JPH0771484B2 - 新規なハイブリドーマ - Google Patents

新規なハイブリドーマ

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JPH0771484B2
JPH0771484B2 JP3208955A JP20895591A JPH0771484B2 JP H0771484 B2 JPH0771484 B2 JP H0771484B2 JP 3208955 A JP3208955 A JP 3208955A JP 20895591 A JP20895591 A JP 20895591A JP H0771484 B2 JPH0771484 B2 JP H0771484B2
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祐章 大村
孝一 高倉
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトIgG↓1型モノ
クローン抗体を産出する能力を有するハイブリドーマに
関する。
【0002】 本発明によって提供されるハイブリドー
マから産出されるヒトIgG↓1型モノクローン抗体は
ニコチン性アセチルコリンレセプター(以下、ニコチン
性アセチルコリンレセプターをAChRと略称する)
反応することから、神経筋接合部のシナプス後膜上に存
在するAChRに対する自己抗体に原因する神経筋伝達
障害が病態の中心であるとされている重症筋無力症の診
断薬として有用であり、また重症筋無力症の治療におけ
る利用が期待される上記自己抗体に対する抗血清又はモ
ノクローン抗体を製造するための原料として有用であ
る。
【0003】
【従来の技術】従来、シビレエイ又は電気ウナギの発電
器官から抽出されたアセチルコリンレセプターで免疫し
たラットの脾細胞とマウス由来のミエローマ細胞とを融
合させることによってハイブリドーマを得、該ハイブリ
ドーマを用いてアセチルコリンレセプターに対するラッ
トモノクローン抗体を得たことが報告されている〔プロ
シーディンクス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ツ・オブ・アメリカ(Proceedingsof t
he National Academy of Sc
iencesof the United State
s of America)第77巻、第755〜75
9頁(1980年)参照〕。重症筋無力症患者の胸腺か
ら取得されたリンパ球をエプスタイン−バール・ウイル
ス(Epstein−Barrvirus)を利用して
形質転換し、得られた形質転換細胞株を用いてアセチル
コリンレセプターに対するヒトモノクローン抗体を得た
ことが報告されている〔サイエンス(Science
s)第215巻、第995〜997頁(1982年)参
照〕。また、重症筋無力症患者の末梢単核球と8−アザ
グアニン耐性を有するヒトミエローマ細胞とを融合さ
せ、得られたハイブリドーマを用いて、重症筋無力症患
者が有するアセチルコリンレセプターに対する自己抗体
と同様のヒトモノクローン抗体を得たことが知られてい
る(特開昭59−231024号公報参照)。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】一般にマウス、ラット
などの動物に由来するモノクローン抗体をヒトに投与し
た場合、そのモノクローン抗体が人体にとって異種蛋白
であるがゆえに該モノクローン抗体に対する免疫反応が
生起し、モノクローン抗体の活性が消失されたり、ショ
ック症状などの副作用が人体に生じることがある。従っ
て、アセチルコリンレセプターに対するラットモノクロ
ーン抗体をヒトに投与することは好ましくない。
【0005】重症筋無力症患者の胸腺から取得されたリ
ンパ球からエプスタイン−バール・ウイルスを利用して
形質転換することにより得られた形質転換細胞株を用い
てアセチルコリンレセプターに対するヒトモノクローン
抗体を製造する方法においては、形質転換細胞株の抗体
産生能が必ずしも高いとは言い難い。この方法で得られ
たヒトモノクローン抗体の詳細については報告されてい
ない。
【0006】また、重症筋無力症患者の末梢単核球とヒ
トミエローマ細胞とから取得されたハイブリドーマを用
いてアセチルコリンレセプターに対するヒトモノクロー
ン抗体を製造する方法に関しては、使用したヒトミエロ
ーマ細胞が8−アザグアニン耐性を有する非分泌型であ
ること、及び得られたヒトモノクローン抗体がアセチル
コリンレセプターに対する自己抗体と同様のものである
こと以外には報告されていない。一般にヒトミエローマ
細胞を用いてハイブリドーマを製造する場合には、その
融合効率及びクローニング効率が低いこと、また得られ
たハイブリドーマの抗体産生能が低いことが知られてい
る〔例えば、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ツズ(Journal of Immunologic
al Methods)第61巻、第17〜32頁(1
983年)参照〕ことから、前記のヒトミエローマ細胞
を用いて得られたハイブリドーマを利用する方法は必ず
しも有利であるとは言い難い。
【0007】しかして、本発明の目的は、ヒトモノクロ
ーン抗体を効率的に産生する能力を有する新規なハイブ
リドーマを提供することにある。
【0008】
【課題を解決するための手段】
【0009】 本発明によれば、上記の目的は、ACh
Rに対する抗体を産生する能力を有するヒト細胞と
(Ag↓1)↓2−cl 7B株(微工研条寄第179
7号)とを融合させることによって得られ、ドデシル硫
酸ナトリウムの存在下に実施されるポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により求められる分子量が180000
±20000であり、かつAChRと反応するヒトIg
G↓1型モノクローン抗体を産生する能力を有するT/
G−59(5C)株(微工研条寄第1798号)を提供
することによって達成される。
【0010】 上記のAChRと反応するヒトIgG↓
1型モノクローン抗体を産生するハイブリドーマの取得
は、まずAChRに対する抗体を産生する能力を有する
ヒト細胞(以下、このヒト細胞を抗AChR抗体産生ヒ
ト細胞と略称する)と増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞
とを融合させ、次いで後述する操作を実施することによ
って行われる。
【0011】 AChRに対する抗体は重症筋無力症な
どの自己免疫疾患の患者の血液中などに存在する。抗A
ChR抗体産生ヒト細胞としては、例えば上記の自己免
疫疾患の患者の胸腺、脾臓、リンパ節、末梢血などから
取得されるリンパ球が挙げられる。このリンパ球は重症
筋無力症患者の胸腺、脾臓などに比較的大量にかつ高濃
度で存在することから、抗AChR抗体産生ヒト細胞と
しては重症筋無力症患者の胸腺、脾臓などに存在するリ
ンパ球を使用するのが実用的である。増殖可能なヒトリ
ンパ芽球様細胞は、例えば、ヒトリンパ球にエプスタイ
ン−バール・ウイルスなどのウイルスを感染させること
により該ヒトリンパ球を形質転換することにより取得さ
れる。融合後、後述するようにAChRと反応するヒト
IgG↓1型モノクローン抗体を産生する能力を有する
ハイブリドーマと使用したヒトリンパ芽球様細胞との選
別を容易にする観点から、増殖可能なヒトリンパ芽球様
細胞としてはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジ
ン感受性を有している6−チオグアニン耐性細胞、8−
アザグアニン耐性細胞又は5−ブロモデオキシウリジン
耐性細胞を使用するのが好適である。かかる増殖可能な
ヒトリンパ芽球様細胞としては、例えば、G(Ag↓
1)↓2−cl 7B株、GM4672株〔ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メディスン(Journ
al of Experimental Medici
ne)第158巻、第718〜730頁(1983年)
参照〕、H35.1.1,0467.3株〔ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メディスン(Journ
al of Experimental Medici
ne)第156巻、第930〜935頁(1982年)
参照〕、KR−4株〔プロシーディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Pro
ceedings of the National
Academy of Sciences of th
e United States of Americ
a)第79巻、第6651〜6655頁(1982年)
参照〕、RH−L4株〔ジャーナル・オブ・イムノロジ
カル・メソッズ(Journal of Immuno
logical Methods)第61巻、第17〜
32頁(1983年)参照〕、GM1500 6TG−
A12株〔ネイチャー(Nature)第288巻、第
488〜489頁(1980年)参照〕、WI−L2−
729HF↓2株〔ジャーナル・オブ・イムノロジー
(Journal of Immunology)第1
32巻、第1798〜1803頁(1984年)参
照〕、LICR−LON−HMy−2株〔プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ
・アメリカ(Proceedings of theN
ational Academy of Scienc
es of theUnited States of
America)第80巻、第2026〜2030頁
(1983年)参照〕などが知られており、本発明では
抗AChR抗体産生ヒト細胞との融合効率並びに得られ
たハイブリドーマのクローニング効率及び増殖性におい
て優れるG(Ag↓1)↓2−cl 7B株を用いる。
G(Ag↓1)↓2−cl 7B株はリウマチ患者の末
梢血リンパ球をエプスタイン−バール・ウイルスを用い
て形質転換させ、得られた形質転換細胞株に8−アザグ
アニン耐性を付与させることによって取得された細胞株
である。なお、G(Ag↓1)↓2−cl 7B株はウ
アバイン耐性をも有する。
【0012】 抗AChR抗体産生ヒト細胞とG(Ag
↓1)↓2−cl7B株との融合は、一般の細胞融合に
おいて用いられる方法に従って、通常は融合剤の存在下
に緩衝液中で実施される。抗AChR抗体産生ヒト細胞
と増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞とはそれらの細胞数
の比が通常約10対1〜約1対1の範囲内、好ましくは
約4対1〜約1.5〜1の範囲内となるような割合で用
いられる。融合剤としてはポリエチレングリコール、セ
ンダイ・ウイルス〔ヘマグルチネイティング・ウイルス
・オブ・ジャパン(Hemagglutinating
Virus of Japan)〕などを使用するこ
とができるが、取り扱い易さ、融合効率の高さなどの点
から、平均分子量が約1000〜5000の範囲内にあ
るポリエチレングリコールを使用するのが好ましく、こ
のポリエチレングリコールを緩衝液中の濃度が約40〜
60重量%の範囲内となるような量で使用するのが適当
である。細胞融合は通常、抗AChR抗体産生ヒト細胞
と増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞とを動物細胞用培地
又は平衡塩類溶液に加え、さらに融合剤を加えた混合液
を、例えば約37℃の温度で約2分間攪拌することによ
って実施される。動物細胞用培地としては例えばRPM
I−1640培地、ハンクスのMEM培地〔ハンクス・
ミニマム・エッセンシャル・メディウム(Hanks’
minimum essential mediu
m)〕、イーグルのMEM培地〔イーグルズ・ミニマム
・エッセンシャル・メディウム(Eagle’s mi
nimum essential medium)〕な
どが使用され、また平衡塩類溶液としては例えばハンク
ス液〔ハンクス・バランスト・ソルツ・ソルーション
(Hanks’ balanced salts so
lution)〕、アール液〔アールズ・バランスト・
ソルツ・ソルーション(Earle’s balanc
ed salts solution)〕などが使用さ
れる。また、抗AChR抗体産生ヒト細胞と増殖可能な
ヒトリンパ芽球様細胞との融合は電気融合法によって行
うこともできる。
【0013】 上記の融合操作終了後、得られた細胞混
合物からAChRと反応するヒトIgG↓1型モノクロ
ーン抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを次の
ようにして選別する。まず、得られた細胞混合物から抗
AChR抗体産生ヒト細胞と増殖可能なヒトリンパ芽球
様細胞とのハイブリドーマを分離・取得する。ヒトリン
パ芽球様細胞としてヒポキサンチン・アミノプテリン・
チミジン感受性を有する細胞を使用した場合、融合操作
によって得られた細胞混合物をヒポキサンチン、アミノ
プテリン及びチミジンを含有する培地(以下、この培地
をHAT培地と称する)で培養することにより、抗AC
hR抗体産生ヒト細胞とヒトリンパ芽球様細胞とのハイ
ブリドーマを選択的に増殖させることができる。このH
AT培地での培養に際して、細胞混合物の培地中での濃
度を通常約1×10↑6〜1×10↑7個/mlの範囲
内となるように調整することが良好な結果を与える。H
AT培地は、例えば、RPMI−1640培地などの動
物細胞用培地に牛胎児血清を約10〜15容量%の濃度
となるように添加し、さらにヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを添加することによって調製され
る。ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンのH
AT培地中での濃度は、目的とするハイブリドーマの増
殖に悪影響を及ぼさない範囲内であれば特に制限されな
いが、通常それぞれ約1×10↑−4モル/l、約4×
10↑−7モル/l及び約1.6×10↑−5モル/l
となるように調整することが好ましい。HAT培地での
培養は、通常二酸化炭素を約5〜8%含む空気中におい
て、約37℃の温度で約1〜4週間静置下に行う。次
に、細胞混合物から分離・取得されたハイブリドーマか
ら、AChRと反応するIgG型抗体を産生する能力を
有するハイブリドーマを選別する。ハイブリドーマがA
ChRと反応するIgG型抗体を産生する能力を有する
ものであるか否かは、例えばラジオ・イムノ・アッセイ
法(以下、これをRIA法と称する)、酵素免疫測定法
(以下、これをELISA法と称する)などによって判
定することができる。このようにして選別されたハイブ
リドーマを、例えば限界希釈法によってクローニングす
ることにより、AChRと反応するヒトIgG↓1型モ
ノクローン抗体を産生する能力を有する増殖可能なハイ
ブリドーマ株を取得することができる。かかるハイブリ
ドーマ株としては、例えばT/G−59(5C)株が挙
げられる。T/G−59(5C)株は重症筋無力症患者
の胸腺に存在するリンパ球とG(Ag↓1)↓2−cl
7B株とを融合させることによって得られたハイブリ
ドーマから選別された株である。
【0014】 このようにして得られたハイブリドーマ
株を、例えば、二酸化炭素を約5〜8%含む空気中で、
RPMI−1640培地などの動物細胞用培地に牛胎児
血清を約10〜15容量%の濃度となるように添加する
ことによって調製した培地、又はハイブリテイー1(日
本薬品開発株式会社製)などのヒトリンパ球系細胞用無
血清培地において約37℃の温度で培養することによ
り、該ハイブリドーマ株の増殖に伴ってAChRと反応
するヒトIgG↓1型モノクローン抗体が産生される。
【0015】 ハイブリドーマ培養液からのAChR
反応するヒトIgG↓1型モノクローン抗体の分離・精
製は例えば次のような方法により行うことができる。ハ
イブリドーマ培養液を遠心分離し、得られた上清を限外
濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの
精製操作に付することにより目的とするヒトIgG↓1
型モノクローン抗体を取得することができる。
【0016】 このようにして得られるAChRと反応
するヒトIgG↓1型モノクローン抗体は180000
±20000の分子量を有する。この分子量は例えばネ
イチャー(Nature)第227巻、第680〜68
5頁(1970年)などに記載されているドデシル硫酸
ナトリウムの存在下に実施されるポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により求められる。この方法に従う電気泳
動はヒトIgG↓1型モノクローン抗体が還元的に分解
されるのを避けるために2−メルカプトエタノールなど
の還元剤の不存在下に行われる。
【0017】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明するが、本
発明は実施例により限定されるものではない。 実施例1: (1) 胸腺細胞の取得
【0018】重症筋無力症患者より摘出した胸腺をダル
ベッコのMEM培地〔ダルベッコズ・モデイフアイド・
イーグルズ・メデイウム(Dulbecco′s mo
dified Eagle′s medium)〕で洗
浄したのち、ステンレスメッシュ上で粉砕し、メッシュ
を通過した細胞をRPMI−1640培地を用いて3回
遠心洗浄した。 (2) 細胞融合
【0019】上記(1)で得られた胸腺細胞の1.04
×10↑8個とG(Ag↓1)↓2−cl 7B株の5.
2×10↑7個とを、平均分子量1500のポリエチレ
ングリコール1gとRPMI−1640培地1mlとの混
合液の1mlと混合して、37℃の温度で2分間攪拌し
た。得られた混合物にRPMI−1640培地9mlを攪
拌下に徐々に加えたのち、この混合物を遠心分離するこ
とにより、細胞混合物を沈殿物として得た。RPMI−
1640培地にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジン及び牛胎児血清をそれぞれ1×10↑-4モル/l、
4×10↑-7モル/l、1.6×10↑-5モル/l及び
約13容量%の濃度となるように加えることによってH
AT培地を調製し、次いで得られたHAT培地に上記の
細胞混合物を2.5×10↑6個/mlの濃度となるよう
に加えた。このようにして得られた細胞を含有する培地
をポリスチレン製のマイクロウエルプレート〔デンマー
ク国ヌンク(Nunc)社製、96ウエルマイクロウエ
ルプレートフタツキ×6個〕の575ウエル中に0.1
ml/ウエルずつ分注し、二酸化炭素を7%の濃度で含む
空気中において37℃の温度で静置培養した。培養開始
より10〜20日後に118ウエルにおいてハイブリド
ーマの増殖が認められた。 (3) ヒト型抗体を産生するハイブリドーマの選別
【0020】 ヒトIgG(重鎖及び軽鎖)に対するヤ
ギ抗血清のIgG分画〔イスラエル国マイルズ−イエダ
(Miles−Yeda)社製、IgGフラクション・
オブ・アンチ・ヒューマンIgG(HアンドLチェイン
ズ)(IgG Fraction of Anti H
uman IgG(H&L Chains))〕をリン
酸緩衝塩類溶液(以下、これをPBSと称する)に0.
05mg/mlの濃度となるように溶解し、得られた溶
液をポリ塩化ビニル製のマイクロウエルプレート〔米国
ベクトン−デイッキンソン・アンド・カンパニー(Be
cton−Dickinson and Compan
y)社製、ファルコン(Falcon)3912、96
穴プレート〕のウエル中に50μl/ウエルずつ分注
し、4℃の温度で1晩静置することによって抗体をプレ
ートに吸着させた。各ウエルから溶液を除去したのち、
牛胎児血清を5容量%含有するPBS溶液を300μl
/ウエルずつ分注し、37℃の温度で2時間静置するこ
とによって抗体が吸着していない固相表面のブロッキン
グを行った。牛胎児血清を5容量%含有するPBS溶液
で各ウエルを洗浄したのち、上記(2)においてハイブ
リドーマの増殖が認められた培地の上清を5μl/ウエ
ルずつ各ウエルに分注し、37℃の温度で1時間静置
し、次いで牛胎児血清を5容量%含有するPBS溶液で
各ウエルを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで標
識したヒト免疫グロブリンに対する抗体〔イギリス国ア
マシヤム(Amersham)社製、アンチヒューマン
Ig,ペルオキシダーゼリンクド,スピーシーズスペシ
フィク・ホール・アンチボデイ(Anti−human
Ig, Peroxidase−linked, S
pecies−specific Whole Ant
ibody)〕を牛胎児血清を5容量%含有するPBS
溶液に約2μg/mlの濃度で溶解し、この溶液を50
μl/ウエルずつ各ウエルに分注し、37℃の温度で1
時間静置した。各ウエルをPBSで洗浄したのち、2,
2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6
−スルホン酸)1ミリモル/l含有し、かつ過酸化水素
を0.0045重量%含有するトリス緩衝塩類溶液(p
H:7.4)を100μl/ウエルずつ各ウエルに分注
し、室温下で15分間振盪することによって発色操作を
行った。各ウエル中の溶液について波長409nmと5
01nmにおける吸光度を測定した結果、118ウエル
中の溶液のうちの49ウエル中の溶液についてその両波
長での吸光度の差が大きいことから、これら49ウエル
中に分注した上清を与えたハイブリドーマはヒト型抗体
を産生していると判定した。(4) AChRと反応す
ヒトIgG型抗体を産生するハイブリドーマの選別
【0021】 上記(3)で得られた49種類のヒト型
抗体を産生するハイブリドーマについて、それらの培養
上清のAChRに対する抗体価をRIA法によって評価
した。すなわち、牛胎児筋肉25gより抽出したACh
Rを含有し、かつトリトン(Triton)X−100
〔米国シグマ(Sigma)社製、α−〔4−(1,
1,3,3−テトラメチルブチル)フェニル〕−ω−ヒ
ドロキシポリ(オキシ−1,2−エタンジイル)〕を2
容量%含有するトリス緩衝塩類溶液(pH:7.4)5
0mlに↑125Iで標識したブンガロトキシン〔イギ
リス国アマシヤム(Amersham)社製、α−ブン
ガロトキシン(α−Bungarotoxin);比活
性:約200キユリー/ミリモル〕を放射能濃度が20
0ナノキユリー/mlとなるように混合し、混合液を室
温下で約2時間振盪した。得られた混合液の50μlず
つを各ハイブリドーマの培養上清50μlに加え、4℃
の温度で1晩静置した。得られた各々の混合液に、ヒト
IgGに対する抗血清〔西ドイツ国ヘキスト(Hoec
hst)社製、抗IgG(γ鎖)血清(ウサギ)〔An
ti−γ G−Globulin/IgG(γ−cha
in)−Serum from rabbit〕をトリ
トンX−100を0.1容量%含有するトリス緩衝塩類
溶液(pH:7.4)で2倍の容積となるように希釈し
て得られた溶液を50μlずつ加え、4℃の温度で1晩
静置した。生成した沈殿物の各々をトリトンX−100
を0.1容量%含有するトリス緩衝塩類溶液(pH:
7.4)で3回遠心洗浄(回転数:3000rpm;所
要時間:20分間)したのち、放射活性をオートウエル
ガンマカウンター(アロカ株式会社製、オートウエルガ
ンマシステムARC−361)で測定した。前述の49
種類のハイブリドーマのうちの44種類のハイブリドー
マの培養上清を用いた場合に生成した沈殿物(試料N
o.1〜44)の放射活性を第1図に示す。また、比較
のため、ハイブリドーマのうちの培養上清の代わりにG
(Ag↓1)↓2−cl 7B株の培養上清を用いる以
外は同様の方法によって沈殿物(試料No.45)を生
成させ、この沈殿物の放射活性を測定した。この測定結
果も併せて第1図に示す。第1図に示されるように、試
料No.10の沈殿物が高い放射活性を有することか
ら、この沈殿物が生成した培養上清はAChRに対して
高い抗体価を有しており、この培養上清を与えたハイブ
リドーマはAChRと反応するヒトIgG型抗体を産生
したと判定した。 (5) ハイブリドーマのクローニング
【0022】 上記(4)で得られたAChRと反応す
ヒトIgG型抗体を産生するハイブリドーマについて
限界希釈法によりクローニングを行った。すなわち、こ
のハイブリドーマを50個/ml、10個/ml及び5
個/mlの濃度となるように牛胎児血清を約13容量%
含有するRPMI−1640培地で希釈し、これらの5
0個/ml、10個/ml及び5個/mlの濃度の希釈
液をそれぞれポリスチレン製のマイクロウエルプレート
〔デンマーク国ヌンク(Nunc)社製、96ウエルマ
イクロウエルプレートフタツキ〕の40ウエル、32ウ
エル及び24ウエルの中に0.1ml/ウエルずつ分注
し、二酸化炭素を7%含有する空気中において37℃の
温度で静置培養した。培養開始より2〜4週間後にプレ
ートの17ウエルにおいて細胞のコロニーが出現した。
コロニーが出現した各ウエルの培養上清について、前記
(4)におけると同様なRIA法によりAChRに対す
る抗体価を測定し、AChRに対するヒトIgG型モノ
クローン抗体の産生能が高い1細胞株を取得した。これ
をT/G−59(5C)株と命名した。 (6) T/G−59(5C)株が産生するヒトモノク
ローン抗体の精製
【0023】上記(5)で得られたT/G−59(5
C)株を1×10↑5個/mlの濃度となるように牛胎児
血清を約13容量%含有するRPMI−1640培地中
に懸濁し、二酸化炭素を7%含有する空気中において3
7℃の温度で培養した。培地中の細胞の濃度が1×10
↑6個/ml以上となった時点で、培養液から細胞を遠心
分離した。得られた細胞を1×10↑5個/mlの濃度と
なるように組織培養用無血清培地(日本薬品開発株式会
社製、ハイブリティー1)中に懸濁し、二酸化炭素を7
%含有する空気中において37℃の温度で培養した。培
地中の細胞の濃度が1×10↑6個/ml以上となった時
点で、培養液を遠心分離することにより上清を約1.5
l得た。この上清を分画分子量10000の限外濾過膜
〔米国ミリポア(Millipore)社製、PTGC
043 10〕で濃縮し、濃縮液を約30ml得た。濃
縮液をゲル浸透クロマトグラフィー〔カラム:東洋曹達
工業株式会社製、TSKゲルG3000SW;溶離液:
0.1モル/lの酢酸ナトリウム緩衝液(pH:5.
0);流速:1ml/分〕に付し、流出液を30秒ごとに
分画した。各画分のAChRに対する抗体価を前記
(4)におけると同様なRIA法により測定した。流出
液の波長280nm(蛋白質の特異的な吸収位置)にお
ける吸光度及び上記の一部の画分のAChRに対する抗
体価を第2図に示す。AChRに対して抗体活性を有
し、かつ波長280nmにおいて高い吸光度を示す溶出
時間が11.5〜15.0分の範囲内にある画分を合わ
せ、これよりアフイニテイクロマトグラフィー〔担体:
スウエーデン国エル・ケー・ビー・プロダクター(LK
B Produkter)社製、ブルー・トリスアクリ
ルM(Blue Trisacryl M)〕を用いて
アルブミンを除去した。得られたヒトIgG型モノクロ
ーン抗体の一部をポリアクリルアミドゲル(アクリルア
ミドとN,N′−メチレンビスアクリルアミドとの構成
重量比=37対1;ゲル濃度:8重量%)を用いてドデ
シル硫酸ナトリウム(濃度:0.1重量%)の存在下に
電気泳動させた結果、ヒトIgG型モノクローン抗体の
分子量は180000±20000であることが判明し
た。ヒトIgG型モノクローン抗体の電気泳動像及びヒ
トIgGの市販品〔米国マイルズ・ラボラトリーズ(M
iles Laboratories)社製、ヒューマ
ンIgG(Human IgG)〕の電気泳動像をそれ
ぞれ第3図及び第4図に示す。なお、上記のアフイニテ
イクロマトグラフィーによって得られたヒトIgG型モ
ノクローン抗体を含有するPBS溶液の波長280nm
における吸光度とヒトIgGの市販品を0.1重量%含
有するPBS溶液の同波長における吸光度との比から、
ヒトIgG型モノクローン抗体の収量は約4.9mgであ
ると判定した。 (7) ヒトIgG型モノクローン抗体のサブクラスの
決定
【0024】上記(6)で得られたヒトIgG型モノク
ローン抗体のサブクラスをELISA法により決定し
た。すなわち、得られたヒトIgG型モノクローン抗体
をPBSで希釈してまず50μg/mlの溶液を調製し、
次いでこの濃度より1/2倍ごとの濃度にPBSで希釈
して0.049μg/mlまでの11種類の濃度の溶液を
調製した。各濃度の溶液をポリ塩化ビニル製のマイクロ
ウエルプレート〔米国ベクトン−デイツキンソン・アン
ド・カンパニー(Becton−Dickinson
and Company)社製、フアルコン(Falc
on)3912、96穴プレート〕に50μl/ウエル
の量で4ウエルずつ分注し、4℃の温度で1晩静置する
ことにより、ヒトIgG型モノクローン抗体をプレート
に吸着させた。各ウエルから溶液を除去したのち、牛胎
児血清を5容量%含有するPBS溶液を300μl/ウ
エルずつ分注し、37℃の温度で2時間静置することに
よってヒトIgG型モノクローン抗体が吸着していない
固相表面のブロッキングを行い、次いで各ウエルを牛胎
児血清を5容量%含有するPBS溶液で洗浄した。ヒト
IgG↓1、ヒトIgG↓2、ヒトIgG↓3及びヒトI
gG↓4に対するマウスモノクローン抗体〔それぞれイ
スラエル国バイオ・イエダ(Bio−Yeda)社製、
モノクローナル・アンチヒューマンIgG↓1:クロー
ンSG−11(Monoclonal Anti−hu
man IgG↓1:Clone SG−11);モノ
クローナル・アンチヒューマンIgG↓2:クローンH
P−6014(Monoclonal Anti−hu
man IgG↓2:CloneHP−6014);モ
ノクローナル・アンチヒューマンIgG↓3:クローン
HP−6050(Monoclonal Anti−h
uman IgG↓3:Clone HP−6050)
及びモノクローナル・アンチヒューマンIgG↓4:ク
ローンHP−25(Monoclonal Anti−
human IgG↓4:Clone HP−25)〕
をそれぞれ牛胎児血清を5容量%含有するPBS溶液に
5μg/mlの濃度となるように溶解し、得られた4種類
のマウスモノクローン抗体の溶液をそれぞれヒトIgG
型モノクローン抗体の吸着量が相異なる11ウエル中に
50μl/ウエルずつ分注し、37℃の温度で1時間静
置し、次いで牛胎児血清を5容量%含有するPBS溶液
で各ウエルを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで
標識したマウス免疫グロブリンに対する抗体〔イギリス
国アマシヤム(Amersham)社製、アンチマウス
Ig,ペルオキシダーゼリンクスド,スピーシーズスペ
シフイック・ホール・アンチボデイ(Anti−mou
se Ig,Peroxidase−Linked,
Species−specific Whole An
tibody)〕を牛胎児血清を5容量%含有するPB
S溶液に約2μg/mlの濃度となるように溶解し、この
溶液を各ウエルに50μl/ウエルずつ加えたのち、3
7℃の温度で1時間静置した。各ウエルをPBSで洗浄
したのち、各ウエルに2,2′−アジノ−ビス(3−エ
チルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)を1ミリモル
/l含有し、かつ過酸化水素を0.0045重量%含有
するトリス緩衝塩類溶液(pH:7.4)を100μl/
ウエルずつ分注し、室温下で15分間振盪することによ
って発色操作を行った。各ウエル中の溶液について波長
409nmと501nmにおける吸光度を測定し、両波
長における吸光度の差を第5図においてグラフで示す。
T/G−59(5C)株によって産生されるAChRに
対するヒトIgG型モノクローン抗体はヒトIgG↓1
に対するマウスモノクローン抗体と特異性に結合したこ
とが第5図から明らかであるから、該ヒトIgG型モノ
クローン抗体はIgG↓1サブクラスに属すると判定し
た。
【0025】
【発明の効果】 本発明によれば、上記の実施例から明
らかなとおり、新規なハイブリドーマを用いることによ
り、AChRと反応する新規なヒトIgG↓1型モノク
ローン抗体が効率的に製造される。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1の(4)においてヒト型抗体を産生す
る49種類のハイブリドーマのうちの44種類のハイブ
リドーマの培養上清を用いた場合に生成した沈殿物(試
料No.1〜44)及びG(Ag↓1)↓2−cl 7B
株の培養上清を用いた場合に生成した沈殿物(試料N
o.45)の放射活性を示す。
【図2】実施例1の(6)においてT/G−59(5
C)株の培養上清の濃縮液をゲル浸透クロマトグラフィ
ーに付して得られた流出液の波長280nmにおける吸
光度及び一部の画分についてRIA法で測定したACh
Rに対する抗体価を示す。
【図3】実施例1の(6)において得られたヒトIgG
型モノクローン抗体の電気泳動像を示す。
【図4】ヒトIgGの市販品の電気泳動像を示す。
【図5】実施例1の(7)において発色操作に付して得
られたマイクロウエルプレートの各ウエル中の溶液につ
いて測定した波長409nmと501nmにおける吸光
度の差を示す。横軸は各ウエルに分注したヒトIgG型
モノクローン抗体を含有するPBS溶液中での該ヒトI
gG型モノクローン抗体の濃度を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 高倉 孝一 大阪府大阪市北区梅田1丁目12番39号 株 式会社クラレ内 審査官 鈴木 恵理子 (56)参考文献 特開 昭59−137497(JP,A) 癌と化学療法,11〜1!(1984)P. 157〜164 SCIENCE,215(1982)P.995− 997

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ニコチン性アセチルコリンレセプターに
    対する抗体を産生する能力を有するヒト細胞とG(Ag
    ↓1)↓2−cl 7B株(微工研条寄第1797号)
    とを融合させることによって得られ、ドデシル硫酸ナト
    リウムの存在下に実施されるポリアクリルアミドゲル電
    気泳動法により求められる分子量が180000±20
    000であり、かつニコチン性アセチルコリンレセプタ
    と反応するヒトIgG↓1型モノクローン抗体を産生
    する能力を有するT/G−59(5C)株(微工研条寄
    第1798号)
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