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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur
Diagnose von Diabetes, insbesondere ein Mittel zur
Diagnose von Diabetes, beinhaltend an einer bestimmten
Position mit ¹³C markierte Glucose oder an einer
bestimmten Position mit ¹³C markierte Brenztraubensäure.
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Bei den Testverfahren, die im allgemeinen beim
Primärscreening bei der Diagnose von Diabetes verwendet
werden, handelt es sich um den Harnzuckertest und die
Untersuchung des Nüchternwerts des Blutzuckerspiegels.
Diese Tests sind einfach und hochspezifisch, jedoch
wenig empfindlich und führen bei Patienten mit leichtem
Diabetes zu negativen Ergebnissen, so dass 70% oder
mehr Patienten nicht erfasst werden; diese Tests werden
als unzureichend für das Screening von Diabetes
betrachtet. (Sekikawa et al., Medical Practice 10: 63,
1993). Einerseits führt der für die Diagnose von
Diabetes verwendete Glucosetoleranztest aufgrund der
Verabreichung einer großen Glucosemenge zu
Nebenwirkungen, und der Patient muss bei diesem Test
mehrere Stunden im Labor bleiben und man muss
wiederholt Blut abnehmen, was für den Patienten
körperlich sehr belastend ist, und zweitens ist der
Test technisch kompliziert, so dass er praktisch nicht
als Screening-Test für Diabetes durchgeführt werden
kann. In jüngster Zeit sind Blut-HbA1C- und
-Fructosamin-Tests, die die durchschnittlichen Blutzuckerwerte
über einen bestimmten verstrichenen Zeitraum
widerspiegeln, bei einigen Einrichtungen als Screening-
Tests für Diabetes eingeführt worden. Unter den
herrschenden Umständen kann man nicht einmal von diesen
Tests sagen, dass sie für leichten Diabetes ausreichend
empfindlich und spezifisch sind, und das Problem
unterschiedlicher Meßergebnisse zwischen den
verschiedenen Einrichtungen bleibt bestehen.
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Untersuchungen des Blutzuckerwertes, HbA1C-Tests und
Fructosamin-Tests sind allgemein zur Diagnose des
Diabetestyps, zur Betreuung von ambulanten Patienten
mit Diabetes sowie zur Auswertung therapeutischer
Wirkungen verwendet worden. Der Blutzuckerwert sinkt
jedoch während der Nüchternheit bei leichtem Diabetes,
während bei den HbA1C- und Fructosamin-Tests nicht nur
die obenbeschriebenen Probleme bestehen, sondern auch
das Problem auftritt, dass die Testergebnisse nicht vor
dem nächsten Besuch des Krankenhauses bekannt sind und
sich die Anweisungen an den Patienten zunächst nach den
früheren Testergebnissen richten.
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Unter diesen Umständen besteht ein Bedarf, zur
Entwicklung eines Testverfahrens, das sich auch für
Patienten mit leichtem Diabetes eignet, das in bezug
auf die Patienten nicht invasiv ist und das zu
sofortigen und genauen Ergebnissen für die Diagnose von
Diabetes, für die Betreuung von Patienten mit Diabetes
und für die Auswertung therapeutischer Wirkungen führt.
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Einerseits wird die Verabreichung von mit ¹³C markierter
Glucose und die Messung von ¹³C, der als Kohlendioxid in
das Exhalat abgegeben wird, allgemein zur Beurteilung
des Energieaufwands verwendet. Da diese Analyse unter
Gleichgewichts-Bedingungen durchgeführt werden sollte,
sollte Glucose bereits über einen langen Zeitraum vor
der Untersuchung verabreicht werden [J. J. Robert et
al., J. Appl. Physiol. 63, 1725-1732 (1987)]. Für diese
Analyse ist daher eine lange Untersuchungszeit
erforderlich; sie bereitet dem Patienten starke
Schmerzen und eignet sich daher praktisch nicht zur
Diagnose von Diabetes.
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Es wurde berichtet, dass nach der Verabreichung von aus
C&sub4;-Pflanzen hergestellter natürlich markierter ¹³C-
Glucose als Bolus der Gehalt an ausgeatmetern ¹³CO&sub2; bei
Patienten mit Diabetes verringert ist (P. Lefebvre, et
al., Diabetologia 14, 39-45 (1978); M. J. Arnaud, et
al., Nutrition and the Diabetic Child, Pediat. Adolesc.
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Endocr. Band. 7, S. 203-212, 1979]. Da natürlich
markierte ¹³C-Glucose jedoch über 6 statistisch verteilt
markierte Kohlenstoffe verfügt, können wir eine
Veränderung des Glucosestoffwechselwegs kaum auswerten.
Da die ¹³C-Konzentration in natürlich markierter
¹³C-Glucose ungefähr 2% beträgt, muss daher weiterhin
eine große Glucosemenge verabreicht werden, um eine
Veränderung der ¹³CO&sub2;-Konzentration in der Ausatemluft
zu verfolgen, was für den Patienten belastend ist.
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Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der
Bereitstellung eines Mittels zur Diagnose von Diabetes,
das sofort zu genauen Ergebnissen führt bei
gleichzeitig geringstmöglicher Belastung des Patienten.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben aufgrund
ihrer Forschungstätigkeit gefunden, dass sich Diabetes
sowie dessen Typ durch die Verabreichung von an einer
bestimmten Position mit ¹³C markierter Glucose oder an
mindestens einer bestimmten Position mit ¹³C markierter
Brenztraubensäure und anschließende Bestimmung des
Grads des Ansteigens des ¹³C-Gehalts in ausgeatmetern CO&sub2;
genau bestimmen lassen.
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Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Mittel zur
Diagnose von Diabetes, beinhaltend an einer bestimmten
Position mit ¹³C markierte Glucose.
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Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Mittel
zur Diagnose von Diabetes, beinhaltend an mindestens
einer bestimmten Position mit ¹³C markierte
Brenztraubensäure.
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In den Zeichnungen ist folgendes dargestellt:
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Fig. 1 zeigt den Hauptstoffwechselweg von Glucose bei
der Decarboxylierung (die Zahlen in Klammern neben dem
CO&sub2; geben die Stellung des Kohlenstoffs in der Glucose
an).
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Fig. 2 zeigt ein Verfahren zur Probenahme des Exhalats
einer Ratte.
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Fig. 3 zeigt den Grad des Ansteigens des ¹³C-Gehalts in
ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) zwanzig Minuten nach
intravenöser Injektion von 1-¹³C-Glucose (100 mg/kg).
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Fig. 4 zeigt die Beziehung zwischen dem 1-¹³C-Glucose-
Atemtest und dem Nüchternblutzuckerwert.
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Fig. 5 zeigt die Beziehung zwischen dem 1-¹³C-Glucose-
Atemtest und der Gesamtmenge des während der ersten
15 Minuten sezernierten Insulins.
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Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen dem ¹³C-C-Glucose-
Atemtest und dem Nüchternblutzuckerwert.
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Fig. 7 zeigt den zeitlichen Verlauf des ¹³C-Gehalts in
ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) während des 3-¹³C-Glucose-
Atemtests.
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Fig. 8 zeigt den Grad des Ansteigens des ¹³C-Gehalts in
ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 10 bis 20 Minuten nach der
Verabreichung von 3-¹³C-Glucose.
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Fig. 9 zeigt die Beziehung zwischen dem 3-¹³C-Glucose-
Atemtest und dem Fructosaminspiegel im Blut.
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Fig. 10 zeigt den zeitlichen Verlauf des ¹³C-Gehalts in
ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) während des 2-¹³C-Glucose-
Atemtests.
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Fig. 11 zeigt den zeitlichen Verlauf des ¹³C-Gehalts in
ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) während des 6-¹³C-Glucose-
Atemtests.
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Fig. 12 zeigt die Beziehung zwischen dem 3-¹³C-Pyruvat-
Atemtest und dem Nüchternblutzuckerwert.
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Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im
Folgenden genauer beschrieben.
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Bei der Glucose in dem vorliegenden Mittel zur Diagnose
von Diabetes handelt es sich um an einer bestimmten
Position mit C markierte Glucose, wobei es sich bei
der markierten Position um eine beliebige Position 1
bis 6 handeln kann.
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Zu einer an einer bestimmten Position mit ¹³C markierten
Glucose zählen z. B. Handelsprodukte wie 1-¹³C-Glucose,
2-¹³C-Glucose, 6-¹³C-Glucose (Hersteller: EURISO-TOP
Ltd., CIL Ltd., ISOTEC Ltd. und ICON Ltd.),
3-¹³C-Glucose (Hersteller: CIL-Ltd. und ICON Ltd.),
4-¹³C-Glucose. (Hersteiler: CIL Ltd.) und 5-¹³C-Glucose
(Hersteller: CIL Ltd.).
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Bei der in dem vorliegenden Mittel zur Diagnose von
Diabetes verwendeten Brenztraubensäure handelt es sich
um eine mindestens an einer bestimmten Position mit
¹³C markierte Brenztraubensäure.
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Bei der Brenztraubensäure der vorliegenden Erfindung
kann es sich um eine beliebige Brenztraubensäure
handeln, bei der ein, zwei oder drei Kohlenstoffe an
den Positionen 1 bis 3 mit ¹³C markiert worden sind,
vorzugsweise handelt es sich um Brenztraubensäure, die
mit ¹³C an Position 3 markiert ist. Insbesondere können
Handelsprodukte wie Natrium-3-¹³C-pyruvat (Hersteller:
ICON Ltd.) usw. verwendet werden.
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Da es sich bei ¹³C um ein stabiles Isotop handelt,
besteht keine Gefahr, dass man sich einer Strahlung
aussetzt, und die Durchführung der Untersuchungen ist
ungefährlich.
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Bei den Untersuchungen, bei denen man sich des
vorliegenden Mittels zur Diagnose von Diabetes bedient,
wird der ¹³C-Gehalt (Δ¹³C ( )) in ausgeatmetern CO&sub2; sofort
nach der Verabreichung bestimmt, und zwar dadurch, dass
man die Daten des Grads des Ansteigens des ¹³C-Gehalts
in ausgeatmetern CO&sub2; (Δ¹³C ( )) in vorbestimmten
Zeitabständen (z. B. 5 Minuten, 20 Minuten) nach der
Verabreichung oder einen zeitlichen Verlauf des Grads
des Ansteigens (Anstieg zu Beginn, Anstiegsänderung,
Zeitpunkt des Maximalwerts usw.) von ¹³C im ausgeatmeten
CO&sub2; (Δ¹³C ( )) über einen vorbestimmten Zeitraum nach
der Verabreichung auswertet. Obwohl die Auswertung
mittels dieses Atmungstests allein nützlich ist, wird
das Ergebnis des Tests vorzugsweise mit dem
Blutzuckerwert, dem Fructosaminspiegel usw. kombiniert,
um zu einer umfassenden Beurteilung zu gelangen.
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Der ¹³C-Gehalt in ausgeatmetern CO&sub2; kann mittels
Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), Infrarot-
Spektrometrie, Massenspektrometrie, photo-akustischer
Spektrometrie sowie NMR (Kernresonanz-Spektroskopie)
bestimmt werden.
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Das vorliegende Mittel zur Diagnose von Diabetes kann
zwischen einer Diabetikergruppe und einer normalen
Gruppe unterscheiden. Insbesondere dient das Mittel zur
Diagnose von Diabetes, beinhaltend mit ¹³C markierte
Glucose, auch der Erkennung des Diabetestyps
(insulinabhängiger bzw. insulinunabhängiger Diabetes).
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Weiterhin kann ein Material zur Auswertung erhalten
werden, das je nach unterschiedlicher Position des mit
¹³C in der Glucose markierten Kohlenstoffs für die
Diagnose von Diabetes vorteilhaft ist.
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So kann zum Beispiel an Position 1 mit ¹³C markierte
Glucose (1-¹³C-Glucose) zwischen an Diabetes leidenden
Individuen und gesunden Individuen einer Gruppe mit
normalem Nüchternblutzuckerwert unterscheiden; diese
Glucose ist daher vorteilhaft für das Primär-Screening.
Aufgrund ihrer ausgezeichneten Beziehung zu der
gesamten sezernierten Insulinmenge wird diese Glucose
vorteilhaft dazu verwendet, einen Therapieweg
festzulegen. An Position 3 mit ¹³C markierte Glucose
(3-¹³C-Glucose) kann zwischen Patienten mit
insulinabhängigem Diabetes und Patienten mit einem
insulinunabhängigen Typ bei fast identischem Blutzuckerwert
unterscheiden; diese Glucose wird daher vorteilhaft zur
Diagnose des Diabetestyps verwendet. Außerdem kann
diese Glucose zwischen insulinabhängigem Diabetes und
insulinunabhängigem Diabetes bei ähnlichem
Fructosaminspiegel unterscheiden und kann daher vorteilhaft zur
Wahrnehmung einer Veränderung der Krankheit (Übergang
vom unabhängigen zum abhängigen Typ) verwendet werden,
was leicht übersehen werden kann, wenn die Auswertung
nur auf dem Fructosaminspiegel beruht.
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Wie in Fig. 1 dargestellt, werden die Kohlenstoffatome
der Glucose je nach ihrer Position in unterschiedlichen
Stoffwechselwegen decarboxyliert. Bei Verabreichung von
an einer bestimmten Position mit ¹³C markierter Glucose
kann daher eine Veränderung des Glucosestoffwechselwegs
dadurch ausgewertet werden, dass der Grad der ¹³CO&sub2;-
Ausatmung bestimmt wird.
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Das vorliegende Mittel zur Diagnose von Diabetes wird
je nach dem Verabreichungsweg entweder durch die
alleinige Verwendung von an einer bestimmten Position
mit ¹³C markierter Glucose (im folgenden Text als
markierte Glucose bezeichnet) oder an mindestens einer
bestimmten Position mit ¹³C markierter Brenztraubensäure
(im folgenden als markierte Brenztraubensäure
bezeichnet) oder durch Mischen mit Füllstoffen oder
Trägern zu pharmazeutischen Präparaten wie Tabletten,
Kapseln, Pulver, Granulat, Flüssigkeit usw. oder
Injektionen usw. verarbeitet. Füllstoffe oder Träger
können, solange sie pharmazeutisch unbedenklich sind,
beliebige üblicherweise auf diesem Gebiet verwendete
Füllstoffe oder Träger sein. Art und Zusammensetzung
solcher Präparate werden je nach dem Verabreichungsweg
und -verfahren auf geeignete Weise geändert. Zum
Beispiel wird Wasser als flüssiger Träger verwendet.
Als feste Träger verwendet man Cellulosederivate wie
Hydroxypropylcellulose sowie Salze organischer Säuren
wie Magnesiumstearat usw. Bei Injektionen sind im
allgemeinen Wasser, physiologische Kochsalzlösung und
verschiedene Pufferlösungen erwünscht. Solche Präparate
können zur Verwendung als Arzneimittel zur oralen
Verabreichung lyophilisiert werden, oder die
lyophilisierten Präparate können kurz vor der
Verwendung in geeigneten Lösungsmitteln für
Injektionszwecke, z. B.. Flüssigkeiten zur intravenösen
Verabreichung wie sterilisiertes Wasser, physiologische
Kochsalzlösung, Elektrolyt usw., gelöst werden.
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Der Gehalt an markierter Glucose oder markierter
Brenztraubensäure im pharmazeutischen Präparat hängt
von der Art des pharmazeutischen Präparats ab und liegt
üblicherweise im Bereich von 10 bis 100 Gew.-%,
vorzugsweise 50 bis 100 Gew.-%. Bei Injektionen wird
die substituierte Glucose oder die substituierte
Brenztraubensäure zum Beispiel in einer Menge von
1 bis 40 Gew.-% zugegeben. Bei Kapseln, Tabletten,
Granulat und Pulver liegt der Gehalt an substituierter
Glucose oder substituierter Brenztraubensäure im
Bereich von ungefähr 10 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise 50
bis 100 Gew.-%, und der Rest sind Träger.
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Das vorliegende Mittel zur Diagnose von Diabetes sollte
in einer Dosierung verabreicht werden, die die
Bestätigung einer Erhöhung des ¹³C-Gehalts in einem
Exhalat nach der Verabreichung ermöglicht. Je nach
Alter und Gewicht des Patienten und dem Zweck des
Atemtests liegt die Dosierung für jede Verabreichung in
einem Bereich von ungefähr 1 bis 2000 mg/kg
Körpergewicht bei einem Erwachsenen.
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Die vorliegende Erfindung wird im folgenden durch die
Beispiele, die keinesfalls den Erfindungsumfang
einschränken sollen, genauer beschrieben.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel zur
Diagnose von Diabetes bereitgestellt, das ohne
Nebenwirkungen ungefährlich zu verwenden ist und sofort zu
genauen Ergebnissen führt, wobei die physische
Belastung des Patienten geringer ist. Das vorliegende
Mittel zur Diagnose von Diabetes ist nicht nur unter
Umständen, bei denen die Patienten oft nicht erfasst
werden, zur Unterscheidung zwischen Gesunden und
Patienten mit Diabetes fähig, sondern auch zur
Bestimmung des Diabetestyps (insulinabhängiger Typ oder
insulinunabhängiger Typ).
Beispiel
1. Material und Methoden
1.1 Tiere
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Männliche Ratten des Sprague-Dawley-Stamms (SD) wurden
von Nippon Charles River K. K. erworben. Es wurden
neugeborene Ratten sowie eine laktierende Ratte
erworben. Vor der Verwendung wurden die Ratten bei 23ºC
± 2ºC und 55 ± 10% Feuchtigkeit gehalten. Die Ratten
erhielten Standardnahrung sowie Wasser ad libitum.
1.2 Erzeugung von Diabetesratten
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Für insulinabhängigen Diabetes wurde ein
insulindefizienter Diabetestyp in einer ausgewachsenen Ratte
dadurch erzeugt, dass man Streptozotocin (STZ)
intraperitoneal verabreichte ("Saibokogaku" (Cell
Engineering), Extra Issue, Medical Experiment Manual
Series, Strategy for Study of Diabetes, Hrsg.: Susumu
Kiyono und Yoshikazu Oka, Verlag: Shushunsha, Japan).
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STZ (Nr. S-0130, Hersteller: Sigma) wurde einer
ausgewachsenen Ratte, die zuvor über Nacht ohne Nahrung
geblieben war, intraperitoneal in einer Dosis von 90 mg/kg
verabreicht. Zwei Tage später wurde Blut aus der
Schwanzvene entnommen, der Blutzuckerwert wurde mit
einem "Terumo Mediace"-Blutzuckermeß-Kit bestimmt, und
eine Ratte mit mindestens 400 mg/dl wurde aus den so
behandelten Ratten ausgewählt. STZ wurde in
Citratpuffer (pH 4, 5) gelöst und innerhalb von 5 Minuten nach
dem Auflösen verabreicht.
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Für den insulinunabhängigen Diabetes wurde ein
insulinsekretionsdefizienter Diabetestyp dadurch erzeugt, daß
man neugeborenen Ratten Streptozotocin (STZ)
verabreichte ("Saibokogaku", Extra Issue, Medical
Experiment Manual Series, Strategy for Study of
Diabetes, Hrsg.: Susumu Kiyono und Yoshikazu Oka,
Verlag: Shushunsha, Japan).
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STZ wurde im Alter von 2 Tagen subkutan in einer Dosis
von 90 mg/kg verabreicht. Im Alter von 4 Tagen wurde
Blut mittels Herzpunktur entnommen und der
Blutzuckerwert wurde mit einem "Terumo Mediace"-Blutzuckermeß-Kit
bestimmt, und eine Ratte mit mindestens 275 mg/dl wurde
aus den so behandelten Ratten ausgewählt. STZ wurde in
Citratpuffer (pH 4,5) gelöst und innerhalb von 5
Minuten nach dem Auflösen verabreicht.
1.3¹³C-Atmungstest
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Eine Ratte, die über Nacht ohne Nahrung geblieben war,
wurde durch intraperitoneale Verabreichung von Nembutal
(50 mg/kg) betäubt und wie in Fig. 2 dargestellt
fixiert. Blut wurde aus der Schwanzvene entnommen und
der Blutzuckerwert wurde mit einem "Terumo Mediace"-
Blutzuckermeß-Kit bestimmt. Über die Oberschenkelvene
wurde 100 mg/kg ¹³C-Glucose bzw. Natrium-¹³C-pyruvat
(0,1 g/ml) als Lösung in physiologischer Kochsalzlösung
verabreicht; der Kopf wurde mit einem zylindrischen
Rohr bedeckt und das Exhalat wurde in ein CAPSTAR-100
(CWE, Inc.) Kohlenstoffdioxid-Meßgerät gesaugt. Für
jede Messung wurde ein Exhalat in einem Volumen von
ungefähr 25 ul mittels einer Hamilton-Spritze entnommen
(Fig. 2). Die Durchflussrate des Kohlendioxid-Meßgeräts
wurde so eingestellt, dass der Kohlendioxidgehalt im
Bereich von 3,5 ± 0,5% lag. Der ¹³C-Gehalt im
ausgeatmeten CO&sub2; wurde mittels eines Gaschromatographie-
Massespektrophotometers (GC-MS) bestimmt. Die
Analysebedingungen für die GC-MS waren:
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Gerät: Shimadzu GC-MS QP-5000
[Shimadzu Co., Ltd.].
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Säule: 0,32 mm · 25 m (IDxL)
Fused-silica-
Kapillarsäule.
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Ionisierungsmethode: EI ("Electron Impact")-Methode.
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Einspritzblocktemperatur: 60ºC.
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Säulentemperatur: 60ºC.
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GC-Grenzflächentemperatur; 230ºC.
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Trägergas: He.
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Trägergasdruck: 20 Kpa.
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Art der Messung: SIM ("Selected Ion
Monitoring").
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Gemessene Ionen: m/z = 45, 46, 47.
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Probeneinspritzvolumen: 20 ul.
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Bei den ¹³C-Glucosen handelte es sich um 1-¹³C-Glucose
(¹³C-Reinheit des Kohlenstoffs an Position 1: 99 Atom-%,
Hersteller: EURISO-TOP Ltd. oder CIL Ltd.), 2-¹³C-
Glucose (¹³C-Reinheit des Kohlenstoffs an Position 2: 99
Atom-%, Hersteller: ISOTEC Ltd.), 3-¹³C-Glucose (¹³C-
Reinheit des Kohlenstoffs an Position 3: 99 Atom-%,
Hersteller: ICON Ltd.) bzw. 6-¹³C-Glucose (¹³C-Reinheit
des Kohlenstoffs an Position 6: 99 Atom-%, Hersteller:
CIL Ltd. oder ICON. Ltd.). Bei der verwendeten
¹³C-Brenztraubensäure handelte es sich um Natrium-
3-¹³C-pyruvat (¹³C-Reinheit des Kohlenstoffs an Position
3: 99 Atom-%, Hersteller: ICON Ltd.). Während des
gesamten Versuchs wurde die Rektaltemperatur überwacht,
und die Körpertemperatur wurde durch eine Wärmematte
bei 37ºC gehalten. Nach Beendigung des Versuchs wurde
Vollblut aus der Abdominalaorta entnommen und als Probe
zur Messung des Fructosaminspiegels im Blut verwendet.
Die Fructosaminanalyse wurde von BML Ltd. als
Auftragsarbeit durchgeführt. Nach der Blutabnahme wurde die bei
dem Versuch verwendete Ratte durch Verabreichung einer
Überdosis des Anästhetikums getötet.
Berechnung des ¹³C-Gehalts
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Der Anteil des in einer Probe vorhandenen
Sauerstoffisotops wurde als der in der Natur gefundene Anteil
angenommen, und ihr ¹³C-Gehalt wurde aus den
Ionenpeakflächen m/z = 45, 46 gemäß der folgenden Formel
berechnet. Der Anteil in den Flächen m/z = 45, 46
(A45/A45) wurde gemäß der japanischen
LOP-Patentveröffentlichung Nr. 120434/95 als "a" angenommen.
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¹³C-Gehalt, (%) = {(0,004176 - 0,0007462a)/(0,9944396 +
0,0034298a)} · 1000 (Formel 1)
Δ¹³C ( )-Berechnung
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Der Δ¹³C ( ) Wert wurde zu jedem Zeitpunkt berechnet aus
dem ¹³C-Gehalt im ausgeatmeten CO&sub2; (¹³C t Min.) und dem
¹³C-Gehalt im Standard-CO&sub2;-Gas (¹³C Std) gemäß folgender
Formel:
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Δ¹³C-Wert ( ) = {(¹³C t Min. - ¹³C 0 Min.)/¹³C Std} · 1000
(Formel 2)
1.4 Messung des Insulinspiegels im Blut
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Bei einer zuvor über Nacht ohne Nahrung geblichenen
Ratte wurde unter Narkose durch intraperitoneale
Verabreichung von Nembutal (50 mg/kg) zwischen der
Oberschenkelarterie und Oberschenkelvene ein Bypass
gebildet. Der Bypass wurde mit einer Abzweigung
versehen, über die Heparin (Nr. 15077-019, Hersteller:
GIBCO. BRL) verabreicht wurde (100 U/Ratte). Nachdem in
physiologischer Kochsalzlösung gelöste ¹³C-Glucose
(0,1 g/ml) durch die Abzweigung verabreicht worden war
(100 mg/kg), wurde im zeitlichen Verlauf Blut
abgenommen und der Blutzuckerwert und der
Insulinspiegel bestimmt. Der Insulinspiegel wurde mit
einem Insulinmeß-Kit (Hersteller: Morinaga Seikagaku
Kenkyusho, Japan) bestimmt.
2. Ergebnisse
2.1 1-¹³C-Glucose-Atemtest
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Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um
männliche normale Ratten des Sprague-Dawley-Stamms (SD)
(vier 8 Wochen alte Ratten sowie vier 11 Wochen alte
Ratten), männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem
Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen
alte Ratten) sowie männliche SD-Ratten mit
insulinabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten,
vier 9 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte
Ratten; STZ wurde den Ratten im Alter von 7 Wochen
verabreicht). Fig. 3 zeigt die Meßergebnisse des Grads
des Ansteigens des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2;
(Δ¹³C ( )) 20 Minuten nach intravenöser Injektion von
100 mg/kg 1-¹³C-Glucose. Fig. 4 zeigt die Meßergebnisse
des Grads des Ansteigens des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten
CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 20 Minuten nach der intravenösen
Injektion von 100 mg/kg 1-¹³C-Glucose in Abhängigkeit
des Blutzuckerwerts unmittelbar vor Verabreichung der
Glucose.
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In der Verteilung der Δ¹³C-Werte 20 Minuten nach der
Verabreichung (Fig. 3) traten bei den normalen Ratten
hohe Werte von über ungefähr 125 auf, bei den Ratten
mit insulinabhängigem Diabetes und den Ratten mit
insulinunabhängigem Diabetes traten jedoch niedrigere
Werte von unter ungefähr 125 auf. Es wird angenommen,
dass bei höherem Zuckergehalt im Blut vor der
Verabreichung der Verdünnungsgrad der verabreichten 1-
¹³C-Glucose höher ist und so der Grad der Abgabe von ¹³C
in die Ausatemluft verringert ist. Tatsächlich wird
beobachtet, dass bei steigendem Blutzuckerwert der Δ¹³C-
Wert (Fig. 4) abnimmt. Im normalen Bereich des
Nüchternblutzuckerwerts (ungefähr 100 mg/dl) ist der
Δ¹³C-Wert bei Tieren mit Diabetes niedriger als bei den
normalen Tieren, obwohl beide praktisch den gleichen
Nüchternblutzuckerwert aufweisen (Fig. 4). Man kann
daher sagen, dass der 1-¹³C-Glucose-Atemtest nicht nur
den Verdünnungsgrad der verabreichten 1-¹³C-Glucose,
d. h. den Blutzuckerwert, angibt.
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Wie oben beispielhaft angeführt, kann der 1-¹³C-Glucose-
Atemtest zwischen Diabetes-Erkrankung und Nicht-
Erkrankung in ein- und derselben Gruppe mit normalem
Nüchternblutzuckerwert unterscheiden und so als genaue
und überlegene Primär-Screeningmethode dienen.
2.2 1-¹³C-Glucose-Atemtest
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Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale
männliche SD-Ratten (fünf 11 Wochen alte Ratten) und um
männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes
(fünf 11 Wochen alte Ratten). Der 1-¹³C-Glucose-Atemtest
und die Messung des Insulinspiegels im Blut wurden an
den gleichen Ratten durchgeführt. 100 mg/kg 1-¹³C-
Glucose wurden den Ratten über die Abzweigung des
Bypasses zwischen der Oberschenkelarterie und
Oberschenkelvene verabreicht. Blut wurde vor der
Verabreichung sowie 1, 2, 3, 5, 7, 10 und 15 Minuten
nach der Verabreichung abgenommen und der,
Insulinspiegel im Blut wurde bestimmt. Fig. 5 zeigt die
Gesamtinsulinmenge, die im Verlauf der 15 Minuten nach
Verabreichung freigesetzt wurde, in Abhängigkeit von
dem gemessenen Anstieg des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten
CO&sub2;.
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Da der Δ¹³C-Wert 20 Minuten nach der Verabreichung der
1-¹³C-Glucose gut mit der über die ersten 15 Minuten
sezernierten Gesamtinsulinmenge korreliert (Fig. 5),
wird dieser Atemtest auch als geeignetes
Untersuchungsverfahren zur Bestimmung eines
Therapieplans angesehen.
2.3 3-¹³C-Glucose-Atemstest
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Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale
männliche SD-Ratten (vier 8 Wochen alte Ratten und vier
11 Wochen alte Ratten), männliche SD-Ratten mit
insulinunabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten
und vier 11 Wochen alte Ratten) sowie männliche
SD-Ratten mit insulinabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen
alte Ratten, vier 9 Wochen alte Ratten und vier 11
Wochen alte Ratten; STZ wurden den Ratten im Alter von
7 Wochen verabreicht). Fig. 6 zeigt die Ergebnisse des
Ansteigens des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( ))
20 Minuten nach intravenöser Injektion von 100 mg/kg
3-¹³C-Glucose in Abhängigkeit vom
Nüchternblutzuckerspiegel vor der Verabreichung der Glucose.
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Die Verteilung der Δ¹³C-Werte 20 Minuten nach der
Verabreichung (Fig. 6) zeigt, daß aufgrund des
Einflusses des Blutzuckerspiegels vor der Verabreichung
die Δ¹³C-Werte mit steigendem Blutzuckerspiegel eher
abnehmen, wie dies beim 1-¹³C-Glucose-Atemtest der Fall
ist. Die Gruppe mit insulinabhängigem Diabetes zeigt
jedoch eher niedrige Δ¹³C-Werte im Vergleich zur
insulinunabhängigen Gruppe, obwohl der
Nüchternblutzuckerwert bei beiden Gruppen ähnlich war.
Dieser Atemtest wird daher als nützlich zur Diagnose
des Diabetestyps in Kombination mit der Messung des
Nüchternblutzuckerwertes erachtet.
2.4 3-¹³C-Glucose-Atmungstest
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Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale
männliche SD-Ratten (vier 11 Wochen alte Ratten),
männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes
(sechs 11 Wochen alte Ratten) sowie männliche SD-Ratten
mit insulinabhängigem Diabetes (vier 11 Wochen alte
Ratten; STZ wurden den Ratten im Alter von 9 Wochen
verabreicht).
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Fig. 7 zeigt die Ergebnisse des Anstiegs des ¹³C-Gehalts
im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 5, 10, 15 bzw. 20 Minuten
nach intravenöser Injektion von 100 mg/kg 3-¹³C-Glucose.
Bei den Δ¹³C-Kurven der ersten 20 Minuten nach der
Verabreichung von 3-¹³C-Glucose (Fig. 7) fiel der
Anstieg der Kurve der Ratten mit insulinunabhängigem
Diabetes in der zweiten Hälfte eher ab. Die Steilheiten
der Kurven im Bereich von 10 bis 20 Minuten nach der
Verabreichung zeigen folgende Tendenz: normale
Ratten > Ratten mit insulinunabhängigem
Diabetes > Ratten mit insulinabhängigem Diabetes
(Fig. 8). Der 3-¹³C-Glucose-Atemtest lässt sich daher
sowohl für die Diagnose von Diabetes als auch für die
Diagnose des Diabetestyps verwenden.
2.5 3-¹³C-Glucose-Atmungstest
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Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale
männliche SD-Ratten (vier 8 Wochen alte Ratten und vier
11 Wochen alte Ratten), männliche SD-Ratten mit
insulinunabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten
und vier 11-Wochen alte Ratten) sowie männliche
SD-Ratten mit insulinabhängigem Diabetes (vier 8 Wochen
alte Ratten, vier 9 Wochen alte Ratten und vier 11
Wochen alte Ratten; STZ wurden den Ratten im Alter von
7 Wochen verabreicht). Fig. 9 zeigt die Ergebnisse des
Anstiegs des ¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( ))
und den Fructosaminspiegel im Blut 20 Minuten nach der
intravenösen Verabreichung von 100 mg/kg 3-¹³C-Glucose.
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Nach, Auftragen der Δ¹³C-Werte gegen den
Fructosaminspiegel 20 Minuten nach der Verabreichung
zeigte sich, dass die Δ¹³C-Werte bei den Ratten mit
insulinabhängigem Diabetes niedriger waren als
diejenigen bei den Ratten mit insulinunabhängigem
Diabetes, obwohl der Fructosaminspiegel bei den beiden
Gruppen ähnlich war (Fig. 9). Aus vielen Berichten geht
hervor, dass bei Patienten mit Symptomen von
insulinabhängigem Diabetes im Anfangsstadium der Erkrankung
später ein Übergang zu insulinunabhängigem Diabetes
stattfindet. Je nach solch einer Symptomveränderung
müssen die Methoden wie die Insulinbehandlung usw.
geändert werden, jedoch übliche Tests, bei denen nur
der durchschnittliche Blutzuckerwert als Fructosamin,
HbAIC usw. bestimmt werden, können solch eine
Veränderung nicht erfassen. Dementsprechend eignet sich
der 3-¹³C-Glucose-Atemtest auch als Test zur Erkennung
solch einer Symptomveränderung.
2.6 2-¹³C-Glucose- und 6-¹³C-Glucose-Atemtests
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Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale
männliche SD-Ratten (zwei 8 Wochen alte Ratten),
männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes
(zwei 8 Wochen alte Ratten) sowie männliche SD-Ratten
mit insulinabhängigem Diabetes (zwei 8 Wochen alte
Ratten). Fig. 10 zeigt den zeitlichen Verlauf des
¹³C-Gehalts im ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 40 Minuten
nach der intravenösen Injektion von 2-¹³C-Glucose. Fig.
11 zeigt den zeitlichen Verlauf des ¹³C-Gehalts im
ausgeatmeten. CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 20 Minuten nach der
intravenösen Injektion von 6-¹³C-Glucose. Sowohl der
2-¹³C-Glucose-Atemtest (Fig. 10) als auch der
6-¹³C-Glucose-Atemtest (Fig. 11) zeigen, dass die
Δ¹³C-Werte bei Ratten mit insuiinabhängigem Diabetes
niedriger sind als bei Ratten mit insulinunabhängigem
Diabetes; man kann daher sagen, dass sich beide
Atemtests für die Diagnose des Diabetestyps eignen.
2.7 3-¹³C-Pyruvat-Atemtest
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Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um normale
männliche Ratten des Sprague-Dawley-Stamms (SD) (vier
8 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten),
männliche SD-Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes
(vier 8 Wochen alte Ratten und vier 11 Wochen alte
Ratten) sowie männliche SD-Ratten mit insulinabhängigem
Diabetes (vier 8 Wochen alte Ratten, vier 9 Wochen alte
Ratten und vier 11 Wochen alte Ratten; STZ wurden den
Ratten im Alter von 7 Wochen verabreicht). Fig. 12
zeigt die Ergebnisse des Anstiegs des ¹³C-Gehalts im
ausgeatmeten CO&sub2; (Δ¹³C ( )) 10 Minuten nach der
intravenösen Injektion von 100 mg/kg Natrium-3-¹³C-
pyruvat sowie den Nüchternblutzuckerwert bei den
gleichen Ratten kurz vor der Verabreichung des
Pyruvats.
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Die Δ¹³C-Werte bei den Ratten mit insulinabhängigem
Diabetes, bei denen die hohen Nüchternblutzuckerwert
(Blutzuckerspiegel von mindestens 200 mg/dl) bestehen
bleiben, liegen in einem weiten Bereich von 100 bis
600( ). Im normalen Bereich des
Nüchternblutzuckerwertes von ungefähr 100 mg/dl weisen die gesunden
Ratten jedoch Werte von unter 400( ) auf, während die
Ratten mit insulinunabhängigem Diabetes und die Ratten
mit insulinabhängigem Diabetes bei
Nüchternblutzuckerwerten von unter 200 mg/dl Δ¹³C-Werte von über
ungefähr 400( ) aufweisen.
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Es wird angenommen, dass der für das Primär-Screening
bei der Diagnose von Diabetes verwendete
Nüchternblutzuckertest ungefähr zwei Drittel der Patienten mit
Diabetes nicht erfasst, da ihr Blutzuckerwert im
Normalbereich liegt. Der vorliegende 3-¹³C-Pyruvat-
Ausatmungstest kann jedoch innerhalb ein und derselben
Gruppe von Individuen mit normalen
Nüchternblutzuckerwerten zwischen Individuen mit Diabetes und
gesunden Individuen unterscheiden und so als exakte und
überlegene Primär-Screening-Methode verwendet werden.
Pharmazeutisches Herstellungsbeispiel 1: Spritze
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10 Gewichtsteile 1-¹³C-Glucose wurden in 90
Gewichtsteilen physiologischer Kochsalzlösung gelöst und durch
Filtration durch ein Millipore-Filter sterilisiert. Das
Filtrat wurde in ein Fläschchen abgefüllt und
verschlossen, wodurch man zu einer Spritze gelangte.
Pharmazeutisches Herstellungsbeispiel 2: Flüssiges
Mittel zur internen Verabreichung
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10 Gewichtsteile 1-¹³C-Glucose wurden in 90
Gewichtsteilen entionisiertem Wasser gelöst und durch
Filtration durch ein Millipore-Filter sterilisiert. Das
Filtrat wurde in ein Fläschchen gefüllt und
verschlossen, wodurch man zu einem flüssigen Mittel zur
internen Verabreichung gelangte.
Pharmazeutisches Herstellungsbeispiel 3: Spritze
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.10 Gewichtsteile Natrium-3-¹³C-pyruvat wurden in
90 Gewichtsteilen physiologischer Kochsalzlösung gelöst
und durch Filtration durch ein Millipore-Filter
sterilisiert. Das Filtrat wurde in ein Fläschchen
abgefüllt und verschlossen, wodurch man zu einer
Spritze gelangte.
Pharmazeutisches Herstellungsbeispiel 4: Flüssiges
Mittel zur internen Verabreichung
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10 Gewichtsteile Natrium-3-¹³C-pyruvat wurden in
90 Gewichtsteilen entionisiertem Wasser gelöst und
durch Filtration durch ein Millipore-Filter
sterilisiert. Das Filtrat wurde in ein Fläschchen
gefüllt und verschlossen, wodurch man zu einem
flüssigen Mittel zur internen Verabreichung gelangte.