WO2021256506A1 - スクラーゼ活性の測定方法およびスクラーゼ関連疾患の診断方法 - Google Patents

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WO2021256506A1
WO2021256506A1 PCT/JP2021/022862 JP2021022862W WO2021256506A1 WO 2021256506 A1 WO2021256506 A1 WO 2021256506A1 JP 2021022862 W JP2021022862 W JP 2021022862W WO 2021256506 A1 WO2021256506 A1 WO 2021256506A1
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sucrase
labeled
sucrose
test sample
activity
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PCT/JP2021/022862
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睦 稲田
恵子 川田
奈美 井上
大輔 古賀
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大塚製薬株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/497—Physical analysis of biological material of gaseous biological material, e.g. breath

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for measuring sucrase activity in a subject and a method for diagnosing a sucrase-related disease.
  • sucrose and / or isomaltose cannot be decomposed and absorbed in the small intestine, and ingestion of sugar or starch causes severe diarrhea and abdominal distension. Mutations in the sucrase-isomaltase gene are known to cause sucrase-isomaltase deficiency.
  • the sucrase-isomaltase complex is a degrading enzyme expressed on the booklet edge (microvillus) of the small intestinal epithelium, which decomposes sucrase into glucose and fructose and isomaltose into two molecules of glucose, which are absorbed from the small intestinal epithelium. To.
  • sucrase or isomaltase activity of the sucrase-isomaltase complex is impaired by mutation, sucrose or isomaltose is not degraded to monosaccharides, respectively. Due to its structural properties, sucrase activity tends to decrease, and isomaltase activity is often relatively maintained.
  • Respect diagnosis of sucrase-isomaltase deficiency, by carbon atoms in the sucrose to 13 C- sucrose labeled with 13 C is ingested subject, measuring the amount of 13 CO 2 to be discharged into the breath, sucrase activity Is known (Non-Patent Document 1).
  • 13 C- amount of 13 CO 2 is discharged to the breath after ingestion of sucrose but reflects sucrase activity and also influenced by the glucose metabolism of the subject, in this method, a breath test using a 13 C- sucrose Should perform a breath test with 13 C-glucose on another day to correct the results of the breath test with 13 C-sucrose.
  • One of the objects of the present disclosure is to provide a simpler method for measuring sucrase activity of a sucrase-isomaltase complex and a method for diagnosing a sucrase-related disease.
  • 13 C-sucrase which was 13 C-labeled with the fructose moiety and 13 C-unlabeled with the glucose moiety, and then 13 C-labeled CO 2 in the exhaled breath collected.
  • the present disclosure is a method of measuring the sucrase activity of a sucrase-isomaltase complex of interest.
  • a 13 C-labeled sucrose is one in which at least one carbon atom of the fructose moiety is 13 C-labeled and the carbon atom of the glucose moiety is 13 C-labeled.
  • Provided is a method in which a test sample is taken at a time determined based on a period of time in which the proportions are comparable in a healthy population and a population with reduced glucose metabolism.
  • At least one carbon atom of the fructose moiety are 13 C-labeled, including 13 C-labeled sucrose carbon atoms glucose moiety is not 13 C-labeled, sucrase-isomaltase complex of interest
  • a composition for measuring the sucrase activity of the body is provided.
  • the present disclosure is a method of diagnosing a sucrase-related disease.
  • (1) A step of measuring the sucrase activity of the target sucrase-isomaltase complex by the above method, and (2) A step of comparing the sucrase activity measured in step (1) with an index value to diagnose a target sucrase-related disease.
  • Provide methods including.
  • the present disclosure is at least one carbon atom is 13 C-labeled fructose moiety, including 13 C-labeled sucrose carbon atoms glucose moiety is not 13 C-labeled, for diagnosing a sucrase-related disease
  • the composition of is provided.
  • the sucrase activity of the target sucrase-isomaltase complex can be measured more easily than the conventional method. Such an assessment of sucrase activity may provide useful information for the diagnosis of sucrase-related diseases.
  • the sucrase-isomaltase complex has a sucrase activity that decomposes sucrose into glucose and fructose, and an isomaltase activity that decomposes isomaltose into two molecules of glucose. Orally ingested sucrose is broken down into monosaccharides in the small intestine by the sucrase activity of this molecule, and the carbon atoms in the sucrose are finally excreted as carbon dioxide in the exhaled breath. Therefore, the amount of 13 C-labeled carbon dioxide contained in the exhaled breath after ingesting 13 C-labeled sucrose reflects sucrase activity.
  • the target may be a human or a non-human mammal.
  • non-human mammals include mice, rats, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, monkeys, pigs, cows and horses.
  • Metabolic diseases include, for example, scrase-isomartase deficiency, irritable bowel syndrome, mucosal disorders caused by infection, drug-induced mucosal disorders, non-alcoholic fatty hepatitis (NASH), non-alcoholic fatty liver disease (non-alcoholic fatty liver disease). NAFLD), fatty liver, viral hepatitis (hepatitis B, hepatitis C, etc.), alcoholic liver disease, primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, hemochromatosis, autoimmune hepatitis, liver cirrhosis, etc.
  • liver disease Includes liver disease, diabetes, borderline diabetes, insulin resistance, hyperglycemia, hyperinsulinemia, obesity, dyslipidemia, hypertension, etc., especially due to scrase-isomartase deficiency, hypersensitive bowel syndrome, infection Mucosal disorders or drug-induced mucosal disorders.
  • the causative microorganisms of mucosal damage caused by infection include viruses such as norovirus, rotavirus, and adenovirus, and bacteria such as campylobacter, enterohemorrhagic Escherichia coli, salmonella, Welsh, staphylococcus, and Vibrio parahaemolyticus.
  • Drug-induced mucosal disorders include non-steroidal anti-inflammatory drugs such as aspirin and indomethacin, chemotherapeutic agents such as methotrexate, 5-FU and docetaxel, and heavy metal preparations such as cisplatin.
  • non-steroidal anti-inflammatory drugs such as aspirin and indomethacin
  • chemotherapeutic agents such as methotrexate, 5-FU and docetaxel
  • heavy metal preparations such as cisplatin.
  • the subject may be fasting or non-fasting upon administration of 13C-labeled sucrose. If the subject is to be fasted when 13 C-labeled sucrose is administered, the subject should be fasted at least 2 hours or more, preferably at least 4 hours or more before administration of 13 C-labeled sucrose, for example, from the day before the test. Is exemplified, and water may be ingested. 13 If the subject is to be in a non-fasting state when administering C-labeled sucrose, a normal diet may be ingested as usual.
  • 13 C-labeled sucrose is then such that at least a portion of CO 2 produced via the glucose metabolism pathway is labeled with 13 C, which is 13 C-labeled fructose moiety, 13 C in glucose moiety It is characterized by being unmarked.
  • the structure of sucrose is shown below, and the carbon atom of the fructose moiety is indicated by *.
  • the 13 C-labeled sucrose in the present disclosure is one in which at least one of the carbon atoms marked with * is labeled with 13 C, and a plurality or all of the carbon atoms marked with * may be labeled with 13 C.
  • the method of labeling sucrose with 13 C is not particularly limited, and commonly used methods are widely adopted (Sasaki, "5.1 Application of stable isotopes to clinical diagnosis”: Area of Chemistry 107 "Stable isotopes". Application of the body to medicine / pharmacy and biology ”pp.149-163 (1975) Nanedo; Kajiwara, RADIOISOTOPES, 41, 45-48 (1992), etc.). Commercially available 13 C labeled sucrose may be used.
  • 13 C-labeled sucrose can be in the form of a composition for oral administration.
  • the components other than the labeled sucrose, the blending ratio of each component, the method for preparing the composition, and the like are not particularly limited.
  • the forms of the composition are liquid forms such as liquids (including syrups), suspensions and emulsions; tablets (including nakeds, coatings), chewable tablets, capsules, pills, powders (powder). ), Solid forms such as syrups and granules, and any other form of oral administration can be employed.
  • the composition is not limited to the one having a pharmaceutical form , as long as it contains the above 13 C-labeled sucrose and does not interfere with the measurement of sucrose activity, and the above 13 C-labeled sucrose can be combined with any food material to provide a solid diet. , In the form of liquid food or liquid food.
  • composition may consist substantially only of 13 C-labeled sucrose, and depending on each pharmaceutical form (administration form), any pharmaceutically acceptable carrier and additive usually used in the art may be used. It may be in a mixed form.
  • the amount of 13 C-labeled sucrose to be blended is not particularly limited, and for example, 1 to 99% by weight in 100% by weight of the composition can be mentioned, and can be appropriately adjusted within such a range.
  • the amount of 13 C-labeled sucrose to be incorporated into the composition can be appropriately adjusted so that the dose per dose is in an appropriate range.
  • compositions When molding the composition into solid forms such as tablets, chewable tablets, capsules, pills, powders (powder), fine granules, and granules, various carriers or additives are used depending on the various forms. Can be used.
  • carriers or additives for example, lactose, sucrose, citrus, dextrin, mannitol, xylitol, sorbitol, erythritol, calcium dihydrogen phosphate, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid and the like.
  • the tablets may be tablets coated with a normal skin, for example, sugar-coated tablets, gelatin-encapsulated tablets, film-coated tablets, double tablets, multi-layer tablets and the like.
  • the capsule is prepared by mixing 13C- labeled sucrose with various carriers exemplified above and filling it in a cured gelatin capsule, a soft capsule, or the like according to a conventional method.
  • the amount of 13 C-labeled sucrose administered to the subject can be adjusted as appropriate. For example, it may be administered in an amount of 0.1 to 1000 mg / kg body weight, 0.2 to 500 mg / kg body weight, 1 to 100 mg / kg body weight or 5 to 50 mg / kg body weight, for example, 10 mg / kg body weight.
  • the subject is a human (adult)
  • the test sample is determined based on a period in which the ratio of 13 CO 2 to unlabeled CO 2 or total CO 2 is equivalent in a healthy population and a population with reduced glucose metabolism. It was collected.
  • a healthy population means a population with no signs and / or symptoms of metabolic disease, in particular a population known to have normal sucrase activity and glucose metabolism.
  • the group with decreased glucose metabolism means a group in which sucrase activity is normal and glucose metabolism is known to be decreased. For example, normal sucrase activity can be confirmed by the absence of mutations in the sucrase-isomaltase gene.
  • the glucose metabolic capacity may be determined using any of the known methods, for example, if the blood glucose level is within the normal range, it can be determined that the glucose metabolic capacity is normal, and the blood glucose level is normal. If it is not within the range, it can be determined that the glucose metabolic capacity is reduced.
  • test sample is taken at any time from the administration of 13C- labeled sucrose to about 20 minutes after administration.
  • the test sample is at any time point from about 5 minutes to about 30 minutes after administration of 13C- labeled sucrose, or at any time point from about 10 minutes to about 25 minutes, for example, about 20 minutes. Will be collected later.
  • a test sample collected from the administration of 13 C-labeled sucrose until the amount of 13 CO 2 contained in the exhaled breath reaches the maximum, or near the time when the amount of 13 CO 2 reaches the maximum can be used.
  • the time for collecting the test sample, in healthy populations, the proportion of 13 CO 2 amount to unlabeled CO 2 amount or total amount of CO 2 in the test sample is determined based on the time of maximum.
  • 13 C-labeled sucrose in healthy population was administered orally to 13 C-labeled sucrose in healthy population, over time breath was collected, 13 CO 2 to unlabeled CO 2 amount or total amount of CO 2 in the breath at each time point It can be determined by calculating the proportion of the quantity and determining the time point at which the proportion reaches its maximum. For example, the average time from oral administration of 13 C-labeled sucrose to the time when the proportion reaches its maximum in a healthy population can be determined to determine when to collect the test sample.
  • the test sample is taken at any time from the administration of 13C- labeled sucrose to 10 minutes after the time when the proportion is maximized in a healthy population.
  • the test sample is taken at any time from the administration of 13C- labeled sucrose to the time when the proportion is maximized in a healthy population.
  • the test sample is about 5 at that time, at or near the time when the proportion is maximum in a healthy population, for example, between about 10 minutes before and about 10 minutes after that time. It is collected from about 5 minutes before to about 5 minutes after, or from about 3 minutes before to about 3 minutes after that time.
  • a plurality of test samples may be collected from the subject over time, the ratio may be calculated for each test sample, and the peak value of the ratio may be used as the measured value of the sucrase activity of the target.
  • the test sample i.e., the exhaled breath discharged from the subject
  • the test sample can be collected based on a conventionally known exhalation test method.
  • Measurement and analysis of 13 CO 2 , unlabeled CO 2 , and total CO 2 contained in the exhaled breath sample may be performed according to a conventionally known procedure, which is known to those skilled in the art.
  • 13 CO 2 can be measured and analyzed by using commonly used analytical methods such as liquid scintillation counter method, mass spectrometry, infrared spectroscopic analysis, luminescence analysis, and magnetic resonance spectroscopy. can.
  • infrared spectroscopy or mass spectrometry is used.
  • Procedure for calculating the ratio of 13 CO 2 amount to unlabeled CO 2 amount or total amount of CO 2 in the test sample may according to known procedures, for example, is described as follows ( “13 C- breath Practical basics and practical application of the test Section 8: 13 C-Breathing test data analysis method ”, Tsuneo Matsubayashi, Wataru Matsuyama, 13 C Medical Application Study Group, pp.102-111).
  • R is a very small value, it is difficult to measure it directly.
  • comparison with the standard substance is always performed, and the measurement result is expressed by the ⁇ value defined by the following equation.
  • PDB carbon dioxide
  • the ⁇ 13 C value ( ⁇ ) is based on the ⁇ 13 C value before reagent administration (that is, the naturally occurring ⁇ value of 13 C) as the background, and this is used as ⁇ 13 after reagent administration. It means the value ( ⁇ 13 C) subtracted from the C value.
  • the R SAM is obtained from (Equation 2), which is the definition of ⁇ 13 C, and substituted into R in the above formula, and the approximation (Equation 7) for obtaining the 13 C concentration is obtained.
  • Equation 8 can calculate the delta% 13 C from delta 13 C.
  • the presence ratio of carbon dioxide contained in the collected breath (the ratio of 13 CO 2 amount to unlabeled CO 2 amount or total amount of CO 2), the amount of change in 13 C concentration in accordance with the following methods (delta It can be calculated as % 13 C).
  • 13 C concentration of 13 C concentration (in breath in the total carbon contained in the breath taken at any time t after 13 C-labeled sucrose administered to a subject, 13 C concentration atom %, (% 13 C) t ) is calculated.
  • 13 C-labeled pre-harvested breath before administration of sucrose to the subject preferably 13 C concentration of 13 C concentration (in breath in the total carbon contained in the breath that is taken 0 hours prior to administration, 13 C concentration atom%, (% 13 C) 0 ) is obtained.
  • (% 13 C) t is subtracted from (% 13 C) 0 to obtain the amount of change in 13 C concentration ( ⁇ % 13 C (atom%)).
  • the amount of change in the 13 C concentration is ⁇ 13 C ( ⁇ ) ( ⁇ 13 C value change ( ⁇ )) or DOB (after formula 3) based on the above equations 5 and 3. ⁇ )) may be converted.
  • the ratio of 13 CO 2 amount to unlabeled CO 2 amount or total amount of CO 2 contained in the expiration, delta% 13 C or delta 13 C area under the curve in the graph showing the change over time in the ( ⁇ ) (Area under It may be calculated as the curve; AUC t).
  • the area under the curve may be calculated according to a conventionally known calculation method, and can be easily understood by those skilled in the art.
  • the vertical axis represents ⁇ % 13 C or ⁇ 13 C ( ⁇ )
  • the horizontal axis represents the elapsed time after administration of 13 C-labeled glucose, indicating the time course of ⁇ % 13 C or ⁇ 13 C ( ⁇ ).
  • the area under the curve is calculated.
  • the vertical axis is ⁇ % 13 C or ⁇ 13 C ( ⁇ ), and the area under the curve from the administration of 13 C-labeled sucrose to t hours later can be expressed as AUC t-0. Further, the vertical axis is ⁇ % 13 C or ⁇ 13 C ( ⁇ ), and the area under the curve from t 1 hour to t 2 hours after administration of 13 C-labeled sucrose can be expressed as AUC t2-t1.
  • the ratio of 13 CO 2 to the unlabeled CO 2 or total CO 2 in the test sample thus calculated can be used as the measured value of the sucrase activity of the sucrase-isomaltase complex of interest.
  • a method for measuring the sucrase activity of a sucrase-isomaltase complex of interest (1) A step of orally administering to a subject 13 C-labeled sucrose in which at least one carbon atom of the fructose moiety is 13 C-labeled and the carbon atom of the glucose moiety is 13 C-labeled. (2) A step of collecting exhaled breath discharged from a subject and using it as a test sample, wherein the test sample is the amount or total of unlabeled CO 2 in the test sample in a healthy group and a group with reduced glucose metabolism.
  • ratio of 13 CO 2 amount to the amount of CO 2 is one that was taken at the time determined based on the period equivalent; and, (3) the ratio of 13 CO 2 amount to unlabeled CO 2 amount or total amount of CO 2 in the test sample, the step of calculating a measure of sucrase activity, Methods are provided that include.
  • At least one of the carbon atoms are 13 C-labeled, including 13 C-labeled sucrose carbon atoms glucose moiety is not 13 C-labeled, sucrase activity of sucrase-isomaltase complex subject of fructose moiety
  • a composition for measuring is provided.
  • for measuring the sucrase activity of sucrase-isomaltase complex of interest and at least one of 13 C-labeled carbon atoms fructose moiety, carbon atoms glucose moiety is not 13 C-labeled 13 C-labeled sucrase is provided.
  • At least one carbon atom of the fructose moiety is 13 C labeled and the carbon atom of the glucose moiety is for producing a composition for measuring the sucrase activity of the sucrase-isomaltase complex of interest. 13 use of C unlabeled 13 C-labeled sucrose is provided.
  • a method for diagnosing a sucrase-related disease of interest is provided by utilizing the above-mentioned method for measuring sucrase activity.
  • the method is (1) A step of measuring the sucrase activity of the target sucrase-isomaltase complex by the above method; and (2) A step of comparing the sucrase activity measured in step (1) with an index value to diagnose a target sucrase-related disease. including.
  • the method can also be a method of assisting in the diagnosis of sucrase-related diseases.
  • sucrase-related disease means a disease caused by a deficiency or a decrease in sucrase activity.
  • sucrase-related diseases include sucrase-isomaltase deficiency, irritable bowel syndrome, infection-induced mucosal damage and drug-induced mucosal damage. Details of mucosal damage are as described above.
  • Diagnosis of sucrase-related disease includes determining whether or not the subject is suffering from a sucrase-related disease, determining the exacerbation or improvement of the sucrase-related disease in the subject, and treating the sucrase-related disease in the subject. It involves determining the effect or determining the severity of the sucrase-related disease of interest.
  • Step (1) can be carried out according to the above-mentioned method for measuring sucrase activity.
  • step (2) the sucrase activity calculated in step (1) is compared with the index value to diagnose the target sucrase-related disease.
  • the index value can be a value obtained from the sucrase activity measured by performing step (1) under the same conditions as the subject for a healthy population. For example, the average value of sucrase activity measured in a healthy population can be determined to determine the index value.
  • the index value may be a value based on the sucrase activity measured for a healthy population at the same time as, in parallel with, or before or after the measurement of the sucrase activity (test value) in the subject, and is a predetermined value. May be.
  • a subject can be diagnosed with a sucrase-related disease if the test value is lower than the index value, and the subject is not suffering from a sucrase-related disease if the test value is equal to or higher than the index value. Can be diagnosed.
  • the severity of sucrase-related diseases can be further known based on the degree of high or low of the test value with respect to the index value.
  • the index value may be the sucrase activity previously measured in the subject according to step (1) under the same conditions.
  • the test value when the test value is lower than the index value, it can be determined that the target sucrase-related disease has deteriorated, and when the test value is higher than the index value, it can be determined that the target sucrase-related disease has been improved.
  • it is a method of diagnosing a sucrase-related disease of interest.
  • ratio of 13 CO 2 amount to the amount of CO 2 is one that was taken at the time determined based on the period equivalent; (3) the ratio of 13 CO 2 amount to unlabeled CO 2 amount or total amount of CO 2 in the test sample, is calculated as a measure of sucrase activity; and, (4) A step of comparing the sucrase activity measured in step (3) with an index value to diagnose a target sucrase-related disease. Methods are provided that include.
  • At least one carbon atom is 13 C-labeled fructose moiety, including 13 C-labeled sucrose carbon atoms glucose moiety is not 13 C-labeled
  • composition for diagnosing a sucrase-related disease in a subject Things are provided.
  • 13 C-labeled sucrose is provided for diagnosing a sucrase-related disease of interest, in which at least one carbon atom of the fructose moiety is 13 C labeled and the carbon atom of the glucose moiety is 13 C unlabeled.
  • At least one carbon atom is 13 C-labeled fructose moiety, carbon atoms glucose moiety is not 13 C-labeled certain aspects
  • the use of 13 C-labeled sucrose is provided.
  • a method for measuring the sucrase activity of a target sucrase-isomaltase complex The breath discharged by 13 C-labeled sucrose orally administered target the test sample, calculating the ratio of 13 CO 2 amount to unlabeled CO 2 amount or total amount of CO 2 in the test sample, as a measure of sucrase activity Including doing A 13 C-labeled sucrose is one in which at least one carbon atom of the fructose moiety is 13 C-labeled and the carbon atom of the glucose moiety is 13 C-labeled.
  • test sample was taken at a time determined based on a period of time in which the proportions were comparable in a healthy population and a population with reduced glucose metabolism.
  • test sample is collected at a time determined based on the time point at which the proportion is maximized in a healthy population.
  • the test sample was collected at any time from the administration of 13C- labeled sucrose to 10 minutes after the time when the ratio became maximum in the healthy population, the first item or the second item. The method described in the section.
  • the test sample was collected at any time between the administration of 13C- labeled sucrose and the time when the ratio was maximized in a healthy population, according to paragraphs 1 to 3. The method described in either.
  • test sample is collected in the vicinity of the time point at which the ratio is maximized in a healthy population.
  • test sample is collected at the time when the ratio is maximized in a healthy population.
  • exhaled breath discharged from the subject at a plurality of time points is used as a test sample, the ratio is calculated for each test sample, and the peak value of the ratio is used as the measured value of sucrase activity. The method described.
  • test sample was collected at any time from the administration of 13C-labeled sucrose to about 20 minutes after administration.
  • Metabolic diseases include scrase-isomartase deficiency, irritable bowel syndrome, mucosal disorders caused by infection, drug-induced mucosal disorders, non-alcoholic steatohepatitis, non-alcoholic steatohepatitis, fatty liver, Viral hepatitis, alcoholic liver disease, primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, hemochromatosis, autoimmune hepatitis, liver disease, diabetes, borderline diabetes, insulin resistance, hyperglycemia, hyperinsulin 11. The method of paragraph 11, wherein the person is bloodstream, obesity, dyslipidemia or hypertension.
  • At least one of the carbon atoms is 13 C-labeled fructose moiety, including 13 C-labeled sucrose carbon atoms glucose moiety is not 13 C-labeled, the sucrase activity of sucrase-isomaltase complex of interest Composition for measurement.
  • 13 C-labeled sucrose is such that all carbon atoms in the fructose moiety are 13 C-labeled.
  • a method for diagnosing sucrase-related diseases (1) A step of measuring the sucrase activity of the sucrase-isomaltase complex of interest by the method according to any one of paragraphs 1 to 15, and a step of measuring the sucrase activity. (2) A step of comparing the sucrase activity measured in step (1) with an index value to diagnose a target sucrase-related disease. How to include. [19] The method according to paragraph 18, wherein the index value is a value obtained from sucrase activity measured according to the method according to any one of paragraphs 1 to 15 in a healthy population. [20] When the test value is lower than the index value, the subject is diagnosed as having a sucrase-related disease, and when the test value is equal to or higher than the index value, the subject has a sucrase-related disease.
  • At least one of the carbon atoms are 13 C-labeled, including 13 C-labeled sucrose carbon atoms glucose moiety is not 13 C-labeled, composition for diagnosing sucrase-related diseases fructose moiety.
  • the composition according to claim 23, wherein the 13 C-labeled sucrose is such that all carbon atoms in the fructose moiety are 13 C-labeled.
  • 13 C-labeled sucrose Three types of 13- C-labeled sucrose shown in FIG. 1 were used in the examples.
  • 13 C6-sucrose 13 C6-fructose
  • 13 C6-sucrose 13 C6-glucose
  • the carbon atom of the glucose portion of sucrose is 13 C. in is labeled
  • 13 C12-sucrose 13 C6- fructose - 13 C6- glucose
  • All carbon atoms have been labeled with 13 C. All of these were purchased from Cambridge Isotope Laboratories, Inc.
  • ZDF fatty ZDF fatty
  • FIG. 1 Shows a breath delta 13 C concentration in FIG.
  • the figure above shows the breath delta 13 C concentration after administration of 13 C6- sucrose (13 C6- fructose).
  • the Tmax of SD rats was 20 minutes, the Cmax was 88.4 ⁇ , the Tmax of ZDF fatty rats was 10 minutes, and the Cmax was 89.4 ⁇ . ..
  • the figure below shows the breath delta 13 C concentration after administration of 13 C6- sucrose (13 C6- glucose).
  • the Tmax of SD rats and ZDF fatty rats was 60 minutes in both groups, but the Cmax was 70.2 ⁇ and 40.7 ⁇ , respectively, and the exhalation response of ZDF fatty rats was significantly lower than that of SD rats. Therefore, breath delta 13 C concentration Tmax vicinity after administration of 13 C6- sucrose (13 C6- fructose) have been shown to be less susceptible to glucose tolerance.
  • the sucrase activity of the target sucrase-isomaltase complex can be measured more easily than the conventional method.
  • the measured values of sucrase activity thus obtained can be used for diagnosis of sucrase-related diseases such as sucrase / isomaltase deficiency.

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Abstract

対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法であって、１３Ｃ標識スクロースを経口投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出することを含み；１３Ｃ標識スクロースは、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていないものであり；被験試料が、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において当該割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである、方法を提供する。また、この方法を利用するスクラーゼ関連疾患の診断方法を提供する。

Description

スクラーゼ活性の測定方法およびスクラーゼ関連疾患の診断方法
　本特許出願は、日本国特許出願第２０２０－１０４４９３号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本開示は、対象におけるスクラーゼ活性の測定方法およびスクラーゼ関連疾患の診断方法に関する。
　スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症は、スクロースおよび／またはイソマルトースを小腸で分解して吸収することができず、砂糖や澱粉を摂取すると激しい下痢と腹部膨満をきたす先天性疾患である。スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症の原因として、スクラーゼ・イソマルターゼ遺伝子の変異が知られている。スクラーゼ・イソマルターゼ複合体は、小腸上皮の冊子縁（微絨毛）に発現する分解酵素であり、これによりスクロースはグルコースとフルクトースに、イソマルトースは２分子のグルコースに分解され、小腸上皮から吸収される。スクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性またはイソマルターゼ活性が変異によって損なわれると、それぞれスクロースまたはイソマルトースが単糖に分解されなくなる。その構造特性から、スクラーゼ活性が低下しやすく、イソマルターゼ活性は比較的保たれていることが多い。
　スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症の診断に関して、スクロース中の炭素原子が１３Ｃで標識された１３Ｃ－スクロースを被験者に摂取させ、呼気に排出される１３ＣＯ２の量を測定することにより、スクラーゼ活性を評価する方法が知られている（非特許文献１）。１３Ｃ－スクロースの摂取後に呼気に排出される１３ＣＯ２の量はスクラーゼ活性を反映するが、被験者のグルコース代謝能によっても影響を受けるため、この方法では、１３Ｃ－スクロースを用いる呼気試験とは別の日に１３Ｃ－グルコースを用いて呼気試験を行い、１３Ｃ－スクロースを用いる呼気試験の結果を補正する必要がある。
Antone R. Opekun et al., BioMed Research International, Volume 2016, Article ID 7952891
　本開示の目的の１つは、従来よりも簡便な、スクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法およびスクラーゼ関連疾患の診断方法を提供することである。
　本発明者らは、フルクトース部分で１３Ｃ標識されており、グルコース部分で１３Ｃ標識されていない１３Ｃ－スクロースを対象に経口投与し、その後採取された呼気中の１３Ｃ標識されたＣＯ２の量を測定することにより、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を従来法より簡便に測定できることを見いだした。
　従って、ある態様では、本開示は、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法であって、
　１３Ｃ標識スクロースを経口投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出することを含み、
　１３Ｃ標識スクロースは、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていないものであり、
　被験試料が、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において当該割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである、方法を提供する。
　ある態様では、本開示は、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための組成物を提供する。
　ある態様では、本開示は、スクラーゼ関連疾患の診断方法であって、
（１）上記の方法により、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定する工程、および、
（２）工程（１）で測定されたスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する工程、
を含む方法を提供する。
　ある態様では、本開示は、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、スクラーゼ関連疾患を診断するための組成物を提供する。
　本開示によると、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を、従来の方法よりも簡便に測定することができる。このようなスクラーゼ活性の評価は、スクラーゼ関連疾患の診断に有用な情報を提供し得る。
１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）および１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）の構造を示す。＊は１３Ｃ標識された炭素原子を示す。 １３Ｃ標識スクロースを経口投与したSprague-Dawley（ＳＤ）ラットの呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。 α-グリコシダーゼ阻害剤および１３Ｃ標識スクロースを経口投与したＳＤラットの呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。 １３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）（上）または１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）（下）を経口投与したＳＤラットおよびZucker Diabetic Fatty（ＺＤＦ ｆａｔｔｙ）ラットの呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間のすべての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
スクラーゼ活性の測定方法
　スクラーゼ・イソマルターゼ複合体は、スクロースをグルコースとフルクトースに分解するスクラーゼ活性と、イソマルトースを２分子のグルコースに分解するイソマルターゼ活性を有する。経口で摂取されたスクロースは、この分子のスクラーゼ活性により小腸で単糖に分解され、スクロース中の炭素原子は、最終的に二酸化炭素として呼気に排出される。従って、１３Ｃで標識されたスクロースを摂取した後の呼気に含まれる１３Ｃで標識された二酸化炭素の量は、スクラーゼ活性を反映する。
　対象は、ヒトであっても、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシおよびウマが例示される。
　対象は、健康であってもよく、代謝性疾患などの疾患に罹患しているか、または、罹患している疑いがあってもよい。代謝性疾患には、例えば、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害、薬剤性粘膜障害、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝、ウイルス性肝炎（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、アルコール性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、自己免疫性肝炎、肝硬変等の肝疾患、糖尿病、境界型糖尿病、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、肥満、脂質異常症、高血圧等が含まれ、特にスクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害または薬剤性粘膜障害である。感染に起因する粘膜障害の原因微生物には、ノロウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス等のウイルス、カンピロバクター、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌、ウェルシュ菌、ブドウ球菌、腸炎ビブリオ等の細菌が含まれる。薬剤性粘膜障害には、アスピリン、インドメタシン等の非ステロイド性抗炎症薬、メトトレキサート、５－ＦＵ、ドセタキセル等の化学療法剤、シスプラチン等の重金属製剤に起因するものが含まれる。
　対象は、１３Ｃ標識スクロースを投与する際に絶食状態であってもよく、非絶食状態であってもよい。１３Ｃ標識スクロースを投与する際に対象を絶食状態とする場合、対象に１３Ｃ標識スクロースを投与する少なくとも２時間以上前、好ましくは少なくとも４時間以上前、例えば試験の前日から、絶食であることが例示され、水分は摂取してもよい。１３Ｃ標識スクロースを投与する際に対象を非絶食状態とする場合は、通常食を通常通り摂取させればよい。
　本開示において、１３Ｃ標識スクロースは、それから糖代謝経路を経て生成されるＣＯ２の少なくとも一部が１３Ｃで標識されるように、フルクトース部分で１３Ｃ標識されており、グルコース部分で１３Ｃ標識されていないことを特徴とする。スクロースの構造を下記に示し、フルクトース部分の炭素原子を＊で示す。本開示における１３Ｃ標識スクロースは、＊で示す炭素原子の少なくとも１つが１３Ｃで標識されたものであり、複数またはすべての＊で示す炭素原子が１３Ｃで標識されていてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　スクロースを１３Ｃで標識する方法は、特に制限されず、通常使用される方法が広く採用される（佐々木、「５．１安定同位体の臨床診断への応用」：化学の領域107「安定同位体の医・薬学、生物学への応用」pp.149-163（1975）南江堂；梶原、RADIOISOTOPES，41，45-48（1992）等）。市販の１３Ｃ標識スクロースを使用してもよい。
　１３Ｃ標識スクロースは経口投与用の組成物の形態であり得る。組成物は、投与後、１３Ｃ標識スクロースが体内に吸収され、代謝され、１３Ｃ標識ＣＯ２が呼気に排出されるものであればよく、それを満たすものである限り、その形態、１３Ｃ標識スクロース以外の成分、各成分の配合割合、組成物の調製方法等は特に制限されない。
　例えば、組成物の形態は、液剤（シロップ剤を含む）、懸濁剤および乳剤などの液状形態；錠剤（裸剤、被覆剤を含む）、チュアブル錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤（粉末剤）、細粒剤および顆粒剤などの固形形態など、任意の経口投与形態を採用することができる。組成物は、製剤形態を有するものに限らず、上記１３Ｃ標識スクロースを含み、スクロース活性の測定を妨げないものであればよく、上記１３Ｃ標識スクロースを任意の食品素材と組み合わせて、固形食、流動食または液状食の形態としたものであってもよい。
　組成物は、実質的に１３Ｃ標識スクロースのみからなるものであってもよく、各製剤形態（投与形態）に応じて、通常当業界において用いられる薬学上許容される任意の担体および添加物を配合した形態であってもよい。
　この場合、配合する１３Ｃ標識スクロースの量は、特に制限されることなく、例えば、組成物１００重量％中１～９９重量％を挙げることができ、かかる範囲で適宜調整することができる。例えば、組成物に配合される１３Ｃ標識スクロースの量は、１回あたりの投与量が適当な範囲になるように、適宜調節し得る。
　組成物を、例えば錠剤、チュアブル錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤（粉末剤）、細粒剤、および顆粒剤などの固形形態に成形するに際しては、各種形態に応じて各種の担体または添加剤を用いることができる。
　担体または添加剤として、例えば乳糖、白糖、蔗糖、デキストリン、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、リン酸二水素カルシウム、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、デキストリン、プルラン等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖、蔗糖、カルメロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポピドン等の崩壊剤；白糖、蔗糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；ポリソルベート８０、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、蔗糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール、コロイド状ケイ酸、ショ糖脂肪酸類、硬化油等の滑沢剤；クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、無水リン酸一水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；酸化鉄、βカロテン、酸化チタン、食用色素、銅クロロフィル、リボフラビン等の着色剤；およびアスコルビン酸、塩化ナトリウム、各種甘味料等の矯味剤等を使用できる。
　錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。またカプセル剤は常法に従い、１３Ｃ標識スクロースを上記で例示した各種の担体と混合して硬化ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
　対象に投与される１３Ｃ標識スクロースの量は、適宜調節し得る。例えば、０．１～１０００ｍｇ／ｋｇ体重、０．２～５００ｍｇ／ｋｇ体重、１～１００ｍｇ／ｋｇ体重または５～５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与し得る。例えば、対象がヒト（成人）である場合、５ｍｇ／体～５０ｇ／体、１０ｍｇ／体～２５ｇ／体、５０ｍｇ／体～５ｇ／体または２５０ｍｇ／体～２．５ｇ／体、例えば５００ｍｇ／体の量で投与し得る。
　下記実施例により裏付けられる通り、グルコース代謝能が異なる集団において、１３Ｃ標識スクロースを投与した後、呼気に含まれる１３ＣＯ２量は、１３Ｃ標識スクロース投与の直後から一定期間は同等であり、その後、グルコース代謝能よって異なる速度で減少する。従って、当該一定期間中に採取した被験試料を用いることにより、対象のグルコース代謝能に拘わらず、スクラーゼ活性を測定することができる。
　本開示において、被験試料は、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである。健康な集団とは、代謝性疾患の兆候および／または症状が認められない集団、特に、スクラーゼ活性およびグルコース代謝能が正常であることが判っている集団を意味する。グルコース代謝能が低下した集団とは、スクラーゼ活性が正常であり、グルコース代謝能が低下していることが判っている集団を意味する。例えば、スクラーゼ活性が正常であることは、スクラーゼ・イソマルターゼ遺伝子に変異がないことにより確認し得る。グルコース代謝能は、既知の方法のいずれを使用して判定してもよく、例えば、血糖値が正常な範囲内にあれば、グルコース代謝能が正常であると判定し得、血糖値が正常な範囲内になければ、グルコース代謝能が低下していると判定し得る。
　当該期間は、健康な集団およびグルコース代謝能が低下した集団に１３Ｃ標識スクロースを経口投与し、経時的に呼気を採取し、各時点で呼気中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を算出し、集団間で当該割合が同等である期間を求めることにより、決定し得る。この期間は、対象の試験と並行して決定してもよく、予め定めてもよい。集団間で当該割合が「同等である」とは、健康な集団における当該割合の平均値に対して、グルコース代謝能が低下した集団における当該割合の平均値が、±約２０％以内、好ましくは±約１０％以内、特に好ましくは±約５％以内にあることを意味する。例えば、被験試料は、１３Ｃ標識スクロースの投与から、投与の約２０分後までのいずれかの時点で採取される。例えば、被験試料は、１３Ｃ標識スクロース投与の約５分後から約３０分後までのいずれかの時点、または、約１０分後から約２５分後までのいずれかの時点、例えば約２０分後に採取される。
　ある実施態様では、グルコース代謝能が異なる集団において、１３Ｃ標識スクロースを投与した後、呼気に含まれる１３ＣＯ２量は、１３Ｃ標識スクロース投与の直後から、１３ＣＯ２量が最大に達するまでは同等である。従って、１３Ｃ標識スクロースの投与から、呼気に含まれる１３ＣＯ２量が最大に達するまで、または、１３ＣＯ２量が最大に達する時点の近傍で採取した被験試料を用い得る。例えば、被験試料を採取する時点は、健康な集団において、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合が最大になる時点に基づいて決定される。当該割合が最大になる時点は、健康な集団に１３Ｃ標識スクロースを経口投与し、経時的に呼気を採取し、各時点で呼気中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を算出し、当該割合が最大に達する時点を求めることにより、決定し得る。例えば、健康な集団において１３Ｃ標識スクロースの経口投与から当該割合が最大に達する時点までの時間の平均値を求め、被験試料を採取する時点を決定し得る。
　例えば、被験試料は、１３Ｃ標識スクロースの投与から、健康な集団において当該割合が最大になる時点の１０分後までのいずれかの時点で採取される。例えば、被験試料は、１３Ｃ標識スクロースの投与から、健康な集団において当該割合が最大になる時点までのいずれかの時点で採取される。例えば、被験試料は、健康な集団において当該割合が最大になる時点で、または、その時点の近傍、例えば、その時点の約１０分前から約１０分後までの間に、その時点の約５分前から約５分後までの間に、もしくは、その時点の約３分前から約３分後までの間に、採取される。あるいは、対象から複数の被験試料を経時的に採取し、各被験試料について当該割合を算出し、当該割合のピーク値を対象のスクラーゼ活性の測定値としてもよい。
　被験試料、即ち、対象から排出された呼気は、従来公知の呼気試験の方法に基づいて採取し得る。呼気試料中に含まれる１３ＣＯ２、非標識ＣＯ２、総ＣＯ２の測定、分析は従来公知の手順に基づいて行えばよく、当業者に公知である。例えば、１３ＣＯ２の測定、分析は、通常、液体シンチレーションカウンター法、質量分析法、赤外分光分析法、発光分析法、磁気共鳴スペクトル法等の一般に使用される分析手法を用いて行うことができる。好ましくは、赤外分光分析法または質量分析法を用いる。
　被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を算出する手順は、従来公知の手順に従えばよく、例えば以下のように説明される（「１３Ｃ－呼気試験の実際　基礎と実践的応用　第８項：１３Ｃ－呼気試験データ解析法」、松林恒夫、松山渉、１３Ｃ医学応用研究会、ｐｐ．１０２－１１１参照）。
（１）δ１３Ｃ値（‰）
　同位体の存在比を表す場合、同一元素の中で最も組成比の高い元素を分母にした同位体比（Ｒ）を用いる。従って、炭素１３（１３Ｃ）のＲ値は、炭素１２（１２Ｃ）を分母とした次式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　Ｒは非常に小さい数値であるため、直接測定することは困難である。より正確に定量するため、質量分析計を用いる場合には、常に標準物質との比較が行われ、測定結果は、次式で定義されるδ値で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 　標準ガスとして、石灰石由来の炭酸ガス（ＰＤＢ）を使用する場合、ＲＳＴＤは、ＲＰＤＢ＝０．０１１２３７２である。
（２）Δ１３Ｃ値（‰）
　Δ１３Ｃ値（‰）は、下式で示すように、試薬投与前のδ１３Ｃ値（すなわち天然に存在する１３Ｃのδ値）をバックグラウンドとして、これを、試薬投与後のδ１３Ｃ値から差し引いた値（Δ１３Ｃ）を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
（３）呼気中の１３Ｃ濃度（％１３Ｃ：ａｔｏｍ％）
　呼気中の１３Ｃ濃度（％１３Ｃ：ａｔｏｍ％）は下式で定義される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　前記（１）で定義した相対値δ１３Ｃ値を、一般的な濃度の概念である総炭素中の１３Ｃ含量（％）の形に変換するには、下記の方法を用いることができる。
　まず、上記式の右辺の分母子を１２Ｃで割り、（式１）に基づいてＲに変換すると、下記の通りになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　このＲに、（式２）で求めたＲＳＡＭを代入して整理すると、次式となり、δ１３Ｃ値を用いて１３Ｃ濃度（％１３Ｃ）を表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
（４）１３Ｃ濃度の変化量（Δ％１３Ｃ）
　呼気中の１３Ｃ濃度（％１３Ｃ）の変化量（Δ％１３Ｃ）は、次式で定義されるように、試薬投与ｔ時間後の１３Ｃ濃度〔（％１３Ｃ）ｔ〕から試薬投与前０時間の１３Ｃ濃度〔（％１３Ｃ）０〕を差し引いて求められる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
（５）δ１３Ｃ値（‰）と１３Ｃ濃度変化量（Δ％１３Ｃ）との関係
　１３Ｃの天然存在比（Ｒ）は約０．０１１であり、標識試薬を投与した場合でも呼気中への増加量はわずかに＋０．００１～０．００２程度である。そこで、天然存在比Ｒ→０とみなすことができ、％１３ＣをＲで表した（式４）は、次式で近似することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　この近似式を用いて、まずδ１３Ｃの定義である（式２）よりＲＳＡＭを求めて上記式のＲに代入して整理すると、１３Ｃ濃度を求める近似（式７）が得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
　これを（式６）に代入すると、下式（式８）に示すように、Δ１３ＣからΔ％１３Ｃを算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
　本開示の方法では、採取した呼気に含まれる二酸化炭素の存在比（非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合）を、下記の方法に従って１３Ｃ濃度の変化量（Δ％１３Ｃ）として算出し得る。
　具体的には、下式に従って、対象に１３Ｃ標識スクロース投与した後の任意の時点ｔに採取された呼気に含まれる総炭素中の１３Ｃ濃度（呼気中の１３Ｃ濃度、１３Ｃ濃度ａｔｏｍ％、（％１３Ｃ）ｔ）を求める。同様に、１３Ｃ標識スクロースの対象への投与前に予め採取された呼気、好ましくは投与前０時間に採取された呼気に含まれる総炭素中の１３Ｃ濃度（呼気中の１３Ｃ濃度、１３Ｃ濃度ａｔｏｍ％、（％１３Ｃ）０）を求める。更に、上記式６に従って、（％１３Ｃ）ｔから（％１３Ｃ）０を差し引いて、１３Ｃ濃度の変化量（Δ％１３Ｃ（ａｔｏｍ％））を求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
　なお、必要に応じて前記１３Ｃ濃度の変化量（Δ％１３Ｃ）は、上記式５および式３に基づいて、Δ１３Ｃ（‰）（δ１３Ｃ値変化量（‰）またはＤＯＢ（‰））に換算してもよい。
　また、呼気に含まれる非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合は、Δ％１３ＣまたはΔ１３Ｃ（‰）の経時的変化を示すグラフにおける曲線下面積（Area under the curve；ＡＵＣｔ）として算出してもよい。曲線下面積の算出は、従来公知の算出方法に従って行えばよく、当業者であれば容易に理解できる。例えば、縦軸をΔ％１３ＣまたはΔ１３Ｃ（‰）とし、横軸を１３Ｃ標識グルコース投与後の経過時間とした、Δ％１３ＣまたはΔ１３Ｃ（‰）の経時的変化を示すグラフにおいて、その曲線下面積を算出する。例えば、縦軸をΔ％１３ＣまたはΔ１３Ｃ（‰）とし、１３Ｃ標識スクロースの投与からｔ時間後までの曲線下面積を、ＡＵＣｔ－０と表すことができる。また、縦軸をΔ％１３ＣまたはΔ１３Ｃ（‰）とし、１３Ｃ標識スクロース投与のｔ１時間後からｔ２時間後までの曲線下面積を、ＡＵＣｔ２－ｔ１と表すことができる。
　かくして算出された被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定値とし得る。
　ある態様では、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法であって、
（１）フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを、対象に経口投与する工程、
（２）対象から排出された呼気を採取し、被験試料とする工程、ここで、被験試料は、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである；および、
（３）被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出する工程、
を含む方法が提供される。
　ある態様では、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための組成物が提供される。
　ある態様では、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースが提供される。
　ある態様では、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための組成物を製造するための、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースの使用が提供される。
スクラーゼ関連疾患の診断方法
　ある態様では、上記のスクラーゼ活性の測定方法を利用して、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する方法が提供される。当該方法は、
（１）上記の方法により、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定する工程；および、
（２）工程（１）で測定されたスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する工程、
を含む。当該方法を、スクラーゼ関連疾患の診断を補助する方法とすることもできる。
　「スクラーゼ関連疾患」は、スクラーゼ活性の欠損または低下に起因する疾患を意味する。スクラーゼ関連疾患の例には、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害および薬剤性粘膜障害が含まれる。粘膜障害の詳細は上記の通りである。
　「スクラーゼ関連疾患の診断」には、対象がスクラーゼ関連疾患に羅患しているか否かを判定すること、対象におけるスクラーゼ関連疾患の悪化または改善を判定すること、対象におけるスクラーゼ関連疾患の治療の効果を判定すること、あるいは、対象のスクラーゼ関連疾患の重症度を判定することが含まれる。
　工程（１）は、上記のスクラーゼ活性の測定方法に準じて実施し得る。工程（２）では、工程（１）で算出したスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する。指標値は、健康な集団について、対象と同等の条件下で工程（１）を実施し、測定されたスクラーゼ活性から得られる値であり得る。例えば、健康な集団において測定されたスクラーゼ活性の平均値を求め、指標値を決定し得る。指標値は、対象におけるスクラーゼ活性（被験値）の測定と同時に、並行して、またはその前もしくは後に、健康な集団について測定したスクラーゼ活性に基づく値であってもよく、予め定めた値であってもよい。被験値が指標値よりも低い場合に、対象がスクラーゼ関連疾患に罹患していると診断し得、指標値と同等であるかそれよりも高い場合に、対象がスクラーゼ関連疾患に罹患していないと診断し得る。また、指標値に対する被験値の高低の程度に基づいて、スクラーゼ関連疾患の重症度をさらに知ることができる。
　あるいは、指標値は、対象において以前に同等の条件下で工程（１）に従って測定されたスクラーゼ活性であってもよい。この場合、被験値が指標値よりも低い場合に、対象のスクラーゼ関連疾患が悪化したと判定し得、指標値よりも高い場合に、対象のスクラーゼ関連疾患が改善されたと判定し得る。
　ある態様では、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する方法であって、
（１）フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを、対象に経口投与する工程；
（２）対象から排出された呼気を採取し、被験試料とする工程、ここで、被験試料は、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである；
（３）被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出する工程；および、
（４）工程（３）で測定されたスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する工程、
を含む方法が提供される。
　ある態様では、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、対象のスクラーゼ関連疾患を診断するための組成物が提供される。
　ある態様では、対象のスクラーゼ関連疾患を診断するための、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースが提供される。
　ある態様では、対象のスクラーゼ関連疾患を診断するための組成物を製造するための、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースの使用が提供される。
　例えば、本開示は下記の実施態様を提供する。
［１］対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法であって、
　１３Ｃ標識スクロースを経口投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出することを含み、
　１３Ｃ標識スクロースは、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていないものであり、
　被験試料が、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において当該割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである、方法。
［２］被験試料が、健康な集団において当該割合が最大になる時点に基づいて決定された時点で採取されたものである、第１項に記載の方法。
［３］被験試料が、１３Ｃ標識スクロースの投与から、健康な集団において当該割合が最大になる時点の１０分後までのいずれかの時点で採取されたものである、第１項または第２項に記載の方法。
［４］被験試料が、１３Ｃ標識スクロースの投与から、健康な集団において当該割合が最大になる時点までの間のいずれかの時点で採取されたものである、第１項～第３項のいずれかに記載の方法。
［５］被験試料が、健康な集団において当該割合が最大になる時点の近傍で採取されたものである、第１項または第２項に記載の方法。
［６］被験試料が、健康な集団において当該割合が最大になる時点で採取されたものである、第１項～第５項のいずれかに記載の方法。
［７］対象から複数の時点で排出された呼気を被験試料とし、各被験試料について当該割合を算出し、当該割合のピーク値をスクラーゼ活性の測定値とする、第１項または第２項に記載の方法。
［８］被験試料が、１３Ｃ標識スクロースの投与から、投与の約２０分後までのいずれかの時点で採取されたものである、第１項または第２項に記載の方法。
［９］対象が絶食状態である、第１項～第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］対象が非絶食状態である、第１項～第８項のいずれかに記載の方法。
［１１］対象が代謝性疾患に罹患しているか、罹患している疑いがある、第１項～第１０項のいずれかに記載の方法。
［１２］代謝性疾患が、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害、薬剤性粘膜障害、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、脂肪肝、ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、自己免疫性肝炎、肝疾患、糖尿病、境界型糖尿病、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、肥満、脂質異常症または高血圧である、第１１項に記載の方法。
［１３］代謝性疾患が、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害または薬剤性粘膜障害である、第１１項または第１２項に記載の方法。
［１４］対象がヒトである、第１項～第１３項のいずれかに記載の方法。
［１５］１３Ｃ標識スクロースが、フルクトース部分のすべての炭素原子が１３Ｃ標識されているものである、第１項～第１４項のいずれかに記載の方法。
［１６］フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための組成物。
［１７］１３Ｃ標識スクロースが、フルクトース部分のすべての炭素原子が１３Ｃ標識されているものである、第１６項に記載の組成物。
［１８］スクラーゼ関連疾患の診断方法であって、
（１）第１項～第１５項のいずれかに記載の方法により、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定する工程、および、
（２）工程（１）で測定されたスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する工程、
を含む方法。
［１９］指標値が、健康な集団において、第１項～第１５項のいずれかに記載の方法に従って測定されたスクラーゼ活性から得られる値である、第１８項に記載の方法。
［２０］被験値が指標値よりも低い場合に、対象がスクラーゼ関連疾患に罹患していると診断し、指標値と同等であるかそれよりも高い場合に、対象がスクラーゼ関連疾患に罹患していないと診断する、第１８項または第１９項に記載の方法。
［２１］スクラーゼ関連疾患が、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害または薬剤性粘膜障害である、第１８項～第２０項のいずれかに記載の方法。
［２２］スクラーゼ関連疾患がスクラーゼ・イソマルターゼ欠損症である、第１８項～第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、スクラーゼ関連疾患を診断するための組成物。
［２４］１３Ｃ標識スクロースが、フルクトース部分のすべての炭素原子が１３Ｃ標識されているものである、第２３項に記載の組成物。
　本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、発明を説明するためだけに供されるものである。
１３ Ｃ標識スクロース
　図１に示す３種類の１３Ｃ標識スクロースを実施例で使用した。１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）は、スクロースのフルクトース部分の炭素原子が１３Ｃで標識されており、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）は、スクロースのグルコース部分の炭素原子が１３Ｃで標識されており、１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）は、すべての炭素原子が１３Ｃで標識されている。これらはすべて Cambridge Isotope Laboratories, Inc.から購入した。
実施例１：
　１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）および１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）１０ｍｇ／４ｍＬ／ｋｇを、前日より絶食した Sprague-Dawley（ＳＤ）ラット（健常モデル、ｎ＝６）に経口投与し呼気を採取した。Gas Chromatography Mass Spectrometry（GC/MS）を用いて呼気中Δ１３Ｃを測定した。
　図２に呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）および１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）のＴｍａｘ／Ｃｍａｘは、それぞれ、２０分／８８．４‰、６０分／６８．５‰および４０分／１１８．４‰であった。１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）および１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）に比べ、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）のＴｍａｘが早いことが示された。
実施例２：
　前日より絶食したＳＤラット（ｎ＝６）にα－グルコシダーゼ阻害剤としてアカルボース（１０ｍｇ／４ｍＬ／ｋｇ）を経口ゾンデを用い経口投与した。３０分後に１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）１０ｍｇ／４ｍＬ／ｋｇを経口投与し呼気を採取した。なお、対照（Control）群（ｎ＝６）はアカルボースの代わりに生理食塩水を４ｍＬ／ｋｇ経口投与した。ＧＣ／ＭＳを用いて呼気中Δ１３Ｃを測定した。
　図３に呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。α-グリコシダーゼ阻害剤を前処理することで、１３ＣＯ２は呼気に排出されなくなった。そのことにより、１３Ｃ標識スクロースの投与後の呼気中Δ１３Ｃ濃度でスクラーゼ活性をモニターできることが確認された。
実施例３：
　１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）または１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）１０ｍｇ／４ｍＬ／ｋｇを前日より絶食したＳＤラット（ｎ＝６）および Zucker Diabetic Fatty（ＺＤＦ ｆａｔｔｙ）ラット（糖尿病モデル、ｎ＝６）に経口投与し、呼気を採取した。ＧＣ／ＭＳを用いて呼気中Δ１３Ｃを測定した。
　図４に呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。上図は、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）を投与した後の呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。ＳＤラットのＴｍａｘは２０分、Ｃｍａｘは８８．４‰、ＺＤＦ ｆａｔｔｙ ラットのＴｍａｘは１０分、Ｃｍａｘは８９．４‰であり、Ｔｍａｘ近傍では両群間の呼気反応に大きな差は認められなかった。下図は、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）を投与した後の呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。ＳＤラット及びＺＤＦ ｆａｔｔｙ ラットのＴｍａｘに関しては両群ともに６０分であったが、Ｃｍａｘはそれぞれ７０．２‰、４０．７‰で、ＺＤＦ ｆａｔｔｙ ラットの呼気反応がＳＤラットに比べ有意に低かった。従って、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）を投与した後のＴｍａｘ近傍の呼気中Δ１３Ｃ濃度は、耐糖能の影響を受けにくいことが示された。
　本開示により、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を、従来の方法よりも簡便に測定することができる。かくして得られるスクラーゼ活性の測定値は、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症などのスクラーゼ関連疾患の診断に利用できる。

Claims (15)

  1. 　対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法であって、
    　１３Ｃ標識スクロースを経口投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出することを含み、
    　１３Ｃ標識スクロースは、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていないものであり、
    　被験試料が、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において当該割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである、方法。
  2. 　被験試料が、健康な集団において当該割合が最大になる時点に基づいて決定された時点で採取されたものである、請求項１に記載の方法。
  3. 　被験試料が、１３Ｃ標識スクロースの投与から、健康な集団において当該割合が最大になる時点の１０分後までのいずれかの時点で採取されたものである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　被験試料が、健康な集団において当該割合が最大になる時点の近傍で採取されたものである、請求項１または２に記載の方法。
  5. 　対象から複数の時点で排出された呼気を被験試料とし、各被験試料について当該割合を算出し、当該割合のピーク値をスクラーゼ活性の測定値とする、請求項１または２に記載の方法。
  6. 　被験試料が、１３Ｃ標識スクロースの投与から、投与の約２０分後までのいずれかの時点で採取されたものである、請求項１または２に記載の方法。
  7. 　対象が代謝性疾患に罹患しているか、罹患している疑いがある、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　代謝性疾患が、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害または薬剤性粘膜障害である、請求項７に記載の方法。
  9. 　１３Ｃ標識スクロースが、フルクトース部分のすべての炭素原子が１３Ｃ標識されているものである、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための組成物。
  11. 　スクラーゼ関連疾患の診断方法であって、
    （１）請求項１～９のいずれかに記載の方法により、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定する工程；および
    （２）工程（１）で測定されたスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する工程、
    を含む方法。
  12. 　指標値が、健康な集団において、請求項１～９のいずれかに記載の方法に従って測定されたスクラーゼ活性から得られる値である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　スクラーゼ関連疾患がスクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害または薬剤性粘膜障害である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 　スクラーゼ関連疾患がスクラーゼ・イソマルターゼ欠損症である、請求項１１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 　フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、スクラーゼ関連疾患を診断するための組成物。
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