JP3158106B2 - モノクローナル抗体及びその製造法 - Google Patents

モノクローナル抗体及びその製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本出願は１９８３年１１月２９日
に出願された米国出願第５５６，０１６号の一部継続出
願であり、よってその出願の内容は参照のために本出願
に組み入れられる。本発明は化学反応を触媒する（ｃａ
ｔａｌｙｚｅ）ためのモノクローナル抗体の使用に関す
る。モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞が産生す
る免疫グロブリンである。モノクローナル抗体は単一の
抗原決定基と反応し、従来の血清由来抗体に比べてより
優れた特異性を示す。また多数のモノクローナル抗体を
スクリーニングして、所望の特異性、結合活性（ａｖｉ
ｄｉｔｙ）およびイソタイプを有する個々の抗体を選択
することができる。ハイブリドーマ細胞系（ｃｅｌｌｌ
ｉｎｅ）は化学的に同一の抗体に対する恒存性の安価な
資源を提供し、そのような抗体の調製を容易に標準化し
うる。 【０００２】 【従来の技術】モノクローナル抗体を産生する方法は当
業者に周知である。例えばコプロウスキー，エッチ．
（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｈ）ら、１９８０年４月１日付
発行の米国特許第４，１９６，２６５号。 【０００３】モノクローナル抗体による抗原識別は免疫
グロブリン（Ｉｇ）分子のＮ−末端域における特異結合
部位に帰因する。Ｉｇ分子は、全てのタンパク−タクパ
ク相互作用に特有な同型の近距離力を介して抗原と反応
すると考えられている。抗原−抗体相互作用は、対応す
る抗原決定基即ちエピトープと抗体の結合部位とが相補
的な三次元形状を示すために極めて特異的である。前記
相補的形状により、分子が互いに近接して近づき実質的
な表面域上で相互作用が起こりうる。抗体−抗原相互作
用の特異性は、抗原決定基の立体配置の変化によって抗
体に対する抗原の結合定数（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓ
ｔａｎｔ）が著るしく低下するという事実から立証され
る。その抗原に対する抗体の結合定数は一般に、基質に
対する酵素の結合定数よりはるかに大きい。 【０００４】モノクローナル抗体の用途は知られてい
る。その１つが診断法に使用することである。例えばデ
ービッド，ジー．（Ｄａｖｉｄ，Ｇ．）およびグリー
ン，エッチ．（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｈ．），１９８３年３月
８日付発行米国特許第４，３７６，１１０号。 【０００５】モノクローナル抗体は、免疫吸着クロマト
グラフィーによって物質を回収するためにも用いられて
きた。例えばミルシュタイン，シー．（Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ，Ｃ．），１９８０，サイエンティフィック・アメリ
カン（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ）２４
３；６６，７０。しかしながら、モノクローナル抗体が
化学反応を触媒するために使用されうることは示唆され
ていない。事実、触媒作用（ｃａｔａｌｙｓｉｓ）の分
野における開発は免疫学の分野とは別個に行なわれてき
た。抗体を触媒として使用した試みの唯一の報告例につ
いては本出願人らも熟知しているが、その試みでは所望
の反応の速度を大きくさせることはできなかった。ジ
ー．ピー．ロイヤー（Ｇ．Ｐ．Ｒｏｙｅｒ），１９８
０，アドバンシス イン カタリシス（Ａｄｖａｎｃｅ
ｓ ｉｎ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ）２９；１９７−２２
７。化学反応のなかで、反応体は異なる状態を通る一連
の遷移をうけ、最終的に生成物に達する。分子的には、
中間状態を介するこれら遷移は結合長さ，角度などの変
化をもたらす。反応体から生成物への遷移は生成物を生
成すべく分解する中間体の形成を含むものとして考えら
れうる。反応全体の速度を、反応体，中間体および生成
物の間の平衡を特徴づける平衡定数で表わすことができ
る。 【０００６】触媒作用は、反応体の状態に関しては中間
体の安定化としてみなされうる。触媒は反応速度を増加
させる物質であり、反応の最後には実質的に化学的変化
をうけないまま回収される。触媒は消費されないが、触
媒が反応に関与することは一般に認められている。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】触媒作用が産業上重要
であるにもかかわらず、簡単な化学的触媒作用や酵素的
触媒作用には多くの制限がある。化学的に触媒させた方
法ではしばしば所望の生成物を高収率で製造しえない。
前記方法では副反応から不純物が生じることもよくあ
る。また、多くの重要な化学反応に対する化学的触媒は
知られていない。他の制限としては、比較的高い触媒コ
スト，化学的活性化の必要性，大気条件中あるいは少量
の水の存在下での有用性の欠如、および大気中の酸素の
存在下での可燃性や爆発性が含まれる。酵素的触媒作用
は、特定の反応を行うために必要な適度の特異性と触媒
機能を有する天然に存在する酵素の存在と発見に依存す
る。多くの化学反応に対する酵素は知られていない。本
発明は、触媒作用に対する新規なアプローチを提供する
ことによってこれらの制限を解決する。本発明は、触媒
の分野では今まで得ることのできなかった作用効率と特
異性とをある程度有する便利で容易に入手可能で安価な
触媒としてのモノクローナル抗体の調製および使用方法
を提供する。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明は、少なくとも１
種の反応体から少なくとも１種の生成物への変換（ｃｏ
ｎｖｅｒｓｉｏｎ）を含む化学反応の速度を増加させる
ための、モノクローナル抗体を含む方法に関する。 【０００９】本発明を実施するに際し、モノクローナル
抗体と１種以上の反応体との複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）
を形成するのに適当な条件下で１種以上の反応体を適当
なモノクローナル抗体と接触させる。１種以上の複合体
化された反応体を生成物へ変換し、生成物を複合体から
遊離させる。 【００１０】一具体例では、本発明はオキシドレダクタ
ーゼ，トランスフェラーゼ，加水分解酵素，リアーゼ，
イソメラーゼおよびリガーゼの如き酵素によっても触媒
されうる化学反応の速度を増加させるのに有用である。
他の具体例では、本発明は、触媒酵素が知られていない
化学反応の反応速度を増加させるために有用である。そ
のような反応の中には、特に酸化，還元，付加，縮合，
脱離，置換，開裂および転位が含まれる。 【００１１】本発明によれば、化学反応の速度を１００
倍以上に、好ましくは１万倍以上に増加させることがで
きる。抗体−反応複合体の形成に適した状態は、約６．
０〜約８．０、好ましくは約約６．０〜約７．５のpHに
維持されかつ約４℃〜約５０℃、好ましくは約２０℃〜
約４５℃の温度に維持されたプロトン性溶媒（ｐｒｏｔ
ｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ）、好ましくは水を含む溶液相あ
るいはエマルジヨン反応系により与えられる。イオン強
度μ＝１／２Σｃi ｚ2 i（式中、ｃは濃度であり、ｚは
イオン性溶質の電荷である）。それは、１リットルあた
り２．０モル以下、好ましくは１リットルあたり約０．
１〜１．５モルの値に維持されなければならない。本発
明方法は減圧あるいは加圧下で実施されうるが、好まし
くは大気圧下で実施する。 【００１２】本発明の実施に際して使用するのに適した
モノクローナル抗体はＫ＞１で特徴づけられる。前記Ｋ
＝ｋｒ／ｋｐ（式中、ｋｒは反応体に対するモノクロー
ナル抗体の親和性（アフィニティー）定数であり、ｋｐ
は生成物に対するモノクローナル抗体の親和性定数であ
る）。モノクローナル抗体は更にｒ1 ＞ｒ0 （式中、ｒ
1は抗体と反応体との複合体形成速度であり、ｒ0 はモ
ノクローナル抗体の非存在下での化学反応速度であ
る）、ｒ2 ＞ｒ0 （式中、ｒ2 は複合体化された反応体
から複合体化された生成物への変換速度である）および
ｒ3 ＞ｒ0 （式中、ｒ3は複合体からの生成物への遊離
速度である）によって特徴づけられる。 【００１３】適当なモノクローナル抗体を産生する方法
も開示されている。一具体例では、当業者に周知の方法
を変更してつくったハイブリドーマ細胞を、適当なモノ
クローナル抗体を産生するという能力の点で選別（スク
リーニング）する。 【００１４】別の具体例では、抗−イデオタイプモノク
ローナル抗体を公知の酵素−基質系に対してつくる。抗
−イデオタイプモノクローナル抗体は、基質を生成物へ
変換する速度を増加させるために使用可能であり、アロ
ステリック制御をうけない。 【００１５】上述した様に、本発明は少なくとも１つの
反応体から少なくとも１つの生成物への変換を含む化学
反応の速度を高める方法を提供するものである。本発明
の実施に於いて、反応体（１つ以上）を少なくとも１つ
の適当なモノクローナル抗体と、該モノクローナル抗体
と該反応体（１つ以上）との間の複合体の形成、該反応
体の（１つ以上）の生成物（１つ以上）への変換および
該生成物（１つ以上）の該複合体からの遊離を可能にす
る適切な条件下で接触させる。 【００１６】本発明に有用なモノクローナル抗体は、本
明細書中に引用によって組み入れられている米国特許第
４，１９６，２６５号（１９８０年４月１日発行）中に
コプロウスキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）等によって開示
されてる技術を改良したものによって調製される。これ
についての詳細は通常の知識を有する当業者には公知の
ものである。本発明の１具体例に於いて、適当な条件下
で反応体に対する一連のモノクローナル抗体が調製され
る。これは、まず最初にＢＡＬＢ／Ｃマウスを適当な抗
原で免疫感作することを含む。抗原は、所望の反応体か
あるいはペプチド又は他のキャリア分子に結合した所望
の反応体か、あるいは反応中間体か又は反応体、生成物
もしくは反応中間体の類似物であり得る。本明細書中で
使用される「類似物（アナログ）」という用語は、その
類似物に対して生産された抗体がその類似物の反応を必
ずしも触媒しないが反応体と免疫学的反応を引き起し得
るように、化学構造の点に於いてその反応体に充分似て
いる異性体、同族体及び他の化合物を包含する。例え
ば、触媒されるべき反応がｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−
ガラクトシドの開裂である場合は、抗原は例えばアオガ
イヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅ
ｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）のようなキャリアに結合し
た類似物ジニトロフェノールであり得、又抗原はその反
応体すなわちｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド
であり得る。 【００１７】 【化９】 【００１８】もう１つの例として、触媒されるべき反応
がアミノレブリン酸２分子からポルホビリノーゲンを生
ずる縮合である場合、 【００１９】 【化１０】 【００２０】抗原は類似物である３−グリシル−４−ヒ
ドロキシ−４−メチル−１，５−ヘパタンニ酸であり得
る。 【００２１】 【化１１】その後免疫感作されたマウスの脾臓から抗体産生リンパ
球を取り出し、ＳＰ２／０細胞のようなミエローマ細胞
と融合させて融合細胞（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌ
ｓ）を作成する。 【００２２】これらの融合細胞をその後マイクロタイタ
ープレートのウエル上に播く。この融合細胞によって産
生される一連のモノクローナル抗体に対して適度な条件
下でスクリーニングを行ない、適度な条件下で所望の反
応を触媒するモノクローナル抗体を同定する。スクリー
ニングは、反応体の標準溶液をマイクロタイターのウエ
ルから採取した一定量の培地で処理し、従来の機器手段
によって所望の生成物の存在を測定することによって便
利に行い得る。この測定は、例えば分光光度計法、ガス
液体クロマトグラフィー又は高圧液体クロマトグラフィ
ーによって容易に行い得る。所望の生成物又は反応体の
標準化試料との比較によって、反応速度が定量化され得
る。この方法によって、触媒作用をもつモノクローナル
抗体を産生する融合細胞を含んでいるウエルを同定す
る。次いで、こうして選択された融合細胞がコロニーを
形成するまで培養する。 【００２３】これらのコロニーはインビトロ（ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ）又はインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）のシステム
で更に増殖させることもできる。後者の場合は、選択さ
れた融合細胞を同系ＢＡＬＢ／Ｃマウスのようなマウス
の腹腔内に移植すると通常２〜３週内に腫瘍を形成す
る。この腫瘍に伴って所望のモノクローナル抗体を含む
腹水が生成される。その後、このモノクローナル抗体
は、限外濾過、超遠心、透析及び免疫アフィニティーク
ロマトグラフィー等の従来の方法によって腹水から分離
回収される。 【００２４】本発明のモノクローナル抗体は以下の式に
よって特徴付けられる。 【００２５】 【数１】(1) Ｋ＝ｋr ／ｋp ＞１ (2) ｒ1 ＞ ｒ0 (3) ｒ2 ＞ ｒ0 (4) ｒ3 ＞ ｒ0 【００２６】式(1) に於いて、Ｋは、反応体に対するモ
ノクローナル抗体のアフィニティー定数ｋr の、生成物
に対するモノクローナル抗体のアフィニティー定数ｋp
に対する比と定義される。この式は、このモノクローナ
ル抗体が生成物よりも反応体に対してより強い結合アフ
ィニティー（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を持
っているという事実を反映している。従って、反応体が
化学修飾を受け生成物を形成した結果、複合体を形成し
た分子に対するモノクローナル抗体の結合アフィニティ
ーが低下して生成物分子が該複合体から遊離し、それに
よって遊離のモノクローナル抗体触媒が再生される。好
ましくはＫは１０2 より大である。 【００２７】式(2) ，(3) および(4) は本発明に有用な
モノクローナル抗体の速度論的特性を示している。 【００２８】式(2) は、抗体−反応体間の複合体形成速
度として定義されるｒ1 がモノクローナル抗体がないと
きの化学反応速度ｒ0 よりも大でなければならないとい
うことを表している。式(3) は、複合体を形成した反応
体が複合体を形成している生成物に変換する速度として
定義されるｒ2 がｒ0 よりも大でなければならないこと
を表している。式(4) は、複合体からの生成物の遊離速
度として定義されるｒ 3 がｒ0 よりも大でなければなら
ないということを表している。ｒ0 ，ｒ1 ，ｒ 2 及びｒ
3 は公知の方法によって直接又は間接的に便利に決定さ
れ得ることは当業者には理解されるところである。 【００２９】これらの特徴の結果、本発明のモノクロー
ナル抗体によって化学反応の速度を好ましくは１０2 倍
以上更に好ましくは１０4 倍以上に早くすることができ
る。 【００３０】本発明に依れば、分離回収されたモノクロ
ーナル抗体を適度な条件下で反応体と接触させる。この
条件によって該モノクローナル抗体と該反応体間の複合
体が形成され得る。通常の知識を有する当業者には、複
合体形成のための適当な条件は問題になっているその特
定の反応体とモノクローナル抗体とに依って変化し得る
ことは理解されよう。従って、モノクローナル抗体が反
応体（１つ以上）と複合体を形成し得なくなったり又は
別様に不活性化されない限り、本発明方法は様々な反応
条件下で実施され得る。より特定的には複合体形成のた
めの適当な条件は、プロトン性溶媒（ｐｒｏｔｉｃ ｓ
ｏｌｖｅｎｔ）、好ましくは水を含む溶液相及び乳濁反
応システムを包含し、これはpHが約６．０〜約８．０、
好ましくは約６．０〜約７．５で温度が約４℃〜約５０
℃、好ましくは約２０℃〜約４５℃に保たれているもの
である。イオン強度、μ＝１／２Σｃi ｚi 2（ここでｃ
は濃度であり、ｚはイオン性溶質の電荷である。）は約
２．０ｍｏｌｅ／ｌより小さく、好ましくは０．１〜
１．５ｍｏｌｅ／ｌに維持すべきである。本発明方法は
減圧又は加圧下で行ない得るが、大気圧で行なうのが好
ましい。溶液相及び乳濁反応システムに加えて、モノク
ローナル抗体が付着される支持物を用いることも適当な
条件として含まれる。このような支持物は、モノクロー
ナル抗体をそれに付着させる方法と共に通常の知識を有
する当業者には良く知られている。 【００３１】本発明方法はどのような化学反応の速度を
高めるのにも広く有用である。例えば、本発明方法は１
つの反応体から１つの生成物への変換を含む化学反応に
適用し得る。このような反応はα−ケト酸からα−アミ
ノ酸への変換を含み、インドールピルビン酸のＬ−トリ
プトファンへの変換によって例示され得る。もう１つの
例としては環状ポリヌクレオチドから鎖状ポリヌクレオ
チドへの変換がある。ここで“ポリヌクレオチド”とい
う用語はポリ及びオリゴヌクレオチドの両者を含む。 【００３２】本発明方法はもっと複雑な化学量論の化学
反応にも適用され得る。例えば、２つの反応体からの１
つの生成物への変換を含む反応の速度も本発明によって
高められ得る。このような反応の例としてアミノレブリ
ン酸２分子からのポルホビリノーゲン１分子への変換が
ある。 【００３３】本方法は、１つの反応体から２つの生成物
への変換を含む反応にも有用である。このような反応
は、β−Ｄ−ガラクトシドからのＤ−ガラクトースと第
２の生成物への変換、ポリヌクレオチド、ポリペプチド
又はポリサッカライドから、それぞれから得られる２つ
のフラグメント（断片）を生じる開裂によって例示され
得る。ここで用いられる“ポリペプチド”及び“ポリサ
ッカライド”という用語は、それぞれポリ及びオリゴペ
プチド並びにポリ及びオリゴサッカライドを含む。 【００３４】本方法は更に１つの反応体から多数の生成
物への変換を含む化学反応の速度を高めることに有用で
ある。このような反応はポリヌクレオチド、ポリペプチ
ドおよびポリサッカライドからのそれぞれから生じるフ
ラグメント（断片）への変換等を含む。 【００３５】本発明のもう１つの具体例では、反応体を
１つより多くのモノクローナル抗体と接触させる。この
抗体の各々は反応体の異なる決定基にそれぞれ作用す
る。従って、反応体がポリヌクレオチドでモノクローナ
ル抗体がこのポリヌクレオチド内部の異なったヌクレオ
チド配列に作用するものであるときは、特定のポリヌク
レオチドフラグメントを該反応体から開裂し得る。 【００３６】本方法は２つの反応体から２つの生成物へ
の変換を含む反応の速度を高めるのにのにも有用であ
る。このような反応は１つの反応体と２番目の反応体と
の間での官能基の交換によって２つの新しい生成物を生
じる、例えばエステル交換反応を含む。 【００３７】前述したところの化学量論の列挙は限定的
なものではなく、むしろ本発明の広範囲に恒る有用性を
指適し、本方法がいま問題にされている反応の化学量論
に限定されないということを示すつもりのものである。 【００３８】前述の議論および実例によっても明らかな
ように、本発明の方法は、酸化、還元、付加、縮合、脱
離、置換、開裂および転位その他のものを含む広範囲な
化学反応に対して有用である。これらの実例は本発明の
触媒特異性が高いということもまた例証するものであ
る。例えば本発明の実施に際して、ポリヌクレオチドの
ある特定なヌクレオチド配列だけ、又はペプチドのある
特定なアミノ酸配列だけと相互作用するモノクローナル
抗体を調製し得る。 【００３９】本発明の方法は酵素によっても触媒され得
る反応の速度を高めることに用い得る。例えば酵素とし
ては、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ジヒドロウラシルデ
ヒドロゲナーゼ若しくはＬ−アミノ酸オキシダーゼのよ
うな酸化還元酵素、グアニジノ酢酸メチルトランスフェ
ラーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ若
しくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのよう
な転移酵素、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース
−６−ホスファターゼ若しくはホスホジェステラーゼの
ような加水分解酵素、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、
アルドラーゼ若しくはヒスチジンアンモニア−リアーゼ
のようなリアーゼ、リブロースリン酸エピメラーゼのよ
うなイソメラーゼまたはチロシル−ｔＲＮＡシンターゼ
若しくはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのようなリガ
ーゼが考えられる。 【００４０】前記した様に本方法は、自然にはアミノレ
ブリン酸デヒドラターゼという酵素によって触媒される
反応である、アミノレブリン酸２分子からポルホビリノ
ーゲン１分子への変換、自然にはホスホジエステラーゼ
（制限）酵素によって触媒されるポリヌクレオチド中の
特定なホスホジエステル結合の開裂を含む反応である、
環状ポリヌクレオチドから鎖状ポリヌクレオチドへの変
換又は鎖状ポリヌクレオチドから２つ以上のそれのフラ
グメントへの変換、自然にはトランスアミナーゼ酵素に
よって触媒される反応体から生成物へのアミノ基の転移
（ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含む反応である、インドールピ
ルビン酸のようなα−ケト酸からＬ−トリプトファンの
ようなα−アミノ酸への変換、及び自然にはβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼによって触媒されるβ−Ｄ−ガラクトシ
ド結合の開裂を含む反応である、β−Ｄ−ガラクトシド
からのＤ−ガラクトース及び第２生成物への変換、の速
度を高めるのに用いることができる。 【００４１】本発明のその他の態様においては、ある酵
素の既知の基質である抗原に対するモノクローナル抗体
を調製し基質を生成物に変換する速度を増加させるため
に使用する。本方法は例えば、酵素β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼの基質として公知のｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−
ガラクトシドのｏ−ニトロフェノールとＤ−ガラクトー
スへの分解（変換）の速度を増加させるのに有用であ
る。本方法においては、該酵素をＢＡＬＢ／Ｃマウスに
接種し、前記した一般的技術に従って処理することによ
って、該酵素に対する一連のモノクローナル抗体を調製
する調製した一連の抗体を至適条件下でスクリーニング
し、酵素の活性部位に結合する第１モノクローナル抗体
を同定する。そのようなモノクローナル抗体は、適当な
条件下で抗原（基質）が酵素に対して結合するのを阻害
する抗体をスクリーニングすることによって同定し得
る。このスクリーニング工程は、例えばラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）のような酵素結合活性を測定する慣用
の方法により行うのが便利である。このようにして同定
した第１モノクローナル抗体を一般的方法により分離回
収し、新たな別のＢＡＬＢ／Ｃマウスに接種するのに使
用する。一般的方法に従い、第１モノクローナル抗体に
対する一連のモノクローナル抗体を生成する。かくして
生成された抗体を“抗−イデイオタイプ”モノクローナ
ル抗体と称する。次に、一連の抗−イデイオタイプモノ
クローナル抗体を一般的方法に従ってスクリーニング
し、至適条件下で抗原（基質）に結合しそれを生成物に
変換する抗−イデイオタイプモノクローナル抗体を同定
する。“（適切な）至適条件”とは抗体−反応体複合体
形成のための前記パラメータ内にある条件を意味する。
かくして生成され、分離回収された抗−イデイオタイプ
モノクローナル抗体は本発明に従い、基質を生成物に変
換する速度を増加するために使用し得る。 【００４２】本発明のこの実施態様において酵素の代り
にこのようなモノクローナル抗体を使用することは、酵
素がアロステリックな場合特に有利である。アロステリ
ック酵素は、基質、生成物あるいは他の分子であり得る
モジュレーター分子により活性化あるいは阻害される酵
素である。その結果、アロステリック酵素の動力学的挙
動はモジュレーター（１種以上）の濃度の変動により大
きく変化する。アロステリック挙動の比較的簡単な例は
フィードバック阻害を受ける酵素により例示される。こ
の場合酵素の触媒効率は、直接のあるいはその後の生成
物の濃度の増加に従い減少する。これによりこのような
酵素の多くの用途での使用は制限され、生成物の連続的
な除去が必要となる。本発明においてはそのような酵素
の代りにアロステリックコントロールを受けない適当な
抗−イデイオタイプモノクローナル抗体を使用すること
によってアロステリック性の問題および制限を打破し得
る。 【００４３】本発明は、以後コファクター（補因子）と
称する非タンパク性有機分子によっても触媒され得る反
応の速度を増加するのに使用し得ることもまた考えられ
る。コファクターとは例えば、ピリドキサールリン酸、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジ
ヌクレオチド、アデノシン三リン酸、チアミンピロリン
酸（ｐｙｒｏｓｐｈｏｓｐｏｈａｔｅ）、フラビンモノ
ヌクレオチド、ビオチン、テトラヒドロ葉酸、コエンザ
イムＢ１２、及びコエンザイムＡ等である。例えばピリ
ドキサールリン酸によって触媒され得る反応にはα−ケ
ト酸及びα−アミノ酸の相互変換（ｉｎｔｅｒ−ｃｏｎ
ｖｅｒｓｉｏｎ）がある。 【００４４】コファクターのみによって触媒される反応
は他のものも含めて比較的遅い反応で、また非選択的で
ある。コファクターのみを使用した時に遭遇する問題を
打破するために、コファクターのみの比較的効率の悪い
触媒能力と高度に特異的で効率の高いモノクローナル抗
体の有利性とを結合する本発明に従ってモノクローナル
抗体を調製し得る。そのようなモノクローナル抗体を調
製するためには、反応体あるいは反応体又は生成物の類
似物に結合したコファクターをマウスに接種し、その後
前述したコプロウスキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）の一般
的方法を行う。次に一般的方法により一連のハイブリド
ーマ細胞を調製して、遊離コファクター及び反応体と複
合化し、化学反応の速度を増加し、生成物を解放（遊
離）し得るモノクローナル抗体の生成に関してスクリー
ニングする。例えばインドールピルビン酸−ピリドキサ
ミンリン酸イミンに対するその様なモノクローナル抗体
は、インドールピルビン酸のアミノ酸トリプトフアンへ
の変換の速度を選択的に増加させる。本発明のこの態様
の実施においては、モノクローナル抗体と少なくとも等
モル量の適当なコファクターを反応混合物に加えること
が好ましい。 【００４５】本発明の特定実施態様の説明のため、実施
例を以下に記載する。 【００４６】材料及び方法 以下の実施例で使用した化学的、生物学的試薬は下記の
市販先より入手した。ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ及びバッファーはシグマケミカル社（Ｓｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，セントルイス、ミ
ズーリ）より入手した。ジニトロフェノール（ＤＮＰ）
及びジニトロベンゼンスルホン酸塩はイーストマンコダ
ック社（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，ロチェ
スター、ニューヨーク）より入手した。ホースラディッ
シュペルオキシド標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン及
び２，２′−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリン
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）はＫＰＬラボラトリー（ＫＰ
Ｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ゲザーズバ
ーグ、メリーランド）より入手した。マイクロタイター
プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ IITM）はダイナテック（Ｄ
ｙｎａｔｅｃｈ，アレキサンドリア、バージニア）より
入手した。カノマイシンはジブコラボラトリーズ（ＧＩ
ＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、グランドアイラン
ド、ニューヨーク）より入手した。牛胎児血清およびア
オガイヘモシアニン及び他のタンパク質はカルバイオケ
ム−ベーリング 【００４７】（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎ
ｇ，サンジエゴ、カリフォルニア）より入手し得る。細
胞成長培地および添加物はエムエーバイオプロダクツ
（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、ウォーカーズビ
ル、メリーランド）より入手し得る。Ｓｐ２０ミエロー
マ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１）はアメリカンタ
イプカルチュアコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ロック
ビル、メリーランド）より入手した。他の試薬、例えば
ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド、５−アミノ
レビュリン酸、過酸化水素、フェノール、硫酸マグネシ
ウム、重炭酸ナトリウム、インドール−３−ピルビン
酸、ビリドキサール−５−リン酸モレキュラーシーブ及
びモルフォ（ｍｏｒｐｈｏ）ＣＤＩ等はアルドリッチケ
ミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，セントルイス、ミズーリ）より入手し得る。ＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスはナショナルカンサーインスティテュー
ト、フレデリックリサーチファシリティ 【００４８】（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ， Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，フレドリック、メリーラン
ド）より入手した。アジュバンドはシグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）より入手した。マウス乳腺腫瘍ウイルス ＲＡＮ
は、例えばＭＴＶ ＡＴＣＣ ＶＲ−７３１（アメリカ
ンタイプカルチュアコレクション）のような市販のマウ
ス乳腺腫瘍ウイルスから従来法により抽出し得る。３−
グリシル−４−ヒドロキシ−４−メチル−１，５−ヘプ
タン二酸類似体は慣用の合成法、例えばアミノレビュリ
ン酸及びレビュリン酸（アルドリッヒ，Ａｌｄｒｉｃ
ｈ）を適当に保護した分子の塩基触媒縮合及びその後の
脱保護及びＨＰＬＣ精製により調製し得る。 【００４９】実施例１ ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシドによるマウス
の免疫化 第０日目に、７週令の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの１グルー
プ（表１のグループ１）に１０mgのｏ−ニトロフェニル
β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）を静脈内、１２mgの
ＯＮＰＧを腹腔内接種した。ＯＮＰＧはpH７．３の０．
１Ｍリン酸バッファーに２５mg／mlの濃度で溶解し、３
７℃に加温した。第３３日目のマウスに、不完全フロイ
ンドアジュバント中のＯＮＰＧを１２．５mg腹腔内接種
した。ＯＮＰＧリン酸バッファー溶液は等容量の不完全
フロインドアジュバントと混合し、接種に先立ち乳化さ
せた。第５４日目に各マウスから血液試料を採取した。
血液サンプルから遠心分離により血清を分離し４℃で保
存した。 【００５０】実施例２ ジニトロフェノールアオガイヘモシアニン結合体による
マウスの免疫化 実施例１の接種マウスの９１日目に、アオガヘモシアニ
ン（ＫＬＨ）に結合させ不完全フロイントアジュバント
中に乳化させたジニトロフェノール（ＤＮＰ）を腹腔内
接種した。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方
法（１９７６，アナル・バイオケム〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．〕７２：２４８）により測定したところ、接
種物は１０mgのタンパク質を含有していた。ジニトロフ
ェノールのＫＬＨへの結合はリトル及びエイセン（Ｌｉ
ｔｔｌｅ，Ｅｉｓｅｎ）の方法（１９６７，メソ・イム
ノル・イムノケム〔Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍ．〕１：１２）により行なった。ＤＮＰ
−ＫＬＨ接種を第１０１日目に繰り返した。接種物は第
９１日目の接種物について記載したように調製した。第
１０５日目に各マウスから血液サンプルを得、遠心分離
により血清を分離し４℃で保存した。 【００５１】実施例３ ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシドによるマウス
の免疫化 ＢＡＬＢ／Ｃマウス（表１のグループ２）に第０日目に
完全フロイントアジュバント中に乳化した５０mgあるい
は１００mgのＯＮＰＧを腹腔内に、第３０日目にpH７．
３の０．１Ｍリン酸バッファー中のＯＮＰＧ１０mgを静
脈内に、第６３日目に不完全フロイントアジュバント中
のＯＮＰＧ（２５mg／ml）１２．５mgを腹腔内にそれぞ
れ接種した。その９日後にマウスから採血し、遠心分離
により血清を分離して４℃で保存した。 【００５２】実施例４ ジニトロフェノールアオガイヘモシアニン結合体による
マウスの免疫化 実施例３の接種マウスの第１２１日目及び第１３１日目
に、不完全フロイントマジュバントに乳化したＤＮＰ−
ＫＬＨを１０mg腹腔内接種し、第１３５日目に採血し
た。遠心分離により血清を分離し４℃で保存した。 【００５３】実施例５ マウス血清の評価 Ａ マイクロタイタープレートウエルの調製 炭酸バッファー中にＯＮＰＧ（１mg／ml）を含有する溶
液５０μｌをポリスチレンマイクロタイタープレートの
各ウエルに加えた。４℃で１８時間後溶液を除去し、ウ
エルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。
次に、ウエルに１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを入れ、１２０分間３７°で
インキュベートしてＯＮＰＧ−コートウエルをブロック
した。 【００５４】Ｂ ＯＮＰＧ−結合アッセイ 実施例１及び３において採集した血清及び免疫化してい
ないマウスの血清を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎで種々の程度に希釈した。かくして得られた溶
液試料を上記のように調製したＯＮＰＧコートウエルに
加え、３７℃で１２０分間インキュベートした。その後
溶液を除去しＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでウエルを４回洗浄し
た。ＯＮＰＧに結合する血清抗体の存在を、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼに結合した抗−マウスヤギイ
ムノグロブリンを使用するエングバル（Ｅｎｇｖａｌ
ｌ）及びパールマン（Ｐｅｒｌｍａｎ）の方法（１９７
１、イムノケム〔Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８７１）
により検出した。洗浄してウエルから非結合抗マウス抗
体を除去した後、２，２′−アジノ−ジ（３−エチルベ
ンズチアゾリンスルホン酸）（ＡＢＴＳ）及び過酸化水
素を各ウエルに加え１５〜２０分間接触させておいた。
ＯＮＰＧで免疫化したマウスから得た血清の１：１０〜
１：３２０の希釈液と接触したウエルにおいて着色生成
物が検出された。実施例３で採集した血清のうち当初に
１００mgのＯＮＰＧを接種したマウスから得たものは
１：３２０よりも大きいタイターを有しており、これは
当初５０mgのＯＮＰＧを接種したマウスから得られた血
清の少くとも２倍以上である。ＯＮＰＧで免疫化されて
いないマウスから得た血清は、本アッセイにおいては着
色生成物を生成しなかった。これ等の結果は、ＤＮＰＧ
で免疫化されたマウスから得た血清はＯＮＰＧに結合し
た抗体を含有していることを示している。 【００５５】Ｃ ＯＮＰＧの開裂を触媒する活性のアッ
セイ ＯＮＰＧと反応する抗体の触媒性を下記のようにして測
定した。実施例１及び３において上記したように得たマ
ウス血清の希釈物の５０μｌを、１％ＢＳＡを含有する
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファー中のＯＮＰＧ５０μｌと
２３℃で１８時間接触させた。同様に、５０μｌのＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡバッファー中の５０ｎｇの酵素
β−Ｄ−ガラクトシダーゼをＯＮＰＧ溶液と接触させ
た。触媒活性の結果、β−Ｄ−ガラクトース及びｏ−ニ
トロフェノールを生成する（後者は黄色を有する）こと
になる触媒活性はどの血清試料中にも検出されなかっ
た。予想されたように酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼは
触媒活性を有していた。 【００５６】次に実施例２および４で採集された、ＫＬ
Ｈに結合したＤＮＰをさらに接種されたマウスから得ら
れた血清について測定した。該血清につき上記した方法
によりＯＮＰＧに結合する抗体の存在を試験した。免疫
化マウスより得た血清が抗−ＯＰＮＧ抗体を含有するこ
とが示された。１：５，１２０の希釈血清が、抗−ＯＮ
ＰＧ抗体の存在に対して陽性の反応を示した。このこと
は、ＫＬＨに結合された類似体による追加の免疫が、血
清中の抗−ＯＮＰＧ抗体の濃度の増加をもたらしたこと
を示している。免疫化していないマウスから得られた血
清を使用すると何の反応も見られなかった。 【００５７】実施例２及び４で採集された血清中の血清
抗体の触媒活性を上記のようにして試験した。結果を表
１に示すが、免疫化されたマウスからの血清試料中にお
いて触媒活性が検知されたことを示している。（以下余
白） 【００５８】 【表１】表 １ マウス血清及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの触媒活性 ４０５ｎｍの吸光度1 血清希釈液 １０分 １８時間 △吸光度2 グループ１3 ＯＮＰＧ 抗血清 １：１０ ．０１９ ．０２３ ．００４ １：２０ ．００５ ．００３ ．０００ １：４０ ．００８ ．０１０ ．００２ グループ２4 ＯＮＰＧ 抗血清 １：１０ ．００６ ．０３１ ．０２５ １：２０ ．００４ ．０４２ ．０３８ １：４０ ．００６ ．００９ ．００３ 正常マウス血清 １：１０ ．００３ ．００９ ．００６ １：２０ ．０００ ．０００ ．０００ １：４０ ．００５ ．００７ ．００２ β−Ｄ−ガラクトシダーゼ ５０ｎｇ ．２２９ ．３６２ ．１３３ ５ｎｇ ．０２９ ．４９６ ．４６７ ０．５ｎｇ ．０００ ．１１２ ．１１２ 1. 血清の吸光度に対して修正した。 2. １０分と１８時間の値の差。 3. 実施例２で得た血清。 4. 実施例４で得た血清。 【００５９】実施例６ ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシドで免疫感作す
ることによる融合（ハイブリダイゼーション）用脾臓細
胞の調製 実施例４と同様に免疫感作し、実施例５と同様にアッセ
イした抗体産生マウスを殺し、その脾臓を摘出する。１
０匹のマウスの脾臓を穏やかに細片化し、細いナイロン
スクリーンを通過させてリンパ球（脾臓細胞）懸濁液を
得る。この懸濁液を血清を含有しないＲＰＭＩ−１６４
０で３回洗浄する。 【００６０】実施例７ 融合（ハイブリダイゼーション）用骨髄腫（ミエロー
マ）細胞の調製 ＳＰ２／０系由来の骨髄腫細胞を、２％牛胎仔血清、ペ
ニシリン及びストレプトマイシンを補ったＨＢ１０１培
地（完全ＨＢ１０１）中で増殖させる。ＳＰ２／０細胞
は細胞融合に使用する前に３日間毎日継代培養し、１０
5 細胞／mlを超えない濃度で接種する。ＳＰ２／０細胞
は融合前にＲＰＭＩ−１６４０で一回洗浄する。 【００６１】実施例８ ハイブリドーマ細胞の調製 実施例６と同様に調製したリンパ球懸濁液と実施例７に
従って調製したＳＰ２／０骨髄腫細胞懸濁液とを４：１
の割合で混合する。細胞をペレツト状にし、次いで１．
６×１０5 リンパ球に対して１mlの割合でポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）１４５０（イーストマン−コダッ
ク（Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ）、ロチエスター（Ｒ
ｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ＮＹ）溶液（ＲＰＭＩ−１６４０
中に５０％ＰＥＧ ｗｔ／ｖｏｌを含有）を細胞ペレッ
トに滴加する。ＰＥＧ溶液で細胞融合した後、細胞懸濁
液を２００ｘｇで５分間遠心する。上清を除去し、最終
濃度１０7 細胞／mlとなるように細胞を完全ＨＢ１０１
中に静かに懸濁する。次いで、９６−ウエルマイクロタ
イタープレートのウエル中にこの最終細胞懸濁物を１０
０μｌの容量で分配し、３７℃で培養する。次いで、２
４時間後に各ウエルに１００μｌのＨＡＴ培地（１×１
０-4Ｍヒポキサンチン、４．０×１０-7Ｍアミノプテリ
ン及び１．６×１０-5Ｍチミジンを補った完全ＨＢ１０
１）を添加する。各ウエルから約１００μｌの培地を吸
引し、新しいＨＡＴ培地１００μｌを添加することによ
り２〜３日毎に細胞に栄養を与える。 【００６２】ＨＡＴ培地中での培養の週１の間に、親の
骨髄腫細胞とリンパ球はほとんど死亡するのが観察され
る。インキュベーションの１０〜１５日後に、ハイブリ
ダイゼーションが成功したことを示すＨＡＴ培地中での
細胞の増殖が観察される。 【００６３】実施例９ 触媒的モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞のスクリーニング 実施例８に従って調製した、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ
−ガラクトシドからｏ−ニトロフェノールとＤ−ガラク
トースへの開裂を触媒しうる抗体を産生するハイブリド
ーマ細胞を含むマイクロタイターウエルを次のようにア
ッセイする：各ウエルがｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガ
ラクトシドの０．０５Ｍ溶液を含有している第２の９６
−ウエルマイクロタイタープレート（アッセイプレー
ト）を調製し、３７℃に維持する。第１プレート（ハイ
ブリドーマプレート）の各ハイブリドーマ含有ウエルの
内容物のアリコート１００μｌを取り出し、アッセイプ
レートの対応ウエルに移す。ｏ−ニトロフェノールの存
在は分光光度計で測定するのが好ましい。又、移した各
５分後にアッセイプレートウエルのアリコート５０μｌ
を生成物の１つ又は両者の存在についてＨＰＬＣで分析
する。ｏ−ニトロフェノールとＤ−ガラクトースを含む
ことが判明した各アッセイプレートウエルを同定し、対
応するハイブリドーマプレートウエルに印をつける。 【００６４】実施例１０ ハイブリドーマ細胞の培養 実施例９で同定した各触媒的ハイブリドーマ細胞懸濁物
の一部を新しいマイクロタイタープレートの各ウエルに
播種する。ハイプリッド細胞のコロニー形成率は５０％
である（すなわち、播種した細胞の５０％が増殖してコ
ロニーを形成する）。この操作により、２週間以内に８
０〜１００％のウエルでハイプリッド細胞のコロニーが
得られる。実施例９に記載の方法により、再度ハイブリ
ドーマ細胞の触媒的抗体の産生について調べる。胸腺リ
ンパ球支持細胞を用い、但し、３つのウエル当りハイプ
リッド細胞１つの濃度で、触媒的抗体を産生し続けてい
るハイブリドーマ細胞を再びクローン化する。特異的な
組み合せからのクローンの９０％未満が抗体を産生する
ときには常にこの操作を繰り返す。 【００６５】実施例１１ インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での触媒的モノクローナル
抗体 実施例９に従って選択したハイプリッド細胞１０６ 個
を同系のＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内接種すると、２〜
３週間以内に接種したマウスの９０％より多くで触知可
能な腫瘍が誘発される。これらの腫瘍は腹水の産生（マ
ウス当り０．５〜３ml）を伴う。ハイブリドーマを有す
るマウスの腹水及び血清中の免疫グロブリン濃度は放射
免疫拡散アッセイで測定する。個々のマウスの血清及び
腹水中のモノクローナル抗体の濃度はほぼ等しく、各々
ml当り5 〜５０mgの抗体を含有している。次に、ゲル濾
過又は限外濾過のような通常の方法で、血清又は腹水か
らｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシドの開裂を触
媒しうるモノクローナル抗体を採取する。 【００６６】実施例１２ ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシドの開裂を触媒
するモノクローナル抗体の使用 ０．５Ｍリン酸バッファーでpH６．８に緩衝し３７℃に
維持した蒸留水１０００ml中に３０．１２ｇ（１００ミ
リモル）のｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシドを
含有する溶液に、実施例６に従って調製したモノクロー
ナル抗体１０mgを加える。反応混合物を２時間静かに攪
拌する。次いで、限外濾過により反応混合物からモノク
ローナル抗体を回収する。次に、濾液を１０℃に冷却
し、重炭酸ナトリウム９．２ｇ（１１０ミリモル）で処
理する。濾液をジエチルエーテル１００ml３部で抽出す
ることによりＤ−ガラクトースを回収する。エーテル部
分を合せて、１．０Ｎ重炭酸ナトリウムで１回洗浄し、
硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下に濃縮
してＤ−ガラクトースを得る。次いで水性部分と重炭酸
ソーダ洗液とを合せ、５Ｎ塩酸の添加によりpH３へと酸
性化する。次に、酸性化した水性部分をエーテルで３回
抽出する。エーテル抽出物を合せ、硫酸マグネシウム上
で乾燥させ、濾過し、減圧下に濃縮してｏ−ニトロフェ
ノールを得る。ＨＰＬＣまたは再結晶によりｏ−ニトロ
フェノール及びＤ−ガラクトースを更に精製してもよ
い。 【００６７】実施例１３ ポルホビリノーゲン（ＰＢＧ）産生用触媒的モノクロー
ナル抗体の調製 ＢＡＬＢ／Ｃマウスを３−グリシル−４−ヒドロキシ−
４−メチル−１，５−ヘプタン二酸で免疫感作するほか
は実施例６の方法に従って、ハイブリダイゼーション用
脾臓細胞を調製する。実施例７に従って骨髄腫細胞を調
製する。次に、実施例８の方法に従って脾臓細胞と骨髄
腫細胞を融合させてハイブリドーマ細胞を生じさせる。
次いで、アッセイ基質がアミノレブリン酸（０．０５
Ｍ）であり、アッセイがＰＢＧに対応するＨＰＬＣ−ピ
ークの出現について試験するものである、実施例９の方
法の変法によりハイブリドーマ細胞をスクリーニングす
る。そのように同定したハイブリドーマ細胞を実施例１
０の方法に従って培養し、実施例１１の方法に従ってマ
ウスから得る。 【００６８】実施例１４ ＰＢＧの産生を触媒するためのモノクローナル抗体の使
用 ０．５Ｍリン酸バッファーでpH６．８に緩衝し、３７℃
に維持した蒸留水１０００ml中に１３．１ｇ（１００ミ
リモル）のアミノレブリン酸を含有する溶液に、実施例
１３に従って調製したモノクローナル抗体３０mgを添加
する。反応混合物を２時間静かに攪拌する。次いで、限
外濾過により反応混合物からモノクローナル抗体を回収
する。反応混合物を凍結乾燥し、残留物をクロマトグラ
フィーにかけ精製ＰＢＧを得る。 【００６９】実施例１５ Ｌ−トリプトファン産生用触媒的モノクローナル抗体の
調製 窒素雰囲気下、無水メタノール中で２．０３ｇ（１０ミ
リモル）のインドール−３−ピルビン酸と２．６５ｇ
（１０ミリモル）のピリドキサミンリン酸と３ｇの乾燥
した４Åのモレキュラーシーブとを混合することにより
シツフ塩基を調製する。反応混合物を一晩静かに攪拌
し、濾過し、減圧下で濃縮してシツフ塩基を得る。ＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスをシツフ塩基で免疫感作する以外は実施
例６の方法で脾臓細胞を調製する。このようにして得ら
れた脾臓細胞を、実施例７に従って調製した骨髄腫細胞
と実施例８の方法に従って融合させる。次いで、基質が
インドール−３−ピルビン酸（０．０５Ｍ）とピリドキ
サミン−５−リン酸（０．０５Ｍ）との混合物であり、
アッセイによりＬ−トリプトファンに対応するＨＰＬＣ
ピークの出現について試験する、実施例９の方法の変法
によりハイブリドーマ細胞をスクリーニングする。この
ように同定したハイブリドーマ細胞を、実施例１０の方
法に従って培養し、実施例１１の方法に従ってマウスか
ら得る。 【００７０】実施例１６ Ｌ−トリプトフアン産生を触媒するためのモノクローナ
ル抗体の使用 ０．５Ｍリン酸バッファーでpH６．５に緩衝し、３７℃
に維持した蒸留水１０００ml中にインドール−３−ピル
ビン酸２０．３ｇ（１００ミリモル）とピリドキサミン
５−リン酸２６．５ｇ（１００ミリモル）とを含有する
溶液に、実施例１５に従って調製したモノクローナル抗
体５０mgを添加する。反応混合物を２時間静かに攪拌す
る。次いで、限外濾過によりモノクローナル抗体を回収
する。反応混合物を透析した後凍結乾燥すると生成物の
Ｌ−トリプトファンが得られる。 【００７１】実施例１７ 特異的ヌクレオチド配列でＲＮＡを開裂しうる触媒的モ
ノクローナル抗体の調製 （Ａ）抗原の調製 冷水（８ml）中に溶解し、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで
pH６．５に滴定した牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（５０
mg）の溶液に、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）カルボジイミド メト−ｐ−トルエンスル
ホネート（ｍｏｒｐｈｏ ＣＤＩ）を添加し、直後にマ
ウス乳腺腫瘍ウイルス３５ＳＲＮＡ（５０mg）を添加す
る。反応混合物を室温まで加温し、周期的に静かに攪拌
しながら１８時間保存する。次いで反応混合物を０．０
５Ｍ重炭酸アンモニウムに対して（４回変えて）、その
後、水に対して（４回変えて）透析する。次に、ＲＮＡ
−蛋白質（ＢＳＡ）結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を凍
結乾燥し、バイアル中に秤量して入れ、−７７℃の窒素
雰囲気下で保存する。又、ＢＳＡの代りにアオガイヘモ
シアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＡ）及びウサ
ギ血清アルブミン（ＲＡ）を使うこともできる。これら
の蛋白質は全てカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ）から入手できる。 【００７２】（Ｂ）モノクローナル抗体の調製 上記（Ａ）で調製したＢＳＡ結合３５ＳＲＮＡでＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウスを免疫感作する以外は実施例６の方法に従
ってハイブリダイゼーション用脾臓細胞を調製する。実
施例７に従って骨髄腫細胞を調製する。次いで、実施例
８の方法に従って、脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合しハイ
ブリドーマ細胞を得る。 【００７３】０．９％ＮａＣｌを含有する０．５Ｍリン
酸バッファー（pH６．１）中の３５ＳＲＮＡとマイクロ
タイターウエル内容物のアリコートとを３７℃で種々の
時間インキュベートすることにより、このように得られ
たハイブリドーマ細胞をスクリーニングする。次いで、
フェノール抽出によりＲＮＡを精製する。抗体開裂によ
り発生したフラグメントの数を２次元ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で測定し、各開裂部位のヌクレオチド配
列を解明する。測定はいずれもシュワルツ（Ｓｃｈｗａ
ｒｔｚ）らがセル（Ｃｅｌｌ）３２：８５３−８６９
（１９８３）に記載した方法に従って行う。各マイクロ
タイターウエルの内容物により誘導されたＲＮＡ開裂で
得たフラグメントとＥｃｏ ＲＩで誘導されたフラグメ
ントとを比較することにより、Ｅｃｏ ＲＩ開裂部位で
のＲＮＡ開裂のみを触媒しうるモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞が選択される。このように同
定したハイブリドーマ細胞を実施例１０の方法に従って
培養し、実施例１１の方法に従ってマウスから得る。 【００７４】実施例１８ Ｅｃｏ ＲＩ部位でのＲＮＡ開裂を触媒するためのモノ
クローナル抗体の使用 ０．９％ＮａＣｌを含有する０．５Ｍリン酸バッファー
でpH６．１に緩衝し、３７℃に維持した蒸留水１００ml
にマウス乳腺腫瘍ウイルス３５ＳＲＮＡ（５０mg）を加
える。実施例１７に従って調製したモノクローナル抗体
（５mg）を反応混合物に添加し、次いで３０分間静かに
攪拌しながらインキュベートする。次にフェノール抽出
でＲＮＡを精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
フラグメントを精製する。 【００７５】実施例１９ β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対する抗イデイオタイプモ
ノクローナル抗体 （Ａ）酵素活性部位に対するモノクローナル抗体の調製 ＢＡＬＢ／Ｃマウスを酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼで
免疫感作する以外は実施例６の方法に従ってハイブリダ
イゼーション用脾臓細胞を調製する。実施例７に従って
骨髄腫細胞を調製する。次いで実施例８の方法に従って
脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合しハイブリドーマ細胞を得
る。このようにして得たハイブリドーマ細胞を、酵素の
活性部位と結合するモノクローナル抗体の産生に関して
スクリーニングする。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ及び放
射標識したｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシドと
に対するマイクロタイターウエル内容物の競合阻害のＲ
ＩＡアッセイによりスクリーニングすると便利である。
次いで、このように選択したハイブリドーマ細胞を実施
例１０の方法に従って培養し、実施例１１の方法に従っ
てマウスから大量に得る。 【００７６】（Ｂ）抗イデイオタイプモノクローナル抗
体の調製 上記（Ａ）に従って調製し選択したモノクローナル抗体
でＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫感作する以外は実施例６の
方法に従ってハイブリダイゼーション用脾臓細胞を調製
する。骨髄腫細胞は又実施例７の方法に従って調製す
る。実施例８の方法に従って、脾臓細胞と骨髄腫細胞を
融合してハイブリドーマ細胞を得る。このようにして得
たハイブリドーマ細胞は先ず実施例９の方法に従ってス
クリーニングする。予備的スクリーニングに基いて選択
したハイブリドーマ細胞を次いでアロステリズムについ
てスクリーニングする。これは、実施例９に従い、但
し、周期的に、生成物のうちの１つの存在を測定するこ
とによって行う。このようにして得たデータから反応速
度を計算できる。種々の量の反応体の存在下に又、種々
の量の測定するものではない生成物と共にアッセイを繰
り返すと、抗体の動力学的動態の変化を検出できる。こ
の方法で、アロステリックな調節を示す抗イデイオタイ
プモノクローナル抗体が排除できる。非アロステリック
な抗イデイオタイプモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞を、実施例１０の方法に従って培養し、
実施例１１の方法に従ってマウス中での増殖により得
る。 【００７７】（Ｃ）抗イデイオタイプモノクローナル抗
体の使用 （Ｂ）で得た抗イデイオタイプモノクローナル抗体を実
施例１２の方法に従って用いることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マセイ，リチヤード・ジエイ. アメリカ合衆国，メアリーランド・ 20852，ロツクヴイル，ヴアレリアン・ コート・５ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/08 C12N 9/00 C12N 5/10 C12N 15/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．少なくとも１種の反応体を少なくとも１種の生成物
    へ変換する化学反応の反応速度を触媒的に上昇させるこ
    とができる触媒的モノクローナル抗体の製造法であっ
    て、 （ａ）(i) 反応体、(ii)ペプチドまたは他の担体分子に
    結合した反応体、(iii) 反応中間体、(iv)反応体の類似
    体、(v) 生成物の類似体であって、この類似体を抗原と
    して得られるモノクローナル抗体が反応体または反応中
    間体に結合できるような該類似体、及び(vi)反応中間体
    の類似体、からなる群より選ばれる抗原に対する複数の
    モノクローナル抗体を誘導し；次いで （ｂ）該複数のモノクローナル抗体をスクリーニングし
    て化学反応を触媒するモノクローナル抗体であって、モ
    ノクローナル抗体が以下の式 【化１】Ｋ＝ｋr ／ｋp ＞１ （ｋr は反応体に対するモノクローナル抗体のアフィニ
    ティー定数であり、ｋpは生成物に対するモノクローナ
    ル抗体のアフィニティー定数である） 【化２】ｒ1 ＞ｒ0 （ｒ1 は抗体と反応体との複合体の形成速度であり、ｒ
    0 はモノクローナル抗体が存在しないときの化学反応の
    速度である） 【化３】ｒ2 ＞ｒ0 （ｒ2 は複合体を形成した反応体から複合体を形成して
    いる生成物への変換速度であり、ｒ0 はモノクローナル
    抗体が存在しないときの化学反応の速度である） 【化４】ｒ3 ＞ｒ0 （ｒ3 は生成物の複合体からの遊離速度であり、ｒ0 は
    モノクローナル抗体が存在しないときの化学反応の速度
    である）によって特徴付けられるモノクローナル抗体を
    同定する； 工程を含む上記製造方法。 ２．抗原が担体分子に結合している請求項１の製造法。 ３．類似体が、該類似体によって誘導される抗体が該類
    似体の免疫反応には関与するが該類似体の反応を必ずし
    も触媒しない程度に反応体、反応中間体または生成物に
    構造的に類似しているものである請求項１の製造法。 ４．類似体が、反応体、反応中間体または生成物の異性
    体またはホモローグである請求項３の製造法。 ５．抗原が反応体の類似体である請求項１の製造法。 ６．化学反応が、コファクターまたは酵素によっても触
    媒され得る反応であって、コファクターまたは酵素が反
    応中に存在する請求項１の製造法。 ７．工程（ｂ）で同定されたモノクローナル抗体を、該
    モノクローナル抗体をそれぞれ産生する複数のハイブリ
    ドーマ細胞を培養することによって大量に製造する請求
    項１の製造法。 ８．モノクローナル抗体を、 （ａ） (i)反応体、(ii)ペプチドまたは他の担体分子に
    結合した反応体、(iii) 反応中間体、(iv)反応体の類似
    体、(v) 生成物の類似体であって、この類似体を抗原と
    して得られるモノクローナル抗体が反応体または反応中
    間体に結合できるような該類似体、及び(vi)反応中間体
    の類似体、からなる群より選ばれる抗原に対する複数の
    モノクローナル抗体を誘導し； （ｂ）該複数のモノクローナル抗体をスクリーニングし
    て化学反応を触媒するモノクローナル抗体を同定し、次
    いで（ｃ）工程（ｂ）で同定されたモノクローナル抗体
    を大量に製造する、 工程を含む方法によって製造する請求項１の製造法。 ９．モノクローナル抗体を、 （ａ） (i)反応体、(ii)ペプチドまたは他の担体分子に
    結合した反応体、(iii) 反応中間体、(iv)反応体の類似
    体、(v) 生成物の類似体であって、この類似体を抗原と
    して得られるモノクローナル抗体が反応体または反応中
    間体に結合できるような該類似体、及び(vi)反応中間体
    の類似体、からなる群より選ばれる抗原で動物を免疫し
    て、動物中に抗体産生リンパ球を誘導し； （ｂ）動物から抗体産生リンパ球を採取し； （ｃ）抗体産生リンパ球とミエローマ細胞とを融合し
    て、それぞれのモノクローナル抗体を産生する複数のハ
    イブリドーマ細胞を調製し；次いで （ｄ）複数のモノクローナル抗体をスクリーニングし
    て、化学反応を触媒するモノクローナル抗体を同定す
    る、 工程を含む方法によって製造する請求項１の製造法。 １０．類似体が、該類似体によって誘導される抗体が該
    類似体の免疫反応には関与するが該類似体の反応を必ず
    しも触媒しない程度に反応体、反応中間体または生成物
    に構造的に類似しているものである請求項９の製造法。 １１．抗原が担体分子に結合している請求項９の製造
    法。 １２．抗原が、反応体、生成物または反応中間体の異性
    体またはホモローグである請求項１０の製造法。 １３．化学反応が酵素によって触媒されることが知られ
    ているものであり、モノクローナル抗体が、 （ａ）酵素に対する複数のモノクローナル抗体を誘導
    し； （ｂ）複数のモノクローナル抗体をスクリーニングし
    て、反応体の酵素への結合を阻止する第１のモノクロー
    ナル抗体を同定し； （ｃ）第１のモノクローナル抗体を回収し； （ｄ）工程（ｃ）で回収された第１のモノクローナル抗
    体に対する複数の抗イデオタイプモノクローナル抗体を
    誘導し； （ｅ）工程（ｄ）で誘導された複数の抗イデオタイプ抗
    体をスクリーニングして、反応体と結合し化学反応速度
    を触媒的に上昇させる第２のモノクローナル抗体を同定
    し；次いで、 （ｆ）モノクローナル抗体を産生するそれぞれの複数の
    ハイブリドーマ細胞を培養して、工程（ｅ）で同定され
    たモノクローナル抗体を大量に製造する、 工程を含む方法から製造されたものである請求項１の方
    法。
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