CN114767859A - 靶向cPLA2在放射诱导的肺损伤防治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供靶向cPLA2在放射诱导的肺损伤防治中的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明揭示了放射诱导的cPLA2/AA‑ERK调控轴线可影响肺成纤维细胞的生长和活化，首次阐明了cPLA2/AA与RILF之间的密切联系，并对RILF发病的分子机制提供了新的视野。cPLA2是RILF的一个关键靶点，可用来开发有效的抗纤维化药物(如ATK)来减轻RILF、预防放射导致的肺损伤，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

靶向cPLA2在放射诱导的肺损伤防治中的应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及靶向cPLA2在放射诱导的肺损伤防治中的应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
放疗(RT)是一种重要的癌症治疗策略，大约50％的癌症患者在治疗过程中会接受至少一轮的放疗。然而，肺作为放射敏感器官，在胸部放射治疗过程中易受损伤。放射诱导的肺损伤(radio-induced lung injury,RILI)是电离放射(ionizing radiation,IR)引起的一种不良反应，其以肺部炎症为特征，包括放射诱导的肺炎和晚期放射诱导的肺纤维化(late radiation-induced lung fibrosis,RILF)两个阶段。急性肺炎是一种炎症反应，发生在放射后几周内，而RILF发生在几个月或几年之后，最终对肺功能造成永久性损害。在胸部放射治疗后，高达15％的患者发生肺炎和肺纤维化。RILI不仅会限制放疗剂量、影响放疗效果，还会降低患者的生活质量。虽然多项研究都在针对RILI和RILF努力探索，目前临床上仍没有有效的保护药物。目前迫切需要进一步阐明RILF的具体机制和有效干预药物
成纤维细胞的增殖和激活对肺纤维化的发展至关重要，可由多种因素促进，包括炎症细胞因子和生长因子。成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化是成纤维细胞激活和纤维化的关键过程，肌成纤维细胞可以通过促进细胞外基质蛋白(如胶原和纤维连接蛋白)的产生，增加肺实质的硬度和厚度，并可分泌金属蛋白酶组织抑制物(MMPs)。目前已知α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)上调是该转化的标志之一。有报道称，放射可增加肺组织和肺泡上皮细胞中α-SMA的表达，提示放射对α-SMA的表达和肌成纤维细胞的形成有显著影响。
花生四烯酸(AA)是一种ω-6多不饱和脂肪酸，可参与许多生物学过程，包括炎症反应。胞内AA被胞质磷脂酶A2(cPLA2)从细胞膜上水解为自由形态，并被各种酶进一步代谢。AA及其代谢产物是急性和慢性炎症的重要介质，研究表明AA与纤维化进展密切相关，如心脏纤维化和肝纤维化。Rutting等发现AA可通过上调肺间充质细胞中IL-6和CXCL8的释放来促进肺部炎症的发生。有研究表明，AA的增加可促进肺成纤维细胞迁移和分化，提示AA、成纤维细胞活化与肺纤维化关系密切。
cPLA2作为AA产生的关键酶，与多种因素(如病毒感染、通气、缺血再灌注、博来霉素)所致的肺损伤有关，然而，cPLA2/AA在RILF中的作用鲜有报道。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供靶向cPLA2在放射诱导的肺损伤防治中的应用。本发明通过研究揭示了放射诱导的cPLA2/AA-ERK调控轴线可影响肺成纤维细胞的生长和活化，首次阐明了cPLA2/AA与RILF之间的密切联系，并对RILF发病的分子机制提供了新的视野，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明的第一个方面，提供靶向抑制cPLA2表达的物质在如下a1)-a5)至少一种中的应用：
a1)减轻放射诱导的肺纤维化和/或制备减轻放射诱导的肺纤维化的产品；
a2)抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活和/或制备抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活的产品；
a3)抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化和/或制备抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化的产品；
a4)抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高和/或制备抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高的产品；
a5)预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病和和/或制备预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病的产品。
其中，所述靶向抑制cPLA2表达的物质可以为化合物或抗体，所述化合物可以为现有已知的cPLA2的抑制剂。在本发明的一个具体实施方式中，所述化合物可以为花生四烯酰三氟甲基酮(ATK)，所述抗体为抗cPLA2抗体(anti-cPLA2)。
本发明的第二个方面，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括靶向抑制cPLA2表达的物质。
本发明的第三个方面，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：
a1)减轻放射诱导的肺纤维化和/或制备减轻放射诱导的肺纤维化的产品；
a2)抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活和/或制备抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活的产品；
a3)抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化和/或制备抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化的产品；
a4)抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高和/或制备抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高的产品；
a5)预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病和和/或制备预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病的产品。
本发明的第四个方面，提供一种放射诱导的肺纤维化的预防和/或治疗方法，所述方法包括向受试者施用上述靶向抑制cPLA2表达的物质或组合物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案揭示了放射诱导的cPLA2/AA-ERK调控轴线可影响肺成纤维细胞的生长和活化，首次阐明了cPLA2/AA与RILF之间的密切联系，并对RILF发病的分子机制提供了新的视野。cPLA2是RILF的一个关键靶点，可用来开发有效的抗纤维化药物(如ATK)来减轻RILF、预防放射导致的肺损伤，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中ATK可明显减弱放射诱导的肺纤维化。(A)C57BL/6J小鼠接受剂量为15Gy的全胸放射，照射18周后进行CT扫描。小鼠分为对照组(CON)和放射组，放射组分别给予PBS组(IR)或ATK组(IR+ATK)。(B)小鼠肺部代表性CT图像(左)和小鼠标准化后的平均肺密度值(各6只)。(C-F)小鼠肺组织的H&E染色代表性照片(C)、马森染色代表性照片(D)、天狼星红染色代表性照片(E)及α-SMA免疫组化分析(F)。左侧为照片，右侧为定量结果。H&E、Masson、Sirius Red染色为200×，α-SMA免疫组化为400×。**p<0.01；***p<0.001。
图2为本发明实施例中放射促进肺成纤维细胞激活并提高cPLA2/AA水平。(A-B)放射后肺成纤维细胞的增殖检测，采用CCK-8(A)和细胞计数(B)。图中展示的是，照射后第五天，0Gy vs 3Gy,6Gy,9Gy的p值。(C-D)放射改变成纤维细胞α-sma表达(C)和迁移(D)。代表照片在左边，定量分析在右边。(E-F)采用SA-β-Gal检测放射对细胞衰老的影响(E)，采用流式检测放射对细胞凋亡检的影响(F)。(G-H)采用免疫荧光分析(G)和免疫印迹(H)检测放射对成纤维细胞cPLA2表达的影响。(I)采用ELISA检测放射后成纤维细胞上清中AA含量。图中展示的是，放射后72h,0Gy vs 3Gy、6Gy和9Gy的p值。(J)免疫组化检测CON组和IR组小鼠肺组织中cPLA2的表达(左为照片，右为定量)。(K)CON组和IR组小鼠肺组织中PDGFRA和cPLA2的共定位。Transwell试验为100×，细胞免疫荧光分析为200×，cPLA2免疫组化和肺组织免疫荧光为400×。图F中,Nec代表细胞坏死；Apo代表细胞凋亡。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns,没有意义。A-I的实验使用MRC5细胞株。
图3为本发明实施例中AA可调控肺成纤维细胞表型。(A-B)AA对成纤维细胞生长的影响，采用CCK-8(A)和细胞计数(B)检测。图中展示的是，刺激后第五天，CON组vs AA-0.5μM，-1.0μM，-2.0μM和-3.0μM的p值。(C-D)AA调节αsma表达(C)和成纤维细胞的迁移(D)。代表照片在左边，定量在右边。Transwell分析100×，免疫荧光分析200×。***p<0.001；ns,没有意义。以上实验均使用MRC5细胞株。
图4为本发明实施例中cPLA2/AA介导放射对肺成纤维细胞的激活。(A)IR和IR+ATK处理的成纤维细胞及对照细胞上清液中AA浓度。(B)CON组、IR组和IR+ATK在小鼠血清AA水平检测(n＝6)。(C-E)IR和IR+ATK组成纤维细胞的增殖，以及AA挽救的IR+ATK组细胞增殖检测，C为CCK-8，E为细胞计数。D是C图中第五天数据的展示。C和E中展示的是CON vs.IR,IRvs.IR+ATK,IR+ATK vs.IR+ATK+AA的p值。(F-G)IR、IR+ATK、IR+ATK+AA及对照组中成纤维细胞的α-SMA表达(F)和迁移能力(G)。Transwell分析100×，免疫荧光分析200×。**p<0.01；***p<0.001。以上实验均以MRC5细胞株为基础。
图5为本发明实施例中验证ERK是IR-AA的下游靶点。(A)AA对肺成纤维细胞t-ERK、p-ERK、cyclinD1和CDK6蛋白水平的影响。(B-D)AA刺激后和用U0126挽救AA刺激后的成纤维细胞增殖检测，采用CCK-8(B)和细胞计数(D)。C显示的是B中第五天的数据。B和D中展示的是CON vs.AA以及AA vs.AA+U0126的p值。(E-G)CON、IR、IR+ATK、IR+ATK+AA和CON+ATK组成纤维细胞中t-ERK,p-ERK,cyclinD1和CDK6的蛋白水平。p-ERK和cyclinD1的免疫荧光为E和F，Western blotting结果为G中。(H-J)IR和IR+U0126组及其对照组中成纤维细胞增殖检测，采用CCK-8(H)和细胞计数(J)。I展示的是H中第五天的数据。H和J中展示的是CON vs.IR和IR vs.IR+U0126的p值。(K)CON,IR,IR+U0126和CON+U0126组成纤维细胞中t-ERK p-ERK,cyclinD1、CDK6蛋白水平。(L)采用免疫组化方法检测CON、IR和IR+ATK组小鼠肺组织中p-ERK蛋白水平。左边是代表性照片，右边是定量。免疫荧光分析200×，p-ERK免疫组化分析400×。**p<0.01；***p<0.001。A-K的实验均基于MRC5细胞株。
图6为本发明实施例中ERK介导IR-AA导致的α-SMA表达和细胞迁移能力增强。(A-B)AA/IR处理的成纤维细胞和u0126挽救的AA/IR处理的成纤维细胞中，α-SMA表达(A)和迁移(B)检测。(C)ATK改善放射诱导的肺纤维化概述示意图。ATK通过抑制放射诱导的cPLA2的增加来显著降低AA的产生，进而降低肺成纤维细胞中p-ERK、cyclinD1、CDK6和α-SMA的蛋白水平，从而抑制成纤维细胞的增殖、分化和迁移，改善放射诱导的肺纤维化。Transwell试验100×，免疫荧光试验200×。**p<0.01；***p<0.001。A-B的实验均基于MRC5细胞株。
图7为本发明实施例中放疗改变成纤维细胞中α-SMA表达(A)和迁移能力(B)，左侧为照片，右侧为定量。(C)采用SA-β-Gal检测放疗后细胞衰老情况。(D)放疗对于成纤维细胞中cPLA2表达的影响。Transwell为100×，免疫荧光为200×，衰老检测为400×。**p <0.01；***p < 0.001。A、B、D使用IMR90细胞下，C使用的是MRC5细胞系。
图8为本发明实施例中使用IMR90细胞系验证AA可调控肺成纤维细胞表型；其中，(A)AA对于成纤维细胞的增殖影响，采用CCK-8。图中展示的是第五天，CON组vs AA-0.5μM,-1.0μM,-2.0μM和-3.0μM组的p值。(B-C)AA调控成纤维细胞的α-SMA表达(B)和迁移(C)。左侧为照片，右侧为定量。Transwell为100×，免疫荧光为200×。**p<0.01；***p < 0.001。
图9为本发明实施例中IR,IR+ATK,IR+ATK+AA和对照组成纤维细胞中α-SMA表达(A)和迁移(B)。Transwell为100×，免疫荧光为200×。**p<0.01；***p<0.001。所有实验均使用IMR90细胞系。
图10为本发明实施例中采用免疫荧光检测CON组和AA组成纤维细胞中p-ERK水平(A)和cyclinD1水平(B)。左侧为照片，右侧为定量。(C)CON组和AA组成纤维细胞中t-ERK,p-ERK,cyclinD1和CDK6蛋白水平检测。免疫荧光为200×。***p<0.001。A-B使用MRC5，C使用IMR90细胞系。
图11为本发明实施例中放射对成纤维细胞中t-ERK,p-ERK,cyclinD1和CDK6蛋白水平的影响，使用MRC5细胞系(A)和IMR90细胞系(B)。
图12为本发明实施例中在CON,IR,IR+ATK,IR+ATK+AA和CON+ATK组IMR90细胞系中，t-ERK,p-ERK,cyclinD1和CDK6蛋白水平检测。
图13为本发明实施例中在CON,IR,IR+U0126和CON+U0126组IMR90细胞系中，t-ERK,p-ERK,cyclinD1和CDK6蛋白水平检测。
图14为本发明实施例中AA/IR处理的成纤维细胞和用U0126挽救的AA/IR处理的成纤维细胞中α-SMA表达(A)和迁移(B)。Transwell为100×，免疫荧光为200×。***p<0.001。所有实验均使用IMR90细胞系。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供靶向抑制cPLA2表达的物质在如下a1)-a5)至少一种中的应用：
a1)减轻放射诱导的肺纤维化和/或制备减轻放射诱导的肺纤维化的产品；
a2)抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活和/或制备抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活的产品；
a3)抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化和/或制备抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化的产品；
a4)抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高和/或制备抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高的产品；
a5)预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病和和/或制备预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病的产品。
其中，所述靶向抑制cPLA2表达的物质可以为化合物或抗体，所述化合物可以为现有已知的cPLA2的抑制剂。在本发明的一个具体实施方式中，所述化合物可以为花生四烯酰三氟甲基酮(ATK)，所述抗体为抗cPLA2抗体(anti-cPLA2)。
所述a1)中，减轻放射诱导的肺纤维化至少表现为：
抑制因放射导致的肺平均密度升高；
抑制因放射导致的肺组织中的胶原沉积；
抑制因放射导致的肺组织中α-SMA蛋白水平的升高。
所述a2)和a3)中，上述应用至少表现为：
抑制放射导致的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化；
抑制放射导致的肺成纤维细胞的细胞迁移。
所述a4)中，肺成纤维细胞中相关因子至少包括p-ERK、cyclinD1和CDK6。
所述a5)中，放射诱导的肺损伤相关疾病至少包括放射诱导的肺炎和放射诱导的肺纤维化。
本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可以供基础研究使用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少包括靶向抑制cPLA2表达的物质。
本发明的又一具体实施方式中，所述靶向抑制cPLA2表达的物质可以为化合物或抗体，所述化合物可以为现有已知的cPLA2的抑制剂。在本发明的一个具体实施方式中，所述化合物可以为花生四烯酰三氟甲基酮(ATK)，所述抗体为抗cPLA2抗体(anti-cPLA2)。
在本发明的又一具体实施方式中，所述组合物其活性成分包括花生四烯酰三氟甲基酮和MEK1/2抑制剂U0126，二者摩尔比控制为1～4:5～10，优选为2:5。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：
a1)减轻放射诱导的肺纤维化和/或制备减轻放射诱导的肺纤维化的产品；
a2)抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活和/或制备抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活的产品；
a3)抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化和/或制备抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化的产品；
a4)抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高和/或制备抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高的产品；
a5)预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病和和/或制备预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病的产品。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可以供基础研究使用。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、混悬剂、片剂、胶囊剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等，还可以是外用剂，如栓剂以及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种放射诱导的肺纤维化的预防和/或治疗方法，所述方法包括向受试者施用上述靶向抑制cPLA2表达的物质或组合物。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
方法和材料
细胞培养
MRC5和IMR90肺成纤维细胞取自中国型培养保藏中心(中国武汉)。用MEM(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)添加10％胎牛血清(FBS,Gibco，巴西)+青霉素G和链霉素(Solarbio，北京，中国)(100U/ml)培养细胞。支原体使用PCR检测。
放射和AA相关体外实验
将MRC5和IMR90细胞植入孔中，细胞粘附后，在齐鲁医院肿瘤中心用6Mv X射线(Clinac-23-EX,Varian,USA)进行照射。剂量率为4.0Gy/min，使用圆柱形电离室进行剂量测定。滤料OFE Cu品位为101，密度为8.92g/cm3.初始剂量分别为3、6和9Gy，最终选择6Gy作为后续体外实验的放射剂量。同样，增殖试验中先用0.5、1.0、2.0和3.0μM AA刺激细胞，1.0μM AA浓度作为后续研究的浓度。在AA相关实验和分析中，培养基中不含FBS，以避免FBS对结果的影响，并根据需要提前进行细胞饥饿。
细胞增殖实验
以3或5×103的浓度将细胞接种到96孔板中，分别进行放射、AA、ATK(4μM)、U0126(10μM)和相应对照处理。然后，每天进行Cell Counting Kit-8(CCK-8,biuss,Beijing,China)检测和人工计数，测定细胞生长，并绘制生长曲线。使用分光光度计(Tecan,
Figure BDA0003590093950000091
瑞士)测量CCK-8在450nm处的吸光度。
细胞迁移试验
含细胞(6或8×104)的200μl无血清MEM注入24孔Transwell系统(美国纽约康宁公司)的上室，800μl的含20％胎牛血清的MEM注入下室。上室细胞提前按前述方法处理48～72h。26h后，用结晶紫溶液(0.1％)对迁移的细胞进行染色，并在100×显微镜下人工计数(Olympus,Tokyo,Japan)。
衰老相关β-半乳糖苷酶检测(SA-β-gal)
使用衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Beyotime，上海，中国)检测MRC5细胞中SA-β-gal活性。将细胞接种到6孔板中，进行不同剂量照射，并在照射后24、48或72h收集细胞。细胞在无CO2条件下，染色过夜。显微镜下计数胞浆蓝色的阳性细胞。
细胞凋亡检测
MRC5细胞凋亡检测采用Annexin V-APC凋亡试剂盒(BestBio,Suzhou,China)。简要步骤为：在照射后的不同时间，收集细胞并使用冷PBS清洗；然后将细胞与Annexin V-APC和碘化丙啶(PI)孵育15-20分钟。采用流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)分析细胞凋亡情况。
试剂和抗体
AA和ATK购自Cayman Chemical(Ann Arbor,USA)。一抗包括；anti-cPLA2购自Bioworld Technology(Nanjing,China)；抗α-sma、抗p-ERK、抗t-ERK、抗cyclinD1购自HUABIO(Hangzhou,China)；anti-PDGFRA购自Abcam(Waltham,USA)；抗β-肌动蛋白购自ZSGB-BIO(中国北京)。山羊抗兔和山羊抗鼠二抗购自ZSGB-BIO(北京，中国)，Alexa Fluor488偶联和DyLight 594偶联二抗购自GeneCopoeia(Rockville,MD,USA)。
蛋白印迹法(WB)
用含有1mM PMSF的RIPA缓冲液(Solarbio,Beijing,China)冰上裂解细胞，然后用超声波匀浆。使用BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime，上海，中国)测定蛋白浓度。裂解液与上样缓冲液(Beyotime，上海，中国)混合，并在95℃加热10分钟。蛋白样品进行电泳并转膜。用5％的牛奶封膜，与一抗在4℃孵育过夜。然后用TBST洗膜，在室温下用二抗孵育1小时，通过放射自显影观察。抗体稀释浓度为：anti-cPLA2 1:1000,anti-p-ERK 1:1000,anti-t-ERK1:1000,anti-cyclinD1 1:1000,anti-β-actin 1:2000，二抗1:5000。
免疫荧光(IF)
细胞按前述进行不同处理，甲醇固定20分钟，用含0.2％Triton X-100(Solarbio，北京，中国)的磷酸盐缓冲液(PBS)处理20分钟，然后在室温下用5％山羊血清(ZSGB-BIO)封闭1小时。然后，将细胞与抗cPLA2(1:200)、抗p-ERK(1:200)、抗cyclinD1(1:200)和抗-α-SMA(1:200)等一抗在4℃下孵育一夜，然后与Alexa Fluor 488偶联的绿色荧光二抗(1:2000)在室温下孵育1h。使用DAPI对细胞核进行染色(Solarbio,Beijing,China)，并在200×荧光显微镜下(Olympus,Tokyo,Japan)拍照。
用福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肺组织切片进行免疫荧光检测血小板源性生长因子受体α(PDGFRA)和cPLA2的共定位。切片脱蜡后再水化，进行热抗原修复，5％山羊血清阻断，一抗(兔抗cPLA2抗体1:100，鼠抗PDGFRA抗体1:200)4℃孵育过夜。次日用山羊抗兔Alexa Fluor 488偶联和山羊抗小鼠DyLight594偶联二抗进行免疫荧光。DAPI标记细胞核。使用400×荧光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)采集图像。
动物模型和治疗方法
C57BL/6J雌性小鼠(4周龄)购自中国北京维通利华实验动物科技公司，饲养于二级生物安全实验室。小鼠置于标准条件下，湿度55±10％，温度22±2℃，水和食物均经过消毒处理。在齐鲁医院肿瘤中心麻醉条件下，小鼠接受6MV全胸X射线照射(Clinac-23-EX,Varian，美国)，累积剂量为15Gy。剂量率为4.0Gy/min，使用圆柱形电离室进行剂量测定。滤料OFE Cu品位为101，密度为8.92g/cm3.放疗前，小鼠随机分为3组:放疗组(IR)、药物组(IR+ATK)(10mg/kg，灌胃，qd)、对照组(CON)(每组n＝6)。由于ATK用PBS稀释，IR组和CON组小鼠均给予PBS处理。照射18周后，对小鼠进行CT扫描，然后处死小鼠。收集血清，-80℃保存，用福尔马林固定肺组织，以备后续实验。动物实验由山东大学动物伦理委员会批准。
组织学分析
小鼠肺组织切片进行苏木精-伊红(H&E)染色、组织病理学分析。为评估肺纤维化水平，本研究使用经典的Ashcroft评分系统来进行小鼠评分。然后，使用Ashcroft评分分析肺组织纤维化情况。使用Masson三色染色和天狼星红染色评估胶原沉积，使用ImageJ软件分析胶原沉积的严重程度。
免疫组织化学(IHC)
小鼠肺组织用福尔马林固定，石蜡包埋，切片4mm。然后脱蜡水化，EDTA溶液热抗原修复。用3％的H2O2处理组织切片，用5％山羊血清(ZSGB-BIO)在室温下封闭60min，然后与一抗(抗cPLA2 1:100,抗p-ERK 1:100,抗α-SMA 1:200)在4℃下孵育过夜。采用辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗和DAB(ZSGB-BIO)进行免疫组化染色。采用ImageJ软件检测α-SMA的表达水平；cPLA2和p-ERK表达评分为人工评分。阳性成纤维细胞占总成纤维细胞的比例评分如下：0分，0-10％阳性细胞；1分，10～30％阳性细胞；2分，阳性细胞30～70％；3分，>70％阳性细胞。成纤维细胞染色强度评分为：0分，未染色；1分，弱染色；2分，中度染色；3分，强染色。最后得分是用染色强度分数乘以比例分数进行计算。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
小鼠血清和细胞上清中AA浓度的测定和计算采用ELISA。收集血清和细胞上清，在-80℃保存并尽快检测。
统计分析
采用GraphPad Prism 7.0进行数据分析。两组间的统计比较采用t检验。当有三组或更多组时，先进行ANOVA分析，对正态分布的数据根据不同的条件进行Dunnett’s或Bonferroni检验来校正p值，而对非正态分布的数据则进行Kruskal-Wallis ANOVA分析。p值<0.05认为有统计学意义。
结果
ATK明显减轻小鼠模型中放射诱导的肺纤维化
C57BL/6J小鼠接受一次照射，剂量为15gy，从而建立放射诱导的肺纤维化动物模型。放射后，每天给小鼠ATK或溶剂处理，18周后对小鼠进行CT扫描以评估肺密度(图1A)。放射后，IR组小鼠的平均肺密度最高(使用Hounsfield units(HU)进行量化)，而IR+ATK组小鼠的肺平均密度相对较低(p<0.001，图1B)。Ashcroft评分分析显示，IR组小鼠评分最高，ATK显著降低了放射后小鼠的Ashcroft评分，提示ATK减轻了放射引起的高纤维化水平(p<0.05，图1C)。
为评估肺纤维化程度，探讨ATK是否能预防放射所致慢性肺纤维化的发生，采用病理染色和免疫组化方法进行检测。Masson三色染色显示，IR小鼠的胶原沉积比CON小鼠增加了约5倍，ATK显著减少了肺组织中的胶原沉积(图1D)。天狼星红染色观察到相似的结果(图1E)。考虑到α-SMA表达是肌成纤维细胞形成和纤维化程度的标志，使用免疫组化检测小鼠肺组织中α-SMA的表达。结果发现，放疗显著增加α-SMA蛋白水平，ATK治疗可以降低α-SMA水平(图1F)。这些结果提示cPLA2在RILF中的重要性以及ATK可通过抑制cPLA2有效减轻RILF。
放射促进肺成纤维细胞激活并提高cPLA2/AA水平
为探讨放射对肺成纤维细胞活化的调节作用，我们在体外分析了放射后肺成纤维细胞表型改变及AA水平的变化。结果发现，放射对成纤维细胞的生长有抑制作用(图2A,2B)。放射在6Gy或9Gy剂量下，分别使MRC5的α-SMA表达水平上调5.9倍和6.2倍(p<0.001，图2C)，这提示放射可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。此外，放射也促进MRC5的迁移，且6或9Gy的放射比3Gy的放射作用更强(p均<0.001；图2D)。在IMR90细胞株中也观察到放射诱导的同样的表型改变(图7A,7B)。我们还检测了MRC5放疗后的衰老(图2E和图7C)和坏死/凋亡(图2F)。6gy照射后，衰老比例在24、48h无变化，在72h略有增加(12.3％增至17.7％)。9Gy照射后，衰老显著升高(图2E)。放疗后坏死改变不明显，而9Gy照射后细胞凋亡呈上升趋势(图2F)。
cPLA2的表达随着放射剂量的增加而显著增加，特别是在6和9Gy剂量下(图2G、2H和图7D)。同时，成纤维细胞上清中的AA浓度也随放射而显著增加；尤其在6gy照射后72h,AA浓度增加了4.6倍(p<0.001，图2I)，且这种增加不是由细胞生长引起的，因为IR抑制细胞增殖，如图2A和2B所示。6gy照射后，细胞在72h释放的AA最多(图2I)。虽然放射导致细胞凋亡呈上升趋势，但细胞凋亡比例相对较小、不能完全解释细胞上清中AA释放的显著增加(尤其是在6gy时)，这提示放射后AA释放增加主要是通过上调cPLA2引起的。放射对成纤维细胞中cPLA2蛋白水平的调节作用采用小鼠实验免疫组化进一步验证(图2J)。此外，我们在小鼠肺组织中对PDGFRA(成纤维细胞的标记物)和cPLA2进行共染色，并发现两种分子之间具有共定位(图2K)，表明放射主要刺激成纤维细胞中cPLA2的表达。综上，放射显著促进成纤维细胞的激活并提高cPLA2/AA水平。
AA可调控肺成纤维细胞表型
鉴于放射可以激活成纤维细胞，增强成纤维细胞中cPLA2的表达和AA的产生，我们继续研究AA是否可调节成纤维细胞的表型，包括增殖、分化和迁移。AA在0.5和1.0μM浓度下增强成纤维细胞的增殖能力，但在3.0μM浓度下抑制了成纤维细胞的生长(图3A、3B和图8A)。AA(1.0μM)使MRC5中α-SMA蛋白水平提高了4.6倍(p<0.001，图3C)，使IMR90中α-SMA蛋白水平提高了2.9倍(p<0.01，图8B)，表明成纤维细胞出现了向肌成纤维细胞的转化。AA(1.0μM)也能促进成纤维细胞的迁移。对于MRC5,AA处理组的迁移细胞数量是对照组的3倍(p<0.001；图3D)。IMR90也出现了同样的趋势(图8C)。这些结果提示，AA可以促进成纤维细胞的生长和表型转化，从而促进纤维化。
cPLA2/AA与放射和肺成纤维细胞活化有关
ATK是cPLA2的有效抑制剂，可降低AA的产生；因此，我们利用ATK和外源性AA进行挽救实验，以检验AA是否能介导放射对成纤维细胞表型改变的影响。结果显示，4.0μM ATK可减弱IR诱导的上清液中AA的增加(图4A)；这种效应在小鼠血清中得到验证(p均<0.001；图4B)。CCK-8增殖实验显示，IR+ATK处理的细胞增殖活性最低，而外源AA的补充可挽救细胞增殖(p<0.001，图4C)。照射后的细胞比未照射细胞对ATK的抑制作用更敏感，这表明由IR上调的cPLA2-AA通路可保护成纤维细胞免受IR诱导的生长抑制(图4D)。增殖实验结果采用细胞计数试验进一步验证(图4E)。ATK可逆转I R促进的α-SMA表达和细胞迁移，而AA可挽救ATK导致的α-SMA下调和迁移抑制(p均<0.01；图4F、4G和图9A、9B)。这些结果表明，放射诱导的肺成纤维细胞激活是由cPLA2/AA途径介导的。
ERK是IR-AA的下游靶点
考虑到IR-AA轴对成纤维细胞表型转化具有显著调控作用，寻找IR-AA的下游靶点十分重要。我们观察到AA处理后的细胞中p-ERK水平上调，cyclinD1和CDK6的表达也增加，而总ERK表达没有改变(图5A和图10A-C)。用MEK1/2抑制剂U0126阻断ERK磷酸化并进行挽救实验。在增殖实验中，AA促进细胞生长且U0126可明显减弱该促进作用，U0126的这种抑制作用在AA处理的细胞中更为明显，表明AA通过p-ERK发挥促进生长的作用(均p<0.001；图5B,5C)。这一结果在细胞计数实验中得到进一步验证(图5D)。
不同剂量(3gy、6gy和9gy)的放射均能上调MRC5和IMR90的p-ERK、cyclinD1和CDK6(图11A,11B)。如免疫荧光分析(图5E,5F)和Western blotting(图5G和图12)显示，ATK可以减弱放射导致的p-ERK、cyclinD1和CDK6水平的升高，且AA可挽救ATK诱导的这些蛋白水平的下降，总ERK表达量没有改变。生长实验表明IR+U0126组细胞的增殖显著慢于IR组细胞，且IR组细胞对U0126处理更加敏感，表明IR导致的p-ERK升高可削弱IR对细胞增殖的抑制作用(p<0.001,图5H,5I)。细胞计数检测也是同样趋势(图5J)。此外，U0126可抑制IR诱导的cyclinD1和CDK6上调，提示IR可通过调节p-ERK来影响cyclinD1和CDK6表达(图5K和图13)。体内实验进一步验证了IR和ATK对p-ERK水平的影响(图5L)。上述结果表明，IR-AA可以提高p-ERK水平以及cyclinD1和CDK6的表达，从而影响细胞生长。
ERK可介导IR-AA导致的α-SMA表达和细胞迁移改变
通常认为，ERK通路与增殖相关。为了观察p-ERK是否介导IR和AA调控的肺成纤维细胞α-SMA水平和迁移能力的改变，我们用U0126进行下一步实验。如前所述，IR和AA上调α-SMA表达，U0126可显著逆转IR和AA诱导的α-SMA表达升高(p<0.001，图6A和图14A)。此外，U0126还可逆转IR和AA导致的迁移能力增强(p均<0.01，图6B和图14B)。这些结果证明，p-ERK与成纤维细胞中α-SMA表达和迁移能力具有显著联系。
RILF是胸部放疗常见的晚期并发症，可导致呼吸困难，甚至严重的呼吸功能不全，影响生活质量。然而，目前仍缺乏有效的RILF干预药物，其发病机制仍未明晰，有待进一步探讨。在本研究中，体内实验结果显示，ATK可通过靶向抑制cPLA2显著减轻小鼠RILF，保护肺组织，表现为肺结构更加完整和胶原沉积减少。在体外实验中，我们发现IR上调了肺成纤维细胞中cPLA2的表达和AA的水平，从而增强了肺成纤维细胞中α-SMA的表达和迁移能力，且这种作用是通过p-ERK介导的。AA可促进成纤维细胞增殖，减轻IR造成的生长抑制，增加成纤维细胞/肌成纤维细胞数量，最终促进肺纤维化。综上，我们发现了RILF中IR-cPLA2/AA-ERK调控轴线，并证明用ATK靶向cPLA2是对RILF有效的保护性措施。
我们设计了多种实验，首次观察到IR显著上调成纤维细胞cPLA2蛋白的表达，促进肺成纤维细胞α-SMA的表达和迁移。此外，这一趋势可被ATK扭转。我们发现AA显著促进肺成纤维细胞的增殖、α-SMA表达和迁移，提示AA可以激活成纤维细胞，刺激肌成纤维细胞分化。我们还发现AA保护成纤维细胞免受IR造成的生长抑制，而ATK削弱了这种保护作用。这些发现揭示了ATK通过靶向cPLA2和降低AA水平来预防RILF的作用。我们的研究结果表明，IR后cPLA2/AA通路上调对成纤维细胞的生长和激活至关重要，cPLA2是RILF发病过程中的关键靶点。用ATK抑制cPLA2有利于IR发挥抑制成纤维细胞生长的作用，且ATK可阻断IR诱导的成纤维细胞激活，从而减轻RILF。
鉴于IR通过cPLA2/AA途径调控成纤维细胞表型，我们进一步探索了IR-AA可能的下游靶点，发现IR或AA处理后成纤维细胞中p-ERK、cyclinD1和CDK6显著增加。其他报道也提示AA及其代谢物可促进ERK通路激活，这与本研究结果一致。根据以往的研究，在成纤维细胞中，cyclinD1表达需要ERK的激活，且持续的ERK激活对cyclinD1表达和G1/S周期转化是必要的。在我们的研究中，cyclinD1和CDK6水平受p-ERK抑制剂的影响，提示cyclinD1和CDK6的表达可能受到p-ERK的调控。我们观察到放射促进衰老(特别是在9Gy)，而衰老可以抑制细胞周期；但我们的结果显示，放射后CDK6和cyclinD1增加，这可能是由于p-ERK通路的激活和其他非衰老细胞的代偿。但在本研究中，IR导致的衰老可能促进了放射对MRC5生长的抑制作用。因此，我们鉴定p-ERK为IR和AA的下游靶点，其通过增强cyclinD1和CDK6的表达来促进细胞增殖。有趣的是，我们观察到U0126逆转了IR和AA诱导的α-SMA表达和迁移的增强，提示p-ERK可介导IR和AA诱导的肺成纤维细胞活化。
综上，本研究揭示了放射诱导的cPLA2/AA-ERK调控轴线可影响肺成纤维细胞的生长和活化，首次阐明了cPLA2/AA与RILF之间的密切联系(图6C)，并对RILF发病的分子机制提供了新的视野。重要的是，cPLA2是RILF的一个关键靶点，可用来开发有效的抗纤维化药物(如ATK)来减轻RILF、预防放射导致的肺损伤。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.靶向抑制cPLA2表达的物质在如下a1)-a5)至少一种中的应用：
a1)减轻放射诱导的肺纤维化和/或制备减轻放射诱导的肺纤维化的产品；
a2)抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活和/或制备抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活的产品；
a3)抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化和/或制备抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化的产品；
a4)抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高和/或制备抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高的产品；
a5)预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病和和/或制备预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病的产品。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向抑制cPLA2表达的物质为化合物或抗体，所述化合物为现有已知的cPLA2的抑制剂；优选的，所述化合物为花生四烯酰三氟甲基酮，所述抗体为抗cPLA2抗体。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述a1)中，减轻放射诱导的肺纤维化至少表现为：
抑制因放射导致的肺平均密度升高；
抑制因放射导致的肺组织中的胶原沉积；
抑制因放射导致的肺组织中α-SMA蛋白水平的升高。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述a2)和a3)中，上述应用至少表现为：
抑制放射导致的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化；
抑制放射导致的肺成纤维细胞的细胞迁移。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述a4)中，肺成纤维细胞中相关因子至少包括p-ERK、cyclinD1和CDK6。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述a5)中，放射诱导的肺损伤相关疾病至少包括放射诱导的肺炎和放射诱导的肺纤维化。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为药物或者实验试剂，所述实验试剂供基础研究使用。
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物其活性成分至少包括靶向抑制cPLA2表达的物质；
所述靶向抑制cPLA2表达的物质为化合物或抗体，所述化合物为现有已知的cPLA2的抑制剂；优选的，所述化合物为花生四烯酰三氟甲基酮，所述抗体为抗cPLA2抗体。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物其活性成分包括花生四烯酰三氟甲基酮和MEK1/2抑制剂U0126，二者摩尔比控制为1～4:5～10，优选为2:5。
10.权利要求8或9所述的组合物在如下任意一种或多种中的应用：
a1)减轻放射诱导的肺纤维化和/或制备减轻放射诱导的肺纤维化的产品；
a2)抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活和/或制备抑制放射诱导的肺成纤维细胞激活的产品；
a3)抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化和/或制备抑制肺成纤维细胞的生长和表型转化的产品；
a4)抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高和/或制备抑制放射导致的肺成纤维细胞中相关因子表达水平的升高的产品；
a5)预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病和和/或制备预防和/或治疗放射诱导的肺损伤相关疾病的产品；
所述产品为药物或者实验试剂，所述实验试剂供基础研究使用。
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