JP6956977B2 - 肝の糖取込み能評価方法 - Google Patents

Description

本特許出願は、日本国特許出願第２０１６−２２０５１０号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、肝の糖取込み能を評価するための組成物、および、前記組成物を使用する、肝の糖取込み能を評価するための方法に関する。

糖尿病など代謝性疾患は、全世界的に社会問題となっており、予防医学の観点から早期発見を可能にする評価方法が求められている。

肝臓は、体内のエネルギー代謝において中心的な役割を担っている。例えば、食事により摂取されたグルコースを取込み、グリコーゲンに変換し、貯蔵し、必要時に分解して血液中にグルコースを供給する。糖尿病などのある種の代謝性疾患では、発症前または早期段階において肝臓における糖の取込みの調節に異常が生じることが知られており、この異常を検出することによる早期診断の可能性が期待されている。しかしながら、肝臓における糖の取込み能を評価することで、代謝性疾患の早期段階で起こる変化を抽出する方法は存在しない。

これまでに、糖尿病等の代謝性疾患を早期発見するための様々な評価方法が開発されてきた。例えば、糖尿病の診断に、^１３Ｃで標識したグルコースを投与し、呼気中に排出される^１３ＣＯ_２を測定する、いわゆる標識Ｃ−呼気試験を応用することが提案されている（特許文献１〜４参照）。具体的には、特許文献１には、特定位の炭素を^１３Ｃで置換したグルコースを用いて呼気試験を行い、呼気中に排泄される^１３ＣＯ_２濃度の増加率を測定することにより、糖尿病の有無およびその病型（１型糖尿病または２型糖尿病）を診断する方法が記載されている。また、特許文献２および３には、特許文献１と同様に^１３Ｃで標識したグルコースを用いて呼気試験を行い、呼気中に排泄される^１３ＣＯ_２濃度から算出した呼気中の^１３Ｃと^１２Ｃとの比（^１３Ｃ／^１２Ｃ）が、健常者のそれよりも低値であることを指標として、糖尿病、インスリン抵抗または耐糖能障害を診断できることが記載されている。さらに、特許文献４には、標識Ｃ−呼気試験を利用して患者の糖代謝能を測定し、糖尿病の病態ステージを検出できることが記載されている。

特開平１０−６７６８９号公報 特表２００２−５１３９１１号公報 特開２００８−２９２５０６号公報 国際公開第２０１４／０３０６５０号

本発明は、肝の糖取込み能を評価するための組成物、および、前記組成物を使用する、肝の糖取込み能を評価するための方法を提供することを目的とする。本発明はまた、肝の糖取込み能を評価するための方法を利用して、糖尿病発症の前段階にある対象動物において、糖尿病発症の前段階のステージを判定する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、^１３Ｃで標識したグルコースを対象動物に投与し、その挙動を観察することにより、肝の糖取込み能を評価できることを見いだした。

従って、ある態様では、本願は、対象動物の肝の糖取込み能を評価するための、^１３Ｃ標識グルコースを含む組成物を提供する。

ある態様では、本願は、対象動物の肝の糖取込み能を評価する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された前記対象動物から採取された血液を被験試料とし、被験試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する工程、
（２）前記濃度を指標値と比較し、前記対象動物の肝の糖取込み能を判定する工程、
を含む方法（以下、方法（Ｉ）と称する）を提供する。

ある態様では、本願は、対象動物の肝の糖取込み能を評価する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識グルコースを静脈投与された前記対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、
（２）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された前記対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、
（３）前記工程（１）で算出された割合と前記工程（２）で算出された割合の差異を算出する工程、
（４）前記工程（３）で算出された差異に基づいて、前記対象動物の肝の糖取込み能を判定する工程、
を含む方法（以下、方法（ＩＩ）と称する）を提供する。

ある態様では、本願は、糖尿病発症の前段階にある対象動物において、糖尿病発症の前段階のステージを判定する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から採取された血液を被験試料とし、被験試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する工程、
（２）前記濃度を指標値と比較し、糖尿病発症の前段階がステージＡまたはステージＢであると判定する工程、
を含む方法（以下、方法（ＩＩＩ）と称する）を提供する。

本発明により、対象動物の肝の糖取込み能を評価することができる。このような評価は、糖尿病等の代謝性疾患の診断、例えば、予防的観点からの診断に寄与し得る。

図１は、^１３Ｃ−グルコースを投与された６週齢ZDF fattyラットおよびZDF leanラットにおける、血中^１３Ｃ−グルコース濃度および呼気△^１３Ｃの測定結果を示す。 図２は、^１３Ｃ−グルコースを投与された７週齢ZDF fattyラットおよびZDF leanラットにおける、血中^１３Ｃ−グルコース濃度および呼気△^１３Ｃの測定結果を示す。 図３は、^１３Ｃ−グルコースを投与されたiLIRKOマウスにおける、血中^１３Ｃ−グルコース濃度および呼気△^１３Ｃの測定結果を示す。 図４は、^１３Ｃ−グルコースを静脈投与または経口投与されたZDF fattyラット、ZDF leanラットおよびSDラットにおける、呼気△^１３Ｃの測定結果を示す。 図５は、図４における静脈投与および経口投与の各々の呼気△^１３Ｃの測定結果についてＡＵＣを算出し、その差異を算出し、糖取り込み量（肝抽出量）としてグラフ化したものである。 図６は、ZDF fattyラット、ZDF leanラットおよびSDラットに^１３Ｃ−グルコースを経口投与し、門脈、肝静脈、下大静脈より採取した血液中の^１３Ｃ−グルコース濃度を測定した結果を示す。 図７は、図６の結果から各ラットにおける^１３Ｃ−グルコースの肝抽出率を算出した結果である。

特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。

本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。

^１３ Ｃ標識グルコースを含む組成物
本発明のある態様では、対象動物の肝の糖取込み能を評価するための、^１３Ｃ標識グルコースを含む組成物が提供される。^１３Ｃ標識グルコースは、これから糖代謝経路を経て生成されるＣＯ_２の少なくとも一部が^１３Ｃで標識されるように、標識されているものである。例えば、このようなグルコースとしては、グルコースの１位あるいは６位、２位あるいは５位、および３位あるいは４位のいずれか少なくとも１つの炭素原子が^１３Ｃである化合物、具体的には、１−^１３Ｃ標識グルコース、２−^１３Ｃ標識グルコース、３−^１３Ｃ標識グルコースを例示できる。またグルコースの１位、２位、３位、４位、５位および６位の複数または全ての炭素原子が^１３Ｃであってもよい。ある実施態様では、^１３Ｃ標識グルコース投与後、呼気中に^１３ＣＯ_２として排出される速さから、３位または４位の炭素原子が^１３Ｃであるグルコース、または、１位、２位、３位、４位、５位および６位の全ての炭素原子が^１３Ｃであるグルコースを用いる。

グルコースを^１３Ｃで標識する方法は、特に制限されず、通常使用される方法が広く採用される（佐々木、「５．１安定同位体の臨床診断への応用」：化学の領域107「安定同位体の医・薬学、生物学への応用」pp.149-163（1975）南江堂；梶原、RADIOISOTOPES，41，45-48（1992）等）。^１３Ｃ標識グルコースはいずれも商業的に入手し得、このような市販品を使用し得る。

前記組成物は、投与後、^１３Ｃ標識グルコースが体内に吸収され、代謝され、^１３Ｃ標識炭酸ガスとして呼気に排出されるものであればよく、それを満たすものである限り、その形態、^１３Ｃ標識グルコース以外の成分、各成分の配合割合、組成物の調製方法等は特に制限されない。

例えば、組成物の形態は、経口投与形態であっても、静脈投与形態であってもよい。前者の場合、液剤（シロップ剤を含む）、懸濁剤および乳剤などの液状形態；錠剤（裸剤、被覆剤を含む）、チュアブル錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤（粉末剤）、細粒剤および顆粒剤などの固形形態など、任意の経口投与形態を採用することができる。後者の場合、例えば注射剤や点滴剤の投与形態（液状、懸濁状または乳液状）を採用できる。ある実施態様では、組成物は経口投与形態である。別の実施態様では、組成物は静脈投与形態である。

また、組成物は、製剤形態を有するものに限らず、上記^１３Ｃ標識グルコースを含み、本発明の作用効果を妨げないものであればよく、上記^１３Ｃ標識グルコースを任意の食品素材と組み合わせて、固形食、流動食または液状食の形態を有するものであってもよい。

組成物は、実質上、上記^１３Ｃ標識グルコースだけからなるものであってもよいが、本発明の作用および効果を損なわない限り、他の成分として、各製剤形態（投与形態）に応じて、通常当業界において用いられる薬学上許容される任意の担体および添加物を配合した形態であってもよい。

この場合、配合する^１３Ｃ標識グルコースの量は、特に制限されることなく、例えば、組成物１００重量％中１〜９９重量％を挙げることができ、かかる範囲で適宜調整することができる。例えば、組成物に配合される^１３Ｃ標識グルコースの量は、後述の方法において１回あたりの投与量が適当な範囲になるように、適宜調節し得る。

組成物を、例えば点滴または注射剤などの液体、懸濁液または乳液の形態に調製するに際しては、各種形態に応じて、精製水または注射用蒸留水のほか、各種の担体または添加剤を用いることができる。例えば、添加剤としては、等張化剤（例えば塩化ナトリウムなど）、ｐＨ調整剤（例えば塩酸、水酸化ナトリウムなど）、緩衝剤（例えばホウ酸、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、保存剤（例えば塩化ベンザルコニウムなど）、増粘剤（例えばカルボキシビニルポリマーなど）のような通常用いられる添加剤を用いることができる。

また、組成物を、例えば錠剤、チュアブル錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤（粉末剤）、細粒剤、および顆粒剤などの固形形態に成形するに際しては、各種形態に応じて各種の担体または添加剤を用いることができる。

担体または添加剤として、例えば乳糖、白糖、デキストリン、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、リン酸二水素カルシウム、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、デキストリン、プルラン等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖、カルメロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポピドン等の崩壊剤；白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；ポリソルベート８０、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール、コロイド状ケイ酸、ショ糖脂肪酸類、硬化油等の滑沢剤；クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、無水リン酸一水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；酸化鉄、βカロテン、酸化チタン、食用色素、銅クロロフィル、リボフラビン等の着色剤；およびアスコルビン酸、塩化ナトリウム、各種甘味料等の矯味剤等を使用できる。

錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。またカプセル剤は常法に従い、^１３Ｃ標識グルコースを上記で例示した各種の担体と混合して硬化ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。

方法（Ｉ）
上記の組成物は、下記の方法（Ｉ）：
対象動物の肝の糖取込み能を評価する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から採取された血液を被験試料とし、被験試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する工程、
（２）前記濃度を指標値と比較し、対象動物の肝の糖取込み能を判定する工程、
を含む方法に使用し得る。

方法（Ｉ）に関して、「対象動物」は、いかなる哺乳動物であってもよい。例えば、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシおよびウマなどが例示され、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等が例示される。ある実施態様では、対象動物はヒト、ラットまたはマウスである。

方法（Ｉ）に関して、対象動物は、健康であってもよく、疾患、例えば、代謝性疾患を有してもよい。「健康である」とは、疾患の兆候および／または症状が認められていない状態を意味する。代謝性疾患には、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝、ウイルス性肝炎（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、アルコール性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、自己免疫性肝炎、肝硬変等の肝疾患、糖尿病、境界型糖尿病等の糖尿病前段階、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、肥満、脂質異常症、高血圧等が含まれる。対象動物は、これらの疾患を有することが疑われる対象動物であってもよい。

方法（Ｉ）に関して、対象動物は、^１３Ｃ標識グルコースを投与する直前に絶食状態であってもよく、非絶食状態であってもよい。^１３Ｃ標識グルコースを投与する直前に対象動物を絶食状態とする場合、対象動物に^１３Ｃ標識グルコースを投与する少なくとも２時間以上前、好ましくは少なくとも４時間以上前から絶食であることが例示され、水分は摂取してもよい。^１３Ｃ標識グルコースを投与する直前に対象動物を絶食状態としない場合は、通常食を通常通り摂取すればよい。

方法（Ｉ）に関して、「肝の糖取込み能」とは、経口摂取されたグルコースを肝臓が取り込む能力を意味する。肝臓は、空腹時などには肝静脈血にグルコースを供給し、栄養摂取時には門脈血からグルコースを取り込み、肝静脈血へのグルコース供給を減少させることにより、血糖値を一定に維持している。従って、門脈血から取り込まれるグルコースから肝静脈血へ供給されるグルコースを差し引いた量が、肝臓に取り込まれるグルコースの量である。方法（Ｉ）に関して、「肝の糖取込み能が低下する」とは、肝臓に取り込まれるグルコースの量が減少することを意味する。

方法（Ｉ）の工程（１）では、^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から採取された血液を被験試料とし、被験試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する。方法（Ｉ）に関して、対象動物に投与される^１３Ｃ標識グルコースの量は、適宜調節し得る。例えば、対象動物がヒト（成人）である場合５ｍｇ／体〜５０ｇ／体、好ましくは１０ｍｇ／体〜２５ｇ／体の範囲となるように調節し得る。

方法（Ｉ）の工程（１）では、^１３Ｃ標識グルコースを投与された対象動物から投与後の任意の時点ｔにおいて採取された血液を被験試料とし得る。即ち、被験試料は、^１３Ｃ標識グルコースを対象動物に投与してからｔ時間後に採取された血液であり得る。方法（Ｉ）に関して、該ｔ時間を血液採取時間ｔとも称する。

血液採取時間ｔは、当業者が適宜決定できる。例えば、対象動物への^１３Ｃ標識グルコース投与後５分間〜３６０分間の間のいずれかの時間が例示され、該範囲内で任意の時間を選択することができる。例えば、対象動物と同種の哺乳動物に^１３Ｃ標識グルコースを経口投与し、複数の時点で血液を採取し、各時点で血液中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定し、濃度が高い時点を選択し、血液採取時間ｔとすることができる。例えば、対象動物がラットである場合、血液採取時間ｔとしては、^１３Ｃ標識グルコース投与後約５〜１２０分間または約１０〜６０分間が例示される。例えば、対象動物がヒトである場合、呼気採取時間ｔとしては、^１３Ｃ標識グルコース投与後５〜２４０分間または１０〜１２０分間が例示される。他の対象動物については、該範囲を参考にして当業者が適宜決定し得る。

従来公知の方法に基づいて対象動物から血液を採取し得る。血液試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度の測定は、従来公知の手順に基づいて行えばよく、当業者に公知である。例えば、ＬＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ等の一般に使用される分析手法を用いて行うことができる。好ましくは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いる。

対象動物から複数の時点で採取した血液試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定し、血液中の^１３Ｃ標識グルコース濃度の経時的変化を示すグラフから、曲線下面積（Area under the curve；ＡＵＣ_ｔ）を算出してもよい。曲線下面積の算出は、従来公知の算出方法に従って行えばよく、当業者であれば容易に理解できる。例えば、縦軸を^１３Ｃ標識グルコース濃度とし、横軸を^１３Ｃ標識グルコース投与後の経過時間とした、^１３Ｃ標識グルコース濃度の経時的変化を示すグラフにおいて、その曲線下面積を算出する。例えば、縦軸を^１３Ｃ標識グルコース濃度とし、^１３Ｃ標識グルコースを対象動物に投与してから血液採取時間ｔまでの曲線下面積を、ＡＵＣ_ｔ−０と表すことができる。また、縦軸を^１３Ｃ標識グルコース濃度とし、血液採取時間ｔ_１から血液採取時間ｔ_２の間における曲線下面積を、ＡＵＣ_{ｔ２−ｔ１}と表すことができる。

方法（Ｉ）の工程（２）では、工程（１）で測定された濃度を指標値と比較し、対象動物の肝の糖取込み能を判定する。ある時点での濃度を比較してもよく、ＡＵＣを比較してもよい。この濃度は、対象動物の肝の糖取込み能を反映し、濃度が高いほど、肝臓に取り込まれるグルコースの割合は低い。指標値は、対象動物と同種の肝の糖取込み能が正常である動物群（対照群）において、対象動物と同等の条件下で、方法（Ｉ）の工程（１）を実施し、測定された濃度から得られる値であり得る。指標値は、被験値の測定と同時に、並行して、またはその前もしくは後に得られた値であってもよく、各被験動物種について予め定めた値であってもよい。肝の糖取込み能が正常である動物としては、代謝性疾患に罹患していない動物、通常の検査で肝臓の機能に異常が認められない動物、糖尿病、および、境界型糖尿病等の糖尿病発症の前段階のいずれでもない動物等が例示される。対象動物について工程（１）で測定された濃度が指標値よりも高い場合に、対象動物の肝の糖取込み能が低下していると判定し得る。

方法（Ｉ）により、対象動物の肝の糖取込み能を評価できる。肝の糖取込み能の評価は、代謝性疾患などの疾患の処置および／または予防に役立ち得る。また、後述する通り、方法（Ｉ）を応用して、糖尿病発症の前段階にある対象動物において、糖尿病発症の前段階のステージを判定することができる。

ある態様では、対象動物の肝の糖取込み能を評価する方法であって、
（１）対象動物に^１３Ｃ標識グルコースを経口投与する工程、
（２）前記対象動物から血液を採取する工程、
（３）前記血液中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する工程、
（４）前記濃度を指標値と比較し、対象動物の肝の糖取込み能を判定する工程、
を含む方法が提供される。

ある態様では、方法（Ｉ）に従って対象動物の肝の糖取込み能を評価するための、^１３Ｃ標識グルコースの使用が提供される。
ある態様では、方法（Ｉ）に従って対象動物の肝の糖取込み能を評価するための組成物を製造するための、^１３Ｃ標識グルコースの使用が提供される。

方法（ＩＩ）
上記の組成物は、下記の方法（ＩＩ）：
対象動物の肝の糖取込み能を評価する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識グルコースを静脈投与された対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、
（２）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、
（３）工程（１）で算出された割合と工程（２）で算出された割合の差異を算出する工程、
（４）工程（３）で算出された差異に基づいて、対象動物の肝の糖取込み能を判定する工程、
を含む方法に使用し得る。

方法（ＩＩ）に関して、「対象動物」は、いかなる哺乳動物であってもよい。例えば、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシおよびウマなどが例示され、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等が例示される。ある実施態様では、対象動物はヒト、ラットまたはマウスである。

方法（ＩＩ）に関して、対象動物は、健康であってもよく、疾患、例えば、代謝性疾患を有してもよい。「健康である」とは、疾患の兆候および／または症状が認められていない状態を意味する。代謝性疾患には、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝、ウイルス性肝炎（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、アルコール性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、自己免疫性肝炎、肝硬変等の肝疾患、糖尿病、境界型糖尿病等の糖尿病前段階、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、肥満、脂質異常症、高血圧等が含まれる。対象動物は、これらの疾患を有することが疑われる対象動物であってもよい。

方法（ＩＩ）に関して、対象動物は、^１３Ｃ標識グルコースを投与する直前に絶食状態であってもよく、非絶食状態であってもよい。^１３Ｃ標識グルコースを投与する直前に対象動物を絶食状態とする場合、対象動物に^１３Ｃ標識グルコースを投与する少なくとも２時間以上前、好ましくは少なくとも４時間以上前から絶食であることが例示され、水分は摂取してもよい。^１３Ｃ標識グルコースを投与する直前に対象動物を絶食状態としない場合は、通常食を通常通り摂取すればよい。

方法（ＩＩ）に関して、「肝の糖取込み能」とは、経口摂取されたグルコースを肝臓が取り込む能力を意味する。肝臓は、空腹時などには肝静脈血にグルコースを供給し、栄養摂取時には門脈血からグルコースを取り込み、肝静脈血へのグルコース供給を減少させることにより、血糖値を一定に維持している。従って、門脈血から取り込まれるグルコースから肝静脈血へ供給されるグルコースを差し引いた量が、肝臓に取り込まれるグルコースの量である。方法（ＩＩ）に関して、「肝の糖取込み能が低下する」とは、肝臓に取り込まれるグルコースの量が減少することを意味する。

方法（ＩＩ）の工程（１）では、^１３Ｃ標識グルコースを静脈投与された対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する。工程（２）では、^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する。上記の組成物を静脈投与または経口投与することにより、^１３Ｃ標識グルコースを静脈投与または経口投与し得る。^１３Ｃ標識グルコースの静脈投与と経口投与は、少なくとも６時間の期間、例えば、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日の期間を隔てて実施することが好ましい。工程（１）と工程（２）のどちらを先に実施してもよい。

方法（ＩＩ）に関して、対象動物に投与される^１３Ｃ標識グルコースの量は、適宜調節し得る。例えば、対象動物がヒト（成人）である場合５ｍｇ／体〜５０ｇ／体、好ましくは１０ｍｇ／体〜２５ｇ／体の範囲となるように調節し得る。工程（１）と工程（２）における投与量は同じであっても異なっていてもよい。

方法（ＩＩ）の工程（１）および（２）では、^１３Ｃ標識グルコースを静脈投与または経口投与された対象動物から投与後の任意の時点ｔにおいて排出された呼気を被験試料とし得る。即ち、被験試料は、^１３Ｃ標識グルコースを対象動物に投与してからｔ時間後に採取された呼気であり得る。本明細書において、該ｔ時間を呼気採取時間ｔとも称する。

呼気採取時間ｔは、当業者が適宜決定できる。例えば、対象動物への^１３Ｃ標識グルコース投与後５分間〜２４０分間の間のいずれかの時間が例示され、該範囲内で任意の時間を選択することができる。例えば、対象動物と同種の哺乳動物に^１３Ｃ標識グルコースを静脈または経口投与し、経時的に呼気を採取し、各時点で呼気中の総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出し、^１３ＣＯ_２量の割合が高い時点を選択し、呼気採取時間ｔとすることができる。例えば、対象動物がラットである場合、呼気採取時間ｔとしては、^１３Ｃ標識グルコース投与後約５〜１２０分間または約１０〜６０分間が例示される。例えば、対象動物がヒトである場合、呼気採取時間ｔとしては、^１３Ｃ標識グルコース投与後５〜２４０分間または１０〜１２０分間が例示される。他の対象動物については、該範囲を参考にして当業者が適宜決定し得る。

対象動物から排出された呼気は、従来公知の呼気試験の方法に基づいて採取し得る。呼気試料中に含まれる^１３ＣＯ_２、非標識ＣＯ_２、総ＣＯ_２の測定、分析は従来公知の手順に基づいて行えばよく、当業者に公知である。例えば、^１３ＣＯ_２の測定、分析は、通常、液体シンチレーションカウンター法、質量分析法、赤外分光分析法、発光分析法、磁気共鳴スペクトル法等の一般に使用される分析手法を用いて行うことができる。好ましくは、赤外分光分析法または質量分析法を用いる。

方法（ＩＩ）の工程（１）および（２）では、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する。呼気中の炭酸ガスの割合を求める手順は従来公知の手順に従えばよく、例えば以下のように説明される（「^１３Ｃ−呼気試験の実際 基礎と実践的応用 第８項：^１３Ｃ−呼気試験データ解析法」、松林恒夫、松山渉、^１３Ｃ医学応用研究会、ｐｐ．１０２−１１１参照）。

（１）δ^１３Ｃ値（‰）
同位体の存在比を表す場合、同一元素の中で最も組成比の高い元素を分母にした同位体比（Ｒ）を用いる。従って、炭素１３（^１３Ｃ）のＲ値は、炭素１２（^１２Ｃ）を分母とした次式で表される。

Ｒは非常に小さい数値であるため、直接測定することは困難である。より正確に定量するため、質量分析計を用いる場合には、常に標準物質との比較が行われ、測定結果は、次式で定義されるδ値で表される。

なお、標準ガスとして、石灰石由来の炭酸ガス（ＰＤＢ）を使用する場合、Ｒ_ＳＴＤは、Ｒ_ＰＤＢ＝０．０１１２３７２である。

（２）Δ^１３Ｃ値（‰）
Δ^１３Ｃ値（‰）は、下式で示すように、試薬投与前のδ^１３Ｃ値（すなわち天然に存在する^１３Ｃのδ値）をバックグラウンドとして、これを、試薬投与後のδ^１３Ｃ値から差し引いた値（Δ^１３Ｃ）を意味する。

（３）呼気中の^１３Ｃ濃度（％^１３Ｃ：ａｔｏｍ％）
呼気中の^１３Ｃ濃度（％^１３Ｃ：ａｔｏｍ％）は下式で定義される。

前記（１）で定義した相対値δ^１３Ｃ値を、一般的な濃度の概念である総炭素中の^１３Ｃ含量（％）の形に変換するには、下記の方法を用いることができる。
まず、上記式の右辺の分母子を^１２Ｃで割り、（式１）に基づいてＲに変換すると、下記の通りになる。

このＲに、（式２）で求めたＲ_ＳＡＭを代入して整理すると、次式となり、δ^１３Ｃ値を用いて^１３Ｃ濃度（％^１３Ｃ）を表すことができる。

（４）^１３Ｃ濃度の変化量（Δ％^１３Ｃ）
呼気中の^１３Ｃ濃度（％^１３Ｃ）の変化量（Δ％^１３Ｃ）は、次式で定義されるように、試薬投与ｔ時間後の^１３Ｃ濃度〔（％^１３Ｃ）_ｔ〕から試薬投与前０時間の^１３Ｃ濃度〔（％^１３Ｃ）_０〕を差し引いて求められる。

（５）δ^１３Ｃ値（‰）と^１３Ｃ濃度変化量（Δ％^１３Ｃ）との関係
^１３Ｃの天然存在比（Ｒ）は約０．０１１であり、標識試薬を投与した場合でも呼気中への増加量はわずかに＋０．００１〜０．００２程度である。そこで、天然存在比Ｒ→０とみなすことができ、％^１３ＣをＲで表した（式４）は、次式で近似することができる。

この近似式を用いて、まずδ^１３Ｃの定義である（式２）よりＲ_ＳＡＭを求めて上記式のＲに代入して整理すると、^１３Ｃ濃度を求める近似（式７）が得られる。

これを（式６）に代入すると、下式（式８）に示すように、Δ^１３ＣからΔ％^１３Ｃを算出することができる。

方法（ＩＩ）の工程（１）および（２）では、採取した呼気に含まれる炭酸ガスの存在比（非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合）を、下記の方法に従って^１３Ｃ濃度の変化量（Δ％^１３Ｃ）として算出し得る。

具体的には、下式に従って、^１３Ｃ標識グルコースの対象動物への投与後の任意の時点ｔに採取された呼気に含まれる総炭素中の^１３Ｃ濃度（呼気中の^１３Ｃ濃度、^１３Ｃ濃度ａｔｏｍ％、（％^１３Ｃ）_ｔ）を求める。同様に、^１３Ｃ標識グルコースの対象動物への投与前に予め採取された呼気、好ましくは投与前０時間に採取された呼気に含まれる総炭素中の^１３Ｃ濃度（呼気中の^１３Ｃ濃度、^１３Ｃ濃度ａｔｏｍ％、（％^１３Ｃ）_０）を求める。更に、上記式６に従って、（％^１３Ｃ）_ｔから（％^１３Ｃ）_０を差し引いて、^１３Ｃ濃度の変化量（Δ％^１３Ｃ（ａｔｏｍ％））を求める。

なお、必要に応じて前記^１３Ｃ濃度の変化量（Δ％^１３Ｃ）は、上記式５および式３に基づいて、Δ^１３Ｃ（‰）（δ^１３Ｃ値変化量（‰）またはＤＯＢ（‰））に換算してもよい。

また、呼気に含まれる非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合は、Δ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）の経時的変化を示すグラフにおける曲線下面積（Area under the curve；ＡＵＣ_ｔ）として算出してもよい。曲線下面積の算出は、従来公知の算出方法に従って行えばよく、当業者であれば容易に理解できる。例えば、縦軸をΔ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）とし、横軸を^１３Ｃ標識グルコース投与後の経過時間とした、Δ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）の経時的変化を示すグラフにおいて、その曲線下面積を算出する。例えば、縦軸をΔ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）とし、^１３Ｃ標識グルコースを対象動物に投与してから呼気採取時間ｔの間における曲線下面積を、ＡＵＣ_ｔ−０と表すことができる。また、縦軸をΔ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）とし、呼気採取時間ｔ_１から呼気採取時間ｔ_２の間における曲線下面積を、ＡＵＣ_{ｔ２−ｔ１}と表すことができる。

方法（ＩＩ）の工程（３）では、工程（１）で算出された割合と工程（２）で算出された割合の差異を算出する。これらの割合は、同じ呼気採取時間ｔにおけるΔ％^１３Ｃ、Δ^１３Ｃ（‰）またはＡＵＣ_ｔ−０であってもよく、同じ呼気採取時間ｔ_１から呼気採取時間ｔ_２におけるＡＵＣ_{ｔ２−ｔ１}であってもよい。好ましくは、ＡＵＣ_ｔ−０またはＡＵＣ_{ｔ２−ｔ１}の差異を算出する。

方法（ＩＩ）の工程（４）では、工程（３）で算出された差異に基づいて、対象動物の肝の糖取込み能を判定する。この差異は、対象動物の肝の糖取込み能を反映し、差異が大きいほど、肝臓に取り込まれるグルコースの割合は高い。工程（４）では、この差異を指標値と比較して、対象動物の肝の糖取込み能を判定してもよい。指標値は、対象動物と同種の肝の糖取込み能が正常である動物群（対照群）において、対象動物における差異の算出と同等の条件下で、方法（ＩＩ）の工程（１）ないし（３）を実施し、算出された差異から得られる値であり得る。指標値は、被験値の測定と同時に、並行して、またはその前もしくは後に得られた値であってもよく、各被験動物種について予め定めた値であってもよい。肝の糖取込み能が正常である動物としては、代謝性疾患に罹患していない動物、通常の検査で肝臓の機能に異常が認められない動物、糖尿病、および、境界型糖尿病等の糖尿病発症の前段階のいずれでもない動物等が例示される。対象動物について工程（３）で算出された差異が指標値よりも小さい場合に、対象動物の肝の糖取込み能が低下していると判定し得る。さらに、方法（ＩＩ）の工程（４）では、対象動物の肝の糖取込み能を、グルコースの取込み量または取込み割合として、公知の方法により定量的に評価することもできる。

後述する実施例で立証される通り、方法（ＩＩ）により判定された肝の糖取込み能は、門脈、肝静脈および下大静脈から採取された血液の血糖値から算出された肝抽出率を反映するものである。門脈、肝静脈および下大静脈からの血液の採取には高度な技術が必要であり、対象動物の身体的負担が大きく、実際の医療の現場では採用しにくい。方法（ＩＩ）では、対象動物は通常の静脈投与および経口投与および呼気採取を受ければよく、小さい負担で肝の糖取込み能を評価し得る。肝の糖取込み能の評価は、代謝性疾患などの疾患の処置および／または予防に役立ち得る。

ある態様では、対象動物の肝の糖取込み能を評価する方法であって、
（１−１）対象動物に^１３Ｃ標識グルコースを静脈投与する工程、
（１−２）前記対象動物から排出された呼気を採集する工程、
（１−３）前記呼気に含まれる非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、
（２−１）対象動物に^１３Ｃ標識グルコースを経口投与する工程、
（２−２）前記対象動物から排出された呼気を採集する工程、
（２−３）前記呼気に含まれる非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、
（３）工程（１−３）で算出された割合と工程（２−３）で算出された割合の差異を算出する工程、
（４）工程（３）で算出された差異に基づいて、対象動物の肝の糖取込み能を判定する工程、
を含む方法が提供される。

ある態様では、方法（ＩＩ）に従って対象動物の肝の糖取込み能を評価するための、^１３Ｃ標識グルコースの使用が提供される。
ある態様では、方法（ＩＩ）に従って対象動物の肝の糖取込み能を評価するための組成物を製造するための、^１３Ｃ標識グルコースの使用が提供される。

方法（ＩＩＩ）
上記の組成物は、下記の方法（ＩＩＩ）：
糖尿病発症の前段階にある対象動物において、糖尿病発症の前段階のステージを判定する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から採取された血液を被験試料とし、被験試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する工程、
（２）前記濃度を指標値と比較し、糖尿病発症の前段階がステージＡまたはステージＢであると判定する工程、
を含む方法に使用し得る。

方法（ＩＩＩ）に関して、「対象動物」は、いかなる哺乳動物であってもよい。例えば、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシおよびウマなどが例示され、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等が例示される。ある実施態様では、対象動物はヒト、ラットまたはマウスである。

方法（ＩＩＩ）に関して、「糖尿病発症の前段階」とは、糖尿病の病態ステージにおいて、血糖値は正常の範囲内あるいはやや高めであるが、血中インスリン濃度が非常に高い段階あるいは肝での糖取込み能が低下している段階を意味する。糖尿病発症の前段階は、境界型糖尿病（血糖値が正常よりも高いが、糖尿病の診断基準には該当しない段階）も含む。糖尿病発症の前段階にある対象動物は、生活習慣を改善しなければ、糖尿病に至るリスクを有する。

糖尿病発症の前段階は、さらに、ステージＡとステージＢに分類される。ステージＡはインスリン分泌亢進段階であり、ステージＢは糖の肝臓抽出率低下段階（即ち、肝での糖取込み能低下段階）である。ステージＡからＢに移行することもあり、ステージＢからＡに移行することもある。後述する実施例により立証される通り、方法（ＩＩＩ）に従って測定した血中^１３Ｃ標識グルコース濃度は、ステージＡにおいて低く、ステージＢにおいて高い。下表は、糖尿病の各病態ステージにおける、各パラメーターの状態を示す。

表中、→は各パラメーターの値が正常範囲内にあることを示す。
→↑は、各パラメーターの値が正常範囲か正常範囲よりやや高いことを示す。
↑は、各パラメーターの値が正常範囲より高いことを示す。
↑↑は、各パラメーターの値が正常範囲より非常に高いことを示す。
↓は、各パラメーターの値が正常範囲より低いことを示す。
↓↓は、各パラメーターの値が正常範囲より非常に低いことを示す。

各パラメーターの正常範囲は、各国で定められている糖尿病の診断基準に基づいて決定し得る。例えば、「糖尿病診療ガイドライン２０１６」によると、日本における血糖値の正常範囲は「空腹時で１１０ｍｇ／ｄＬ未満」とされており、これに基づいて、例えば、血糖値の正常範囲を１１０ｍｇ／ｄＬ未満とすることができる。あるいは、正常範囲は、対象動物と同種の糖尿病および境界型糖尿病等の糖尿病発症の前段階のいずれにも罹患していない動物群（対照群）において測定された各パラメーターの値に基づいて決定し得る。

対象動物が糖尿病発症の前段階にあることは、いかなる方法によって判定されてもよい。例えば、国際公開第２０１４／０３０６５０号に記載の通り、^１３Ｃ標識グルコース投与後の呼気に含まれる^１３ＣＯ_２量により判定され得る。例えば、
（ａ）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、
（ｂ）前記割合を指標値と比較し、対象動物の糖代謝能を判定する工程、ここで、指標値は、対象動物と同種の糖代謝能が正常である動物群において工程（ａ）に従って測定された割合から得られる値である、
（ｃ）工程（ｂ）において、前記割合が指標値よりも高い場合に、対象動物が糖尿病発症の前段階にあると判定する工程、
を含む方法により判定され得る。

工程（ａ）は、方法（ＩＩ）の工程（２）に準じて実施し得る。工程（ｂ）では、工程（ａ）で算出された割合を指標値と比較し、対象動物の糖代謝能を判定する。ある時点でのΔ％^１３ＣまたはΔ^１３Ｃ（‰）を比較してもよく、ＡＵＣを比較してもよい。この割合は、対象動物の肝の糖代謝能を反映し、割合が高いほど、糖代謝能は高い。指標値は、対象動物と同種の糖代謝能が正常である動物群（対照群）において、対象動物と同等の条件下で、工程（ａ）を実施し、測定された濃度から得られる値であり得る。指標値は、被験値の測定と同時に、並行して、またはその前もしくは後に得られた値であってもよく、各被験動物種について予め定めた値であってもよい。糖代謝能が正常である動物としては、代謝性疾患に罹患していない動物、通常の検査で肝臓の機能に異常が認められない動物、糖尿病、および、境界型糖尿病等の糖尿病発症の前段階のいずれでもない動物等が例示される。対象動物について工程（ａ）で測定された割合が指標値よりも高い場合に、対象動物が糖尿病発症の前段階にあると判定し得る。

方法（ＩＩＩ）の工程（１）では、^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から採取された血液を被験試料とし、被験試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する。この工程の詳細は、上記方法（Ｉ）の工程（１）と同様である。

方法（ＩＩＩ）の工程（２）では、工程（１）で測定された濃度を指標値と比較し、糖尿病発症の前段階がステージＡまたはステージＢであると判定する。ある時点での濃度を比較してもよく、ＡＵＣを比較してもよい。この濃度は、対象動物の肝の糖取込み能を反映し、濃度が高いほど、肝臓に取り込まれるグルコースの割合は低い。指標値は、対象動物と同種の肝の糖取込み能が正常である動物群（対照群）において、対象動物と同等の条件下で、方法（ＩＩＩ）の工程（１）を実施し、測定された濃度から得られる値であり得る。指標値は、被験値の測定と同時に、並行して、またはその前もしくは後に得られた値であってもよく、各被験動物種について予め定めた値であってもよい。肝の糖取込み能が正常である動物としては、代謝性疾患に罹患していない動物、通常の検査で肝臓の機能に異常が認められない動物、糖尿病、および、境界型糖尿病等の糖尿病発症の前段階のいずれでもない動物等が例示される。対象動物について工程（１）で測定された濃度が指標値よりも低い場合に、糖尿病発症の前段階がステージＡであると判定し得、前記濃度が指標値よりも高い場合に、糖尿病発症の前段階がステージＢであると判定し得、前記濃度が指標値と同等である場合に、糖尿病発症の前段階がステージＡからステージＢ、または、ステージＢからステージＡへの移行期にあると判定し得る。

後述する実施例で立証される通り、方法（ＩＩＩ）により、糖尿病発症の前段階のステージを判定し得る。これまで糖尿病発症の前段階のステージを判定する方法は存在しなかった。方法（ＩＩＩ）は、糖尿病発症の前段階のステージを判定することを可能にし、より効果的な糖尿病の予防に役立つことが期待される。

ある態様では、糖尿病発症の前段階にある対象動物において、糖尿病発症の前段階のステージを判定する方法であって、
（１）糖尿病発症の前段階にある対象動物に^１３Ｃ標識グルコースを経口投与する工程、
（２）前記対象動物から血液を採取する工程、
（３）前記血液中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する工程、
（４）前記濃度を指標値と比較し、糖尿病発症の前段階がステージＡまたはステージＢであると判定する工程、
を含む方法が提供される。

ある態様では、方法（ＩＩＩ）に従って糖尿病発症の前段階にある対象動物において糖尿病発症の前段階のステージを判定するための、^１３Ｃ標識グルコースを含む組成物が提供される。
ある態様では、方法（ＩＩＩ）に従って糖尿病発症の前段階にある対象動物において糖尿病発症の前段階のステージを判定するための、^１３Ｃ標識グルコースの使用が提供される。
ある態様では、方法（ＩＩＩ）に従って糖尿病発症の前段階にある対象動物において糖尿病発症の前段階のステージを判定するための組成物を製造するための、^１３Ｃ標識グルコースの使用が提供される。

例えば、本願は下記の実施態様を提供する。
［１］対象動物の肝の糖取込み能を評価するための、^１３Ｃ標識グルコースを含む組成物。
［２］経口投与用である、第１項に記載の組成物。
［３］静脈投与用である、第１項に記載の組成物。
［４］対象動物の肝の糖取込み能を評価する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から採取された血液を被験試料とし、被験試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する工程、
（２）前記濃度を指標値と比較し、対象動物の肝の糖取込み能を判定する工程、
を含む方法。
［５］前記工程（２）における指標値が、対象動物と同種の肝の糖取込み能が正常である動物群において前記工程（１）に従って測定された濃度から得られる値である、第４項に記載の方法。
［６］前記工程（２）において、前記濃度が前記指標値よりも高い場合に、対象動物の肝の糖取込み能が低下していると判定する、第５項に記載の方法。
［７］対象動物の肝の糖取込み能を評価する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識グルコースを静脈投与された対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、
（２）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、
（３）前記工程（１）で算出された割合と前記工程（２）で算出された割合の差異を算出する工程、
（４）前記工程（３）で算出された差異に基づいて、対象動物の肝の糖取込み能を判定する工程、
を含む方法。
［８］前記工程（４）が、対象動物と同種の肝の糖取込み能が正常である動物群において前記工程（１）ないし（３）を実施し、算出された差異から得られる値を指標値とし、対象動物について前記工程（３）で算出された差異を指標値と比較することを含む、第７項に記載の方法。
［９］対象動物について前記工程（３）で算出された差異が前記指標値よりも小さい場合に、対象動物の肝の糖取込み能が低下していると判定する、第８項に記載の方法。
［１０］前記工程（３）で算出された差異に基づいて肝の糖取込み量を算出する工程をさらに含む、第７項ないし第９項のいずれかに記載の方法。
［１１］糖尿病発症の前段階にある対象動物において糖尿病発症の前段階のステージを判定するための、^１３Ｃ標識グルコースを含む組成物。
［１２］糖尿病発症の前段階にある対象動物において、糖尿病発症の前段階のステージを判定する方法であって、
（１）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された対象動物から採取された血液を被験試料とし、被験試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する工程、
（２）前記濃度を指標値と比較し、糖尿病発症の前段階がステージＡまたはステージＢであると判定する工程、
を含む方法。
［１３］前記工程（２）における指標値が、対象動物と同種の肝の糖取込み能が正常である動物群において前記工程（１）に従って測定された濃度から得られる値である、第１２項に記載の方法。
［１４］前記工程（２）において、前記濃度が前記指標値よりも低い場合に、糖尿病発症の前段階がステージＡであると判定する、第１３項に記載の方法。
［１５］前記ステージＡが、インスリン分泌亢進段階である、第１４項に記載の方法。
［１６］前記工程（２）において、前記濃度が前記指標値よりも高い場合に、糖尿病発症の前段階がステージＢであると判定する、第１３項に記載の方法。
［１７］前記ステージＢが、肝の糖取込み能低下段階である、第１６項に記載の方法。
［１８］前記対象動物が糖尿病発症の前段階にあることが、
（ａ）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された前記対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、
（ｂ）前記割合を指標値と比較し、前記対象動物の糖代謝能を判定する工程、ここで、指標値は、前記対象動物と同種の糖代謝能が正常である動物群において工程（ａ）に従って測定された割合から得られる値である、
（ｃ）前記工程（ｂ）において、前記割合が前記指標値よりも高い場合に、前記対象動物が糖尿病発症の前段階にあると判定する工程、
を含む方法により判定される、第１２項ないし第１７項のいずれかに記載の方法。

本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、発明を説明するためだけに供されるものである。

使用動物
Zucker Diabetic Fatty Rat (ZDF-Lepr^fa/CrlCrlj)(日本チャールスリバー株式会社、神奈川、日本）を用いた。
ZDF fatty ラット：肥満遺伝子であるレプチン受容体変異をホモで有する（Lepr^fa/Lepr^fa）ラット。８週齢程度で高脂血症と高血糖を呈し、１２週程度で２型糖尿病を呈することから糖尿病モデル動物として用いた。
ZDF Lean ラット:優性遺伝子ホモ接合体（＋/＋）またはヘテロ接合体(Lepr^fa/+)を有するラット。正常血糖値を示す。ZDF fattyラットの対照として用いた。

実施例１：糖尿病発症の前段階における ^１３ Ｃグルコース血中濃度および呼気△ ^１３ Ｃによる肝の糖取込み能評価
実施例１−１；６週齢ZDF fattyラットの肝の糖取込み能評価
絶食ZDF fattyラット（６週齢；ｎ＝４）およびZDF leanラット（６週齢；ｎ＝４）に、^１３Ｃ_６−グルコース（13C₆-Glucose [D-GLUCOSE(U-13C₆、99％)], Cambridge Isotope Laboratories, Inc（Andover, MA, USA））を１０ｍｇ／ｋｇ経口投与し、投与前および投与後、経時的に血液および呼気を採取した。得られた呼気の△^１３ＣをＧＣ／ＭＳにて測定した。血中^１３Ｃ_６−グルコース濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて測定した。また、グルコース投与前に絶食中の各ラットの血糖値を測定した。

結果を図１に示す。６週齢のZDF fattyラットの血糖値は８８ｍｇ／ｄＬであり、呼気の△^１３ＣがZDF leanラットより高く推移したことから、糖尿病の発症は認めないが糖代謝が亢進している状態、即ち、糖尿病発症の前段階にあると判定された。ZDF fattyラットの血中^１３Ｃ_６グルコース濃度は、ZDF Leanラットよりも低く推移した。従って、６週齢のZDF fattyラットでは、肝の糖取込み能が低下しておらず、糖尿病発症の前段階のステージＡ、即ち、インスリン分泌亢進段階にあることが示唆された。

実施例１−２；７週齢ZDF fattyラットの肝の糖取込み能評価
絶食ZDF leanラット（７週齢；ｎ＝４）およびZDF fattyラット（７週齢；ｎ＝４）に、^１３Ｃ_６−グルコースを１０ｍｇ／ｋｇ経口投与し、投与前および投与後、経時的に血液および呼気を採取した。得られた呼気の△^１３ＣをＧＣ／ＭＳにて測定した。血中^１３Ｃ_６−グルコース濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて測定した。また、グルコース投与前に絶食中の各ラットの血糖値を測定した。

結果を図２に示す。７週齢のZDF fattyラットの血糖値は８８ｍｇ／ｄＬであり、呼気の△^１３ＣがZDF leanラットより高く推移したことから、糖尿病の発症は認めないが糖代謝が亢進している状態、即ち、糖尿病発症の前段階であると判定された。ZDF fattyラットの血中^１３Ｃ_６グルコース濃度は、ZDF Leanラットよりも高く推移した。従って、７週齢のZDF fattyラットは、肝の糖取込み能が低下しており、糖尿病発症の前段階のステージＢ、即ち、肝臓抽出率低下段階にあることが示唆された。

実施例１−３；iLIRKOマウスの肝の糖取込み能評価
iLIRKOマウス（誘導性肝臓特異的インスリン受容体欠損マウス：inducible Liver-specific insulin receptor KO mice）は、後天的に肝臓単独でインスリン受容体をノックアウトできるマウスであり、糖尿病発症の前段階のステージＢ（肝臓抽出率低下段階）のモデルとして使用できる（Michael MD, et al., Loss of insulin signaling in hepatocytes leads to severe insulin resistance and progressive hepatic dysfunction. Mol Cell 2000; 6(1): 87-97）。iLIRKOマウス（２〜３ヶ月齢、ｎ＝５）および対照であるIRfloxマウス（２〜３ヶ月齢、ｎ＝５）に、^１３Ｃ_６−グルコースを１０ｍｇ／ｋｇ経口投与し、投与前および投与後、経時的に血液および呼気を採取した。得られた呼気の△^１３ＣをＧＣ／ＭＳにて測定した。血中^１３Ｃ_６−グルコース濃度はＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて測定した。

結果を図３に示す。iLIRKOマウスの呼気の△^１３Ｃおよび血中^１３Ｃ_６−グルコース濃度は、IRfloxマウスよりも高く推移した。この結果は、実施例１−２の結果と合致する。iLIRKOマウスにおいては、肝臓以外の臓器の糖代謝は正常であり、呼気の△^１３Ｃは高いが、肝臓における糖の取り込み能は低く、血中^１３Ｃ_６−グルコース濃度が対照に比べて上昇したものと考えられる。

実施例２： ^１３ Ｃ標識グルコースのｉｖ摂取およびｐｏ摂取後の呼気△ ^１３ Ｃによる糖取込み能評価
実施例２−１： ^１３ Ｃ標識グルコースのｉｖ、ｐｏ摂取後の呼気△ ^１３ Ｃの推移
非絶食状態のZDF fattyラット（１８週齢；ｎ＝６）、ZDF leanラット（１８週齢；ｎ＝６）およびＳＤラット（１４週齢；ｎ＝３）に、^１３Ｃ_６−グルコースを１０ｍｇ／ｋｇ経口投与し、投与前および投与後に、経時的に呼気を採取し、得られた呼気のΔ^１３ＣをＧＣ／ＭＳにて測定した。経口投与の３日後に、非絶食状態の同じラットに、^１３Ｃ_６−グルコースを１０ｍｇ／ｋｇ静脈投与し、投与前および投与後に、経時的に呼気を採取し、得られた呼気のΔ^１３ＣをＧＣ／ＭＳにて測定した。

結果を図４に示す。糖尿病モデルであるZDF fattyラットでは、経口投与と静脈投与で呼気試験の結果にほとんど差はなかった。一方、対照であるZDF leanラットおよびＳＤラットでは、経口投与と静脈投与の呼気試験の結果に差が認められ、静脈投与の方が呼気のΔ^１３Ｃは高かった。経口投与されたグルコースは必ず肝臓を通過するが、静脈投与されたグルコースは肝臓を通過しないことから、呼気のΔ^１３Ｃの差異は肝臓における糖取り込みを反映すると考えられる。

さらに、静脈投与および経口投与の各々の呼気△^１３Ｃの測定結果についてＡＵＣを算出し、その差異を糖取り込み量（肝抽出量）としてグラフ化した（図５）。肝抽出量はＳＤラットで最も高く、次いでZDF leanラット、ZDF fattyラットの順であり、糖尿病モデルであるZDF fattyラットでは糖の肝抽出量が低いことが示された。また、ZDF fattyラットがホモで有する遺伝子変異をヘテロで有するZDF leanラットの肝抽出量は、この遺伝子変異を有さないＳＤラットの肝抽出量よりも低かった。

実施例２−２：血中 ^１３ Ｃ標識グルコース濃度による肝抽出率の測定
非絶食の各ラット（ZDF lean、ZDF fatty、ＳＤ、各ｎ＝１２）に、^１３Ｃ_６−グルコースを１０ｍｇ／ｋｇ経口投与した。投与の５分、１０分および３０分後に、各群のラットを４匹ずつ安楽死させて開腹し、門脈、肝静脈、下大静脈より同時に採血した。血中^１３Ｃ_６−グルコース濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて測定した。結果を図６に示す。全てのラットにおいて、グルコース投与の５分および１０分後の血中濃度は門脈で高く、次いで肝静脈、下大静脈の順であった。

これらの血中濃度を下記の計算式にあてはめ、^１３Ｃ_６−グルコースの肝抽出率を算出した。

結果を図７に示す。肝抽出率はＳＤラットで最も高く、次いでZDF leanラット、ZDF fattyラットの順であった。この結果は、実施例２−１の結果と合致し、実施例２−１における^１３Ｃ標識グルコースの静脈投与および経口投与の呼気△^１３Ｃによる糖取込み能評価が、実際の肝抽出率を反映するものであることが示された。

本発明により、対象動物の肝の糖取込み能を評価することができる。このような評価は、糖尿病等の代謝性疾患の診断、例えば、予防的観点からの診断に寄与し得、適切な対象動物における代謝性疾患の予防を促進することにより、医療経済に貢献し得る。

Claims (7)

1. 糖尿病発症の前段階にある対象動物において、糖尿病発症の前段階がインスリン分泌亢進段階または肝の糖取込み能低下段階であると判定するために、
   （１）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された前記対象動物から採取された血液を被験試料とし、被験試料中の^１３Ｃ標識グルコース濃度を測定する工程、
   （２）前記濃度を指標値と比較する工程、
   を含む方法。
2. 前記工程（２）における指標値が、前記対象動物と同種の肝の糖取込み能が正常である動物群において前記工程（１）に従って測定された濃度から得られる値である、請求項１に記載の方法。
3. 前記濃度が前記指標値よりも低い場合に、糖尿病発症の前段階がインスリン分泌亢進段階であると判定するための、請求項２に記載の方法。
4. 前記濃度が前記指標値よりも高い場合に、糖尿病発症の前段階が肝の糖取込み能低下段階であると判定するための、請求項２に記載の方法。
5. 前記対象動物が、
   （ａ）^１３Ｃ標識グルコースを経口投与された前記対象動物から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ_２量または総ＣＯ_２量に対する^１３ＣＯ_２量の割合を算出する工程、および
   （ｂ）前記割合を指標値と比較する工程、ここで、指標値は、前記対象動物と同種の糖代謝能が正常である動物群において工程（ａ）に従って測定された割合から得られる値である、
   を含む方法により、前記割合が前記指標値よりも高いものである、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の方法。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の方法において使用するための、^１３Ｃ標識グルコースを含む組成物。
7. 経口投与用である、請求項６に記載の組成物。

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