DE69716838T2 - Diagnostisches Mittel für Diabetes - Google Patents

Diagnostisches Mittel für Diabetes

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Diagnose von Diabetes, insbesondere ein Mittel zur Diagnose von Diabetes, beinhaltend an einer bestimmten Position mit ¹³C markierte Glucose oder an einer bestimmten Position mit ¹³C markierte Brenztraubensäure.
  • Bei den Testverfahren, die im allgemeinen beim Primärscreening bei der Diagnose von Diabetes verwendet werden, handelt es sich um den Harnzuckertest und die Untersuchung des Nüchternwerts des Blutzuckerspiegels. Diese Tests sind einfach und hochspezifisch, jedoch wenig empfindlich und führen bei Patienten mit leichtem Diabetes zu negativen Ergebnissen, so dass 70% oder mehr Patienten nicht erfasst werden; diese Tests werden als unzureichend für das Screening von Diabetes betrachtet. (Sekikawa et al., Medical Practice 10: 63, 1993). Einerseits führt der für die Diagnose von Diabetes verwendete Glucosetoleranztest aufgrund der Verabreichung einer großen Glucosemenge zu Nebenwirkungen, und der Patient muss bei diesem Test mehrere Stunden im Labor bleiben und man muss wiederholt Blut abnehmen, was für den Patienten körperlich sehr belastend ist, und zweitens ist der Test technisch kompliziert, so dass er praktisch nicht als Screening-Test für Diabetes durchgeführt werden kann. In jüngster Zeit sind Blut-HbA1C- und -Fructosamin-Tests, die die durchschnittlichen Blutzuckerwerte über einen bestimmten verstrichenen Zeitraum widerspiegeln, bei einigen Einrichtungen als Screening- Tests für Diabetes eingeführt worden. Unter den herrschenden Umständen kann man nicht einmal von diesen Tests sagen, dass sie für leichten Diabetes ausreichend empfindlich und spezifisch sind, und das Problem unterschiedlicher Meßergebnisse zwischen den verschiedenen Einrichtungen bleibt bestehen.
  • Untersuchungen des Blutzuckerwertes, HbA1C-Tests und Fructosamin-Tests sind allgemein zur Diagnose des Diabetestyps, zur Betreuung von ambulanten Patienten mit Diabetes sowie zur Auswertung therapeutischer Wirkungen verwendet worden. Der Blutzuckerwert sinkt jedoch während der Nüchternheit bei leichtem Diabetes, während bei den HbA1C- und Fructosamin-Tests nicht nur die obenbeschriebenen Probleme bestehen, sondern auch das Problem auftritt, dass die Testergebnisse nicht vor dem nächsten Besuch des Krankenhauses bekannt sind und sich die Anweisungen an den Patienten zunächst nach den früheren Testergebnissen richten.
  • Unter diesen Umständen besteht ein Bedarf, zur Entwicklung eines Testverfahrens, das sich auch für Patienten mit leichtem Diabetes eignet, das in bezug auf die Patienten nicht invasiv ist und das zu sofortigen und genauen Ergebnissen für die Diagnose von Diabetes, für die Betreuung von Patienten mit Diabetes und für die Auswertung therapeutischer Wirkungen führt.
  • Einerseits wird die Verabreichung von mit ¹³C markierter Glucose und die Messung von ¹³C, der als Kohlendioxid in das Exhalat abgegeben wird, allgemein zur Beurteilung des Energieaufwands verwendet. Da diese Analyse unter Gleichgewichts-Bedingungen durchgeführt werden sollte, sollte Glucose bereits über einen langen Zeitraum vor der Untersuchung verabreicht werden [J. J. Robert et al., J. Appl. Physiol. 63, 1725-1732 (1987)]. Für diese Analyse ist daher eine lange Untersuchungszeit erforderlich; sie bereitet dem Patienten starke Schmerzen und eignet sich daher praktisch nicht zur Diagnose von Diabetes.
  • Es wurde berichtet, dass nach der Verabreichung von aus C&sub4;-Pflanzen hergestellter natürlich markierter ¹³C- Glucose als Bolus der Gehalt an ausgeatmetern ¹³CO&sub2; bei Patienten mit Diabetes verringert ist (P. Lefebvre, et al., Diabetologia 14, 39-45 (1978); M. J. Arnaud, et al., Nutrition and the Diabetic Child, Pediat. Adolesc.
  • Endocr. Band. 7, S. 203-212, 1979]. Da natürlich markierte ¹³C-Glucose jedoch über 6 statistisch verteilt markierte Kohlenstoffe verfügt, können wir eine Veränderung des Glucosestoffwechselwegs kaum auswerten. Da die ¹³C-Konzentration in natürlich markierter ¹³C-Glucose ungefähr 2% beträgt, muss daher weiterhin eine große Glucosemenge verabreicht werden, um eine Veränderung der ¹³CO&sub2;-Konzentration in der Ausatemluft zu verfolgen, was für den Patienten belastend ist.
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Mittels zur Diagnose von Diabetes, das sofort zu genauen Ergebnissen führt bei gleichzeitig geringstmöglicher Belastung des Patienten.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben aufgrund ihrer Forschungstätigkeit gefunden, dass sich Diabetes sowie dessen Typ durch die Verabreichung von an einer bestimmten Position mit ¹³C markierter Glucose oder an mindestens einer bestimmten Position mit ¹³C markierter Brenztraubensäure und anschließende Bestimmung des Grads des Ansteigens des ¹³C-Gehalts in ausgeatmetern CO&sub2; genau bestimmen lassen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Mittel zur Diagnose von Diabetes, beinhaltend an einer bestimmten Position mit ¹³C markierte Glucose.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Mittel zur Diagnose von Diabetes, beinhaltend an mindestens einer bestimmten Position mit ¹³C markierte Brenztraubensäure.
  • In den Zeichnungen ist folgendes dargestellt:
  • Fig. 1 zeigt den Hauptstoffwechselweg von Glucose bei der Decarboxylierung (die Zahlen in Klammern neben dem CO&sub2; geben die Stellung des Kohlenstoffs in der Glucose an).
  • Fig. 2 zeigt ein Verfahren zur Probenahme des Exhalats einer Ratte.
  • Fig. 3 zeigt den Grad des Ansteigens des ¹³C-Gehalts in ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) zwanzig Minuten nach intravenöser Injektion von 1-¹³C-Glucose (100 mg/kg).
  • Fig. 4 zeigt die Beziehung zwischen dem 1-¹³C-Glucose- Atemtest und dem Nüchternblutzuckerwert.
  • Fig. 5 zeigt die Beziehung zwischen dem 1-¹³C-Glucose- Atemtest und der Gesamtmenge des während der ersten 15 Minuten sezernierten Insulins.
  • Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen dem ¹³C-C-Glucose- Atemtest und dem Nüchternblutzuckerwert.
  • Fig. 7 zeigt den zeitlichen Verlauf des ¹³C-Gehalts in ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) während des 3-¹³C-Glucose- Atemtests.
  • Fig. 8 zeigt den Grad des Ansteigens des ¹³C-Gehalts in ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 10 bis 20 Minuten nach der Verabreichung von 3-¹³C-Glucose.
  • Fig. 9 zeigt die Beziehung zwischen dem 3-¹³C-Glucose- Atemtest und dem Fructosaminspiegel im Blut.
  • Fig. 10 zeigt den zeitlichen Verlauf des ¹³C-Gehalts in ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) während des 2-¹³C-Glucose- Atemtests.
  • Fig. 11 zeigt den zeitlichen Verlauf des ¹³C-Gehalts in ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) während des 6-¹³C-Glucose- Atemtests.
  • Fig. 12 zeigt die Beziehung zwischen dem 3-¹³C-Pyruvat- Atemtest und dem Nüchternblutzuckerwert.
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden genauer beschrieben.
  • Bei der Glucose in dem vorliegenden Mittel zur Diagnose von Diabetes handelt es sich um an einer bestimmten Position mit C markierte Glucose, wobei es sich bei der markierten Position um eine beliebige Position 1 bis 6 handeln kann.
  • Zu einer an einer bestimmten Position mit ¹³C markierten Glucose zählen z. B. Handelsprodukte wie 1-¹³C-Glucose, 2-¹³C-Glucose, 6-¹³C-Glucose (Hersteller: EURISO-TOP Ltd., CIL Ltd., ISOTEC Ltd. und ICON Ltd.), 3-¹³C-Glucose (Hersteller: CIL-Ltd. und ICON Ltd.), 4-¹³C-Glucose. (Hersteiler: CIL Ltd.) und 5-¹³C-Glucose (Hersteller: CIL Ltd.).
  • Bei der in dem vorliegenden Mittel zur Diagnose von Diabetes verwendeten Brenztraubensäure handelt es sich um eine mindestens an einer bestimmten Position mit ¹³C markierte Brenztraubensäure.
  • Bei der Brenztraubensäure der vorliegenden Erfindung kann es sich um eine beliebige Brenztraubensäure handeln, bei der ein, zwei oder drei Kohlenstoffe an den Positionen 1 bis 3 mit ¹³C markiert worden sind, vorzugsweise handelt es sich um Brenztraubensäure, die mit ¹³C an Position 3 markiert ist. Insbesondere können Handelsprodukte wie Natrium-3-¹³C-pyruvat (Hersteller: ICON Ltd.) usw. verwendet werden.
  • Da es sich bei ¹³C um ein stabiles Isotop handelt, besteht keine Gefahr, dass man sich einer Strahlung aussetzt, und die Durchführung der Untersuchungen ist ungefährlich.
  • Bei den Untersuchungen, bei denen man sich des vorliegenden Mittels zur Diagnose von Diabetes bedient, wird der ¹³C-Gehalt (Δ¹³C ( )) in ausgeatmetern CO&sub2; sofort nach der Verabreichung bestimmt, und zwar dadurch, dass man die Daten des Grads des Ansteigens des ¹³C-Gehalts in ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) in vorbestimmten Zeitabständen (z. B. 5 Minuten, 20 Minuten) nach der Verabreichung oder einen zeitlichen Verlauf des Grads des Ansteigens (Anstieg zu Beginn, Anstiegsänderung, Zeitpunkt des Maximalwerts usw.) von ¹³C im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) über einen vorbestimmten Zeitraum nach der Verabreichung auswertet. Obwohl die Auswertung mittels dieses Atmungstests allein nützlich ist, wird das Ergebnis des Tests vorzugsweise mit dem Blutzuckerwert, dem Fructosaminspiegel usw. kombiniert, um zu einer umfassenden Beurteilung zu gelangen.
  • Der ¹³C-Gehalt in ausgeatmetern CO&sub2; kann mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), Infrarot- Spektrometrie, Massenspektrometrie, photo-akustischer Spektrometrie sowie NMR (Kernresonanz-Spektroskopie) bestimmt werden.
  • Das vorliegende Mittel zur Diagnose von Diabetes kann zwischen einer Diabetikergruppe und einer normalen Gruppe unterscheiden. Insbesondere dient das Mittel zur Diagnose von Diabetes, beinhaltend mit ¹³C markierte Glucose, auch der Erkennung des Diabetestyps (insulinabhängiger bzw. insulinunabhängiger Diabetes).
  • Weiterhin kann ein Material zur Auswertung erhalten werden, das je nach unterschiedlicher Position des mit ¹³C in der Glucose markierten Kohlenstoffs für die Diagnose von Diabetes vorteilhaft ist.
  • So kann zum Beispiel an Position 1 mit ¹³C markierte Glucose (1-¹³C-Glucose) zwischen an Diabetes leidenden Individuen und gesunden Individuen einer Gruppe mit normalem Nüchternblutzuckerwert unterscheiden; diese Glucose ist daher vorteilhaft für das Primär-Screening. Aufgrund ihrer ausgezeichneten Beziehung zu der gesamten sezernierten Insulinmenge wird diese Glucose vorteilhaft dazu verwendet, einen Therapieweg festzulegen. An Position 3 mit ¹³C markierte Glucose (3-¹³C-Glucose) kann zwischen Patienten mit insulinabhängigem Diabetes und Patienten mit einem insulinunabhängigen Typ bei fast identischem Blutzuckerwert unterscheiden; diese Glucose wird daher vorteilhaft zur Diagnose des Diabetestyps verwendet. Außerdem kann diese Glucose zwischen insulinabhängigem Diabetes und insulinunabhängigem Diabetes bei ähnlichem Fructosaminspiegel unterscheiden und kann daher vorteilhaft zur Wahrnehmung einer Veränderung der Krankheit (Übergang vom unabhängigen zum abhängigen Typ) verwendet werden, was leicht übersehen werden kann, wenn die Auswertung nur auf dem Fructosaminspiegel beruht.
  • Wie in Fig. 1 dargestellt, werden die Kohlenstoffatome der Glucose je nach ihrer Position in unterschiedlichen Stoffwechselwegen decarboxyliert. Bei Verabreichung von an einer bestimmten Position mit ¹³C markierter Glucose kann daher eine Veränderung des Glucosestoffwechselwegs dadurch ausgewertet werden, dass der Grad der ¹³CO&sub2;- Ausatmung bestimmt wird.
  • Das vorliegende Mittel zur Diagnose von Diabetes wird je nach dem Verabreichungsweg entweder durch die alleinige Verwendung von an einer bestimmten Position mit ¹³C markierter Glucose (im folgenden Text als markierte Glucose bezeichnet) oder an mindestens einer bestimmten Position mit ¹³C markierter Brenztraubensäure (im folgenden als markierte Brenztraubensäure bezeichnet) oder durch Mischen mit Füllstoffen oder Trägern zu pharmazeutischen Präparaten wie Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulat, Flüssigkeit usw. oder Injektionen usw. verarbeitet. Füllstoffe oder Träger können, solange sie pharmazeutisch unbedenklich sind, beliebige üblicherweise auf diesem Gebiet verwendete Füllstoffe oder Träger sein. Art und Zusammensetzung solcher Präparate werden je nach dem Verabreichungsweg und -verfahren auf geeignete Weise geändert. Zum Beispiel wird Wasser als flüssiger Träger verwendet. Als feste Träger verwendet man Cellulosederivate wie Hydroxypropylcellulose sowie Salze organischer Säuren wie Magnesiumstearat usw. Bei Injektionen sind im allgemeinen Wasser, physiologische Kochsalzlösung und verschiedene Pufferlösungen erwünscht. Solche Präparate können zur Verwendung als Arzneimittel zur oralen Verabreichung lyophilisiert werden, oder die lyophilisierten Präparate können kurz vor der Verwendung in geeigneten Lösungsmitteln für Injektionszwecke, z. B.. Flüssigkeiten zur intravenösen Verabreichung wie sterilisiertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Elektrolyt usw., gelöst werden.
  • Der Gehalt an markierter Glucose oder markierter Brenztraubensäure im pharmazeutischen Präparat hängt von der Art des pharmazeutischen Präparats ab und liegt üblicherweise im Bereich von 10 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise 50 bis 100 Gew.-%. Bei Injektionen wird die substituierte Glucose oder die substituierte Brenztraubensäure zum Beispiel in einer Menge von 1 bis 40 Gew.-% zugegeben. Bei Kapseln, Tabletten, Granulat und Pulver liegt der Gehalt an substituierter Glucose oder substituierter Brenztraubensäure im Bereich von ungefähr 10 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise 50 bis 100 Gew.-%, und der Rest sind Träger.
  • Das vorliegende Mittel zur Diagnose von Diabetes sollte in einer Dosierung verabreicht werden, die die Bestätigung einer Erhöhung des ¹³C-Gehalts in einem Exhalat nach der Verabreichung ermöglicht. Je nach Alter und Gewicht des Patienten und dem Zweck des Atemtests liegt die Dosierung für jede Verabreichung in einem Bereich von ungefähr 1 bis 2000 mg/kg Körpergewicht bei einem Erwachsenen.
  • Die vorliegende Erfindung wird im folgenden durch die Beispiele, die keinesfalls den Erfindungsumfang einschränken sollen, genauer beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel zur Diagnose von Diabetes bereitgestellt, das ohne Nebenwirkungen ungefährlich zu verwenden ist und sofort zu genauen Ergebnissen führt, wobei die physische Belastung des Patienten geringer ist. Das vorliegende Mittel zur Diagnose von Diabetes ist nicht nur unter Umständen, bei denen die Patienten oft nicht erfasst werden, zur Unterscheidung zwischen Gesunden und Patienten mit Diabetes fähig, sondern auch zur Bestimmung des Diabetestyps (insulinabhängiger Typ oder insulinunabhängiger Typ).
    • Beispiel 1. Material und Methoden 1.1 Tiere
  • Männliche Ratten des Sprague-Dawley-Stamms (SD) wurden von Nippon Charles River K. K. erworben. Es wurden neugeborene Ratten sowie eine laktierende Ratte erworben. Vor der Verwendung wurden die Ratten bei 23ºC ± 2ºC und 55 ± 10% Feuchtigkeit gehalten. Die Ratten erhielten Standardnahrung sowie Wasser ad libitum.
    • 1.2 Erzeugung von Diabetesratten
  • Für insulinabhängigen Diabetes wurde ein insulindefizienter Diabetestyp in einer ausgewachsenen Ratte dadurch erzeugt, dass man Streptozotocin (STZ) intraperitoneal verabreichte ("Saibokogaku" (Cell Engineering), Extra Issue, Medical Experiment Manual Series, Strategy for Study of Diabetes, Hrsg.: Susumu Kiyono und Yoshikazu Oka, Verlag: Shushunsha, Japan).
  • STZ (Nr. S-0130, Hersteller: Sigma) wurde einer ausgewachsenen Ratte, die zuvor über Nacht ohne Nahrung geblieben war, intraperitoneal in einer Dosis von 90 mg/kg verabreicht. Zwei Tage später wurde Blut aus der Schwanzvene entnommen, der Blutzuckerwert wurde mit einem "Terumo Mediace"-Blutzuckermeß-Kit bestimmt, und eine Ratte mit mindestens 400 mg/dl wurde aus den so behandelten Ratten ausgewählt. STZ wurde in Citratpuffer (pH 4, 5) gelöst und innerhalb von 5 Minuten nach dem Auflösen verabreicht.
  • Für den insulinunabhängigen Diabetes wurde ein insulinsekretionsdefizienter Diabetestyp dadurch erzeugt, daß man neugeborenen Ratten Streptozotocin (STZ) verabreichte ("Saibokogaku", Extra Issue, Medical Experiment Manual Series, Strategy for Study of Diabetes, Hrsg.: Susumu Kiyono und Yoshikazu Oka, Verlag: Shushunsha, Japan).
  • STZ wurde im Alter von 2 Tagen subkutan in einer Dosis von 90 mg/kg verabreicht. Im Alter von 4 Tagen wurde Blut mittels Herzpunktur entnommen und der Blutzuckerwert wurde mit einem "Terumo Mediace"-Blutzuckermeß-Kit bestimmt, und eine Ratte mit mindestens 275 mg/dl wurde aus den so behandelten Ratten ausgewählt. STZ wurde in Citratpuffer (pH 4,5) gelöst und innerhalb von 5 Minuten nach dem Auflösen verabreicht.
    • 1.3¹³C-Atmungstest
  • Eine Ratte, die über Nacht ohne Nahrung geblieben war, wurde durch intraperitoneale Verabreichung von Nembutal (50 mg/kg) betäubt und wie in Fig. 2 dargestellt fixiert. Blut wurde aus der Schwanzvene entnommen und der Blutzuckerwert wurde mit einem "Terumo Mediace"- Blutzuckermeß-Kit bestimmt. Über die Oberschenkelvene wurde 100 mg/kg ¹³C-Glucose bzw. Natrium-¹³C-pyruvat (0,1 g/ml) als Lösung in physiologischer Kochsalzlösung verabreicht; der Kopf wurde mit einem zylindrischen Rohr bedeckt und das Exhalat wurde in ein CAPSTAR-100 (CWE, Inc.) Kohlenstoffdioxid-Meßgerät gesaugt. Für jede Messung wurde ein Exhalat in einem Volumen von ungefähr 25 ul mittels einer Hamilton-Spritze entnommen (Fig. 2). Die Durchflussrate des Kohlendioxid-Meßgeräts wurde so eingestellt, dass der Kohlendioxidgehalt im Bereich von 3,5 ± 0,5% lag. Der ¹³C-Gehalt im ausgeatmeten CO&sub2; wurde mittels eines Gaschromatographie- Massespektrophotometers (GC-MS) bestimmt. Die Analysebedingungen für die GC-MS waren:
  • Gerät: Shimadzu GC-MS QP-5000 [Shimadzu Co., Ltd.].
  • Säule: 0,32 mm · 25 m (IDxL) Fused-silica- Kapillarsäule.
  • Ionisierungsmethode: EI ("Electron Impact")-Methode.
  • Einspritzblocktemperatur: 60ºC.
  • Säulentemperatur: 60ºC.
  • GC-Grenzflächentemperatur; 230ºC.
  • Trägergas: He.
  • Trägergasdruck: 20 Kpa.
  • Art der Messung: SIM ("Selected Ion Monitoring").
  • Gemessene Ionen: m/z = 45, 46, 47.
  • Probeneinspritzvolumen: 20 ul.
  • Bei den ¹³C-Glucosen handelte es sich um 1-¹³C-Glucose (¹³C-Reinheit des Kohlenstoffs an Position 1: 99 Atom-%, Hersteller: EURISO-TOP Ltd. oder CIL Ltd.), 2-¹³C- Glucose (¹³C-Reinheit des Kohlenstoffs an Position 2: 99 Atom-%, Hersteller: ISOTEC Ltd.), 3-¹³C-Glucose (¹³C- Reinheit des Kohlenstoffs an Position 3: 99 Atom-%, Hersteller: ICON Ltd.) bzw. 6-¹³C-Glucose (¹³C-Reinheit des Kohlenstoffs an Position 6: 99 Atom-%, Hersteller: CIL Ltd. oder ICON. Ltd.). Bei der verwendeten ¹³C-Brenztraubensäure handelte es sich um Natrium- 3-¹³C-pyruvat (¹³C-Reinheit des Kohlenstoffs an Position 3: 99 Atom-%, Hersteller: ICON Ltd.). Während des gesamten Versuchs wurde die Rektaltemperatur überwacht, und die Körpertemperatur wurde durch eine Wärmematte bei 37ºC gehalten. Nach Beendigung des Versuchs wurde Vollblut aus der Abdominalaorta entnommen und als Probe zur Messung des Fructosaminspiegels im Blut verwendet. Die Fructosaminanalyse wurde von BML Ltd. als Auftragsarbeit durchgeführt. Nach der Blutabnahme wurde die bei dem Versuch verwendete Ratte durch Verabreichung einer Überdosis des Anästhetikums getötet.
    • Berechnung des ¹³C-Gehalts
  • Der Anteil des in einer Probe vorhandenen Sauerstoffisotops wurde als der in der Natur gefundene Anteil angenommen, und ihr ¹³C-Gehalt wurde aus den Ionenpeakflächen m/z = 45, 46 gemäß der folgenden Formel berechnet. Der Anteil in den Flächen m/z = 45, 46 (A45/A45) wurde gemäß der japanischen LOP-Patentveröffentlichung Nr. 120434/95 als "a" angenommen.
  • ¹³C-Gehalt, (%) = {(0,004176 - 0,0007462a)/(0,9944396 + 0,0034298a)} · 1000 (Formel 1)
    • Δ¹³C ( )-Berechnung
  • Der Δ¹³C ( ) Wert wurde zu jedem Zeitpunkt berechnet aus dem ¹³C-Gehalt im ausgeatmeten CO&sub2; (¹³C t Min.) und dem ¹³C-Gehalt im Standard-CO&sub2;-Gas (¹³C Std) gemäß folgender Formel:
  • Δ¹³C-Wert ( ) = {(¹³C t Min. - ¹³C 0 Min.)/¹³C Std} · 1000 (Formel 2)
    • 1.4 Messung des Insulinspiegels im Blut
  • Bei einer zuvor über Nacht ohne Nahrung geblichenen Ratte wurde unter Narkose durch intraperitoneale Verabreichung von Nembutal (50 mg/kg) zwischen der Oberschenkelarterie und Oberschenkelvene ein Bypass gebildet. Der Bypass wurde mit einer Abzweigung versehen, über die Heparin (Nr. 15077-019, Hersteller: GIBCO. BRL) verabreicht wurde (100 U/Ratte). Nachdem in physiologischer Kochsalzlösung gelöste ¹³C-Glucose (0,1 g/ml) durch die Abzweigung verabreicht worden war (100 mg/kg), wurde im zeitlichen Verlauf Blut abgenommen und der Blutzuckerwert und der Insulinspiegel bestimmt. Der Insulinspiegel wurde mit einem Insulinmeß-Kit (Hersteller: Morinaga Seikagaku Kenkyusho, Japan) bestimmt.
    • 2. Ergebnisse 2.1 1-¹³C-Glucose-Atemtest
  • Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um männliche normale Ratten des Sprague-Dawley-Stamms (SD) (vier 8 Wochen alte Ratten sowie vier 11 Wochen alte Ratten), männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten) sowie männliche SD-Ratten mit insulinabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten, vier 9 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten; STZ wurde den Ratten im Alter von 7 Wochen verabreicht). Fig. 3 zeigt die Meßergebnisse des Grads des Ansteigens des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 20 Minuten nach intravenöser Injektion von 100 mg/kg 1-¹³C-Glucose. Fig. 4 zeigt die Meßergebnisse des Grads des Ansteigens des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 20 Minuten nach der intravenösen Injektion von 100 mg/kg 1-¹³C-Glucose in Abhängigkeit des Blutzuckerwerts unmittelbar vor Verabreichung der Glucose.
  • In der Verteilung der Δ¹³C-Werte 20 Minuten nach der Verabreichung (Fig. 3) traten bei den normalen Ratten hohe Werte von über ungefähr 125 auf, bei den Ratten mit insulinabhängigem Diabetes und den Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes traten jedoch niedrigere Werte von unter ungefähr 125 auf. Es wird angenommen, dass bei höherem Zuckergehalt im Blut vor der Verabreichung der Verdünnungsgrad der verabreichten 1- ¹³C-Glucose höher ist und so der Grad der Abgabe von ¹³C in die Ausatemluft verringert ist. Tatsächlich wird beobachtet, dass bei steigendem Blutzuckerwert der Δ¹³C- Wert (Fig. 4) abnimmt. Im normalen Bereich des Nüchternblutzuckerwerts (ungefähr 100 mg/dl) ist der Δ¹³C-Wert bei Tieren mit Diabetes niedriger als bei den normalen Tieren, obwohl beide praktisch den gleichen Nüchternblutzuckerwert aufweisen (Fig. 4). Man kann daher sagen, dass der 1-¹³C-Glucose-Atemtest nicht nur den Verdünnungsgrad der verabreichten 1-¹³C-Glucose, d. h. den Blutzuckerwert, angibt.
  • Wie oben beispielhaft angeführt, kann der 1-¹³C-Glucose- Atemtest zwischen Diabetes-Erkrankung und Nicht- Erkrankung in ein- und derselben Gruppe mit normalem Nüchternblutzuckerwert unterscheiden und so als genaue und überlegene Primär-Screeningmethode dienen.
    • 2.2 1-¹³C-Glucose-Atemtest
  • Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale männliche SD-Ratten (fünf 11 Wochen alte Ratten) und um männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes (fünf 11 Wochen alte Ratten). Der 1-¹³C-Glucose-Atemtest und die Messung des Insulinspiegels im Blut wurden an den gleichen Ratten durchgeführt. 100 mg/kg 1-¹³C- Glucose wurden den Ratten über die Abzweigung des Bypasses zwischen der Oberschenkelarterie und Oberschenkelvene verabreicht. Blut wurde vor der Verabreichung sowie 1, 2, 3, 5, 7, 10 und 15 Minuten nach der Verabreichung abgenommen und der, Insulinspiegel im Blut wurde bestimmt. Fig. 5 zeigt die Gesamtinsulinmenge, die im Verlauf der 15 Minuten nach Verabreichung freigesetzt wurde, in Abhängigkeit von dem gemessenen Anstieg des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2;.
  • Da der Δ¹³C-Wert 20 Minuten nach der Verabreichung der 1-¹³C-Glucose gut mit der über die ersten 15 Minuten sezernierten Gesamtinsulinmenge korreliert (Fig. 5), wird dieser Atemtest auch als geeignetes Untersuchungsverfahren zur Bestimmung eines Therapieplans angesehen.
    • 2.3 3-¹³C-Glucose-Atemstest
  • Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale männliche SD-Ratten (vier 8 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten), männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten) sowie männliche SD-Ratten mit insulinabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten, vier 9 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten; STZ wurden den Ratten im Alter von 7 Wochen verabreicht). Fig. 6 zeigt die Ergebnisse des Ansteigens des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 20 Minuten nach intravenöser Injektion von 100 mg/kg 3-¹³C-Glucose in Abhängigkeit vom Nüchternblutzuckerspiegel vor der Verabreichung der Glucose.
  • Die Verteilung der Δ¹³C-Werte 20 Minuten nach der Verabreichung (Fig. 6) zeigt, daß aufgrund des Einflusses des Blutzuckerspiegels vor der Verabreichung die Δ¹³C-Werte mit steigendem Blutzuckerspiegel eher abnehmen, wie dies beim 1-¹³C-Glucose-Atemtest der Fall ist. Die Gruppe mit insulinabhängigem Diabetes zeigt jedoch eher niedrige Δ¹³C-Werte im Vergleich zur insulinunabhängigen Gruppe, obwohl der Nüchternblutzuckerwert bei beiden Gruppen ähnlich war. Dieser Atemtest wird daher als nützlich zur Diagnose des Diabetestyps in Kombination mit der Messung des Nüchternblutzuckerwertes erachtet.
    • 2.4 3-¹³C-Glucose-Atmungstest
  • Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale männliche SD-Ratten (vier 11 Wochen alte Ratten), männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes (sechs 11 Wochen alte Ratten) sowie männliche SD-Ratten mit insulinabhängigem Diabetes (vier 11 Wochen alte Ratten; STZ wurden den Ratten im Alter von 9 Wochen verabreicht).
  • Fig. 7 zeigt die Ergebnisse des Anstiegs des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 5, 10, 15 bzw. 20 Minuten nach intravenöser Injektion von 100 mg/kg 3-¹³C-Glucose. Bei den Δ¹³C-Kurven der ersten 20 Minuten nach der Verabreichung von 3-¹³C-Glucose (Fig. 7) fiel der Anstieg der Kurve der Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes in der zweiten Hälfte eher ab. Die Steilheiten der Kurven im Bereich von 10 bis 20 Minuten nach der Verabreichung zeigen folgende Tendenz: normale Ratten > Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes > Ratten mit insulinabhängigem Diabetes (Fig. 8). Der 3-¹³C-Glucose-Atemtest lässt sich daher sowohl für die Diagnose von Diabetes als auch für die Diagnose des Diabetestyps verwenden.
    • 2.5 3-¹³C-Glucose-Atmungstest
  • Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale männliche SD-Ratten (vier 8 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten), männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten und vier 11-Wochen alte Ratten) sowie männliche SD-Ratten mit insulinabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten, vier 9 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten; STZ wurden den Ratten im Alter von 7 Wochen verabreicht). Fig. 9 zeigt die Ergebnisse des Anstiegs des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) und den Fructosaminspiegel im Blut 20 Minuten nach der intravenösen Verabreichung von 100 mg/kg 3-¹³C-Glucose.
  • Nach, Auftragen der Δ¹³C-Werte gegen den Fructosaminspiegel 20 Minuten nach der Verabreichung zeigte sich, dass die Δ¹³C-Werte bei den Ratten mit insulinabhängigem Diabetes niedriger waren als diejenigen bei den Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes, obwohl der Fructosaminspiegel bei den beiden Gruppen ähnlich war (Fig. 9). Aus vielen Berichten geht hervor, dass bei Patienten mit Symptomen von insulinabhängigem Diabetes im Anfangsstadium der Erkrankung später ein Übergang zu insulinunabhängigem Diabetes stattfindet. Je nach solch einer Symptomveränderung müssen die Methoden wie die Insulinbehandlung usw. geändert werden, jedoch übliche Tests, bei denen nur der durchschnittliche Blutzuckerwert als Fructosamin, HbAIC usw. bestimmt werden, können solch eine Veränderung nicht erfassen. Dementsprechend eignet sich der 3-¹³C-Glucose-Atemtest auch als Test zur Erkennung solch einer Symptomveränderung.
    • 2.6 2-¹³C-Glucose- und 6-¹³C-Glucose-Atemtests
  • Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale männliche SD-Ratten (zwei 8 Wochen alte Ratten), männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes (zwei 8 Wochen alte Ratten) sowie männliche SD-Ratten mit insulinabhängigem Diabetes (zwei 8 Wochen alte Ratten). Fig. 10 zeigt den zeitlichen Verlauf des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 40 Minuten nach der intravenösen Injektion von 2-¹³C-Glucose. Fig. 11 zeigt den zeitlichen Verlauf des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten. CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 20 Minuten nach der intravenösen Injektion von 6-¹³C-Glucose. Sowohl der 2-¹³C-Glucose-Atemtest (Fig. 10) als auch der 6-¹³C-Glucose-Atemtest (Fig. 11) zeigen, dass die Δ¹³C-Werte bei Ratten mit insuiinabhängigem Diabetes niedriger sind als bei Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes; man kann daher sagen, dass sich beide Atemtests für die Diagnose des Diabetestyps eignen.
    • 2.7 3-¹³C-Pyruvat-Atemtest
  • Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale männliche Ratten des Sprague-Dawley-Stamms (SD) (vier 8 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten), männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten) sowie männliche SD-Ratten mit insulinabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten, vier 9 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten; STZ wurden den Ratten im Alter von 7 Wochen verabreicht). Fig. 12 zeigt die Ergebnisse des Anstiegs des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 10 Minuten nach der intravenösen Injektion von 100 mg/kg Natrium-3-¹³C- pyruvat sowie den Nüchternblutzuckerwert bei den gleichen Ratten kurz vor der Verabreichung des Pyruvats.
  • Die Δ¹³C-Werte bei den Ratten mit insulinabhängigem Diabetes, bei denen die hohen Nüchternblutzuckerwert (Blutzuckerspiegel von mindestens 200 mg/dl) bestehen bleiben, liegen in einem weiten Bereich von 100 bis 600( ). Im normalen Bereich des Nüchternblutzuckerwertes von ungefähr 100 mg/dl weisen die gesunden Ratten jedoch Werte von unter 400( ) auf, während die Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes und die Ratten mit insulinabhängigem Diabetes bei Nüchternblutzuckerwerten von unter 200 mg/dl Δ¹³C-Werte von über ungefähr 400( ) aufweisen.
  • Es wird angenommen, dass der für das Primär-Screening bei der Diagnose von Diabetes verwendete Nüchternblutzuckertest ungefähr zwei Drittel der Patienten mit Diabetes nicht erfasst, da ihr Blutzuckerwert im Normalbereich liegt. Der vorliegende 3-¹³C-Pyruvat- Ausatmungstest kann jedoch innerhalb ein und derselben Gruppe von Individuen mit normalen Nüchternblutzuckerwerten zwischen Individuen mit Diabetes und gesunden Individuen unterscheiden und so als exakte und überlegene Primär-Screening-Methode verwendet werden.
    • Pharmazeutisches Herstellungsbeispiel 1: Spritze
  • 10 Gewichtsteile 1-¹³C-Glucose wurden in 90 Gewichtsteilen physiologischer Kochsalzlösung gelöst und durch Filtration durch ein Millipore-Filter sterilisiert. Das Filtrat wurde in ein Fläschchen abgefüllt und verschlossen, wodurch man zu einer Spritze gelangte.
    • Pharmazeutisches Herstellungsbeispiel 2: Flüssiges Mittel zur internen Verabreichung
  • 10 Gewichtsteile 1-¹³C-Glucose wurden in 90 Gewichtsteilen entionisiertem Wasser gelöst und durch Filtration durch ein Millipore-Filter sterilisiert. Das Filtrat wurde in ein Fläschchen gefüllt und verschlossen, wodurch man zu einem flüssigen Mittel zur internen Verabreichung gelangte.
    • Pharmazeutisches Herstellungsbeispiel 3: Spritze
  • .10 Gewichtsteile Natrium-3-¹³C-pyruvat wurden in 90 Gewichtsteilen physiologischer Kochsalzlösung gelöst und durch Filtration durch ein Millipore-Filter sterilisiert. Das Filtrat wurde in ein Fläschchen abgefüllt und verschlossen, wodurch man zu einer Spritze gelangte.
    • Pharmazeutisches Herstellungsbeispiel 4: Flüssiges Mittel zur internen Verabreichung
  • 10 Gewichtsteile Natrium-3-¹³C-pyruvat wurden in 90 Gewichtsteilen entionisiertem Wasser gelöst und durch Filtration durch ein Millipore-Filter sterilisiert. Das Filtrat wurde in ein Fläschchen gefüllt und verschlossen, wodurch man zu einem flüssigen Mittel zur internen Verabreichung gelangte.

Claims (6)

1. Mittel zur Diagnose von Diabetes, beinhaltend an einer bestimmten Position mit ¹³C markierte Glucose.
2. Mittel zur Diagnose von Diabetes gemäß Anspruch 1, wobei die Glucose an Position 1 mit ¹³C markiert ist.
3. Mittel zur Diagnose von Diabetes gemäß Anspruch 1, wobei die Glucose an Position 3 mit ¹³C markiert ist.
4. Mittel zur Diagnose von Diabetes, beinhaltend an mindestens einer bestimmten Position mit ¹³C markierte Brenztraubensäure.
5. Mittel zur Diagnose von Diabetes gemäß Anspruch 4, wobei die Brenztraubensäure an Position 3 mit ¹³C markiert ist.
6. Verwendung von ¹³C markierter Brenztraubensäure oder Glucose zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Diagnose von Diabetes.
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