CN104737016B - 测定糖代谢能力的方法及用于该方法的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定受试者的糖代谢能力的方法、以及适用于该方法的组合物。本发明的糖代谢能力测定方法如下所述：使用用于测定糖代谢能力的组合物，实施下述工序(a)及(b)，从而测定受试者的糖代谢能力，所述组合物以经至少一个同位素C标记的葡萄糖作为有效成分，所述葡萄糖在机体内将被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中，工序(a)为将上述组合物施予至受试者并采集呼出气；工序(b)为求出标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例。

Description

测定糖代谢能力的方法及用于该方法的组合物
技术领域
本发明涉及一种测定受试者的糖代谢能力的方法、以及适用于该方法的组合物。具体而言，本发明涉及利用13C等标记C-呼气试验测定及监测受试者的糖代谢能力的方法、以及适用于该方法的组合物。此外，本发明涉及利用标记C-呼气试验测定受试者的糖代谢能力、从而判定糖尿病发病后的病态阶段或/及糖尿病发病的前阶段的方法(以下，在本说明书中，也将糖尿病发病后的病态阶段及糖尿病发病的前阶段统称为“糖尿病病态阶段”。)。
背景技术
对于糖尿病的诊断，通常首先利用尿糖检查或空腹时的血糖值检查进行初筛，在上述检查为阳性的情况下，进行葡萄糖负荷试验，从而确诊。近来，有时也在使用葡萄糖的糖负荷试验之前检查血中的HbAlC或果糖胺。
但是，就尿糖检查、空腹时的血糖值检查等现有方法而言，由于许多糖尿病患者的尿糖呈阴性，血糖值显示为正常值，因此也经常漏诊糖尿病患者，其灵敏度低已成为问题。因此，就现有方法而言，由于其无法判定糖尿病虽未发作但为糖尿病前阶段的状态，因此从预防医学的方面考虑是不充分的。此外，虽然使用葡萄糖的糖负荷试验是优异的检查方法，但已指出其存在因摄取大量葡萄糖而导致副作用的问题，并且，由于需要对受试者进行历经数小时的约束，并反复进行采血，因此受试者的身体负担大，现实中只能对有限的对象者实施该方法。此外，HbAlC或果糖胺的结果直到下次就医时才能知晓，故存在快速性不足的缺点。
此外，作为用于诊断糖尿病的病型(胰岛素依赖型、非胰岛素依赖型)、确定治疗方针、以及调查糖尿病的治疗效果的检查，以往主要通过对血中胰岛素浓度的测定、对血中或尿中的C-肽的测定、使用葡萄糖的糖负荷试验中对血糖值、血中胰岛素浓度的经时变化的测定来进行。但是，如上文所述，由于使用葡萄糖的糖负荷试验给受试者的身体带来较大负担，所以实际很少实施，血中胰岛素浓度、血中或尿中C-肽的结果直到下次就医时才能知晓，快速性不足。
另一方面，提出了应用所谓的标记C-呼气试验(即，施予用13C标记过的葡萄糖，测定以二氧化碳的形式排出至呼出气中的13CO2)来诊断糖尿病(参见专利文献1～3)。具体而言，专利文献1中记载了下述方法：使用将特定位置的碳用13C取代而得的葡萄糖进行呼气试验，测定排出至呼出气中的13CO2浓度的增加率，由此诊断有无糖尿病并区分糖尿病的病型(1型糖尿病、2型糖尿病)。此外，专利文献2及3中记载了下述内容：与专利文献1同样地使用用13C标记过的葡萄糖进行呼气试验，可以以呼出气中的13C与12C之比(13C/12C，其是根据排出至呼出气中的13CO2浓度算出的)是比健康受试者低的值为指标来诊断糖尿病患者、胰岛素抵抗患者或糖耐量受损患者。
但是，无论哪一文献中均未记载或暗示通过使用葡萄糖的标记C-呼气试验，能够高精度地检测受试者的糖代谢能力，其结果，不仅能够测定、监测已出现糖尿病病症的患者的病态阶段，而且能够测定、监测糖尿病发病的前阶段的状态。
此外，专利文献4中记载了下述方法：将用2H标记过的葡萄糖施予至受试者，测定该受试者体内的重水(2H2O)的总量，以该重水(2H2O)的总量除以胰岛素量或胰岛素浓度曲线下面积(胰岛素AUC)而得到的值为指标，确定受试者的胰岛素抵抗性的方法；此外，专利文献5中记载了下述方法：根据施予检查用食品后测得的血糖值及胰岛素浓度，求出胰岛素浓度曲线下面积(胰岛素AUC)与葡萄糖浓度曲线下面积(葡萄糖AUC)的乘积(“胰岛素AUC×葡萄糖AUC”)，以该值为指标确定受试者的胰岛素抵抗性的方法。
如上所述，上述文献中虽然记载了在对受试者的胰岛素抵抗性的评价中考虑胰岛素浓度曲线下面积(胰岛素AUC)，但无论哪一文献中均未记载或暗示通过使用葡萄糖的标记C-呼气试验，能够高精度地检测受试者的糖代谢能力，其结果，不仅能够测定、监测已出现糖尿病病症的患者的病态阶段，而且能够测定、监测糖尿病发病的前阶段的状态。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平10-67689号公报
专利文献2：日本特表2002-513911号公报
专利文献3：日本特开2008-292506号公报
专利文献4：日本特表2008-543787号公报
专利文献5：日本特开2010-44093号公报
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过使用了被同位素标记过的葡萄糖的标记C-呼气试验、高精度且快速地检测受试者的糖代谢能力的方法。此外，本发明的目的在于提供一种用于测定及监测已出现糖尿病病症的患者的病态阶段、以及糖尿病发病的前阶段的状态的方法。
此外，本发明的目的在于提供一种用于测定糖代谢能力的组合物，以用于上述方法。
为了解决上述课题，本申请的发明人反复进行了锐意研究，结果发现：根据施予用同位素标记过的葡萄糖后、被排出至呼出气中的同位素标记二氧化碳(CO2)的量、及由该量算出的呼出气中含有的二氧化碳的存在比例(标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例)的行为，能够高精度且快速地测定受试者的糖代谢能力。此外，本申请的发明人发现，通过将如上所述进行测定而得到的受试者的糖代谢能力作为指标，不仅能够测定已出现糖尿病病症的患者的病态阶段，还能够测定糖尿病发病的前阶段的状态，并且可对其进行经时监测。进而，本申请的发明人发现，通过将上述受试者的糖代谢能力作为指标，能够判定药物(糖尿病治疗药)对糖尿病患者的治疗效果，并且也能够对其进行经时监测。本发明是基于上述发现而完成的。
即，本发明包括下述方案：
(1)测定糖代谢能力的方法
(1-1)测定受试者的糖代谢能力的方法，包括下述工序(a)及(b)：
工序(a)，将以经至少一个同位素C标记的葡萄糖为有效成分的组合物施予至受试者，采集呼出气，所述葡萄糖将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中；以及
工序(b)，求出呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例。
需要说明的是，该工序(b)可以像下文所述那样通过求出例如Δ％13C(13C浓度变化量：atom％)或Δ13C值(δ13C值变化量：‰)来进行。
(1-2)如(1-1)所述的糖代谢能力测定方法，还包括下述工序(c)：
工序(c)，将工序(b)中得到的受试者的“标记CO2量相对于呼出气中含有的未标记CO2量或CO2总量的比例”(受试者值)与从健康受试者得到的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(对照值)进行比较，将受试者值低于对照值的情况确定为受试者的糖代谢能力降低，将受试者值高于对照值的情况确定为受试者的糖代谢能力亢进。
(1-3)如(1-1)或(1-2)所述的糖代谢能力测定方法,其中，上述同位素为13C。
(1-4)如(1-1)～(1-3)中任一项所述的糖代谢能力测定方法，其中，上述组合物的施予形态为经口施予形态或注射施予形态。
(1-5)如(1-1)～(1-4)中任一项所述的糖代谢能力测定方法，其特征在于，针对处于糖负荷状态的受试者实施工序(a)。
(1-6)如(1-5)所述的糖代谢能力测定方法，其中，处于糖负荷状态的受试者是在工序(a)之前摄取了糖类、或者含有糖或被代谢成为糖的物质的饮食品的受试者。
(1-7)如(1-6)所述的糖代谢能力测定方法，上述饮食品是除糖或被代谢成为糖的成分以外还含有选自由蛋白质(包括半消化态蛋白质)、氨基酸、脂肪、电解质、微量元素类及维生素类组成的组中的至少1种物质的液态、半液态或固态的饮食品。
(2)检测糖尿病发病后的病态阶段及糖尿病发病的前阶段的方法
(2-1)将利用(1-1)～(1-7)中任一项所述的糖代谢能力测定方法得到的受试者的糖代谢能力作为指标、检测受试者的糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段的方法。
以下，本说明书中也将“糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段”统称为“糖尿病病态阶段”。
(2-2)如(2-1)所述的检测糖尿病病态阶段的方法，包括下述工序：将在(1-2)～(1-7)中任一项所述的糖代谢能力测定方法中被确定为糖代谢能力亢进的受试者确定为处于糖尿病发病的前阶段。
具体而言，该本发明的方法可改述为下述[2-a]～[2-g]。
[2-a]检测受试者的糖尿病病态阶段的方法，包括下述工序(a)～(c’)：
工序(a)，将以经至少一个同位素C标记的葡萄糖(标记C-葡萄糖)为有效成分的组合物施予至受试者，采集呼出气，所述葡萄糖(标记C-葡萄糖)在机体内将被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中；
工序(b)，求出呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例；以及
工序(c’)，将上述工序(b)中得到的受试者的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))(受试者值)与从健康受试者得到的相应的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或者Δ13C值(‰))(对照值)进行比较，受试者值低于对照值时，将该受试者确定为已出现糖尿病病症，受试者值高于对照值时，将该受试者确定为处于糖尿病发病的前阶段。
[2-b]如[2-a]所述的检测方法，其中，上述同位素为13C。
[2-c]如[2-a]或[2-b]所述的检测方法，其中，上述组合物的施予形态为经口施予形态或注射施予形态。
[2-d]如[2-a]～[2-c]中任一项所述的检测方法，其特征在于，针对处于糖负荷状态的受试者实施上述工序(a)。
[2-f]如[2-d]所述的检测方法，其中，处于糖负荷状态的受试者是在工序(a)之前摄取了糖类、或者含有糖或被代谢成为糖的物质的饮食品的受试者。
[2-g]如[2-f]所述的检测方法，其中，上述饮食品是除糖或代谢成为糖的成分以外还含有选自由蛋白质(包括半消化态蛋白质)、氨基酸、脂肪、电解质、微量元素类及维生素类组成的组中的至少1种物质的液态、半液态或固态的饮食品。
此外，本发明的检测糖尿病病态阶段的方法，除采用上述方法以外，也可以采用下述(2-3)～(2-6)中记载的方法来实施。
(2-3)如(2-1)所述的方法，其中，使用[Δ13C(‰)-到呼出气采集时间t为止的曲线下面积(△13C(‰)AUCt)]或“施予被测样品后的至少1个时间点(t)处的△13C(‰)值(Δ13C(‰)t)”作为利用(1-1)～(1-6)中任一项所述的糖代谢能力测定方法得到的受试者的糖代谢能力的指标，根据将上述中的任一方除以受试者的胰岛素浓度而得的值(“Δ13C(‰)AUCt/胰岛素”或“Δ13C(‰)t/胰岛素”)与血糖值的相关关系，检测受试者的糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段。
(2-4)如(2-3)所述的方法，其中，上述施予被测样品后的至少1个时间点(t)是施予被测样品后120分钟以内的至少1个时间点。
(2-5)如(2-3)或(2-4)所述的方法，其中，上述施予被测样品后的至少1个时间点(t)是施予被测样品后经过10分钟以上之后的至少1个时间点。
(2-6)如(2-3)～(2-5)中任一项所述的方法，包括下述工序：从受试者得到的“Δ13C(‰)AUCt/胰岛素”或“Δ13C(‰)t/胰岛素”为比从健康受试者得到的“Δ13C(‰)AUCt/胰岛素”或“Δ13C(‰)t/胰岛素”低的值时，将该受试者确定为处于糖尿病发病的前阶段或糖尿病发病后的病态阶段。
(3)检测对于糖尿病患者的糖尿病治疗效果的方法
(3-1)将利用(1-1)～(1-6)中任一项所述的糖代谢能力测定方法得到的糖尿病患者的糖代谢能力作为指标、检测糖尿病治疗对接受该糖尿病治疗的糖尿病患者的治疗效果的方法。
(3-2)如(3-1)所述的方法，包括下述工序：将糖尿病治疗前测得的受试者的糖代谢能力与糖尿病治疗后测得的受试者的糖代谢能力进行对比，以糖尿病治疗后的糖代谢能力较糖尿病治疗前有所增加为指标，确定对于该受试者有糖尿病治疗效果。
具体而言，该本发明的方法可改述为下述[3-a]～[3-g]。
[3-a]检测对糖尿病患者的糖尿病治疗的方法，包括下述工序(a’)、(b)及(d)：
工序(a’)，在糖尿病治疗前后向受试者给予以经至少一个同位素C标记的葡萄糖(标记C-葡萄糖)为有效成分的组合物，采集呼出气，所述葡萄糖(标记C-葡萄糖)将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中；
工序(b)，求出糖尿病治疗前后的呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例；以及
工序(d)，将工序(b)中从糖尿病治疗处置后的受试者得到的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))与从糖尿病治疗处置前的受试者得到的相应的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))(对照值)进行比较，对于被测值高于对照值的情况下的该受试者，确定为有糖尿病治疗效果，对于被测值与对照值相同或者比对照组低的情况下的该受试者，确定为没有糖尿病治疗效果。
[3-b]如[3-a]所述的检测方法，其中，上述同位素为13C。
[3-c]如[3-a]或[3-b]所述的检测方法，其中，上述组合物的施予形态为经口施予形态或注射施予形态。
[3-d]如[3-a]～[3-c]中任一项所述的检测方法，其特征在于，针对处于糖负荷状态的受试者实施上述工序(a’)。
[3-f]如[3-d]所述的检测方法，其中，处于糖负荷状态的受试者是在工序(a’)之前摄取了糖类、或者含有糖或被代谢成为糖的物质的饮食品的受试者。
[3-g]如[3-f]所述的检测方法，其中，上述饮食品是除糖或代谢成为糖的成分以外还含有选自由蛋白质(包括半消化态蛋白质)、氨基酸、脂肪、电解质、微量元素类及维生素类组成的组中的至少1种物质的液态、半液态或固态的饮食品。
(4)用于测定糖代谢能力的组合物
(4-1)用于测定糖代谢能力的组合物，所述组合物以经至少一个同位素C标记的葡萄糖作为有效成分，所述葡萄糖将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中。
(4-2)如(4-1)所述的用于测定糖代谢能力的组合物，其中，上述同位素为13C。
(4-3)如(4-1)或(4-2)所述的用于测定糖代谢能力的组合物，其中，上述组合物的施予形态为经口施予形态或注射施予形态。
(5)标记C-葡萄糖的应用
(5-1)经至少一个同位素C标记的葡萄糖用于制造用于利用呼气试验测定糖代谢能力的组合物(用于测定糖代谢能力的组合物)的应用，所述葡萄糖将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中。
(5-2)如(5-1)所述的应用，其中，上述对糖代谢能力的测定利用(1-6)～(1-7)中任一项所述的方法进行。
(5-3)经至少一个同位素C标记的葡萄糖用于制造用于利用呼气试验测定糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段的组合物(用于测定糖尿病病态阶段的组合物)的应用，所述葡萄糖将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中。
(5-4)如(5-3)所述的应用，其中，上述对糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段的测定利用(2-1)～(2-6)及(2-a)～(2-g)中任一项所述的方法进行。
(5-5)经至少一个同位素C标记的葡萄糖用于制造用于利用呼气试验检测对糖尿病患者的糖尿病治疗效果的组合物(用于检测糖尿病治疗效果的组合物)的应用，所述葡萄糖将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中。
(5-6)如(5-5)所述的应用，其中，上述对糖尿病治疗效果的检测利用(3-1)、(3-2)及(3-a)～(3-g)中任一项所述的方法进行。
(6)标记C-葡萄糖或含有其的组合物的用途
(6-1)经至少一个同位素C标记的葡萄糖、或将所述葡萄糖作为有效成分的组合物，所述葡萄糖将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中，所述葡萄糖或组合物用于利用呼气试验测定糖代谢能力。
(6-2)如(6-1)所述的葡萄糖或组合物，其中，上述对糖代谢能力的测定利用(1-6)～(1-7)中任一项所述的方法进行。
(6-3)经至少一个同位素C标记的葡萄糖、或将所述葡萄糖作为有效成分的组合物，所述葡萄糖将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中，所述葡萄糖或组合物用于利用呼气试验测定糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段。
(6-4)如(6-3)所述的葡萄糖或组合物，其中，上述对糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段的测定利用(2-1)～(2-6)及(2-a)～(2-g)中任一项所述的方法进行。
(6-5)经至少一个同位素C标记的葡萄糖、或将所述葡萄糖作为有效成分的组合物，所述葡萄糖将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中，所述葡萄糖或组合物用于利用呼气试验检测对糖尿病患者的糖尿病治疗效果。
(6-6)(6-5)所述的葡萄糖或组合物，其中，上述对糖尿病治疗效果的检测利用(3-1)、(3-2)及(3-a)～(3-g)中任一项所述的方法进行。
根据本发明的方法，能够高精度且快速地测定评价受试者的糖代谢能力。通过将处于糖负荷条件下的受试者作为对象施行本发明的方法、及/或通过将作为被测物质的标记C-葡萄糖的施予形态设定为静脉施予而不是经口施予，能够更进一步提高精度及快速性。
此外，根据本发明的方法，通过将如上所述进行测定而得到的受试者的糖代谢能力作为指标，不仅可以确定已出现糖尿病病症的患者的病态阶段，还能够确定是否为糖尿病发病的前阶段，并且能够经时监测其状态(包括糖尿病的发病前的状态在内的糖尿病的病态)。尤其是能够在短时间(优选为试验开始(施予以由至少一个同位素C标记而成的葡萄糖为有效成分的组合物)后60分钟以内，较优选为试验开始后30分钟以内)内测定、评价所述糖尿病病态阶段。因此，根据本发明的方法，不需要长时间约束受试者，能够减轻身体上或精神上的负担。
进而，根据本发明的方法，通过将上述受试者的糖代谢能力作为指标，能够判定糖尿病治疗对接受该糖尿病治疗的糖尿病患者的治疗效果，并且能够经时监测糖尿病的治疗效果。根据本发明，该判定也能够在短时间(优选为试验开始(施予以经至少一个同位素C标记的葡萄糖为有效成分的组合物)后120分钟以内，较优选为试验开始后60分钟以内，进一步优选为试验开始后30分钟以内)内进行测定评价。因此，根据本发明的方法，在判定糖尿病的治疗效果时，不需要长时间约束受试者，能够减轻身体上或精神上的负担。
附图说明
[图1]表示实验例1的结果。表示向4组大鼠(1-13C-Glc施予组、2-13C-Glc施予组、3-13C-Glc施予组和U-13C-Glc施予组)分别施予各13C-葡萄糖溶液后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移。图中，纵轴表示呼出气中的Δ13C(‰)，横轴表示施予各13C-葡萄糖溶液后的呼出气采集时间(t)(分钟)。
[图2]表示实验例2的结果。表示向4组大鼠(A组：健康组、B组：糖尿病重度发病组、C组：糖尿病中度发病组、D组：糖尿病发病前阶段组，以下，图3及4中也相同。)分别施予U-13C-葡萄糖经口施予液后、进行测定而得到的呼出气中的Δ13C(‰)的推移。图中，纵轴表示呼出气中的Δ13C(‰)，横轴表示施予U-13C-葡萄糖经口施予液后的呼出气采集时间(t)(分钟)。以下，图5～13中也相同。
[图3]表示实验例2的结果。表示4组大鼠的“血糖值(mg/dL)”(横轴)与[Δ13C(‰)-呼出气采集时间(120分钟)曲线下面积(AUC)]除以各组的胰岛素浓度(ng/mL)而得的值即“AUC120/胰岛素(‰·min·mL/ng)”(纵轴)的相关关系。
[图4]表示实验例2的结果。表示4组大鼠的“血糖值(mg/dL)”(横轴)与Δ13C(‰)(10分钟)除以各组的胰岛素浓度(ng/mL)而得的值即“Δ13C(‰)(10分钟)/胰岛素(‰·min·mL/ng)”(纵轴)的相关关系。
[图5]表示实验例3的结果。表示在大鼠(ZDF Fatty、ZDF lean)的各周龄时施予U-13C-葡萄糖经口施予液后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移。
[图6]表示实验例4(2-1)的结果。表示向禁食条件下的第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)分别经口施予U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/4mL/kg)后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移。
[图7]表示实验例4(2-2-1)的结果。表示分别向第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)同时经口施予葡萄糖水溶液(450mg/4mL/kg)和U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/4mL/kg)后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移。
[图8]表示实验例4(2-2-2)的结果。表示向第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)分别经口施予葡萄糖水溶液(450mg/4mL/kg)、于30分钟后经口施予U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/4mL/kg)后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移。
[图9]表示实验例4(2-2-3)的结果。表示向第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)分别经口施予葡萄糖水溶液(450mg/4mL/kg)、于30分钟后静脉施予U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/4mL/kg)后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移。
[图10]表示实验例4(2-2-4)的结果。表示向第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)分别经口施予葡萄糖水溶液(2g/4mL/kg)、于30分钟后静脉施予U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/4mL/kg)后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移。
[图11]表示实验例4(2-2-5)的结果。表示向第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)分别以4mL/kg的量经口施予经肠营养剂(蛋白质和氨基酸制剂：商品名“Racol(注册商标)配合经肠用液”)、于30分钟后静脉施予U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/4mL/kg)后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移。
[图12]表示实验例5的结果。表示3组大鼠(A组：健康组、B组：糖尿病重度发病组、C组：糖尿病中度发病组)中的、糖尿病治疗药施予前(未处置)的Δ13C(‰)的推移和糖尿病治疗药(二甲双胍)施予后的Δ13C(‰)的推移。
[图13]表示实验例6的结果。表示各组大鼠(对照组：-■-、1型糖尿病组：-□-、胰岛素施予4h-糖尿病组：-△-、胰岛素施予24h-糖尿病组：-●-)的呼出气模式(Δ13C(‰)的推移)。
具体实施方式
(I)对与标记C-呼气试验相关的术语及分析方法的说明
本发明的糖代谢能力测定方法以采用13C-呼气试验等标记C-呼气试验为基础。因此，在说明本发明之前，对与标记C-呼气试验相关的术语及其分析方法进行说明(“13C-呼气试验的实际基础和实践的应用第8项：13C-呼气试验数据分析法”，松林恒夫、松山涉，13C医学应用研究会，pp.102-111)。
需要说明的是，此处，作为本发明中使用的“同位素C或O中的至少一方”的一个例子，示例13C进行说明。
(1)δ13C值(‰)
表示同位素的存在比例时，采用将同一元素中组成比例最高的元素作为分母的同位素比(R)。因此，碳13(13C)的R值用以碳12(12C)作为分母的下式表示。
R＝13C/12C······(式1)
由于R是非常小的数值，因此难以直接进行测定。为了更准确地进行定量而使用质谱仪时，常与标准物质进行比较，测定结果用下式定义的δ值表示。
δ13C＝([RSAM/RSTD]-1)×1000······(式2)
δ13C：δ13C值(‰)
RSAM：样品气中的13C存在比例
RSTD：标准气中的13C存在比例
需要说明的是，使用来自石灰石的二氧化碳(PDB)作为标准气时，RSTD为RPDB＝0.0112372。
(2)Δ13C值(‰)
如下式所示，“Δ13C值(‰)”是指将施予试剂前的δ13C值(即，天然存在的13C的δ值)作为背景(back ground)从施予试剂后的δ13C值中减去而得到的值(Δ13C)。
Δ13C(‰)＝(δ13C)t-(δ13C)0······(式3)
Δ13C(‰)：δ13C值变化量(‰)
(δ13C)t：施予试剂后t小时时的δ13C值(‰)
(δ13C)0：施予试剂前0小时时的δ13C值(‰)
(3)呼出气中的13C浓度(％13C：atom％)
呼出气中的13C浓度(％13C：atom％)用下式定义。
％13C＝[13C/(13C+12C)]×100
为了将(1)中定义的相对值δ13C值转换为总碳中的13C含量(％)(其为通常的浓度的概念)的形式，可以采用下述的方法。
首先，将上述式的右边的分母和分子除以12C，基于(式1)转换为R，则成为下式。
％13C＝[R/(R+1)]×100······(式4)
将(式2)中求出的RSAM代入该R中进行整理，则成为下式，可以用δ13C值表示13C浓度(％13C)。
％13C＝{[(δ13C/1000)+1]×RPDB×100}/{[[(δ13C/1000)+1]×RPDB]+1}···
(式5)
％13C：13C浓度(atom％)
δ13C：δ13C值(‰)
RPDB：PDB标准气中的13C存在比例＝0.0112372
(4)13C浓度的变化量(Δ％13C)
如下式所定义地那样，呼出气中的13C浓度(％13C)的变化量(Δ％13C)，可以通过将施予前0小时的13C浓度〔(％13C)0〕从施予t小时后的13C浓度〔(％13C)t〕中减去而求出。
Δ％13C＝(％13C)t-(％13C)0······(式6)
Δ％13C：13C浓度变化量(atom％)
(％13C)t：施予试剂t小时后的13C浓度(atom％)
(％13C)0：施予试剂前0小时时的13C浓度(atom％)
(5)Δ13C值(‰)与13C浓度变化量(Δ％13C)的关系
13C的天然存在比例(R)为约0.011，即使在施予标记试剂的情况下，呼出气中的增加量也仅为+0.001～0.002左右。因此，可以视为天然存在比例R→0，用R表示％13C的(式4)可以用下式进行近似。
％13C＝[R/(R+1)]×100≈R×100
使用上述近似式，首先利用作为δ13C的定义的(式2)求出RSAM，将其代入上述式的R中进行整理，则可得到计算13C浓度的近似(式7)。
％13C＝[(δ13C/1000)+1]×RPDB×100······(式7)
将其代入(式6)，则如下式(式8)所示，可以由Δ13C算出Δ％13C。
Δ％13C＝(％13C)t-(％13C)0
＝{[(δ13C)t-(δ13C)0]/1000}×RPDB×100
＝(Δ13C×RPDB)/10······(式8)
Δ％13C：13C浓度变化量(atom％)
Δ13C：δ13C值变化量(‰)
RPDB：PDB标准气中的13C存在比例＝0.0112372
(II)用于测定糖代谢能力的组合物
本发明的用于测定糖代谢能力的组合物以经至少一个同位素C标记的葡萄糖作为有效成分，所述葡萄糖将在机体内被转化为标记的CO2气体而被排出至呼出气中。可在本发明中使用的标记C-葡萄糖具有下述特性：施予至受试者后，根据体内的糖代谢能力而进行糖代谢，以含有标记C的二氧化碳(其反映了受试者糖代谢能力的大小)的形式排出至呼出气中。
作为可用于标记构成葡萄糖的碳原子的同位素，没有特别限定，具体可举出13C及14C。上述同位素无论为放射性及非放射性均可，但从安全性的观点考虑优选为非放射性同位素。作为上述同位素，可优选举出13C。
同位素元素-标记葡萄糖是以下述方式标记而成的：随后经由糖代谢途径生成的CO2的至少一部分被同位素标记。例如，作为如上所述的葡萄糖，可以举出葡萄糖的1位或6位、2位或5位、以及3位或4位中任一方的至少1个碳原子被同位素标记而形成的化合物，具体而言，可以举出1-13C标记葡萄糖、2-13C标记葡萄糖、3-13C标记葡萄糖。此外，也可以是葡萄糖的1位、2位、3位、4位、5位及6位的全部碳原子被同位素标记而形成的物质。如下文所述的实验例1所示，从“Δ13C(‰)”的上升速度(换言之，施予13C标记葡萄糖后，以13CO2的形式被排出至呼出气中的速度)考虑，优选3位或4位的碳原子被同位素标记而形成的葡萄糖(例如，3-13C标记葡萄糖、4-13C标记葡萄糖)，以及1位、2位、3位、4位、5位及6位的全部碳原子被同位素标记而形成的葡萄糖。
用13C、14C及18O等同位素标记葡萄糖等化合物的方法没有特别限定，可广泛采用通常所使用的方法(佐佐木，“5.1稳定同位素在临床诊断中的应用”：化学领域107“稳定同位素在医·药学、生物学中的应用”，pp.149-163(1975)，南江堂；梶原，RADIOISOTOPES,41,45-48(1992)等)。上述同位素标记化合物、特别是实施例中示出的13C标记-葡萄糖均可以以商业方式获得，简便起见也可以使用相关的市售品。
关于本发明的组合物，只要基本上满足下述条件即可，并不特别限定其形态、标记C-葡萄糖以外的成分、各成分的配合比例、组合物的制备方法等，所述条件为：在施予后，标记C-葡萄糖被吸收至体内，再在被代谢后，以标记二氧化碳的形式排出至呼出气中。
例如，作为形态，可以具有经口施予形态，也可以具有静脉施予形态。在前者的情况下，可采用下述任意经口施予形态：液体制剂(包括糖浆剂)、悬浮剂及乳剂等液体形态；片剂(包括未包衣剂、包衣剂)、咀嚼片剂、胶囊剂、丸剂、散剂(粉末剂)、细粒剂及颗粒剂等固体形态等。在后者的情况下，可采用例如注射剂、滴注剂的施予形态(液态、悬浮态或乳液态)。优选作为非侵害性测定方法的经口施予形态，如实验例4所示，从能获得高的测定精度的方面来看，进一步优选静脉施予形态。
此外，本发明的组合物并不限定于具有制剂形态，只要含有上述标记C-葡萄糖且不阻碍本发明的作用效果即可，可以将上述标记C-葡萄糖与任意食品素材组合，制成固体食品、流体食品或液态食品的形态。
本发明的组合物可以实质上仅包含作为有效成分的上述标记C-葡萄糖，但只要不损害本发明的作用及效果，则也可以是根据各制剂形态(施予形态)配合有本领域中通常使用的药学上可容许的任意载体和添加剂作为其他成分的形态。
在上述情况下，作为有效成分而配合的标记C-葡萄糖的量没有特别限定，可举出在100重量％的组合物中为1～95重量％，可以在上述范围内适当调整。
将本发明的组合物制备成例如滴注剂或注射剂等液体、悬浮液或乳状液的形态时，除了可以使用纯化水或注射用蒸馏水以外，还可以根据各种形态使用各种载体或添加剂。例如，作为添加剂，可以使用等渗剂(例如氯化钠等)、pH调节剂(例如盐酸、氢氧化钠等)、缓冲剂(例如硼酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等)、防腐剂(例如苯扎氯铵等)、增稠剂(例如羧基乙烯基聚合物等)那样的通常使用的添加剂。
此外，将本发明的组合物成型为例如片剂、咀嚼片剂、胶囊剂、丸剂、散剂(粉末剂)、细粒剂及颗粒剂等固体形态时，可以根据各种形态使用各种载体或添加剂。
作为载体或添加剂，可以使用例如乳糖、白糖、糊精、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇、磷酸二氢钙、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸等赋形剂；水、乙醇、单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、磷酸钾、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、糊精、普鲁兰多糖等粘合剂；干燥淀粉、褐藻酸钠、琼脂粉末、昆布多糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯类、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、淀粉、乳糖、羧甲基纤维素钙、低取代度羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚维酮(crospovidone)等崩解剂；白糖、硬脂酸、可可脂、氢化油等崩解抑制剂；聚山梨醇酯80、季铵盐类、月桂基硫酸钠等吸收促进剂；甘油、淀粉等保湿剂；淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶体硅酸(colloidal silicic acid)等吸附剂；精制滑石、硬脂酸盐、硼酸粉末、聚乙二醇、胶体硅酸、蔗糖脂肪酸酯类、氢化油等润滑剂；柠檬酸、柠檬酸酐、柠檬酸钠、柠檬酸钠二水合物、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钠、磷酸氢钠等pH调节剂；氧化铁、β胡萝卜素、氧化钛、食用色素、叶绿素铜、核黄素等着色剂；以及抗坏血酸、氯化钠、各种甜味剂等矫味剂等。
片剂可根据需要制成实施了通常的涂层的片剂，例如糖衣片、明胶包被片、膜包衣片、双层片、多层片等。此外，胶囊剂可如下进行制备：按照常规方法，将作为有效成分的同位素标记葡萄糖与上文中示例的各种载体混合，填充在硬胶囊(hard gelatin capsule)、软胶囊等中进行制备。
本发明的组合物可用作下文所述的测定方法中向受试者施予的样品(被测样品)。具体而言，可用作为了测定受试者的糖代谢能力而施予的被测样品。此外，本发明的组合物可用作为了测定及确定受试者的糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段而施予的被测样品。进而，本发明的组合物可用作为了判定、监测糖尿病治疗对于糖尿病患者的效果而施予的被测样品。
上述测定方法均可如下进行测定：将本发明的组合物施予至受试者(包括人和动物)后，采集呼出气，测定呼出气中含有的二氧化碳的存在比例(标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例)，由此以该存在比例为指标进行测定。其详细内容在下述(III)中进行说明。
本发明的用于测定糖代谢能力的组合物具有经口施予形态或静脉施予形态(注射剂或滴注剂)的情况下，作为在该组合物中配合的标记C-葡萄糖(有效成分)的量，可根据情况适当进行调节设定。在任意情况下，均可以以每1次的施予量换算成标记C-葡萄糖(有效成分)的量为5mg/个体～50g/个体、优选为10mg/个体～25g/个体的范围的方式进行制备。
(III)测定糖代谢能力的方法
通过使用上文所述的本发明的用于测定糖代谢能力的组合物，能够测定受试者(人或人以外的哺乳动物)的糖代谢能力。
如下所述，该糖代谢能力的测定基本上可经由下述工序进行：将以标记C-葡萄糖为有效成分的上述组合物施予至以人为代表的哺乳动物(受试者)，采集呼出气[本发明的方法的工序(a)]；测定该呼出气中含有的二氧化碳的存在比例(标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例)[本发明的方法的工序(b)]。
[工序(a)]将以经至少一个同位素C标记的葡萄糖(标记C-葡萄糖)为有效成分的组合物施予至受试者，采集呼出气，所述葡萄糖(标记C-葡萄糖)将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中；以及
[工序(b)]求出呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例。
如上文所述，本发明中使用的标记C-葡萄糖均具有下述特性：经口或静脉施予至受试者后，对应于受试者的糖代谢能力进行糖代谢，以反映该糖代谢能力的大小的量的“含有标记C的二氧化碳”的形式排出至呼出气中。
需要说明的是，此处，以标记C-葡萄糖为有效成分的本发明的组合物的施予方法没有特别限定，经口施予或静脉内施予均可。从为非侵害性的方法的方面来看，优选经口施予，如实验例4所示，从精度的高低的方面考虑，优选静脉内施予。
作为配合在本发明的用于测定糖代谢能力的组合物中的标记C-葡萄糖(有效成分)的量，可根据情况适当进行调节设定。在用于测定糖代谢能力的组合物具有经口施予形态或静脉内施予形态的任一种情况下，均可以以每1次的施予量换算成标记C-葡萄糖(有效成分)的量为5mg/个体～50g/个体、优选为10mg/个体～25g/个体的范围的方式进行制备。
如上文所述，本发明中作为对象的受试者为人或人以外的哺乳动物。作为人以外的哺乳动物，可以举出小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猴、猪、牛及马等，优选小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴等实验动物。
在实施工序(a)之前，上述受试者可以为禁食状态，也可以为非禁食状态。如下文所述的实验例4所示，与处于禁食状态的受试者相比，通过针对处于糖负荷状态的受试者实施工序(a)，能够在短时间内高精度地测定糖代谢能力，因此，非禁食状态、特别是处于糖负荷状态是优选的。更详细而言，优选在实施工序(a)之前的至少120分钟前、较优选至少60分钟前，让处于禁食状态的受试者摄取糖类(例如葡萄糖)、或者含有糖类的饮食品或含有代谢成为糖类的物质的饮食品，使其处于糖负荷状态。关于上述糖类或饮食品的施予量，可以举出施予至体内的葡萄糖或在体内代谢生成的葡萄糖的量为450mg～2g/kg左右的比例。
此处，作为含有糖类的饮食品或含有被代谢成为糖类的饮食品，没有限定，可以举出除糖类或代谢成为糖类的成分以外还含有选自由蛋白质(包括半消化态蛋白质)、氨基酸、脂肪、电解质、微量元素类及维生素类组成的组中的至少1种物质的液态、半液态或固态的饮食品。此处，作为糖类，可以没有限定地举出葡萄糖、蔗糖(白糖)、麦芽糖、山梨糖醇、低聚糖、碳水化合物等。优选葡萄糖及麦芽糊精。
作为用于在上述糖负荷试验中使用的饮食品，虽然没有特别限定，但具体而言，可以使用像下文所述的实验例中使用的“Racol(注册商标)配合经肠用液”那样含有糖类(麦芽糊精、精制白糖)的经肠营养剂。
作为使用工序(a)中采集的呼出气、根据其中含有的二氧化碳的存在比例(标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例)测定受试者的糖代谢能力的方法的一个例子，以使用将13C-标记葡萄糖作为有效成分的组合物的情况(即，测定的标记CO2为13CO2的情况)为例进行说明，如下所述。
(1)按照下文中记载的方法，以减去了给予13C-标记葡萄糖之前的13C含量(atom％)〔(％13C)0〕而得的13C浓度的变化量(Δ％13C)的形式算出采集的呼出气中含有的二氧化碳的存在比例(13CO2量相对于CO2总量的比例)。
具体而言，求出于施予试剂开始t小时后采集的呼出气中含有的总碳中的13C含量(atom％)〔呼出气中的13C浓度(％13C)〕〔(％13C)t〕，进而按照式6减去施予13C-标记化合物之前的13C浓度(atom％)〔(％13C)0〕，求出13C浓度的变化量(Δ％13C)。
13C浓度(atom％)＝[13C/(13C+12C)]×100
Δ％13C＝(％13C)t-(％13C)0······(式6)
Δ％13C：13C浓度变化量(atom％)
(％13C)t：施予试剂t小时后的13C浓度(atom％)
(％13C)0：施予试剂前0小时时的13C浓度(atom％)
(2)需要说明的是，根据需要，上述13C浓度的变化量(Δ％13C)可基于式5及式3换算为Δ13C值(‰)〔δ13C值变化量(‰)或DOB(‰)〕。
％13C＝{[(δ13C/1000)+1]×RPDB×100}/{[[(δ13C/1000)+1]×RPDB]+1}······(式5)
％13C：13C浓度(atom％)
δ13C：δ13C值(‰)
RPDB：PDB标准气中的13C存在比例＝0.0112372
Δ13C(‰)＝(δ13C)t-(δ13C)0······(式3)
Δ13C(‰)：δ13C值变化量(‰)
(δ13C)t：施予试剂后t小时时的δ13C值(‰)
(δ13C)0：施予试剂前0小时时的δ13C值(‰)
如下文所述的实验例所示，施予以标记C-葡萄糖为有效成分的用于测定糖代谢能力的组合物后被排出至呼出气中的标记C的含量、或者与之相对应的Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰)反映着受试者的糖代谢能力，根据使用该组合物的本发明的方法，能够精度良好且快速地测定该受试者的糖代谢能力。
需要说明的是，对呼出气样品中含有的标记二氧化碳的测定·分析根据使用的同位素为放射性还是非放射性而不同，但是，通常可采用液体闪烁计数法(liquidscintillation counter method)、质谱法(mass spectrometry)、红外分光光度法(infrared spectroscopy)、发射光谱法(emission spectrometry)、磁共振波谱法(magnetic resonance spectrum method)等常规使用的分析方法进行。从测定精度的方面考虑优选红外分光光度法及质谱法。
可以将上述工序(b)中得到的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))作为指标，利用下述方法确定受试者的糖代谢能力。
(c-1)将工序(b)中得到的受试者的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))(受试者值)与从健康受试者得到的相应的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或者Δ13C值(‰))(对照值)进行比较。
(c-2)进行比较的结果，将受试者值低于对照值的情况确定为受试者的糖代谢能力降低，将受试者值高于对照值的情况确定为受试者的糖代谢能力亢进。
需要说明的是，此处所谓健康受试者，是指在糖尿病方面是健康的、亦即未出现糖尿病病症且也不处于糖尿病发病前的状态的受试者(非糖尿病者)。
如实验例2(图2)所示，可知已出现糖尿病病症的患者的糖代谢能力与健康受试者的糖代谢能力相比有所降低，随着糖尿病的症状发展，危重度越高，糖代谢能力的降低越显著。另一方面，可知虽未出现糖尿病病症但处于糖尿病发病的前阶段的受试者的糖代谢能力与健康受试者的糖代谢能力相比有所升高。因此，如下述(IV)中详述的那样，通过利用本发明的方法测定受试者的糖代谢能力，不仅能够评价、确定糖尿病发病的病态阶段，而且能够检测出处于糖尿病发病的前阶段的受试者。具体而言，在本发明的方法中，糖代谢能力低于健康受试者的糖代谢能力的受试者被确定为已出现糖尿病病症，此外，在本发明的方法中，糖代谢能力高于健康受试者的糖代谢能力的受试者被确定为处于糖尿病发病的前阶段。即，根据本发明的糖代谢能力测定方法，能够检测出受试者处于糖尿病发病的前阶段，从而能够判定糖尿病发病的风险，能够给糖尿病发病的预防带来益处。
此外，如上所述，可以通过测定已经出现糖尿病病症的糖尿病患者的糖代谢能力来判定及监测糖尿病患者的病态阶段(危重度)，同样地，如实验例5及6(图12及13)所示，也可以通过测定正在接受糖尿病治疗的糖尿病患者的糖代谢能力来判定及监测由针对该糖尿病患者的糖尿病治疗所产生的治疗效果。在下述(V)中对其进行详述。
需要说明的是，上述方法也可以通过与利用呼气试验的本发明的方法同时实施本领域中已知或惯用的诊断糖尿病的方法(对血糖值的测定、胰岛素抵抗性试验、对血红蛋白A1c的测定等)来进行。
(IV)测定糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段的方法
如上所述，通过将利用上文所述的本发明的糖代谢能力测定方法得到的受试者的糖代谢能力作为指标，能够测定该受试者的糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段。
具体而言，以下述工序(a)～(c)中的工序(c)中得到的结果为依据，与健康受试者的糖代谢能力进行比较，将被确定为糖代谢能力降低的受试者认定为糖尿病患者(糖尿病发病患者)，将被确定为糖代谢能力亢进(上升)的受试者认定为处于糖尿病发病的前阶段的患者(糖尿病前阶段患者)，由此能够判定糖尿病的病态阶段。
[工序(a)]将以经至少一个同位素C标记的葡萄糖(标记C-葡萄糖)为有效成分的组合物施予至受试者并采集呼出气，所述葡萄糖(标记C-葡萄糖)将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中；
[工序(b)]求出呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例；以及
[工序(c)]将工序(b)中得到的受试者的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))(受试者值)与从健康受试者得到的相应的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或者Δ13C值(‰))(对照值)进行比较，受试者值低于对照值时，将该受试者确定为糖代谢能力降低，受试者值高于对照值时，将该受试者确定为糖代谢能力亢进。
需要说明的是，在本发明的“测定糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段的方法”中，上述[工序(c)]可改述如下。
[工序(c’)]将工序(b)中得到的受试者的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))(受试者值)与从健康受试者得到的相应的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或者Δ13C值(‰))(对照值)进行比较，受试者值低于对照值时，将该受试者确定为已出现糖尿病病症，受试者值高于对照值时，将该受试者确定为处于糖尿病发病的前阶段的工序。
特别地，本发明的方法在能够辨别处于糖尿病发病的前阶段的患者(糖尿病前阶段患者，其是难以采用现有方法进行判定的)和健康受试者的方面是有用的。此外，如实施例2(图2)所示，若糖代谢能力的降低程度大，则糖尿病的发展程度(危重度)大，糖代谢能力的降低程度和糖尿病的发展程度(危重度)之间存在相关关系，因此，根据本发明的方法，可依据糖代谢能力降低的程度来测定评价及监测糖尿病的发展程度(危重度)。
糖尿病的病态阶段(糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段)的测定也可以利用下述方法进行。根据该方法，不仅能够更明确且更高精度地将糖尿病患者与健康受试者区别开，而且能够更明确且更高精度地将处于糖尿病发病的前阶段的患者与健康受试者区别开。
方法(1)，求出受试者在禁食条件下的[血糖值](mg/dl)与向该受试者施予标记C-葡萄糖后、优选为从施予标记C-葡萄糖开始120分钟以内的至少1个时间点的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))除以该受试者在禁食条件下的血中胰岛素浓度(ng/mL)而得到的参数〔例如[Δ13C(‰)(t分钟)/胰岛素(mL/ng)](‰·mL/ng)〕的相关关系。
具体而言，如实验例2(3-3)(图4)所示，在以上述参数(例如[Δ13C(‰)(t)/胰岛素](‰·mL/ng)(t＝10分钟)为纵轴、且以上述[血糖值](mg/dl)为横轴的图中，绘制(spotting)上述参数和血糖值的图从而调查两者的相关关系，由此能够将糖尿病患者及处于糖尿病发病的前阶段的患者与健康受试者区别开。
如图4所示，将横轴表示的血糖值以例如150mg/dl划分开、并且将纵轴表示的[Δ13C(‰)(t)/胰岛素](t＝10分钟)以例如90‰·mL/ng划分开时，健康受试者组集中在左上栏(血糖值150mg/dl以下、[Δ13C(‰)(t)/胰岛素]90‰·mL/ng以上)，与之相对地，糖尿病患者和处于糖尿病发病的前阶段的患者集中在[Δ13C(‰)(t)/胰岛素]90‰·mL/ng以下(特别是低值)的区域。其中，处于糖尿病发病的前阶段的患者集中在[Δ13C(‰)(t)/胰岛素]90‰·mL/ng以下、且血糖值150mg/dl以下的区域，进而随着糖尿病发病、其程度发展(危重度变高)，存在根据其程度向图的右侧(血糖值高于150mg/dl的区域)移动的倾向。
方法(2)，求出受试者在禁食条件下的[血糖值](mg/dl)与向该受试者施予标记C-葡萄糖后120分钟以内的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或者Δ13C值(‰))的曲线下面积除以该受试者在禁食条件下的血中胰岛素浓度(ng/mL)而得到的参数〔例如[Δ13C(‰)AUC(t分钟)/胰岛素(mL/ng)](‰·min·mL/ng)〕的相关关系。
具体而言，如实验例2(3-2)(图3)所示，在以上述参数(例如[Δ13C(‰)AUCt/胰岛素](‰·min·mL/ng)、t＝120分钟)为纵轴、并且以上述[血糖值](mg/dl)为横轴的图中，绘制上述参数和血糖值的图从而调查两者的相关关系，由此能够将糖尿病患者及处于糖尿病发病的前阶段的患者与健康受试者区别开。
如图3所示，将横轴表示的血糖值以例如150mg/dl划分开、并且将纵轴表示的[Δ13C(‰)AUCt/胰岛素](t＝120分钟)以例如23000‰·min·mL/ng划分开时，健康受试者组集中在左上栏(血糖值150mg/dl以下、[Δ13C(‰)AUCt/胰岛素]23000‰·min·mL/ng以上)，与之相对地，糖尿病患者和处于糖尿病发病的前阶段的患者集中在[Δ13C(‰)AUCt/胰岛素]23000‰·min·mL/ng以下(特别是低值)的区域。其中，处于糖尿病发病的前阶段的患者集中在[Δ13C(‰)AUCt/胰岛素]23000‰·min·mL/ng以下、且血糖值150mg/dl以下的区域，进而随着糖尿病发病、其程度发展(危重度变高)，存在根据其程度向图的右侧(血糖值高于150mg/dl的区域)移动的倾向。
如上所述，根据本发明的方法，能够通过短时间的试验来区别检测处于糖尿病发病的前阶段的受试者与健康受试者和糖尿病患者，因此，可通过将该结果反馈给受试者、采取适当的处置，以期抑制或预防糖尿病发病。此外，通过经时地对受试者进行监测，还能够经时地管理·监视糖尿病发病有无进展及进展程度、糖尿病患者的危重度。
(V)检测对于糖尿病患者的糖尿病治疗效果的方法
如上文所述，通过将利用本发明的糖代谢能力测定方法得到的受试者的糖代谢能力作为指标，能够检测评价糖尿病治疗对正在接受糖尿病治疗的受试者(糖尿病患者)的治疗效果。
具体而言，对于受试者，于糖尿病治疗前后进行下述工序(a’)～(b)，对比糖尿病治疗前后得到的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))，糖尿病治疗后的值高于糖尿病治疗前的值的情况下，可确定对糖尿病有治疗效果。
[工序(a’)]于糖尿病治疗前后将以经至少一个同位素C标记的葡萄糖(标记C-葡萄糖)为有效成分的组合物施予至受试者并采集呼出气，所述葡萄糖(标记C-葡萄糖)将在机体内被转化为标记二氧化碳而被排出至呼出气中；
[工序(b)]求出糖尿病治疗前后的呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例；以及
[(d)工序]将工序(b)中从糖尿病治疗处置后的受试者得到的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))与从糖尿病治疗处置前的受试者得到的相应的“呼出气中含有的标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(Δ％13C(atom％)或Δ13C值(‰))(对照值)进行比较，对于受试者值高于对照值的情况下的该受试者，确定为有糖尿病治疗效果，对于受试者值与对照值相同或者比对照组低的情况下的该受试者，确定为没有糖尿病治疗效果。
根据本发明的方法，对于接受过糖尿病的治疗的糖尿病患者，能够以糖代谢能力的上升为指标测定评价及监测该糖尿病治疗的治疗效果。
实施例
以下给出实施例及实验例，以更进一步阐明本发明。但是，本发明并不受这些实施例等的任何限制。
实验例1葡萄糖的13C标记部位的差别
(1)13C-葡萄糖溶液的制备
(a)将1-13C-葡萄糖(将1位的碳原子取代为13C的葡萄糖。MW：181，CambridgeIsotope Laboratory制)用生理盐水制备成300μmol/mL。
(b)将2-13C-葡萄糖(将2位的碳原子取代为13C的葡萄糖。MW：181，CambridgeIsotope Laboratory制)用生理盐水制备成300μmol/mL。
(c)将3-13C-葡萄糖(将3位的碳原子取代为13C的葡萄糖。MW：181，CambridgeIsotope Laboratory制)用生理盐水制备成300μmol/mL。
(d)将U-13C-葡萄糖(将全部的碳原子取代为13C的葡萄糖。MW：186，CambridgeIsotope Laboratory制)用生理盐水制备成50μmol/mL。
(2)实验方法
将作为受试动物的禁食过的大鼠(雄，SD系大鼠)分为4组(每组n＝4)，分别以1mL/kg的量向各组(1-13C-Glc施予组、2-13C-Glc施予组、3-13C-Glc施予组及U-13C-Glc施予组)大鼠静脉内施予按上文所述制备的各13C-葡萄糖溶液。然后，在各13C-葡萄糖溶液的施予前(0分钟)和施予后的各时间点(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)采集呼出气，使用呼出气分析用质谱仪(ABCA：SerCon公司制)，由排出至呼出气中的13CO2浓度求出Δ13C(‰)。
需要说明的是，Δ13C(‰)如下进行计算：分别测定13C-葡萄糖溶液施予前(0分钟)和施予后的各呼出气采集时间点(t分钟)的呼出气中的13CO2/12CO2浓度比(δ13C值)，由各采集时间点(t)的δ13C值(δ13Ct)与施予前的δ13C值(δ13C0)之差(δ13Ct-δ13C0)算出(在以下的实验例中也相同)。
(3)实验结果
向4组大鼠分别施予各13C-葡萄糖溶液后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移示于图1。图中，纵轴为呼出气中的Δ13C(‰)。此外，横轴表示施予各13C-葡萄糖溶液后的呼出气采集时间(分钟)(t分钟)。
如图1所示，到施予葡萄糖溶液后30分钟为止的Δ13C(‰)值较高的是3-13C-Glc施予组(-▲-)，次之为U-13C-Glc施予组(-×-)。根据该结果确认到：1-13C-葡萄糖、2-13C-葡萄糖、3-13C-葡萄糖及U-13C-葡萄糖中，施予至体内后、在较早期以13CO2的形式被排出至呼出气中、反映在Δ13C(‰)值中的13C-葡萄糖为3-13C-葡萄糖，次之为U-13C-葡萄糖。即，可在短时间内测定Δ13C(‰)值的13C-葡萄糖优选为3-13C-葡萄糖和U-13C-葡萄糖。
实验例2利用呼气试验的糖尿病病态阶段的监测(其一)
(1)U-13C-葡萄糖经口施予液的制备
将U-13C-葡萄糖(MW：186，Cambridge Isotope Laboratory制)溶解在生理盐水中，制备浓度为50μmol/4mL的U-13C-葡萄糖经口施予液。
(2)病态阶段监测实验
作为受试动物，使用表1记载的A～D共计4组大鼠(雄，ZDF大鼠(Lean或Fatty)，每组n＝4～6)，使各组大鼠禁食后，以4mL/kg的量强制经口施予按上文所述制备的U-13C-葡萄糖经口施予液。
[表1]
然后，在U-13C-葡萄糖经口施予液的施予前(0分钟)和施予后(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)的各时间点采集呼出气，使用呼出气分析用质谱仪(ABCA:SerCon公司制)，由排出至呼出气中的13CO2浓度求出Δ13C(‰)。
(3)实验结果
(3-1)向上述4组大鼠分别施予U-13C-葡萄糖经口施予液后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移示于图2。图中，纵轴为呼出气中的Δ13C(‰)。此外，横轴表示施予U-13C-葡萄糖经口施予液后的呼出气采集时间(分钟)。
如图2所示，糖尿病中度发病组(C组：-■-)及糖尿病重度发病组(B组：-◆-)的Δ13C(‰)值比健康组(A组：-▲-)低。另一方面，糖尿病发病前阶段组(D组：-×-)的Δ13C(‰)值比健康组、糖尿病发病组(糖尿病中度发病组、糖尿病重度发病组)中的任一组都高。
根据上述结果确认到：在糖尿病发病前阶段，糖代谢能力与健康时相比有所上升，U-13C-葡萄糖被更快地代谢而以13CO2的形式排出至呼出气中。此外，确认到了一旦糖尿病发病，则糖代谢能力降低，糖代谢被抑制，结果，13C-葡萄糖被代谢而以13CO2的形式排出至呼出气中的量降低；进而确认到了该糖代谢能力的降低(13CO2排出量的降低)与糖尿病的危重度相关。
从该结果可知，通过将13C-葡萄糖作为被测物质、利用呼气试验测定糖代谢能力，不仅能够判定糖尿病发病后的病态阶段，而且能够判定糖尿病发病的前阶段。
(3-2)4组大鼠的[Δ13C(‰)-呼出气采集时间(120分钟)曲线下面积(AUC)]除以各组的胰岛素浓度(ng/mL)而得到的值(“AUC120/胰岛素(‰·min·mL/ng)”)与各组的“血糖值(mg/dL)”的相关关系示于图3。图中纵轴表示AUC120/胰岛素浓度(‰·min·mL/ng)，横轴表示血糖值(mg/dL)。
由图3可知，单位胰岛素浓度的AUC(120分钟)[AUC120/胰岛素(‰·min·mL/ng)]在糖尿病发病前阶段组(D组：-×-)及糖尿病发病组(糖尿病中度发病组(C组：-■-)和糖尿病重度发病组(B组：-◆-))中显示出显著的低值，均与健康组(A组：-▲-)的值明显不同。进而，表明了随着糖尿病病态阶段的发展，随着血糖值的上升，图形向图的右侧移动。由此确认到，通过求出上述参数[AUC120/胰岛素(‰·min·mL/ng)]与[血糖值(mg/dL)]的相关关系，能够辨别健康状态与糖尿病发病前阶段和糖尿病，并且能够判定及监测糖尿病发病前阶段和糖尿病的病态阶段(将它们统称为“糖尿病病态阶段”)。使用上述参数的糖尿病病态阶段判定在特别是糖尿病发病前阶段(其是难以采用现有方法进行辨别的)的诊断中是有用的。
(3-3)4组大鼠的U-13C-葡萄糖经口施予后10分钟时间点的Δ13C(‰)除以各胰岛素浓度(ng/mL)而得到的值“Δ13C(‰)(10分钟)/胰岛素(‰·mL/ng)”与各组的“血糖值(mg/dL)”的相关关系示于图4。图中，纵轴表示“Δ13C(‰)(10分钟)/胰岛素浓度”(‰·mL/ng)，横轴表示血糖值(mg/dL)。
根据该结果确认到，即使将上述图3中的纵轴从“AUC120/胰岛素(‰·min·mL/ng)”替换为“Δ13C(‰)(10分钟)/胰岛素(‰·mL/ng)”，也能够辨别健康状态与糖尿病发病前阶段和糖尿病，并且能够判定及监测糖尿病病态阶段。即，通过求出[血糖值](mg/dL)与13C-葡萄糖施予后的某个时间点(施予后t分)的Δ13C(‰)(Δ13C(‰)(t分钟))除以胰岛素浓度而得到的参数[Δ13C(‰)(t分钟)/胰岛素](‰·mL/ng)的相关关系，能够辨别健康状态与糖尿病发病前阶段和糖尿病，并且能够判定及监测糖尿病发病前阶段和糖尿病的病态阶段(糖尿病病态阶段)。需要说明的是，上述测定时间点(t分钟)为13C-葡萄糖施予后即可，但从利用本发明的优点(可在短时间内实行上述辨别及监测)的观点考虑，为施予13C-葡萄糖后120分钟以内，优选为60分钟以内，较优选为30分钟以内。此外，虽未限定，但优选为在13C-葡萄糖施予后经过至少10分钟以上之后。
使用上述参数的糖尿病病态阶段判定在对特别是糖尿病发病前阶段(其是难以采用现有方法在短时间内进行辨别的)的诊断中是有用的。
实验例3利用呼气试验的糖尿病病态阶段的监测(其二)
(1)U-13C-葡萄糖经口施予液的制备
将U-13C-葡萄糖(MW：186，Cambridge Isotope Laboratory制)溶解在生理盐水中，制备浓度为50μmol/4mL的U-13C-葡萄糖经口施予液。
(2)周龄变化时的病态阶段监测实验
作为受试动物，使用禁食过的ZDF Laen大鼠(非糖尿病大鼠：健康组)(雄，n＝4)和ZDF Fatty大鼠(雄，n＝4)，对于ZDF Fatty大鼠，在9、10、13及23周龄的各时间点以4mL/kg的量强制经口施予按上文所述制备的施予液，此外，对于ZDF Laen大鼠，在13周龄的各时间点以4mL/kg的量强制经口施予按上文所述制备的施予液。然后，在U-13C-葡萄糖经口施予液施予前(0分钟)和施予后的各时间点(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)对各组采集呼出气，使用呼出气分析用质谱仪(ABCA：SerCon公司制)，由排出至呼出气中的13CO2浓度测定Δ13C(‰)。
(3)实验结果
在各周龄时(ZDF Fatty：9W、10W、13W、23W；ZDF Laen：13W)施予U-13C-葡萄糖经口施予液后测得的呼出气中的Δ13C(‰)的推移示于图5。图中，纵轴表示呼出气中的Δ13C(‰)，此外，横轴表示施予U-13C-葡萄糖经口施予液后的呼出气采集时间(分钟)。
如图5所示，在9周龄ZDF Fatty大鼠(-○-)中，显示出了与健康组(13周龄ZDFLean大鼠、-■-)相同的呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)。另一方面，在ZDF Fatty大鼠10周龄组(-□-)及13周龄组(-×-)中，糖代谢亢进，其呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)显示出了比健康组(-■-)的呼出气模式高的值。进而，在23周龄ZDF Fatty大鼠(-△-)中，出现糖尿病病症，其呼出气模式显示出了比健康组(-■-)的呼出气模式低的值。由此确认到：通过利用使用了13C-葡萄糖的呼气试验、将呼出气中的Δ13C(‰)作为指标，能够将健康状态、糖尿病发病前阶段、及糖尿病各自区别开，并且能够监测糖尿病发病前阶段及糖尿病的病态阶段(糖尿病病态阶段)的经时性推移。
实验例4糖负荷条件下的呼气试验
(1)受试动物
作为受试动物，使用作为糖尿病模型动物的OLETF大鼠和作为其对照的LETO大鼠。具体而言，将第1组(对照组：LETO大鼠，雄，n＝5)和第2组(糖尿病组：OLETF大鼠，雄，n＝6)禁食20小时后，实施下述试验。
(2)实验方法和结果
(2-1)禁食条件下的呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)
向禁食条件下的第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)分别经口施予U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/4mL/kg)。在U-13C-葡萄糖施予前(0分钟)和施予后的各时间点(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)对各组采集呼出气，使用呼出气分析用质谱仪(ABCA：SerCon公司制)，由排出至呼出气中的13CO2浓度测定Δ13C(‰)。其呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)示于图6。
(2-2)按450mg/4mL/kg施予葡萄糖的条件下(糖负荷条件下)的呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)
(2-2-1)分别向(1)的受试动物、第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)同时经口施予葡萄糖水溶液(450mg/4mL/kg)和U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/4mL/kg)。
与(2-1)同样地，在U-13C-葡萄糖施予前(0分钟)和施予后的各时间点(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)对各组采集呼出气，由排出至呼出气中的13CO2浓度测定Δ13C(‰)。其呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)示于图7。
(2-2-2)此外，向(1)的受试动物、第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)分别经口施予葡萄糖水溶液(450mg/4mL/kg)，于30分钟后经口施予U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/4mL/kg)。与(2-1)同样地，在U-13C-葡萄糖施予前(0分钟)和施予后的各时间点(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)对各组采集呼出气，由排出至呼出气中的13CO2浓度测定Δ13C(‰)。其呼出气模式(呼出气中的Δ13C‰)的推移)示于图8。
(2-2-3)向(1)的受试动物、第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)分别经口施予葡萄糖水溶液(450mg/4mL/kg)，于30分钟后静脉内施予U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/mL/kg)。与(2-1)同样地，在U-13C-葡萄糖施予前(0分钟)和施予后的各时间点(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)对各组采集呼出气，由排出至呼出气中的13CO2浓度测定Δ13C(‰)。其呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)示于图9。
(2-2-4)向(1)的受试动物、第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)分别经口施予葡萄糖水溶液(2g/4mL/kg)，于30分钟后静脉内施予U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/mL/kg)。与(2-1)同样地，在U-13C-葡萄糖施予前(0分钟)和施予后的各时间点(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)对各组采集呼出气，由排出至呼出气中的13CO2浓度测定Δ13C(‰)。其呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)示于图10。
(2-2-5)分别向(1)的受试动物、第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)以4mL/kg的量经口施予经肠营养剂(蛋白质和氨基酸制剂：商品名“Racol(注册商标)配合经肠用液”，ENOtsuka Pharmaceutical Co.,Ltd)，于30分钟后静脉内施予U-13C-葡萄糖水溶液(50μmol/mL/kg)。与(2-1)同样地，在U-13C-葡萄糖施予前(0分钟)和施予后的各时间点(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)对各组采集呼出气，由排出至呼出气中的13CO2浓度测定Δ13C(‰)。其呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)示于图11。
各图(图6～11)中，纵轴为Δ13C(‰)，横轴表示施予U-13C-葡萄糖后的呼出气采集时间(分钟)。此外，-□-及-■-分别为对第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)进行测定而得到的呼出气中的Δ13C(‰)的经时的推移。
(3)讨论
如图6所示，在禁食条件下，第1组(对照组)与第2组(糖尿病组)的Δ13C(‰)值之差小。另一方面，如图7～11所示，确认了在糖负荷条件下，与第2组(糖尿病组)的呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)相比，第1组(对照组)的呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)显著地高。即，在禁食条件下，虽然健康受试者组(对照组)和糖尿病组的呼出气反应(呼出气模式、呼出气中的Δ13C(‰)的推移)之间存在差异，但其程度小，与之相对，通过在糖负荷条件下的测定，二者的呼出气反应(呼出气模式、呼出气中的Δ13C(‰)的推移)的差异增加。根据上述结果确认到：通过在糖负荷条件下进行测定，能将糖尿病组与健康受试者组(对照组)区别开，变得更容易辨别。
此外，如图7所示，同时施予13C-葡萄糖和用于糖负荷的糖类时，观察到了第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)的初始(特别是施予后10分钟以内)的呼出气反应存在重叠，但是，如图8所示，通过在施予作为被测物质的13C-葡萄糖之前事先施予糖类(糖负荷)，上述初始的呼出气反应的重叠消除。进而，从图8与图9和10的对比可知，通过将13C-葡萄糖的施予形态从经口施予(图8)变更为静脉内施予(图9和10)，第1组(对照组)和第2组(糖尿病组)中的呼出气反应的差异、特别是初始(例如施予后10分钟以内)的呼出气反应的差异进一步扩大。
从以上结果可知，利用糖负荷条件下的使用13C-葡萄糖的呼气试验、优选为事先施予糖类而使糖负荷的条件下的使用13C-葡萄糖的呼气试验、较优选为静脉施予13C-葡萄糖而进行的呼气试验，能够提高糖尿病病态阶段的测定精度。
此外，如图11所示，确认到了即使变更糖负荷中使用的糖类(葡萄糖)而使用含有蛋白质、脂肪、糖类及各种矿物成分的经肠溶液(Racol[注册商标]配合经肠用液)，也能获得相同的结果。由于一直以来担心糖尿病患者因OGTT(糖负荷试验)而导致高血糖的危险性，因此认为含有蛋白质、脂肪、糖类及各种矿物成分的饮食品可成为代替现有的在OGTT中使用的糖类(葡萄糖)的试验食品。
实验例5对糖尿病治疗药的治疗效果的评价
(1)实验方法
作为受试动物，使用3组ZDF大鼠(A组：健康组(n＝4)，B组：糖尿病重度发病组(n＝6)，C组：糖尿病中度发病组(n＝6))。需要说明的是，实验中，使这些ZDF大鼠自由摄取水及饵料(含有糖类、脂质及蛋白质)(MF：Oriental Yeast Co.,Ltd.)。即，下述实验在非禁食条件下进行。
每天早上(共3天)以300mg/kg的量向上述各组大鼠经口施予二甲双胍(和光株式会社，其为双胍类糖尿病治疗药(通用名称：Melbin)的有效成分)。于第3天的施予后3小时后静脉内施予利用实验例1的(1)中记载的方法制备的U-13C-葡萄糖溶液。
然后，以各组大鼠为对象，在U-13C-葡萄糖施予前(0分钟)和施予后的各时间点(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)采集呼出气，使用呼出气分析用质谱仪(ABCA：SerCon公司制)，由排出至呼出气中的13CO2浓度测定Δ13C(‰)。
(2)实验结果
各3组(A组：健康组、B组：糖尿病重度发病组、C组：糖尿病中度发病组)的糖尿病治疗药施予前(未处置)的Δ13C(‰)的推移(A组：-◆-、B组：-■-、C组：-▲-)和糖尿病治疗药施予后的Δ13C(‰)的推移(B组：-□-、C组：-△-)示于图12。图中，纵轴表示Δ13C(‰)，横轴表示U-13C-葡萄糖施予后的呼出气采集时间(分钟)。
由图12可知，确认到了与糖尿病治疗药施予前相比，通过施予糖尿病治疗药，两个糖尿病发病组(B及C组)的呼出气模式(呼出气中的Δ13C(‰)的推移)均变高，糖代谢能力亢进。即，确认到了糖尿病治疗药的治疗效果可利用本发明的呼气试验进行评价判定。
此外，通过该实验，确认到了通过利用使用13C-葡萄糖的呼气试验、特别是静脉施予13C-葡萄糖而进行的呼气试验，能够在短时间(例如3天以内)内确认糖尿病治疗药的治疗效果(通常，对于药物的治疗效果的判定，将药物治疗开始后约1个月后的HbA1c测定值用作指标)。
实验例6对施予胰岛素后的治疗效果的评价
作为受试动物，使用对照组(Wistar大鼠，雄，n＝3)及1型糖尿病组(STZ大鼠，雄，n＝3)。需要说明的是，实验中，使这些大鼠自由摄取水及饵料(含有糖类、脂质及蛋白质)(MF：Oriental YeastCo.,Ltd.)。即，下述实验在非禁食条件下进行。
作为1型糖尿病组(STZ大鼠)，使用以65mg/mL/kg的量静脉内施予STZ(链脲菌素：SIGNA)后经过1周后的大鼠。
向1型糖尿病组以30U/个体的量皮下施予胰岛素(SIGMA)，在胰岛素施予前、施予后4小时后或施予后24小时后，静脉内施予利用实验例1(1)中记载的方法制备的1-13C-葡萄糖溶液(其中，对于作为健康组的对照组的大鼠，不实施胰岛素施予)。然后，对于各组大鼠(对照组、1型糖尿病组、胰岛素施予4h-糖尿病组、胰岛素施予24h-糖尿病组)，在1-13C-葡萄糖施予前(0分钟)和施予后的各时间点(10、20、30、40、50、60、80、100、120分钟)采集呼出气，使用呼出气分析用质谱仪(ABCA：SerCon公司制)，由排出至呼出气中的13CO2浓度测定Δ13C(‰)。
各组大鼠(对照组：-■-、1型糖尿病组：-□-、胰岛素施予4h-糖尿病组：-△-、胰岛素施予24h-糖尿病组：-●-)的呼出气模式(Δ13C(‰)的推移)示于图13。图中，纵轴表示Δ13C(‰)，横轴表示施予1-13C-葡萄糖后的呼出气采集时间(分钟)。从图13的胰岛素施予4h-糖尿病组(-△-)的结果可知，胰岛素的效果持续期间的Δ13C(‰)显示出了几乎与对照组相同的值。此外，从胰岛素施予24h-糖尿病组(-●-)的结果可知，由于胰岛素的效果消失，导致呼出气模式(Δ13C(‰)的推移)显示出了低值。
以上实验结果表明，通过利用本发明的使用13C-葡萄糖的呼气试验，能够确认胰岛素对于糖尿病患者的效果。

Claims (5)

1.以经至少一个同位素C标记的葡萄糖作为有效成分的组合物在对处于糖尿病发病的前阶段的受试者进行诊断的试剂的制造中的用途，所述诊断通过包括下述工序(a)、(b)及(c)的测定方法来进行，将被确定为糖代谢能力亢进的受试者确定为处于糖尿病发病的前阶段：
工序(a)，将所述试剂施予至受试者并采集呼出气；
工序(b)，求出标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例；
工序(c)，将工序(b)中得到的受试者的“标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(受试者值)与从健康受试者得到的“标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例”(对照值)进行比较，将受试者值高于对照值的情况确定为受试者的糖代谢能力亢进。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，针对处于糖负荷状态的受试者实施工序(a)。
3.如权利要求2所述的用途，其中，处于糖负荷状态的受试者是在工序(a)之前摄取过糖类、或含有糖类的饮食品、或含有将代谢为糖类的物质的饮食品的受试者。
4.以经至少一个同位素C标记的葡萄糖作为有效成分的组合物在下述试剂的制造中的用途，所述试剂用于检测糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段，所述检测是通过包括下述工序(a)、(b)、(c)及(d)的测定方法来进行的：
工序(a)，将所述试剂施予至受试者并采集呼出气；
工序(b)，求出标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例；
工序(c)，将上述工序(b)中得到的值或到呼出气采集时间t为止的曲线下面积除以受试者的血中胰岛素浓度(ml/ng)，求出施予被测样品后的至少1个时间点(t)处的“△13C(‰)t/胰岛素”或“△13C(‰)AUCt/胰岛素”；
工序(d)，求出上述工序(c)中得到的受试者的“△13C(‰)t/胰岛素”或“△13C(‰)AUCt/胰岛素”与该受试者的血糖值之间的相关关系。
5.以经至少一个同位素C标记的葡萄糖作为有效成分的组合物在对处于糖尿病发病的前阶段或/及糖尿病发病的受试者进行诊断的试剂的制造中的用途，所述诊断是通过包括下述工序(a)、(b)、(c)及(d)的测定方法来进行的：
工序(a)，将所述试剂施予至受试者并采集呼出气；
工序(b)，求出标记CO2量相对于未标记CO2量的比例或标记CO2量相对于CO2总量的比例；
工序(c)，将上述工序(b)中得到的值或到呼出气采集时间t为止的曲线下面积除以受试者的血中胰岛素浓度(ml/ng)，求出施予被测样品后的至少1个时间点(t)处的“△13C(‰)t/胰岛素”或“△13C(‰)AUCt/胰岛素”；
工序(d)，将从上述工序(c)得到的“△13C(‰)t/胰岛素”或“△13C(‰)AUCt/胰岛素”(受试者值)与从健康受试者得到的“△13C(‰)t/胰岛素”或“△13C(‰)AUCt/胰岛素”(对照值)进行比较，受试者值为比对照值低的值时，确定该受试者处于糖尿病发病前的前阶段或/及糖尿病发病后的病态阶段。
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