule animale infectée par un vecteur d'expression viral recombinant (par exemple adéno virus ou vaccinia virus).
Les éléments d'expression de ces systèmes varient selon le système hôte/vecteur utilisé. Par exemple, lorsque le clonage a lieu dans un système de cellules de mammifères, les promoteurs qui dérivent du génome de cellules de mammifères (par exemple un promoteur métallothionéine) ou à partir de virus de mammifères (par exemple le promoteur tardif d'adénoviras (adenovirus late promoter) ou le promoteur de vaccinia virus 7,5 K) peuvent être utilisés.
L'invention concerne de plus le clonage de l'ADNc de GnRH-R2 dans un vecteur d'expression pCDNA 3.1. Des cellules HEK peuvent être transfectées avec la construction vecteur/GnRH-R2 de manière transitoire ou de façon stable en utilisant un réactif Effectene selon les recommandations du fabricant (Qiagen).
De nombreuses procédures connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour la production d'anticorps contre des épitopes du récepteur GnRH-R2 produit de manière recombinante. Des anticorps neutralisants, ceux qui réalisent une compétition avec les sites de fixation à GnRH sur le récepteur GnRH-R2 sont préférés pour une utilisation dans des méthodes de diagnostic ou thérapeutiques.
Pour la production d'anticorps, différentes espèces d'animaux peuvent être immunisées par injection de GnRH-R2 (y compris, notamment, les lapins, les souris, les rats, etc.). Des adjuvants peuvent être utilisés pour augmenter la réponse immunologique, dépendant de l'espèce hôte, notamment le réactif de Freund, des gels minéraux comme l'hydroxide d'aluminium, des substances ayant des surfaces activées comme la lysoélicithine, des polyols pluroniques, des polyanions, des peptides, des huiles minérales, du dinitrophénol, etc.
Des anticorps monoclonaux contre GnRH-R2 peuvent être préparés en utilisant n'importe quelle technique qui permet la production de molécules d'anticorps dans des cultures de lignées cellulaires comme, par exemple, les techniques d'hybridomes originellement décrites par Kohler et Milstein (Nature (1975), 256, 495-497), la technique d'hybridome de cellules B (Kosbor et coll., Immunology Today (1983), 4, 72 ; Cote et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. (1983), 80, 2026-2030). Des fragments d'anticorps reconnaissant les sites spécifiques de liaison de GnRH-R2 peuvent être générés par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. De tels fragments comprennent notamment les fragments F(ab')2 qui peuvent être obtenus par digestion trypsique de la molécule d'anticorps. L'ADN de GnRH-R2, les ohgonucléotides anti-sens, les produits d'expression de GnRH-R2, les anticorps et les lignées cellulaires hôtes exprimant GnRH-R2 décrits ci-dessus sont utiles dans le domaine du diagnostic et en thérapeutique, mais également pour la recherche pharmacologique et la découverte de médicaments.
Par exemple, la séquence d'ADN de GnRH-R2 peut être utilisée dans des essais d'hybridation sur biopsies pour diagnostiquer une expression anormale de GnRH-R2, par exemple une analyse par les techniques de Southern et de Northern, incluant les essais d'hybridation in situ. Dans le domaine thérapeutique, des molécules anti-sens définies sur la base de la séquence d'ADN de GnRH-R2 peuvent être utilisées pour bloquer le transport et l'expression de GnRH-R2. Alternativement, l'ADN de GnRH-R2 peut être utilisé en thérapie génique pour introduire le gène normal recombinant dans des cellules défectives ou pour corriger des mutations afin de reconstituer GnRH-R2 et sa fonction.
Également selon la présente invention, des anticorps spécifiques contre GnRH-R2 peuvent être utilisés pour déterminer le profil d'expression du récepteur dans des biopsies de tissus, ou pour permettre des diagnostics à partir d'imagerie médicale réalisée in vivo. Par exemple, un anticorps couplé à une entité de détection en imagerie peut être administré à un patient pour localiser la distribution de GnRH-R2 in vivo.
Toujours selon l'invention, le récepteur GnRH-R2, ou un fragment de celui-ci contenant son site de fixation, peut être administré in vivo. Le récepteur libre ou le fragment peptidique de celui-ci peut réaliser une compétition pour la fixation de GnRH et inhiber son interaction avec le récepteur natif vivo.
A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevets, tous les brevets et toutes autres références mentionnées ici sont incorporées par référence.
Les paragraphes qui suivent décrivent une méthode pour cloner un ADNc codant pour le récepteur GnRH-R2. Çlonqge [ du récepteur GnRH-R2
Dans un premier temps, une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est réalisée sur une série de banques d'ADNc disponibles commercialement de tissus du cerveau ou de l'hypophyse dans lesquels GnRH est habituellement exprimé (cf. Kakar et coll., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 189, 289-295) en utilisant les amorces FI de séquence SEQ. ID. NO. 1 et RI de séquence SEQ. ID. NO. 2. Ces séquences, reproduites ci-après, contiennent respectivement des séquences de sites de restriction HindIII et EcoRI.
Les séquences SEQ. ID. NO. 1 et SEQ. ID. NO. 2 des amorces FI et RI sont les suivantes :
- SEQ. LD. NO. 1 : 5'- GCA AGC TTC CAC CAT GTC TGC AGG C-3'
- SEQ. LD. NO. 2 : 5'- CGG AAT TCG GGG GGA ACT AGG AG -3'
Les conditions de réaction incluent 0,5 μM de FI (de séquence SEQ. ID. NO. 1) et de RI (de séquence SEQ. ID. NO. 2), 200 μM de déoxynucléotides triphosphate (ou dNTPs : dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 et 0,5 U Taq ADN polymérase dans un volume final de 50 μl. Les paramètres de cycles thermiques comprennent une dénaturation à 94° C pendant 30 s, une hybridation des amorces à 60° C pendant 1 minute et une extension de polymérisation à 72° C pendant 30 s (avec une extension finale de 5 minutes).
Les produits de PCR sont ensuite séparés sur gel d'agarose 1 % et visualisés par une coloration au bromure d'éthidium.
La séquence en acides nucléiques obtenue ainsi contient les sites de restriction HindIII dans la partie 5' et EcoRI dans la partie 3', permettant une insertion directement dans un vecteur d'expression, par exemple un vecteur d'expression de type pCDNA3.1 (InVitrogen).
Après l'étape d'amplification par PCR présentée ci-dessus, les produits sont soumis à une hydrolyse HindIII et EcoRI afin de libérer des extrémités contenant ces séquences puis purifiés à partir du gel d'agarose par électroélution. La séquence obtenue est ensuite insérée dans un vecteur d'expression comme par exemple pCDNA3.1 (InNifrogen). L'analyse par digestion par des enzymes de restriction convenables de différents clones bactériens ayant reçu ledit vecteur d'expression permet d'isoler les clones bactériens contenant la nouvelle construction « vecteur d'expression / polynucléotide codant pour GnRH-R2 ». La préparation en grande quantité de ces constructions plasmidiques est réalisée à l'aide d'un kit de purification d'ADN plasmidique (Qiagen).
L'intérêt de l'invention dans le domaine thérapeutique peut être apprécié à l'aide des tests pharmacologiques décrits ci-après.
Tests pharmacologiques
A) Affinité de GnRH pour le récepteur GnRH-R2 :
Les cellules sont récupérées 48 h après la transfection par un traitement à la trypsine. Pour la préparation membranaire, les membranes des cellules transfectées avec le récepteur humain GnRH-R2 sont diluées à la concentration de 100 μg/ml dans le tampon réactionnel contenant 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM de MgCl2, 100 μg/ml de bacitracine et 0,1 % d'albumine de sérum bovin (BSA). Les membranes sont incubées avec 0,2 nM de [125L]D-Trp6-GnRH (NEN) dans un volume final de 200 μl pendant 1 heure à 4° C. La réaction est arrêtée par une filtration rapide sur des filtres 96 puits GF/1 pré-chargés à 0,5 % en polyéthylènimine. Les filtres sont ensuite lavés trois fois à 4 C avec du tampon de lavage contenant 50 mM Tris (pH 7,4) en utilisant une station de filtration Packard 96 puits. Les filtres ainsi séchés sont submergés de 40 μl de cocktail scintillant (Microscint O, Packard) et sont soumis à un comptage sur le Topcount (Packard). L'activité non-spécifique est déterminée en présence de 100 nM de D-Trp6-GnRH. Une courbe dose-réponse est générée pour D-Trp6-GnRH (0,001 nM à 100 nM) et permet de montrer l'affinité de GnRH pour le récepteur GnRH-R2.
B) Modulation de la production d'Inositol Phosphate :
La production d'Inositol Phosphate (LP) stimulée par GnRH est déterminée selon la méthode de Davidson et coll., Endocrinology (1990), 126, 80-87. En résumé, les cellules transfectées par GnRH-R2 sont incubées 18 h en présence de [H3]Inositol et stimulées avec 100 nM de GnRH en présence de chlorure de lithium. La réaction est stoppée par l'addition d'acide formique 0,1 M à 4° C. Après neutralisation avec du Tris/Base 1 M, les Inositol Phosphates sont séparés sur une colonne échangeuse d'ions (Biorad) et comptés. Les résultats obtenus permettent d'apprécier la modulation de la production d'Inositol Phosphate par le récepteur GnRH-R2.

Claims

REVENDICATIONS
1. Récepteur GnRH-R2 isolé, lequel comprend la séquence d'acides aminés SEQ. ID. NO. 4 ou SEQ. ID. NO. 6.
2. Récepteur GnRH isolé codé par une séquence nucléotidique telle qu'il s'hybride avec le polynucléotide de séquence SEQ. LD. NO. 3 ou SEQ. ID. NO. 5.
3. Polynucléotide isolé comprenant soit la séquence de nucléotides SEQ. ID. NO. 3 ou SEQ. LD. NO. 5, soit la séquence complémentaire à ladite séquence de nucléotides SEQ. ID. NO. 3 ou SEQ. ID. NO. 5.
4. Polynucléotide isolé qui code pour un récepteur GnRH naturel, ledit polynucléotide comprenant une séquence nucléotidique telle qu'il s'hybride avec un polynucléotide selon la revendication 3.
5. Polynucléotide isolé comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ. ID. NO. 4 ou SEQ. ID. NO. 6.
6. Polynucléotide isolé qui code pour un récepteur GnRH naturel, ledit polynucléotide étant susceptible de s'hybrider avec un polynucléotide isolé selon la revendication 5.
7. Polynucléotide isolé qui code pour un récepteur GnRH naturel, ledit polynucléotide étant susceptible d'être obtenu par un procédé comportant les étapes suivantes :
a) réaction de polymérisation en chaîne (PCR) sur une banque d'ADNc humain de tissus de cerveau ou d'hypophyse avec 0,5 μM d'amorce FI (de séquence SEQ. LD. NO. 1) et d'amorce RI (de séquence SEQ. ID. NO. 2), 200 μM de déoxynucléotides triphosphate (ou dNTPs : dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl2 et 0,5 U de Taq ADN polymérase dans un volume final de 50 μl, les paramètres de cycles thermiques comprenant une dénaturation à 94° C pendant 30 s, une hybridation des amorces à 60° C pendant 1 minute et une extension de polymérisation à 72° C pendant 30 s
(avec une extension finale de 5 minutes) ;
b) hydrolyse des séquences HindIII et EcoRI ; et c) séparation sur gel d'agarose 1%.
8. Récepteur GnRH naturel codé par un polynucléotide isolé selon la revendication 7.
9. Vecteur recombinant contenant la séquence nucléotidique d'un polynucléotide selon l'une des revendications 3 à 7.
10. Cellule génétiquement modifiée contenant la séquence nucléotidique d'un polynucléotide selon l'une des revendications 3 à 7.
11. Utilisation d'un récepteur selon la revendication 1, 2 ou 8 pour la découverte d'agents thérapeutiques.
12. En tant que médicament, un récepteur selon la revendication 1, 2 ou 8 ou un fragment biologiquement actif de celui-ci.
13. Composition pharmaceutique contenant, à titre de principe actif, un récepteur selon la revendication 1, 2 ou 8, ou un fragment biologiquement actif de celui-ci.
14. Utilisation d'un récepteur selon la revendication 1, 2 ou 8 ou d'un fragment biologiquement actif de celui-ci pour préparer un médicament destiné à traiter les pathologies dépendantes des stéroïdes gonadiques.
15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que le médicament préparé est destiné à traiter l'une des pathologies suivantes :
- chez la femme : l'endométriose, le fibrome, la désensibilisation hypophysaire gonadotrope lors des protocoles de procréation médicalement assistée, le cancer du sein chez la femme pré-ménopausée, le syndrome des ovaires polykystiques, le cancer de l'ovaire et le cancer de l'endomètre ;
- chez l'homme : l'hyperplasie bénigne de la prostate et le cancer de la prostate ;
- la puberté précoce masculine ou féminine.
16. Utilisation d'un récepteur selon la revendication 1, 2 ou 8 ou d'un fragment biologiquement actif de celui-ci pour préparer un médicament destiné à protéger les ovaires chez la femme qui est soumise à une chimiothérapie.
17. Utilisation d'un récepteur selon la revendication 1, 2 ou 8 ou d'un fragment biologiquement actif de celui-ci pour préparer un médicament destiné à traiter l'adénome gonadotrope.
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