JP2017043557A - ヒトジペプチジルペプチダーゼiv阻害剤の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
国際糖尿病連合(IDF)が出版した「糖尿病アトラス 第6版」によると、2013年に世界中の糖尿病患者数は約3億8200万人と見積もられており、糖尿病が原因の死亡者数は510万人にのぼる。糖尿病患者はさらに増加傾向にあり、2035年には5億9200万人にまで増えると予想されている。
DPPIVは、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類において、広範な組織に分布する多機能のII型膜貫通糖タンパク質である。一般的にオリゴペプチドやポリペプチドのアミノ末端から、Xaa−ProまたはXaa−Alaのジペプチド(ここでXaaはどのようなアミノ酸でも良い)を好んで切り出すことができるセリン型エキソペプチダーゼである。ただし、Xaa−Proの切り出しはXaa−Alaの切り出しに比べて圧倒的に速い。本酵素は、最初にグリシルプロリル−ナフチルアミダーゼとして文献記載されたが(非特許文献1参照)、その後、ジペプチジルアミノペプチダーゼIVあるいはポストプロリンジペプチジルペプチダーゼIVと命名された(非特許文献2参照)。
ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させて得たミミズ抽出液のうち、分子量10kDa未満の低分子量画分であるミミズ低分子量画分を主成分とする点にある。
ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程と、
前記抽出工程で得たミミズ抽出液を限外濾過して、分子量10kDa未満の低分子量画分をミミズ低分子量画分として回収する分子量分画工程とを実行し、
前記分子量分画工程で回収したミミズ低分子量画分を主成分としてDPPIV阻害剤を得る点にある。
即ち、ミミズ乾燥粉末は、食経験も豊富であり、天然由来素材で安全性が高いことから、本構成のごとく、ミミズ低分子量画分を主成分としてDPPIV阻害剤を得ることで、抗糖尿病効果を有する医薬品や、機能性食品、特定保健用食品としての応用が期待できる。また、原料となるミミズは繁殖が容易であり、一年中入手することが出来るため、生産性にも優れている。
本発明に係るDPPIV阻害剤は、DPPIVの阻害活性を有するDPPIV阻害剤であって、ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させて得たミミズ抽出液のうち、分子量10kDa未満の低分子量画分であるミミズ低分子量画分を主成分とする。
このDPPIV阻害剤の主成分であるミミズ低分子量画分は、ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程と、この抽出工程で得たミミズ抽出液を限外濾過して、分子量10kDa未満の低分子量画分をミミズ低分子量画分として回収する分子量分画工程とを実行することで得られる。
そして、詳細については後述する実施例にて説明するが、このようにして得られたミミズ低分子量画分を主成分とするDPPIV阻害剤は、DPPIVに対して阻害活性を有することが確認できた。
本実施例におけるミミズ乾燥粉末の調整方法について以下に説明する。
水道水で洗浄したLumbricidae科に属するミミズ(具体的にはEisenia fetida)1.5kgを3L(リットル)の5%NaHCO3溶液に30分間浸漬し、体腔液を除去した(特許文献4参照)。次に、そのミミズを水道水で洗浄後、フードプロセッサーで破砕した。次に、そのミミズの破砕物をプラスチックバックに入れ、高圧装置(シナダ製、SHP100−50A)を用いて60℃、100MPa、16時間の高静水圧処理を行うことで、自己消化させた。得られたミミズ自己消化物を5,000×gで10分間遠心分離し、上清650gを回収した。上清は凍結乾燥することで、ミミズ乾燥粉末150gを回収した。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子量分画工程において、ミミズ抽出液を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子量10kDa未満の低分子量画分である限外濾過液をミミズ低分子量画分(実施例1)として得た。更に、これを凍結乾燥して、乾燥粉末とした。2回の実験でそれぞれ、1.01g、1.04gのミミズ低分子量画分の乾燥粉末を得た。
DPPIVの活性測定は、発光基質法に基づいたDPPIV drug discovery kit(Enzo Life Sciences製)を用いて行った。Glycyl−L−proline p−nitroanilide(Gly−Pro−pNA)を基質として用いて、DPPIVを作用させると、加水分解作用によりp−nitroaniline(pNA)が生成する。DPPIV活性は、このpNAの405nmにおける吸光度変化(ΔA405)を測定することにより測定することが出来る(非特許文献29−31参照)。
実施例1のミミズ低分子量画分の乾燥粉末を50mM Tris−HCl(pH7.5)に溶解し、100、50、25、12.5mg/mLの溶液を作製した。各濃度のサンプルと37℃でプレインキュベートした50mM Tris−HCl(pH7.5)を合わせて35μLとし、これに17mU/mLのヒトDPPIV(Enzo Life Sciences製、ロット番号:12111311B)を15μL加えた。さらに、この混合物に37℃でプレインキュベートした0.2mM Gly−Pro−pNAを50μL加えることにより反応を開始した。そして、[1−(サンプルの活性値/コントロールの活性値)]×100をDPPIV阻害率(%)とした。そして、サンプルの終濃度と各濃度での阻害率を片対数プロットして、ImageJのカーブフィッティングソフトを用いた近似曲線から50%阻害濃度(IC50)を算出した。
上記実施例1において限外濾過膜を通過しなかった分子量10kDa以上の高分子量画分をミミズ高分子量画分(比較例1)とし、凍結乾燥して、乾燥粉末とした。
このように得られた比較例1のミミズ高分子量画分の凍結乾燥粉末は2回の実験でそれぞれ0.57g、0.56gであった。これらの粉末を50mM Tris−HCl(pH7.5)に溶解し、10mg/mL 溶液として、上述したDPPIV阻害活性測定試験と同条件でDPPIV阻害活性を測定した。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子量分画工程において、ミミズ抽出液を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子量10kDa未満の低分子量画分である限外濾過液を得た。
次に、この限外濾過液10mLを、70℃のウォーターバスで30分間加熱する加熱処理により分画する濃縮工程を実行した。加熱処理後の限外濾過液を室温25℃に30分間冷却後、15,000×gで10分間遠心分離して、上清を凍結乾燥した。この画分を後加熱処理ミミズ低分子量画分(実施例2)と呼ぶ。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、このミミズ抽出液10mLを、70℃、30分間の加熱処理により分画する濃縮工程を実行した。
次に、分子量分画工程において、加熱処理後のミミズ抽出液を室温25℃に30分間冷却後、15,000×gで10分間遠心分離して得られた上清を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子量10kDa未満の低分子量画分である限外濾過液をミミズ低分子量画分として得た。この画分を前加熱処理ミミズ低分子量画分(実施例3)と呼ぶ。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子量分画工程において、ミミズ抽出液を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子量10kDa未満の低分子量画分である限外濾過液を得た。
次に、この限外濾過液を冷アセトン沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。具体的には、限外濾過液10mLに−20℃の冷却100%アセトンを40mL加え懸濁した。その後、4℃、15,000×gで10分間遠心分離して得られた沈殿物を10mLのイオン交換水で懸濁した。懸濁液はさらに遠心分離し、上清を凍結乾燥した。この画分を後冷アセトン沈殿処理ミミズ低分子量画分(実施例4)と呼ぶ。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、このミミズ抽出液を冷アセトン沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。具体的には、ミミズ抽出液10mLに−20℃の冷却100%アセトンを40mL加え懸濁した。その後、4℃、15,000×gで10分間遠心分離して得られた沈殿物を10mLのイオン交換水で懸濁した。
次に、分子量分画工程において、その懸濁液を15,000×gで10分間遠心分離して得られた上清を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子量10kDa未満の低分子量画分である限外濾過液をミミズ低分子量画分として得た。この画分を前冷アセトン沈殿処理ミミズ低分子量画分(実施例5)と呼ぶ。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子量分画工程において、ミミズ抽出液を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子量10kDa未満の低分子量画分である限外濾過液を得た。
次に、この限外濾過液を冷エタノール沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。具体的には、限外濾過液10mLに−20℃に冷却した99.5%エタノールを40mL加え懸濁した。その後、4℃、15,000×gで10分間遠心分離して得られた沈殿物を10mLのイオン交換水で懸濁した。懸濁液はさらに遠心分離し、上清を凍結乾燥した。この画分を後冷エタノール沈殿処理ミミズ低分子量画分(実施例6)と呼ぶ。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、このミミズ抽出液を冷エタノール沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。具体的には、ミミズ抽出液10mLに−20℃の冷却100%エタノールを40mL加え懸濁した。その後、4℃、15,000×gで10分間遠心分離して得られた沈殿物を10mLのイオン交換水で懸濁した。
次に、分子量分画工程において、その懸濁液を15,000×gで10分間遠心分離して得られた上清を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子量10kDa未満の低分子量画分である限外濾過液をミミズ低分子量画分として得た。この画分を前冷エタノール沈殿処理ミミズ低分子量画分(実施例7)と呼ぶ。
上記実施例1−7で得られた各サンプルの回収量(重量)と終濃度10mg/mLでのDPPIV阻害率とを表1に示す。
一方、分子量分画工程の前後に冷アセトン沈殿処理による濃縮工程を実行した実施例4,5のサンプルでは、何れも実施例1の未処理のミミズ低分子量画分よりも高いDPPIV阻害率を示した。特に、実施例5の後冷アセトン沈殿処理ミミズ低分子量画分では、本実験で最も高いDPPIV阻害率(51%)が確認された。
分子量分画工程の前後に加熱処理による濃縮工程を実行した実施例2,3のサンプルでも、何れも実施例1の未処理のミミズ低分子量画分よりも高いDPPIV阻害率が確認された。この結果から、ミミズ乾燥粉末由来のDPPIV阻害剤は熱安定であると考えられる。
以上の結果より、分子量分画工程の前後に加熱処理又は冷アセトン沈殿処理による濃縮工程を実行した実施例2−5のサンプルでは、回収量も多く、DPPIV阻害活性も高いため、加熱処理又は冷アセトン沈殿処理が優れた初期分画であると考えられる。さらに、これらの分画は分子量分画工程の前に行うことでより効果的であった。
このようにして得られたミミズ乾燥粉末由来のDPPIV阻害剤は、食品や飲料に配合して機能性食品などへ用いることも可能であるが、さらに凍結乾燥やスプレードライなど公知の方法で粉末化したものを用いることも可能である。
(1)上記実施形態では、分子量分画工程前のミミズ抽出液又は分子量分画工程後のミミズ低分子量画分を濃縮する濃縮工程において、冷エタノール沈殿処理、冷アセトン沈殿処理、又は、加熱処理の濃縮処理法を採用した例を示したが、別の濃縮処理法を採用しても構わない。
ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を水に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程と、
前記抽出工程で得たミミズ抽出液を限外濾過して、分子質量10kDa未満の低分子質量画分をミミズ低分子質量画分として回収する分子質量分画工程とを実行し、
前記分子質量分画工程前の前記ミミズ抽出液を加熱処理又は冷アセトン沈殿処理により濃縮する濃縮工程を実行し、
前記分子質量分画工程で回収したミミズ低分子質量画分を主成分としてヒトDPPIV阻害剤を得る点にある。
即ち、ミミズ乾燥粉末は、食経験も豊富であり、天然由来素材で安全性が高いことから、本構成のごとく、ミミズ低分子質量画分を主成分としてヒトDPPIV阻害剤を得ることで、抗糖尿病効果を有する医薬品や、機能性食品、特定保健用食品としての応用が期待できる。また、原料となるミミズは繁殖が容易であり、一年中入手することが出来るため、生産性にも優れている。
本発明に係るヒトDPPIV阻害剤は、ヒトDPPIVの阻害活性を有するヒトDPPIV阻害剤であって、ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させて得たミミズ抽出液のうち、分子質量10kDa未満の低分子質量画分であるミミズ低分子質量画分を主成分とする。
このヒトDPPIV阻害剤の主成分であるミミズ低分子質量画分は、ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程と、この抽出工程で得たミミズ抽出液を限外濾過して、分子質量10kDa未満の低分子質量画分をミミズ低分子質量画分として回収する分子質量分画工程とを実行することで得られる。
そして、詳細については後述する実施例にて説明するが、このようにして得られたミミズ低分子質量画分を主成分とするヒトDPPIV阻害剤は、ヒトDPPIVに対して阻害活性を有することが確認できた。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子質量分画工程において、ミミズ抽出液を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子質量10kDa未満の低分子質量画分である限外濾過液をミミズ低分子質量画分(実施例1)として得た。更に、これを凍結乾燥して、乾燥粉末とした。2回の実験でそれぞれ、1.01g、1.04gのミミズ低分子質量画分の乾燥粉末を得た。
実施例1のミミズ低分子質量画分の乾燥粉末を50mM Tris−HCl(pH7.5)に溶解し、100、50、25、12.5mg/mLの溶液を作製した。各濃度のサンプルと37℃でプレインキュベートした50mM Tris−HCl(pH7.5)を合わせて35μLとし、これに17mU/mLのヒトDPPIV(Enzo Life Sciences製、ロット番号:12111311B)を15μL加えた。さらに、この混合物に37℃でプレインキュベートした0.2mM Gly−Pro−pNAを50μL加えることにより反応を開始した。そして、[1−(サンプルの活性値/コントロールの活性値)]×100をDPPIV阻害率(%)とした。そして、サンプルの終濃度と各濃度での阻害率を片対数プロットして、ImageJのカーブフィッティングソフトを用いた近似曲線から50%阻害濃度(IC50)を算出した。
上記実施例1において限外濾過膜を通過しなかった分子質量10kDa以上の高分子質量画分をミミズ高分子質量画分(比較例1)とし、凍結乾燥して、乾燥粉末とした。
このように得られた比較例1のミミズ高分子質量画分の凍結乾燥粉末は2回の実験でそれぞれ0.57g、0.56gであった。これらの粉末を50mM Tris−HCl(pH7.5)に溶解し、10mg/mL 溶液として、上述したDPPIV阻害活性測定試験と同条件でDPPIV阻害活性を測定した。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子質量分画工程において、ミミズ抽出液を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子質量10kDa未満の低分子質量画分である限外濾過液を得た。
次に、この限外濾過液10mLを、70℃のウォーターバスで30分間加熱する加熱処理により分画する濃縮工程を実行した。加熱処理後の限外濾過液を室温25℃に30分間冷却後、15,000×gで10分間遠心分離して、上清を凍結乾燥した。この画分を後加熱処理ミミズ低分子質量画分(実施例2)と呼ぶ。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、このミミズ抽出液10mLを、70℃、30分間の加熱処理により分画する濃縮工程を実行した。
次に、分子質量分画工程において、加熱処理後のミミズ抽出液を室温25℃に30分間冷却後、15,000×gで10分間遠心分離して得られた上清を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子質量10kDa未満の低分子質量画分である限外濾過液をミミズ低分子質量画分として得た。この画分を前加熱処理ミミズ低分子質量画分(実施例3)と呼ぶ。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子質量分画工程において、ミミズ抽出液を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子質量10kDa未満の低分子質量画分である限外濾過液を得た。
次に、この限外濾過液を冷アセトン沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。具体的には、限外濾過液10mLに−20℃の冷却100%アセトンを40mL加え懸濁した。その後、4℃、15,000×gで10分間遠心分離して得られた沈殿物を10mLのイオン交換水で懸濁した。懸濁液はさらに遠心分離し、上清を凍結乾燥した。この画分を後冷アセトン沈殿処理ミミズ低分子質量画分(実施例4)と呼ぶ。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、このミミズ抽出液を冷アセトン沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。具体的には、ミミズ抽出液10mLに−20℃の冷却100%アセトンを40mL加え懸濁した。その後、4℃、15,000×gで10分間遠心分離して得られた沈殿物を10mLのイオン交換水で懸濁した。
次に、分子質量分画工程において、その懸濁液を15,000×gで10分間遠心分離して得られた上清を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子質量10kDa未満の低分子質量画分である限外濾過液をミミズ低分子質量画分として得た。この画分を前冷アセトン沈殿処理ミミズ低分子質量画分(実施例5)と呼ぶ。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、分子質量分画工程において、ミミズ抽出液を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子質量10kDa未満の低分子質量画分である限外濾過液を得た。
次に、この限外濾過液を冷エタノール沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。具体的には、限外濾過液10mLに−20℃に冷却した99.5%エタノールを40mL加え懸濁した。その後、4℃、15,000×gで10分間遠心分離して得られた沈殿物を10mLのイオン交換水で懸濁した。懸濁液はさらに遠心分離し、上清を凍結乾燥した。
この画分を後冷エタノール沈殿処理ミミズ低分子質量画分(実施例6)と呼ぶ。
先ず、抽出工程において、ミミズ乾燥粉末2.00gを200mLのイオン交換水に懸濁して10%(w/v)のミミズ乾燥粉末溶液を得て、そのミミズ乾燥粉末溶液を10,000×gで10分間遠心分離を行い、更に、上清を孔径5μmのフィルター、続いて孔径0.45μmのメンブレンフィルターで濾過して、その濾過液をミミズ抽出液として得た。
次に、このミミズ抽出液を冷エタノール沈殿処理により分画する濃縮工程を実行した。
具体的には、ミミズ抽出液10mLに−20℃の冷却100%エタノールを40mL加え懸濁した。その後、4℃、15,000×gで10分間遠心分離して得られた沈殿物を10mLのイオン交換水で懸濁した。
次に、分子質量分画工程において、その懸濁液を15,000×gで10分間遠心分離して得られた上清を、VIVA SPIN 20(GEヘルスケア製、MWCO:10,000)を用いて限外濾過し、分子質量10kDa未満の低分子質量画分である限外濾過液をミミズ低分子質量画分として得た。この画分を前冷エタノール沈殿処理ミミズ低分子質量画分(実施例7)と呼ぶ。
一方、分子質量分画工程の前後に冷アセトン沈殿処理による濃縮工程を実行した実施例4,5のサンプルでは、何れも実施例1の未処理のミミズ低分子質量画分よりも高いDPPIV阻害率を示した。特に、実施例5の後冷アセトン沈殿処理ミミズ低分子質量画分では、本実験で最も高いDPPIV阻害率(51%)が確認された。
分子質量分画工程の前後に加熱処理による濃縮工程を実行した実施例2,3のサンプルでも、何れも実施例1の未処理のミミズ低分子質量画分よりも高いDPPIV阻害率が確認された。この結果から、ミミズ乾燥粉末由来のDPPIV阻害剤は熱安定であると考えられる。
以上の結果より、分子質量分画工程の前後に加熱処理又は冷アセトン沈殿処理による濃縮工程を実行した実施例2−5のサンプルでは、回収量も多く、DPPIV阻害活性も高いため、加熱処理又は冷アセトン沈殿処理が優れた初期分画であると考えられる。さらに、これらの分画は分子質量分画工程の前に行うことでより効果的であった。
このようにして得られたミミズ乾燥粉末由来のDPPIV阻害剤は、食品や飲料に配合して機能性食品などへ用いることも可能であるが、さらに凍結乾燥やスプレードライなど公知の方法で粉末化したものを用いることも可能である。
(1)上記実施形態では、分子質量分画工程前のミミズ抽出液又は分子質量分画工程後のミミズ低分子質量画分を濃縮する濃縮工程において、冷エタノール沈殿処理、冷アセトン沈殿処理、又は、加熱処理の濃縮処理法を採用した例を示したが、別の濃縮処理法を採用しても構わない。
Claims (5)
- ジペプチジルペプチダーゼIVの阻害活性を有するジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤であって、
ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させて得たミミズ抽出液のうち、分子量10kDa未満の低分子量画分であるミミズ低分子量画分を主成分とするジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤。 - ジペプチジルペプチダーゼIVの阻害活性を有するジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤の製造方法であって、
ミミズを破砕して得られたミミズ乾燥粉末を抽出溶媒に接触させてミミズ抽出液を得る抽出工程と、
前記抽出工程で得たミミズ抽出液を限外濾過して、分子量10kDa未満の低分子量画分をミミズ低分子量画分として回収する分子量分画工程とを実行し、
前記分子量分画工程で回収したミミズ低分子量画分を主成分としてジペプチジルペプチダーゼ阻害剤を得るジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤の製造方法。 - 前記分子量分画工程前の前記ミミズ抽出液又は前記分子量分画工程後の前記ミミズ低分子量画分を濃縮する濃縮工程を実行する請求項2に記載のジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤の製造方法。
- 前記濃縮工程が、加熱処理又は冷アセトン沈殿処理により分画する工程である請求項3に記載のジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤の製造方法。
- 請求項1に記載のジペプチジルペプチダーゼIV阻害剤を含む含有物。
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