KR100246126B1 - N-아세틸글루코사민 전이효소ⅲ에 대한 단일클론 항체, 이를생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법 - Google Patents

N-아세틸글루코사민 전이효소ⅲ에 대한 단일클론 항체, 이를생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100246126B1
KR100246126B1 KR1019970064030A KR19970064030A KR100246126B1 KR 100246126 B1 KR100246126 B1 KR 100246126B1 KR 1019970064030 A KR1019970064030 A KR 1019970064030A KR 19970064030 A KR19970064030 A KR 19970064030A KR 100246126 B1 KR100246126 B1 KR 100246126B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
monoclonal antibody
transferase iii
cell line
acetylglucosamine transferase
fusion
Prior art date
Application number
KR1019970064030A
Other languages
English (en)
Other versions
KR19990043051A (ko
Inventor
정태화
송은영
이희구
김경아
이홍수
김철호
이태균
권두한
오은숙
장지은
Original Assignee
박호군
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 박호군, 한국과학기술연구원 filed Critical 박호군
Priority to KR1019970064030A priority Critical patent/KR100246126B1/ko
Publication of KR19990043051A publication Critical patent/KR19990043051A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100246126B1 publication Critical patent/KR100246126B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 암세포 조직에서 특이적으로 발현되는 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ(N-acetylglucosaminyl transferase Ⅲ)에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 간질환 환자의 간세포 및 암세포에서 그 활성이 증가하는 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체에 대한 것으로서, 상기의 단일클론 항체는 혈액이나 조직내의 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원을 검색하여 암세포 및 간질환을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｎ-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법
본 발명은 암세포 조직에서 특이적으로 발현되는 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ(N-acetylglucosaminyl transferase Ⅲ)에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 간질환 환자의 간세포 및 암세포에서 그 활성이 증가하는 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체에 대한 것으로서, 상기의 단일클론 항체는 혈액이나 조직내의 N-아세틸글루코사민전이효소Ⅲ 항원을 검색하여 암세포 및 간질환을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
인간 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ(N-acetylglucosaminyl transferase Ⅲ)는 골지체의 벽에 결합되어 있는 효소로서 글루코사민 잔기를 N-결합형 당쇄의 트리만노실 중심(trimannosyl core)에 부가하여 이분지(bisecting) 글루코사민 잔기의 형성을 촉매하는 당전이 효소이다. 이분지 글루코사민 잔기는 여러 당단백질에서 복잡한 형태의 당쇄 구조를 유도하는 전구체이다. 이들 당쇄의 구조는 발생과 분화과정에 따라 변화하는 것으로 알려져 있으며 이것은 세포표면의 당쇄가 세포간 상호작용에 특정한 역할을 수행하고 있다는 것을 의미한다. 특히 악성 종양으로 전이되는 세포에도 복잡한 N-결합형 당쇄 구조의 변화가 수반된다.
N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ의 활성은 처음으로 암닭의 난관에서 검출되었으며(Narasimhan, J. Biol. Chem. 257, 10235-10242, 1982), 간암이 진행되는 흰쥐의 간과 신장에서 그 활성이 보고되고 있다(Narasimhan 등, J. Biol. Chem. 263, 1273-1281, 1988; Nishikawa 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 152, 107-112, 1988; Pascale 등, Carcinogenesis 10, 961-964, 1989; Nishikawa et al., Biochim. Biophys. Acta 1035, 313-318, 1990).
특히 사람의 경우 간암, 간경변 등 간질환 환자의 조직과 혈액에서는 정상인과 비교하여 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ의 활성이 80-100배 정도로 과잉 발현된다고 한다(Ishibashi 등, Clin. Chim. Acta 185, 325-332, 1991).
N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ의 발현증가의 생물학적 중요성은 아직 명백하게 이해되지는 않지만 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 발현의 증가는 기질 수준에서 N-아세틸글루코사민-β-1,4 갈락토실 전이효소(N-acetylglucosamine β-1,4-galactosyl transferase), N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅱ, Ⅳ, Ⅴ에 의한 분지를 억제하고 이분지형의 당쇄를 형성하는 전구체 역할을 함으로써 분지상(分枝像)의 분균형을 초래한다(Schachyer, H. Biochem. Cell. Biol. 64, 163-181, 1986). 그러므로 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ의 발현변화는 N-결합형 당쇄구조의 결정에 중요한 역할을 하며 이는 정상세포가 암세포로 전이되어 나가는 과정에 큰 영향을 미치는 것으로 여겨진다.
또한 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ는 간질환의 정도, 예를 들어 간염, 간경변, 간암에 따라 발현정도가 다르므로 혈액 중의 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 분석하면 간기능 상태는 물론 간질환의 상태를 진단할 수 있다.
지금까지 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 활성도 측정은 형광표지 기질을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 확인하거나 액체 섬광계수기(liquid scintilation counter)를 이용하여 분석하였다. 이와 같은 방법들은 측정 시간이 많이 걸릴뿐 아니라 고가의 기기가 필요하며 반응 및 처리과정도 복잡하여 비전문가는 분석이 불가능하다. 그러므로 빠른 시간에 간편하게 당전이 효소를 객관적으로 분석할 수 있는 분석방법이 필요하다. 특정물질을 정성적 또는 정량적으로 분석하는 방법에는 여러 가지가 있으며 이들 방법중 항체를 이용한 면역측정법이 널리 이용되고 있다.
항원 항체반응을 이용한 면역 측정법이라함은 측정하고자 하는 물질을 항원으로 하여 이에 대한 특정 항체를 만들어서 항원에 결합할 수 있도록 하고 항원 항체의 결합여부와 결합정도를 효소, 방사선 물질, 형광 물질과 같은 표지를 사용하여 측정함으로써 생체물질을 정성, 정량하는 방법이다.
이와 같은 면역 측정법을 이용하여 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 측정하는 분석 시스템이 확립된다면, 그 시스템은 간질환에서 과잉 발현되는 당전이 효소인 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ의 반응기작 연구에 손쉽게 사용될 수 있고 혈액이나 조직중에서 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 측정하여 효과적으로 간질환을 진단하는데 이용할 수 있어 간질환이 성인병의 주요원인인 우리나라 현실에서 큰 도움이 될 수 있다.
이에 본 발명자들은 암세포나 간질환에서 과잉 발현되는 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 검색하는 효과적인 시스템을 구축하기 위하여, N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 마우스에 면역화시키고 그 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하여 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 선별한 다음 이를 이용하여 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단백질에 높은 특이성을 나타내는 마우스 단일클론 항체를 대량으로 분리하여 그의 항원 특이성 등을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 암세포 조직에서 특이적으로 발현되는 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다.
도 1은 본 발명의 단일클론 항체에 대한 항원으로 사용되는 재조합 N-아세틸글루코사민전이효소Ⅲ를 그를 생산하는 대장균 형질전환체로부터 분리, 정제한 결과를 나타낸 것이고,
레인 1 : 표준 표식자(low standard marker) ;
레인 2 : 5μl ; 레인 3 : 10μl ;
레인 4 : 20μl N-아세틸글루코사민전이효소Ⅲ ;
도 2는 본 발명의 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체의 항원 특이성을 웨스턴 블럿에 의하여 검증하여 나타낸 것이다.
레인 1, 6 : 표준 표식자 ;
레인 2, 3 : 단일클론 항체 GT 273 G ;
레인 4, 5 : 단일클론 항체 GT 125 M ;
레인 7 : IL-2 수용체에 대한 단일클론 항체 ;
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 제공한다.
또한 본 발명은 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원을 특이적으로 인식하는 소 단위형(subclass type)이 IgM 인 단일클론 항체를 생산하는 마우스 융합세포주(수탁번호 : KCTC 0378 BP)와 소단위형이 IgG2b인 단일클론 항체를 생산하는 마우스 융합세포주(수탁번호 : KCTC 0379 BP)를 제공한다.
또한 본 발명은 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 상기 융합세포주의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 암세포나 혈청내의 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원농도를 결정하여 암이나 간질환의 진단하는데 이용하는 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단백질을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제조하기 위하여, 우선 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ(대한민국 특허출원 제 97-48855 호)를 생산하는 대장균 형질전환체를 배양하여 그로부터 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 분리, 정제한다.
본 발명에서 사용한 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ는 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 유전자의 처음 23개 아미노산을 코우드하는 영역이 제거된 결손형 유전자로부터 발현된 결손형 단백질이다.
본 발명은 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제조하기 위하여, 상기 재조합 결손형 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 이용하여 마우스를 면역화시키고 이로부터 추출한 비장 세포와 마이엘로마 세포를 융합시킨 후, 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 특이성을 보이는 세포 클론을 효소 면역 측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 등으로 선별한다.
상기에서 선별된 세포 클론이 생산하는 단일클론 항체의 소 단위형을 면역확산법으로 결정하고, 그 중 소 단위형이 IgM 인 하나의 마우스 융합세포주를“GT 125 M”이라 명명하고 소 단위형이 IgG2b인 마우스 융합세포주를“GT 273 G”라 명명하여 이들을 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 9월 24일에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0378 BP, KCTC 0379 BP).
본 발명은 상기 융합세포주로부터 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 대량으로 생산하기 위하여, N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 생산하는 상기 융합세포를 다시 마우스에 주사하고 복강이 부풀어 오른 생쥐에서 고농도의 융합세포를 함유하는 복수액을 취하여 본 발명의 단일클론 항체를 대량으로 얻는다.
본 발명은 상기 융합세포주로부터 얻은 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체가 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단백질을 선별적으로 인식하는 항원 특이성이 있는가를 확인하기 위하여, 상기 과정으로 제조된 단일클론 항체를 전기영동하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 상기 단일클론 항체는 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단백질에 대하여 선별적으로 높은 항원 인식 능력을 나타냄을 확인하였다(도 2 참조).
본 발명의 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 사람의 혈액이나 조직내에 존재하는 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단백질 항원과 플레이트에 코팅한 항-N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단일클론 항체를 경쟁적으로 반응시키면 환자의 세포나 혈청내의 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원농도를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 암이나 간질환의 진단에 이용될 수 있다.
따라서 본 발명의 단일클론 항체는 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단백질 항원 진단 키트를 개발하는데 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 의 제조
단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 생산하고 분석하는데 필요한 면역원을 제조하기 위하여, 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ(대한민국 특허출원 제97-48855 호) 유전자를 포함한 플라스미드 벡터 pET 22를 대장균에 형질전환시킨 후 그를 배양하여 DEAE-세파셀 분액법(DEAE-sephacel fractionation, 0-0.3M NaCl), 세파크릴 S-200(Sephacryl S-200)에서의 젤 거름(gel filtration), 전기영동(10% PAGE) 과정을 거쳐 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 분리, 정제하였다. SDS-PAGE를 통하여 그 순도를 확인한 결과 순수분리되었음을 확인하였고 브레드포드(Bradford)법에 의해 그 농도를 측정한 결과 1mg/ml 이었다.
<실시예 2> 마우스의 면역화
융합 세포주의 개발에 필요한 면역화된 생쥐를 얻기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ와 동량의 완전 보조항원(complete Freund's adjuvant)을 유상화가 될 때까지 잘 혼합하여 생후 6-8주된 Balb/c 마우스(mouse)의 복강내에 주사하였다. 2 주 후에 처음 주사한 것과 같은 양의 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 불완전 보조항원(Freund's incomplete adjuvant)에 혼합하여 동일 부위에 주사하였다. 그로부터 4-5일 후에 생쥐 꼬리 부위의 혈관에서 소량의 피를 뽑아내어 역가를 확인한 후 세포융합 실험 3-4 일전에 0.85% 생리식염수에 녹인 10μg의 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 생쥐의 정맥 및 복강내에 주사하였다.
<실시예 3> 융합세포주의 제조
융합세포주를 제조하는데 필요한 세포융합을 실시하기 위하여 상기 실시예 2에서 제조한 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 면역원을 주사하여 얻은 생쥐의 비장세포와 골수종 세포(myeloma cell, SP2/0)를 준비하였다.
세포융합의 모(parent)세포로는 골수종 세포 발한 SP2/0·Ag14를 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 최대밀도 5×105/ml 정도로 항상 유지시켜 사용하였고, 한스완충액(Han's buffered saline solution, HBSS)을 이용하여 2회 원심분리하였다.
상기 실시예 2에서 면역화된 생쥐를 이터(ether)로 마취시킨 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 꺼내서 곱게 간 다음 한스완충액을 이용하여 현탁액을 만들고 15ml 의 원심분리관에 넣어서 원심분리하고 다시 현탁, 원심분리하여 비장세포를 충분히 세척하였다.
비장세포와 SP2/0·Ag14를 각각 10ml 씩 재현탁시키고 108개의 비장세포와 107개의 SP2/0·Ag14를 50ml 원심분리관에서 섞어 다시 원심분리하여 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 다시 손가락으로 가볍게 두드려서 분산시키고 37℃에서 1분간 유지시킨 후에 한스완충액이 들어 있는 45% 폴리에틸 글라이콜(poliethylglycol)-5% DMSO의 퓨소겐(fusogen) 1ml 을 1분간에 걸쳐 넣고 또다시 1분간 약간 흔들어 주었다. 그 후 배양배지인 RPMI 배지 9ml를 3분간에 걸쳐 첨가하고 다시 50ml 이 될 때까지 흔들어 주면서 서서히 RPMI을 첨가하였다. 이 현탁액을 원심분리한 후 세포 침전물을 분리 배지인 HAT 배지에 1-2×105정도로 재현탁시키고 96-웰 마이크로 타이터 플레이트(96-well microtiter plate)에 깔은 후 37℃의 항습 이산화탄소 배양기(humidified CO2incubator, Forma Scientific사)에서 배양하였다.
<실시예 4> 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주의 선별
실시예 3에서 제조한 융합세포 중에서 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에만 특이적으로 반응하는 융합세포주를 선별하기 위하여, N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원을 이용한 효소 면역 측정법을 수행하였다. 구체적으로 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원을 96-웰 엘리자 플레이트에 각 웰당 50μl(2g) 씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고 반응하지 않은 항원은 인산완충용액-트윈 20(PBST) 용액으로 세척하여 제거하였다. 여기에 염소 마우스 IgG-서양 고추냉이 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-horse radish peroxidase) 를 가하여 실온에서 1 시간 동안 반응 시키고 PBST 용액으로 충분히 세척한 다음 퍼옥시다제의 기질용액인 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(o-penylenediamine dihydrochloride, OPD)을 넣어 반응시키고 그 반응정도를 엘리자 해독기(ELISA Reader, Flow. Lab사)로 492 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
그 결과 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 융합세포주들을 먼저 선별하였고, 여러번 반복 실험을 퉁하여 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원에만 특이적으로 반응하는 융합 세포주를 선별한 후 단일클론이 되게 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론항체를 생성하는 융합세포주를 선별하였다.
상기 과정으로 6개의 클론을 얻어 클로닝하고 동결시킨 다음 상등액을 취해 효소면역측정법으로 역가를 측정하고 면역확산법으로 소 단위형(subclass type)을 확인하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
6 개의 클론중 5개의 클론은 IgM이고 나머지 1개의 클론은 IgG2b으로 판명되었다.
클론 흡광도(492nm) 소 단위형
GT 10 M 1.149 IgM
GT 94 M 1.762. IgM
GT 122 M 1.139 IgM
GT 125 M 2.883 IgM
GT 6 M 1.128 IgM
GT 273 G 1.463 IgG2b
소 단위형이 IgM 으로 판명된 5개의 클론중에서 선별된 가장 높은 역가를 보이는 1개의 융합세포주를“GT 125 M”이라 명명하고 소 단위형이 IgG2b인 융합세포주를“GT 273 G”라 명명하여 이들을 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 9월 24일에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0378 BP, KCTC 0379 BP).
<실시예 5> 단일클론 항체의 대량생산
상기 실시예 4에서 얻은 계속적으로 항체를 분비하는 융합세포주로부터 단일클론 항체를 대량 생산하기 위하여 0.5ml 피리스텐(pistane)을 생쥐의 복강내로 주사하였다. 1주일 후에 각각의 융합세포들을 생쥐 한 마리당 5×106씩 주사하고 복강이 부풀어 오른 생쥐에서 복수액을 채취하였다. 복수액에는 융합세포가 고농도로 자라기 때문에 이 액체를 10,000rpm 에서 세포를 침전시킨 후 상층액만을 취하고 이 상층액은 정제될 때까지 -20℃에서 보관하였다.
<실시예 6> 단일클론 항체의 항원 특이성 조사
상기 실시예 1에서 분리, 정제한 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 10% -폴리아크릴아마이드 젤 전기영동한 다음 필터막에 전기적인 방법으로 옮겼다. 막에 옮긴 단백질의 비특이적인 반응을 줄이기 위해 3% 소혈청 알부민 용액으로 12-14 시간 동안 필터막을 차단시켰다.
N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 확인하기 위하여, 1차항체로 본 발명의 융합세포가 생산하는 항-N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단일클론 항체를 사용하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 상기 막을 0.5% 소혈청 알부민이 포함된 인산 완충액으로 3회 세척한 다음 2차 항체로는 서양 고추냉이 퍼옥시다제(horse radish peroxidase) 가 결합된 항 마우스 IgG을 사용하여 상온에서 반응시켰고 다시 0.5% 트윈이 포함된 인산 완충 용액으로 세척한 후 0.018%(v/v) 4-클로로-1-나프톨과 0.045%(v/v) 과산화수소가 인산 완충용액과 메탄올에 녹아 있는 기질을 이용하여 발색반응을 시켰다.
그 결과 도 2 에 나타난 바와 같이, IL-2 는 본 발명의 단일클론 항체에 의하여 전혀 인식되지 않는 반면 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단백질은 상기 단일클론 항체에 특이적으로 결합하였음을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단백질을 인식하는 높은 특이성을 지닌다. 따라서 상기 단일클론 항체는 암세포 조직 특히 간질환 환자의 간세포 및 암세포에서 그 활성이 특이적으로 증가하는 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원의 탐지에 쓰일 수 있어 암세포 및 간질환을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 간질환 환자의 혈액이나 조직내에 존재하는 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 항원과 플레이트에 코팅한 항-N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 단일클론 항체와의 경쟁반응을 시키는 경쟁 효소 면역 측정법 (competitive enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 환자 혈액이나 세포 조직내의 N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ의 유무와 농도를 간접적으로 측정하고 진단하는데 응용될 수 있다.

Claims (7)

  1. N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ 를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체.
  2. 제 1 항의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주
  3. 제 2 항에 있어서, 융합세포주는 IgM 의 소 단위형을 가지는 마우스 융합세포주 (수탁번호 : KCTC 0378 BP).
  4. 제 2 항에 있어서, 융합세포주는 IgG2b의 소 단위형을 가지는 마우스 융합세포주 (수탁번호 : KCTC 0379 BP).
  5. N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ를 마우스에 면역화 시킨 다음 그 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하고 이로부터 제 1 항의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주를 선별하여 얻는 제 3 항 또는 제 4항의 융합세포주의 제조방법.
  6. N-아세틸글루코사민 전이효소Ⅲ에 대한 단일클론 항체를 생산하는 제 3 항 또는 제 4 항의 융합세포를 마우스에 주사하고 복강이 부풀어 오른 마우스에서 고농도의 융합세포를 함유하는 복수액을 취하여 제 1 항의 단일클론 항체를 대량으로 얻는 단일클론 항체의 제조방법.
  7. 제 1 항의 단일클론 항체를 유효성분으로 하는 암세포 검색 시약 및 간질환 진단 시약.
KR1019970064030A 1997-11-28 1997-11-28 N-아세틸글루코사민 전이효소ⅲ에 대한 단일클론 항체, 이를생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법 KR100246126B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019970064030A KR100246126B1 (ko) 1997-11-28 1997-11-28 N-아세틸글루코사민 전이효소ⅲ에 대한 단일클론 항체, 이를생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019970064030A KR100246126B1 (ko) 1997-11-28 1997-11-28 N-아세틸글루코사민 전이효소ⅲ에 대한 단일클론 항체, 이를생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR19990043051A KR19990043051A (ko) 1999-06-15
KR100246126B1 true KR100246126B1 (ko) 2000-03-15

Family

ID=19525904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019970064030A KR100246126B1 (ko) 1997-11-28 1997-11-28 N-아세틸글루코사민 전이효소ⅲ에 대한 단일클론 항체, 이를생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100246126B1 (ko)

Also Published As

Publication number Publication date
KR19990043051A (ko) 1999-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4935343A (en) Monoclonal antibodies for interleukin-1β
Comer et al. Characterization of a mouse monoclonal antibody specific for O-linked N-acetylglucosamine
US7435590B2 (en) Monoclonal antibody and hybridoma producing the same
US7514227B2 (en) Anti-human mitochondrial adenylate kinase isozyme antibody, diagnostic formulation and diagnostic kit for cardiac disease
CA2025266A1 (en) Anti-hcg-.beta. core monoclonal antibody, its production and use
KR960002740B1 (ko) 안티-트롬빈-결합물질 모노클로날 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 모노클로날 항체를 이용한 트롬빈-결합물질의 정제법 및 측정법
KR102029394B1 (ko) 치쿤구니아 바이러스 감염 진단용 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이를 이용한 치쿤구니아 바이러스 감염 진단 방법
JPH09176199A (ja) 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用
KR100246126B1 (ko) N-아세틸글루코사민 전이효소ⅲ에 대한 단일클론 항체, 이를생산하는 융합세포주 및 그들의 제조방법
EP1098198A1 (en) Method for the qualitative and quantitative determination of class igG human antibodies
JPH07238099A (ja) モノクローナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定法
CA2281262C (en) Anti-human medullasin monoclonal antibody, process for producing the same and immunoassay using the same
US5622837A (en) Pancreas elastase 1-specific antibody, a process for obtaining it, and a test kit containing such antibody
JP3018111B2 (ja) モノクローナル抗体及びアシアログリコプロテインレセプターの測定法
US4952507A (en) Production and diagnostic use of antibodies against pancreatic alpha-amaylase
JPS63307900A (ja) 抗ＬＣＡ結合性ヒトα−フェトプロテインモノクロ−ナル抗体
Zegers et al. Detection of genetic variants of alpha 1-antitrypsin with site-specific monoclonal antibodies
Rousson et al. Preparation of an anti-acid sphingomyelinase monoclonal antibody for the quantitative determination and polypeptide analysis of lysosomal sphingomyelinase in fibroblasts from normal and Niemann-Pick type A patients
JPH0977799A (ja) ヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒト−ｍｉｆ）に対するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ
KR20030036010A (ko) 암 진단을 위한 항-인산화 캠타이드 단일클론 항체를이용한 혈중 프로테인키나제의 효소활성측정법
JP3849001B2 (ja) 抗−２′−デオキシシチジン抗体並びにその製造及び使用
KR100277660B1 (ko) N-아세틸 글루코사민 전이효소ⅲ의 활성도 측정방법 및 그 측정용 킷트
JPH0591894A (ja) ヒトの細胞質ゾルホスホリパーゼａ２と反応する抗体
KR20030036011A (ko) 암 진단을 위한 항프로테인 키나제 에이 항체를 이용한효소면역측정법
JP2948594B2 (ja) モノクローナル抗体

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20061205

Year of fee payment: 8

LAPS Lapse due to unpaid annual fee