JP5901092B1

JP5901092B1 - ヒトジペプチジルペプチダーゼｉｖ阻害剤の製造方法

Info

Publication number: JP5901092B1
Application number: JP2015167176A
Authority: JP
Inventors: 國世井上
Original assignee: ワキ製薬株式会社
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2015-08-26
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2035-08-26
Also published as: JP2017043557A

Abstract

【課題】高い安全性を有する天然由来素材のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、その製造方法、及びその含有物を提供する。【解決手段】本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害活性を有するジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤であって、ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させて得たミミズ抽出液のうち、分子量１０ｋＤａ未満の低分子量画分であるミミズ低分子量画分を主成分とする。【選択図】図１

Description

本発明は、ヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害活性を有するヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法に関する。

糖尿病は、インスリン生産が十分でない、もしくはインスリンが効果的に働かなくなったときにおこる慢性的疾患である。インスリンは膵臓から産出されるホルモンであり、食物から摂取したグルコースを体細胞へ取り込むことで、筋肉や組織の機能発現のためのエネルギーに変換する働きを有する。糖尿病患者では、グルコースが十分に吸収されずに血液中を循環し続けることで、高血糖状態となり、体細胞に損傷を与え続ける。とくに、手足、網膜、腎臓、脳などにおける末梢血管に対する損傷が重篤な症状を引き起こし、このような損傷によって、命に係わる合併症に至る場合が多い。
国際糖尿病連合（ＩＤＦ）が出版した「糖尿病アトラス第６版」によると、２０１３年に世界中の糖尿病患者数は約３億８２００万人と見積もられており、糖尿病が原因の死亡者数は５１０万人にのぼる。糖尿病患者はさらに増加傾向にあり、２０３５年には５億９２００万人にまで増えると予想されている。

糖尿病には、Ｉ型糖尿病とＩＩ型糖尿病がある。Ｉ型糖尿病は、自己免疫反応によってインスリン生産性β細胞が攻撃されることによって、十分なインスリンを生産できなくなることによって起こる。従って、Ｉ型糖尿病の治療にはインスリンの投与が必要となる。一方、ＩＩ型糖尿病は、インスリンを生産することはできるが、十分量が生産できない場合、あるいは、インスリン耐性ができておりインスリンが効果的に働かない場合に、血糖値が上がってしまうことにより引き起こされる糖尿病の症状である。ＩＩ型糖尿病患者では、症状が重篤化するまで発症に気付かず、慢性的な高血糖による糖尿病合併症がすでに進展した時に診断されることが多い。多くの場合は、食事療法、運動療法、経口薬で血糖値を調節することができるが、血糖値の調節は困難である。「糖尿病アトラス第６版」によると、糖尿病患者の８５−９５％をＩＩ型糖尿病患者が占めると見積もられている。

ＩＩ型糖尿病治療薬のなかには、服用したあと低血糖を引き起こすものがあるが、低血糖が出にくい経口薬として近年開発されたものの一つにジペプチジルペプチダーゼＩＶ（以下「ＤＰＰＩＶ」と略称する。）阻害剤がある。
ＤＰＰＩＶは、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類において、広範な組織に分布する多機能のＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。一般的にオリゴペプチドやポリペプチドのアミノ末端から、Ｘａａ−ＰｒｏまたはＸａａ−Ａｌａのジペプチド（ここでＸａａはどのようなアミノ酸でも良い）を好んで切り出すことができるセリン型エキソペプチダーゼである。ただし、Ｘａａ−Ｐｒｏの切り出しはＸａａ−Ａｌａの切り出しに比べて圧倒的に速い。本酵素は、最初にグリシルプロリル−ナフチルアミダーゼとして文献記載されたが（非特許文献１参照）、その後、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶあるいはポストプロリンジペプチジルペプチダーゼＩＶと命名された（非特許文献２参照）。

ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットなどの酵素では比較的相同性が高いヒトＤＰＰＩＶは、７６６アミノ酸残基から成り、糖鎖修飾を受けた分子量は約１２０，０００である。アミノ末端（Ｎ末端）の６残基が細胞質側に出て、細胞質尾部を構成し、それに続く２４残基は膜貫通ドメインを形成している。さらに、これに続いて７３６残基からなる細胞外ドメインがある。この細胞外ドメインには糖修飾を受ける部位、システインに富む部位、およびペプチド結合の加水分解反応に関与する触媒活性部位が存在する（非特許文献３参照）。一方、血清や他の体液（精液、だ液、胆汁など）に可溶性ＤＰＰＩＶが見出されている。これは、細胞外ドメインに存在するＳｅｒ３９残基の位置で、プロテアーゼによる加水分解的な切断を受けて、細胞質尾部と膜貫通ドメインが切り離され、可溶化型になったものである（非特許文献４参照）。

ヒトＤＰＰＩＶでは、酵素活性の発現に必須の活性残基はＳｅｒ６３０、Ａｓｐ７０８、Ｈｉｓ７４０（マウスのＤＰＰＩＶではＳｅｒ６２４、Ａｓｐ７０２、Ｈｉｓ７３４）であり、これらが触媒性トライアッドを構成しており、本酵素はセリン型エキソペプチダーゼ（クランＳＣ）に分類される（非特許文献５参照）。ＤＰＰＩＶは、細胞表面で２分子が非共有結合で会合したホモダイマーを取っている。また、ＤＰＰＩＶは、Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ２６（非特許文献６参照）およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）結合タンパク質（非特許文献７参照）と同一物質であり、典型的な多機能性タンパク質である。

ＤＰＰＩＶの最も研究された機能は、インクレチンホルモン分解を通したグルコース恒常性への関与である。インクレチンは、栄養素の摂取に伴って消化管から分泌され、すい臓β細胞に作用してインスリン分泌を促進する一群のインスリン分泌性ホルモンの総称である。グルコースを経口投与すると、経静脈投与の場合よりも効果的なインスリン分泌作用が見られ、このような作用のことをインクレチン効果とよんでいる。インクレチンの主要な構成メンバーはグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）とグルコース依存性インスリン分泌ポリペプチド（ＧＩＰ）である。ＧＬＰ−１とＧＩＰは、食物の摂取に応答して腸から分泌される（非特許文献８参照）。ＧＬＰ−１は、小腸下部のＬ細胞から分泌される。まず前駆型のプログルカゴンとして生産されたのち活性化を受けて、活性型ＧＬＰ−１（７−３６残基から構成される）として血液循環内に産出される。しかし、活性型ＧＬＰ−１のＮ末端ジペプチド（Ｈｉｓ−Ａｌａ）はＤＰＰＩＶによって切り離されて、すみやかに不活性型ＧＬＰ−１（９−３６残基から構成される）に変換される。同様に、活性型ＧＩＰ（１−４２残基）は、ＤＰＰＩＶによりＮ末端ジペプチド（Ｔｙｒ−Ａｌａ）が切り離されて、不活性型ＧＩＰ（３−４３残基）に変換される（非特許文献９参照）。活性型のＧＬＰ−１およびＧＩＰの血中半減期は数分程度と考えられている。一方、ＩＩ型糖尿病においてはインクレチン反応が低下し、その結果、インスリン分泌が減少する。そのため、血液中のＤＰＰＩＶ活性を阻害することができると、インクレチンの分解を遅延させることができ、インスリン産生を高めることが期待出来る（非特許文献１０参照）。

現在までに使用が認められた合成ＤＰＰＩＶ阻害剤としては、シタグリプチン、サクサグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン、リナグリプチン、アナグリプチン、テネグリプチンなどが存在する（非特許文献１１−１５参照）。これらの合成ＤＰＰＩＶ阻害剤には、頭痛、感染、吐き気、肝機能不全、過敏性反応（アナフィラキシーショック、血管性浮腫、剥離性皮膚疾患）などの副作用が認められている（非特許文献１１，１３参照）。このような理由から、副作用を示さない天然由来素材のＤＰＰＩＶ阻害剤に大きな期待が寄せられている。近年、チーズ、カボチャ、魚、卵黄、海藻、米ぬかを含む様々な食品を原料としたＤＰＰＩＶ阻害剤が報告されてきた（特許文献１，非特許文献１６−２０参照）。

ミミズは古くから漢方薬として解熱、利尿、血流改善などに用いられてきた。また、ミミズを原料としたミミズ乾燥粉末を用いた健康食品も存在する（特許文献２−４参照）。このように、ミミズには十分な食経験があるため、安全な食品であると考えられる。また、ミミズは条件を満たせば一年中繁殖が可能であり、生産性にも優れている。近年は、生ごみ処理とそれに伴う肥料の製造に、コンポストの形でミミズが利用されている。一方、ミミズは、古くから世界各地で、魚釣りのエサとして、あるいはニワトリなどの家禽のエサとしても用いられてきた。

ミミズの体液や破砕液や自己消化液、およびこれらから調製されたミミズ乾燥粉末には、血栓溶解作用（非特許文献２１，２２参照）やタンパク質分解作用（非特許文献２３，２４参照）、アミラーゼ活性やセルラーゼ活性（非特許文献２５、２６参照）、キュウリモザイクウイルスなどの植物ウイルスに対する抗ウイルス活性（非特許文献２７参照）、抗エラスターゼ、抗チロシナーゼ、抗マトリクスメタロプロテイナーゼ１（非特許文献２８参照）などの生理作用が報告されている。しかしながら、現在までに、ミミズやその乾燥粉末において、ＤＰＰＩＶ阻害活性は報告されていない。

特開２００７―３９４２４号公報特開２０１５―０４８３４２号公報特開２０１２―２１９０７０号公報特開２０１５―０４８３５３号公報

Ｖ．Ｋ．Ｈｏｐｓｕ−Ｈａｖｕら、Ａｎｅｗｄｉｐｅｐｔｉｄｅｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄａｓｅｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｇｌｙｃｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ−β −ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅ，７、１９７−２０１、１９６６Ｔ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、Ｐｏｓｔ−ｐｒｏｌｉｎｅｃｌｅａｖｉｎｇｅｎｚｙｍｅａｎｄｐｏｓｔ−ｐｒｏｌｉｎｅｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３、３７０８−３０１６、１９７８Ｒ．Ｍｅｎｔｌｅｉｎ、Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅＩＶ（ＣＤ２６）−−ｒｏｌｅｉｎｔｈｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，８５、９−２４、１９９９Ｓ．Ｉｗａｋｉ−Ｅｇａｗａら、ＤｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅＩＶｆｒｏｍｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４、４２８−４３３、１９９８Ｆ．Ｄａｖｉｄら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｅｒｉｎｅ６２４，ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ７０２，ａｎｄｈｉｓｔｉｄｉｎｅ７３４ａｓｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｔｒｉａｄｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆｍｏｕｓｅｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅＩＶ（ＣＤ２６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８、１７２４７−１７２５２、１９９３Ｂ．Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ、ＣＤ２６：ａｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎＴ−ｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１５、１８０−１８４、１９９４Ｅ．Ｒｉｃｈａｒｄら、ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＣｈａｒｇｅｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓｏｆＨｕｍａｎＡｄｅｎｏｓｉｎｅＤｅａｍｉｎａｓｅＣｏｍｐｒｉｓｅａＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＥｐｉｔｏｐｅｆｏｒＢｉｎｄｉｎｇｔｈｅＡｄｅｎｏｓｉｎｅＤｅａｍｉｎａｓｅＣｏｍｐｌｅｘｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎＣＤ２６／ＤｉｐｅｐｔｉｄｙｌＰｅｐｔｉｄａｓｅＩＶ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７、１９７２０−１９７２６、２００２Ｃ．Ｄｅａｃｏｎら、ＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｖｅｉｎｃｒｅｔｉｎｈｏｒｍｏｎｅｓｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅＩＶｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｍｅａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｃｒｅｔｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｄｏｇｓ、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１７２：３５５−３６２、２００２Ｒ．Ｍｅｎｔｌｅｉｎら、Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅＩＶｈｙｄｒｏｌｙｓｅｓｇａｓｔｒｉｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ，ｐｅｐｔｉｄｅｈｉｓｔｉｄｉｎｅｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅａｎｄｉｓｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｔｈｅｉｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４、８２９−８３５、１９９３Ｈ．Ｍｉｔａｎｉら、ＤｉｐｅｐｔｉｄｙｌＰｅｐｔｉｄａｓｅＩＶＩｎｈｉｂｉｔｏｒＮＶＰ−ＤＰＰ７２８ＡｍｅｌｉｏｒａｔｅｓＥａｒｌｙＩｎｓｕｌｉｎＲｅｓｐｏｎｓｅａｎｄＧｌｕｃｏｓｅＴｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＡｇｅｄＲａｔｓｂｕｔＮｏｔｉｎＡｇｅｄＦｉｓｃｈｅｒ３４４ＲａｔｓＬａｃｋｉｎｇＩｔｓＥｎｚｙｍｅＡｃｔｉｖｉｔｙ、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，８８：４５１−４５８（２００２）Ｍ．Ｅ．Ｃｏｘら、Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉｎｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ：ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙ、ＤｒｕｇＨｅａｌｔｈｃＰａｔｉｅｎｔＳａｆ．，２、７−１９、２０１０Ｐ．Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ，ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ，ａｎｄｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｔｈｅｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４ｉｎｈｉｂｉｔｏｒａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ：Ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｄｏｓｅｓｔｕｄｙｉｎａｄｕｌｔｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．，３０、４９９−５１２、２００８Ｄ．Ｓｉｎｇｈ−Ｆｒａｎｃｏら、Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎｏｎｇｌｙｃａｅｍｉｃｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ：ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗａｎｄｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ、ＤｉａｂｅｔｅｓＯｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ．，１４、６９４−７０８、２０１２Ｈ．Ｋ．Ｙａｎｇら、Ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｈａｓｅ３ｔｒｉａｌｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙａｎｄｓａｆｅｔｙｏｆａｎａｇｌｉｐｔｉｎｉｎｄｒｕｇ−ｎａｉｖｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．，６２、４４９−４６２、２０１５Ｈ．Ｏｔｓｕｋｉら、Ｓａｆｅｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｅｎｅｌｉｇｌｉｐｔｉｎ：ａｎｏｖｅｌＤＰＰ−４ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｆｏｒｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ、Ｉｎｔ．Ｕｒｏｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，４６、４２７−４３２、２０１４Ｂ．Ｋｏｎｒａｄら、ＴｈｅＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＤｉｐｅｐｔｉｄｙｌＰｅｐｔｉｄａｓｅ（ＤＰＰ）−ＩＶ， α−ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｎｄＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＣｏｎｖｅｒｔｉｎｇＥｎｚｙｍｅ（ＡＣＥ）ＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＡｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＷｈｅｙＰｒｏｔｅｉｎｓＨｙｄｒｏｌｙｚｅｄｗｉｔｈＳｅｒｉｎｅＰｒｏｔｅａｓｅＩｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＡｓｉａｎＰｕｍｐｋｉｎ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｆｉｃｉｆｏｌｉａ）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．，２０、４８３−４９１、２０１４Ｅ．Ｃ．Ｌｉ−Ｃｈａｎら、ＰｅｐｔｉｄｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＡｔｌａｎｔｉｃｓａｌｍｏｎｓｋｉｎｇｅｌａｔｉｎａｓｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅＩＶｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．，６０、９７３−９７８、２０１２Ａ．Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍａｎｅｇｇｙｏｌｋｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，４７、３６９−３８０、２０１５Ｐ．Ａ．Ｈａｍｅｄｙ，ら、Ｉｎｖｉｔｒｏａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｈｅｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ，ａｎｔｉ−ｄｉａｂｅｔｉｃａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＰａｌｍａｒｉａｐａｌｍａｔａｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．，２５、１７９３−１８０３、２０１３Ｔ．Ｈａｔａｎａｋａら、ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅＩＶｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｐｅｐｔｉｄｅｓｆｒｏｍｄｅｆａｔｔｅｄｒｉｃｅｂｒａｎ、ＦｏｏｄＣｈｅｍ．，１３４、７９７−８０２、２０１２Ｈ．Ｍｉｈａｒａら、ＡＮｏｖｅｌＦｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃＥｎｚｙｍｅＥｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅＥａｒｔｈｗｏｒｍ，Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓｒｕｂｅｌｌｕｓ、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４１、４６１−４７２、１９９１Ｉ．Ｈ．Ｃｈｏら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｉｘｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｓｅｒｉｎｅ−ｐｒｏｔｅａｓｅｓｆｒｏｍｅａｒｔｈｗｏｒｍＬｕｍｂｒｉｃｕｓｒｕｂｅｌｌｕｓ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３７、１９９−２０５、２００４Ｎ．Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｏｔｅｎｔｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓｉｎｅａｒｔｈｗｏｒｍ，Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓｒｕｂｅｌｌｕｓ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７、１７２６−１７３０、１９９３Ｆ．Ｗａｎｇら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｇｒｏｕｐｏｆｅａｒｔｈｗｏｒｍｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓｆｒｏｍＥｉｓｅｎｉａｆｅｔｉｄａ、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＬｅｔｔ．，２５、１１０５−１１０９、２００３Ｍ．Ｕｅｄａら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｒａｗ−ｓｔａｒｃｈ−ｄｉｇｅｓｔｉｎｇａｎｄｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ α−ａｍｙｌａｓｅｓｆｒｏｍＥｉｓｅｎｉａｆｏｅｔｉｄａ、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０、１２５−１３０、２００８Ｍ．Ｕｅｄａら、Ａｎｏｖｅｌｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄｃｅｌｌｕｌａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｆｒｏｍＥｉｓｅｎｉａｆｏｅｔｉｄａ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌａｓｅ， β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ， β−１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅ，ａｎｄ β−ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７、２６−３２、２０１０Ｍ．Ｕｅｄａら、Ａｎｏｖｅｌａｎｔｉ−ｐｌａｎｔｖｉｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｃｏｅｌｏｍｉｃｆｌｕｉｄｏｆｔｈｅｅａｒｔｈｗｏｒｍＥｉｓｅｎｉａｆｏｅｔｉｄａ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓａｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５１、３８１−３８５、２００８Ｎ．Ａｚｕｍｉら、Ａｎｔｉ−ｅｌａｓｔａｓｅ，ａｎｔｉ−ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅａｎｄｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅａｒｔｈｗｏｒｍｅｘｔｒａｃｔｓａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｎｅｗａｎｔｉ−ａｇｉｎｇａｇｅｎｔ、ＡｓｉａｎＰａｃ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｂｉｏｍｅｄ．，４、Ｓ３４８−Ｓ３５２、２０１４Ｔ．Ｎａｇａｔｓｕら、ＮｅｗｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｆｏｒＸ−ｐｒｏｌｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ−ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４、４６６−４７６、１９７６Ｋ．Ｆｕｊｉｔａら、Ｓｅｒｕｍｇｌｙｃｙｌｐｒｏｌｉｎｅｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓａｎｄｓｙｓｔｅｍｉｃｌｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，８８、１５−２０、１９７８Ｅ．Ｓｃｈｏｅｎら、ＤｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅＩＶｏｆｈｕｍａｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２３、２５５−２５８、１９８４Ｐ．Ｇ．Ｌａｕｓｔｓｅｎら、Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｏｆｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６８、９８−１０４、２００１

この実情に鑑み、本発明の主たる課題は、高い安全性を有する天然由来素材のヒトＤＰＰＩＶ阻害剤の製造方法を提供する点にある。

本発明の第１特徴構成は、ヒトＤＰＰＩＶの阻害活性を有するヒトＤＰＰＩＶ阻害剤の製造方法であって、
ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を水に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程と、
前記抽出工程で得たミミズ抽出液を限外濾過して、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分をミミズ低分子質量画分として回収する分子質量分画工程とを実行し、
前記分子質量分画工程前の前記ミミズ抽出液を加熱処理又は冷アセトン沈殿処理により濃縮する濃縮工程を実行し、
前記分子質量分画工程で回収したミミズ低分子質量画分を主成分としてヒトＤＰＰＩＶ阻害剤を得る点にある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ミミズ乾燥粉末から得たミミズ抽出液のうち、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分であるミミズ低分子質量画分が、ヒトＤＰＰＩＶに対して阻害活性を有することを見出して、本発明を完成させるに至った。
即ち、ミミズ乾燥粉末は、食経験も豊富であり、天然由来素材で安全性が高いことから、本構成のごとく、ミミズ低分子質量画分を主成分としてヒトＤＰＰＩＶ阻害剤を得ることで、抗糖尿病効果を有する医薬品や、機能性食品、特定保健用食品としての応用が期待できる。また、原料となるミミズは繁殖が容易であり、一年中入手することが出来るため、生産性にも優れている。

本構成によれば、上記濃縮工程を実行することで、ミミズ乾燥粉末の抽出成分のうちの分子質量１０ｋＤａ未満のミミズ低分子質量画分を高濃度で得ることができるので、高いヒトＤＰＰＩＶ阻害活性を発現するヒトＤＰＰＩＶ阻害剤を得ることができる。

本構成によれば、上記濃縮工程において、前記分子質量分画工程前の前記ミミズ抽出液を、加熱処理又は冷アセトン沈殿処理により分画することができる。そして、このように加熱処理又は冷アセトン沈殿処理を濃縮工程における濃縮法として選択すれば、一層高いヒトＤＰＰＩＶ阻害活性を発現するヒトＤＰＰＩＶ阻害剤を得ることができる。

実施例１のミミズ低分子質量画分について各濃度におけるヒトＤＰＰＩＶ阻害率を示すグラフ図

本発明の実施形態について以下に説明する。
本発明に係るヒトＤＰＰＩＶ阻害剤は、ヒトＤＰＰＩＶの阻害活性を有するヒトＤＰＰＩＶ阻害剤であって、ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させて得たミミズ抽出液のうち、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分であるミミズ低分子質量画分を主成分とする。
このヒトＤＰＰＩＶ阻害剤の主成分であるミミズ低分子質量画分は、ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程と、この抽出工程で得たミミズ抽出液を限外濾過して、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分をミミズ低分子質量画分として回収する分子質量分画工程とを実行することで得られる。
そして、詳細については後述する実施例にて説明するが、このようにして得られたミミズ低分子質量画分を主成分とするヒトＤＰＰＩＶ阻害剤は、ヒトＤＰＰＩＶに対して阻害活性を有することが確認できた。

本発明に係るヒトＤＰＰＩＶ阻害剤の製造方法では、上記分子質量分画工程前のミミズ抽出液又は上記分子質量分画工程後のミミズ低分子質量画分を濃縮する濃縮工程を実行しても構わない。このことで、ミミズ乾燥粉末の抽出成分のうちの分子質量１０ｋＤａ未満のミミズ低分子質量画分を高濃度で得ることができるので、高いヒトＤＰＰＩＶ阻害活性を発現するヒトＤＰＰＩＶ阻害剤を得ることができる。

更に、この濃縮工程としては、冷エタノール沈殿処理、冷アセトン沈殿処理、加熱処理などの公知の濃縮処理法を採用することができるが、特に加熱処理又は冷アセトン沈殿処理を濃縮工程における濃縮処理法として選択すれば、一層高いＤＰＰＩＶ阻害活性を発現するＤＰＰＩＶ阻害剤を得ることができる。

また、上記抽出工程を、ミミズ乾燥粉末をイオン交換水に懸濁させた懸濁液を遠心分離して、上清又は当該上清のフィルターによる濾過液を前記ミミズ抽出液として得る工程とすることで、ミミズ乾燥粉末の抽出成分を比較的高濃度且つ高純度で分離することができる。

以下に本発明の実施例及びその効果の実証するための試験例を説明する。

＜ミミズ乾燥粉末の調製方法＞
本実施例におけるミミズ乾燥粉末の調整方法について以下に説明する。
水道水で洗浄したＬｕｍｂｒｉｃｉｄａｅ科に属するミミズ（具体的にはＥｉｓｅｎｉａｆｅｔｉｄａ）１．５ｋｇを３Ｌ（リットル）の５％ＮａＨＣＯ_３溶液に３０分間浸漬し、体腔液を除去した（特許文献４参照）。次に、そのミミズを水道水で洗浄後、フードプロセッサーで破砕した。次に、そのミミズの破砕物をプラスチックバックに入れ、高圧装置（シナダ製、ＳＨＰ１００−５０Ａ）を用いて６０℃、１００ＭＰａ、１６時間の高静水圧処理を行うことで、自己消化させた。得られたミミズ自己消化物を５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清６５０ｇを回収した。上清は凍結乾燥することで、ミミズ乾燥粉末１５０ｇを回収した。

［実施例１］
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末２．００ｇを２００ｍＬのイオン交換水に懸濁して１０％（ｗ／ｖ）のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径５μｍのフィルター、続いて孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子質量分画工程において、ミミズ抽出液を、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＧＥヘルスケア製、ＭＷＣＯ：１０，０００）を用いて限外濾過し、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分である限外濾過液をミミズ低分子質量画分（実施例１）として得た。更に、これを凍結乾燥して、乾燥粉末とした。２回の実験でそれぞれ、１．０１ｇ、１．０４ｇのミミズ低分子質量画分の乾燥粉末を得た。

＜ＤＰＰＩＶ阻害活性測定試験＞
ＤＰＰＩＶの活性測定は、発光基質法に基づいたＤＰＰＩＶｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙｋｉｔ（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ製）を用いて行った。Ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ）を基質として用いて、ＤＰＰＩＶを作用させると、加水分解作用によりｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ（ｐＮＡ）が生成する。ＤＰＰＩＶ活性は、このｐＮＡの４０５ｎｍにおける吸光度変化（ΔＡ_４０５）を測定することにより測定することが出来る（非特許文献２９−３１参照）。

３７℃でプレインキュベートした５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）３５μＬに１７ｍＵ／ｍＬヒトＤＰＰＩＶ（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｌｏｔ：１２１１１３１１Ｂ）１５μＬを加え、この混合物に３７℃でプレインキュベートした０．２ｍＭＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを５０μＬ加えることにより反応を開始した。マイクロプレートリーダー（コロナ電気製、ＭＴＰ−３１０Ｌａｂ）、で生成したｐＮＡによるΔＡ_４０５を１分ごとに２０分間測定した。５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と０．２ｍＭＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを混合したものをブランク（対照）とした。ＤＰＰＩＶを添加した時に観測された測定値からブランク値を差し引いた値を、酵素活性に基づいて生成したｐＮＡのΔＡ_４０５とした。２０分間にわたりΔＡ_４０５を測定し、直線的な増加が観測されることを確認したうえで、１分間あたりのΔＡ_４０５を算出した。ｐＮＡの４０５ｎｍにおける分子吸光係数（ε_４０５）は、９，６２０Ｍ^−１ｃｍ^−１（非特許文献３２参照）であり、この値と１分間当たりのΔＡ_４０５とから、１分間あたりに生成するｐＮＡ量（μＭ／ｍｉｎ）を算出した。

そして、ミミズ低分子質量画分のＤＰＰＩＶ阻害活性は、以下の要領で測定した。
実施例１のミミズ低分子質量画分の乾燥粉末を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し、１００、５０、２５、１２．５ｍｇ／ｍＬの溶液を作製した。各濃度のサンプルと３７℃でプレインキュベートした５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を合わせて３５μＬとし、これに１７ｍＵ／ｍＬのヒトＤＰＰＩＶ（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ製、ロット番号：１２１１１３１１Ｂ）を１５μＬ加えた。さらに、この混合物に３７℃でプレインキュベートした０．２ｍＭＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを５０μＬ加えることにより反応を開始した。そして、［１−（サンプルの活性値／コントロールの活性値）］×１００をＤＰＰＩＶ阻害率（％）とした。そして、サンプルの終濃度と各濃度での阻害率を片対数プロットして、ＩｍａｇｅＪのカーブフィッティングソフトを用いた近似曲線から５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）を算出した。

図１（ａ）（ｂ）には、実施例１の２種のミミズ低分子質量画分について、各濃度におけるＤＰＰＩＶ阻害率を示した。どちらのミミズ低分子質量画分でも２．５ｍｇ／ｍＬ以下ではＤＰＰＩＶ阻害を確認することが出来なかったが、５ｍｇ／ｍＬ以上では濃度依存的に阻害率の上昇が確認された。阻害曲線から求めたＩＣ_５０は、作製した２種のミミズ低分子質量画分ともに１１ｍｇ／ｍＬと算出された。この結果から、実施例１のミミズ低分子質量画分には、ヒトＤＰＰＩＶに対して阻害活性を有することが示された。

［比較例１］
上記実施例１において限外濾過膜を通過しなかった分子質量１０ｋＤａ以上の高分子質量画分をミミズ高分子質量画分（比較例１）とし、凍結乾燥して、乾燥粉末とした。
このように得られた比較例１のミミズ高分子質量画分の凍結乾燥粉末は２回の実験でそれぞれ０．５７ｇ、０．５６ｇであった。これらの粉末を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬ溶液として、上述したＤＰＰＩＶ阻害活性測定試験と同条件でＤＰＰＩＶ阻害活性を測定した。

その結果、ＤＰＰＩＶのみでの活性が、１．２μＭ／ｍｉｎであったのに対し、比較例１のミミズ高分子質量画分を加えると、それぞれ２．６、２．９μＭ／ｍｉｎとなりＤＰＰＩＶのみの場合と比較して２倍以上の値となった。従って、比較例１のミミズ高分子質量画分にはＤＰＰＩＶ阻害活性が認められないことが示された。比較例１のミミズ高分子質量画分の添加により、ＤＰＰＩＶ活性が逆に増大したことから、当該ミミズ高分子質量画分画分には、ＤＰＰＩＶ基質（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ）を分解するＤＰＰＩＶ様の活性ないしは活性測定に用いたヒトＤＰＰＩＶの活性を増強させる活性が含まれることが示された。

次に、各種濃縮工程を実行した実施例について説明する。

［実施例２］
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末２．００ｇを２００ｍＬのイオン交換水に懸濁して１０％（ｗ／ｖ）のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径５μｍのフィルター、続いて孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子質量分画工程において、ミミズ抽出液を、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＧＥヘルスケア製、ＭＷＣＯ：１０，０００）を用いて限外濾過し、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分である限外濾過液を得た。
次に、この限外濾過液１０ｍＬを、７０℃のウォーターバスで３０分間加熱する加熱処理により分画する濃縮工程を実行した。加熱処理後の限外濾過液を室温２５℃に３０分間冷却後、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離して、上清を凍結乾燥した。この画分を後加熱処理ミミズ低分子質量画分（実施例２）と呼ぶ。

［実施例３］
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末２．００ｇを２００ｍＬのイオン交換水に懸濁して１０％（ｗ／ｖ）のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径５μｍのフィルター、続いて孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、このミミズ抽出液１０ｍＬを、７０℃、３０分間の加熱処理により分画する濃縮工程を実行した。
次に、分子質量分画工程において、加熱処理後のミミズ抽出液を室温２５℃に３０分間冷却後、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離して得られた上清を、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＧＥヘルスケア製、ＭＷＣＯ：１０，０００）を用いて限外濾過し、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分である限外濾過液をミミズ低分子質量画分として得た。この画分を前加熱処理ミミズ低分子質量画分（実施例３）と呼ぶ。

［実施例４］
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末２．００ｇを２００ｍＬのイオン交換水に懸濁して１０％（ｗ／ｖ）のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径５μｍのフィルター、続いて孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子質量分画工程において、ミミズ抽出液を、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＧＥヘルスケア製、ＭＷＣＯ：１０，０００）を用いて限外濾過し、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分である限外濾過液を得た。
次に、この限外濾過液を冷アセトン沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。具体的には、限外濾過液１０ｍＬに−２０℃の冷却１００％アセトンを４０ｍＬ加え懸濁した。その後、４℃、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離して得られた沈殿物を１０ｍＬのイオン交換水で懸濁した。懸濁液はさらに遠心分離し、上清を凍結乾燥した。この画分を後冷アセトン沈殿処理ミミズ低分子質量画分（実施例４）と呼ぶ。

［実施例５］
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末２．００ｇを２００ｍＬのイオン交換水に懸濁して１０％（ｗ／ｖ）のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径５μｍのフィルター、続いて孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、このミミズ抽出液を冷アセトン沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。具体的には、ミミズ抽出液１０ｍＬに−２０℃の冷却１００％アセトンを４０ｍＬ加え懸濁した。その後、４℃、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離して得られた沈殿物を１０ｍＬのイオン交換水で懸濁した。
次に、分子質量分画工程において、その懸濁液を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離して得られた上清を、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＧＥヘルスケア製、ＭＷＣＯ：１０，０００）を用いて限外濾過し、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分である限外濾過液をミミズ低分子質量画分として得た。この画分を前冷アセトン沈殿処理ミミズ低分子質量画分（実施例５）と呼ぶ。

［実施例６］
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末２．００ｇを２００ｍＬのイオン交換水に懸濁して１０％（ｗ／ｖ）のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径５μｍのフィルター、続いて孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子質量分画工程において、ミミズ抽出液を、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＧＥヘルスケア製、ＭＷＣＯ：１０，０００）を用いて限外濾過し、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分である限外濾過液を得た。
次に、この限外濾過液を冷エタノール沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。具体的には、限外濾過液１０ｍＬに−２０℃に冷却した９９．５％エタノールを４０ｍＬ加え懸濁した。その後、４℃、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離して得られた沈殿物を１０ｍＬのイオン交換水で懸濁した。懸濁液はさらに遠心分離し、上清を凍結乾燥した。
この画分を後冷エタノール沈殿処理ミミズ低分子質量画分（実施例６）と呼ぶ。

［実施例７］
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末２．００ｇを２００ｍＬのイオン交換水に懸濁して１０％（ｗ／ｖ）のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径５μｍのフィルター、続いて孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、このミミズ抽出液を冷エタノール沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。
具体的には、ミミズ抽出液１０ｍＬに−２０℃の冷却１００％エタノールを４０ｍＬ加え懸濁した。その後、４℃、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離して得られた沈殿物を１０ｍＬのイオン交換水で懸濁した。
次に、分子質量分画工程において、その懸濁液を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離して得られた上清を、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ＧＥヘルスケア製、ＭＷＣＯ：１０，０００）を用いて限外濾過し、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分である限外濾過液をミミズ低分子質量画分として得た。この画分を前冷エタノール沈殿処理ミミズ低分子質量画分（実施例７）と呼ぶ。

上記実施例１−７で得られた各サンプルのＤＰＰＩＶ阻害活性を、ＤＰＰＩＶｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙｋｉｔ（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。各サンプルの１００ｍｇ／ｍＬ溶液を１０μＬ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を２５μＬ、１７ｍＵ／ｍＬのヒトＤＰＰＩＶ（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ロット番号：１２１１１３１１Ｂ）を１５μＬ、０．２ｍＭＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを５０μＬ加えることで反応を開始した。その後、上述したＤＰＰＩＶ阻害活性測定試験と同様の方法で各サンプルのＤＰＰＩＶ阻害率を算出した。
上記実施例１−７で得られた各サンプルの回収量（重量）と終濃度１０ｍｇ／ｍＬでのＤＰＰＩＶ阻害率とを表１に示す。

結果、回収量に関しては、分子質量分画工程の前後に冷エタノール沈殿処理による濃縮工程を実行した実施例６，７のサンプルでは、何れも冷エタノール沈殿処理において沈殿物があまり回収できなかったため、回収量が少なかった。一方で、分子質量分画工程の前後に冷アセトン沈殿処理や加熱処理による濃縮工程を実行した実施例２−５のサンプルでは、何れも回収量が多く、特に、実施例２の後加熱処理ミミズ低分子質量画分や、実施例５の前冷アセトン沈殿処理ミミズ低分子質量画分では、実施例１の濃縮工程を実行していない未処理のミミズ低分子質量画分とほとんど同じ回収量であった。更に、実施例３の前加熱処理ミミズ低分子質量画分では、実施例１の未処理のミミズ低分子質量画分よりも回収量が多くなった。

ＤＰＰＩＶ阻害率に関しては、分子質量分画工程の前後に冷エタノール沈殿処理による濃縮工程を実行した実施例６，７のサンプルでは、何れもＤＰＰＩＶ阻害率が２５％程度となり、実施例１の未処理のミミズ低分子質量画分よりも低くなった。従って、強いＤＰＰＩＶ阻害剤はエタノールでは、十分沈殿しないものと考えられる。
一方、分子質量分画工程の前後に冷アセトン沈殿処理による濃縮工程を実行した実施例４，５のサンプルでは、何れも実施例１の未処理のミミズ低分子質量画分よりも高いＤＰＰＩＶ阻害率を示した。特に、実施例５の後冷アセトン沈殿処理ミミズ低分子質量画分では、本実験で最も高いＤＰＰＩＶ阻害率（５１％）が確認された。
分子質量分画工程の前後に加熱処理による濃縮工程を実行した実施例２，３のサンプルでも、何れも実施例１の未処理のミミズ低分子質量画分よりも高いＤＰＰＩＶ阻害率が確認された。この結果から、ミミズ乾燥粉末由来のＤＰＰＩＶ阻害剤は熱安定であると考えられる。
以上の結果より、分子質量分画工程の前後に加熱処理又は冷アセトン沈殿処理による濃縮工程を実行した実施例２−５のサンプルでは、回収量も多く、ＤＰＰＩＶ阻害活性も高いため、加熱処理又は冷アセトン沈殿処理が優れた初期分画であると考えられる。さらに、これらの分画は分子質量分画工程の前に行うことでより効果的であった。
このようにして得られたミミズ乾燥粉末由来のＤＰＰＩＶ阻害剤は、食品や飲料に配合して機能性食品などへ用いることも可能であるが、さらに凍結乾燥やスプレードライなど公知の方法で粉末化したものを用いることも可能である。

〔別実施形態〕
（１）上記実施形態では、分子質量分画工程前のミミズ抽出液又は分子質量分画工程後のミミズ低分子質量画分を濃縮する濃縮工程において、冷エタノール沈殿処理、冷アセトン沈殿処理、又は、加熱処理の濃縮処理法を採用した例を示したが、別の濃縮処理法を採用しても構わない。

（２）上記実施形態では、Ｌｕｍｂｒｉｃｉｄａｅ科に属するミミズを用いたが、健康食品用・薬剤用で用いられる別の科に属するミミズを原料として用いてもよい。

（３）本実施形態におけるＤＰＰＩＶ阻害剤の製造方法に含まれる各工程の処理条件については適宜変更可能である。

（４）本実施形態では、ミミズの破砕物に高静水圧処理を行った後に、遠心分離後の上清を凍結乾燥して調整されたミミズ乾燥粉末を原料として用いたが、別の方法で調整されたものや市販のミミズ乾燥粉末を原料として用いても構わない。

Claims

ヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害活性を有するヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法であって、
ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を水に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程と、
前記抽出工程で得たミミズ抽出液を限外濾過して、分子質量１０ｋＤａ未満の低分子質量画分をミミズ低分子質量画分として回収する分子質量分画工程とを実行し、
前記分子質量分画工程前の前記ミミズ抽出液を加熱処理又は冷アセトン沈殿処理により濃縮する濃縮工程を実行し、
前記分子質量分画工程で回収したミミズ低分子質量画分を主成分としてジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤を得るヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
前記分子質量分画工程で回収したミミズ低分子質量画分を２．５ｍｇ／ｍＬ超の濃度でＴｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してジペプチジルペプチダーゼ阻害剤を得る請求項１に記載のヒトジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。