JPH0591894A - ヒトの細胞質ゾルホスホリパーゼａ２と反応する抗体 - Google Patents
ヒトの細胞質ゾルホスホリパーゼａ２と反応する抗体Info
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- JPH0591894A JPH0591894A JP4043019A JP4301992A JPH0591894A JP H0591894 A JPH0591894 A JP H0591894A JP 4043019 A JP4043019 A JP 4043019A JP 4301992 A JP4301992 A JP 4301992A JP H0591894 A JPH0591894 A JP H0591894A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 分子量約１００ｋＤａのヒト細胞質ゾルホス
ホリパーゼＡ2に特異的に結合する新規単クローン抗体
およびポリクローン抗体とその使用法を提供する。 【構成】 ヒト細胞質ゾルホスホリパーゼＡ2（ｃＰＬ
Ａ2）に特異的に結合する単クローン抗体およびポリク
ローン抗体を調製して、該酵素に対するその特異的活性
を立証すると共に、これらを使用して新規な免疫アフィ
ニティーカラムを作成し、これがｃＰＬＡ2の存在の検
出同定、および精製に使用できることを明らかにした。
ホリパーゼＡ2に特異的に結合する新規単クローン抗体
およびポリクローン抗体とその使用法を提供する。 【構成】 ヒト細胞質ゾルホスホリパーゼＡ2（ｃＰＬ
Ａ2）に特異的に結合する単クローン抗体およびポリク
ローン抗体を調製して、該酵素に対するその特異的活性
を立証すると共に、これらを使用して新規な免疫アフィ
ニティーカラムを作成し、これがｃＰＬＡ2の存在の検
出同定、および精製に使用できることを明らかにした。
Description
【０００１】本発明は免疫学の一般的分野に属し、ヒト
の１００ｋＤａの細胞質ゾルホスホリパーゼＡ2（ｃＰ
ＬＡ2）酵素に対して反応性を有する単クローン抗体お
よびポリクローン抗体を包含する。また本発明は、本発
明の抗体を利用するｃＰＬＡ2の精製および同定法をも
包含する。
の１００ｋＤａの細胞質ゾルホスホリパーゼＡ2（ｃＰ
ＬＡ2）酵素に対して反応性を有する単クローン抗体お
よびポリクローン抗体を包含する。また本発明は、本発
明の抗体を利用するｃＰＬＡ2の精製および同定法をも
包含する。
【０００２】ヒトｃＰＬＡ2とその精製法は、米国特許
出願番号第０７／５７３５１３号に記述されている。本
発明以前には、ｃＰＬＡ2に特異的な抗体は知られてい
なかった。さらに、ｃＰＬＡ2をほぼ均一に精製する簡
便な方法もなかった。また本発明以前には、複雑な生物
学的混合物中のｃＰＬＡ2の存在を迅速かつ特異的に同
定する方法もなかった。本発明はｃＰＬＡ2に特異的な
新規抗体を提供すると共に、ｃＰＬＡ2の迅速な精製お
よび同定法を提供する。
出願番号第０７／５７３５１３号に記述されている。本
発明以前には、ｃＰＬＡ2に特異的な抗体は知られてい
なかった。さらに、ｃＰＬＡ2をほぼ均一に精製する簡
便な方法もなかった。また本発明以前には、複雑な生物
学的混合物中のｃＰＬＡ2の存在を迅速かつ特異的に同
定する方法もなかった。本発明はｃＰＬＡ2に特異的な
新規抗体を提供すると共に、ｃＰＬＡ2の迅速な精製お
よび同定法を提供する。
【０００３】ホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）は、ホスホ
グリセリド類のｓｎ−２−アシルエステル結合の加水分
解を触媒し、等モル量のリソリン脂質および遊離脂肪酸
を生成させるホスファチド２−アシルヒドロラーゼの総
称である（Dennis,E.A.,TheEnzymes,第１６巻,Academic
Press,New York(1983)）。ホスホリパーゼＡ2酵素類は
あらゆる生物種に存在し、多様な酵素群を形成してい
る。現在までに研究された該酵素のほとんどは約１４ｋ
Ｄａの分子量を有し、そのアミノ酸配列の相同性は著し
い。
グリセリド類のｓｎ−２−アシルエステル結合の加水分
解を触媒し、等モル量のリソリン脂質および遊離脂肪酸
を生成させるホスファチド２−アシルヒドロラーゼの総
称である（Dennis,E.A.,TheEnzymes,第１６巻,Academic
Press,New York(1983)）。ホスホリパーゼＡ2酵素類は
あらゆる生物種に存在し、多様な酵素群を形成してい
る。現在までに研究された該酵素のほとんどは約１４ｋ
Ｄａの分子量を有し、そのアミノ酸配列の相同性は著し
い。
【０００４】最も豊富に存在し、一般に研究されている
ＰＬＡ2酵素は分泌型酵素である。これらの酵素は細胞
内で生産され、分泌小胞中に封入されて、細胞の刺激に
応じて細胞外環境に放出され、そこで生物学的物質の消
化を助ける。これらの酵素とは対照的に、ｃＰＬＡ2は
極めて少量しか存在せず、細胞内に止まって分泌型とは
全く異なる機能を果す。細胞内ＰＬＡ2Sの詳細な研究は
これらの酵素の細胞内濃度が極めて低いことによって妨
げられてきた（VadasおよびPruzanski,Lab.Investigati
on,55,4:391(1986)）。
ＰＬＡ2酵素は分泌型酵素である。これらの酵素は細胞
内で生産され、分泌小胞中に封入されて、細胞の刺激に
応じて細胞外環境に放出され、そこで生物学的物質の消
化を助ける。これらの酵素とは対照的に、ｃＰＬＡ2は
極めて少量しか存在せず、細胞内に止まって分泌型とは
全く異なる機能を果す。細胞内ＰＬＡ2Sの詳細な研究は
これらの酵素の細胞内濃度が極めて低いことによって妨
げられてきた（VadasおよびPruzanski,Lab.Investigati
on,55,4:391(1986)）。
【０００５】受容体が仲介するｃＰＬＡ2活性を特異的
な阻害剤によって調節可能にすることは望ましい目標で
あり、またこれは喘息、虚血症、関節炎、敗血性ショッ
ク、および皮膚の炎症性疾患の新規な治療法を導くこと
であろう。特定の疾患状態を伴うｃＰＬＡ2活性の不活
化もしくは特異的阻害は、医学界にとって極めて有用に
なるであろう。この目標に到達するためには、ある疾患
の発生に関与するｃＰＬＡ2をまず同定し、単離しなけ
ればならない。本明細書は、ｃＰＬＡ2に対する単クロ
ーン抗体およびポリクローン抗体の調製法および単離法
について記述する。本明細書において、抗体なる用語
は、その特異的結合能を保持する抗体断片をも包含す
る。また本明細書は、複雑な生物学的混合物からｃＰＬ
Ａ2を精製するための抗体使用法、および種々の調製物
における該酵素の存在の同定法をも明らかにするであろ
う。
な阻害剤によって調節可能にすることは望ましい目標で
あり、またこれは喘息、虚血症、関節炎、敗血性ショッ
ク、および皮膚の炎症性疾患の新規な治療法を導くこと
であろう。特定の疾患状態を伴うｃＰＬＡ2活性の不活
化もしくは特異的阻害は、医学界にとって極めて有用に
なるであろう。この目標に到達するためには、ある疾患
の発生に関与するｃＰＬＡ2をまず同定し、単離しなけ
ればならない。本明細書は、ｃＰＬＡ2に対する単クロ
ーン抗体およびポリクローン抗体の調製法および単離法
について記述する。本明細書において、抗体なる用語
は、その特異的結合能を保持する抗体断片をも包含す
る。また本明細書は、複雑な生物学的混合物からｃＰＬ
Ａ2を精製するための抗体使用法、および種々の調製物
における該酵素の存在の同定法をも明らかにするであろ
う。
【０００６】本発明はｃＰＬＡ2と反応し得る抗体、並
びに、ｃＰＬＡ2を単離するためのそのような抗体の使
用法を包含する。該使用法は次の各工程： ａ）該抗体をある表面に固定化する； ｂ）該固定化抗体をｃＰＬＡ2含有混合物と接触させ
る； ｃ）ｃＰＬＡ2に結合した該固定化抗体を該混合物から
分離する； ｄ）抗体に結合したｃＰＬＡ2を該固定化抗体から溶離
させることによって、ｃＰＬＡ2を回収する； からなる。また本発明は、次の各工程： ａ）該抗体をある検定表面上に固定化する； ｂ）該検定表面を、ｃＰＬＡ2を含有すると考えられる
液体と接触させ、適切な溶液でその検定表面を洗浄す
る； ｃ）該検定表面を、検出基で標識した抗ｃＰＬＡ2抗体
と接触させ、その検定表面を適切な溶液で洗浄する； ｄ）該検出基の存在を検出する； からなる、ｃＰＬＡ2の存在を同定するための、該抗体
の使用法をも包含する。
びに、ｃＰＬＡ2を単離するためのそのような抗体の使
用法を包含する。該使用法は次の各工程： ａ）該抗体をある表面に固定化する； ｂ）該固定化抗体をｃＰＬＡ2含有混合物と接触させ
る； ｃ）ｃＰＬＡ2に結合した該固定化抗体を該混合物から
分離する； ｄ）抗体に結合したｃＰＬＡ2を該固定化抗体から溶離
させることによって、ｃＰＬＡ2を回収する； からなる。また本発明は、次の各工程： ａ）該抗体をある検定表面上に固定化する； ｂ）該検定表面を、ｃＰＬＡ2を含有すると考えられる
液体と接触させ、適切な溶液でその検定表面を洗浄す
る； ｃ）該検定表面を、検出基で標識した抗ｃＰＬＡ2抗体
と接触させ、その検定表面を適切な溶液で洗浄する； ｄ）該検出基の存在を検出する； からなる、ｃＰＬＡ2の存在を同定するための、該抗体
の使用法をも包含する。
【０００７】標的タンパク質に対する抗体の調製につい
ては、当該技術分野においてよく知られている。Galfre
およびMilstein,Methods in Enzymology,第７３巻,Acad
emicPress,New York(1981)；James W.Goding,Monoclona
l Antibodies:Principles and Practice,Academic Pres
s,Orlando,Florida(1986)；Current Protocols in Mole
cular Biology,F.M.Ausubel等共編,Wiley Interscienc
e,New York,(1987)を参照のこと。
ては、当該技術分野においてよく知られている。Galfre
およびMilstein,Methods in Enzymology,第７３巻,Acad
emicPress,New York(1981)；James W.Goding,Monoclona
l Antibodies:Principles and Practice,Academic Pres
s,Orlando,Florida(1986)；Current Protocols in Mole
cular Biology,F.M.Ausubel等共編,Wiley Interscienc
e,New York,(1987)を参照のこと。
【０００８】標的タンパク質との反応性を有する抗体を
調製するためには、まずそのタンパク質を精製しなけれ
ばならない。比較的不純なタンパク質抗原調製物を免疫
化に用いることもできるが、求めている単クローン抗体
（ｍａｂ）をハイブリドーマが生産しているか否かを正
確に決定するためや、あるいは免疫血清の抗体力価を検
定するためには、高度に精製されたタンパク質が必要で
ある。したがって以下に、ヒトｃＰＬＡ2を１００００
倍以上、ほぼ均一に精製する方法、ｃＰＬＡ2に対する
ｍａｂおよび抗血清（ポリクローン抗体）の調製法、並
びに、ヒトｃＰＬＡ2を一操作で精製するための該抗体
の使用法について記述する。
調製するためには、まずそのタンパク質を精製しなけれ
ばならない。比較的不純なタンパク質抗原調製物を免疫
化に用いることもできるが、求めている単クローン抗体
（ｍａｂ）をハイブリドーマが生産しているか否かを正
確に決定するためや、あるいは免疫血清の抗体力価を検
定するためには、高度に精製されたタンパク質が必要で
ある。したがって以下に、ヒトｃＰＬＡ2を１００００
倍以上、ほぼ均一に精製する方法、ｃＰＬＡ2に対する
ｍａｂおよび抗血清（ポリクローン抗体）の調製法、並
びに、ヒトｃＰＬＡ2を一操作で精製するための該抗体
の使用法について記述する。
【０００９】ｃＰＬＡ2の精製 ｃＰＬＡ2の精製法は米国特許出願番号第０７／５７３
５１３号に記述されている。以下にその方法を要約し、
ｃＰＬＡ2がヒト白血病モノブラストイド（単芽球様）
Ｕ９３７細胞株からどのように単離されるかについて簡
潔に記述する。
５１３号に記述されている。以下にその方法を要約し、
ｃＰＬＡ2がヒト白血病モノブラストイド（単芽球様）
Ｕ９３７細胞株からどのように単離されるかについて簡
潔に記述する。
【００１０】Ｕ９３７細胞株はアメリカンタイプカルチ
ャーコレクション（ＡＴＣＣ）の永久保存株の１つであ
り、受託番号ＣＲＬ１５９３の下で入手できる。Ｕ９３
７細胞を生育させて回収し、これを、プロテアーゼ阻害
剤存在下、窒素キャビテーションによって溶解する。こ
の溶解液から超遠心分離によって可溶性分画を調製す
る。得られた細胞質ゾルタンパク質溶液にはｃＰＬＡ2
が含まれており、これを一連の精製操作に付す。
ャーコレクション（ＡＴＣＣ）の永久保存株の１つであ
り、受託番号ＣＲＬ１５９３の下で入手できる。Ｕ９３
７細胞を生育させて回収し、これを、プロテアーゼ阻害
剤存在下、窒素キャビテーションによって溶解する。こ
の溶解液から超遠心分離によって可溶性分画を調製す
る。得られた細胞質ゾルタンパク質溶液にはｃＰＬＡ2
が含まれており、これを一連の精製操作に付す。
【００１１】この細胞溶解液の可溶性分画を一連のカラ
ムクロマトグラフィー操作にかける。アニオン交換クロ
マトグラフィーの後、疎水相互作用クロマトグラフィー
および分子量分画を行い、最後にもう一度、ｃＰＬＡ2
が樹脂に弱く結合するような条件の疎水相互作用技術を
用いる。各カラム精製を個別に行い、その溶出液の２８
０ｎｍの吸光度を監視しながら分画する。タンパク質ピ
ーク分画についてそのホスホリパーゼ活性を検定し、望
ましい活性を有する分画を、ｃＰＬＡ2の均一溶液が得
られるまで次のカラムにかける。
ムクロマトグラフィー操作にかける。アニオン交換クロ
マトグラフィーの後、疎水相互作用クロマトグラフィー
および分子量分画を行い、最後にもう一度、ｃＰＬＡ2
が樹脂に弱く結合するような条件の疎水相互作用技術を
用いる。各カラム精製を個別に行い、その溶出液の２８
０ｎｍの吸光度を監視しながら分画する。タンパク質ピ
ーク分画についてそのホスホリパーゼ活性を検定し、望
ましい活性を有する分画を、ｃＰＬＡ2の均一溶液が得
られるまで次のカラムにかける。
【００１２】均一に精製した活性なｃＰＬＡ2は、この
ｃＰＬＡ2を含有する最終カラムの緩衝液１体積に対し
て、２体積の７５％グリセロール水溶液と、さらに２ｍ
Ｍ ２−メルカプロエタノール（２−ＭＥ）を混合して
調製した溶液中で、−２０℃で保存できる。この条件下
で、ｃＰＬＡ2は数カ月間酵素活性を維持する。
ｃＰＬＡ2を含有する最終カラムの緩衝液１体積に対し
て、２体積の７５％グリセロール水溶液と、さらに２ｍ
Ｍ ２−メルカプロエタノール（２−ＭＥ）を混合して
調製した溶液中で、−２０℃で保存できる。この条件下
で、ｃＰＬＡ2は数カ月間酵素活性を維持する。
【００１３】ｃＰＬＡ2を単離できたら、当該技術分野
においてよく知られている従来の方法でｃＰＬＡ2に特
異的な抗体を産生させることができる。選択した宿主中
に数週間または数カ月にわたって注射を繰り返すと免疫
応答が引き出され、有意な抗ｃＰＬＡ2血清力価がもた
らされる。好ましい宿主は哺乳類種であり、より高度に
好ましい種はウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスであ
る。このように免疫化された動物から得た血液を、確立
された方法で加工することにより、ｃＰＬＡ２に反応す
る抗血清（ポリクローン抗体）を得ることができる。次
に、この抗血清を当該技術分野において既知の技術に従
ってｃＰＬＡ２に吸着させることによりアフニティー精
製することができる。アフニティー精製した抗血清内の
免疫グロブリン分画を当該技術分野で既知の方法で単離
することにより、さらに精製することができる。得られ
た物質は、ｃＰＬＡ2に対して反応性を有する免疫グロ
ブリンの混成集団であろう。
においてよく知られている従来の方法でｃＰＬＡ2に特
異的な抗体を産生させることができる。選択した宿主中
に数週間または数カ月にわたって注射を繰り返すと免疫
応答が引き出され、有意な抗ｃＰＬＡ2血清力価がもた
らされる。好ましい宿主は哺乳類種であり、より高度に
好ましい種はウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスであ
る。このように免疫化された動物から得た血液を、確立
された方法で加工することにより、ｃＰＬＡ２に反応す
る抗血清（ポリクローン抗体）を得ることができる。次
に、この抗血清を当該技術分野において既知の技術に従
ってｃＰＬＡ２に吸着させることによりアフニティー精
製することができる。アフニティー精製した抗血清内の
免疫グロブリン分画を当該技術分野で既知の方法で単離
することにより、さらに精製することができる。得られ
た物質は、ｃＰＬＡ2に対して反応性を有する免疫グロ
ブリンの混成集団であろう。
【００１４】また抗ｃＰＬＡ2抗体を、免疫原担体に共
役させたｃＰＬＡ2合成ペプチド断片からなる半合成的
免疫原を調製することによって、生成させることもでき
る。ペプチド断片を調製するための工程および装置は当
該技術分野において数多く知られている。ウシ血清アル
ブミンやキーホールリムペットヘモシアニンなど、適切
な免疫原担体が当該技術分野において数多く知られてお
り、また２つのタンパク質を結合させる技術も同様によ
く知られている。半合成免疫原が構築したら、そのｃＰ
ＬＡ2断片に特異的な抗体を製造する方法は、天然のｃ
ＰＬＡ2に反応する抗体を製造するために用いた方法と
同一である。
役させたｃＰＬＡ2合成ペプチド断片からなる半合成的
免疫原を調製することによって、生成させることもでき
る。ペプチド断片を調製するための工程および装置は当
該技術分野において数多く知られている。ウシ血清アル
ブミンやキーホールリムペットヘモシアニンなど、適切
な免疫原担体が当該技術分野において数多く知られてお
り、また２つのタンパク質を結合させる技術も同様によ
く知られている。半合成免疫原が構築したら、そのｃＰ
ＬＡ2断片に特異的な抗体を製造する方法は、天然のｃ
ＰＬＡ2に反応する抗体を製造するために用いた方法と
同一である。
【００１５】抗ｃＰＬＡ2ｍａｂは、精製ｃＰＬＡ2を用
いて容易に調製される。ｍａｂを生産する方法は過去１
５年以上にわたって実施されてきており、当業者一般に
よく知られている。アジュバント中のｃＰＬＡ2を繰り
返し腹腔内注射または皮下注射すれば、ほとんどの動物
中で免疫応答が起こるであろう。超免疫化したＢ−リン
パ球をその動物から取り出し、これを、無限に培養でき
る適切な融合相手となる細胞株と融合させる。Ｂ−リン
パ球を超免疫化し、それをｍａｂの生産に使用するのに
好ましい動物は哺乳類である。より好ましい動物はラッ
トおよびマウスであり、最も好ましくはｂａｌｂ／ｃマ
ウス株である。
いて容易に調製される。ｍａｂを生産する方法は過去１
５年以上にわたって実施されてきており、当業者一般に
よく知られている。アジュバント中のｃＰＬＡ2を繰り
返し腹腔内注射または皮下注射すれば、ほとんどの動物
中で免疫応答が起こるであろう。超免疫化したＢ−リン
パ球をその動物から取り出し、これを、無限に培養でき
る適切な融合相手となる細胞株と融合させる。Ｂ−リン
パ球を超免疫化し、それをｍａｂの生産に使用するのに
好ましい動物は哺乳類である。より好ましい動物はラッ
トおよびマウスであり、最も好ましくはｂａｌｂ／ｃマ
ウス株である。
【００１６】数多くの哺乳類細胞株がハイブリドーマを
作成するための融合相手として適している。このような
株の多くはＡＴＣＣおよび商業的な供給者から市販され
ている。融合相手となる好ましい細胞株はマウスの骨髄
腫であり、ＨＬ−１TMフレンドリー骨髄腫６５３細胞株
（HL-1 Friendly myeloma-653 cell line,Ventrex,Port
land,ME）が最も好ましい。
作成するための融合相手として適している。このような
株の多くはＡＴＣＣおよび商業的な供給者から市販され
ている。融合相手となる好ましい細胞株はマウスの骨髄
腫であり、ＨＬ−１TMフレンドリー骨髄腫６５３細胞株
（HL-1 Friendly myeloma-653 cell line,Ventrex,Port
land,ME）が最も好ましい。
【００１７】融合したら、得られたハイブリドーマを選
択生育培地中で１〜２週間培養する。未融合の骨髄腫細
胞、あるいは骨髄腫細胞同士の融合を、混合ハイブリド
ーマ培養物から除去するためには、２種類のよく知られ
た選択系が利用できる。選択系の選択は免疫化したマウ
スの株および融合相手として用いた骨髄腫の株に依存す
る。TaggartおよびSamloff,Science,219,1228(1982）に
記述されているＡＡＴ選択系を使用することもできる
が、Littlefield,Science,145,709(1964）に記述されて
いるＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）選択系は、上述した好ましいマウス株および融合相
手との適合性を有するので、このＨＡＴ選択系が好まし
い。
択生育培地中で１〜２週間培養する。未融合の骨髄腫細
胞、あるいは骨髄腫細胞同士の融合を、混合ハイブリド
ーマ培養物から除去するためには、２種類のよく知られ
た選択系が利用できる。選択系の選択は免疫化したマウ
スの株および融合相手として用いた骨髄腫の株に依存す
る。TaggartおよびSamloff,Science,219,1228(1982）に
記述されているＡＡＴ選択系を使用することもできる
が、Littlefield,Science,145,709(1964）に記述されて
いるＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）選択系は、上述した好ましいマウス株および融合相
手との適合性を有するので、このＨＡＴ選択系が好まし
い。
【００１８】次に、使用し終わった生育培地を、免疫特
異的ｍａｂの分泌に関してスクリーニングする。酵素結
合免疫吸収剤検定法（ＥＬＩＳＡ）がこの目的に最も適
しているが、大量のスクリーニングに適合させた放射免
疫検定法も使用し得る。無関係な培養またはあまり望ま
しくない培養を漸減させることを意図した複数のスクリ
ーニングを実施すべきである。ｃＰＬＡ2に対する反応
性を有するｍａｂを分泌する培養を、既知のＰＬＡ2Sと
の交差反応性に関してスクリーニングするべきである。
ｃＰＬＡ2に対して優先的に結合するｍａｂを、市販の
検定法を用いてアイソタイプに分類する。好ましいｍａ
ｂはＩｇＧ群であり、より高度に好ましいｍａｂはＩｇ
Ｇ1およびＩｇＧ2サブアイソタイプである。
異的ｍａｂの分泌に関してスクリーニングする。酵素結
合免疫吸収剤検定法（ＥＬＩＳＡ）がこの目的に最も適
しているが、大量のスクリーニングに適合させた放射免
疫検定法も使用し得る。無関係な培養またはあまり望ま
しくない培養を漸減させることを意図した複数のスクリ
ーニングを実施すべきである。ｃＰＬＡ2に対する反応
性を有するｍａｂを分泌する培養を、既知のＰＬＡ2Sと
の交差反応性に関してスクリーニングするべきである。
ｃＰＬＡ2に対して優先的に結合するｍａｂを、市販の
検定法を用いてアイソタイプに分類する。好ましいｍａ
ｂはＩｇＧ群であり、より高度に好ましいｍａｂはＩｇ
Ｇ1およびＩｇＧ2サブアイソタイプである。
【００１９】求めるｍａｂを分泌するハイブリドーマ培
養を数回サブクローニングすることによって、単クロー
ン性および安定性を確立するべきである。真核非付着性
細胞培養をサブクローニングするためのよく知られた方
法には、限界希釈、軟アガロースおよび蛍光活性化細胞
選別技術が含まれる。各サブクローニングの後、安定な
抗体分泌培養が確立されたことを確かめるために、得ら
れた培養の抗体分泌を再検定し、アイソタイプに分類し
なければならない。
養を数回サブクローニングすることによって、単クロー
ン性および安定性を確立するべきである。真核非付着性
細胞培養をサブクローニングするためのよく知られた方
法には、限界希釈、軟アガロースおよび蛍光活性化細胞
選別技術が含まれる。各サブクローニングの後、安定な
抗体分泌培養が確立されたことを確かめるために、得ら
れた培養の抗体分泌を再検定し、アイソタイプに分類し
なければならない。
【００２０】本発明の抗ｃＰＬＡ2抗体は、本発明のｃ
ＰＬＡ2単離法の実施には不可欠な免疫親和性表面を調
製するために必須の試薬である。この免疫親和性表面
は、抗ｃＰＬＡ2抗体をある物質に、少なくともその抗
体結合部位の幾つかが露出しており、その抗原を結合で
きるように固定化することによって形成される。抗体を
固定化するために用いる物質は、多孔性多糖ベースのビ
ーズからプラスチック重合体、無機物質までに及ぶ。好
ましい物質は、最大の表面積／体積比を有し、抗体もし
くはｃＰＬＡ2に対して不利な影響を与えない物質であ
る。種々のサイズのビーズ中に形成された多糖マトリッ
クスは多孔性であり、高い表面積／体積比を有し、扱い
易く、生化学的精製技術分野においてよく知られており
またよく理解されているので、より高度に好ましい。Af
finity Chromatography Principles &Methods,Pharmaci
a Fine Chemicals,(1983）を参照のこと。
ＰＬＡ2単離法の実施には不可欠な免疫親和性表面を調
製するために必須の試薬である。この免疫親和性表面
は、抗ｃＰＬＡ2抗体をある物質に、少なくともその抗
体結合部位の幾つかが露出しており、その抗原を結合で
きるように固定化することによって形成される。抗体を
固定化するために用いる物質は、多孔性多糖ベースのビ
ーズからプラスチック重合体、無機物質までに及ぶ。好
ましい物質は、最大の表面積／体積比を有し、抗体もし
くはｃＰＬＡ2に対して不利な影響を与えない物質であ
る。種々のサイズのビーズ中に形成された多糖マトリッ
クスは多孔性であり、高い表面積／体積比を有し、扱い
易く、生化学的精製技術分野においてよく知られており
またよく理解されているので、より高度に好ましい。Af
finity Chromatography Principles &Methods,Pharmaci
a Fine Chemicals,(1983）を参照のこと。
【００２１】多くの種類の抗体固定化工程が、過去数十
年間にわたって開発されてきた。固定化は、抗体を望ま
しい物質に直接共有結合させるか、あるいは抗体を物質
に架橋することによって達成できる。
年間にわたって開発されてきた。固定化は、抗体を望ま
しい物質に直接共有結合させるか、あるいは抗体を物質
に架橋することによって達成できる。
【００２２】抗体の、セファロースTM（Pharmacia,Pist
cataway,NJ）のような多糖ベースのビーズへのＣＮＢｒ
またはカルボジイミド結合は、本発明に合致する直接結
合法の例である。一般的には直接結合法が特定の様式で
抗体を配向させることはないが、直接結合法の幾つか
は、固定化物質上で抗体に再現性のある配向を取らせる
ことができる。
cataway,NJ）のような多糖ベースのビーズへのＣＮＢｒ
またはカルボジイミド結合は、本発明に合致する直接結
合法の例である。一般的には直接結合法が特定の様式で
抗体を配向させることはないが、直接結合法の幾つか
は、固定化物質上で抗体に再現性のある配向を取らせる
ことができる。
【００２３】好ましい結合法は、抗原結合領域が露出す
るように抗体を配向させる。このような方法の１つは、
抗体の重鎖上の天然炭水化物を利用する。まずこの炭水
化物部分を対応するアルデヒドに酸化した後、このアル
デヒドを表面上の１級アミノ基と反応させることによ
り、抗体を有利な配向で結合させることができる。
るように抗体を配向させる。このような方法の１つは、
抗体の重鎖上の天然炭水化物を利用する。まずこの炭水
化物部分を対応するアルデヒドに酸化した後、このアル
デヒドを表面上の１級アミノ基と反応させることによ
り、抗体を有利な配向で結合させることができる。
【００２４】多くの種類の架橋が考えられ、これらには
抗体を固定化物質に共有結合させる有機リンカーが含ま
れる。このようなスペーサーアーム（spacer arms）は
使用可能であり、架橋が形成された後でタンパク質と相
互作用しないことが好ましい。
抗体を固定化物質に共有結合させる有機リンカーが含ま
れる。このようなスペーサーアーム（spacer arms）は
使用可能であり、架橋が形成された後でタンパク質と相
互作用しないことが好ましい。
【００２５】もう１つの種類の架橋は、固定化物質に結
合したより大きな多価分子で、数個の抗体を結合できる
ものに基づく。固定化表面に結合し、非共有結合的に抗
体を結合できる特異的免疫吸着剤もまた別種類の架橋で
ある。プロテインＡは、抗体を配向させる能力を有する
特異的免疫吸着剤の一例である。プロテインＡを化学的
に固定化表面に結合させ、抗体をそれに結合させること
によって、そのＦａｂ抗体部分は免疫親和性表面から離
れて配向し、好ましい立体配置をもたらすであろう。
合したより大きな多価分子で、数個の抗体を結合できる
ものに基づく。固定化表面に結合し、非共有結合的に抗
体を結合できる特異的免疫吸着剤もまた別種類の架橋で
ある。プロテインＡは、抗体を配向させる能力を有する
特異的免疫吸着剤の一例である。プロテインＡを化学的
に固定化表面に結合させ、抗体をそれに結合させること
によって、そのＦａｂ抗体部分は免疫親和性表面から離
れて配向し、好ましい立体配置をもたらすであろう。
【００２６】上記の議論は本発明の範囲の限定を意味す
るものではない。抗体を固定化表面に連結する方法は他
にも数多くよく知られており、これらもまた本発明に合
致する。
るものではない。抗体を固定化表面に連結する方法は他
にも数多くよく知られており、これらもまた本発明に合
致する。
【００２７】免疫親和性表面を調製したら、ｃＰＬＡ2
含有液体をこの表面に接触させなければならない。バッ
チ法も適当であるが、カラムクロマトグラフィーが好ま
しい。バッチ式分離は、濾過、遠心分離またはデカンテ
ーションによって達成できる。カラムクロマトグラフィ
ーを用いる場合は、簡単な洗浄工程で、固定化抗体から
混合物を分離できる。免疫親和性表面からのｃＰＬＡ2
の除去は、表面に結合したｃＰＬＡ2複合体を、抗体と
ｃＰＬＡ2との相互作用を破壊し得る溶液にさらすこと
によって達成できる。この溶液が、免疫親和性表面また
はｃＰＬＡ2に不利な影響を与えないことが好ましい。
より好ましい溶液は、ミリモル／ｌ濃度の２−ＭＥを含
有するほぼ中性ｐＨの緩衝化された生理的塩類溶液であ
る。最も高度に好ましい溶液は、ｃＰＬＡ2の酵素活性
に不利な影響を与えないものである。
含有液体をこの表面に接触させなければならない。バッ
チ法も適当であるが、カラムクロマトグラフィーが好ま
しい。バッチ式分離は、濾過、遠心分離またはデカンテ
ーションによって達成できる。カラムクロマトグラフィ
ーを用いる場合は、簡単な洗浄工程で、固定化抗体から
混合物を分離できる。免疫親和性表面からのｃＰＬＡ2
の除去は、表面に結合したｃＰＬＡ2複合体を、抗体と
ｃＰＬＡ2との相互作用を破壊し得る溶液にさらすこと
によって達成できる。この溶液が、免疫親和性表面また
はｃＰＬＡ2に不利な影響を与えないことが好ましい。
より好ましい溶液は、ミリモル／ｌ濃度の２−ＭＥを含
有するほぼ中性ｐＨの緩衝化された生理的塩類溶液であ
る。最も高度に好ましい溶液は、ｃＰＬＡ2の酵素活性
に不利な影響を与えないものである。
【００２８】検出基で標識された抗体を種々の環境中の
抗原の存在の同定に使用できることはよく知られてい
る。放射性同位体で標識された抗体は、様々な生物学的
液体中の抗原の存在を極めて正確に高感度で同定するた
めの放射免疫検定において、数十年来使用されてきた。
より最近では、酵素で標識した抗体が放射標識抗体の代
替物として一般的なＥＬＩＳＡ法で用いられてきた。
抗原の存在の同定に使用できることはよく知られてい
る。放射性同位体で標識された抗体は、様々な生物学的
液体中の抗原の存在を極めて正確に高感度で同定するた
めの放射免疫検定において、数十年来使用されてきた。
より最近では、酵素で標識した抗体が放射標識抗体の代
替物として一般的なＥＬＩＳＡ法で用いられてきた。
【００２９】本発明の抗体をポリスチレン壁やポリスチ
レン粒子などの固定化物質に結合させて、被験試料中に
ｃＰＬＡ2が存在するか否かを決定するための免疫検定
に利用することができる。本発明のこの態様では、試料
をこの免疫親和性表面と接触させ、これをインキュベー
トする。洗浄工程の後、その表面を、検出基で標識した
本発明のもう１つの抗体と接触させることにより、免疫
親和性表面に結合しているｃＰＬＡ2を検出することが
できる。
レン粒子などの固定化物質に結合させて、被験試料中に
ｃＰＬＡ2が存在するか否かを決定するための免疫検定
に利用することができる。本発明のこの態様では、試料
をこの免疫親和性表面と接触させ、これをインキュベー
トする。洗浄工程の後、その表面を、検出基で標識した
本発明のもう１つの抗体と接触させることにより、免疫
親和性表面に結合しているｃＰＬＡ2を検出することが
できる。
【００３０】もう１つの方式の検定態様では、ｃＰＬＡ
2を含有すると思われる被験試料をある表面上に乾燥さ
せて固定化被験試料を形成させる。次いで、本発明の標
識抗体をこの固定化被験試料と接触させ、これをインキ
ュベートする。この試料がｃＰＬＡ2を含有していれ
ば、標識抗体が固定化ｃＰＬＡ2に結合するであろう。
またまず本発明の非標識抗体を使用した後、既にｃＰＬ
Ａ2に結合している本発明の抗体に結合する標識した第
２抗体を使用することによって、この方法を行うことも
できる。洗浄後、検出基の存在を検出するために、固定
化被験試料を測定する
2を含有すると思われる被験試料をある表面上に乾燥さ
せて固定化被験試料を形成させる。次いで、本発明の標
識抗体をこの固定化被験試料と接触させ、これをインキ
ュベートする。この試料がｃＰＬＡ2を含有していれ
ば、標識抗体が固定化ｃＰＬＡ2に結合するであろう。
またまず本発明の非標識抗体を使用した後、既にｃＰＬ
Ａ2に結合している本発明の抗体に結合する標識した第
２抗体を使用することによって、この方法を行うことも
できる。洗浄後、検出基の存在を検出するために、固定
化被験試料を測定する
【００３１】検出基の典型例は、アルカリホスファター
ゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはβ−ガラクト
シダーゼなどの酵素である。適切な基質がこの酵素と反
応すると、変色が起こる。このような系においては、分
光光度計を用いてその色強度を定量することができる。
検出基が放射性同位体である場合は、適当なガンマ線あ
るいはベータ線検出装置を使用してその検出基を定量す
ることができる。検出基の強度は、被験試料中のｃＰＬ
Ａ2量と直接的に相関する。
ゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはβ−ガラクト
シダーゼなどの酵素である。適切な基質がこの酵素と反
応すると、変色が起こる。このような系においては、分
光光度計を用いてその色強度を定量することができる。
検出基が放射性同位体である場合は、適当なガンマ線あ
るいはベータ線検出装置を使用してその検出基を定量す
ることができる。検出基の強度は、被験試料中のｃＰＬ
Ａ2量と直接的に相関する。
【００３２】以下の実施例は、本発明の実施法の記述を
補助し、本発明の抗ｃＰＬＡ2抗体の特徴を例示するで
あろう。
補助し、本発明の抗ｃＰＬＡ2抗体の特徴を例示するで
あろう。
【００３３】実施例１：Ｕ９３７細胞培養 ヒト白血病モノブラストイド株化細胞Ｕ９３７をアメリ
カンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入
手した。本株化細胞はＡＴＣＣの永久保存株であり、受
託番号ＣＲＬ１５９３の下で入手できる。Ｕ９３７細胞
培養を、５％胎生ウシ血清（HyClone Laboratories,Log
an,Utah）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Tanabe USA,San
Diego,CA）、０．０２％ プルロニックＦ−６８（BASF
Corporation,Parsippany,NJ）、１ｍＭ ＣａＣｌ2、
５０μｇ／ｍｌ トブラマイシン（Eli Lilly and Co.,
Indianapolis,IN）、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（USB,Cleve
land,OH）、２．２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ3、１００μＭ
エタノールアミン（SigmaChemical,St.Louis,MO）を補
足したＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Gibco Laboratories
Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY）中で維持
した。
カンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入
手した。本株化細胞はＡＴＣＣの永久保存株であり、受
託番号ＣＲＬ１５９３の下で入手できる。Ｕ９３７細胞
培養を、５％胎生ウシ血清（HyClone Laboratories,Log
an,Utah）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Tanabe USA,San
Diego,CA）、０．０２％ プルロニックＦ−６８（BASF
Corporation,Parsippany,NJ）、１ｍＭ ＣａＣｌ2、
５０μｇ／ｍｌ トブラマイシン（Eli Lilly and Co.,
Indianapolis,IN）、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（USB,Cleve
land,OH）、２．２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ3、１００μＭ
エタノールアミン（SigmaChemical,St.Louis,MO）を補
足したＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Gibco Laboratories
Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY）中で維持
した。
【００３４】細胞懸濁液１ｍｌの入ったＡＴＣＣからの
アンプルをドライアイス容器から取り出し、３７℃水浴
に設置して氷が融解するまで激しく撹拌した。この時点
以降すべての操作を滅菌技術を用いて行った。アンプル
を開封し、その内容物を取り出して１５ｍｌコニカル
（円錐型）滅菌遠心管中に入れた。培地（３７℃）９ｍ
ｌを加えた後、その遠心管を卓上型遠心機（Damon/IEC
Division,Needham Heights,MA）中、１０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離した。培地をデカントして細胞ペレッ
トを培地（３７℃）５０ｍｌ中に再懸濁し、Ｔ−７５組
織培養フラスコ（Corning Glass,Corning,NY）に移し
て、これを５％ ＣＯ2、９５％ 空気で平衡化した３
７℃のインキュベーター（培養器）中に設置した。
アンプルをドライアイス容器から取り出し、３７℃水浴
に設置して氷が融解するまで激しく撹拌した。この時点
以降すべての操作を滅菌技術を用いて行った。アンプル
を開封し、その内容物を取り出して１５ｍｌコニカル
（円錐型）滅菌遠心管中に入れた。培地（３７℃）９ｍ
ｌを加えた後、その遠心管を卓上型遠心機（Damon/IEC
Division,Needham Heights,MA）中、１０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離した。培地をデカントして細胞ペレッ
トを培地（３７℃）５０ｍｌ中に再懸濁し、Ｔ−７５組
織培養フラスコ（Corning Glass,Corning,NY）に移し
て、これを５％ ＣＯ2、９５％ 空気で平衡化した３
７℃のインキュベーター（培養器）中に設置した。
【００３５】コールターカウンター（Coulter Counter,
Coulter Electronics,Hialeah,FL）で計測した細胞計数
値が１〜１．５ｘ１０6細胞／ｍｌになったときに培養
物を５００ｍｌ滅菌マイクロキャリアースピナーフラス
コ（microcarrier spinner flask）中の新鮮な培地４５
０ｍｌに移し（計５００ｍｌ培地）、３７℃の５％ＣＯ
2インキュベーター中、マイクロキャリアー磁石撹拌子
（Bellco）を用いて５０ｒｐｍで撹拌した。細胞密度が
１〜１．５ｘ１０6に達したときに、この５００ｍｌ細
胞懸濁液を６ｌマイクロキャリアースピナー（Bellco）
中の培地（３７℃）５．５ｌ中に入れた。このスピナー
フラスコの上部空間に５％ ＣＯ2、２５％ Ｏ2、７０
％ Ｎ2が連続的に通気するように、０．２ミクロン孔
フィルター（Gelman sciences,Ann Arbor,MI）を装着し
た。３７℃、５０ｒｐｍで撹拌した。細胞密度が１〜
１．５ｘ１０6細胞／ｍｌに達したときに、この５ｌ細
胞懸濁液を、滅菌３６ｌバイオテックオーバーヘッドド
ライブシステム（BiotechOverhead Drive System,Bellc
o）中の培地（３７℃）約３６ｌ中に入れた。７０％
Ｎ2、２５％ Ｏ2、５％ ＣＯ2を滅菌通気フィルター
を通してこの培養物に散布した。側面排出口の１つにパ
スツールピペットを装着し、ガス流量を５〜１０泡／秒
に設定した。この培養物を６〜７ｒｐｍで撹拌し、３７
℃でインキュベートした。毎日細胞数を計測し、細胞密
度が約１ｘ１０6細胞／ｍｌに達したとき、この培養物
に１００％ Ｏ2を極めてゆっくりした速度で散布し
た。
Coulter Electronics,Hialeah,FL）で計測した細胞計数
値が１〜１．５ｘ１０6細胞／ｍｌになったときに培養
物を５００ｍｌ滅菌マイクロキャリアースピナーフラス
コ（microcarrier spinner flask）中の新鮮な培地４５
０ｍｌに移し（計５００ｍｌ培地）、３７℃の５％ＣＯ
2インキュベーター中、マイクロキャリアー磁石撹拌子
（Bellco）を用いて５０ｒｐｍで撹拌した。細胞密度が
１〜１．５ｘ１０6に達したときに、この５００ｍｌ細
胞懸濁液を６ｌマイクロキャリアースピナー（Bellco）
中の培地（３７℃）５．５ｌ中に入れた。このスピナー
フラスコの上部空間に５％ ＣＯ2、２５％ Ｏ2、７０
％ Ｎ2が連続的に通気するように、０．２ミクロン孔
フィルター（Gelman sciences,Ann Arbor,MI）を装着し
た。３７℃、５０ｒｐｍで撹拌した。細胞密度が１〜
１．５ｘ１０6細胞／ｍｌに達したときに、この５ｌ細
胞懸濁液を、滅菌３６ｌバイオテックオーバーヘッドド
ライブシステム（BiotechOverhead Drive System,Bellc
o）中の培地（３７℃）約３６ｌ中に入れた。７０％
Ｎ2、２５％ Ｏ2、５％ ＣＯ2を滅菌通気フィルター
を通してこの培養物に散布した。側面排出口の１つにパ
スツールピペットを装着し、ガス流量を５〜１０泡／秒
に設定した。この培養物を６〜７ｒｐｍで撹拌し、３７
℃でインキュベートした。毎日細胞数を計測し、細胞密
度が約１ｘ１０6細胞／ｍｌに達したとき、この培養物
に１００％ Ｏ2を極めてゆっくりした速度で散布し
た。
【００３６】培養が２〜３ｘ１０6細胞／ｍｌに達した
とき、この生育容器中の内容物を滅菌５０ｌカルボイ
（Nalgene,Rochester,NY）に移した。このカルボイに蓋
をして４℃で約４８時間保存することによって、細胞を
容器の底に沈降させた。以降の工程はすべて４℃で行
い、滅菌操作を必要としなかった。培地のほとんどをカ
ルボイの上部から吸引して捨て、５〜６ｌの細胞懸濁液
が残った。このカルボイを振盪して細胞をその培地中に
再懸濁させ、その細胞懸濁液を１ｌ遠心管（Nalgene）
６本に分注した。この遠心管をＩＥＣ遠心機（Damon/IE
C）中、２５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清
を捨て、細胞を１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、
２ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、２
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の溶液２ｌ中
で洗浄した。洗浄した細胞ペレットを合わせて、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、１００μＭ ロイペプチンの溶液（ｐＨ８）
中に１０8細胞／ｍｌ（約１０ｍｇ／ｍｌタンパク質）
の密度で再懸濁し、約５００ｍｌの細胞懸濁液、または
約５ｇの細胞タンパク質を得た。
とき、この生育容器中の内容物を滅菌５０ｌカルボイ
（Nalgene,Rochester,NY）に移した。このカルボイに蓋
をして４℃で約４８時間保存することによって、細胞を
容器の底に沈降させた。以降の工程はすべて４℃で行
い、滅菌操作を必要としなかった。培地のほとんどをカ
ルボイの上部から吸引して捨て、５〜６ｌの細胞懸濁液
が残った。このカルボイを振盪して細胞をその培地中に
再懸濁させ、その細胞懸濁液を１ｌ遠心管（Nalgene）
６本に分注した。この遠心管をＩＥＣ遠心機（Damon/IE
C）中、２５００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清
を捨て、細胞を１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、
２ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、２
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の溶液２ｌ中
で洗浄した。洗浄した細胞ペレットを合わせて、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、１００μＭ ロイペプチンの溶液（ｐＨ８）
中に１０8細胞／ｍｌ（約１０ｍｇ／ｍｌタンパク質）
の密度で再懸濁し、約５００ｍｌの細胞懸濁液、または
約５ｇの細胞タンパク質を得た。
【００３７】実施例２：ｃＰＬＡ２の精製 細胞にフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）お
よびペプスタチンＡをそれぞれ１ｍＭおよび１００μＭ
濃度（メタノール中にそれぞれ２００ｍＭおよび２０ｍ
Ｍの混合ストック溶液として調製したものを使用した）
になるように加えた後、これを前以て冷却したパール細
胞破壊ボンベ（Paar cell disruption bomb,Parr Inst
r.Co.,Moline,IL）に移し、これを６００ｐｓｉ窒素
下、４℃で磁石撹拌子を用いて２０分間混合し、加圧を
解除することによって細胞を溶解した。この細胞溶解液
を遠心分離（１５００００ｘｇ、６０分、４℃）し、得
られた上清を集めた。カラムクロマトグラフィーに先立
って、この細胞抽出物をまず綿布に通し、次いでミリパ
ック−４０フィルター（Millipak-40 filter,0.22μm,M
illipore,Bedford,MA）を通して、可変速ペリスタポン
プを用いて濾過した。
よびペプスタチンＡをそれぞれ１ｍＭおよび１００μＭ
濃度（メタノール中にそれぞれ２００ｍＭおよび２０ｍ
Ｍの混合ストック溶液として調製したものを使用した）
になるように加えた後、これを前以て冷却したパール細
胞破壊ボンベ（Paar cell disruption bomb,Parr Inst
r.Co.,Moline,IL）に移し、これを６００ｐｓｉ窒素
下、４℃で磁石撹拌子を用いて２０分間混合し、加圧を
解除することによって細胞を溶解した。この細胞溶解液
を遠心分離（１５００００ｘｇ、６０分、４℃）し、得
られた上清を集めた。カラムクロマトグラフィーに先立
って、この細胞抽出物をまず綿布に通し、次いでミリパ
ック−４０フィルター（Millipak-40 filter,0.22μm,M
illipore,Bedford,MA）を通して、可変速ペリスタポン
プを用いて濾過した。
【００３８】この細胞質ゾル分画（２〜３ｇタンパク
質）を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ２−ＭＥ、１
ｍＭ エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエ
ーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴ
Ａ）、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で前平衡
した３．２ｘ１４ｃｍファストフローセファロースＱ
（ファルマシア）（Fast Flow Sepharose Q (Pharmaci
a)）カラムに、６ｍｌ／分の流速で充填した。このカラ
ムを同緩衝液５００ｍｌで洗浄し、２ｍＭ ２−ＭＥ、
１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８）中の１５０ｍＭ ＮａＣｌから５００ｍＭ ＮａＣ
ｌへの１５００ｍｌの直線的塩濃度勾配によって溶出さ
せ、各１２ｍｌの分画を分取した。このカラム溶出液の
２８０ｎｍの吸光度（ＡＵＦ２．０）を監視し、各分画
の２μｌを用いてそのＰＬＡ2活性を検定した。ＰＬＡ2
は約３８０ｍＭ ＮａＣｌで、第４７〜５６分画（１２
０ｍｌ）に溶出した。これらの分画をまとめ、ＹＭ３０
膜を装着したアミコン（Amicon）限外濾過撹拌容器（st
irred cell）を用いて、２５ｍｌに濃縮した。
質）を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ２−ＭＥ、１
ｍＭ エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエ
ーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴ
Ａ）、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で前平衡
した３．２ｘ１４ｃｍファストフローセファロースＱ
（ファルマシア）（Fast Flow Sepharose Q (Pharmaci
a)）カラムに、６ｍｌ／分の流速で充填した。このカラ
ムを同緩衝液５００ｍｌで洗浄し、２ｍＭ ２−ＭＥ、
１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８）中の１５０ｍＭ ＮａＣｌから５００ｍＭ ＮａＣ
ｌへの１５００ｍｌの直線的塩濃度勾配によって溶出さ
せ、各１２ｍｌの分画を分取した。このカラム溶出液の
２８０ｎｍの吸光度（ＡＵＦ２．０）を監視し、各分画
の２μｌを用いてそのＰＬＡ2活性を検定した。ＰＬＡ2
は約３８０ｍＭ ＮａＣｌで、第４７〜５６分画（１２
０ｍｌ）に溶出した。これらの分画をまとめ、ＹＭ３０
膜を装着したアミコン（Amicon）限外濾過撹拌容器（st
irred cell）を用いて、２５ｍｌに濃縮した。
【００３９】上記のアニオン交換カラムを経て濃縮した
ピーク分画（１５０ｍｇタンパク質）を、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、２ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で前平衡したフェニル
−スーパーロースＨＲ１０／１０カラム（Phenyl-Super
ose HR 10/10column,Pharmacia）に流速１ｍｌ／分で充
填し、各４ｍｌの分画を分取した。同緩衝液１２０ｍｌ
でこのカラムを洗浄した後、カラム緩衝液１体積と溶出
緩衝液（５０％エチレングリコール、２ｍＭ ２−Ｍ
Ｅ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ８）１体積を用いて、流速０．７５ｍｌ／分で１２
０ｍｌの直線的勾配をかけた。このカラム溶出液の２８
０ｎｍの吸光度を監視し、各分画の２μｌを用いてその
ＰＬＡ2活性を検定した。ＰＬＡ2は１５〜４５％エチレ
ングリコールで、第３２〜５２分画（４０ｍｌ）に、幅
広いピークとして溶出した。これらの分画をまとめ、ま
ずＹＭ３０膜を装着したアミコン撹拌容器で濃縮した
後、セントリコン−３０微量濃縮器（Centricon-30 mic
roconcentrators,Amicon）を用いて＜１ｍｌに濃縮し、
これを１５体積の３０％エチレングリコール、２ｍＭ
２−ＭＥ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に再懸濁して、
再度２ｍｌに濃縮した。
ピーク分画（１５０ｍｇタンパク質）を、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、２ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で前平衡したフェニル
−スーパーロースＨＲ１０／１０カラム（Phenyl-Super
ose HR 10/10column,Pharmacia）に流速１ｍｌ／分で充
填し、各４ｍｌの分画を分取した。同緩衝液１２０ｍｌ
でこのカラムを洗浄した後、カラム緩衝液１体積と溶出
緩衝液（５０％エチレングリコール、２ｍＭ ２−Ｍ
Ｅ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ８）１体積を用いて、流速０．７５ｍｌ／分で１２
０ｍｌの直線的勾配をかけた。このカラム溶出液の２８
０ｎｍの吸光度を監視し、各分画の２μｌを用いてその
ＰＬＡ2活性を検定した。ＰＬＡ2は１５〜４５％エチレ
ングリコールで、第３２〜５２分画（４０ｍｌ）に、幅
広いピークとして溶出した。これらの分画をまとめ、ま
ずＹＭ３０膜を装着したアミコン撹拌容器で濃縮した
後、セントリコン−３０微量濃縮器（Centricon-30 mic
roconcentrators,Amicon）を用いて＜１ｍｌに濃縮し、
これを１５体積の３０％エチレングリコール、２ｍＭ
２−ＭＥ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に再懸濁して、
再度２ｍｌに濃縮した。
【００４０】上記の疎水相互作用カラムを経て濃縮した
ピーク分画を集めて（約５ｍｇタンパク質）、３０％エ
チレングリコール、２ｍＭ ２−ＭＥ、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８で前平衡した直列スーパーロース１２カラム
（各１．６ｘ５０ｃｍ）に、流速０．１５ｍｌ／分で充
填し、各１．５ｍｌの分画を分取した。このカラム溶出
液の２８０ｎｍの吸光度を監視し、各分画の２μｌを用
いてｃＰＬＡ2活性を検定した。この酵素活性は第３８
〜４７分画（１５ｍｌ）に溶出した。これらの分画を合
わせて、セントリコン−３０微量濃縮器（Amicon）を８
つ並列させて、＜６５０μｌに濃縮した。この濃縮試料
（１濃縮器あたり約８０μｌ）をそれぞれ２．５ｍｌの
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ Ｅ
ＧＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁
し（得られた溶液のエチレングリコール最終濃度は＜１
％）、再度約８０μｌに濃縮した後、これらをまとめて
最終体積＜６５０μｌにした。
ピーク分画を集めて（約５ｍｇタンパク質）、３０％エ
チレングリコール、２ｍＭ ２−ＭＥ、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８で前平衡した直列スーパーロース１２カラム
（各１．６ｘ５０ｃｍ）に、流速０．１５ｍｌ／分で充
填し、各１．５ｍｌの分画を分取した。このカラム溶出
液の２８０ｎｍの吸光度を監視し、各分画の２μｌを用
いてｃＰＬＡ2活性を検定した。この酵素活性は第３８
〜４７分画（１５ｍｌ）に溶出した。これらの分画を合
わせて、セントリコン−３０微量濃縮器（Amicon）を８
つ並列させて、＜６５０μｌに濃縮した。この濃縮試料
（１濃縮器あたり約８０μｌ）をそれぞれ２．５ｍｌの
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ Ｅ
ＧＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁
し（得られた溶液のエチレングリコール最終濃度は＜１
％）、再度約８０μｌに濃縮した後、これらをまとめて
最終体積＜６５０μｌにした。
【００４１】上記のゲル濾過カラムを経て濃縮した試料
（約１ｍｇタンパク質）を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２
ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８を用いて１ｍｌに希釈した。この試
料を、希釈に用いたものと同じ緩衝液で前平衡したフェ
ニル−セファロースＨＲ５／５（Pharmacia）に、流速
０．２５ｍｌ／分で充填し、各０．５ｍｌの分画を集め
た。同緩衝液８ｍｌでこのカラムを洗浄した後、カラム
緩衝液１体積と溶出緩衝液（５０％エチレングリコー
ル、２ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）１体積を用いて、１０ｍｌ
の直線的勾配を、０．２５ｍｌ／分の流速でかけた。前
述のように、溶出は、カラムを次の使用のために再度条
件化するために必要なだけである。このカラム溶出液の
２８０ｎｍの吸光度を監視し、各分画の２μｌを用いて
ｃＰＬＡ2活性を検定した。ｃＰＬＡ2活性は第７〜２０
分画（７ｍｌ）に認められた。これらの分画をまとめ、
まずセントリコン−３０微量濃縮器（Amicon）で濃縮
し、次いでウルトラフリー−ＭＣ１００００ＮＭＷＬフ
ィルターユニット（Ultrafree-MC 10,000 NMWL filter
unit,Millipore）を用いて約６０μｌに濃縮した。回収
されたタンパク質は約１００μｇであった。
（約１ｍｇタンパク質）を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２
ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８を用いて１ｍｌに希釈した。この試
料を、希釈に用いたものと同じ緩衝液で前平衡したフェ
ニル−セファロースＨＲ５／５（Pharmacia）に、流速
０．２５ｍｌ／分で充填し、各０．５ｍｌの分画を集め
た。同緩衝液８ｍｌでこのカラムを洗浄した後、カラム
緩衝液１体積と溶出緩衝液（５０％エチレングリコー
ル、２ｍＭ ２−ＭＥ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）１体積を用いて、１０ｍｌ
の直線的勾配を、０．２５ｍｌ／分の流速でかけた。前
述のように、溶出は、カラムを次の使用のために再度条
件化するために必要なだけである。このカラム溶出液の
２８０ｎｍの吸光度を監視し、各分画の２μｌを用いて
ｃＰＬＡ2活性を検定した。ｃＰＬＡ2活性は第７〜２０
分画（７ｍｌ）に認められた。これらの分画をまとめ、
まずセントリコン−３０微量濃縮器（Amicon）で濃縮
し、次いでウルトラフリー−ＭＣ１００００ＮＭＷＬフ
ィルターユニット（Ultrafree-MC 10,000 NMWL filter
unit,Millipore）を用いて約６０μｌに濃縮した。回収
されたタンパク質は約１００μｇであった。
【００４２】実施例３：ｃＰＬＡ２酵素活性検定 基質：１−パルミトイル−２−［１４Ｃ］−アラキドノ
イル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（［１４Ｃ］
ＰＣ、５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、NEN Research Products
から入手）およびｓｎ−１，２−ジオレオイルグリセロ
ール（ＤＧ、Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL）を
モル比２：１で含有する超音波処理したリポソーム、を
以下のように調製した。［１４Ｃ］ＰＣ（２０ｎｍｏ
ｌ、１ｘ１０6ｄｐｍ、１００μＣｉ／ｍｌ、トルエン
／エタノール溶液）およびＤＧ（１０ｎｍｏｌ、１００
μｇ／ｍｌ、クロロホルム溶液）を窒素下で乾燥した。
この脂質を、マイクロソンプローブ−ソニケーター（Mi
croson probe-sonicator,Heat-sysytems,Ultrasonics）
を用い、４℃で、４ｘ１５秒、４５秒休止の超音波処理
にかけることによって、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍ
Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５の検定緩衝液１ｍｌ中に分
散させた。ウシ血清アルブミン（本質的に脂肪酸非含
有、１００ｍｇ／ｍｌ水保存溶液、Sigma）を加えて最
終濃度４ｍｇ／ｍｌにした。ｃＰＬＡ2活性を検定する
試料を、リポソーム（ＤＧ ０．２５ｎｍｏｌを含む
［１４Ｃ］ＰＣ ０．５ｎｍｏｌ（５００００ｃｐ
ｍ））５０μｌと共に、１ｍＭ ＣａＣｌ2および１ｍ
Ｍ ２−ＭＥを含む検定緩衝液（総体積０．２ｍｌ）中
でインキュベートした。このインキュベーションを３７
℃で１５分間行い、ドールズ試薬（Dole's reagent：１
０μｇ／ｍｌステアリン酸を含有する２−プロパノール
／ヘプタン／０．５Ｍ 硫酸の４０／１０／１混合物）
２ｍｌを加えることによって停止させた。混合した後、
ヘプタン１．２ｍｌおよび水１ｍｌを加えた。この混合
物を簡単にボルテックスし、その上層を、ヘプタン２ｍ
ｌおよび使用前に１３０℃で活性化したバイオ−シル
（Bio-Sil,Bio-Rad Laboratories）１５０ｍｇの入った
チューブに移した。このチューブを完全にボルテックス
し、遠心分離（１０００ｘｇ、５分間）した。その上清
をシンチレーションバイアル中にデカントした。シンチ
レーションカクテル液（Ｒｅａｄｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ+、
Beckman）１０ｍｌを加えた後、パッカード液体シンチ
レーション計数器モデル１５００（Packard liquid sci
ntillation counter Model 1500）を用いて放射活性を
計数した。高放射活性計数値は酵素活性に相関する。
イル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（［１４Ｃ］
ＰＣ、５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、NEN Research Products
から入手）およびｓｎ−１，２−ジオレオイルグリセロ
ール（ＤＧ、Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL）を
モル比２：１で含有する超音波処理したリポソーム、を
以下のように調製した。［１４Ｃ］ＰＣ（２０ｎｍｏ
ｌ、１ｘ１０6ｄｐｍ、１００μＣｉ／ｍｌ、トルエン
／エタノール溶液）およびＤＧ（１０ｎｍｏｌ、１００
μｇ／ｍｌ、クロロホルム溶液）を窒素下で乾燥した。
この脂質を、マイクロソンプローブ−ソニケーター（Mi
croson probe-sonicator,Heat-sysytems,Ultrasonics）
を用い、４℃で、４ｘ１５秒、４５秒休止の超音波処理
にかけることによって、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍ
Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５の検定緩衝液１ｍｌ中に分
散させた。ウシ血清アルブミン（本質的に脂肪酸非含
有、１００ｍｇ／ｍｌ水保存溶液、Sigma）を加えて最
終濃度４ｍｇ／ｍｌにした。ｃＰＬＡ2活性を検定する
試料を、リポソーム（ＤＧ ０．２５ｎｍｏｌを含む
［１４Ｃ］ＰＣ ０．５ｎｍｏｌ（５００００ｃｐ
ｍ））５０μｌと共に、１ｍＭ ＣａＣｌ2および１ｍ
Ｍ ２−ＭＥを含む検定緩衝液（総体積０．２ｍｌ）中
でインキュベートした。このインキュベーションを３７
℃で１５分間行い、ドールズ試薬（Dole's reagent：１
０μｇ／ｍｌステアリン酸を含有する２−プロパノール
／ヘプタン／０．５Ｍ 硫酸の４０／１０／１混合物）
２ｍｌを加えることによって停止させた。混合した後、
ヘプタン１．２ｍｌおよび水１ｍｌを加えた。この混合
物を簡単にボルテックスし、その上層を、ヘプタン２ｍ
ｌおよび使用前に１３０℃で活性化したバイオ−シル
（Bio-Sil,Bio-Rad Laboratories）１５０ｍｇの入った
チューブに移した。このチューブを完全にボルテックス
し、遠心分離（１０００ｘｇ、５分間）した。その上清
をシンチレーションバイアル中にデカントした。シンチ
レーションカクテル液（Ｒｅａｄｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ+、
Beckman）１０ｍｌを加えた後、パッカード液体シンチ
レーション計数器モデル１５００（Packard liquid sci
ntillation counter Model 1500）を用いて放射活性を
計数した。高放射活性計数値は酵素活性に相関する。
【００４３】実施例４：抗ｃＰＬＡ2単クローン抗体の
調製 実施例１および２の教示にしたがって単離した細胞質ゾ
ルＰＬＡ2を、すべての免疫化および検定に使用した。
８週齢の雌のｂａｌｂ／ｃマウスを、フロンド完全アジ
ュバント中に乳化したｃＰＬＡ2 ８μｇで、腹腔内
（ｉ．ｐ．）に免疫化した。この動物に、フロンド不完
全アジュバント中の追加免疫８μｇ、８μｇ、４μｇ
を、３週間おきに腹腔内に与えた。融合の３日前に、最
後の追加免疫ｃＰＬＡ2 ９μｇをアジュバントなしで
腹腔内に行った。
調製 実施例１および２の教示にしたがって単離した細胞質ゾ
ルＰＬＡ2を、すべての免疫化および検定に使用した。
８週齢の雌のｂａｌｂ／ｃマウスを、フロンド完全アジ
ュバント中に乳化したｃＰＬＡ2 ８μｇで、腹腔内
（ｉ．ｐ．）に免疫化した。この動物に、フロンド不完
全アジュバント中の追加免疫８μｇ、８μｇ、４μｇ
を、３週間おきに腹腔内に与えた。融合の３日前に、最
後の追加免疫ｃＰＬＡ2 ９μｇをアジュバントなしで
腹腔内に行った。
【００４４】最後の追加免疫の３日後にこのｂａｌｂ／
ｃマウスを殺し、その脾臓を無菌的に摘出した。この脾
臓を、生育培地（ＧＭ：１０％胎生ウシ血清（Hyclone,
A-1111D）、ＨＥＰＥＳ（GIBCO,380-2400AJ）含有４５
％ＲＰＭＩ−１６４０、４５％ＨＬ−１（Ventrex,VBPG
001)）５ｍｌの入ったペトリ皿に入れた。平滑なプロー
ブ（探り針）を用いて脾臓細胞を器官からそいだ後、こ
れを総体積１０ｍｌのＧＭが入った１５ｍｌ試験管に移
した。細胞を２２℃で１時間保持した後、その懸濁細胞
を別の１５ｍｌ試験管に移した。この脾臓細胞試料を
０．８５％ＮＨ4Ｃｌに入れ、細胞数を計数した。次い
で、この細胞を約２００ｘｇで５分間遠心分離すること
によりペレット状にした後、これを新鮮なＧＭ５ｍｌに
懸濁した。
ｃマウスを殺し、その脾臓を無菌的に摘出した。この脾
臓を、生育培地（ＧＭ：１０％胎生ウシ血清（Hyclone,
A-1111D）、ＨＥＰＥＳ（GIBCO,380-2400AJ）含有４５
％ＲＰＭＩ−１６４０、４５％ＨＬ−１（Ventrex,VBPG
001)）５ｍｌの入ったペトリ皿に入れた。平滑なプロー
ブ（探り針）を用いて脾臓細胞を器官からそいだ後、こ
れを総体積１０ｍｌのＧＭが入った１５ｍｌ試験管に移
した。細胞を２２℃で１時間保持した後、その懸濁細胞
を別の１５ｍｌ試験管に移した。この脾臓細胞試料を
０．８５％ＮＨ4Ｃｌに入れ、細胞数を計数した。次い
で、この細胞を約２００ｘｇで５分間遠心分離すること
によりペレット状にした後、これを新鮮なＧＭ５ｍｌに
懸濁した。
【００４５】ＨＬ−１TMフレンドリー骨髄腫６５３細胞
（Ventrex,VBPG007653）を、ｃＰＬＡ2反応性脾臓細胞
調製物の融合相手として使用した。使用前に、対数増殖
を確実にするために、この細胞をＧＭ中に維持した。細
胞数計測を行い、１９．７ｘ１０6細胞を遠心分離によ
ってペレット化し、これを新鮮なＧＭ５ｍｌ中に再懸濁
した。
（Ventrex,VBPG007653）を、ｃＰＬＡ2反応性脾臓細胞
調製物の融合相手として使用した。使用前に、対数増殖
を確実にするために、この細胞をＧＭ中に維持した。細
胞数計測を行い、１９．７ｘ１０6細胞を遠心分離によ
ってペレット化し、これを新鮮なＧＭ５ｍｌ中に再懸濁
した。
【００４６】ＧＭ５ｍｌ中の１９７ｘ１０6脾臓細胞を
１９．７ｘ１０6骨髄腫細胞と混合し、これを３７℃で
５分間インキュベートした。次いで遠心分離によってこ
の細胞をペレット化し、すべての液体を除去した。次
に、軽くたたいて細胞をほぐした。融合培地（ＨＥＰＥ
Ｓ含有ＲＰＭＩ−１６４０中の４３％ ＰＥＧ４０００
（ATCC））１．５ｍｌを３７℃で、１分間隔で加えた
後、これを１分間撹拌した。３７℃に加温したＨＥＰＥ
Ｓ含有ＲＰＭＩ−１６４０を、一定に撹拌しながら、約
１ｍｌ／分の速度で２分間添加し、次いで８ｍｌ／分で
１分間添加した。次いで遠心分離によってこの細胞をペ
レット化した。液体を吸引し、容器を軽くたたいてペレ
ットをほぐした。
１９．７ｘ１０6骨髄腫細胞と混合し、これを３７℃で
５分間インキュベートした。次いで遠心分離によってこ
の細胞をペレット化し、すべての液体を除去した。次
に、軽くたたいて細胞をほぐした。融合培地（ＨＥＰＥ
Ｓ含有ＲＰＭＩ−１６４０中の４３％ ＰＥＧ４０００
（ATCC））１．５ｍｌを３７℃で、１分間隔で加えた
後、これを１分間撹拌した。３７℃に加温したＨＥＰＥ
Ｓ含有ＲＰＭＩ−１６４０を、一定に撹拌しながら、約
１ｍｌ／分の速度で２分間添加し、次いで８ｍｌ／分で
１分間添加した。次いで遠心分離によってこの細胞をペ
レット化した。液体を吸引し、容器を軽くたたいてペレ
ットをほぐした。
【００４７】融合操作で得た細胞を、１０％ハイブリド
ーマ促進補足剤（hybridoma enhancing supplment;Sigm
a H8142）、２０％胎生ウシ血清（Hyclone)、３５％
ＲＰＭＩ−１６４０／ＨＥＰＥＳ（GIBCO）、３５％
ＨＬ−１（Ventrex）、１ｘＨＡＴ（Sigma：５ｍＭ ヒ
ポキサンチン、０．０２ｍＭアミノプテリン、０．８ｍ
Ｍ チミジンの溶液２００ｍｌ中に懸濁した。この細胞
を９６穴クラスター皿に１ウェルあたりに２００μｌ分
注し、これを５％ ＣＯ2雰囲気の湿潤化した３７℃イ
ンキュベーターに設置した。
ーマ促進補足剤（hybridoma enhancing supplment;Sigm
a H8142）、２０％胎生ウシ血清（Hyclone)、３５％
ＲＰＭＩ−１６４０／ＨＥＰＥＳ（GIBCO）、３５％
ＨＬ−１（Ventrex）、１ｘＨＡＴ（Sigma：５ｍＭ ヒ
ポキサンチン、０．０２ｍＭアミノプテリン、０．８ｍ
Ｍ チミジンの溶液２００ｍｌ中に懸濁した。この細胞
を９６穴クラスター皿に１ウェルあたりに２００μｌ分
注し、これを５％ ＣＯ2雰囲気の湿潤化した３７℃イ
ンキュベーターに設置した。
【００４８】実施例５：ＣＰＬＡ2ＥＬＩＳＡ−抗ｃＰ
ＬＡ2分泌ハイブリドーマの選択 顕微鏡的コロニーが見え始めた後（７〜１０日）、使用
済みの組織培養培地５０μｌを各培養から無菌的に取り
出し、ＥＬＩＳＡ法を用いてそのｃＰＬＡ2反応性を検
定した。ポリスチレン微量滴定プレートのウェルを、５
０μｇ／ｍｌＢＳＡ（Sigma）を添加した５００ｎｇ／
ｍｌ ｃＰＬＡ2／ＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．
４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）溶液１００μｌで被覆
し、４℃で終夜インキュベートすることにより、検定用
プレートを調製した。次に、このプレートを洗浄緩衝液
（ＷＢ：０．０５％ツヴィーン２０（Sigma）／ＴＢＳ
溶液）で１回洗浄した。次いで、このプレートをＴＢＳ
中の０．５％ミルク溶液で遮断した。各生育培養から得
た使用済みの培地５０μｌを１検定ウェルに添加し、こ
れを２２℃で１時間インキュベートした。次に、このプ
レートをＷＢで４回洗浄した。ペルオキシダーゼで標識
したヤギの抗マウスＩｇＧ、ガンマ鎖特異的（Sigma,A-
3673)（１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有ＴＢＳで１：５００
の希釈率で希釈したもの）５０μｌを各ウェルに添加
し、これを２２℃で１時間インキュベートした。次にこ
のプレートをＷＢで４回洗浄した。検定を進行させるた
めに、０．０１２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液
（ｐＨ５）中のＯＰＤ基質（Sigama,P-6912）５０μｌ
を添加した。２０分後、１Ｎ ＨＣｌ ５０μｌで反応
を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を９６穴読み取り機を
用いて測定した。融合後に接種した９６０穴の内、２培
養ウェルの使用済み培地がバックグラウンドより少なく
とも０．２大きい読みを与え、これらがｃＰＬＡ2反応
性の最初の検索において陽性であると考えた。これら２
つの親ハイブリドーマ培養と、それぞれに対応する抗体
を＃１３２ ＰＬ１２および＃１３２ ＰＣ３−１と命
名した。
ＬＡ2分泌ハイブリドーマの選択 顕微鏡的コロニーが見え始めた後（７〜１０日）、使用
済みの組織培養培地５０μｌを各培養から無菌的に取り
出し、ＥＬＩＳＡ法を用いてそのｃＰＬＡ2反応性を検
定した。ポリスチレン微量滴定プレートのウェルを、５
０μｇ／ｍｌＢＳＡ（Sigma）を添加した５００ｎｇ／
ｍｌ ｃＰＬＡ2／ＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．
４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）溶液１００μｌで被覆
し、４℃で終夜インキュベートすることにより、検定用
プレートを調製した。次に、このプレートを洗浄緩衝液
（ＷＢ：０．０５％ツヴィーン２０（Sigma）／ＴＢＳ
溶液）で１回洗浄した。次いで、このプレートをＴＢＳ
中の０．５％ミルク溶液で遮断した。各生育培養から得
た使用済みの培地５０μｌを１検定ウェルに添加し、こ
れを２２℃で１時間インキュベートした。次に、このプ
レートをＷＢで４回洗浄した。ペルオキシダーゼで標識
したヤギの抗マウスＩｇＧ、ガンマ鎖特異的（Sigma,A-
3673)（１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有ＴＢＳで１：５００
の希釈率で希釈したもの）５０μｌを各ウェルに添加
し、これを２２℃で１時間インキュベートした。次にこ
のプレートをＷＢで４回洗浄した。検定を進行させるた
めに、０．０１２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液
（ｐＨ５）中のＯＰＤ基質（Sigama,P-6912）５０μｌ
を添加した。２０分後、１Ｎ ＨＣｌ ５０μｌで反応
を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を９６穴読み取り機を
用いて測定した。融合後に接種した９６０穴の内、２培
養ウェルの使用済み培地がバックグラウンドより少なく
とも０．２大きい読みを与え、これらがｃＰＬＡ2反応
性の最初の検索において陽性であると考えた。これら２
つの親ハイブリドーマ培養と、それぞれに対応する抗体
を＃１３２ ＰＬ１２および＃１３２ ＰＣ３−１と命
名した。
【００４９】実施例６：抗ｃＰＬＡ2抗血清の調製 ８週齢の雌のｂａｌｂ／ｃマウスに、実施例１および２
に記述したｃＰＬＡ2８μｇ（フロインド完全アジュバ
ント中に乳化したもの）を腹腔内投与した。この動物
に、フロインド不完全アジュバント中のそれぞれ８μ
ｇ、８μｇ、４μｇの追加免疫を、３週間おきに３回腹
腔内投与した。最後に９μｇの腹腔内注射をアジュバン
トなしで行った。数回採血し、そのｃＰＬＡ2反応性を
検定した。採血＃１３２−１は最初の免疫化の４週間後
に行い、採血＃１３２−Ｔは最初の免疫化の１２週間後
に行った。
に記述したｃＰＬＡ2８μｇ（フロインド完全アジュバ
ント中に乳化したもの）を腹腔内投与した。この動物
に、フロインド不完全アジュバント中のそれぞれ８μ
ｇ、８μｇ、４μｇの追加免疫を、３週間おきに３回腹
腔内投与した。最後に９μｇの腹腔内注射をアジュバン
トなしで行った。数回採血し、そのｃＰＬＡ2反応性を
検定した。採血＃１３２−１は最初の免疫化の４週間後
に行い、採血＃１３２−Ｔは最初の免疫化の１２週間後
に行った。
【００５０】採血した血液から血清を調製し、これをＥ
ＬＩＳＡ法でｃＰＬＡ2に対して滴定した。このＥＬＩ
ＳＡ法を実施例５に準じて行い、その結果を図１に要約
する。図１のグラフでは、免疫化したマウスの血清と対
照マウスの血清のｃＰＬＡ2反応性を比較している。こ
の３つの滴定曲線は、免疫化したマウスの血清がｃＰＬ
Ａ2に反応するポリクローン抗体を含んでおり、一方、
対照血清はこれを含まないという事実を、明確に示して
いる。
ＬＩＳＡ法でｃＰＬＡ2に対して滴定した。このＥＬＩ
ＳＡ法を実施例５に準じて行い、その結果を図１に要約
する。図１のグラフでは、免疫化したマウスの血清と対
照マウスの血清のｃＰＬＡ2反応性を比較している。こ
の３つの滴定曲線は、免疫化したマウスの血清がｃＰＬ
Ａ2に反応するポリクローン抗体を含んでおり、一方、
対照血清はこれを含まないという事実を、明確に示して
いる。
【００５１】実施例７：ｃＰＬＡ２酵素活性の免疫吸着 ハイブリドーマ＃１３２ ＰＬ１２、＃１３２ ＰＣ３
−１から得た使用済みの培地および抗血清＃１３２−Ｔ
を用いて、これらが既知のｃＰＬＡ2溶液からｃＰＬＡ2
活性を除去する能力を検定した。無関連の抗体を分泌す
るハイブリドーマを負対照（ネガティブコントロール）
として使用した。フルオロテック抗マウスＩｇＧビーズ
（Fluorotec anti-mouse IgG beads,Baxter-Pandex,Mun
delein,IL）を使って、使用済みハイブリドーマ培養培
地また血清４００μｌ中の抗体を固定化した。この混合
物を穏やかに振盪しながら２２℃で終夜インキュベート
した。次に遠心分離によってこのビーズをペレット化
し、液体を捨てた。次いでこのビーズを、１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡを含むＴＢＳ １ｍｌで洗浄することにより、
未結合の抗体を除去した。次に１．２５μｇ／ｍｌ（１
ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ中）のｃＰＬＡ2溶液１００μｌを
このペレットに加え、これを２２℃で４時間インキュベ
ートした。次にこのビーズをペレット化し、その液体の
ｃＰＬＡ2活性を、実施例３に準じて検定した。このビ
ーズをさらに洗浄することにより、未結合のｃＰＬＡ2
を除去した後、そのｃＰＬＡ2活性を検定した。
−１から得た使用済みの培地および抗血清＃１３２−Ｔ
を用いて、これらが既知のｃＰＬＡ2溶液からｃＰＬＡ2
活性を除去する能力を検定した。無関連の抗体を分泌す
るハイブリドーマを負対照（ネガティブコントロール）
として使用した。フルオロテック抗マウスＩｇＧビーズ
（Fluorotec anti-mouse IgG beads,Baxter-Pandex,Mun
delein,IL）を使って、使用済みハイブリドーマ培養培
地また血清４００μｌ中の抗体を固定化した。この混合
物を穏やかに振盪しながら２２℃で終夜インキュベート
した。次に遠心分離によってこのビーズをペレット化
し、液体を捨てた。次いでこのビーズを、１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡを含むＴＢＳ １ｍｌで洗浄することにより、
未結合の抗体を除去した。次に１．２５μｇ／ｍｌ（１
ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ中）のｃＰＬＡ2溶液１００μｌを
このペレットに加え、これを２２℃で４時間インキュベ
ートした。次にこのビーズをペレット化し、その液体の
ｃＰＬＡ2活性を、実施例３に準じて検定した。このビ
ーズをさらに洗浄することにより、未結合のｃＰＬＡ2
を除去した後、そのｃＰＬＡ2活性を検定した。
【００５２】図２はこの検定結果を示しており、両ｍａ
ｂと抗血清が共にｃＰＬＡ2酵素活性を既知の酵素溶液
から除去できることを明確に立証している。第１欄は負
対照；第２欄は抗血清＃１３２−Ｔ；第３欄はｍａｂ＃
１３２ ＰＬ１２；第４欄はｍａｂ＃１３２ ＰＣ３−
１である。ここで、酵素活性を減少させる能力がｍａｂ
＃１３２ ＰＣ３−１では低く、このことが、天然型の
ｃＰＬＡ2立体配座では容易に接近できないｃＰＬＡ2分
子上のエピトープにこの抗体が結合することを示唆して
いる、ということに注目すべきである。
ｂと抗血清が共にｃＰＬＡ2酵素活性を既知の酵素溶液
から除去できることを明確に立証している。第１欄は負
対照；第２欄は抗血清＃１３２−Ｔ；第３欄はｍａｂ＃
１３２ ＰＬ１２；第４欄はｍａｂ＃１３２ ＰＣ３−
１である。ここで、酵素活性を減少させる能力がｍａｂ
＃１３２ ＰＣ３−１では低く、このことが、天然型の
ｃＰＬＡ2立体配座では容易に接近できないｃＰＬＡ2分
子上のエピトープにこの抗体が結合することを示唆して
いる、ということに注目すべきである。
【００５３】したがって、両ｍａｂと抗血清が共にｃＰ
ＬＡ2酵素活性を既知の溶液から除去できるがゆえに、
これらがいずれもｃＰＬＡ2反応性であることが確認さ
れた。次にこの２種類のハイブリドーマ培養を限界希釈
によってサブクローニングし、ｃＰＬＡ2反応性を再検
定し、市販のキットを用いてサブアイソタイプに分類し
た。得られた単クローン抗体分泌ハイブリドーマを＃１
３２ ＰＬ１２ ＳＣ−Ｄ１および＃１３２ ＰＣ３−
１ ＳＣ−Ｅ８と命名した。各培養はｃＰＬＡ2に反応
するｍａｂを分泌する。ｍａｂ＃１３２ ＰＬ１２ Ｓ
Ｃ−Ｄ１はＩｇＧ1サブクラスに属し、ｍａｂ＃１３２
ＰＣ３−１ ＳＣ−Ｅ８はＩｇＧ2aサブクラスに属す
ることがわかった。
ＬＡ2酵素活性を既知の溶液から除去できるがゆえに、
これらがいずれもｃＰＬＡ2反応性であることが確認さ
れた。次にこの２種類のハイブリドーマ培養を限界希釈
によってサブクローニングし、ｃＰＬＡ2反応性を再検
定し、市販のキットを用いてサブアイソタイプに分類し
た。得られた単クローン抗体分泌ハイブリドーマを＃１
３２ ＰＬ１２ ＳＣ−Ｄ１および＃１３２ ＰＣ３−
１ ＳＣ−Ｅ８と命名した。各培養はｃＰＬＡ2に反応
するｍａｂを分泌する。ｍａｂ＃１３２ ＰＬ１２ Ｓ
Ｃ−Ｄ１はＩｇＧ1サブクラスに属し、ｍａｂ＃１３２
ＰＣ３−１ ＳＣ−Ｅ８はＩｇＧ2aサブクラスに属す
ることがわかった。
【００５４】実施例８：交差反応性分析 実施例５に記述した方法に準じてＥＬＩＳＡ法を実施
し、プロテインＡ精製した本発明の２種類のｍａｂおよ
び抗血清が、よく知られており、低分子量で、分泌型の
２種類のＰＬＡ2との交差反応するか否かを決定した。
３種類の検定ウェルを調製した。それぞれの検定ウェル
は、異なった型のＰＬＡ2を含有している。このＥＬＩ
ＳＡ法で目標分子（ターゲット）として使用した３種類
のＰＬＡ2は、実施例１および２に記述したｃＰＬＡ2、
リュウマチ様関節炎滑液から単離した分泌型滑液ＰＬＡ
2（ｓＰＬＡ2：Kramer等,J.Biological Chem.264,5768
(1989)）、並びに、コブラ（Naja naja）毒から単離さ
れたＰＬＡ2（Sigma）である。
し、プロテインＡ精製した本発明の２種類のｍａｂおよ
び抗血清が、よく知られており、低分子量で、分泌型の
２種類のＰＬＡ2との交差反応するか否かを決定した。
３種類の検定ウェルを調製した。それぞれの検定ウェル
は、異なった型のＰＬＡ2を含有している。このＥＬＩ
ＳＡ法で目標分子（ターゲット）として使用した３種類
のＰＬＡ2は、実施例１および２に記述したｃＰＬＡ2、
リュウマチ様関節炎滑液から単離した分泌型滑液ＰＬＡ
2（ｓＰＬＡ2：Kramer等,J.Biological Chem.264,5768
(1989)）、並びに、コブラ（Naja naja）毒から単離さ
れたＰＬＡ2（Sigma）である。
【００５５】試験した抗体は、実施例６および７に記述
したｍａｂ＃１３２ ＰＬ１２ ＳＣ−Ｄ１および＃１
３２ ＰＣ３−１ ＳＣ−Ｅ８、並びに、実施例６に記
述した抗血清＃１３２−１である。本実験で使用した対
照抗体は、ｓＰＬＡ2に対して生じさせ、プロテインＡ
精製したｍａｂ＃１２９ Ｃ２および＃１２９ Ｄ３、
並びに、抗血清＃１２８−Ｔである。各試料を、滴定に
よって予め決定しておいた最大結合濃度で試験した。
したｍａｂ＃１３２ ＰＬ１２ ＳＣ−Ｄ１および＃１
３２ ＰＣ３−１ ＳＣ−Ｅ８、並びに、実施例６に記
述した抗血清＃１３２−１である。本実験で使用した対
照抗体は、ｓＰＬＡ2に対して生じさせ、プロテインＡ
精製したｍａｂ＃１２９ Ｃ２および＃１２９ Ｄ３、
並びに、抗血清＃１２８−Ｔである。各試料を、滴定に
よって予め決定しておいた最大結合濃度で試験した。
【００５６】このＥＬＩＳＡ法を二連で実施し、その結
果を表１に要約した。表１に列挙した値は各検定ウェル
について得られた吸光度の読みの平均値である。
果を表１に要約した。表１に列挙した値は各検定ウェル
について得られた吸光度の読みの平均値である。
【表１】 試料番号 目標分子 ｃＰＬＡ２ ｓＰＬＡ２ Ｎａｊａ 132-1 (1:2000希釈) 0.791 0.054 0.053 132 PL12 SC-D1 (8μg/ml) 0.579 0.010 0.008 132 PC3-1 SC-E8 (2.6μg/ml) 0.975 0.017 0.013 128-T (1:2000希釈) 0.021 0.638 0.014 129 C2 (21μg/ml) 0.025 0.336 0.017 129 D3 (3μg/ml) 0.022 0.564 0.017
【００５７】表１は、本発明の抗体が、単クローン抗体
およびポリクローン抗体のどちらも、ｃＰＬＡ2と特異
的に反応し、２種類の低分子量型ＰＬＡ2とは交差反応
しないことを立証している。
およびポリクローン抗体のどちらも、ｃＰＬＡ2と特異
的に反応し、２種類の低分子量型ＰＬＡ2とは交差反応
しないことを立証している。
【００５８】実施例９：免疫アフィニティー（親和性）
クロマトグラフィー イムノピュアRＡｇ／Ａｂイモビライゼーションキット
＃３（ImmunoPureR Ag/Ab Immobilization Kit #3）を
ピアス（Pierce,P.O.Box 117,Rockford,IL 61105）から
購入した。このキットには、抗体アフィニティーカラム
を製造するための試薬が、抗ｃＰＬＡ2単クローン抗体
を除いて、すべて含まれている。プロテインＡ精製した
抗体＃１３２ ＰＬ１２ ＳＣ−Ｄ１ ０．８ｍｇ上の
炭水化物部分を過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化し
た。次に、酸化した抗体を上記のキット中のアガロース
ビーズと反応させた。２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ）（最
終ＯＤを最初のＯＤで割って１００倍する）により、８
０％結合アフィニティーが測定された。この免疫アフィ
ニティービーズの約半分を１ｍｌカラムに注ぎ、これを
緩衝液Ａ（１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ２−ＭＥ）約１０ｍｌで平衡化
した。
クロマトグラフィー イムノピュアRＡｇ／Ａｂイモビライゼーションキット
＃３（ImmunoPureR Ag/Ab Immobilization Kit #3）を
ピアス（Pierce,P.O.Box 117,Rockford,IL 61105）から
購入した。このキットには、抗体アフィニティーカラム
を製造するための試薬が、抗ｃＰＬＡ2単クローン抗体
を除いて、すべて含まれている。プロテインＡ精製した
抗体＃１３２ ＰＬ１２ ＳＣ−Ｄ１ ０．８ｍｇ上の
炭水化物部分を過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化し
た。次に、酸化した抗体を上記のキット中のアガロース
ビーズと反応させた。２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ）（最
終ＯＤを最初のＯＤで割って１００倍する）により、８
０％結合アフィニティーが測定された。この免疫アフィ
ニティービーズの約半分を１ｍｌカラムに注ぎ、これを
緩衝液Ａ（１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ２−ＭＥ）約１０ｍｌで平衡化
した。
【００５９】実施例２Ａに記述したＵ９３７の高速上清
（high-speed supernatant）約６ｍｌを、上述の免疫ア
フィニティーカラムに０．０５ｍｌ／分の流速で室温
（４℃が好ましい）で充填した。その後、このカラムを
緩衝液Ａ約４ｍｌで洗浄した。結合したｃＰＬＡ2を、
１００％緩衝液Ａから始めて、１００％緩衝液Ｂ（１ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０４ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．
４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ２−ＭＥ、２．
０ＭＭｇＣｌ2）で終わる１００分間の直線的勾配
（０．２ｍｌ／分）を用いて溶出させた。各約２ｍｌの
分画を分取し、５つのグループにわけて、その酵素活性
を実施例３に準じて検定した。
（high-speed supernatant）約６ｍｌを、上述の免疫ア
フィニティーカラムに０．０５ｍｌ／分の流速で室温
（４℃が好ましい）で充填した。その後、このカラムを
緩衝液Ａ約４ｍｌで洗浄した。結合したｃＰＬＡ2を、
１００％緩衝液Ａから始めて、１００％緩衝液Ｂ（１ｍ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．０４ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．
４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ２−ＭＥ、２．
０ＭＭｇＣｌ2）で終わる１００分間の直線的勾配
（０．２ｍｌ／分）を用いて溶出させた。各約２ｍｌの
分画を分取し、５つのグループにわけて、その酵素活性
を実施例３に準じて検定した。
【００６０】ｃＰＬＡ2は極めて希少な酵素であるの
で、免疫アフィニティー精製によって微量しか回収され
なかった。この溶出液中の酵素活性を検出するために
は、溶出緩衝液中に担体タンパク質としてＢＳＡを加え
る必要があった。大量の酵素を精製する場合には、外来
の担体タンパク質を精製したばかりのｃＰＬＡ2に添加
することが望ましくないことを、当業者は認識するであ
ろう。
で、免疫アフィニティー精製によって微量しか回収され
なかった。この溶出液中の酵素活性を検出するために
は、溶出緩衝液中に担体タンパク質としてＢＳＡを加え
る必要があった。大量の酵素を精製する場合には、外来
の担体タンパク質を精製したばかりのｃＰＬＡ2に添加
することが望ましくないことを、当業者は認識するであ
ろう。
【００６１】表２に、免疫アフィニティー精製の結果を
記載する。最終結果は最右欄に示されており、予備精製
した試料に対する酵素活性の率（％）として表現されて
いる。出発試料中に認められる全ｃＰＬＡ2活性の８０
％以上がこのカラムに吸着し、活性酵素として回収され
た。
記載する。最終結果は最右欄に示されており、予備精製
した試料に対する酵素活性の率（％）として表現されて
いる。出発試料中に認められる全ｃＰＬＡ2活性の８０
％以上がこのカラムに吸着し、活性酵素として回収され
た。
【表２】 分画番号 体積 試料体積あたり 総計数値 回収率 (ml) の計数値 (%) 充填試料 6.0 3575/ 1μl 21.5E6 100.0 通過 12.5 2303/20μl 1.44E6 6.7 １〜３ 6.0 2184/20μl 0.65E6 3.0 ４〜６ 6.0 1536/ 2μl 4.61E6 21.4 ７〜９ 6.0 3918/ 2μl 11.75E6 54.7 １０〜１２ 6.0 2027/20μl 0.61E6 2.8
【００６２】実施例１０：ウエスタンブロット分析 実施例２で記述したように精製したｃＰＬＡ2約８０ｎ
ｇを、８〜１６％ＳＤＳゲルの４レーンのそれぞれに充
填した。このゲルを２５ｍＡで、染料がゲルの下端に達
するまで泳動した。サートブロット（Sartblot,Sartori
us Filters,Inc.,30940 San Clemente St.,Hayward,CA
94544）装置とそれに与えられている操作法を用いて、
このゲル中のタンパク質をニトロセルロース（Novex,P.
O.Box 1158,Encintas,CA 92024）に転移させた。転移条
件は３０Ｖ一定電圧１．５時間であった。このブロット
の展開には、リンス緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐ
Ｈ７．５）、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１％ トリトンＸ−１００）を中心緩衝化
系（central buffering sysytem）として使用した。
ｇを、８〜１６％ＳＤＳゲルの４レーンのそれぞれに充
填した。このゲルを２５ｍＡで、染料がゲルの下端に達
するまで泳動した。サートブロット（Sartblot,Sartori
us Filters,Inc.,30940 San Clemente St.,Hayward,CA
94544）装置とそれに与えられている操作法を用いて、
このゲル中のタンパク質をニトロセルロース（Novex,P.
O.Box 1158,Encintas,CA 92024）に転移させた。転移条
件は３０Ｖ一定電圧１．５時間であった。このブロット
の展開には、リンス緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐ
Ｈ７．５）、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１％ トリトンＸ−１００）を中心緩衝化
系（central buffering sysytem）として使用した。
【００６３】タンパク質を含有するニトロセルロース
を、ＳＤＳゲルのレーンに対応する４切片に切断した。
各切片を個別に１次抗体溶液５ｍｌ中、４℃で終夜イン
キュベートした。この１次抗体溶液は、ｍａｂ＃１３２
ＰＣ３−１ ＳＣ−Ｅ８および＃１３２ ＰＬ−１２
ＳＣ−Ｄ１の使用済み生育培地とした。実施例６に記
述した抗血清１３２−Ｔを０．３％ ＢＳＡ／リンス緩
衝液で１：５００に希釈して、これを陽対照（ポジティ
ブコントロール）として使用し、また０．３％ＢＳＡ／
リンス緩衝液のみの溶液を負対照として使用した。次
に、各切片をリンス緩衝液中で各１０分間、４回洗浄し
た。次いでその切片を、Ｉ125−標識したヒツジ抗マウ
スＩｇ（Amersham Corp.,Arlington Heights,IL）の
１：２５０希釈液約３０ｍｌ中、室温で４時間インキュ
ベートした。最後にこの切片を前回と同様に４回洗浄
し、これをオートラドカセット（autorad cassette）中
のＸ線フィルムの下に、切断前の状態で隣合わせて並べ
た。このフィルムを−７０℃で１６時間、上記の切片に
暴露した後、取り出して現像した。
を、ＳＤＳゲルのレーンに対応する４切片に切断した。
各切片を個別に１次抗体溶液５ｍｌ中、４℃で終夜イン
キュベートした。この１次抗体溶液は、ｍａｂ＃１３２
ＰＣ３−１ ＳＣ−Ｅ８および＃１３２ ＰＬ−１２
ＳＣ−Ｄ１の使用済み生育培地とした。実施例６に記
述した抗血清１３２−Ｔを０．３％ ＢＳＡ／リンス緩
衝液で１：５００に希釈して、これを陽対照（ポジティ
ブコントロール）として使用し、また０．３％ＢＳＡ／
リンス緩衝液のみの溶液を負対照として使用した。次
に、各切片をリンス緩衝液中で各１０分間、４回洗浄し
た。次いでその切片を、Ｉ125−標識したヒツジ抗マウ
スＩｇ（Amersham Corp.,Arlington Heights,IL）の
１：２５０希釈液約３０ｍｌ中、室温で４時間インキュ
ベートした。最後にこの切片を前回と同様に４回洗浄
し、これをオートラドカセット（autorad cassette）中
のＸ線フィルムの下に、切断前の状態で隣合わせて並べ
た。このフィルムを−７０℃で１６時間、上記の切片に
暴露した後、取り出して現像した。
【００６４】図３は免疫ブロットの結果を表している。
第１レーンは負対照であり、第２レーンは陽対照：抗血
清＃１３２−Ｔである。第３レーンはｍａｂ＃１３２
ＰＬ１２ ＳＣ−Ｄ１であり、第４レーンはｍａｂ＃１
３２ ＰＣ３−１ＳＣ−Ｅ８である。第３レーンにはバ
ンドが認められず、このことは、ｍａｂ＃１３２ＰＬ１
２ ＳＣ−Ｄ１が変性状態にあるｃＰＬＡ2を結合でき
ないことを意味している、ということに注目すべきであ
る。
第１レーンは負対照であり、第２レーンは陽対照：抗血
清＃１３２−Ｔである。第３レーンはｍａｂ＃１３２
ＰＬ１２ ＳＣ−Ｄ１であり、第４レーンはｍａｂ＃１
３２ ＰＣ３−１ＳＣ−Ｅ８である。第３レーンにはバ
ンドが認められず、このことは、ｍａｂ＃１３２ＰＬ１
２ ＳＣ−Ｄ１が変性状態にあるｃＰＬＡ2を結合でき
ないことを意味している、ということに注目すべきであ
る。
【００６５】図２および図３を比較すると、ｍａｂ＃１
３２ ＰＬ１２ ＳＣ−Ｄ１が天然型立体配座のｃＰＬ
Ａ2を最もよく結合できることは明らかであり、このこ
とは、活性な天然型の状態にあるｃＰＬＡ2を精製する
ときにはこのｍａｂを使用することが好ましい、という
ことを示している。逆に、ｍａｂ＃１３２ ＰＣ３−１
ＳＣ−Ｅ８は、変性状態にあるｃＰＬＡ2を最もよく
結合できる。
３２ ＰＬ１２ ＳＣ−Ｄ１が天然型立体配座のｃＰＬ
Ａ2を最もよく結合できることは明らかであり、このこ
とは、活性な天然型の状態にあるｃＰＬＡ2を精製する
ときにはこのｍａｂを使用することが好ましい、という
ことを示している。逆に、ｍａｂ＃１３２ ＰＣ３−１
ＳＣ−Ｅ８は、変性状態にあるｃＰＬＡ2を最もよく
結合できる。
【００６６】ハイブリドーマ＃１３２ ＰＬ１２ ＳＣ
−Ｄ１（寄託者参照Ｉｄ．Ｚ−４８−５ＭＧ−６３）お
よびハイブリドーマ＃１３２ ＰＣ３−１−ＳＣ−Ｅ８
（寄託者参照Ｉｄ．Ｚ４８−５−ＭＧ−７０）はブタペ
スト条約に基づきＡＴＣＣに、それぞれ受託番号ＨＢ１
０５６３およびＨＢ１０５６４の下で寄託された。
−Ｄ１（寄託者参照Ｉｄ．Ｚ−４８−５ＭＧ−６３）お
よびハイブリドーマ＃１３２ ＰＣ３−１−ＳＣ−Ｅ８
（寄託者参照Ｉｄ．Ｚ４８−５−ＭＧ−７０）はブタペ
スト条約に基づきＡＴＣＣに、それぞれ受託番号ＨＢ１
０５６３およびＨＢ１０５６４の下で寄託された。
【図１】 免疫化したマウスおよび対照マウスから得た
血清のｃＰＬＡ2反応性を示す。図中の３つの滴定曲線
は、免疫化したマウスの血清がｃＰＬＡ2と反応するポ
リクローン抗体を含有しており、一方、対照血清はこれ
を含有しないことを明確に示している。
血清のｃＰＬＡ2反応性を示す。図中の３つの滴定曲線
は、免疫化したマウスの血清がｃＰＬＡ2と反応するポ
リクローン抗体を含有しており、一方、対照血清はこれ
を含有しないことを明確に示している。
【図２】 免疫吸着検定の結果を示す。これによって抗
ｃＰＬＡ2ｍａｂおよび抗血清が、ｃＰＬＡ2酵素活性を
含有する既知の溶液からｃＰＬＡ2酵素活性を除去し得
ることを明白に立証している。第１欄は負対照；第２欄
は抗血清＃１３２−Ｔ；第３欄はｍａｂ＃１３２ ＰＬ
１２；第４欄はｍａｂ＃１３２ ＰＣ３−１である。
ｃＰＬＡ2ｍａｂおよび抗血清が、ｃＰＬＡ2酵素活性を
含有する既知の溶液からｃＰＬＡ2酵素活性を除去し得
ることを明白に立証している。第１欄は負対照；第２欄
は抗血清＃１３２−Ｔ；第３欄はｍａｂ＃１３２ ＰＬ
１２；第４欄はｍａｂ＃１３２ ＰＣ３−１である。
【図３】 免疫ブロットの結果を示す。第１レーンは負
対照であり、第２レーンは陽対照；抗血清＃１３２−Ｔ
である。第３レーンはｍａｂ＃１３２ ＰＬ１２ＳＣ−
Ｄ１であり、第４レーンはｍａｂ＃１３２ ＰＣ３−１
ＳＣ−Ｅ８である。
対照であり、第２レーンは陽対照；抗血清＃１３２−Ｔ
である。第３レーンはｍａｂ＃１３２ ＰＬ１２ＳＣ−
Ｄ１であり、第４レーンはｍａｂ＃１３２ ＰＣ３−１
ＳＣ−Ｅ８である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジヨゼフ・ビンセント・マネツタ アメリカ合衆国46256インデイアナ州イン デイアナポリス、ノース・リチヤード・ア ベニユー8134番 (72)発明者 ジヨン・リチヤード・スポーツマン アメリカ合衆国46268インデイアナ州イン デイアナポリス、クレイバーン・ドライブ 4725番
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒト細胞質ゾルホスホリパーゼＡ2（ｃ
ＰＬＡ2）に対して特異的に結合する抗体。 - 【請求項２】 ＡＴＣＣに受託番号ＨＢ１０５６３の下
で寄託されているハイブリドーマ＃１３２ ＰＬ１２
ＳＣ−Ｄ１。 - 【請求項３】 請求項２のハイブリドーマが分泌する単
クローン抗体。 - 【請求項４】 ＡＴＣＣに受託番号ＨＢ１０５６４の下
で寄託されているハイブリドーマ＃１３２ ＰＣ３−１
ＳＣ−Ｅ８。 - 【請求項５】 請求項４のハイブリドーマが分泌する単
クローン抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66333591A | 1991-03-01 | 1991-03-01 | |
| US663335 | 1991-03-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0591894A true JPH0591894A (ja) | 1993-04-16 |
Family
ID=24661380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4043019A Pending JPH0591894A (ja) | 1991-03-01 | 1992-02-28 | ヒトの細胞質ゾルホスホリパーゼａ２と反応する抗体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0501779A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0591894A (ja) |
| CA (1) | CA2061738A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
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-
1992
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- 1992-02-28 JP JP4043019A patent/JPH0591894A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PROC.NATL.ACAD.SCI.USA,87=1990 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0501779A1 (en) | 1992-09-02 |
| CA2061738A1 (en) | 1992-09-02 |
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