KR20020074082A - ｒｅｇ-유사 단백질 - Google Patents

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KR20020074082A
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Abstract

본 발명은 생물학적 샘플내에 존재하는 단백질의 존재, 부재, 농도 또는 발현 농도를 이용하여, 종양, 암 및 관련 질환의 존재 유무 뿐만 아니라, 당해 질환들과 관련된 예후 및 진단을 나타낼 수 있는 단백질에 관한 것이다.

Description

ｒｅｇ-유사 단백질{reg-Like protein}
본 발명은 생물학적 샘플내에 존재하는 단백질의 존재, 부재, 농도 또는 발현 농도를 이용하여, 종양, 암 및 관련 질환의 존재 유무 뿐만 아니라, 당해 질환들과 관련된 예후 및 진단을 나타낼 수 있는 단백질에 관한 것이다.
종양은 조직의 비정상적 덩어리이다. 종양은 증식이 제어되지 않을 경우에, 악성으로 불리게 된다. 이러한 상태를 일반적으로 암이라 부른다. 다수의 방법을 사용하여, 환자에 있어서 종양이 발전하여 악성으로 되는 시기를 측정한다. 다양한 종양 또는 암 마커를 동정하거나 정량화하는 방법이 이러한 측정을 수행하는데 한가지 바람직한 수단이다.
광범위하게는, "마커"는 정상 조직 및 다른 질환과 암을 구별하는데 사용할 수 있는 임의의 특성이다. 이러한 마커의 존재는 분류에 대한 기초이다. 보다 구체적으로, 당해 용어는 분석하기 쉬운 특정 분자를 나타내는데 사용된다. 혈청 마커는 당해 명칭이 암시하듯이 환자의 혈청에서 용이하게 분석할 수 있는 마커이다. 전형적으로, 마커는 정상 세포와 조직에서 존재하는 양(또는 전혀 존재하지 않음)보다 종양 세포에서 훨씬 다량으로 존재하는 분비형 단백질이거나 세포 수용체이다. 그 예로는 PSA, CEA 및 AFP가 있다.
보다 확대된 종양 및 암 마커에 대한 고찰 방법으로는 다양한 세포에서 생성되는 핵산(뿐만 아니라 핵산과 관련있는 다른 물질)으로부터 종양과 암을 검출하는 방법을 포함한다. 암은 일반적으로 다발성 변이 질환인 것으로 생각된다. 따라서, 분자 수준에서의 변이 측정은 오랫동안 암 마커로 사용되어 온 일부 마커에 의해 가능한 것보다 더 직접적이고 신뢰성이 있는 진단 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이와 같이, 암 질환을 유발하거나 암 질환과 함께 일어나는 변이를 나타내는 핵산 서열을 암 마커로 간주하는 것이 적합하다. 한편, 핵산 분석의 수행력은 혈청 마커의 가치를 떨어뜨리지 않는다. 각 핵산은 환자의 진단, 스테이징 및 치료 모니터링에 적합한 역할을 할 수 있다.
암 관련 항원 및 암 관련 사건을 암호화하는 유전자의 발견은 또한 암 세포 증식에 대한 유전자적 개입의 기회를 제공한다. 암을 정상 조직과 구별하는데 정확하고 일관되게 사용되는 암 마커는 진단적으로 잠재성이 있을 뿐만 아니라, 치료와 예후에도 바람직하다. 따라서, 이러한 마커에 대한 연구는 계속되어야 한다.
C형 렉틴 상과에 속하는 reg 단백질은 약 20kD의 분비형 단백질이다. 당해 단백질은 위장관의 정상 조직과 악성 조직, 뇌하수체 및 재생 뉴런에서 발견된다. reg의 발현은 세포 증식, 이동 및 분화와 관련이 있다(Chiba T et al., 2000, J. Gastroenterol 35 Suppl 12:52, Levine JL, 2000, Surg Res 89:60, Otonkoski T et al., 1994, Diabetes 43:1164, Bernard-Perronese FR, 1999, J Histochem Cytochem 47:863). 공지의 reg 유전자는 사람 염색체 2p12에 밀집해 있다.
reg 단백질과의 제1 특징화 일원은 Reg1α로서, 랫트의 재생 췌도에서 분리되었다(Terazono et al., 1988). 그 후, 또 다른 4개의 사람 reg 단백질을 암호화하는 cDNA 및 이에 상응하는 마우스 및 랫트의 오르토로그(ortholog)도 클로닝되었다(Watanabe et al., 1990; Lasserre et al., 1992; Bartoli et al., 1993; Rafaeloff et al., 1997). 이들은 상피 세포 및 신경외피세포의 아군에 대하여 유사분열 활성을 나타낸다(Katsumata et al., 1995, Zenilman et al., 1996, 1997, 1998; Livesey et al., 1997). 랫트의 reg1 단백질에 대한 성장 신호 형질도입 수용체도 최근 기술되었다. 당해 수용체는 사람의 다발성 외골증 유전자와 동일성인 유전자에 의해 암호화된다. 당해 수용체는 췌도외에도 신장, 간, 위, 부신 및 뇌하수체를 비롯한 다양한 조직에서 발현되는 것으로 밝혀져 있다(Kobayashi S et al. 2000).
여전히 암의 진단, 치료 및 예방에 있어서 새로운 종양 및 암 마커의 동정,분리 및 사용의 중요하다.
본 발명은 RELP 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공하기 위한 것이다. 당해 분자는 서열 2의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드와 70% 이상의 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 분자인 서열 1의 핵산 분자일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 분자에 상보적인 핵산 분자, 서열 1의 핵산 서열의 적어도 15개 이상의 연속 염기의 핵산 분자 또는 엄격한 조건하에서 서열 1의 핵산 서열 분자에 하이브리드하는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 분리된 RELP가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 종양이나 암 질환의 존재를 검출하는 방법은 전술한 서열의 폴리펩타이드, 단백질 및 핵산 분자의 발현을 검출하는 단계, 생물학적 샘플내에 존재하는 상기 분자의 존재 또는 농도와 상기 종양이나 암 질환의 존재 또는 부재와의 상호관계를 나타내는 단계를 포함한다.
또 다른 본 발명의 양태에 있어서, RELP 및 이의 기능적 등가물에 결합하는 항체도 제공된다.
또 다른 본 발명의 양태에 있어서, 전술한 폴리펩타이드, 단백질 또는 핵산 서열을 검출하기 위한 키트도 제공된다.
도 1은 RELP를 암호화하는 cDNA의 핵산 서열(서열 1)이다.
도 2는 RELP의 아미노산 서열(서열 2)이다.
도 3은 RELP 신호 단백질을 암호화하는 cDNA의 핵산 서열(서열 3)이다.
도 3a는 RELP 신호 단백질의 아미노산 서열(서열 4)이다.
도 4는 RELP 유전자의 축척 도식도이다.
용어 정의:
본 명세서에 사용된 "단백질 상과"라는 용어는 진화 관계가 완전하게 정립되지 않을 수 있거나, 인가된 계통발생 기준과 관계가 멀 수 있지만, 유사한 3차원 구조를 나타내거나 결정적인 아미노산의 컨센서스를 나타내는 단백질을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "단백질과"란 용어는 인가된 계통발생 기준에 의해 진화 관계가 정립된 단백질을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "핵산 서열"이란 용어는 변형 염기를 1개 이상 포함하는 전술한 DNA 또는 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성이나 다른 이유로 변형시킨 DNA 또는 RNA는 본 명세서에서 상기 용어가 의미하는 "핵산 서열"이다. 또한, 2가지 예만을 들어보면 이노신과 같은 희귀 염기, 또는 트리틸화된 염기와 같은 변형 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA도 본 명세서에서 당해 용어가 사용된 바와 같은 핵산 서열이다. DNA 또는 RNA에는 당해 기술 분야에 공지된 많은 유용한 목적을 위한 다양한 변형이 제공되어 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 핵산 서열이란 용어는 핵산 서열의 이러한 화학적, 효소적 또는 대사적 변형 형태 뿐만 아니라, 특히 단순 세포 또는 복합 세포를 비롯한 세포 및 바이러스에서 특징으로 나타나는 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다. 핵산 서열은 올리고뉴클레오티드라고 불리기도 하는 짧은 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용된 RELP의 "기능적 유도체"란 용어는 RELP의 생물학적 활성과 거의 유사한 생물학적 활성(또는 기능적 또는 구조적)을 보유하는 화합물이다."기능적 유도체"란 용어에는 RELP의 "단편", "변형체", "축퇴성 변형체", "유사체" 및 "상동체" 또는 "화학적 유도체"를 포함한다. 한 분자가 RELP와 "실질적으로 유사하다"는 것은, 두 분자가 거의 유사한 구조를 갖거나 또는 두 분자가 유사한 생물학적 활성을 갖고 있다는 것이다.
새로이 동정된 단백질인 "RELP"(Reg 유사 단백질)를 본 명세서에서 특성규명한다. 당해 단백질을 암호화하는 핵산(예를 들어, cDNA 포함)을 분리 및 클로닝하여, 암 진단에 유용한 당해 화합물의 용도를 제시하였다. 유전자 구조 및 이의 염색체 위치를 제시하고, 이의 발현의 조직 분포에 대하여 기술한다. 또한, 당해 단백질에 결합하는 항체를 제조하고, 이의 사용 방법도 고안하였다. 또한, 마우스의 RELP 상동체를 클로닝하고, 특성을 규명하였다.
본 명세서에 기술된 모든 핵산 서열은 별다른 표시가 없는 한 5'→3' 방향으로 제시하였다.
도 1은 RELP를 생성하는데 사용된 cDNA의 핵산 서열(서열 1)이다. RELP cDNA는 추정의 22개 아미노산 신호 펩타이드를 보유한 158개 아미노산 단백질을 암호화한다(도 3). RELP의 분자량은 약 18kd이고, 등전점은 9.128로 계산되었다. RELP의 아미노 말단은 고도의 소수성이고, 22개 아미노산의 절단가능한 신호 서열을 포함한다. 사람 Reg 단백질은 서로 51 내지 87% 동일하고, 55 내지 87% 유사한 반면, RELP는 상기 단백질에 32 내지 37% 동일하고, 42 내지 47% 유사하다.
RELP의 1차 구조는 단일 탄수화물 인식(CRD) 도메인을 포함하는 C형 렉틴 상과 단백질 아군의 1차 구조와 유사하다. 분자내 이황화 결합에 관여하는 CRD에 결합된 4개의 보존성 시스테인과 2개의 선택성 시스테인은 RELP에서 모두 보존된다. 잔기 50 내지 53은 추정의 N-글리코실화 부위를 포함한다. RELP의 2차 구조는 사람 Reg1α의 2차 구조와 유사하고, 당해 단백질들의 총체적인 폴드(fold)가 관련되는 것으로 나타난다. RELP의 아미노산 서열은 도 2에 제시한다(서열 2).
RELP 유전자는 염색체 1 밴드 p12-13.1 상에 존재하고, 약 17,500개 염기쌍에 이르며, 7개의 엑손을 포함한다. 도 4는 엑손 사이의 거리가 일정 비율로 도시된 유전자를 개략적으로 도시한 것이다. 각 엑손의 위치는 로마 숫자로 표시하였다.
정상 조직에서 RELP의 발현: RELP 메시지는 소장에 존재하는 상피 세포 아군에서 고도로 발현된다. 당해 세포 아군은 소장의 신경내분비 세포(크로모그라닌의 공동국재화로 입증됨)를 나타낸다. RELP mRNA는 또한 위, 결장의 다양한 부분(음와 하부의 상피 세포에 국재화된 경우), 췌장, 전립선 및 정소에서 관찰된다.
질환에 걸린 조직에서의 RELP의 발현: RELP는 다양한 기관, 예를 들어, 난소, 위, 결장, 유방 및 췌장으로부터 유래되는 점액성 종양에서 전위적으로 다량 발현된다. RELP mRNA의 발현은 점액성 난소 종양에서 매우 높은 것으로 보인다. 단백질 수준에서의 균일한 높은 발현은 점액성 난소 종양, 위 종양, 결장 종양 및 유방 종양 유래의 상피 세포에서 관찰된다. 선관내의 점액성 췌장 종양 역시 RELP를 발현시킨다. 이러한 종양은 재발성 췌장염을 소인으로 하는 새롭게 확인된 췌장 질환으로서 나타나고 있다. 이들은 악성으로 발전하기 쉬울 것으로 예상된다.
검체 유래의 생물학적 샘플은 암 세포가 검체에 존재하는지를 측정하는데 사용된다. 적합한 샘플의 예로는 혈액과 생검 물질을 포함한다. 1가지 진단 방법은 RELP 유전자 전사체, 이의 단편에 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 표지된 프로브에 샘플에 함유된 세포 유래의 RNA를 노출시키는 것이다. 물론, 하이브리드화 조건은 생물학적 샘플의 성질, 암 종류, 프로브 제조 방법 및 조직 제조 방법에 따라 최적의 민감성과 특이성을 수득하기 위하여 변화시킨다.
샘플을 프로브와 접촉시킨 후, 다음 단계는 RELP 유전자의 발현이 추론된 샘플로부터 얻어진 mRNA의 뉴클레오티드 서열과 프로브가 하이브리드하였는지를 측정하는 것으로서, 상승된 농도의 존재는 암으로 진단될 수 있다.
또 다른 진단 방법은 항원성(즉, RELP) 펩타이드에 지시된 항체와 샘플을 접촉시키는 것이다. 이러한 항체는 RELP 항원을 검출하기 위한 고도의 특이적 분석법의 개발에 유용한 것으로서, 다양한 여러 방식으로 시험이 수행될 수 있도록 한다. 항체는 표지된 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. RELP는 분비형 분자이므로, RELP-발현 암을 검출하거나 추적하기 위하여 혈청, 혈장, 낭포액, 췌장액 및 뇨와 같은 체액내의 RELP 항원의 존재를 검출하는 방법이 사용될 수 있다. 전형적으로, 당해 단백질은 정상 발현 수준과 비교할 경우에 질환에 걸린 조직(전술한 바와 같음)에서 100배 내지 1000배 사이로 발현된다. 따라서, 혈청에서는 정상 농도에 비하여 200 내지 1000%의 농도가 본 발명의 혈청 분석에서 검출될 것이다. 가장 일반적으로는, 정상 RELP 농도의 약 250%의 혈청 농도가 결장암 환자에서 예상될 수 있다. 이와 마찬가지로, mRNA 발현 농도를 분석하는 분자 진단 시험에서는 발현 농도가 정상 농도의 150 내지 1000%인 경우에 질환을 나타낸다.
정제된 생물학적 활성 RELP는 여러 가지 물리적 형태를 가질 수 있다. RELP는 전장의 초기 폴리펩타이드 또는 프로세싱되지 않은 폴리펩타이드로서 존재하거나 또는 부분적으로 프로세싱된 폴리펩타이드 또는 프로세싱된 폴리펩타이드의 배합물으로서 존재할 수 있다. 전장의 초기 RELP 폴리펩타이드는 전장의 초기 폴리펩타이드의 단편을 형성시키는 특이적 단백분해 절단 과정에 의해 해독후 변형될 수 있다. 단편 또는 단편의 물리적 결합은 RELP와 관련된 완전한 생물학적 활성을 가질 수 있으나, RELP 활성의 정도는 각각의 RELP 단편 및 물리적으로 결합된 RELP 폴리펩타이드 단편마다 달라질 수 있다.
특정 아미노산을 암호화하는 다양한 코돈에는 상당량의 중복이 존재하므로, 본 발명은 또한 최종적으로 동일한 아미노산으로 해독되는 대안적 코돈을 포함하는 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명의 목적상, 1개 이상의 대체 코돈을 보유하는 서열은 축퇴성 변화로서 정의될 수 있다. 또한, 발현된 단백질의 최종적인 물리적 성질을 실질적으로 변화시키지 않는, DNA 서열 또는 해독된 단백질내의 변이도 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 지방족 아미노산인 알라닌, 발린, 로이신 및 이소로이신의 치환; 하이드록실 잔기인 세린과 트레오닌의 상호교환, 산성 잔기인 아스파르트산과 글루탐산의 교환, 아미드 잔기인 아스파라긴과 글루타민간의 치환, 염기성 잔기인 리신과 아르기닌의 교환 및 방향족 잔기 중에서 페닐알라닌과 타이로신은 폴리펩타이드의 작용성에 변화를 일으키지 않는다. 이러한 치환은 공지된 것이고, 예를 들어, 문헌[참조:Molecular Biology of the Gene, 4thEd. BengaminCummings Pub.Co. by Watson et al.]에 제시되어 있다.
펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 천연 펩타이드의 성질과 상이한 성질을 갖는 펩타이드를 암호화하도록 변화시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. DNA 서열을 변화시키는 방법으로는, 부위 지시된 돌연변이유발법, 키메라성 치환 및 유전자 융합을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 부위 지시된 돌연변이유발법은 잠재성 돌연변이, 보존성 돌연변이 또는 비보존성 돌연변이를 생성할 수 있는 1개 이상의 DNA 잔기를 변화시키는데 사용한다. 키메라 유전자는 RELP 유전자에 존재하는 유사 도메인을 치환시키기 위하여 유사하거나 상이한 유전자의 도메인을 교환하여 제조한다. 이와 마찬가지로, 융합 유전자는 RELP 유전자의 동정 및 분리를 용이하게 하기 위한 친화성 태그와 같은 도메인을 RELP 유전자에 첨가하여 제조할 수 있다. 융합 유전자는 RELP 유전자의 영역을 치환시키기 위하여, 예를 들어, 경막 도메인을 제거하거나 또는 표적 서열을 첨가하여 단백질의 정상 수송을 재유도하거나 또는 새로운 해독후 변형 서열을 RELP 유전자에 첨가하여 단백질의 가용성 형태를 만들기 위하여 제조할 수 있다. 변화된 성질의 예로는 기질에 대한 효소 친화성의 변화 또는 리간드에 대한 수용체의 친화성의 변화를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 핵산 서열 및 폴리펩타이드 서열의 이러한 모든 변화는, 이들이 본 명세서에 개시된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드 서열의 본래의 용도와 일치된 작용성을 보유하는 한, 본 발명의 유용한 변형체이다.
동일성 또는 유사성은, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 핵산 서열 사이의 관계로서, 서열을 비교하여 측정한다. 당해 기술 분야에서, 동일성은 서열의 줄 사이의 정합성으로 측정되는 바와 같이 경우에 따라 폴리펩타이드 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미하기도 한다. 동일성 및 유사성은 용이하게 계산할 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Prejects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). 2개의 핵산 서열이나 2개의 폴리펩타이드 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하는 방법에는 다수의 방법이 있는 한편, 두 용어는 당업자에게 익히 공지되어 있다(Sequence Anaylsis in Molecular Biology, von Heinje, G., 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo, H., and Lipman, D., (1988) SIAM J. Applied Math., 48, 1073). 서열 사이의 동일성이나 유사성을 측정하는데 통상적으로 사용되는 방법으로는, 문헌[참조: Carillo, H., and Lipman, D., (1988) SIAM J. Applied Math., 48, 1073]에 개시된 것을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 동일성을 측정하기 위한 보다 바람직한 방법은 시험되는 서열 사이의 정합성이 최대가 되도록 고안한다. 동일성 및 유사성을 측정하는 방법은 컴퓨터 프로그램으로 코드화되어 있다. 두 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하기 위한바람직한 컴퓨터 프로그램 방법으로는 GCG 프로그램 팩키지(Devereux, J., et al., (1984) Nucleic Acids Research 12(1), 387), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Atschul, S. F. et al., (1990) J. Molec. Biol. 215, 403)가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
폴리펩타이드는 종종 20개의 천연 아미노산으로 통상적으로 불리는 20개 아미노산 이외의 다른 아미노산을 함유한다. 말단 아미노산을 비롯한 다수의 아미노산들이 소정의 폴리펩타이드에서 프로세싱 및 다른 해독후 변형과 같은 자연적 과정 뿐만 아니라, 당해 기술 분야에 공지된 화학적 변형 기법에 의해 변형될 수 있다. 폴리펩타이드에서 천연적으로 발생하는 일반적 변형은 여기에 소모적으로 열거하기에는 지나치게 수가 많고, 기본서 및 보다 상세한 논문 뿐만 아니라, 여러권으로 된 연구 논문에 상세하게 기술되어 있고, 당업자에게는 익히 공지되어 있을 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드에 존재할 수 있는 공지된 변형 중에는, 예를 들어, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 잔기의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교화, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교화의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백분해적 프로세싱, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 단백질에의 전달-RNA 매개된 아미노산의 첨가, 예를 들어, 아르기닐화 및 우비퀴틴화가 있다. 이러한 변형은 당업자에게 공지된 것이며,과학 문헌에 아주 상세하게 기술되어 있다[참조예: PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993)].
본 발명의 범주에는 본 명세서에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열과 전체 길이상에서 70% 이상 동일한 핵산 서열 및 당해 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열이 포함된다. 또는, 80% 이상 동일한 영역을 포함하는 핵산 서열이 보다 바람직하고, 90% 이상 동일한 영역을 포함하는 핵산 서열이 보다 더 바람직하며, 이러한 바람직한 핵산 서열 중에서 95% 이상인 서열이 특히 바람직하다. 또한, 동일성이 95% 이상인 서열 중에서 97% 이상인 서열이 보다 바람직하고, 98% 이상과 99% 이상인 서열이 특히 더 바람직하며, 99% 이상인 서열이 가장 바람직하다. 바람직한 구체예에서 전술한 핵산 서열에 하이브리드하는 핵산 서열은 본 명세서에 제시된 RELP 아미노산 서열을 특징으로 하는 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 기능이나 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 이와 관련하여 바람직한 구체예는 서열 1의 DNA가 암호화하는 성숙 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 기능이나 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이다. 본 발명은 또한 전술한 서열에 하이브리드하는 핵산 서열에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명은 특히 엄격한 조건에서 전술한 핵산 서열에 하이브리드하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "엄격한 조건"이란 용어는 서열간의 동일성이 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상인 경우에만 하이브리드화가 발생하는 것을 의미한다.
본 발명의 핵산 서열은 본 명세서에 제시된 RELP의 서열을 암호화하는 전장의 cDNA 및 게놈 클론을 분리하고, 당해 서열과 서열 유사성이 높은 다른 유전자의 cDNA 및 게놈 클론을 분리하기 위하여 RNA, cDNA 및 게놈 DNA의 하이브리드화 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 프로브는 일반적으로 15개 이상의 염기를 포함한다. 당해 프로브는 30개 이상의 염기를 포함하는 것이 바람직하고, 50개 이상의 염기를 포함할 수도 있다. 특히 바람직한 프로브는 30개 이상의 염기와 50개 이하의 염기를 보유하는 것이다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 유전자의 암호 영역은 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하기 위하여 공지의 DNA 서열을 이용해 선별함으로써 분리할 수 있다. 본 발명에 개시된 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드는 프로브가 하이브리드하는 라이브러리의 성분을 결정하기 위하여 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 선별하는데 사용한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 서열 2의 폴리펩타이드(특히 성숙 폴리펩타이드) 뿐만 아니라, 서열 2의 폴리펩타이드와 동일성이 70% 이상의 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 2의 폴리펩타이드와 동일성이 80% 이상, 보다 바람직하게는 서열 2의 폴리펩타이드와 유사성이 90% 이상(보다 바람직하게는 동일성이 90% 이상), 보다 더 바람직하게는 서열 2의 폴리펩타이드와 유사성이 95% 이상(보다 더 바람직하게는 동일성이 97% 이상)인 폴리펩타이드를 포함하고, 또한 일반적으로 30개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 포함하는 상기 폴리펩타이드의 일부를 포함하기도 한다. 본 발명의 폴리펩타이드 단편의 대표적인 예로는 서열 2의 절두 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 유도체를 포함하지만, 아미노말단을 포함하는 일련의 연속 잔기(즉, 연속 영역, 부분 또는 일부) 또는 카복실 말단을 포함하는 일련의 연속 잔기, 또는 이중 절두 돌연변이체에서와 같이 아미노 말단을 포함하는 것과 카복시 말단을 포함하는 것, 2개의 일련의 연속 잔기의 결실은 제외된다. 또한, 이러한 본 발명의 양태에 있어서 서열 2의 서열을 특징으로 하는 폴리펩타이드의 구조적 또는 기능적 속성을 특징으로 하는 단편이 바람직하다.
실시예
실시예 1: cDNA의 클로닝 및 서열분석
점액성 난소 종양 유래의 라이브러리에서 다량으로 발현되는 EST를 동정하였다. 당해 EST를 기초로 한 소정의 프리단백질을 암호화하는 전장의 cDNA 삽입체는 획득하고, pSport 벡터에 클로닝하고, 서열분석으로 확인하였다. NCBI EST 데이터베이스에서 사람 RELP cDNA를 이용한 블라스팅으로 동일성이 높은 3개의 마우스 서열을 수득하였다. 이에 대응하는 클론(IMAGE 클론 ID 717371, 1079498 및 1096767)을 획득하고 서열분석하였다. RELP의 추정의 마우스 오르토로그를 pGEMA1bSVPA 백터내의 XbaI 부위에 클로닝하였다. 마우스의 RELP 및 이를 암호화하는 핵산은 각각 사람의 RELP 및 이와 관련된 핵산과 66% 아미노산 동일성 및 70% 뉴클레오티드 서열 동일성이 있는 것으로 관찰되었다. 마우스의 RELP 역시 다른 마우스 Reg 서열과 43 내지 45% 유사성과 32% 내지 37% 동일성이 있는 것으로 관찰되었다. 당해 단백질을 발현시키는데 사용된 cDNA의 핵산 서열은 도 1에 제시하였다(서열 1).
실시예 2: 항체
C 말단의 RELP-유래 펩타이드를 합성하고(CAEMSSNNNFLTWSSNE, 서열 5), 키홀 림펫 헤모시아닌에 커플링시킨 뒤, 폴리클로날 항체 생산용 래빗을 면역화하는데 사용하였다. 혈청을 ELISA에 의해 상응하는 펩타이드에 대한 반응성을 시험하고, 양성 배취를 친화성 정제하였다. 정제된 항체는 조직 절편에 펩타이드 에피토프를 보유한 단백질을 특이적으로 검출하였다. 이로써 상응하는 펩타이드를 항체와 동시에 첨가하는 경우에 신호의 완전 제거로 확인하였다. 면역조직화학에서 잘 사용되는 이러한 폴리클로날 항체 외에도, 천연 폴드 상태인 단백질을 검출할 수 있는 모노클로날 항체를 제조하였다. 모노클로날 항체를 제조하기 위하여, 천연 폴드 상태와 해독후 변형을 유지하기 위하여 포유동물 세포에서 제조된, 정제된 항원을 제조하였다. RELP-IgG 불변부 융합 단백질인 항원을 마우스 골수종 세포에서 발현시키고, 분비 단백질을 베이트(bait)로서 Fc 부분을 사용하여 정제하였다. 이와 같이 정제된 항원은 C-말단 폴리클로날 항체와 다른 5개의 항-RELP 펩타이드 항체(하기 서열 6 내지 서열 11 참조)에 의해 웨스턴 블롯에서 인식되었다. IgG 불변부 대신에 RELP에 대하여 반응하는 항체를 생산하는 클론을 양성 클론 중에서 선택하여 RELP에 대한 마우스 모노클로날 항체를 생성하기 위하여 상기 항원을 사용하였다.
RELP의 임상 동정용 키트는 상기 항체 및 이와 유사한 항체를 이용하여 용이하게 적합화시킬 수 있다. 이러한 키트에는 RELP 동정에 지시된 항체, 적합한 표시 시약(예, 효소, 라벨 등) 및 (선택적으로) 이러한 키트를 임상 적용하는데 유용한 기타 다른 시약, 예를 들어, 희석 완충액, 안정화제 및 이러한 분석에 일반적으로 사용되는 기타 다른 물질을 포함할 수 있다. 당해 키트는 체액내 RELP를 검출하여 RELP를 발현시키는 암을 선별하거나 추적하고, 조직 샘플 중의 RELP 단백질의 존재를 선별하는데 사용될 수 있다.
실시예 3: 이중 면역형광 염색법
정상 십이지장 점막의 조직 절편을 RELP에 대한 폴리클로날 펩타이드 항체(1:30; 25㎍/㎖) 및 크로모그라닌 A에 대한 모노클로날 항체(1:5000; 0.2㎍/㎖ Chemicon, Temecula, CA), 이어서 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트-접합된 돼지 항-래빗 면역글로불린(ICN/Cappel) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-접합된 염소 항-마우스 면역글로불린(ICN/Cappel)으로 이중 염색하였다. 대조 염색으로서, 1차 항체 대신에 정상 래빗과 마우스 혈청의 IgG 분획을 사용하였다.
RELP와 크로모그라닌 A의 공동국재화는 십이지장에 있는 RELP 발현 세포가 신경내분비성 개체에 속하는 것임을 시사한다.
실시예 4: 동일 반응계내 하이브리드화
포르말린 고정된 파라핀으로 매립시킨 조직 샘플을 5 내지 7mμ 두께의 절편으로 절단하고, 실란 코팅된 유리 슬라이드에 장착한 뒤, 37℃에서 하룻밤 및 65℃에서 30분 동안 항온처리한 다음, 크실렌에서 10분 동안 파라핀제거를 2회 실시하였다. 다음, 샘플을 등급화된 일련의 에탄올 용액(100 내지 70%)을 통해 재수화시키고, 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.0)로 5분 동안 2회 세척하고, PBS 중의 0.1mol/L 글리신으로 5분 동안 2회 처리한 다음, PBS 중의 0.3% 트리톤 X-100으로 15분 동안 삼출시켰다. 다음, 절편을 프로테이나제 K(Finnzymes, Helsinki, Finland) 처리(㎍/㎖, TE 완충액 중; 100mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L EDTA, pH 8.0)로 37℃에서 30분 동안 처리하고, PBS 중의 3% 파라포름알데하이드로 4℃에서 5분 동안 최종고정시킨 다음, PBS로 2회 세척하였다. 당해 슬라이드를 0.25%(v/v) 아세트산 무수물, 100mmol/L 트리에탄올아민, pH 8.0에서 5분 동안 2회 침지시켜 양성 전하를 차단시켰다. 당해 슬라이드를 4xSSC, 50%(v/v) 탈이온화된 포름아미드에서 37℃하에 10분 동안 평형화시켰다. PCR로 증폭된 0.4kb RELP cDNA 삽입체를 TA 클로닝 키트(Invitrogen, San Diego CA, USA)를 사용하여 pCR-II 벡터에 연결시켜 프로브를 제조하였다. RELP 안티센스 또는 센스 RNA 프로브의 주형은 적당한 벡터 작제물을 선형화하여 제조하였다(각각 3'에서 5' 방향 또는 5'에서 3' 방향으로). RNA 표지화 키트(Boehringer-Mannheim)를 사용하여 시험관내 전사로 디곡시게닌 표지된 RNA 프로브를 작제하였다. 하이브리드화는 1xDenhart 용액(0.2g/L Ficoll Type 400, Pharmacia), 0.2g/L 폴리비닐피롤리돈, 0.2g/L 소 혈청 알부민(분획 V: Sigma), 40% 포름아미드, 10% 덱스트란 설페이트, 4xSSC, 10mmol/L 디티오트레이톨, 1㎎/㎖ 효모 tRNA, 1㎎/㎖ 청어 정자 DNA 및 300ng/㎖ 디곡시게닌-표지된 RNA 프로브를 함유하는 하이브리드화 혼합물을 사용하여 45℃에서 하룻밤 동안 실시하였다. 하이브리드화 후, 조직 절편을 2xSSC로 37℃에서 5분 동안 2회 세척하고, 60% 포름아미드, 0.2xSSC로 15분 동안 1회 세척하고, 다음 실온에서 0.2xSSC로 5분 동안 2회 세정하고, 100mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 150mmol/L NaCl에서 10분 동안 2회 세척하였다. 신호 검출은 1:250 알칼리성 포스파타제-접합된 양 항디곡시게닌 Fab 단편(Boehringer Mannheim)을 사용하여 실시하였다. 신호는 절편을 NBT/BCIP 원액(Boehringer Mannheim)으로 1.5시간 동안 항온처리하여 가시화하였다.
소수의 RELP-양성 세포가 위 점막 및 외분비 췌장에서 관찰되었다. 정상 결장에서는 음와의 하부에 있는 상피 세포에서 RELP가 국재화되어 있었다. 강한 RELP mRNA 신호는 십이지장 점막에 존재하는 선택된 세포의 세포질에서 관찰되는 반면, 대부분의 상피에서는 관찰되지 않았다. 난소, 위, 결장 및 유방 유래의 점액성 암에서는 RELP mRNA가 상피세포에서도 검출되었다. RELP-특이적 mRNA의 가시화로부터 RELP 단백질이 당해 세포에 의해 발현된다는 것을 확인하였다.
실시예 5: 면역조직화학
RELP의 C-말단 펩타이드에 대한 친화성 정제된 폴리클로날 항체를 사용하여 RELP의 면역조직화학 검출 및 국재화에 사용하였다. 헬싱키 대학 병리학부 보관소에서 획득한, 포르말린으로 고정되고 파라핀으로 매립시킨 정상 조직과 종양 조직유래의 4㎛ 절편을 3-아미노프로필-트리에톡시-실란(APES, Sigma, St. Louis, MO, U.S.A) 코팅된 슬라이드 상에 올려놓았다. 당해 절편을 파라핀제거하고, 등급화된 농도의 에탄올로 재수화한 다음, 메탄올성 과산화물(무수 메탄올에 0.5% 과산화수소)로 실온에서 30분 동안 처리하여, 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단시켰다. 항원의 복구는 마이크로웨이브 오븐에서 5분 동안(650W) 2회 실시하였다. Elite ABC 키트(Vectastain, Vector Laboratories, Burlingame, CA, U.S.A)를 사용하여 면역퍼옥시다제 염색을 실시하였다. RELP 항체는 최적의 1:2000의 희석률에서 사용하였다. 비오티닐화된 제2 항체 및 퍼옥시다제 표지된 아비딘-비오틴 복합체를 모두 상기 절편상에서 30분 동안 항온처리하였다. 희석은 PBS(pH 7.2)로 실시하고, 모든 항온처리는 실온의 가습실에서 실시하였다. 여러 염색 단계 후 슬라이드는 PBS로 3회 세척하였다. 퍼옥시다제 염색은 실온에서 15분 동안 3-아미노-9-에틸카바졸(Sigma) 용액(0.03% 과산화수소를 함유하는 0.05M 아세트산염 완충액 0.2㎎/㎖, pH 5.0)으로 가시화하였다. 마지막으로, 절편을 메이어의 헤마톡실린으로 가볍게 대비염색하고 장착용 수성 배지(Aquamount, BDH)로 장착하였다. 대조 실험에서는 1차 항체 대신에 정상 래빗 혈청의 IgG 분획을 사용하거나 1차 항체를 RELP 펩타이드로 예비흡착시켰다. 당해 염색법은 십이지장 상피 세포의 아군, 위점막 상피 세포의 아군, 외분비 췌장 십이지장 세포, 결장 음와 하부 세포, 유방관 상피세포의 아군 및 난소, 위, 결장, 유방 및 췌장 유래의 양성 및 악성 점막 종양의 상피 세포에서 RELP 단백질의 존재를 시사한 반면, 간질에서는 전혀 존재하지 않았다. 점액성 종양 유래의 상피 세포내 존재하는 RELP 단백질의 풍부하고 균일한 발현은RELP가 종양 마커로서 사용될 수 있음을 지지하는 것이다. 분리형 단백질이므로 RELP는 혈청이나 혈장에서 측정할 수 있다. 또한, 항-RELP 항체는 조직 샘플와 세포학적 표본에서 고립 종양 세포를 검측하는데 유용하다는 것을 입증할 수 있다.
실시예 6: 유전자의 구조 및 뉴클레오티드 서열
RELP cDNA는 1517개 뉴클레오티드를 포함하고, 단백질 암호 영역은 158개 아미노산의 프리단백질을 암호하는 476bp의 뉴클레오티드로 구성된다. 5' 미해독 및 3' 비해독 영역은 각각 440개 및 601개의 뉴클레오티드를 포함한다. 제1 메티오닌(nt 441 내지 443)은 코작 컨센서스 해독 개시 부위를 선재시키고 있다(코작 서열 AAG가 개시 메티오닌 앞에 옴). 폴리아데닐화 신호(AATAAA)는 종결 코돈의 510bp 후방에 위치한다. 당해 단백질의 유전자구조는 공개된 도메인내 게놈 데이터 베이스의 분석으로 추론하였다. 게놈 데이터베이스의 무작위적으로 규정된 단편의 결실 염기쌍 플랭킹 말단은 물리적 게놈 RELP 서열의 전술한 영역을 서열분석하여 얻었다.
게놈 RELP 서열을 포함하는 사람 게놈 PAC 클론은 GenomeSystemsInc(St. Louis, Missouri)에서 입수하였다. 약 120kb의 게놈 삽입체를 함유하는 PAC 플라스미드로 NS3516 박테리아 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA는 EndoFree Plasmid Maxi Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 분리하였다. 게놈 서열은 결실 서열 데이터에 플랭킹되어 있는 RELP 특이적 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.
사용된 프라이머는 다음과 같다:
증폭된 DNA 단편은 TA 벡터에 서브클로닝하고, 벡터 유래의 relp 특이적 프라이머로 서열분석하여 relp 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열을 수득하였다. 게놈 RELP DNA와 RELP cDNA 서열을 비교한 결과 전사된 영역이 6개의 인트론으로 분리된 7개의 엑손으로 분리되었고, 모든 엑손-인트론 접합부가 GT-AG 규칙에 따르고 있다는 것을 확인하였다. 엑손 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7의 길이는 각각 172, 174, 161, 98, 137, 106 및 669bp이다(도 4). 상이한 스플라이싱으로 인하여 엑손 2가 모든 전사체에서 관찰되는 것은 아닌 것으로 측정되었다. 제1 엑손의 개시는 AG 규칙을 사용한 게놈 서열 및 스플라이싱 공여체 수용체 부위 컨센서스 서열 위치로부터 추론되었다. 엑손 1 내지 3은 440nt(또는 엑손 2가 결실되어 있는 스플라이싱 변형체에서 266nt)의 5' 비해독 영역을 암호화하고 엑손 7은 601nt의 3' 비해독 영역을 암호화한다.
relp 유전자의 프로모터 서열은 프로모터 분석 프로그램 Genomatix(http:genomatix.gsf.de/mat_fam)으로 분석하였다. Ap-1 결합 부위와 cAMP 반응성 인자는 전사 개시 부위로부터 각각 15 및 44 염기쌍 전방에 위치한다.
실시예 7: 형광성 동일 반응계내 하이브리드화(FISH)
relp 유전자의 염색체 위치를 측정하기 위하여 형광성 동일 반응계내 하이브리드화를 실시하였다. RELP 유전자를 함유하는 사람 게놈 PAC 클론은 사람 염색체내 RELP의 위치를 국재화하기 위한 프로브로서 사용하였다. PAC 플라스미드는 닉 해독에 의해 비오틴-16-dUTP로 표지화하였다. 사람 간기 및 중기 핵을 갖는 슬라이드는 37℃에서 10분 동안 0.01N HCl로 예비처리하고, 37℃에서 5분 동안 펩신(20㎎)을 함유하는 0.01N HCl로 예비처리하였다. 일정 등급의 에탄올로 탈수한 후, 슬라이드를 70% 포름아미드/2xSSC로 64℃에서 변성시켰다. 하이브리드화는 37℃에서 하룻밤 동안 실시하였다. 하이브리드화 후, 슬라이드를 2xSSC로 45℃에서 1x5분 동안, 0.1xSSC로 45℃에서 2x5분 및 4xSSC/0.2% Tween으로 실온에서 1x5분간 세척하고, 5% BSA/4xSSC로 37℃에서 30분 및 4xSSC/0.2% Tween으로 45℃에서 5분간 차단하였다. 하이브리드화된 프로브를 아비딘 접합된 FITC로 검출하고 신호는 비오티닐화된 항아비딘 항체로 증폭시켰다. 4xSSC/0.2% Tween으로 45℃에서 3x5분 동안 세척한 후 슬라이드를 DAPI를 이용하여 대비염색시키고 퇴색방지 용액에서 장착하였다.
하이브리드화는 염색체 1 밴드 p12-13.1에서 독점적인 신호를 나타냈다.
실시예 8: 도트 블롯 및 노던 블롯 분석
도트 블롯 및 노던 블롯 분석은 Multi Tissue Expression(MTE) Array 및 Multiple Tissue Northern(NTN) 블롯 II와 III(Clontech)을 사용하여 실시하였다.32P-표지된 전장 RELP cDNA를 프로브로 사용하였다. 표지는 멀티프라임 DNA 표지 시스템 키트(Amersham Pharmacia Biotech)으로 실시하였다. 자가방사기록을 위해 필터를 코닥 바이오맥스 MS 필름에 1 내지 3일간 노출시켰다. 도트 블롯 분석 결과 위장관, 전립선 및 고환의 조직에서 RELP mRNA가 나타났다. 노던 블롯 분석 결과 십이지장, 위, 고환 및 전립선에서 1.5kb가 고도로 발현된 것으로 증명되었다. 또한, 공장, 회장, 맹장, 충수돌기, 하부 결장 및 췌장에서 유의적인 발현이 나타났다. 갑상선, 척수, 부신, 골수, 비장, 흉선, 난소 또는 혈액 백혈구에서는 RELP 발현이 나타나지 않았다.
상기는 RELP의 정상 조직 분포에 대한 설명이다.
상기 열거된 기관으로부터 동정된 암에서 RELP는 정규 장소외에서 발현된다. 이것은 RELP를 전혀 발현시키지 않고 이러한 발현과 무관한 세포에서 발현되고 이러한 발현이 분화 수준의 퇴화에 기인한다는 것을 의미한다.
따라서, 정상 수준 이상의 RELP의 존재는 전제 유기체의 수준에서 나타난다. 즉, 신체가 지나치게 RELP를 생성한다는 것은(혈장에서 측정한 경우) RELP-양성 종양을 진행하고 있는 것으로 알려진 기관중의 하나에 암이 존재하고 있음을 가리킨다.
실시예 9: 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCT)
로버스트 RT-PCR 키트(Finnzymes, Espoo, Finland)를 사용한 연속 RT-PCR에 의해 RELP mRNA의 역전사 및 PCR 증폭을 실시하였다. 1회 RT-PCT 반응으로부터 100 ng의 폴리(A) RNA가 cDNA로 역전사되었다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:
센스:CAGCTGTGCTCCTGGATGGT (서열 12)
CTCCTATTGCTGAGCTGCCT (서열 14)
안티센스:TGGTCGGTACTTGCACAGGA (서열 44)
ATTCGTTGCTGCTCCAAGTT (서열 45)
역전사 반응은 48℃에서 30분 동안 실시하였다. PCR 증폭 이전에 샘플을 처음에 95℃에서 4분 동안 변성시켰다. 주기 변수는 다음과 같다(30회): 95℃에서 30초 동안 변성, 60℃에서 1분 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 신장 및 72℃에서 5분 동안 최종 연장.
증폭된 산물은 아가로즈 전기영동으로 분석하고 제조업체의 지침에 따라 TA 클로닝 시스템(Invitrogen, San Diego)의 벡터내로 아클로닝하였다. 클로닝된 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열분석을 써모 시퀀스 키트(Thermo Sequence Kit)(Amersham, Buckingshire, UK) 및 ALF 익스프레스 시쿼네이터(Pharmacia, Uppsala, Sweden)로 수행하였다. 당해 절차 결과, RELP가 십이지장, 결장, 위 및 췌장에서 전사되는 것이 증명되었고, 노던 블롯 및 도트 블롯 실험으로 RELP와 동일성인 다른 reg 단백질을 나타내는 RNA를 검출해야 한다는 가능성을 배제하였다.
실시예 10: 시험관내 해독
RELP cDNA의 전장 서열을 함유하는 cDNA 단편을 T7 RNA 폴리머라제 프로모터하에 진핵 발현 벡터 pCDNA 3(Invitrogen, San Diego)내로 아클로닝하였다.35S-메티오닌(Amersham International's Redivue L-35Smethionine, Amersham Pharmacia Biotech)의 존재하에 개 췌장 미립체 막을 함유한 토끼 망상적혈구 용해물을 사용하여 RELP 단백질을 발현시켰다. 시험관내 해독에 의해 수득한 단백질을 SDS-PAGE(12%) 겔 전기영동으로 분석하고 자가방사기록으로 나타냈다. 해독 결과 PAGE에 의한 분석으로 18kd의 겉보기 분자량을 갖는 단백질 산물로 나타났다. 이것은 RELP의 산정된 분자량(18.2kd)와 일치한다. 미립체 막 분획을 첨가할 경우 단백질 산물의 크기는 17kd로 감소하였고, 이것은 절단될 수 있는 N-말단 23개 아미노산 시그날 펩타이드를 포함한 RELP의 추정 구조와 일치한다.
실시예 11: 효소 면역검정(예견)
RELP 항원에 대해 면역검정을 한다. 이것은 10fmol/L의 검출이 경쟁 검정에서 가능하기 때문에 달성가능한 것이다. 비경쟁 검정의 민감도는 사용된 표지의 검출 하한치에 의해 결정된다: 1 내지 2,000,000 젭토몰(10-21mol)("Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry" 4th Edition, p143).
효소 면역검정(EIA) 절차를 위해 (면역퍼옥시다제 염색에 의해 항원을 함유하는 것으로 나타나는) 결장 종양 표본 분해물을 함유한 항원 표본물을 사용한다. 사람 원발성 결장 암 표본을 모으고 4℃에서 0.2%(w/v) 나트륨 데옥시콜레이트가 함유된 10mM 트리스 완충액(pH 7.4)의 10회 용량에서 균질화하였다. 균질물을 신속하게 37℃로 옮기고 교반하면서 다음의 시약(최종 농도)을 첨가하였다: 1mM 시스테인(Sigma), 1mM EDTA(Sigma) 및 파파인(0.8unit/ml)(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Ind). 5분 후 5mM 요오도아세트아미드(Sigma)를 첨가하여 분해를 정지하였다. 균질물을 4℃하에서 100,000xg로 1시간 동안 원심분리하고 각각 10mM로 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 아미노카프론산을 함유한 10mM 트리스/0.9%NaCl 용액 완충액(pH 7.4)에 대해 투석하였다. 균질물을 0.5mg의 단백질/ml의 농도로 소량씩 동결시켰다.
RELP를 측정하는 면역검정 절차 동안에 형성되는 용량 반응 곡선은 100ng 내지 100㎍/ml의 항원 투입에서 직선성을 증명한다. 혈청 분석을 위한 범위는 1ng 내지 1000ng/ml인데, 그 이유는 이들 샘플이 검정이전에 10배 희석되기 때문이다.
실시예 2에 기술된 고체상 항체 제제는 CNBr-활성화된 세파로즈(Pharmacia)를 사용하여 준비한다. 미세역가 평판(Nuncl Immunoplates; Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y.)을 4℃하에서 18시간 동안 50mM 탄산염-중탄산염 완충액(pH 9.6)중의 항체(200㎕/웰)로 피복한다. 항체 용액을 제거한 후 플라스틱상에 남아 있는 단백질 결합 부위를 200㎕의 검정 완충액(1%(v/v) 토끼 혈청 및 1%(w/v) 소 알부민을 함유한 PBS)을 첨가하여 차단한다. 실온에서 1시간 배양한 후 피복된 평판을 검정 절차를 위해 즉시 사용한다.
검정을 수행하기 위해 검정 완충액 중에 희석된 200㎕ 샘플을 37℃에서 1 내지 5시간 동안 적용한다. 검정 완충액을 사용하여 3회 세척한 후 양고추냉이 퍼옥시다제(Sigma, Type VI)에 공유 결합된 항체 200㎕를 37℃에서 각 웰에 1.5시간 동안 적용한다. 결합체를 10%(v/v) 마우스 혈청을 함유한 PBS ml당 면역글로불린 0.5㎍의 농도로 희석한다. 상기와 같이 세척 절차 후 웰당 200㎕의 기질을 실온에서 0.5시간 동안 적용한다. 기질 용액은 pH 5.0 시트레이트 완충액과 0.003% 과산화수소 ml당 0.4mg의 o-페닐렌디아민을 함유한다. 50㎕의 2N 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고, 효소 검정 평판 리더(Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA)를사용하여 488nM에서 흡광도를 모니터링한다.
결합된 효소 결합체의 비율은 다음과 같이 산정한다:
(B-B0)(Bt-B0)(100)
여기서, B는 샘플의 흡광도이고, Bt는 최대 흡광도이며, B0는 블랭크의 흡광도이다. 각 검정은 표준 분해물 및 검정 완충액에 희석된 26배 희석 혈청 샘플을 사용하여 3회 반복하여 실시한다. CEA 및 비면역 토끼 혈청에 대한 항체를 포함한 고체상의 여러 항체 시약을 치환시킴으로써 면역검정의 특이성을 검사한다. 고체상 항체가운데 실시예 2에서 제조된 항체만이 고도로 희석된 항원과 결합한다.
혈청 RELP의 수준은 정상 대조 대상자, 양성 및 악성 전립선 환자 및 난소, 위, 결장 및 유방암 환자에 대해 검정한다.
건강한 대상자로부터 채취된 혈청은 약 90ng/ml의 RELP/ml의 평균 값을 나타낸다. 샘플은 5%만이 150ng/ml 이상에서 혈청 항원을 나타내며, 이 값은 증가된 혈청 수준에 대한 컷오프로서 정한다.
양성 결장 질환 환자로부터 채취된 혈청은 160ng/ml의 평균 RELP 값을 나타낸다(표 IV). 200ng/ml 이상의 발생률은 5%이다. 결장암 환자(질환 증거가 있음)는 평균 160ng/ml 이상으로 넓은 범위의 RELP 순환계 수준을 나타낸다.
상기된 것에 상응하는 암 환자로부터 채취된 혈청 또한 평가하였다. 증가된 RLEP 값의 발생률은 90%이다. 암 환자 그룹의 평균 혈청 값은 대조군의 수준에 비해 유의적으로 높다(약 250% 이상).
수술을 받은 원발성 국소적 결장암 환자의 한정된 수를 대상으로 한 실험에서 혈청중 RELP의 수준은 유의적으로 감소하였다. 이들 데이터는 혈청 RELP 수준과 종양 부하사이의 연관성을 가리킨다. 따라서, 이러한 측정치는 환자의 모니터링에 유용하다.
본 발명에 따라, 생물학적 샘플내에 존재하는 단백질의 존재, 부재, 농도 또는 발현 농도를 이용하여, 종양, 암 및 관련 질환의 존재 유무 뿐만 아니라, 당해 질환들과 관련된 예후 및 진단을 나타낼 수 있는 단백질을 제공할 수 있다.

Claims (7)

  1. a) 서열 2의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드와 70% 이상의 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 분자;
    b) (a)의 핵산 서열에 상보적인 핵산 분자;
    c) (a) 또는 (b)의 핵산 서열의 15개 이상의 연속 염기를 포함하는 핵산 분자 및
    d) 엄격한 조건하에서 (a)의 핵산 서열 분자에 하이브리드하는 핵산 분자의 존재 또는 양을 측정하는 단계 및
    이와 같은 핵산 분자의 존재 또는 양과 종양의 존재와의 상호관계를 나타내는 단계를 포함하여, 종양의 존재를 검출하는 방법.
  2. 생물학적 샘플 중의 RELP의 농도를 측정함을 포함하여, 종양의 존재를 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 분자의 존재 또는 양과 종양의 존재 또는 부재와의 상호관계를 나타내는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. a) reg 유사 단백질(RELP)과 면역학적으로 반응성인 항체 및
    b) 상기 항체의 존재를 검출하기 위한 시약을 포함하는, RELP의 존재를 측정하기 위한 키트.
  5. 제4항에 있어서, 암의 존재를 동정하거나, 암을 특성규명하거나, 암의 치료 과정을 모니터링하는데 사용하기 위한 지침서를 추가로 포함하는 키트.
  6. a) RELP를 암호화하는 핵산 서열의 15개 이상의 연속 염기를 포함하고, RELP를 암호화하는 핵산 서열의 일부에 상보적인 시약 핵산 분자 및
    b) 상기 시약 핵산 분자를 함유하는 용기를 포함하는, 암의 존재를 확인하거나, 암을 특성규명하거나, 암의 치료 과정을 모니터링하기 위한 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 시약 핵산 분자가 서열 12 내지 43으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 키트.
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