JP2023110107A - スクラーゼ活性の測定方法およびスクラーゼ関連疾患の診断方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】本開示の目的の１つは、従来法よりも簡便なスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法およびスクラーゼ関連疾患の診断方法を提供することである。【解決手段】対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法であって、１３Ｃ標識スクロースを経口投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出することを含み；１３Ｃ標識スクロースは、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていないものであり；被験試料が、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において当該割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである、方法を提供する。また、この方法を利用するスクラーゼ関連疾患の診断方法を提供する。【選択図】図４

Description

本開示は、対象におけるスクラーゼ活性の測定方法およびスクラーゼ関連疾患の診断方法に関する。
スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症は、スクロースおよび／またはイソマルトースを小腸で分解して吸収することができず、砂糖や澱粉を摂取すると激しい下痢と腹部膨満をきたす先天性疾患である。スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症の原因として、スクラーゼ・イソマルターゼ遺伝子の変異が知られている。スクラーゼ・イソマルターゼ複合体は、小腸上皮の冊子縁（微絨毛）に発現する分解酵素であり、これによりスクロースはグルコースとフルクトースに、イソマルトースは２分子のグルコースに分解され、小腸上皮から吸収される。スクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性またはイソマルターゼ活性が変異によって損なわれると、それぞれスクロースまたはイソマルトースが単糖に分解されなくなる。その構造特性から、スクラーゼ活性が低下しやすく、イソマルターゼ活性は比較的保たれていることが多い。
スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症の診断に関して、スクロース中の炭素原子が１３Ｃで標識された１３Ｃ－スクロースを被験者に摂取させ、呼気に排出される１３ＣＯ２の量を測定することにより、スクラーゼ活性を評価する方法が知られている（非特許文献１）。１３Ｃ－スクロースの摂取後に呼気に排出される１３ＣＯ２の量はスクラーゼ活性を反映するが、被験者のグルコース代謝能によっても影響を受けるため、この方法では、１３Ｃ－スクロースを用いる呼気試験とは別の日に１３Ｃ－グルコースを用いて呼気試験を行い、１３Ｃ－スクロースを用いる呼気試験の結果を補正する必要がある。
Antone R. Opekun et al., BioMed Research International, Volume 2016, Article ID 7952891
本開示の目的の１つは、従来よりも簡便な、スクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法およびスクラーゼ関連疾患の診断方法を提供することである。
本発明者らは、フルクトース部分で１３Ｃ標識されており、グルコース部分で１３Ｃ標識されていない１３Ｃ－スクロースを対象に経口投与し、その後採取された呼気中の１３Ｃ標識されたＣＯ２の量を測定することにより、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を従来法より簡便に測定できることを見いだした。
従って、ある態様では、本開示は、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法であって、
１３Ｃ標識スクロースを経口投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出することを含み、
１３Ｃ標識スクロースは、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていないものであり、
被験試料が、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において当該割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである、方法を提供する。
ある態様では、本開示は、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための組成物を提供する。
ある態様では、本開示は、スクラーゼ関連疾患の診断方法であって、
（１）上記の方法により、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定する工程、および、
（２）工程（１）で測定されたスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する工程、
を含む方法を提供する。
ある態様では、本開示は、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、スクラーゼ関連疾患を診断するための組成物を提供する。
本開示によると、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を、従来の方法よりも簡便に測定することができる。このようなスクラーゼ活性の評価は、スクラーゼ関連疾患の診断に有用な情報を提供し得る。
１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）および１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）の構造を示す。＊は１３Ｃ標識された炭素原子を示す。 １３Ｃ標識スクロースを経口投与したSprague-Dawley（ＳＤ）ラットの呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。 α-グリコシダーゼ阻害剤および１３Ｃ標識スクロースを経口投与したＳＤラットの呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。 １３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）（上）または１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）（下）を経口投与したＳＤラットおよびZucker Diabetic Fatty（ＺＤＦ ｆａｔｔｙ）ラットの呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間のすべての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
スクラーゼ活性の測定方法
スクラーゼ・イソマルターゼ複合体は、スクロースをグルコースとフルクトースに分解するスクラーゼ活性と、イソマルトースを２分子のグルコースに分解するイソマルターゼ活性を有する。経口で摂取されたスクロースは、この分子のスクラーゼ活性により小腸で単糖に分解され、スクロース中の炭素原子は、最終的に二酸化炭素として呼気に排出される。従って、１３Ｃで標識されたスクロースを摂取した後の呼気に含まれる１３Ｃで標識された二酸化炭素の量は、スクラーゼ活性を反映する。
対象は、ヒトであっても、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシおよびウマが例示される。
対象は、健康であってもよく、代謝性疾患などの疾患に罹患しているか、または、罹患している疑いがあってもよい。代謝性疾患には、例えば、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害、薬剤性粘膜障害、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝、ウイルス性肝炎（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、アルコール性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、自己免疫性肝炎、肝硬変等の肝疾患、糖尿病、境界型糖尿病、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、肥満、脂質異常症、高血圧等が含まれ、特にスクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害または薬剤性粘膜障害である。感染に起因する粘膜障害の原因微生物には、ノロウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス等のウイルス、カンピロバクター、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌、ウェルシュ菌、ブドウ球菌、腸炎ビブリオ等の細菌が含まれる。薬剤性粘膜障害には、アスピリン、インドメタシン等の非ステロイド性抗炎症薬、メトトレキサート、５－ＦＵ、ドセタキセル等の化学療法剤、シスプラチン等の重金属製剤に起因するものが含まれる。
対象は、１３Ｃ標識スクロースを投与する際に絶食状態であってもよく、非絶食状態であってもよい。１３Ｃ標識スクロースを投与する際に対象を絶食状態とする場合、対象に１３Ｃ標識スクロースを投与する少なくとも２時間以上前、好ましくは少なくとも４時間以上前、例えば試験の前日から、絶食であることが例示され、水分は摂取してもよい。１３Ｃ標識スクロースを投与する際に対象を非絶食状態とする場合は、通常食を通常通り摂取させればよい。
本開示において、１３Ｃ標識スクロースは、それから糖代謝経路を経て生成されるＣＯ２の少なくとも一部が１３Ｃで標識されるように、フルクトース部分で１３Ｃ標識されており、グルコース部分で１３Ｃ標識されていないことを特徴とする。スクロースの構造を下記に示し、フルクトース部分の炭素原子を＊で示す。本開示における１３Ｃ標識スクロースは、＊で示す炭素原子の少なくとも１つが１３Ｃで標識されたものであり、複数またはすべての＊で示す炭素原子が１３Ｃで標識されていてもよい。
Figure 2023110107000002
スクロースを１３Ｃで標識する方法は、特に制限されず、通常使用される方法が広く採用される（佐々木、「５．１安定同位体の臨床診断への応用」：化学の領域107「安定同位体の医・薬学、生物学への応用」pp.149-163（1975）南江堂；梶原、RADIOISOTOPES，41，45-48（1992）等）。市販の１３Ｃ標識スクロースを使用してもよい。
１３Ｃ標識スクロースは経口投与用の組成物の形態であり得る。組成物は、投与後、１３Ｃ標識スクロースが体内に吸収され、代謝され、１３Ｃ標識ＣＯ２が呼気に排出されるものであればよく、それを満たすものである限り、その形態、１３Ｃ標識スクロース以外の成分、各成分の配合割合、組成物の調製方法等は特に制限されない。
例えば、組成物の形態は、液剤（シロップ剤を含む）、懸濁剤および乳剤などの液状形態；錠剤（裸剤、被覆剤を含む）、チュアブル錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤（粉末剤）、細粒剤および顆粒剤などの固形形態など、任意の経口投与形態を採用することができる。組成物は、製剤形態を有するものに限らず、上記１３Ｃ標識スクロースを含み、スクロース活性の測定を妨げないものであればよく、上記１３Ｃ標識スクロースを任意の食品素材と組み合わせて、固形食、流動食または液状食の形態としたものであってもよい。
組成物は、実質的に１３Ｃ標識スクロースのみからなるものであってもよく、各製剤形態（投与形態）に応じて、通常当業界において用いられる薬学上許容される任意の担体および添加物を配合した形態であってもよい。
この場合、配合する１３Ｃ標識スクロースの量は、特に制限されることなく、例えば、組成物１００重量％中１～９９重量％を挙げることができ、かかる範囲で適宜調整することができる。例えば、組成物に配合される１３Ｃ標識スクロースの量は、１回あたりの投与量が適当な範囲になるように、適宜調節し得る。
組成物を、例えば錠剤、チュアブル錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤（粉末剤）、細粒剤、および顆粒剤などの固形形態に成形するに際しては、各種形態に応じて各種の担体または添加剤を用いることができる。
担体または添加剤として、例えば乳糖、白糖、蔗糖、デキストリン、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、リン酸二水素カルシウム、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、デキストリン、プルラン等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖、蔗糖、カルメロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポピドン等の崩壊剤；白糖、蔗糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；ポリソルベート８０、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、蔗糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール、コロイド状ケイ酸、ショ糖脂肪酸類、硬化油等の滑沢剤；クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、無水リン酸一水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；酸化鉄、βカロテン、酸化チタン、食用色素、銅クロロフィル、リボフラビン等の着色剤；およびアスコルビン酸、塩化ナトリウム、各種甘味料等の矯味剤等を使用できる。
錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。またカプセル剤は常法に従い、１３Ｃ標識スクロースを上記で例示した各種の担体と混合して硬化ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
対象に投与される１３Ｃ標識スクロースの量は、適宜調節し得る。例えば、０．１～１０００ｍｇ／ｋｇ体重、０．２～５００ｍｇ／ｋｇ体重、１～１００ｍｇ／ｋｇ体重または５～５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与し得る。例えば、対象がヒト（成人）である場合、５ｍｇ／体～５０ｇ／体、１０ｍｇ／体～２５ｇ／体、５０ｍｇ／体～５ｇ／体または２５０ｍｇ／体～２．５ｇ／体、例えば５００ｍｇ／体の量で投与し得る。
下記実施例により裏付けられる通り、グルコース代謝能が異なる集団において、１３Ｃ標識スクロースを投与した後、呼気に含まれる１３ＣＯ２量は、１３Ｃ標識スクロース投与の直後から一定期間は同等であり、その後、グルコース代謝能よって異なる速度で減少する。従って、当該一定期間中に採取した被験試料を用いることにより、対象のグルコース代謝能に拘わらず、スクラーゼ活性を測定することができる。
本開示において、被験試料は、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである。健康な集団とは、代謝性疾患の兆候および／または症状が認められない集団、特に、スクラーゼ活性およびグルコース代謝能が正常であることが判っている集団を意味する。グルコース代謝能が低下した集団とは、スクラーゼ活性が正常であり、グルコース代謝能が低下していることが判っている集団を意味する。例えば、スクラーゼ活性が正常であることは、スクラーゼ・イソマルターゼ遺伝子に変異がないことにより確認し得る。グルコース代謝能は、既知の方法のいずれを使用して判定してもよく、例えば、血糖値が正常な範囲内にあれば、グルコース代謝能が正常であると判定し得、血糖値が正常な範囲内になければ、グルコース代謝能が低下していると判定し得る。
当該期間は、健康な集団およびグルコース代謝能が低下した集団に１３Ｃ標識スクロースを経口投与し、経時的に呼気を採取し、各時点で呼気中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を算出し、集団間で当該割合が同等である期間を求めることにより、決定し得る。この期間は、対象の試験と並行して決定してもよく、予め定めてもよい。集団間で当該割合が「同等である」とは、健康な集団における当該割合の平均値に対して、グルコース代謝能が低下した集団における当該割合の平均値が、±約２０％以内、好ましくは±約１０％以内、特に好ましくは±約５％以内にあることを意味する。例えば、被験試料は、１３Ｃ標識スクロースの投与から、投与の約２０分後までのいずれかの時点で採取される。例えば、被験試料は、１３Ｃ標識スクロース投与の約５分後から約３０分後までのいずれかの時点、または、約１０分後から約２５分後までのいずれかの時点、例えば約２０分後に採取される。
ある実施態様では、グルコース代謝能が異なる集団において、１３Ｃ標識スクロースを投与した後、呼気に含まれる１３ＣＯ２量は、１３Ｃ標識スクロース投与の直後から、１３ＣＯ２量が最大に達するまでは同等である。従って、１３Ｃ標識スクロースの投与から、呼気に含まれる１３ＣＯ２量が最大に達するまで、または、１３ＣＯ２量が最大に達する時点の近傍で採取した被験試料を用い得る。例えば、被験試料を採取する時点は、健康な集団において、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合が最大になる時点に基づいて決定される。当該割合が最大になる時点は、健康な集団に１３Ｃ標識スクロースを経口投与し、経時的に呼気を採取し、各時点で呼気中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を算出し、当該割合が最大に達する時点を求めることにより、決定し得る。例えば、健康な集団において１３Ｃ標識スクロースの経口投与から当該割合が最大に達する時点までの時間の平均値を求め、被験試料を採取する時点を決定し得る。
例えば、被験試料は、１３Ｃ標識スクロースの投与から、健康な集団において当該割合が最大になる時点の１０分後までのいずれかの時点で採取される。例えば、被験試料は、１３Ｃ標識スクロースの投与から、健康な集団において当該割合が最大になる時点までのいずれかの時点で採取される。例えば、被験試料は、健康な集団において当該割合が最大になる時点で、または、その時点の近傍、例えば、その時点の約１０分前から約１０分後までの間に、その時点の約５分前から約５分後までの間に、もしくは、その時点の約３分前から約３分後までの間に、採取される。あるいは、対象から複数の被験試料を経時的に採取し、各被験試料について当該割合を算出し、当該割合のピーク値を対象のスクラーゼ活性の測定値としてもよい。
被験試料、即ち、対象から排出された呼気は、従来公知の呼気試験の方法に基づいて採取し得る。呼気試料中に含まれる１３ＣＯ２、非標識ＣＯ２、総ＣＯ２の測定、分析は従来公知の手順に基づいて行えばよく、当業者に公知である。例えば、１３ＣＯ２の測定、分析は、通常、液体シンチレーションカウンター法、質量分析法、赤外分光分析法、発光分析法、磁気共鳴スペクトル法等の一般に使用される分析手法を用いて行うことができる。好ましくは、赤外分光分析法または質量分析法を用いる。
被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を算出する手順は、従来公知の手順に従えばよく、例えば以下のように説明される（「１３Ｃ－呼気試験の実際 基礎と実践的応用 第８項：１３Ｃ－呼気試験データ解析法」、松林恒夫、松山渉、１３Ｃ医学応用研究会、ｐｐ．１０２－１１１参照）。
（１）δ１３Ｃ値（‰）
同位体の存在比を表す場合、同一元素の中で最も組成比の高い元素を分母にした同位体比（Ｒ）を用いる。従って、炭素１３（１３Ｃ）のＲ値は、炭素１２（１２Ｃ）を分母とした次式で表される。
Figure 2023110107000003
Ｒは非常に小さい数値であるため、直接測定することは困難である。より正確に定量するため、質量分析計を用いる場合には、常に標準物質との比較が行われ、測定結果は、次式で定義されるδ値で表される。
Figure 2023110107000004
 標準ガスとして、石灰石由来の炭酸ガス（ＰＤＢ）を使用する場合、ＲＳＴＤは、ＲＰＤＢ＝０．０１１２３７２である。
（２）Δ１３Ｃ値（‰）
Δ１３Ｃ値（‰）は、下式で示すように、試薬投与前のδ１３Ｃ値（すなわち天然に存在する１３Ｃのδ値）をバックグラウンドとして、これを、試薬投与後のδ１３Ｃ値から差し引いた値（Δ１３Ｃ）を意味する。
Figure 2023110107000005
（３）呼気中の１３Ｃ濃度（％１３Ｃ：ａｔｏｍ％）
呼気中の１３Ｃ濃度（％１３Ｃ：ａｔｏｍ％）は下式で定義される。
Figure 2023110107000006
前記（１）で定義した相対値δ１３Ｃ値を、一般的な濃度の概念である総炭素中の１３Ｃ含量（％）の形に変換するには、下記の方法を用いることができる。
まず、上記式の右辺の分母子を１２Ｃで割り、（式１）に基づいてＲに変換すると、下記の通りになる。
Figure 2023110107000007
このＲに、（式２）で求めたＲＳＡＭを代入して整理すると、次式となり、δ１３Ｃ値を用いて１３Ｃ濃度（％１３Ｃ）を表すことができる。
Figure 2023110107000008
（４）１３Ｃ濃度の変化量（Δ％１３Ｃ）
呼気中の１３Ｃ濃度（％１３Ｃ）の変化量（Δ％１３Ｃ）は、次式で定義されるように、試薬投与ｔ時間後の１３Ｃ濃度〔（％１３Ｃ）ｔ〕から試薬投与前０時間の１３Ｃ濃度〔（％１３Ｃ）０〕を差し引いて求められる。
Figure 2023110107000009
（５）δ１３Ｃ値（‰）と１３Ｃ濃度変化量（Δ％１３Ｃ）との関係
１３Ｃの天然存在比（Ｒ）は約０．０１１であり、標識試薬を投与した場合でも呼気中への増加量はわずかに＋０．００１～０．００２程度である。そこで、天然存在比Ｒ→０とみなすことができ、％１３ＣをＲで表した（式４）は、次式で近似することができる。
Figure 2023110107000010
この近似式を用いて、まずδ１３Ｃの定義である（式２）よりＲＳＡＭを求めて上記式のＲに代入して整理すると、１３Ｃ濃度を求める近似（式７）が得られる。
Figure 2023110107000011
これを（式６）に代入すると、下式（式８）に示すように、Δ１３ＣからΔ％１３Ｃを算出することができる。
Figure 2023110107000012
本開示の方法では、採取した呼気に含まれる二酸化炭素の存在比（非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合）を、下記の方法に従って１３Ｃ濃度の変化量（Δ％１３Ｃ）として算出し得る。
具体的には、下式に従って、対象に１３Ｃ標識スクロース投与した後の任意の時点ｔに採取された呼気に含まれる総炭素中の１３Ｃ濃度（呼気中の１３Ｃ濃度、１３Ｃ濃度ａｔｏｍ％、（％１３Ｃ）ｔ）を求める。同様に、１３Ｃ標識スクロースの対象への投与前に予め採取された呼気、好ましくは投与前０時間に採取された呼気に含まれる総炭素中の１３Ｃ濃度（呼気中の１３Ｃ濃度、１３Ｃ濃度ａｔｏｍ％、（％１３Ｃ）０）を求める。更に、上記式６に従って、（％１３Ｃ）ｔから（％１３Ｃ）０を差し引いて、１３Ｃ濃度の変化量（Δ％１３Ｃ（ａｔｏｍ％））を求める。
Figure 2023110107000013
なお、必要に応じて前記１３Ｃ濃度の変化量（Δ％１３Ｃ）は、上記式５および式３に基づいて、Δ１３Ｃ（‰）（δ１３Ｃ値変化量（‰）またはＤＯＢ（‰））に換算してもよい。
また、呼気に含まれる非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合は、Δ％１３ＣまたはΔ１３Ｃ（‰）の経時的変化を示すグラフにおける曲線下面積（Area under the curve；ＡＵＣｔ）として算出してもよい。曲線下面積の算出は、従来公知の算出方法に従って行えばよく、当業者であれば容易に理解できる。例えば、縦軸をΔ％１３ＣまたはΔ１３Ｃ（‰）とし、横軸を１３Ｃ標識グルコース投与後の経過時間とした、Δ％１３ＣまたはΔ１３Ｃ（‰）の経時的変化を示すグラフにおいて、その曲線下面積を算出する。例えば、縦軸をΔ％１３ＣまたはΔ１３Ｃ（‰）とし、１３Ｃ標識スクロースの投与からｔ時間後までの曲線下面積を、ＡＵＣｔ－０と表すことができる。また、縦軸をΔ％１３ＣまたはΔ１３Ｃ（‰）とし、１３Ｃ標識スクロース投与のｔ１時間後からｔ２時間後までの曲線下面積を、ＡＵＣｔ２－ｔ１と表すことができる。
かくして算出された被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定値とし得る。
ある態様では、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法であって、
（１）フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを、対象に経口投与する工程、
（２）対象から排出された呼気を採取し、被験試料とする工程、ここで、被験試料は、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである；および、
（３）被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出する工程、
を含む方法が提供される。
ある態様では、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための組成物が提供される。
ある態様では、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースが提供される。
ある態様では、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための組成物を製造するための、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースの使用が提供される。
スクラーゼ関連疾患の診断方法
ある態様では、上記のスクラーゼ活性の測定方法を利用して、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する方法が提供される。当該方法は、
（１）上記の方法により、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定する工程；および、
（２）工程（１）で測定されたスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する工程、
を含む。当該方法を、スクラーゼ関連疾患の診断を補助する方法とすることもできる。
「スクラーゼ関連疾患」は、スクラーゼ活性の欠損または低下に起因する疾患を意味する。スクラーゼ関連疾患の例には、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害および薬剤性粘膜障害が含まれる。粘膜障害の詳細は上記の通りである。
「スクラーゼ関連疾患の診断」には、対象がスクラーゼ関連疾患に羅患しているか否かを判定すること、対象におけるスクラーゼ関連疾患の悪化または改善を判定すること、対象におけるスクラーゼ関連疾患の治療の効果を判定すること、あるいは、対象のスクラーゼ関連疾患の重症度を判定することが含まれる。
工程（１）は、上記のスクラーゼ活性の測定方法に準じて実施し得る。工程（２）では、工程（１）で算出したスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する。指標値は、健康な集団について、対象と同等の条件下で工程（１）を実施し、測定されたスクラーゼ活性から得られる値であり得る。例えば、健康な集団において測定されたスクラーゼ活性の平均値を求め、指標値を決定し得る。指標値は、対象におけるスクラーゼ活性（被験値）の測定と同時に、並行して、またはその前もしくは後に、健康な集団について測定したスクラーゼ活性に基づく値であってもよく、予め定めた値であってもよい。被験値が指標値よりも低い場合に、対象がスクラーゼ関連疾患に罹患していると診断し得、指標値と同等であるかそれよりも高い場合に、対象がスクラーゼ関連疾患に罹患していないと診断し得る。また、指標値に対する被験値の高低の程度に基づいて、スクラーゼ関連疾患の重症度をさらに知ることができる。
あるいは、指標値は、対象において以前に同等の条件下で工程（１）に従って測定されたスクラーゼ活性であってもよい。この場合、被験値が指標値よりも低い場合に、対象のスクラーゼ関連疾患が悪化したと判定し得、指標値よりも高い場合に、対象のスクラーゼ関連疾患が改善されたと判定し得る。
ある態様では、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する方法であって、
（１）フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを、対象に経口投与する工程；
（２）対象から排出された呼気を採取し、被験試料とする工程、ここで、被験試料は、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである；
（３）被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出する工程；および、
（４）工程（３）で測定されたスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する工程、
を含む方法が提供される。
ある態様では、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、対象のスクラーゼ関連疾患を診断するための組成物が提供される。
ある態様では、対象のスクラーゼ関連疾患を診断するための、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースが提供される。
ある態様では、対象のスクラーゼ関連疾患を診断するための組成物を製造するための、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースの使用が提供される。
例えば、本開示は下記の実施態様を提供する。
［１］対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法であって、
１３Ｃ標識スクロースを経口投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出することを含み、
１３Ｃ標識スクロースは、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていないものであり、
被験試料が、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において当該割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである、方法。
［２］被験試料が、健康な集団において当該割合が最大になる時点に基づいて決定された時点で採取されたものである、第１項に記載の方法。
［３］被験試料が、１３Ｃ標識スクロースの投与から、健康な集団において当該割合が最大になる時点の１０分後までのいずれかの時点で採取されたものである、第１項または第２項に記載の方法。
［４］被験試料が、１３Ｃ標識スクロースの投与から、健康な集団において当該割合が最大になる時点までの間のいずれかの時点で採取されたものである、第１項～第３項のいずれかに記載の方法。
［５］被験試料が、健康な集団において当該割合が最大になる時点の近傍で採取されたものである、第１項または第２項に記載の方法。
［６］被験試料が、健康な集団において当該割合が最大になる時点で採取されたものである、第１項～第５項のいずれかに記載の方法。
［７］対象から複数の時点で排出された呼気を被験試料とし、各被験試料について当該割合を算出し、当該割合のピーク値をスクラーゼ活性の測定値とする、第１項または第２項に記載の方法。
［８］被験試料が、１３Ｃ標識スクロースの投与から、投与の約２０分後までのいずれかの時点で採取されたものである、第１項または第２項に記載の方法。
［９］対象が絶食状態である、第１項～第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］対象が非絶食状態である、第１項～第８項のいずれかに記載の方法。
［１１］対象が代謝性疾患に罹患しているか、罹患している疑いがある、第１項～第１０項のいずれかに記載の方法。
［１２］代謝性疾患が、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害、薬剤性粘膜障害、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、脂肪肝、ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ヘモクロマトーシス、自己免疫性肝炎、肝疾患、糖尿病、境界型糖尿病、インスリン抵抗性、高血糖症、高インスリン血症、肥満、脂質異常症または高血圧である、第１１項に記載の方法。
［１３］代謝性疾患が、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害または薬剤性粘膜障害である、第１１項または第１２項に記載の方法。
［１４］対象がヒトである、第１項～第１３項のいずれかに記載の方法。
［１５］１３Ｃ標識スクロースが、フルクトース部分のすべての炭素原子が１３Ｃ標識されているものである、第１項～第１４項のいずれかに記載の方法。
［１６］フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための組成物。
［１７］１３Ｃ標識スクロースが、フルクトース部分のすべての炭素原子が１３Ｃ標識されているものである、第１６項に記載の組成物。
［１８］スクラーゼ関連疾患の診断方法であって、
（１）第１項～第１５項のいずれかに記載の方法により、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定する工程、および、
（２）工程（１）で測定されたスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する工程、
を含む方法。
［１９］指標値が、健康な集団において、第１項～第１５項のいずれかに記載の方法に従って測定されたスクラーゼ活性から得られる値である、第１８項に記載の方法。
［２０］被験値が指標値よりも低い場合に、対象がスクラーゼ関連疾患に罹患していると診断し、指標値と同等であるかそれよりも高い場合に、対象がスクラーゼ関連疾患に罹患していないと診断する、第１８項または第１９項に記載の方法。
［２１］スクラーゼ関連疾患が、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害または薬剤性粘膜障害である、第１８項～第２０項のいずれかに記載の方法。
［２２］スクラーゼ関連疾患がスクラーゼ・イソマルターゼ欠損症である、第１８項～第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、スクラーゼ関連疾患を診断するための組成物。
［２４］１３Ｃ標識スクロースが、フルクトース部分のすべての炭素原子が１３Ｃ標識されているものである、第２３項に記載の組成物。
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、発明を説明するためだけに供されるものである。
１３ Ｃ標識スクロース
図１に示す３種類の１３Ｃ標識スクロースを実施例で使用した。１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）は、スクロースのフルクトース部分の炭素原子が１３Ｃで標識されており、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）は、スクロースのグルコース部分の炭素原子が１３Ｃで標識されており、１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）は、すべての炭素原子が１３Ｃで標識されている。これらはすべて Cambridge Isotope Laboratories, Inc.から購入した。
実施例１：
１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）および１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）１０ｍｇ／４ｍＬ／ｋｇを、前日より絶食した Sprague-Dawley（ＳＤ）ラット（健常モデル、ｎ＝６）に経口投与し呼気を採取した。Gas Chromatography Mass Spectrometry（GC/MS）を用いて呼気中Δ１３Ｃを測定した。
図２に呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）および１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）のＴｍａｘ／Ｃｍａｘは、それぞれ、２０分／８８．４‰、６０分／６８．５‰および４０分／１１８．４‰であった。１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）および１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）に比べ、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）のＴｍａｘが早いことが示された。
実施例２：
前日より絶食したＳＤラット（ｎ＝６）にα－グルコシダーゼ阻害剤としてアカルボース（１０ｍｇ／４ｍＬ／ｋｇ）を経口ゾンデを用い経口投与した。３０分後に１３Ｃ１２－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース－１３Ｃ６－グルコース）１０ｍｇ／４ｍＬ／ｋｇを経口投与し呼気を採取した。なお、対照（Control）群（ｎ＝６）はアカルボースの代わりに生理食塩水を４ｍＬ／ｋｇ経口投与した。ＧＣ／ＭＳを用いて呼気中Δ１３Ｃを測定した。
図３に呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。α-グリコシダーゼ阻害剤を前処理することで、１３ＣＯ２は呼気に排出されなくなった。そのことにより、１３Ｃ標識スクロースの投与後の呼気中Δ１３Ｃ濃度でスクラーゼ活性をモニターできることが確認された。
実施例３：
１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）または１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）１０ｍｇ／４ｍＬ／ｋｇを前日より絶食したＳＤラット（ｎ＝６）および Zucker Diabetic Fatty（ＺＤＦ ｆａｔｔｙ）ラット（糖尿病モデル、ｎ＝６）に経口投与し、呼気を採取した。ＧＣ／ＭＳを用いて呼気中Δ１３Ｃを測定した。
図４に呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。上図は、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）を投与した後の呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。ＳＤラットのＴｍａｘは２０分、Ｃｍａｘは８８．４‰、ＺＤＦ ｆａｔｔｙ ラットのＴｍａｘは１０分、Ｃｍａｘは８９．４‰であり、Ｔｍａｘ近傍では両群間の呼気反応に大きな差は認められなかった。下図は、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－グルコース）を投与した後の呼気中Δ１３Ｃ濃度を示す。ＳＤラット及びＺＤＦ ｆａｔｔｙ ラットのＴｍａｘに関しては両群ともに６０分であったが、Ｃｍａｘはそれぞれ７０．２‰、４０．７‰で、ＺＤＦ ｆａｔｔｙ ラットの呼気反応がＳＤラットに比べ有意に低かった。従って、１３Ｃ６－スクロース（１３Ｃ６－フルクトース）を投与した後のＴｍａｘ近傍の呼気中Δ１３Ｃ濃度は、耐糖能の影響を受けにくいことが示された。
本開示により、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を、従来の方法よりも簡便に測定することができる。かくして得られるスクラーゼ活性の測定値は、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症などのスクラーゼ関連疾患の診断に利用できる。

Claims (15)

  1. 対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性の測定方法であって、
    １３Ｃ標識スクロースを経口投与された対象から排出された呼気を被験試料とし、被験試料中の非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する１３ＣＯ２量の割合を、スクラーゼ活性の測定値として算出することを含み、
    １３Ｃ標識スクロースは、フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていないものであり、
    被験試料が、健康な集団とグルコース代謝能が低下した集団において当該割合が同等である期間に基づいて決定された時点で採取されたものである、方法。
  2. 被験試料が、健康な集団において当該割合が最大になる時点に基づいて決定された時点で採取されたものである、請求項１に記載の方法。
  3. 被験試料が、１３Ｃ標識スクロースの投与から、健康な集団において当該割合が最大になる時点の１０分後までのいずれかの時点で採取されたものである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 被験試料が、健康な集団において当該割合が最大になる時点の近傍で採取されたものである、請求項１または２に記載の方法。
  5. 対象から複数の時点で排出された呼気を被験試料とし、各被験試料について当該割合を算出し、当該割合のピーク値をスクラーゼ活性の測定値とする、請求項１または２に記載の方法。
  6. 被験試料が、１３Ｃ標識スクロースの投与から、投与の約２０分後までのいずれかの時点で採取されたものである、請求項１または２に記載の方法。
  7. 対象が代謝性疾患に罹患しているか、罹患している疑いがある、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 代謝性疾患が、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害または薬剤性粘膜障害である、請求項７に記載の方法。
  9. １３Ｃ標識スクロースが、フルクトース部分のすべての炭素原子が１３Ｃ標識されているものである、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定するための組成物。
  11. スクラーゼ関連疾患の診断方法であって、
    （１）請求項１～９のいずれかに記載の方法により、対象のスクラーゼ・イソマルターゼ複合体のスクラーゼ活性を測定する工程；および、
    （２）工程（１）で測定されたスクラーゼ活性を指標値と比較し、対象のスクラーゼ関連疾患を診断する工程、
    を含む方法。
  12. 指標値が、健康な集団において、請求項１～９のいずれかに記載の方法に従って測定されたスクラーゼ活性から得られる値である、請求項１１に記載の方法。
  13. スクラーゼ関連疾患がスクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、過敏性腸症候群、感染に起因する粘膜障害または薬剤性粘膜障害である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. スクラーゼ関連疾患がスクラーゼ・イソマルターゼ欠損症である、請求項１１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. フルクトース部分の少なくとも１つの炭素原子が１３Ｃ標識されており、グルコース部分の炭素原子が１３Ｃ標識されていない１３Ｃ標識スクロースを含む、スクラーゼ関連疾患を診断するための組成物。
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