CN109010376B - 糖分解酶抑制剂的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种食用历史悠久且安全性高的源自天然物的糖分解酶抑制剂的制造方法。以蚯蚓或其破碎物或蚯蚓或其破碎物的干燥粉末为原料而得到糖分解酶抑制剂。实行得到蚯蚓提取液的提取工序和得到源自该蚯蚓粉末萃取物的分子质量小于3kDa的组分的分离工序而得到糖分解酶抑制剂。成为抑制对象的规定糖分解酶中的1个为α‑葡糖苷酶。

Description

糖分解酶抑制剂的制造方法
技术领域
本发明涉及一种对特定糖分解酶具有活性抑制效果的糖分解酶抑制剂的制造方法。
背景技术
根据日本厚生劳动省的调查，近年来，强烈被怀疑患有糖尿病的日本成人男女上升到约950万人，且不能排除患有糖尿病的可能性的人也上升到约1100万人(非专利文献1)。并且，根据报告实际接受治疗的患者数为约317万人，每年医疗费用达约1.2兆日元，在国民健康方面、医疗财政方面成为大问题(非专利文献2、非专利文献3)。
糖尿病为因胰岛素生产不足或胰岛素的功能降低而引起的疾病，且呈现血糖值上升，尿中也出现糖等症状。胰岛素为由胰脏的β细胞产生、分泌的激素，除了促进在全身脏器中从血中摄取葡萄糖而降低血糖的功能以外，还发挥促进从肝脏或肌肉中的葡萄糖向糖原的合成，抑制从肝脏中的糖原向葡萄糖的分解等很多重要的作用(非专利文献4)。已知在糖尿病患者中，由于因胰岛素不足而引起的高血糖状态持续，因此损伤蓄积在血管的细胞中而发展成动脉硬化，进而会引起糖尿病性视网膜症、糖尿病性肾病、糖尿病性神经障碍等严重的并发症(非专利文献5)。
糖尿病的主要原因为过食、缺乏运动、肥胖、压力、遗传因素等，大致分为I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病因胰脏β细胞障碍而胰岛素绝对不足，治疗中需要注射胰岛素。另一方面，II型糖尿病因胰岛素生产量降低或胰岛素耐性而胰岛素相对不足，因此治疗中进行饮食疗法、运动疗法或药物疗法。一般认为，日本人中糖尿病患者的95％为II型糖尿病(非专利文献5)。
饮食中所摄取的糖的消化、吸收中，糖分解酶起重要的作用。例如，淀粉首先在口腔内通过唾液的α-淀粉酶(以下，称为唾液淀粉酶)而一部分被切断之后，在小肠中通过胰脏的α-淀粉酶(以下，称为胰淀粉酶)而被分解至麦芽糖，进而通过麦芽糖酶而被分解成葡萄糖。产物葡萄糖经由糖转运体而被小肠上皮细胞摄取，进而被转运到血管内(非专利文献6)。
淀粉酶广义上为将淀粉水解的酶的总称，且分类为在非特定的部位切断糖链的内切型酶和从糖链的非还原末端切断一定数量的葡萄糖单元的外切型酶。α-淀粉酶(酶编号EC3.2.1.1)为仅水解糖链的α1→4葡萄糖苷键的内切型酶，人体中作为同功酶还已知唾液淀粉酶和胰淀粉酶(非专利文献6)。这些同功酶在DNA序列中具有非常高的同源性，在氨基酸序列中90％以上相同，作为酶的性质也极其相似(非专利文献7)。实际上，这些同功酶还共同常见于人的血清或尿中。并且，在动物、植物、微生物和广泛的生物中发现了α-淀粉酶，且根据报告还存在于蚯蚓中(非专利文献8)。
关于以α-淀粉酶为代表的糖分解酶的作用方式，除了内切型、外切型的区分以外，还从如下多个观点进行分类，即，基于切断的葡萄糖苷键的种类的区分、基于最终生成物的种类的区分、基于直链状底物的聚合度与分解速度的关系的区分、基于底物寡糖的切断位置的不同的区分等。这些复杂的作用方式的差异源自各酶的立体结构，但通过假设在包含切断葡萄糖苷键的活性部位的前后的结构中具有被称为亚位点的糖键合部位的结构单元而先行进行了理论性解释(非专利文献9)。然后，根据X射线晶体结构分析，较多的酶的功能通过与亚位点结构建立关联而得以明确，例如根据报告，人的唾液型α-淀粉酶中由496氨基酸、3个结构域构成，在结构域A的深裂纹结构中存在-4至+3的亚位点(成为底物的糖链在-1与+1之间被切断)；对于显现活性而言重要的是亚位点-2的色氨酸残基(非专利文献10)。
外切型淀粉酶从淀粉或直链淀粉的非还原性末端切出特定数的葡萄糖单元。外切型淀粉酶可根据切出的葡萄糖单元的链长而进一步分类。将葡萄糖单元逐一切出的酶称为葡萄糖淀粉酶(酶编号EC3.2.1.3)；将一次切出2个葡萄糖单元(即为麦芽糖单元)的酶称为β-淀粉酶(EC3.2.1.2)；将一次切出3个葡萄糖单元(即为麦芽三糖单元)的酶称为外切异麦芽三糖水解酶(EC3.2.1.95)；将一次切出4个葡萄糖单元(即为麦芽四糖单元)的酶称为外切异麦芽四糖水解酶(EC3.2.1.60)；将一次切出6个葡萄糖单元(即为麦芽六糖单元)的酶称为外切异麦芽六糖水解酶(EC3.2.1.98)。并且，内切型淀粉酶中，除了仅水解α1→4葡萄糖苷键的α-淀粉酶(EC3.2.1.1)以外，还有选择性水解α1→6葡萄糖苷键的支链淀粉酶(EC3.2.1.41)或异淀粉酶(EC3.2.1.68)(非专利文献6)。
麦芽糖酶、即α-葡糖苷酶为水解存在于糖链的非还原末端的α-D-葡萄糖苷键的外切糖苷酶的总称，但狭义上是指α-葡糖苷酶(EC3.2.1.20)，且将麦芽糖、直链淀粉及其寡糖作为底物(非专利文献11)。除此以外，广义上的α-葡糖苷酶包括将蔗糖分解成葡萄糖和果糖的蔗糖酶、将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的乳糖酶、切断异麦芽糖或低分子α1→6葡萄糖苷键的异麦芽糖酶等酶。也水解苯基-α-D-葡萄糖苷或对硝基苯基α-D葡萄糖苷，且多利用其进行酶活性测定(非专利文献11)。如上所述，内切型淀粉酶和外切型淀粉酶均为水解成为目标的α-D-葡萄糖苷键的酶，目标选择系统虽不同，但认为基本作用机制相同。
另一方面，糖转运蛋白质为横跨生物膜而进行糖的转运的蛋白质的总称，根据其转运方式已知有葡萄糖转运体(GLUT)家族和钠-葡萄糖共转运体(SGLT)家族。前者为根据葡萄糖的浓度梯度摄取葡萄糖的促进扩散系统的转运体，后者为利用钠离子的细胞内外的浓度梯度，转运钠的同时逆葡萄糖浓度梯度摄取葡萄糖的能动转运系统的转运体(非专利文献12)。小肠中，出现在绒毛细胞的SGLT1对葡萄糖向细胞内的摄入发挥主要作用，除此以外，GLUT5有助于果糖的摄取。并且，虽对葡萄糖的亲和性低但大量存在的GLUT2有助于葡萄糖向血中转移(非专利文献13)。
目前，作为糖尿病的治疗药而开发利用了上述糖分解酶的抑制剂、糖转运体的抑制剂。多种α-葡糖苷酶抑制剂被用作抑制饭后血糖值上升的糖尿病治疗药。脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)为α-葡糖苷酶及β‐葡糖苷酶的抑制剂，分别相对应的IC50值为12.6μM及47μM(非专利文献14)。
并且，广泛使用阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖。阿卡波糖呈直链四糖状结构，且与α-葡糖苷酶一同对α-淀粉酶显示抑制效果。伏格列波糖与米格列醇呈类似单糖的结构。这些与阿卡波糖相比，对α-葡糖苷酶的抑制效果强(非专利文献15、非专利文献16)。关于伏格列波糖进行叙述，对猪小肠麦芽糖酶和蔗糖酶显示比阿卡波糖分别强20倍及30倍的抑制效果，对大鼠小肠麦芽糖酶和蔗糖酶显示分别强270倍及190倍的抑制效果。另一方面，对猪及大鼠的胰淀粉酶的抑制效果为阿卡波糖的1/3000。伏格列波糖对α-葡糖苷酶的选择性比α-淀粉酶高，但对α-葡糖苷酶的IC50值为10μM至1nM(非专利文献14、非专利文献15、非专利文献16)。这些医药品通过抑制α-葡糖苷酶活性来抑制自小肠的葡萄糖摄取，但并不是直接降低血糖值。并且，根据报告，当过度强地抑制糖的分解时，会引起腹胀或低血糖症状等副作用。
另一方面，对于糖转运体，作为抑制出现在肾中且对近曲小管(近位尿細管)中的葡萄糖再吸收发挥主要作用的钠-葡萄糖共转运体(SGLT2)的医药品，已知有卡格列净(Canagliflozin)、伊格列净(Ipragliflozin)等。根据报告，这些降低从尿再吸收的葡萄糖量，但由于作用于肾，因此需要注意其药物动态，除此以外，还需要注意如多尿或低血糖等副作用。
并且，在这种情况下，进行了多种尝试来探索针对能够从蔬菜或海藻、草木、微生物等天然物口服摄取的α-淀粉酶或α-葡糖苷酶的抑制成分。
例如，从小麦(专利文献1)、荞麦(专利文献2)、茶(专利文献3)、灰树花(专利文献4)、橄榄叶(专利文献5)、芸豆(非专利文献17)等发现α-淀粉酶抑制效果，且从核桃(专利文献6)、紫菜(专利文献7)、梅(专利文献8)、烧酒醪(专利文献9)、桑叶(非专利文献18)、五层龙属(サラシア属)植物(非专利文献18)等发现α-葡糖苷酶抑制效果，还报告有多种对α-淀粉酶和α-葡糖苷酶这两者具有抑制效果。从源自微生物的化合物也报告有很多与抑制剂有关的内容。作为例子，能够举出如作为α-葡糖苷酶抑制剂的野尻霉素(nojirimycin)、作为α-淀粉酶抑制剂的S-AI等以寡糖为成分的例子和以蛋白质为成分的例子(非专利文献19)。
显示这些抑制效果的成分中，还存在已知其性质或结构的成分，例如专利文献7的紫菜中包含含有经硫酸化的糖的结构即紫菜聚糖(Porphyran)、专利文献3的茶或专利文献5的橄榄叶中包含如黄酮、黄酮醇等黄酮类化合物、含有其配糖体的多酚化合物，桑叶中包含1-脱氧野尻霉素，五层龙属植物中包含salacinol及Kotalanol。Salacinol和Kotalanol显现活性时需要锍硫酸分子内盐结构，且显示与市售的α-葡糖苷酶抑制剂阿卡波糖相同程度的活性(非专利文献18)。另外，专利文献1及非专利文献17中，作为显示抑制效果的成分而分别举出小麦及芸豆的蛋白质(分子质量3,500Da以上)，专利文献10中作为显示抑制效果的成分举出分解马铃薯的蛋白质而得到的肽。
蚯蚓为被分类为环节动物门寡毛纲的绳状生物，主要生活在土壤中并摄食有机物，且通过消化吸收和排泄而发挥分解土壤中的有机物的作用。在该方面，蚯蚓促进土壤的耕犁，并且将植物能够利用的有机物带至土壤中来，对农业而言为必不可少的存在。蚯蚓位于食物链的底层，在自然界中，被鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类等广范围的生物捕食。并且，还被用作鱼或鸡的饲料，还存在人类在各地食用的记录。在东方，以解热、镇痛、利尿、促进血流等目的而作为中药也被长期利用。如此关于蚯蚓，有具有足够的安全性的充分的食用历史，且还生产有使用了蚯蚓干燥粉末的健康食品(专利文献11、专利文献12)。
目前，从蚯蚓的体腔液或破碎液及由这些制造的蚯蚓干燥粉末中，除了上述淀粉酶活性(非专利文献8)以外，还发现纤维素酶活性(非专利文献20)、脂肪酶活性(非专利文献21)、尿激酶样活性或组织纤溶酶原激活物(t-PA)样活性等多种蛋白酶活性(非专利文献22、非专利文献23)。进而，从蚯蚓破碎液的丙酮沉淀组分发现有弹性蛋白酶抑制活性、底物金属蛋白酶抑制活性及酪氨酸酶抑制活性(非专利文献24)，从蚯蚓干燥粉末提取液的小于10kDa的低分子组分发现有二肽基肽酶IV抑制活性(专利文献13)，同样地从5kDa以下的低分子组分发现有血管收缩素转化酶抑制活性(专利文献14)。本发明人等最近示出蚯蚓提取液的3kDa以下的组分含有促进胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶等酶活性的物质(日本专利申请2017-076108；酶活性促进剂的制造方法及酶活性促进剂的含有物)。然而，目前为止没有与蚯蚓成分中的α-淀粉酶抑制活性、α-葡糖苷酶抑制活性有关的报告。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2014-51473号公报；
专利文献2：日本特开2005-220110号公报；
专利文献3：日本特开2010-222277号公报；
专利文献4：日本特开2000-319192号公报；
专利文献5：日本特开2002-10753号公报；
专利文献6：日本特开2004-352649号公报；
专利文献7：日本特开2006-104100号公报；
专利文献8：日本专利第4403457号公报；
专利文献9：国际公开第2008/090999号公报；
专利文献10：日本特开平10-292000号公报；
专利文献11：日本专利第5548931号公报；
专利文献12：日本特开2015-48353号公报；
专利文献13：日本专利第5901092号公报；
专利文献14：日本特开2015-168631号公报。
非专利文献
非专利文献1：厚生劳动省、平成24年国民健康·营养调查结果的概要；
非专利文献2：厚生劳动省、平成26年(2014年)患者调查的概况；
非专利文献3：厚生劳动省、平成25年度国民医疗费的概况；
非专利文献4：今堀和友、山川民夫(主编)：生物化学词典，第4版，Tokyo KagakuDojin，东京，142-143页(胰岛素)、2007年；
非专利文献5：今堀和友、山川民夫(主编)：生物化学词典，第4版，Tokyo KagakuDojin，东京、931页(糖尿病)、2007年；
非专利文献6：今堀和友，山川民夫(主编)：生物化学词典，第4版，Tokyo KagakuDojin，东京，66-67页(淀粉酶)、2007年；
非专利文献7：The Amylase Research Society of Japan.(日本淀粉酶研究学会)：Enzyme chemistry and molecular biology of amylases and related enzymes.(淀粉酶和相关酶的酶化学和分子生物学)(Yamamoto,T.,ed.),CRC出版社，Florida,USA,pp.196-197(1995)；
非专利文献8：Ueda,M.,等：Purification and characterization of novelraw-starch-digesting and cold-adapted alpha-amylases from Eisenia foetida.Comp.Biochem.Physiol.B.Biochem.Mol.Biol.150,125-130(2008)；
非专利文献9：广海启太郎：淀粉酶的作用方式和亚位点结构.淀粉科学，21、190-203(1974)；
非专利文献10：Ramasubbu,N.,等：Human salivaryα-amylase Trp58situated atsubsite-2is critical for enzyme activity Eur.J.Biochem Eur.J.Biochem.271,2517-2529(2004)；
非专利文献11：今堀和友、山川民夫(主编)：生物化学词典，第4版，Tokyo KagakuDojin，东京、404页(α-葡糖苷酶)，2007年；
非专利文献12：今堀和友、山川民夫(主编)：生物化学词典，第4版，Tokyo KagakuDojin，东京，934页(糖转运体)，2007年；
非专利文献13：Voet,D.,Voet,J.G.,and Pratt,C.W.(著)、田宫信雄、村松正实、八木达彦、远藤斗志也(译)：ヴォート基礎生化学(沃特基础生物化学)，第1版，TokyoKagaku Dojin，东京，452-453页，2004年；
非专利文献14：秋山彻、河府和义：抑制剂手册、YODOSHA CO.,LTD.，东京，404-419页，2006年；
非专利文献15：和光纯药工业株式会社：α-葡糖苷酶抑制剂.试剂主页，2017年，(http：//www.wako-chem.co.jp)；
非专利文献16：Dabhi,A.S.,Bhatt,N.R.,and Shah,M.J.：Voglibose：An alphaglucosidase inhibitor.J.Clin.Diagn.Res.7,3023-3027(2013)；
非专利文献17：吉川秀树、桑岛千荣、小垂真：芸豆中的α-淀粉酶抑制剂活性和其性质.Kyoto Koka Women’s University研究简报，47，227-237(2009)；
非专利文献18：吉川雅之：药用植物的糖尿病预防成分.化学和生物、40、172-178、(2002)；
非专利文献19：村尾泽夫、大山邦夫、村井英继、后藤章、松井良博、福原健一、宫田茂一、住田光夫、荒井基夫：放線菌の精算するアミラーゼ阻害剤(放线菌的精算的淀粉酶抑制剂).淀粉科学、26、157-164、(1979)；
非专利文献20：Ueda,M.,等：A novel cold-adapted cellulose complex fromEisenia foetida：characterization of a multienzyme complex withcarboxymethylcellulase,beta-glucosidase,beta-1,3glucanase,and beta-xylosidase.Comp.Biochem.Physiol.B.Biochem.Mol.Biol.157,26-32(2010)；
非专利文献21：Nakajima,N.,等：An isozyme of earthworm serine proteasesacts on hydrolysis of triacylglycerol.Biosci Biotechnol.Biochem.69,2009-2011(2005)；
非专利文献22：Nakajima,N.,等：Characterization of potent fibrinolyticenzymes in earthworm,Lumbricus rubellus.Biosci.Biotechnol.Biochem.57,1726-1730(1993)；
非专利文献23：Phan,T.T.,等：Purification and characterization of novelfibrinolytic proteases as potential antithrombotic agents from earthwormPerionyx excavates.AMB Express,1-11(2011)；
非专利文献24：Azmi,N.,等：Anti-elastase,anti-tyrosinase and matrixmetalloproteinase-1inhibitory activity of earthworm extracts as potential newanti-agingagent.Asian.Pac.J.Trop.Biomed.4,S348-S352(2014)；
非专利文献25：广海启太郎：新·入門酵素化学(新·入门酶化学)，修订第2版(西泽一俊、志村宪助、编著)，南江堂，东京，21-93页，1995年；
非专利文献26：井上国世：初めての酵素化学(第一次酶化学)(井上国世、编著)，CMC Publishing CO.,LTD.，东京，241-365页，2016年；
非专利文献27：SIGMA Quality Control Test Procedure：Enzymatic assay ofα-glucosidase.Sigma(1996)；
非专利文献28：滨冈直裕、中川良二、比良彻、八卷幸二：小豆子葉部のα-グルコシダーゼ活性およびGLP-1分泌に与える影響(小豆子叶部对α-葡糖苷酶活性及GLP-1分泌的影响)，日本食品科学工学会志，60,43-47(2013)。
发明内容
本发明的主要课题在于提供一种具有糖分解酶的活性抑制效果、尤其是α-淀粉酶及α-葡糖苷酶的活性抑制效果的、食用历史悠久且安全性高的源自天然物的糖分解酶抑制剂的制造方法，还在于能够提供一种对糖尿病、肥胖的预防、改善有效的食品、医药品等。
本发明人等为了解决上述课题而进行深入研究的结果，完成了本发明。
即，本发明的第1特征构成为对特定糖分解酶具有活性抑制效果的糖分解酶抑制剂的制造方法，其特征在于，所述特定糖分解酶中的1个为α-葡糖苷酶，实行如下工序来得到所述糖分解酶抑制剂，即，提取工序，以蚯蚓或其破碎物、或者蚯蚓或其破碎物的干燥粉末为原料并添加水而得到蚯蚓提取液；及分离工序，得到源自该蚯蚓提取液的分子质量小于3kDa的提取液小于3kDa组分。
本发明的第2特征构成的特征在于所述特定糖分解酶中的1个为α-淀粉酶。
根据本构成，蚯蚓有悠久的食用历史，且为安全性高的源自天然的原料，因此能够期待作为具有通过抑制小肠中的糖分解酶活性、尤其是α-淀粉酶活性、α-葡糖苷酶活性而抑制糖的消化吸收的效果，且对糖尿病、肥胖、代谢综合症等生活习惯病的预防、改善有效的医药品、健康食品、补充剂等的应用。并且，对象并不限定于人，还考虑针对近年来和人一样地生活习惯病这样的疾病成为问题的狗或猫等宠物哺乳动物、牛、马、猪等家畜的、作为医药品、以改善健康为目的的宠物食品的应用。成为原料的蚯蚓能够容易地繁殖，在生产率方面也存在优点。
并且，根据本构成，通过得到蚯蚓提取液中分子质量小于3kDa的组分即提取液小于3kDa组分的分离工序，能够去除蚯蚓提取液中分子质量为3kDa以上的高分子质量组分。
如上所述，根据报告，蚯蚓本身含有具有α-淀粉酶活性的酶成分，因此在从本发明的糖分解酶抑制剂中排除源自蚯蚓的α-淀粉酶的目的中，该分离工序也具有重要的意义。
而且，通过对所得到的分子质量小于3kDa的提取液小于3kDa组分施加冷冻干燥处理等浓缩操作，能够以高浓度得到该组分中所含有的具有α-淀粉酶活性抑制效果、α-葡糖苷酶活性抑制效果的糖分解酶抑制剂。冷冻干燥处理粉末在保存性、加工性方面也优异。
本发明的第3特征构成的特征在于对通过所述分离工序而回收的提取液小于3kDa组分实行选自冻融处理、酸处理、加热处理、有机溶剂处理中的至少一种来得到所述糖分解酶抑制剂。
根据本构成，通过进行上述冻融处理，能够使不耐冻融的成分改性并将其去除。并且，冷冻中还能够期待稳定地长期保存本发明的糖分解酶抑制剂。并且，通过进行上述酸处理，能够使不耐酸的成分改性并将其去除。并且，通过进行上述加热处理，能够使不耐热的成分改性并将其去除。进而还能够期待基于热的杀菌效果。并且，通过进行上述有机溶剂处理，能够去除转移到有机层的成分及转移到界面的成分。各处理之后，进行离心分离等分离操作，从而能够容易地去除经改性的成分。而且，不仅可以将这些处理单独实行，而且可以组合多种来实行，从而能够得到纯度更高的糖分解酶抑制剂。
发明效果
根据本发明，能够提供一种食用历史悠久且安全性高的源自天然物的糖分解酶抑制剂的制造方法。并且，能够作为对糖尿病或肥胖的预防、改善有效的食品、医药品等而提供。
附图说明
图1为表示以成为各种浓度的方式制备在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末，并将其添加到α-淀粉酶溶液时所观察到的生成物量(405nm的吸光度)的经时变化的图表。
图2为以各浓度将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末添加到α-淀粉酶溶液时的α-淀粉酶活性的相对值(未添加提取液小于3kDa组分粉末时的相对于α-淀粉酶活性的相对值)的图表。
图3为表示按添加到反应液的α-淀粉酶浓度，以各浓度将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末添加到反应液时的α-淀粉酶活性抑制率的图表。
图4为表示添加于反应液中的底物试剂溶液浓度的变化对α-淀粉酶活性的影响的图表。
图5为表示不含有在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末、或以最终浓度成为40mg/mL的方式含有提取液小于3kDa组分粉末的条件下，对使添加于反应液中的底物试剂溶液的相对浓度发生变化时的α-淀粉酶活性进行分析，将横轴设为底物试剂溶液的相对浓度，将纵轴设为反应速度时的米氏(Michaelis)曲线的图表。
图6为表示不含有在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末、或以最终浓度成为40mg/mL的方式含有提取液小于3kDa组分粉末的条件下，对使添加到反应液中的底物试剂溶液的相对浓度发生变化时观察到的α-淀粉酶活性测定的结果进行分析，将横轴设为底物试剂溶液的相对浓度的倒数，将纵轴设为反应速度的倒数的赖威佛-柏克(Lineweaver-Burk)曲线的图表、及表示通过该曲线求出的酶反应速度论参数的表图。
图7为表示不含有在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末、或以最终浓度成为40mg/mL的方式含有提取液小于3kDa组分粉末的条件下，对使添加到反应液中的底物试剂溶液的相对浓度发生变化时观察到的α-淀粉酶活性进行分析，将横轴设为底物试剂溶液的相对浓度，将纵轴设为底物试剂溶液的相对浓度除以反应速度得到的数值的哈尼斯-伍尔夫(Hanes-Woolf)曲线的图表、及表示通过该曲线求出的酶反应速度论参数的表图。
图8为表示在使底物试剂溶液的相对浓度发生变化的基础上，对以各种浓度将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末添加到反应液时观察到的α-淀粉酶活性进行分析，按底物试剂溶液的相对浓度，将横轴设为添加到反应液中的提取液小于3kDa组分粉末的最终浓度，将纵轴设为反应速度的倒数的迪克逊(Dixon)曲线的图表。
图9为表示以各种浓度将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末添加到反应液时观察到的α-葡糖苷酶活性、生成物量(400nm的吸光度)的经时变化的图表。
图10为表示以成为各种浓度的方式将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末添加到α-葡糖苷酶反应液时的相对于α-葡糖苷酶活性的抑制率的图表。
具体实施方式
对本发明进行详细说明。本发明的糖分解酶抑制剂通过如下工序而得到，即提取工序，对使用将成为原料的蚯蚓进行破碎而得到的破碎液制备的蚯蚓干燥粉末添加水而得到蚯蚓提取液；及分离工序，对在该提取工序中得到的蚯蚓提取液进行超滤而得到分子质量小于3kDa的组分即提取液小于3kDa组分。用于得到提取液小于3kDa组分的分离工序并不限定于超滤，还可以利用离心分离、凝胶过滤等公知的分离法。在后述实施例中，确认到以该提取液小于3kDa组分为主成分的糖分解酶抑制剂具有抑制α-淀粉酶活性及α-葡糖苷酶活性的效果。
本发明的糖分解酶抑制剂的制造方法中，可以对从上述分子质量分离后的蚯蚓提取液得到的提取液小于3kDa组分实行冷冻干燥处理来制成提取液小于3kDa组分的冷冻干燥粉末即提取液小于3kDa组分粉末。通过本工序能够对提取液小于3kDa组分进行浓缩，并能够得到高浓度的糖分解酶抑制剂。并且，通过设为提取液小于3kDa组分粉末，能够提高保存性或加工性。并且，能够对上述分子质量分离后的提取液小于3kDa组分实行选自冻融处理、酸处理、加热处理、有机溶剂处理中的至少一种处理。关于冻融处理，能够在至-80℃的温度(超低温冰箱)及-196℃(液氮温度)下进行处理。关于酸处理，能够使用至pH2的酸来进行处理。关于加热处理，能够在常压下、至100℃的温度下进行处理。关于有机溶剂处理，能够使用己烷等能够分层为水层和有机溶剂层的有机溶剂。
这些处理工序可以组合多种来实行而与其顺序无关，并且能够对处理后的溶液进行离心分离或过滤等通常的分离操作，并能够通过去除固体物质而得到纯度更高的糖分解酶抑制剂。
关于本发明的糖分解酶抑制剂，通过制成含有其的含有物，能够用作以抑制酶、尤其是α-淀粉酶活性或α-葡糖苷酶活性为目的的医药品、健康食品、补充剂或宠物食品等。
以下，对本发明的实施例进行说明。但是，本发明并不限定于以下实施例。
＜蚯蚓干燥粉末的制备方法＞
本发明的实施例中所使用的蚯蚓干燥粉末的制备是按照专利文献12的方法进行的。即，用自来水清洗成为原料的养殖红纹蚯蚓(Eisenia fetida)的生物体30kg之后，在5％(w/v)碳酸氢钠水溶液中浸渍1小时，使蚯蚓吐出体腔液而去除该体腔液。将对再次进行水洗的蚯蚓进行破碎，将其填充到塑料袋并密封之后，使用等静压式高压处理装置(SHP-100-50A，SHINADA CO.,LTD.制，新泻县长冈市)，在100MPa、60℃下进行了16小时的处理。使用滚子泵(RP-LVS，FURUE SCIENCE CO.,LTD.制，东京都新宿区)及圆筒型超离心分离机(ASM160AP，TOMOE ENGINEERING CO.,LTD.制，东京都品川区)，以17,000rpm连续对该处理物进行了离心分离。使用真空冷冻干燥机(TF20-80TNNN，宝制作所制，东京都板桥区)，对所得到的离心上清液进行冷冻干燥处理之后，将其破碎成粉末状。将该粉末在80℃下干燥6小时而成的粉末作为最终的蚯蚓干燥粉末。此时的回收量为4.0kg，相对于最初的蚯蚓生物体重量30kg，收率为13％。
[实施例1]
用烧杯称取5g在上述制备工序中得到的蚯蚓干燥粉末，添加蒸馏水而使其成为50mL，从而得到了10％(w/v)悬浮液。使用搅拌器将悬浮液搅拌10分钟之后，以16,100xg进行10分钟的离心分离，从而去除了沉淀物。将该上清液作为蚯蚓提取液。
接着，使用Vivaspin 20(3kDa MWCO，GE Healthcare制，英国小查尔方特)对该蚯蚓提取液进行超滤，从而得到了分子质量小于3kDa的低分子组分的滤液。将该滤液作为提取液小于3kDa组分，进而将使用冷冻干燥机(FDU-1200，EYELA制，东京)进行了冷冻干燥的粉末作为提取液小于3kDa组分粉末。此时，从24mL的提取液小于3kDa组分得到了1.7g的提取液小于3kDa组分粉末。从而，源自最初的5g蚯蚓干燥粉末的提取液小于3kDa组分粉末的收率为34％。即，从最初的蚯蚓生物体重量30kg得到1.3kg的提取液小于3kDa组分粉末，其收率为4.4％。
＜α-淀粉酶活性测定试验＞
关于α-淀粉酶活性，使用DIAMONDCOLOR·AMY-LDIRECT(KTAM-103(缓冲液)及KTAM-113(底物试剂溶液)，TOYOBO CO.,LTD.，大阪府大阪市)进行了测定。以下，按照制造者说明对本产品的测定原理进行说明。即，试样中的α-淀粉酶水解合成底物α-2-氯-4-硝基苯基-半乳糖基麦芽糖苷(G alG2CNP)而生成半乳糖麦芽糖苷(GalG2)和2-氯-4-硝基苯酚(CNP)。能够通过在405nm的波长下测定因CNP引起的黄色吸光度的每单位时间的增加量来求出α-淀粉酶活性。另外，CNP的405nm下的摩尔吸光系数(ε405)为13,400M-1cm-1。
关于α-淀粉酶，对源自猪胰脏的α-淀粉酶(产品编号A3176，SIGMA制，批号：SLBM2655V)的粉末添加20mM的Tris-HCl(pH7.0)缓冲液以使粉末浓度成为10mg/mL，并进行5分钟的回动搅拌之后，以16,100xg进行10分钟的离心分离而去除了不溶性成分。对于该上清液，利用布拉德福德(Bradford)法以牛血清白蛋白(BSA)为标准而对蛋白质浓度进行了定量。该上清液的蛋白质浓度为226μg/mL。使用相同的缓冲液将该上清液稀释至0.5μg/mL，并将其作为α-淀粉酶的储备溶液。
将利用上述方法制备的0.5μg/mL的α-淀粉酶溶液5μL和预先在37℃下进行了保温的缓冲液108.5μL添加到96微孔板，并在37℃下进行了5分钟的保温。通过对其添加预先在37℃下进行了保温的底物试剂溶液36.5μL而开始进行酶反应，使用酶标仪(xMark，Bio-RadLaboratories制，美国加利福尼亚州Hercules(ハーキュリーズ))，每1分钟进行测定，测定15分钟，测定了37℃下的405nm的吸光度。另一方面，作为对照实验，替代α-淀粉酶溶液而添加不含有α-淀粉酶的缓冲液并以相同的方式进行测定，且将其作为空白。按每一测定时间，从添加α-淀粉酶时的测定值减去空白值，从而确认到每一测定时间的405nm的吸光度变化(ΔA405)随着测定时间的增加而直线增加。根据该直线斜率求出了每1分钟的吸光度变化量(ΔA405/min)。所使用的微孔板的光路长度以反应液量150μL计为0.458cm。并且，生成物CNP的分子吸光系数ε405为13,400M-1cm-1。从这些值和ΔA405/min求出每1分钟所生成的CNP量，并将其作为反应速度(即酶活性)。此时，求出不含有提取液小于3kDa组分的条件下的α-淀粉酶活性为6.5×10-6M/min。
＜α-淀粉酶抑制效果测定试验＞
图1为表示以成为各种浓度的方式制备在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末，并将其添加到α-淀粉酶溶液时所观察到的生成物量(405nm的吸光度)的经时变化的图表。各浓度中的α-淀粉酶活性从表示生成物的生成的经时变化的直线的斜率求出。图例的EB表示酶的空白，DB表示酶及提取液小于3kDa组分粉末的双空白。另外，EB包含最终浓度10mg/mL的提取液小于3kDa组分粉末。
关于提取液小于3kDa组分的α-淀粉酶抑制效果，具体而言通过以下方法进行了测定。提取液小于3kDa组分的试样溶液以成为80、40、20、10、5mg/mL的方式将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末溶解于缓冲液而进行了制备。在微孔板的孔内将预先在37℃下进行了保温的各浓度的试样溶液75μL与缓冲液33.5μL进行混合，对其添加0.5μg/mL的α-淀粉酶溶液5μL并在37℃进行了5分钟的保温。接着，通过添加预先在37℃下进行了保温的底物试剂溶液36.5μL而作为反应液开始进行反应，使用酶标仪，每1分钟进行测定，测定15分钟，测定了37℃下的405nm的吸光度。另外，将各测定各进行了3次。
将测定结果示于图1。通过上述方法对图1的测定结果进行了分析的结果是，不含有提取液小于3kDa组分粉末时，所求出的通过α-淀粉酶每1分钟生成的CNP量、即反应速度为6.5×10-6M/min。进而，将该值设为相对值1而相对示出了使用了各试样溶液时的α-淀粉酶活性(图2)。根据图2，可知若将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末添加到酶反应体系，则依赖于其浓度地α-淀粉酶活性被抑制。当添加了最终浓度40mg/mL的提取液小于3kDa组分粉末时，α-淀粉酶活性以相对活性计降低至0.65(65％)。另一方面，在上述测定中，不含有α-淀粉酶，而含有最终浓度10mg/mL的提取液小于3kDa组分粉末的条件的反应液中，未观察到GalG2CNP分解活性(图1的E B)。从这些结果，表示在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分中含有浓度依赖地抑制α-淀粉酶活性的成分，而且该成分完全不含有α-淀粉酶样活性。
[比较试验例1]
在上述α-淀粉酶活性测定试验的α-淀粉酶储备溶液的制备中，变更基于通过布拉德福德法进行了定量的α-淀粉酶溶液的缓冲液的稀释率而制备了0.25μg/mL及0.1μg/mL的α-淀粉酶储备溶液。使用这些浓度不同的α-淀粉酶溶液，以与所述α-淀粉酶抑制效果测定试验相同的方法对基于提取液小于3kDa组分的α-淀粉酶抑制效果进行了试验。将测定各进行了3次。
以与上述相同的方法对测定结果进行了分析。不含有提取液小于3kDa组分粉末时，对通过α-淀粉酶每1分钟生成的CNP量、即反应速度进行了测定的结果是，α-淀粉酶储备溶液浓度为0.25μg/mL时为3.1×10-6M/min，并且为0.1μg/mL时为1.3×10-6M/min。
考虑到使用了上述0.5μg/mL的α-淀粉酶储备溶液时的结果，显示酶反应速度与酶浓度成比例地发生变化。该情况表示该酶反应遵循米氏方程型速度论(Michaelis-Menten-type kinetics)。
在此，以与图2相同地，在各α-淀粉酶储备溶液浓度，将不含有提取液小于3kDa组分粉末时的反应速度分别设为相对值1，分别以相对值求出了添加了各浓度的提取液小于3kDa组分粉末时的反应速度。而且，对所求出的相对值进行(1-相对值)×100的计算，并将其作为抑制率(单位：％)。图3中示出使用了0.25μg/mL、0.1μg/mL的α-淀粉酶储备溶液及为了比较而使用了上述0.5μg/mL的α-淀粉酶储备溶液时的、添加到反应液的提取液小于3kDa组分粉末的最终浓度与抑制率的关系。
如图3所示，α-淀粉酶活性抑制率依赖于添加到反应液的提取液小于3kDa组分粉末的最终浓度而变大。不同的酶浓度会在提取液小于3kDa组分粉末的最终浓度为10mg/mL以下的范围内使抑制率产生略微偏差，但提取液小于3kDa组分粉末的最终浓度为20mg/mL以上时未给抑制率带来影响。并且，当以最终浓度40mg/mL添加了提取液小于3kDa组分粉末时，抑制率在任意酶浓度下均成为35％，这表明本发明的糖分解酶抑制剂具有不以低用量急剧抑制α-淀粉酶活性、而是稳定地发生作用来发挥效果的可能性。
[比较试验例2]
用缓冲液对上述α-淀粉酶活性测定试验中所使用的底物试剂溶液进行稀释，从而分别制备了将底物试剂溶液的原液作为相对浓度1时的相对浓度0.75、0.5、0.25、0.1、0.05的底物试剂溶液稀释液。使用这些浓度不同的底物试剂溶液，以与上述相同的方法进行了α-淀粉酶活性测定试验。另外，酶液使用了0.5μg/mL的α-淀粉酶储备溶液。并且，使用这些浓度不同的底物试剂溶液，并以与所述α-淀粉酶抑制效果测定试验相同的方法对以最终浓度成为40mg/mL的方式将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末添加到反应液时的α-淀粉酶活性进行了测定。将各测定各进行了3次。
将测定结果示于图4。图表(图4(a))表示未添加提取液小于3kDa组分粉末时的结果，图表(图4(b))表示以最终浓度成为40mg/mL的方式将提取液小于3kDa组分粉末添加到反应液时的结果。以相对浓度表示底物试剂溶液的浓度。在此，关于相对浓度，将底物试剂溶液制品的原液设为相对值1。α-淀粉酶活性可从各自的底物浓度中所观察到的直线的斜率求出。
在任意情况下，随着反应液中的底物浓度的增加而405nm的吸光度变化量(ΔA405/min)即酶活性增大。并且，若以相同的底物浓度进行比较，则在任意底物浓度下，均通过添加提取液小于3kDa组分粉末而ΔA405/min减少，且抑制了α-淀粉酶活性。在此，通过上述方法进行分析，在各自的相对底物浓度下，求出了以最终浓度成为40mg/mL的方式添加了提取液小于3kDa组分粉末时的α-淀粉酶活性抑制率(表1)。
[表1]
如表1所示，在使用了底物试剂溶液的原液的条件下，以最终浓度成为40mg/mL的方式添加了提取液小于3kDa组分粉末时，α-淀粉酶活性抑制率为约35％，但在用缓冲液对底物试剂溶液进行稀释而将相对浓度设为0.50的条件下，α-淀粉酶活性抑制率成为约38％。进而，在将底物试剂溶液的相对浓度设为0.1的条件下抑制率为约43％，将相对浓度设为0.05的条件下抑制率为约49％。进一步对底物试剂溶液进行稀释，将相对浓度设为0.03时，伴随酶反应的405nm的吸光度明显小，且很难追踪其变化。如以上所示，尽管酶反应液中所含有的α-淀粉酶浓度和提取液小于3kDa组分粉末浓度一定，但随着底物浓度减少而抑制率上升。并且，相反地，随着底物浓度的增大而抑制率减少。由此推断，本发明的糖分解酶抑制剂具有通过与底物针对酶活性部位的结合竞争而抑制α-淀粉酶活性的类型的抑制方式。
而且，利用酶反应速度论(非专利文献25、非专利文献26)对本发明的基于糖分解酶抑制剂的α-淀粉酶抑制的性质进行了分析。将底物试剂溶液的相对浓度标绘于横轴，将通过图4的各数据求出的反应速度(v)标绘于纵轴而制作了米氏曲线(图5)。进而，制作了将底物试剂溶液的相对浓度的倒数(1/v)标绘于横轴，将反应速度的倒数标绘于纵轴而成的赖威佛-柏克(Lineweav er-Burk)曲线(图6)及将底物试剂溶液的相对浓度标绘于横轴，将底物试剂溶液的相对浓度除以反应速度而得的值标绘于纵轴而成的哈尼斯-伍尔夫(Hanes-Woolf)曲线(图7)。从各自的曲线得到基于最小二乘法的近似直线，由此求出了米氏常数Km(单位：M)及最大速度Vmax(单位：M/s)的酶反应速度论参数。并且，分子活性(转变数(ターンオーバー数))kcat(单位：1/s)以Vmax/[E]0表现。在此，[E]0(单位：M)为反应液中的酶初始浓度。特异性常数kcat/Km(单位：1/(Ms))从kcat与Km计算。另外，底物试剂溶液中所含有的GalG2CNP的摩尔浓度不明确，因此在标记这些的参数的基础上，将底物试剂溶液原液的GalG2CNP的摩尔浓度表示为常数[SS]。
基于抑制剂的酶抑制大体分类为竞争型与混合型(非专利文献26)。竞争型抑制通过抑制剂与酶上与底物结合的部位(底物结合部位)结合，且底物与抑制剂相互竞争争夺底物结合部位而引起。在抑制剂的存在下，酶与底物的结合受到抑制剂干扰，因此酶与底物之间的亲和力降低(即Km增大)，且抑制酶-底物复合物(ES复合物)的形成。但是，当底物浓度充分大时，实质上能够无视抑制剂对酶-底物之间的结合的干扰，所得到的反应速度(即最大速度Vmax)成为与不存在抑制剂时得到的最大速度Vmax相同的值。
混合型抑制中，抑制剂与和底物结合部位不同的部位(抑制剂结合部位)结合，由此针对底物结合部位的底物结合、酶反应速度常数受到影响。混合型抑制的特殊情况即非竞争抑制中，认为底物与抑制剂对酶的相互作用彼此独立，并且在酶-抑制剂复合物(EI)中失活。该情况下，活性也可以由游离的酶(E)带来，因此与不存在抑制剂的情况相比，存在抑制剂的情况下，最大速度Vmax虽降低，但Km未发现发生变化。通常的混合型抑制中，底物与抑制剂对酶的相互作用相互影响，因此与不存在抑制剂的情况相比，抑制剂存在的情况下，可发现在酶与底物的亲和力及酶活性这两方面发生变化。
酶抑制剂不仅是仅与酶的底物结合部位结合的竞争型抑制、或仅与抑制剂结合部位结合的混合型抑制，还可考虑在这两个结合部位结合的情况。该情况下，认为有可能依赖于抑制剂针对底物结合部位或抑制剂结合部位的亲和力的程度，而显现竞争型抑制(即在抑制剂存在下Vmax及kcat未发生变化，但Km增大)和混合型抑制(在抑制剂存在下Vmax及kcat减少，Km增大)这两者的性质。
图5的米氏(Michaelis)曲线中，各曲线表示饱和曲线，得知当以最终浓度成为40mg/mL的方式添加了提取液小于3kDa组分粉末时，反应速度(v)即酶活性降低。认为本发明的基于糖分解酶抑制剂的α-淀粉酶活性抑制的方式若为竞争型，则最大反应速度Vmax在提取液小于3kDa组分粉末的添加、非添加条件下变相同。但是，即使在使用赋予最大底物浓度的底物试剂溶液的原液的条件下，反应速度也未达到最大值。这表明为了达到最大反应速度，需要进一步高浓度的底物，但至少仅从图5很难明确判断是竞争型抑制还是混合型抑制。
因此，制作赖威佛-柏克曲线，并求出了酶反应速度论参数(图6)。最大反应速度在提取液小于3kDa组分粉末的最终浓度为0mg/mL、40mg/mL的任意条件下均成为大致相同的值。即，表示在底物浓度充分过剩的条件下赋予(预测)的最大速度Vmax与提取液小于3kDa组分粉末的有无添加无关而未发生变化。另一方面，通过添加提取液小于3kDa组分粉末(最终浓度40mg/mL)，Km值大致增大2倍，由此表示α-淀粉酶与底物的亲和性显著降低。这些结果强烈表明本发明的基于糖分解酶抑制剂的α-淀粉酶活性抑制的方式有可能是竞争型。
利用相同的数据制作哈尼斯-伍尔夫曲线，并求出了酶反应速度论参数(图7)。通过添加最终浓度40mg/mL的提取液小于3kDa组分粉末，显示最大反应速度及α-淀粉酶与底物的亲和性这两者均降低。即，Km值大致增大至1.5倍，Vmax(及kcat)值减少了21％。这些结果表明基于提取液小于3kDa组分粉末中的酶抑制剂的α-淀粉酶活性抑制为混合型抑制方式。但是，与对Km值的影响相比，对Vmax(及kcat)值的影响很小，但不可无视竞争型抑制的可能性。
作为这些图6与图7的结果的差异的理由，认为如下，即当为竞争型抑制时，若相对于抑制剂浓度增加底物浓度则抑制效果会减少，但赖威佛-柏克曲线在其特性上，权重施加到底物浓度低的区域的测定数据，相对于此，哈尼斯-伍尔夫曲线具有权重施加到底物浓度高的区域的测定结果的性质。无法从图6的曲线中读取的混合型抑制的特征有可能反应在图7的曲线中。
根据以上内容，作为本发明的基于糖分解酶抑制剂的α-淀粉酶活性的抑制机制，会引发以下疑问。
第一，所观察到的抑制是由单一抑制物质引起，还是由两种以上的抑制物质引起。
如果设为由单一物质引起抑制，则该物质是与α-淀粉酶的底物结合部位结合而引起竞争型抑制，还是与抑制剂结合部位结合而引起混合型抑制，或者与这两个结合部位结合而显示竞争型与混合型的抑制型。
进而，抑制并不是由单一抑制剂引起的，而是由抑制型不同的两种以上的抑制剂引起的，这些与酶的底物结合部位、抑制剂结合部位结合，其效果有可能引起底物的结合亲和性降低(即Km的增大)、分子催化剂活性降低(即Vmax及kcat的减少)。
在抑制物质的种类、是否为竞争型抑制还是混合型抑制的判别、酶的底物结合部位及抑制剂结合部位的鉴定方面，上述研究的酶反应速度论的方法有限。将来需要推进抑制物质的有效成分的纯化，并进行使用了酶与抑制剂的复合物的X射线晶体分析或NMR等的高精度的结构分析，由此分析抑制剂是与底物结合部位结合，还是与和其不同的抑制剂结合部位结合，或者是与这两个部位结合，并确定抑制方式。
[比较试验例3]
用缓冲液稀释上述α-淀粉酶活性测定试验中所使用的底物试剂溶液(原液)而制备了浓度不同的底物试剂溶液稀释液。具体而言，将底物试剂溶液原液的浓度设为相对浓度1而分别制备了相对浓度0.5及相对浓度0.25的底物试剂溶液稀释液。并且，实施例1中所得到的提取液小于3kDa组分粉末以成为80、40、20、10、5mg/mL的方式溶解于缓冲液中，并按浓度制备了提取液小于3kDa组分粉末的试样溶液。与所述α-淀粉酶抑制效果测定试验的情况相同，将预先在37℃下进行了保温的各浓度的试样溶液75μL和缓冲液33.5μL在微孔板的孔内进行混合，对其添加0.5μg/mL的α-淀粉酶溶液5μL，并在37℃下进行了5分钟的保温。接着，通过添加预先在37℃下进行了保温的各浓度的底物试剂溶液36.5μL而作为反应液开始进行反应，并使用酶标仪每1分钟进行测定，测定15分钟，测定了37℃下的405nm的吸光度(A405)。另外，将各测定各进行了3次。
关于各测定结果，通过上述方法进行分析，按底物试剂溶液的相对浓度，将提取液小于3kDa组分粉末的最终浓度标绘于横轴(x轴)，将反应速度的倒数标绘于纵轴(y轴)，制作迪克逊曲线(Dixonplot)(图8)。从各曲线得到基于最小二乘法的回归直线，并通过该回归方程，分别求出了底物浓度不同的回归直线的交点。迪克逊曲线中，改变了该交点的x坐标的符号的值表示抑制物质常数(inhibitorconstant)Ki(非专利文献25、非专利文献26)。从而，本发明的基于糖分解酶抑制剂的α-淀粉酶活性抑制的抑制物质常数(Ki)显示为39±2mg/mL。在此，若假设提取液小于3kDa组分粉末中所含有的物质的平均分子量为3,000，则推定Ki以摩尔浓度计为13mM。并且，若假设该抑制物质的平均分子量为1,500，则推定Ki为26mM。但是，认为提取液小于3kDa组分粉末中所含有的所有的物质并不都是抑制剂成分，因此认为实质上的Ki成为进一步小的值。
＜α-葡糖苷酶活性测定试验＞
关于α-葡糖苷酶活性，参阅非专利文献27及非专利文献28的方法，通过α-葡糖苷酶，将底物对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)水解成对硝基苯酚(PNP)和D-葡萄糖(G)，并测定源自所产生的对硝基苯酚的400nm的吸光度变化量来进行了评价。
关于α-葡糖苷酶，将大鼠肠丙酮粉末大鼠来源(产品编号I1630，SIGMA，批号：SLBN7104V)用作酶源。使0.5g的丙酮粉末悬浮于10mL的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，一边将容器浸在冰水中一边使用均质机(NS-51，Microtek Nithion(マイクロテック·ニチオン)制，千叶县船桥市)，以旋转调整器的刻度20计破碎了3分钟。将破碎液在4℃、15,000xg离心分离15分钟而得到的上清液作为酶液。关于酶液的蛋白质量，通过布拉德福德法以牛血清白蛋白(BSA)为标准进行了定量。所求出的本酶液的蛋白质浓度为4.5mg/mL。
将底物对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(简称为PNPG；产品编号25032-91，NacalaiTesque制，批号：M6E7187)在50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)溶解成3mM来作为PNPG底物液。
将酶液12.5μL与预先在37℃下进行了保温的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)87.5μL添加到96微孔板，并在37℃下保温5分钟。对其添加预先在37℃下进行了保温的PNPG底物液50μL而开始进行反应，并使用酶标仪每1分钟进行测定，测定15分钟，测定了37℃下的400nm的吸光度(A400)。另一方面，作为对照试验，替代酶液而添加不含有α-葡糖苷酶的50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)并以同样的方式进行测定，且将其作为空白。从添加酶液时的测定值减去空白值而求出每一测定时间的400nm的吸光度变化(ΔA400)，确认该吸光度变化随着反应时间而直线增加，并根据该直线的斜率而求出了每1分钟的吸光度变化量(ΔA400/min)。在此，生成物PNP的400nm下的分子吸光系数ε400为18,300M-1cm-1(非专利文献27)，并且，PNP的pKa为7.15，测定时的pH为7.0，因此根据汉-哈二氏方程式(Henderson-Hasselbalch equation)(非专利文献26)，测定条件下的ε400成为7,585M-1cm-1。并且，由于所使用的微孔板的光路长以反应液量150μL计为0.458cm，因此从这些值和ΔA400/min求出每1分钟所生成的PNP量，且将其作为反应速度即酶活性。此时，在不含有提取液小于3kDa组分粉末的条件下求出的α-葡糖苷酶活性为3.4×10-6M/min。
＜α-葡糖苷酶抑制效果测定试验＞
图9表示以各种浓度将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末添加到反应液时观察到的α-淀粉酶活性、生成物量(400nm的吸光度)的经时变化。图例的EB表示酶的空白，DB表示酶及提取液小于3kDa组分粉末的双空白。另外，EB以最终浓度成为10mg/mL的方式含有提取液小于3kDa组分粉末。
关于提取液小于3kDa组分的α-淀粉酶抑制效果，具体而言通过以下方法进行了测定。提取液小于3kDa组分的试样溶液以成为80、40、20、10、4、2mg/mL的方式将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末溶解于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)而进行了制备。在微孔板的孔中将预先在37℃下进行了保温的各浓度的试样溶液75μL与pH7.0的50mM磷酸钾缓冲液12.5μL进行混合，对其添加酶液12.5μL并在37℃下进行了5分钟的保温。接着，通过添加预先在37℃下进行了保温的PNPG底物液50μL而作为反应液开始进行反应，使用酶标仪每1分钟进行测定，测定15分钟，测定了37℃下的400nm的吸光度(A400)。另外，将各测定各进行了3次。
将测定结果示于图9。得知随着添加到反应液的提取液小于3kDa组分的浓度的增大，表示400nm的吸光度变化(ΔA400)的直线的斜率减少。
另一方面，不含有α-葡糖苷酶，且以最终浓度成为10mg/mL的方式含有提取液小于3kDa组分的条件的反应液中，未观察到PNPG分解活性(图9的EB)。从这些结果显示，在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分中含有依赖浓度地抑制α-葡糖苷酶活性的成分，并且该成分完全不具有α-葡糖苷酶样活性。
而且，通过上述方法对图9的测定结果进行了分析。通过α-葡糖苷酶从每1分钟生成的PNP量求出的不含有提取液小于3kDa组分粉末时的酶反应速度(vo)为3.4×10-6M/min。同样地，计算添加某一浓度的提取液小于3kDa组分粉末时的酶反应速度(vi)，将基于提取液小于3kDa组分粉末的抑制率(单位：％)定义为[1-(vi/vo)]×100，从而求出了存在各种浓度的提取液小于3kDa组分粉末时的抑制率。制作了将提取液小于3kDa组分粉末的最终浓度标绘于横轴，将抑制率标绘于纵轴的图10。通过图10可知，增加添加到反应液的提取液小于3kDa组分粉末的最终浓度时，抑制率虽增加但显示饱和曲线行为。在此，将抑制50％的α-葡糖苷酶活性的提取液小于3kDa组分粉末的最终浓度设为IC50时，IC50为7.4mg/mL。通常，当酶与抑制剂结合而形成酶-抑制剂复合物时，其平衡常数相当于抑制物质常数Ki，其值大致相当于IC50。因此，能够将提取液小于3kDa组分粉末的相对于α-葡糖苷酶的抑制物质常数Ki视为7.4mg/mL。当使用了同等浓度的提取液小于3kDa组分粉末时的α-淀粉酶活性抑制率为约10％。并且，如上所述，提取液小于3kDa组分粉末的相对于α-淀粉酶的抑制物质常数Ki为39±2mg/mL。从以上内容显示，与α-淀粉酶活性相比，本发明的糖分解酶抑制剂对α-葡糖苷酶活性发挥高5.3倍的抑制效果。
接着，对向在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末进一步进行了各种处理工序的实施例进行说明。
[实施例2]
制备了以成为80mg/mL的方式将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末溶解于DIAMONDCOLOR·AMY-L DIRECT的缓冲液(KTAM-103，α-淀粉酶抑制试验用)或50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0，α-葡糖苷酶抑制试验用)中的试样溶液。使用-80℃的超低温冷冻机(MDF-U384，SANYOE lectric Co.,LTD.制，大阪府守口市)对该溶液进行冷冻处理，保持一晚之后，将容器浸渍于自来水中而将其融化。将该溶液作为“冻融处理溶液”(实施例2)。
[实施例3]
以成为80mg/mL的方式将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末溶解在10mM的HCl(pH2.0)中。在室温下将该溶液保持3小时之后，添加1M的NaOH而进行了中和。进而进行冷冻处理之后，使用冷冻干燥机将其制成再次冷冻干燥处理粉末。以成为与溶解在10mM的HCl时相同的体积的方式向该再冷冻干燥处理粉末添加DIAMONDCOLOR·AMY-LDIRECT的缓冲液(KTAM-103、α-淀粉酶抑制试验用)或50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0、α-葡糖苷酶抑制试验用)而制备了试样溶液。将该溶液作为“酸处理溶液”(实施例3)。
[实施例4]
制备了以成为80mg/mL的方式将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末溶解在DIAMONDCOLOR·AMY-L DIRECT的缓冲液(KTAM-103，α-淀粉酶抑制试验用)或50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0，α-葡糖苷酶抑制试验用)的试样溶液。使用铝块恒温槽(DTU-1BN，TietechCo.,LTD.制，东京)，在100℃下对该溶液进行了10分钟或30分钟加热处理。
在此，在溶解在α-葡糖苷酶抑制试验用即50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的80mg/mL的提取液小于3kDa组分粉末中，加热处理后视觉辨认到沉淀物，因此以15,000xg离心分离5分钟而去除沉淀物，并收集了上清液。
将如以上通过加热处理所收集的提取液小于3kDa组分粉末的溶液冷却至室温来作为“加热处理溶液”(实施例4)。
[实施例5]
制备了以成为80mg/mL的方式将在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末溶解在DIAMONDCOLOR·AMY-L DIRECT的缓冲液(KTAM-103，α-淀粉酶抑制试验用)或50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0，α-葡糖苷酶抑制试验用)的试样溶液。将该溶液放入玻璃样品瓶，并添加等量的己烷(特级试剂，含有正己烷97％，Nacalai Tesque Inc.制、京都市)后加盖，使用旋涡混合器激烈搅拌了5分钟。以10,000xg离心分离5分钟而充分分层之后，去除己烷层，并小心地回收水层。将该水层的溶液作为“己烷萃取溶液”(实施例5)。另外，还制备了对不含有提取液小于3kDa组分粉末的DIAMONDCOLOR·AMY-L DIRECT的缓冲液(KTAM-103、α-淀粉酶抑制试验用)或50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0、α-葡糖苷酶抑制试验用)，添加等量的己烷并进行了相同的萃取操作的溶液，将这些分别作为对照组。
[针对实施例2～5的α-淀粉酶抑制效果测定试验]
使用在上述实施例2～5中得到的各试样溶液，并通过与所述α-淀粉酶抑制效果测定试验相同的方法进行了测定。将预先在37℃下进行了保温的各试样溶液75μL与缓冲液33.5μL在微孔板的孔内进行混合，对其添加0.5μg/mL的α-淀粉酶溶液5μL，且在37℃下保温了5分钟。接着，通过添加预先在37℃下进行了保温的底物试剂溶液36.5μL而作为反应液开始进行反应，使用酶标仪每1分钟进行测定，测定15分钟，测定了37℃下的405nm的吸光度。另外，将各测定各进行了3次。通过上述方法分析结果，且分别计算了相对于未含有提取液小于3kDa组分粉末时的α-淀粉酶活性，使用了各试样溶液时的抑制率(表2)。另外，为了进行比较，将实施例1的以最终浓度成为40mg/mL的方式添加了提取液小于3kDa组分粉末时的α-淀粉酶活性抑制率也组合示于表2中。
[表2]
首先，关于实施例2的冻融处理溶液进行详细说明。与未添加提取液小于3kDa组分粉末的情况相比，使用了在-80℃下进行冷冻、保持一晚之后融化的冻融处理溶液的情况下，也抑制了35％的α-淀粉酶活性。这表示如下内容：与使用了未处理的提取液小于3kDa组分粉末时效果相同，因此显示α-淀粉酶活性抑制效果的成分对实施例2的冻融处理具有稳定性及耐冻融性。并且，由此能够期待使不耐低温的成分改性而去除的效果、能够防止微生物的繁殖并长期保存的可能性。
接着，关于实施例3的酸处理溶液，与未添加提取液小于3kDa组分粉末的情况相比，使用了以pH2保持3小时之后进行了中和的酸处理溶液的情况下，也抑制了34％的α-淀粉酶活性。该结果示出，显示α-淀粉酶活性抑制效果的成分对实施例3的酸处理具有稳定性及耐酸性。并且，由此能够期待使不耐酸的成分改性而去除的效果、基于酸的杀菌效果。而且口服摄取时，也能够期待耐胃酸而到达小肠并抑制α-淀粉酶的可能性。
进而，关于实施例4的加热处理溶液，与未添加提取液小于3kDa组分粉末的情况相比，添加了在100℃下进行10分钟及30分钟加热处理而成的加热处理溶液的情况下，也分别抑制了36％及40％的α-淀粉酶活性。这表示与添加了未实施加热处理的提取液小于3kDa组分粉末时相同或更高的抑制效果。从以上内容显示，提取液小于3kDa组分粉末中的α-淀粉酶活性抑制剂成分相对于实施例4的加热处理具有高稳定性及耐热性。并且，由此可期待通过对提取液小于3kDa组分粉末进行加热处理而使不耐热的成分失活或者改性而去除的效果，进而能够期待杀菌效果或杀灭病毒效果。
并且，关于实施例5的己烷萃取溶液，与未添加提取液小于3kDa组分粉末的情况相比，使用了进行将己烷添加到提取液小于3kDa组分粉末并搅拌、分层的萃取操作之后得到的水层的情况下，也抑制了35％的α-淀粉酶活性。另一方面，使用水层对α-淀粉酶抑制进行了研究，该水层中替代提取液小于3kDa组分粉末而仅使用缓冲液进行了相同的萃取操作。进行萃取操作而得到的水层的抑制活性中未发现与未进行萃取操作的对照组(即未处理的缓冲液)的抑制活性的差异。这些结果表示，显示α-淀粉酶活性抑制效果的成分并不是源自通过己烷萃取操作而有可能转移到水层中的己烷。并且，表示提取液小于3kDa组分粉末中的α-淀粉酶抑制物质对己烷稳定，不转移到己烷层或界面而保持于水层中，且为亲水性高的物质。从以上结果能够期待通过使用己烷等有机溶剂的萃取操作，去除转移到有机层的成分及转移到界面的成分的效果。己烷为应用于生物物质的提取工序中的具有最高的非极性和高疏水性的有机溶剂，通常使用高于己烷的非极性或疏水性的溶剂为例外。从而，如上所述，该提取液小于3kDa组分粉末不会在己烷中削弱α-淀粉酶活性抑制效果、或使该效果消失，因此能够判断除了己烷以外的有机溶剂中，也具有充分的稳定性和耐有机溶剂性。
[针对实施例2～5的α-葡糖苷酶抑制效果测定试验]
进而，使用在上述实施例2～5中得到的各试样溶液，并以与所述α-葡糖苷酶抑制效果测定试验相同的方法进行了测定。将预先在37℃下进行了保温的各浓度的试样溶液75μL与50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)12.5μL在微孔板的孔内进行混合，对其添加酶液12.5μL，在37℃下保温了5分钟。接着，通过添加预先在37℃下进行了保温的PNPG底物液50μL而作为反应液开始进行反应，使用酶标仪每1分钟进行测定，测定15分钟，测定了37℃下的400nm的吸光度。另外，将各测定各进行了3次。通过上述方法对结果进行分析，分别计算出对未含有提取液小于3kDa组分粉末时的α-葡糖苷酶活性使用了各试样溶液时的抑制率(表3)。另外，为了进行比较，将添加了实施例1的最终浓度40mg/mL的提取液小于3kDa组分粉末时的α-葡糖苷酶活性抑制率也组合示于表3。
[表3]
如表3所示，以最终浓度40mg/mL将实施例2的冻融处理溶液或实施例3的酸处理溶液添加到反应液的情况下，α-葡糖苷酶活性抑制率也与使用了实施例1的提取液小于3kDa组分粉末(未处理溶液)的情况相同。
从这些结果表示，显示α-葡糖苷酶活性抑制效果的成分对实施例2的冻融处理或实施例3的酸处理非常稳定，且具有高耐冻融性、耐酸性。并且，与使用了实施例1的提取液小于3kDa组分粉末(未处理溶液)的情况相比，将实施例4的加热处理溶液添加到反应液的情况下，α-葡糖苷酶活性抑制率略微降低。而且，与使用了实施例1的提取液小于3kDa组分粉末(未处理溶液)的情况相比，将实施例5的己烷萃取溶液以最终浓度40mg/mL添加到反应液的情况下，还发现α-葡糖苷酶活性抑制率略微降低。通过对提取液小于3kDa组分粉末进行冻融、酸性、加热、己烷处理等前处理，与未进行这些的情况相比，还观察到抑制活性略微降低的例子，即使如此，这些前处理后的抑制效果也充分大。从而，能够判断显示α-葡糖苷酶活性抑制活性的成分对实施例4的加热处理或实施例5的己烷萃取处理具有高稳定性、耐热性、耐有机溶剂性。显示α-葡糖苷酶活性抑制活性的成分中可观察到的这些特性与显示上述α-淀粉酶活性抑制效果的成分的特性相同，在保存性、加工性、应用性等方面也可期待与上述相同的优异的效果。
通过以上结果，认为通过对在实施例1中得到的提取液小于3kDa组分粉末，将冻融处理、酸处理、加热处理、有机溶剂处理单独或组合多种而实行，由此能够得到纯度更高且具有α-淀粉酶活性抑制效果及α-葡糖苷酶活性抑制效果的糖分解酶抑制剂。
如此得到的源自蚯蚓的糖分解酶抑制剂能够使用于医药品、功能性食品、添加剂、宠物食品等中。
[其他实施方式]
(1)上述实施方式中，成为原料的蚯蚓使用了红纹蚯蚓(Eisenia fetida)，但也可以使用以医药品、健康食品用途使用的其他种类的蚯蚓。
(2)上述实施方式中，使用了对蚯蚓的破碎液进行等静压式高压处理，对经离心分离的上清液进行冷冻干燥而制备的蚯蚓干燥粉末，但也可以使用通过其他方法制备的蚯蚓干燥粉末。
(3)关于上述实施方式中的糖分解酶抑制剂的制造方法中所含有的各工序的处理条件能够适当进行变更。
(4)上述实施方式中，例示了将蚯蚓干燥粉末作为原料而制造糖分解酶抑制剂的情况，但也可以将蚯蚓或其破碎物作为原料而制造糖分解酶抑制剂。

Claims (2)

1.一种糖分解酶抑制剂的制造方法，所述糖分解酶抑制剂对特定糖分解酶具有活性抑制效果，其中，
所述特定糖分解酶包含α-葡糖苷酶和α-淀粉酶的至少一种，
实行如下工序来得到所述糖分解酶抑制剂，即：
提取工序，以蚯蚓破碎物、或者蚯蚓干燥粉末或蚯蚓破碎物的干燥粉末为原料并添加水而得到蚯蚓提取液；及
分离工序，得到源自该蚯蚓提取液的分子质量小于3kDa的提取液小于3kDa组分。
2.根据权利要求1所述的糖分解酶抑制剂的制造方法，其中，
对通过所述分离工序回收的提取液小于3kDa组分实行选自冻融处理、酸处理、加热处理、有机溶剂处理中的至少一种来得到所述糖分解酶抑制剂，所述有机溶剂为己烷。
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