JPH0771484B2 - 新規なハイブリドーマ - Google Patents
新規なハイブリドーマInfo
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- JPH0771484B2 JPH0771484B2 JP3208955A JP20895591A JPH0771484B2 JP H0771484 B2 JPH0771484 B2 JP H0771484B2 JP 3208955 A JP3208955 A JP 3208955A JP 20895591 A JP20895591 A JP 20895591A JP H0771484 B2 JPH0771484 B2 JP H0771484B2
- Authority
- JP
- Japan
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- human
- monoclonal antibody
- cells
- antibody
- human igg
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/286—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＩｇＧ↓1型モノ
クローン抗体を産出する能力を有するハイブリドーマに
関する。
クローン抗体を産出する能力を有するハイブリドーマに
関する。
【０００２】 本発明によって提供されるハイブリドー
マから産出されるヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体は
ニコチン性アセチルコリンレセプター（以下、ニコチン
性アセチルコリンレセプターをＡＣｈＲと略称する）と
反応することから、神経筋接合部のシナプス後膜上に存
在するＡＣｈＲに対する自己抗体に原因する神経筋伝達
障害が病態の中心であるとされている重症筋無力症の診
断薬として有用であり、また重症筋無力症の治療におけ
る利用が期待される上記自己抗体に対する抗血清又はモ
ノクローン抗体を製造するための原料として有用であ
る。
マから産出されるヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体は
ニコチン性アセチルコリンレセプター（以下、ニコチン
性アセチルコリンレセプターをＡＣｈＲと略称する）と
反応することから、神経筋接合部のシナプス後膜上に存
在するＡＣｈＲに対する自己抗体に原因する神経筋伝達
障害が病態の中心であるとされている重症筋無力症の診
断薬として有用であり、また重症筋無力症の治療におけ
る利用が期待される上記自己抗体に対する抗血清又はモ
ノクローン抗体を製造するための原料として有用であ
る。
【０００３】
【従来の技術】従来、シビレエイ又は電気ウナギの発電
器官から抽出されたアセチルコリンレセプターで免疫し
たラットの脾細胞とマウス由来のミエローマ細胞とを融
合させることによってハイブリドーマを得、該ハイブリ
ドーマを用いてアセチルコリンレセプターに対するラッ
トモノクローン抗体を得たことが報告されている〔プロ
シーディンクス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）第７７巻、第７５５〜７５
９頁（１９８０年）参照〕。重症筋無力症患者の胸腺か
ら取得されたリンパ球をエプスタイン−バール・ウイル
ス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ）を利用して
形質転換し、得られた形質転換細胞株を用いてアセチル
コリンレセプターに対するヒトモノクローン抗体を得た
ことが報告されている〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ）第２１５巻、第９９５〜９９７頁（１９８２年）参
照〕。また、重症筋無力症患者の末梢単核球と８−アザ
グアニン耐性を有するヒトミエローマ細胞とを融合さ
せ、得られたハイブリドーマを用いて、重症筋無力症患
者が有するアセチルコリンレセプターに対する自己抗体
と同様のヒトモノクローン抗体を得たことが知られてい
る（特開昭５９−２３１０２４号公報参照）。
器官から抽出されたアセチルコリンレセプターで免疫し
たラットの脾細胞とマウス由来のミエローマ細胞とを融
合させることによってハイブリドーマを得、該ハイブリ
ドーマを用いてアセチルコリンレセプターに対するラッ
トモノクローン抗体を得たことが報告されている〔プロ
シーディンクス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステー
ツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）第７７巻、第７５５〜７５
９頁（１９８０年）参照〕。重症筋無力症患者の胸腺か
ら取得されたリンパ球をエプスタイン−バール・ウイル
ス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ）を利用して
形質転換し、得られた形質転換細胞株を用いてアセチル
コリンレセプターに対するヒトモノクローン抗体を得た
ことが報告されている〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ）第２１５巻、第９９５〜９９７頁（１９８２年）参
照〕。また、重症筋無力症患者の末梢単核球と８−アザ
グアニン耐性を有するヒトミエローマ細胞とを融合さ
せ、得られたハイブリドーマを用いて、重症筋無力症患
者が有するアセチルコリンレセプターに対する自己抗体
と同様のヒトモノクローン抗体を得たことが知られてい
る（特開昭５９−２３１０２４号公報参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一般にマウス、ラット
などの動物に由来するモノクローン抗体をヒトに投与し
た場合、そのモノクローン抗体が人体にとって異種蛋白
であるがゆえに該モノクローン抗体に対する免疫反応が
生起し、モノクローン抗体の活性が消失されたり、ショ
ック症状などの副作用が人体に生じることがある。従っ
て、アセチルコリンレセプターに対するラットモノクロ
ーン抗体をヒトに投与することは好ましくない。
などの動物に由来するモノクローン抗体をヒトに投与し
た場合、そのモノクローン抗体が人体にとって異種蛋白
であるがゆえに該モノクローン抗体に対する免疫反応が
生起し、モノクローン抗体の活性が消失されたり、ショ
ック症状などの副作用が人体に生じることがある。従っ
て、アセチルコリンレセプターに対するラットモノクロ
ーン抗体をヒトに投与することは好ましくない。
【０００５】重症筋無力症患者の胸腺から取得されたリ
ンパ球からエプスタイン−バール・ウイルスを利用して
形質転換することにより得られた形質転換細胞株を用い
てアセチルコリンレセプターに対するヒトモノクローン
抗体を製造する方法においては、形質転換細胞株の抗体
産生能が必ずしも高いとは言い難い。この方法で得られ
たヒトモノクローン抗体の詳細については報告されてい
ない。
ンパ球からエプスタイン−バール・ウイルスを利用して
形質転換することにより得られた形質転換細胞株を用い
てアセチルコリンレセプターに対するヒトモノクローン
抗体を製造する方法においては、形質転換細胞株の抗体
産生能が必ずしも高いとは言い難い。この方法で得られ
たヒトモノクローン抗体の詳細については報告されてい
ない。
【０００６】また、重症筋無力症患者の末梢単核球とヒ
トミエローマ細胞とから取得されたハイブリドーマを用
いてアセチルコリンレセプターに対するヒトモノクロー
ン抗体を製造する方法に関しては、使用したヒトミエロ
ーマ細胞が８−アザグアニン耐性を有する非分泌型であ
ること、及び得られたヒトモノクローン抗体がアセチル
コリンレセプターに対する自己抗体と同様のものである
こと以外には報告されていない。一般にヒトミエローマ
細胞を用いてハイブリドーマを製造する場合には、その
融合効率及びクローニング効率が低いこと、また得られ
たハイブリドーマの抗体産生能が低いことが知られてい
る〔例えば、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ツズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）第６１巻、第１７〜３２頁（１
９８３年）参照〕ことから、前記のヒトミエローマ細胞
を用いて得られたハイブリドーマを利用する方法は必ず
しも有利であるとは言い難い。
トミエローマ細胞とから取得されたハイブリドーマを用
いてアセチルコリンレセプターに対するヒトモノクロー
ン抗体を製造する方法に関しては、使用したヒトミエロ
ーマ細胞が８−アザグアニン耐性を有する非分泌型であ
ること、及び得られたヒトモノクローン抗体がアセチル
コリンレセプターに対する自己抗体と同様のものである
こと以外には報告されていない。一般にヒトミエローマ
細胞を用いてハイブリドーマを製造する場合には、その
融合効率及びクローニング効率が低いこと、また得られ
たハイブリドーマの抗体産生能が低いことが知られてい
る〔例えば、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ツズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）第６１巻、第１７〜３２頁（１
９８３年）参照〕ことから、前記のヒトミエローマ細胞
を用いて得られたハイブリドーマを利用する方法は必ず
しも有利であるとは言い難い。
【０００７】しかして、本発明の目的は、ヒトモノクロ
ーン抗体を効率的に産生する能力を有する新規なハイブ
リドーマを提供することにある。
ーン抗体を効率的に産生する能力を有する新規なハイブ
リドーマを提供することにある。
【０００８】
【０００９】 本発明によれば、上記の目的は、ＡＣｈ
Ｒに対する抗体を産生する能力を有するヒト細胞とＧ
（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株（微工研条寄第１７９
７号）とを融合させることによって得られ、ドデシル硫
酸ナトリウムの存在下に実施されるポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により求められる分子量が１８００００
±２００００であり、かつＡＣｈＲと反応するヒトＩｇ
Ｇ↓１型モノクローン抗体を産生する能力を有するＴ／
Ｇ−５９（５Ｃ）株（微工研条寄第１７９８号）を提供
することによって達成される。
Ｒに対する抗体を産生する能力を有するヒト細胞とＧ
（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株（微工研条寄第１７９
７号）とを融合させることによって得られ、ドデシル硫
酸ナトリウムの存在下に実施されるポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により求められる分子量が１８００００
±２００００であり、かつＡＣｈＲと反応するヒトＩｇ
Ｇ↓１型モノクローン抗体を産生する能力を有するＴ／
Ｇ−５９（５Ｃ）株（微工研条寄第１７９８号）を提供
することによって達成される。
【００１０】 上記のＡＣｈＲと反応するヒトＩｇＧ↓
１型モノクローン抗体を産生するハイブリドーマの取得
は、まずＡＣｈＲに対する抗体を産生する能力を有する
ヒト細胞（以下、このヒト細胞を抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒ
ト細胞と略称する）と増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞
とを融合させ、次いで後述する操作を実施することによ
って行われる。
１型モノクローン抗体を産生するハイブリドーマの取得
は、まずＡＣｈＲに対する抗体を産生する能力を有する
ヒト細胞（以下、このヒト細胞を抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒ
ト細胞と略称する）と増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞
とを融合させ、次いで後述する操作を実施することによ
って行われる。
【００１１】 ＡＣｈＲに対する抗体は重症筋無力症な
どの自己免疫疾患の患者の血液中などに存在する。抗Ａ
ＣｈＲ抗体産生ヒト細胞としては、例えば上記の自己免
疫疾患の患者の胸腺、脾臓、リンパ節、末梢血などから
取得されるリンパ球が挙げられる。このリンパ球は重症
筋無力症患者の胸腺、脾臓などに比較的大量にかつ高濃
度で存在することから、抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞と
しては重症筋無力症患者の胸腺、脾臓などに存在するリ
ンパ球を使用するのが実用的である。増殖可能なヒトリ
ンパ芽球様細胞は、例えば、ヒトリンパ球にエプスタイ
ン−バール・ウイルスなどのウイルスを感染させること
により該ヒトリンパ球を形質転換することにより取得さ
れる。融合後、後述するようにＡＣｈＲと反応するヒト
ＩｇＧ↓１型モノクローン抗体を産生する能力を有する
ハイブリドーマと使用したヒトリンパ芽球様細胞との選
別を容易にする観点から、増殖可能なヒトリンパ芽球様
細胞としてはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジ
ン感受性を有している６−チオグアニン耐性細胞、８−
アザグアニン耐性細胞又は５−ブロモデオキシウリジン
耐性細胞を使用するのが好適である。かかる増殖可能な
ヒトリンパ芽球様細胞としては、例えば、Ｇ（Ａｇ↓
１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株、ＧＭ４６７２株〔ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ）第１５８巻、第７１８〜７３０頁（１９８３年）
参照〕、Ｈ３５．１．１，０４６７．３株〔ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ）第１５６巻、第９３０〜９３５頁（１９８２年）
参照〕、ＫＲ−４株〔プロシーディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃ
ａ）第７９巻、第６６５１〜６６５５頁（１９８２年）
参照〕、ＲＨ−Ｌ４株〔ジャーナル・オブ・イムノロジ
カル・メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）第６１巻、第１７〜
３２頁（１９８３年）参照〕、ＧＭ１５００ ６ＴＧ−
Ａ１２株〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２８８巻、第
４８８〜４８９頁（１９８０年）参照〕、ＷＩ−Ｌ２−
７２９ＨＦ↓２株〔ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第１
３２巻、第１７９８〜１８０３頁（１９８４年）参
照〕、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ−２株〔プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ
・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅＮ
ａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ ｏｆ ｔｈｅＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａ）第８０巻、第２０２６〜２０３０頁
（１９８３年）参照〕などが知られており、本発明では
抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞との融合効率並びに得られ
たハイブリドーマのクローニング効率及び増殖性におい
て優れるＧ（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株を用いる。
Ｇ（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株はリウマチ患者の末
梢血リンパ球をエプスタイン−バール・ウイルスを用い
て形質転換させ、得られた形質転換細胞株に８−アザグ
アニン耐性を付与させることによって取得された細胞株
である。なお、Ｇ（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株はウ
アバイン耐性をも有する。
どの自己免疫疾患の患者の血液中などに存在する。抗Ａ
ＣｈＲ抗体産生ヒト細胞としては、例えば上記の自己免
疫疾患の患者の胸腺、脾臓、リンパ節、末梢血などから
取得されるリンパ球が挙げられる。このリンパ球は重症
筋無力症患者の胸腺、脾臓などに比較的大量にかつ高濃
度で存在することから、抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞と
しては重症筋無力症患者の胸腺、脾臓などに存在するリ
ンパ球を使用するのが実用的である。増殖可能なヒトリ
ンパ芽球様細胞は、例えば、ヒトリンパ球にエプスタイ
ン−バール・ウイルスなどのウイルスを感染させること
により該ヒトリンパ球を形質転換することにより取得さ
れる。融合後、後述するようにＡＣｈＲと反応するヒト
ＩｇＧ↓１型モノクローン抗体を産生する能力を有する
ハイブリドーマと使用したヒトリンパ芽球様細胞との選
別を容易にする観点から、増殖可能なヒトリンパ芽球様
細胞としてはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジ
ン感受性を有している６−チオグアニン耐性細胞、８−
アザグアニン耐性細胞又は５−ブロモデオキシウリジン
耐性細胞を使用するのが好適である。かかる増殖可能な
ヒトリンパ芽球様細胞としては、例えば、Ｇ（Ａｇ↓
１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株、ＧＭ４６７２株〔ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ）第１５８巻、第７１８〜７３０頁（１９８３年）
参照〕、Ｈ３５．１．１，０４６７．３株〔ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ）第１５６巻、第９３０〜９３５頁（１９８２年）
参照〕、ＫＲ−４株〔プロシーディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃ
ａ）第７９巻、第６６５１〜６６５５頁（１９８２年）
参照〕、ＲＨ−Ｌ４株〔ジャーナル・オブ・イムノロジ
カル・メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）第６１巻、第１７〜
３２頁（１９８３年）参照〕、ＧＭ１５００ ６ＴＧ−
Ａ１２株〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２８８巻、第
４８８〜４８９頁（１９８０年）参照〕、ＷＩ−Ｌ２−
７２９ＨＦ↓２株〔ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第１
３２巻、第１７９８〜１８０３頁（１９８４年）参
照〕、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ−２株〔プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ
・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅＮ
ａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ ｏｆ ｔｈｅＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａ）第８０巻、第２０２６〜２０３０頁
（１９８３年）参照〕などが知られており、本発明では
抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞との融合効率並びに得られ
たハイブリドーマのクローニング効率及び増殖性におい
て優れるＧ（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株を用いる。
Ｇ（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株はリウマチ患者の末
梢血リンパ球をエプスタイン−バール・ウイルスを用い
て形質転換させ、得られた形質転換細胞株に８−アザグ
アニン耐性を付与させることによって取得された細胞株
である。なお、Ｇ（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株はウ
アバイン耐性をも有する。
【００１２】 抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞とＧ（Ａｇ
↓１）↓２−ｃｌ７Ｂ株との融合は、一般の細胞融合に
おいて用いられる方法に従って、通常は融合剤の存在下
に緩衝液中で実施される。抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞
と増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞とはそれらの細胞数
の比が通常約１０対１〜約１対１の範囲内、好ましくは
約４対１〜約１．５〜１の範囲内となるような割合で用
いられる。融合剤としてはポリエチレングリコール、セ
ンダイ・ウイルス〔ヘマグルチネイティング・ウイルス
・オブ・ジャパン（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ
Ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ）〕などを使用するこ
とができるが、取り扱い易さ、融合効率の高さなどの点
から、平均分子量が約１０００〜５０００の範囲内にあ
るポリエチレングリコールを使用するのが好ましく、こ
のポリエチレングリコールを緩衝液中の濃度が約４０〜
６０重量％の範囲内となるような量で使用するのが適当
である。細胞融合は通常、抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞
と増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞とを動物細胞用培地
又は平衡塩類溶液に加え、さらに融合剤を加えた混合液
を、例えば約３７℃の温度で約２分間攪拌することによ
って実施される。動物細胞用培地としては例えばＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地、ハンクスのＭＥＭ培地〔ハンクス・
ミニマム・エッセンシャル・メディウム（Ｈａｎｋｓ’
ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕ
ｍ）〕、イーグルのＭＥＭ培地〔イーグルズ・ミニマム
・エッセンシャル・メディウム（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉ
ｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）〕な
どが使用され、また平衡塩類溶液としては例えばハンク
ス液〔ハンクス・バランスト・ソルツ・ソルーション
（Ｈａｎｋｓ’ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔｓ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）〕、アール液〔アールズ・バランスト・
ソルツ・ソルーション（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｂａｌａｎｃ
ｅｄ ｓａｌｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）〕などが使用さ
れる。また、抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞と増殖可能な
ヒトリンパ芽球様細胞との融合は電気融合法によって行
うこともできる。
↓１）↓２−ｃｌ７Ｂ株との融合は、一般の細胞融合に
おいて用いられる方法に従って、通常は融合剤の存在下
に緩衝液中で実施される。抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞
と増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞とはそれらの細胞数
の比が通常約１０対１〜約１対１の範囲内、好ましくは
約４対１〜約１．５〜１の範囲内となるような割合で用
いられる。融合剤としてはポリエチレングリコール、セ
ンダイ・ウイルス〔ヘマグルチネイティング・ウイルス
・オブ・ジャパン（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ
Ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ）〕などを使用するこ
とができるが、取り扱い易さ、融合効率の高さなどの点
から、平均分子量が約１０００〜５０００の範囲内にあ
るポリエチレングリコールを使用するのが好ましく、こ
のポリエチレングリコールを緩衝液中の濃度が約４０〜
６０重量％の範囲内となるような量で使用するのが適当
である。細胞融合は通常、抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞
と増殖可能なヒトリンパ芽球様細胞とを動物細胞用培地
又は平衡塩類溶液に加え、さらに融合剤を加えた混合液
を、例えば約３７℃の温度で約２分間攪拌することによ
って実施される。動物細胞用培地としては例えばＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地、ハンクスのＭＥＭ培地〔ハンクス・
ミニマム・エッセンシャル・メディウム（Ｈａｎｋｓ’
ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕ
ｍ）〕、イーグルのＭＥＭ培地〔イーグルズ・ミニマム
・エッセンシャル・メディウム（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉ
ｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）〕な
どが使用され、また平衡塩類溶液としては例えばハンク
ス液〔ハンクス・バランスト・ソルツ・ソルーション
（Ｈａｎｋｓ’ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔｓ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）〕、アール液〔アールズ・バランスト・
ソルツ・ソルーション（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｂａｌａｎｃ
ｅｄ ｓａｌｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）〕などが使用さ
れる。また、抗ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞と増殖可能な
ヒトリンパ芽球様細胞との融合は電気融合法によって行
うこともできる。
【００１３】 上記の融合操作終了後、得られた細胞混
合物からＡＣｈＲと反応するヒトＩｇＧ↓１型モノクロ
ーン抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを次の
ようにして選別する。まず、得られた細胞混合物から抗
ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞と増殖可能なヒトリンパ芽球
様細胞とのハイブリドーマを分離・取得する。ヒトリン
パ芽球様細胞としてヒポキサンチン・アミノプテリン・
チミジン感受性を有する細胞を使用した場合、融合操作
によって得られた細胞混合物をヒポキサンチン、アミノ
プテリン及びチミジンを含有する培地（以下、この培地
をＨＡＴ培地と称する）で培養することにより、抗ＡＣ
ｈＲ抗体産生ヒト細胞とヒトリンパ芽球様細胞とのハイ
ブリドーマを選択的に増殖させることができる。このＨ
ＡＴ培地での培養に際して、細胞混合物の培地中での濃
度を通常約１×１０↑６〜１×１０↑７個／ｍｌの範囲
内となるように調整することが良好な結果を与える。Ｈ
ＡＴ培地は、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動
物細胞用培地に牛胎児血清を約１０〜１５容量％の濃度
となるように添加し、さらにヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを添加することによって調製され
る。ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンのＨ
ＡＴ培地中での濃度は、目的とするハイブリドーマの増
殖に悪影響を及ぼさない範囲内であれば特に制限されな
いが、通常それぞれ約１×１０↑−４モル／ｌ、約４×
１０↑−７モル／ｌ及び約１．６×１０↑−５モル／ｌ
となるように調整することが好ましい。ＨＡＴ培地での
培養は、通常二酸化炭素を約５〜８％含む空気中におい
て、約３７℃の温度で約１〜４週間静置下に行う。次
に、細胞混合物から分離・取得されたハイブリドーマか
ら、ＡＣｈＲと反応するＩｇＧ型抗体を産生する能力を
有するハイブリドーマを選別する。ハイブリドーマがＡ
ＣｈＲと反応するＩｇＧ型抗体を産生する能力を有する
ものであるか否かは、例えばラジオ・イムノ・アッセイ
法（以下、これをＲＩＡ法と称する）、酵素免疫測定法
（以下、これをＥＬＩＳＡ法と称する）などによって判
定することができる。このようにして選別されたハイブ
リドーマを、例えば限界希釈法によってクローニングす
ることにより、ＡＣｈＲと反応するヒトＩｇＧ↓１型モ
ノクローン抗体を産生する能力を有する増殖可能なハイ
ブリドーマ株を取得することができる。かかるハイブリ
ドーマ株としては、例えばＴ／Ｇ−５９（５Ｃ）株が挙
げられる。Ｔ／Ｇ−５９（５Ｃ）株は重症筋無力症患者
の胸腺に存在するリンパ球とＧ（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ
７Ｂ株とを融合させることによって得られたハイブリ
ドーマから選別された株である。
合物からＡＣｈＲと反応するヒトＩｇＧ↓１型モノクロ
ーン抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを次の
ようにして選別する。まず、得られた細胞混合物から抗
ＡＣｈＲ抗体産生ヒト細胞と増殖可能なヒトリンパ芽球
様細胞とのハイブリドーマを分離・取得する。ヒトリン
パ芽球様細胞としてヒポキサンチン・アミノプテリン・
チミジン感受性を有する細胞を使用した場合、融合操作
によって得られた細胞混合物をヒポキサンチン、アミノ
プテリン及びチミジンを含有する培地（以下、この培地
をＨＡＴ培地と称する）で培養することにより、抗ＡＣ
ｈＲ抗体産生ヒト細胞とヒトリンパ芽球様細胞とのハイ
ブリドーマを選択的に増殖させることができる。このＨ
ＡＴ培地での培養に際して、細胞混合物の培地中での濃
度を通常約１×１０↑６〜１×１０↑７個／ｍｌの範囲
内となるように調整することが良好な結果を与える。Ｈ
ＡＴ培地は、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動
物細胞用培地に牛胎児血清を約１０〜１５容量％の濃度
となるように添加し、さらにヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを添加することによって調製され
る。ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンのＨ
ＡＴ培地中での濃度は、目的とするハイブリドーマの増
殖に悪影響を及ぼさない範囲内であれば特に制限されな
いが、通常それぞれ約１×１０↑−４モル／ｌ、約４×
１０↑−７モル／ｌ及び約１．６×１０↑−５モル／ｌ
となるように調整することが好ましい。ＨＡＴ培地での
培養は、通常二酸化炭素を約５〜８％含む空気中におい
て、約３７℃の温度で約１〜４週間静置下に行う。次
に、細胞混合物から分離・取得されたハイブリドーマか
ら、ＡＣｈＲと反応するＩｇＧ型抗体を産生する能力を
有するハイブリドーマを選別する。ハイブリドーマがＡ
ＣｈＲと反応するＩｇＧ型抗体を産生する能力を有する
ものであるか否かは、例えばラジオ・イムノ・アッセイ
法（以下、これをＲＩＡ法と称する）、酵素免疫測定法
（以下、これをＥＬＩＳＡ法と称する）などによって判
定することができる。このようにして選別されたハイブ
リドーマを、例えば限界希釈法によってクローニングす
ることにより、ＡＣｈＲと反応するヒトＩｇＧ↓１型モ
ノクローン抗体を産生する能力を有する増殖可能なハイ
ブリドーマ株を取得することができる。かかるハイブリ
ドーマ株としては、例えばＴ／Ｇ−５９（５Ｃ）株が挙
げられる。Ｔ／Ｇ−５９（５Ｃ）株は重症筋無力症患者
の胸腺に存在するリンパ球とＧ（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ
７Ｂ株とを融合させることによって得られたハイブリ
ドーマから選別された株である。
【００１４】 このようにして得られたハイブリドーマ
株を、例えば、二酸化炭素を約５〜８％含む空気中で、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞用培地に牛胎児
血清を約１０〜１５容量％の濃度となるように添加する
ことによって調製した培地、又はハイブリテイー１（日
本薬品開発株式会社製）などのヒトリンパ球系細胞用無
血清培地において約３７℃の温度で培養することによ
り、該ハイブリドーマ株の増殖に伴ってＡＣｈＲと反応
するヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体が産生される。
株を、例えば、二酸化炭素を約５〜８％含む空気中で、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞用培地に牛胎児
血清を約１０〜１５容量％の濃度となるように添加する
ことによって調製した培地、又はハイブリテイー１（日
本薬品開発株式会社製）などのヒトリンパ球系細胞用無
血清培地において約３７℃の温度で培養することによ
り、該ハイブリドーマ株の増殖に伴ってＡＣｈＲと反応
するヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体が産生される。
【００１５】 ハイブリドーマ培養液からのＡＣｈＲと
反応するヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体の分離・精
製は例えば次のような方法により行うことができる。ハ
イブリドーマ培養液を遠心分離し、得られた上清を限外
濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの
精製操作に付することにより目的とするヒトＩｇＧ↓１
型モノクローン抗体を取得することができる。
反応するヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体の分離・精
製は例えば次のような方法により行うことができる。ハ
イブリドーマ培養液を遠心分離し、得られた上清を限外
濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの
精製操作に付することにより目的とするヒトＩｇＧ↓１
型モノクローン抗体を取得することができる。
【００１６】 このようにして得られるＡＣｈＲと反応
するヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体は１８００００
±２００００の分子量を有する。この分子量は例えばネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２２７巻、第６８０〜６８
５頁（１９７０年）などに記載されているドデシル硫酸
ナトリウムの存在下に実施されるポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により求められる。この方法に従う電気泳
動はヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体が還元的に分解
されるのを避けるために２−メルカプトエタノールなど
の還元剤の不存在下に行われる。
するヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体は１８００００
±２００００の分子量を有する。この分子量は例えばネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２２７巻、第６８０〜６８
５頁（１９７０年）などに記載されているドデシル硫酸
ナトリウムの存在下に実施されるポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により求められる。この方法に従う電気泳
動はヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体が還元的に分解
されるのを避けるために２−メルカプトエタノールなど
の還元剤の不存在下に行われる。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明するが、本
発明は実施例により限定されるものではない。 実施例１： （１） 胸腺細胞の取得
発明は実施例により限定されるものではない。 実施例１： （１） 胸腺細胞の取得
【００１８】重症筋無力症患者より摘出した胸腺をダル
ベッコのＭＥＭ培地〔ダルベッコズ・モデイフアイド・
イーグルズ・メデイウム（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ）〕で洗
浄したのち、ステンレスメッシュ上で粉砕し、メッシュ
を通過した細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３回
遠心洗浄した。 （２） 細胞融合
ベッコのＭＥＭ培地〔ダルベッコズ・モデイフアイド・
イーグルズ・メデイウム（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ′ｓ ｍｅｄｉｕｍ）〕で洗
浄したのち、ステンレスメッシュ上で粉砕し、メッシュ
を通過した細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３回
遠心洗浄した。 （２） 細胞融合
【００１９】上記（１）で得られた胸腺細胞の１．０４
×１０↑8個とＧ（Ａｇ↓1）↓2−ｃｌ ７Ｂ株の５．
２×１０↑7個とを、平均分子量１５００のポリエチレ
ングリコール１ｇとＲＰＭＩ−１６４０培地１mlとの混
合液の１mlと混合して、３７℃の温度で２分間攪拌し
た。得られた混合物にＲＰＭＩ−１６４０培地９mlを攪
拌下に徐々に加えたのち、この混合物を遠心分離するこ
とにより、細胞混合物を沈殿物として得た。ＲＰＭＩ−
１６４０培地にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジン及び牛胎児血清をそれぞれ１×１０↑-4モル／ｌ、
４×１０↑-7モル／ｌ、１．６×１０↑-5モル／ｌ及び
約１３容量％の濃度となるように加えることによってＨ
ＡＴ培地を調製し、次いで得られたＨＡＴ培地に上記の
細胞混合物を２．５×１０↑6個／mlの濃度となるよう
に加えた。このようにして得られた細胞を含有する培地
をポリスチレン製のマイクロウエルプレート〔デンマー
ク国ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製、９６ウエルマイクロウエ
ルプレートフタツキ×６個〕の５７５ウエル中に０．１
ml／ウエルずつ分注し、二酸化炭素を７％の濃度で含む
空気中において３７℃の温度で静置培養した。培養開始
より１０〜２０日後に１１８ウエルにおいてハイブリド
ーマの増殖が認められた。 （３） ヒト型抗体を産生するハイブリドーマの選別
×１０↑8個とＧ（Ａｇ↓1）↓2−ｃｌ ７Ｂ株の５．
２×１０↑7個とを、平均分子量１５００のポリエチレ
ングリコール１ｇとＲＰＭＩ−１６４０培地１mlとの混
合液の１mlと混合して、３７℃の温度で２分間攪拌し
た。得られた混合物にＲＰＭＩ−１６４０培地９mlを攪
拌下に徐々に加えたのち、この混合物を遠心分離するこ
とにより、細胞混合物を沈殿物として得た。ＲＰＭＩ−
１６４０培地にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジン及び牛胎児血清をそれぞれ１×１０↑-4モル／ｌ、
４×１０↑-7モル／ｌ、１．６×１０↑-5モル／ｌ及び
約１３容量％の濃度となるように加えることによってＨ
ＡＴ培地を調製し、次いで得られたＨＡＴ培地に上記の
細胞混合物を２．５×１０↑6個／mlの濃度となるよう
に加えた。このようにして得られた細胞を含有する培地
をポリスチレン製のマイクロウエルプレート〔デンマー
ク国ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製、９６ウエルマイクロウエ
ルプレートフタツキ×６個〕の５７５ウエル中に０．１
ml／ウエルずつ分注し、二酸化炭素を７％の濃度で含む
空気中において３７℃の温度で静置培養した。培養開始
より１０〜２０日後に１１８ウエルにおいてハイブリド
ーマの増殖が認められた。 （３） ヒト型抗体を産生するハイブリドーマの選別
【００２０】 ヒトＩｇＧ（重鎖及び軽鎖）に対するヤ
ギ抗血清のＩｇＧ分画〔イスラエル国マイルズ−イエダ
（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ）社製、ＩｇＧフラクション・
オブ・アンチ・ヒューマンＩｇＧ（ＨアンドＬチェイン
ズ）（ＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ Ｈ
ｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ Ｃｈａｉｎｓ））〕をリン
酸緩衝塩類溶液（以下、これをＰＢＳと称する）に０．
０５ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解し、得られた溶
液をポリ塩化ビニル製のマイクロウエルプレート〔米国
ベクトン−デイッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅ
ｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ）社製、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）３９１２、９６
穴プレート〕のウエル中に５０μｌ／ウエルずつ分注
し、４℃の温度で１晩静置することによって抗体をプレ
ートに吸着させた。各ウエルから溶液を除去したのち、
牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液を３００μｌ
／ウエルずつ分注し、３７℃の温度で２時間静置するこ
とによって抗体が吸着していない固相表面のブロッキン
グを行った。牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液
で各ウエルを洗浄したのち、上記（２）においてハイブ
リドーマの増殖が認められた培地の上清を５μｌ／ウエ
ルずつ各ウエルに分注し、３７℃の温度で１時間静置
し、次いで牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液で
各ウエルを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで標
識したヒト免疫グロブリンに対する抗体〔イギリス国ア
マシヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、アンチヒューマン
Ｉｇ，ペルオキシダーゼリンクド，スピーシーズスペシ
フィク・ホール・アンチボデイ（Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
Ｉｇ， Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ， Ｓ
ｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗｈｏｌｅ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ）〕を牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ
溶液に約２μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、この溶液を５０
μｌ／ウエルずつ各ウエルに分注し、３７℃の温度で１
時間静置した。各ウエルをＰＢＳで洗浄したのち、２，
２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６
−スルホン酸）１ミリモル／ｌ含有し、かつ過酸化水素
を０．００４５重量％含有するトリス緩衝塩類溶液（ｐ
Ｈ：７．４）を１００μｌ／ウエルずつ各ウエルに分注
し、室温下で１５分間振盪することによって発色操作を
行った。各ウエル中の溶液について波長４０９ｎｍと５
０１ｎｍにおける吸光度を測定した結果、１１８ウエル
中の溶液のうちの４９ウエル中の溶液についてその両波
長での吸光度の差が大きいことから、これら４９ウエル
中に分注した上清を与えたハイブリドーマはヒト型抗体
を産生していると判定した。（４） ＡＣｈＲと反応す
るヒトＩｇＧ型抗体を産生するハイブリドーマの選別
ギ抗血清のＩｇＧ分画〔イスラエル国マイルズ−イエダ
（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ）社製、ＩｇＧフラクション・
オブ・アンチ・ヒューマンＩｇＧ（ＨアンドＬチェイン
ズ）（ＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ Ｈ
ｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ Ｃｈａｉｎｓ））〕をリン
酸緩衝塩類溶液（以下、これをＰＢＳと称する）に０．
０５ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解し、得られた溶
液をポリ塩化ビニル製のマイクロウエルプレート〔米国
ベクトン−デイッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅ
ｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ）社製、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）３９１２、９６
穴プレート〕のウエル中に５０μｌ／ウエルずつ分注
し、４℃の温度で１晩静置することによって抗体をプレ
ートに吸着させた。各ウエルから溶液を除去したのち、
牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液を３００μｌ
／ウエルずつ分注し、３７℃の温度で２時間静置するこ
とによって抗体が吸着していない固相表面のブロッキン
グを行った。牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液
で各ウエルを洗浄したのち、上記（２）においてハイブ
リドーマの増殖が認められた培地の上清を５μｌ／ウエ
ルずつ各ウエルに分注し、３７℃の温度で１時間静置
し、次いで牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液で
各ウエルを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで標
識したヒト免疫グロブリンに対する抗体〔イギリス国ア
マシヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、アンチヒューマン
Ｉｇ，ペルオキシダーゼリンクド，スピーシーズスペシ
フィク・ホール・アンチボデイ（Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
Ｉｇ， Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ， Ｓ
ｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗｈｏｌｅ Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ）〕を牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ
溶液に約２μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、この溶液を５０
μｌ／ウエルずつ各ウエルに分注し、３７℃の温度で１
時間静置した。各ウエルをＰＢＳで洗浄したのち、２，
２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６
−スルホン酸）１ミリモル／ｌ含有し、かつ過酸化水素
を０．００４５重量％含有するトリス緩衝塩類溶液（ｐ
Ｈ：７．４）を１００μｌ／ウエルずつ各ウエルに分注
し、室温下で１５分間振盪することによって発色操作を
行った。各ウエル中の溶液について波長４０９ｎｍと５
０１ｎｍにおける吸光度を測定した結果、１１８ウエル
中の溶液のうちの４９ウエル中の溶液についてその両波
長での吸光度の差が大きいことから、これら４９ウエル
中に分注した上清を与えたハイブリドーマはヒト型抗体
を産生していると判定した。（４） ＡＣｈＲと反応す
るヒトＩｇＧ型抗体を産生するハイブリドーマの選別
【００２１】 上記（３）で得られた４９種類のヒト型
抗体を産生するハイブリドーマについて、それらの培養
上清のＡＣｈＲに対する抗体価をＲＩＡ法によって評価
した。すなわち、牛胎児筋肉２５ｇより抽出したＡＣｈ
Ｒを含有し、かつトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００
〔米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、α−〔４−（１，
１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル〕−ω−ヒ
ドロキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）〕を２
容量％含有するトリス緩衝塩類溶液（ｐＨ：７．４）５
０ｍｌに↑１２５Ｉで標識したブンガロトキシン〔イギ
リス国アマシヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、α−ブン
ガロトキシン（α−Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ）；比活
性：約２００キユリー／ミリモル〕を放射能濃度が２０
０ナノキユリー／ｍｌとなるように混合し、混合液を室
温下で約２時間振盪した。得られた混合液の５０μｌず
つを各ハイブリドーマの培養上清５０μｌに加え、４℃
の温度で１晩静置した。得られた各々の混合液に、ヒト
ＩｇＧに対する抗血清〔西ドイツ国ヘキスト（Ｈｏｅｃ
ｈｓｔ）社製、抗ＩｇＧ（γ鎖）血清（ウサギ）〔Ａｎ
ｔｉ−γ Ｇ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ／ＩｇＧ（γ−ｃｈａ
ｉｎ）−Ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ〕をトリ
トンＸ−１００を０．１容量％含有するトリス緩衝塩類
溶液（ｐＨ：７．４）で２倍の容積となるように希釈し
て得られた溶液を５０μｌずつ加え、４℃の温度で１晩
静置した。生成した沈殿物の各々をトリトンＸ−１００
を０．１容量％含有するトリス緩衝塩類溶液（ｐＨ：
７．４）で３回遠心洗浄（回転数：３０００ｒｐｍ；所
要時間：２０分間）したのち、放射活性をオートウエル
ガンマカウンター（アロカ株式会社製、オートウエルガ
ンマシステムＡＲＣ−３６１）で測定した。前述の４９
種類のハイブリドーマのうちの４４種類のハイブリドー
マの培養上清を用いた場合に生成した沈殿物（試料Ｎ
ｏ．１〜４４）の放射活性を第１図に示す。また、比較
のため、ハイブリドーマのうちの培養上清の代わりにＧ
（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株の培養上清を用いる以
外は同様の方法によって沈殿物（試料Ｎｏ．４５）を生
成させ、この沈殿物の放射活性を測定した。この測定結
果も併せて第１図に示す。第１図に示されるように、試
料Ｎｏ．１０の沈殿物が高い放射活性を有することか
ら、この沈殿物が生成した培養上清はＡＣｈＲに対して
高い抗体価を有しており、この培養上清を与えたハイブ
リドーマはＡＣｈＲと反応するヒトＩｇＧ型抗体を産生
したと判定した。 （５） ハイブリドーマのクローニング
抗体を産生するハイブリドーマについて、それらの培養
上清のＡＣｈＲに対する抗体価をＲＩＡ法によって評価
した。すなわち、牛胎児筋肉２５ｇより抽出したＡＣｈ
Ｒを含有し、かつトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００
〔米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、α−〔４−（１，
１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル〕−ω−ヒ
ドロキシポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）〕を２
容量％含有するトリス緩衝塩類溶液（ｐＨ：７．４）５
０ｍｌに↑１２５Ｉで標識したブンガロトキシン〔イギ
リス国アマシヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、α−ブン
ガロトキシン（α−Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ）；比活
性：約２００キユリー／ミリモル〕を放射能濃度が２０
０ナノキユリー／ｍｌとなるように混合し、混合液を室
温下で約２時間振盪した。得られた混合液の５０μｌず
つを各ハイブリドーマの培養上清５０μｌに加え、４℃
の温度で１晩静置した。得られた各々の混合液に、ヒト
ＩｇＧに対する抗血清〔西ドイツ国ヘキスト（Ｈｏｅｃ
ｈｓｔ）社製、抗ＩｇＧ（γ鎖）血清（ウサギ）〔Ａｎ
ｔｉ−γ Ｇ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ／ＩｇＧ（γ−ｃｈａ
ｉｎ）−Ｓｅｒｕｍ ｆｒｏｍ ｒａｂｂｉｔ〕をトリ
トンＸ−１００を０．１容量％含有するトリス緩衝塩類
溶液（ｐＨ：７．４）で２倍の容積となるように希釈し
て得られた溶液を５０μｌずつ加え、４℃の温度で１晩
静置した。生成した沈殿物の各々をトリトンＸ−１００
を０．１容量％含有するトリス緩衝塩類溶液（ｐＨ：
７．４）で３回遠心洗浄（回転数：３０００ｒｐｍ；所
要時間：２０分間）したのち、放射活性をオートウエル
ガンマカウンター（アロカ株式会社製、オートウエルガ
ンマシステムＡＲＣ−３６１）で測定した。前述の４９
種類のハイブリドーマのうちの４４種類のハイブリドー
マの培養上清を用いた場合に生成した沈殿物（試料Ｎ
ｏ．１〜４４）の放射活性を第１図に示す。また、比較
のため、ハイブリドーマのうちの培養上清の代わりにＧ
（Ａｇ↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株の培養上清を用いる以
外は同様の方法によって沈殿物（試料Ｎｏ．４５）を生
成させ、この沈殿物の放射活性を測定した。この測定結
果も併せて第１図に示す。第１図に示されるように、試
料Ｎｏ．１０の沈殿物が高い放射活性を有することか
ら、この沈殿物が生成した培養上清はＡＣｈＲに対して
高い抗体価を有しており、この培養上清を与えたハイブ
リドーマはＡＣｈＲと反応するヒトＩｇＧ型抗体を産生
したと判定した。 （５） ハイブリドーマのクローニング
【００２２】 上記（４）で得られたＡＣｈＲと反応す
るヒトＩｇＧ型抗体を産生するハイブリドーマについて
限界希釈法によりクローニングを行った。すなわち、こ
のハイブリドーマを５０個／ｍｌ、１０個／ｍｌ及び５
個／ｍｌの濃度となるように牛胎児血清を約１３容量％
含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、これらの５
０個／ｍｌ、１０個／ｍｌ及び５個／ｍｌの濃度の希釈
液をそれぞれポリスチレン製のマイクロウエルプレート
〔デンマーク国ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製、９６ウエルマ
イクロウエルプレートフタツキ〕の４０ウエル、３２ウ
エル及び２４ウエルの中に０．１ｍｌ／ウエルずつ分注
し、二酸化炭素を７％含有する空気中において３７℃の
温度で静置培養した。培養開始より２〜４週間後にプレ
ートの１７ウエルにおいて細胞のコロニーが出現した。
コロニーが出現した各ウエルの培養上清について、前記
（４）におけると同様なＲＩＡ法によりＡＣｈＲに対す
る抗体価を測定し、ＡＣｈＲに対するヒトＩｇＧ型モノ
クローン抗体の産生能が高い１細胞株を取得した。これ
をＴ／Ｇ−５９（５Ｃ）株と命名した。 （６） Ｔ／Ｇ−５９（５Ｃ）株が産生するヒトモノク
ローン抗体の精製
るヒトＩｇＧ型抗体を産生するハイブリドーマについて
限界希釈法によりクローニングを行った。すなわち、こ
のハイブリドーマを５０個／ｍｌ、１０個／ｍｌ及び５
個／ｍｌの濃度となるように牛胎児血清を約１３容量％
含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、これらの５
０個／ｍｌ、１０個／ｍｌ及び５個／ｍｌの濃度の希釈
液をそれぞれポリスチレン製のマイクロウエルプレート
〔デンマーク国ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製、９６ウエルマ
イクロウエルプレートフタツキ〕の４０ウエル、３２ウ
エル及び２４ウエルの中に０．１ｍｌ／ウエルずつ分注
し、二酸化炭素を７％含有する空気中において３７℃の
温度で静置培養した。培養開始より２〜４週間後にプレ
ートの１７ウエルにおいて細胞のコロニーが出現した。
コロニーが出現した各ウエルの培養上清について、前記
（４）におけると同様なＲＩＡ法によりＡＣｈＲに対す
る抗体価を測定し、ＡＣｈＲに対するヒトＩｇＧ型モノ
クローン抗体の産生能が高い１細胞株を取得した。これ
をＴ／Ｇ−５９（５Ｃ）株と命名した。 （６） Ｔ／Ｇ−５９（５Ｃ）株が産生するヒトモノク
ローン抗体の精製
【００２３】上記（５）で得られたＴ／Ｇ−５９（５
Ｃ）株を１×１０↑5個／mlの濃度となるように牛胎児
血清を約１３容量％含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中
に懸濁し、二酸化炭素を７％含有する空気中において３
７℃の温度で培養した。培地中の細胞の濃度が１×１０
↑6個／ml以上となった時点で、培養液から細胞を遠心
分離した。得られた細胞を１×１０↑5個／mlの濃度と
なるように組織培養用無血清培地（日本薬品開発株式会
社製、ハイブリティー１）中に懸濁し、二酸化炭素を７
％含有する空気中において３７℃の温度で培養した。培
地中の細胞の濃度が１×１０↑6個／ml以上となった時
点で、培養液を遠心分離することにより上清を約１．５
ｌ得た。この上清を分画分子量１００００の限外濾過膜
〔米国ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製、ＰＴＧＣ
０４３ １０〕で濃縮し、濃縮液を約３０ml得た。濃
縮液をゲル浸透クロマトグラフィー〔カラム：東洋曹達
工業株式会社製、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ；溶離液：
０．１モル／ｌの酢酸ナトリウム緩衝液（pH：５．
０）；流速：１ml／分〕に付し、流出液を３０秒ごとに
分画した。各画分のＡＣｈＲに対する抗体価を前記
（４）におけると同様なＲＩＡ法により測定した。流出
液の波長２８０ｎｍ（蛋白質の特異的な吸収位置）にお
ける吸光度及び上記の一部の画分のＡＣｈＲに対する抗
体価を第２図に示す。ＡＣｈＲに対して抗体活性を有
し、かつ波長２８０ｎｍにおいて高い吸光度を示す溶出
時間が１１．５〜１５．０分の範囲内にある画分を合わ
せ、これよりアフイニテイクロマトグラフィー〔担体：
スウエーデン国エル・ケー・ビー・プロダクター（ＬＫ
Ｂ Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ）社製、ブルー・トリスアクリ
ルＭ（Ｂｌｕｅ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ）〕を用いて
アルブミンを除去した。得られたヒトＩｇＧ型モノクロ
ーン抗体の一部をポリアクリルアミドゲル（アクリルア
ミドとＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドとの構成
重量比＝３７対１；ゲル濃度：８重量％）を用いてドデ
シル硫酸ナトリウム（濃度：０．１重量％）の存在下に
電気泳動させた結果、ヒトＩｇＧ型モノクローン抗体の
分子量は１８００００±２００００であることが判明し
た。ヒトＩｇＧ型モノクローン抗体の電気泳動像及びヒ
トＩｇＧの市販品〔米国マイルズ・ラボラトリーズ（Ｍ
ｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、ヒューマ
ンＩｇＧ（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）〕の電気泳動像をそれ
ぞれ第３図及び第４図に示す。なお、上記のアフイニテ
イクロマトグラフィーによって得られたヒトＩｇＧ型モ
ノクローン抗体を含有するＰＢＳ溶液の波長２８０ｎｍ
における吸光度とヒトＩｇＧの市販品を０．１重量％含
有するＰＢＳ溶液の同波長における吸光度との比から、
ヒトＩｇＧ型モノクローン抗体の収量は約４．９mgであ
ると判定した。 （７） ヒトＩｇＧ型モノクローン抗体のサブクラスの
決定
Ｃ）株を１×１０↑5個／mlの濃度となるように牛胎児
血清を約１３容量％含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中
に懸濁し、二酸化炭素を７％含有する空気中において３
７℃の温度で培養した。培地中の細胞の濃度が１×１０
↑6個／ml以上となった時点で、培養液から細胞を遠心
分離した。得られた細胞を１×１０↑5個／mlの濃度と
なるように組織培養用無血清培地（日本薬品開発株式会
社製、ハイブリティー１）中に懸濁し、二酸化炭素を７
％含有する空気中において３７℃の温度で培養した。培
地中の細胞の濃度が１×１０↑6個／ml以上となった時
点で、培養液を遠心分離することにより上清を約１．５
ｌ得た。この上清を分画分子量１００００の限外濾過膜
〔米国ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製、ＰＴＧＣ
０４３ １０〕で濃縮し、濃縮液を約３０ml得た。濃
縮液をゲル浸透クロマトグラフィー〔カラム：東洋曹達
工業株式会社製、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ；溶離液：
０．１モル／ｌの酢酸ナトリウム緩衝液（pH：５．
０）；流速：１ml／分〕に付し、流出液を３０秒ごとに
分画した。各画分のＡＣｈＲに対する抗体価を前記
（４）におけると同様なＲＩＡ法により測定した。流出
液の波長２８０ｎｍ（蛋白質の特異的な吸収位置）にお
ける吸光度及び上記の一部の画分のＡＣｈＲに対する抗
体価を第２図に示す。ＡＣｈＲに対して抗体活性を有
し、かつ波長２８０ｎｍにおいて高い吸光度を示す溶出
時間が１１．５〜１５．０分の範囲内にある画分を合わ
せ、これよりアフイニテイクロマトグラフィー〔担体：
スウエーデン国エル・ケー・ビー・プロダクター（ＬＫ
Ｂ Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ）社製、ブルー・トリスアクリ
ルＭ（Ｂｌｕｅ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ）〕を用いて
アルブミンを除去した。得られたヒトＩｇＧ型モノクロ
ーン抗体の一部をポリアクリルアミドゲル（アクリルア
ミドとＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドとの構成
重量比＝３７対１；ゲル濃度：８重量％）を用いてドデ
シル硫酸ナトリウム（濃度：０．１重量％）の存在下に
電気泳動させた結果、ヒトＩｇＧ型モノクローン抗体の
分子量は１８００００±２００００であることが判明し
た。ヒトＩｇＧ型モノクローン抗体の電気泳動像及びヒ
トＩｇＧの市販品〔米国マイルズ・ラボラトリーズ（Ｍ
ｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製、ヒューマ
ンＩｇＧ（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）〕の電気泳動像をそれ
ぞれ第３図及び第４図に示す。なお、上記のアフイニテ
イクロマトグラフィーによって得られたヒトＩｇＧ型モ
ノクローン抗体を含有するＰＢＳ溶液の波長２８０ｎｍ
における吸光度とヒトＩｇＧの市販品を０．１重量％含
有するＰＢＳ溶液の同波長における吸光度との比から、
ヒトＩｇＧ型モノクローン抗体の収量は約４．９mgであ
ると判定した。 （７） ヒトＩｇＧ型モノクローン抗体のサブクラスの
決定
【００２４】上記（６）で得られたヒトＩｇＧ型モノク
ローン抗体のサブクラスをＥＬＩＳＡ法により決定し
た。すなわち、得られたヒトＩｇＧ型モノクローン抗体
をＰＢＳで希釈してまず５０μｇ／mlの溶液を調製し、
次いでこの濃度より１／２倍ごとの濃度にＰＢＳで希釈
して０．０４９μｇ／mlまでの１１種類の濃度の溶液を
調製した。各濃度の溶液をポリ塩化ビニル製のマイクロ
ウエルプレート〔米国ベクトン−デイツキンソン・アン
ド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）社製、フアルコン（Ｆａｌｃ
ｏｎ）３９１２、９６穴プレート〕に５０μｌ／ウエル
の量で４ウエルずつ分注し、４℃の温度で１晩静置する
ことにより、ヒトＩｇＧ型モノクローン抗体をプレート
に吸着させた。各ウエルから溶液を除去したのち、牛胎
児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液を３００μｌ／ウ
エルずつ分注し、３７℃の温度で２時間静置することに
よってヒトＩｇＧ型モノクローン抗体が吸着していない
固相表面のブロッキングを行い、次いで各ウエルを牛胎
児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。ヒト
ＩｇＧ↓1、ヒトＩｇＧ↓2、ヒトＩｇＧ↓3及びヒトＩ
ｇＧ↓4に対するマウスモノクローン抗体〔それぞれイ
スラエル国バイオ・イエダ（Ｂｉｏ−Ｙｅｄａ）社製、
モノクローナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓1：クロー
ンＳＧ−１１（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕ
ｍａｎ ＩｇＧ↓1：Ｃｌｏｎｅ ＳＧ−１１）；モノ
クローナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓2：クローンＨ
Ｐ−６０１４（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕ
ｍａｎ ＩｇＧ↓2：ＣｌｏｎｅＨＰ−６０１４）；モ
ノクローナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓3：クローン
ＨＰ−６０５０（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈ
ｕｍａｎ ＩｇＧ↓3：Ｃｌｏｎｅ ＨＰ−６０５０）
及びモノクローナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓4：ク
ローンＨＰ−２５（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−
ｈｕｍａｎ ＩｇＧ↓4：Ｃｌｏｎｅ ＨＰ−２５）〕
をそれぞれ牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液に
５μｇ／mlの濃度となるように溶解し、得られた４種類
のマウスモノクローン抗体の溶液をそれぞれヒトＩｇＧ
型モノクローン抗体の吸着量が相異なる１１ウエル中に
５０μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃の温度で１時間静
置し、次いで牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液
で各ウエルを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで
標識したマウス免疫グロブリンに対する抗体〔イギリス
国アマシヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、アンチマウス
Ｉｇ，ペルオキシダーゼリンクスド，スピーシーズスペ
シフイック・ホール・アンチボデイ（Ａｎｔｉ−ｍｏｕ
ｓｅ Ｉｇ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌｉｎｋｅｄ，
Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗｈｏｌｅ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ）〕を牛胎児血清を５容量％含有するＰＢ
Ｓ溶液に約２μｇ／mlの濃度となるように溶解し、この
溶液を各ウエルに５０μｌ／ウエルずつ加えたのち、３
７℃の温度で１時間静置した。各ウエルをＰＢＳで洗浄
したのち、各ウエルに２，２′−アジノ−ビス（３−エ
チルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を１ミリモル
／ｌ含有し、かつ過酸化水素を０．００４５重量％含有
するトリス緩衝塩類溶液（pH：７．４）を１００μｌ／
ウエルずつ分注し、室温下で１５分間振盪することによ
って発色操作を行った。各ウエル中の溶液について波長
４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光度を測定し、両波
長における吸光度の差を第５図においてグラフで示す。
Ｔ／Ｇ−５９（５Ｃ）株によって産生されるＡＣｈＲに
対するヒトＩｇＧ型モノクローン抗体はヒトＩｇＧ↓1
に対するマウスモノクローン抗体と特異性に結合したこ
とが第５図から明らかであるから、該ヒトＩｇＧ型モノ
クローン抗体はＩｇＧ↓1サブクラスに属すると判定し
た。
ローン抗体のサブクラスをＥＬＩＳＡ法により決定し
た。すなわち、得られたヒトＩｇＧ型モノクローン抗体
をＰＢＳで希釈してまず５０μｇ／mlの溶液を調製し、
次いでこの濃度より１／２倍ごとの濃度にＰＢＳで希釈
して０．０４９μｇ／mlまでの１１種類の濃度の溶液を
調製した。各濃度の溶液をポリ塩化ビニル製のマイクロ
ウエルプレート〔米国ベクトン−デイツキンソン・アン
ド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）社製、フアルコン（Ｆａｌｃ
ｏｎ）３９１２、９６穴プレート〕に５０μｌ／ウエル
の量で４ウエルずつ分注し、４℃の温度で１晩静置する
ことにより、ヒトＩｇＧ型モノクローン抗体をプレート
に吸着させた。各ウエルから溶液を除去したのち、牛胎
児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液を３００μｌ／ウ
エルずつ分注し、３７℃の温度で２時間静置することに
よってヒトＩｇＧ型モノクローン抗体が吸着していない
固相表面のブロッキングを行い、次いで各ウエルを牛胎
児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。ヒト
ＩｇＧ↓1、ヒトＩｇＧ↓2、ヒトＩｇＧ↓3及びヒトＩ
ｇＧ↓4に対するマウスモノクローン抗体〔それぞれイ
スラエル国バイオ・イエダ（Ｂｉｏ−Ｙｅｄａ）社製、
モノクローナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓1：クロー
ンＳＧ−１１（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕ
ｍａｎ ＩｇＧ↓1：Ｃｌｏｎｅ ＳＧ−１１）；モノ
クローナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓2：クローンＨ
Ｐ−６０１４（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕ
ｍａｎ ＩｇＧ↓2：ＣｌｏｎｅＨＰ−６０１４）；モ
ノクローナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓3：クローン
ＨＰ−６０５０（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈ
ｕｍａｎ ＩｇＧ↓3：Ｃｌｏｎｅ ＨＰ−６０５０）
及びモノクローナル・アンチヒューマンＩｇＧ↓4：ク
ローンＨＰ−２５（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−
ｈｕｍａｎ ＩｇＧ↓4：Ｃｌｏｎｅ ＨＰ−２５）〕
をそれぞれ牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液に
５μｇ／mlの濃度となるように溶解し、得られた４種類
のマウスモノクローン抗体の溶液をそれぞれヒトＩｇＧ
型モノクローン抗体の吸着量が相異なる１１ウエル中に
５０μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃の温度で１時間静
置し、次いで牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液
で各ウエルを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで
標識したマウス免疫グロブリンに対する抗体〔イギリス
国アマシヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、アンチマウス
Ｉｇ，ペルオキシダーゼリンクスド，スピーシーズスペ
シフイック・ホール・アンチボデイ（Ａｎｔｉ−ｍｏｕ
ｓｅ Ｉｇ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌｉｎｋｅｄ，
Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｗｈｏｌｅ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ）〕を牛胎児血清を５容量％含有するＰＢ
Ｓ溶液に約２μｇ／mlの濃度となるように溶解し、この
溶液を各ウエルに５０μｌ／ウエルずつ加えたのち、３
７℃の温度で１時間静置した。各ウエルをＰＢＳで洗浄
したのち、各ウエルに２，２′−アジノ−ビス（３−エ
チルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を１ミリモル
／ｌ含有し、かつ過酸化水素を０．００４５重量％含有
するトリス緩衝塩類溶液（pH：７．４）を１００μｌ／
ウエルずつ分注し、室温下で１５分間振盪することによ
って発色操作を行った。各ウエル中の溶液について波長
４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光度を測定し、両波
長における吸光度の差を第５図においてグラフで示す。
Ｔ／Ｇ−５９（５Ｃ）株によって産生されるＡＣｈＲに
対するヒトＩｇＧ型モノクローン抗体はヒトＩｇＧ↓1
に対するマウスモノクローン抗体と特異性に結合したこ
とが第５図から明らかであるから、該ヒトＩｇＧ型モノ
クローン抗体はＩｇＧ↓1サブクラスに属すると判定し
た。
【００２５】
【発明の効果】 本発明によれば、上記の実施例から明
らかなとおり、新規なハイブリドーマを用いることによ
り、ＡＣｈＲと反応する新規なヒトＩｇＧ↓１型モノク
ローン抗体が効率的に製造される。
らかなとおり、新規なハイブリドーマを用いることによ
り、ＡＣｈＲと反応する新規なヒトＩｇＧ↓１型モノク
ローン抗体が効率的に製造される。
【図１】実施例１の（４）においてヒト型抗体を産生す
る４９種類のハイブリドーマのうちの４４種類のハイブ
リドーマの培養上清を用いた場合に生成した沈殿物（試
料Ｎｏ．１〜４４）及びＧ（Ａｇ↓1）↓2−ｃｌ ７Ｂ
株の培養上清を用いた場合に生成した沈殿物（試料Ｎ
ｏ．４５）の放射活性を示す。
る４９種類のハイブリドーマのうちの４４種類のハイブ
リドーマの培養上清を用いた場合に生成した沈殿物（試
料Ｎｏ．１〜４４）及びＧ（Ａｇ↓1）↓2−ｃｌ ７Ｂ
株の培養上清を用いた場合に生成した沈殿物（試料Ｎ
ｏ．４５）の放射活性を示す。
【図２】実施例１の（６）においてＴ／Ｇ−５９（５
Ｃ）株の培養上清の濃縮液をゲル浸透クロマトグラフィ
ーに付して得られた流出液の波長２８０ｎｍにおける吸
光度及び一部の画分についてＲＩＡ法で測定したＡＣｈ
Ｒに対する抗体価を示す。
Ｃ）株の培養上清の濃縮液をゲル浸透クロマトグラフィ
ーに付して得られた流出液の波長２８０ｎｍにおける吸
光度及び一部の画分についてＲＩＡ法で測定したＡＣｈ
Ｒに対する抗体価を示す。
【図３】実施例１の（６）において得られたヒトＩｇＧ
型モノクローン抗体の電気泳動像を示す。
型モノクローン抗体の電気泳動像を示す。
【図４】ヒトＩｇＧの市販品の電気泳動像を示す。
【図５】実施例１の（７）において発色操作に付して得
られたマイクロウエルプレートの各ウエル中の溶液につ
いて測定した波長４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光
度の差を示す。横軸は各ウエルに分注したヒトＩｇＧ型
モノクローン抗体を含有するＰＢＳ溶液中での該ヒトＩ
ｇＧ型モノクローン抗体の濃度を示す。
られたマイクロウエルプレートの各ウエル中の溶液につ
いて測定した波長４０９ｎｍと５０１ｎｍにおける吸光
度の差を示す。横軸は各ウエルに分注したヒトＩｇＧ型
モノクローン抗体を含有するＰＢＳ溶液中での該ヒトＩ
ｇＧ型モノクローン抗体の濃度を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 高倉 孝一 大阪府大阪市北区梅田１丁目12番39号 株 式会社クラレ内 審査官 鈴木 恵理子 (56)参考文献 特開 昭59−137497（ＪＰ，Ａ) 癌と化学療法，11〜１！（1984）Ｐ. 157〜164 ＳＣＩＥＮＣＥ，215（1982）Ｐ．995− 997
Claims (1)
- 【請求項１】 ニコチン性アセチルコリンレセプターに
対する抗体を産生する能力を有するヒト細胞とＧ（Ａｇ
↓１）↓２−ｃｌ ７Ｂ株（微工研条寄第１７９７号）
とを融合させることによって得られ、ドデシル硫酸ナト
リウムの存在下に実施されるポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により求められる分子量が１８００００±２０
０００であり、かつニコチン性アセチルコリンレセプタ
ーと反応するヒトＩｇＧ↓１型モノクローン抗体を産生
する能力を有するＴ／Ｇ−５９（５Ｃ）株（微工研条寄
第１７９８号）。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62223174A JPH0695949B2 (ja) | 1987-09-08 | 1987-09-08 | ヒトＩｇＧ１型モノクローン抗体 |
| US07/175,304 US5192684A (en) | 1987-09-08 | 1988-03-30 | Human IgG1 monoclonal antibody specific for the nicotinic acetylcholine receptor and hybridoma producing the antibody |
| JP3208955A JPH0771484B2 (ja) | 1987-09-08 | 1991-07-26 | 新規なハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62223174A JPH0695949B2 (ja) | 1987-09-08 | 1987-09-08 | ヒトＩｇＧ１型モノクローン抗体 |
| JP3208955A JPH0771484B2 (ja) | 1987-09-08 | 1991-07-26 | 新規なハイブリドーマ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62223174A Division JPH0695949B2 (ja) | 1987-09-08 | 1987-09-08 | ヒトＩｇＧ１型モノクローン抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05304981A JPH05304981A (ja) | 1993-11-19 |
| JPH0771484B2 true JPH0771484B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=26517140
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62223174A Expired - Lifetime JPH0695949B2 (ja) | 1987-09-08 | 1987-09-08 | ヒトＩｇＧ１型モノクローン抗体 |
| JP3208955A Expired - Lifetime JPH0771484B2 (ja) | 1987-09-08 | 1991-07-26 | 新規なハイブリドーマ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62223174A Expired - Lifetime JPH0695949B2 (ja) | 1987-09-08 | 1987-09-08 | ヒトＩｇＧ１型モノクローン抗体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5192684A (ja) |
| JP (2) | JPH0695949B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4129849A1 (de) * | 1991-02-14 | 1992-08-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoklonale antikoerper gegen humane pankreas-inselzellen |
| US7105159B1 (en) | 1992-11-05 | 2006-09-12 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Antibodies to prostate-specific membrane antigen |
| AU2002356844C1 (en) * | 2001-10-23 | 2010-03-04 | Amgen Fremont Inc. | PSMA antibodies and protein multimers |
| US20050215472A1 (en) | 2001-10-23 | 2005-09-29 | Psma Development Company, Llc | PSMA formulations and uses thereof |
| JP4269064B2 (ja) * | 2003-02-26 | 2009-05-27 | 国立大学法人 千葉大学 | 重症筋無力症の検査方法及びそのための検査薬 |
| US7879913B2 (en) * | 2005-06-28 | 2011-02-01 | Catholic Healthcare West | Iptakalim hydrochloride for decreasing nicotine use |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4464465A (en) * | 1982-04-05 | 1984-08-07 | Genetic Systems Corporation | Cell-driven viral transfer in eukaryotes |
| JPS59137497A (ja) * | 1983-01-20 | 1984-08-07 | ザ・リ−ジエンツ・オブ・ザ・ユニバ−シテイ・オブ・カリフオルニア | 抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
| JPS58216125A (ja) * | 1982-06-09 | 1983-12-15 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト抗体の産生方法 |
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1988
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1991
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| 癌と化学療法，１１〜１！（１９８４）Ｐ．１５７〜１６４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6467199A (en) | 1989-03-13 |
| JPH0695949B2 (ja) | 1994-11-30 |
| JPH05304981A (ja) | 1993-11-19 |
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