WO2016158546A1 - ヒトヘルペスウイルス６ｂ抗原組成物 - Google Patents
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
Definitions
- the present invention relates to an antigen composition of human herpesvirus 6B. Furthermore, the present invention relates to a vaccine comprising an antigen composition of human herpesvirus 6B.
- Herpes virus is a general term for viruses belonging to the family Herpesviridae.
- Human herpesvirus 6 (human herpes virus 6: HHV-6) or 7 (HHV-7) is a double-stranded DNA virus that belongs to the herpesviridae ⁇ -herpesvirus subfamily, and has a sudden rash (Exanthom subitum) Is the cause virus.
- HHV-6 can be classified into two variants, HHV-6A and HHV-6B. In particular, HHV-6B is a cause of sudden rashes in infants.
- HHV-6 The primary target of HHV-6 is lymphocytes of the T cell lineage, but HHV-6B is latently infected in most adults and is the causative virus for sudden rashes in infancy. The pathogenicity of HHV-6A has not been reported yet.
- gQ1 binds to gQ2 and gH / gL complex to form gH / gL / gQ1 / gQ2 (hereinafter referred to as “tetramer complex”). This tetrameric complex is found in the viral envelope.
- Non-patent Documents 1 to 3; FIG. 8 of Non-patent Document 2 disclose that the ligand structure of HHV-6B that functions functionally in binding to CD134 is a dimeric complex (gQ1 / gQ2), and that the tetrameric complex structure is not essential for binding to the receptor.
- Non-Patent Document 4 discloses that analysis on intracellular processing concerning gQ1 and gQ2 was performed.
- Non-Patent Document 2 discloses an analysis result on the U100 gene product and an analysis result on complex formation with gH and gL.
- HHV-6A neutralizing antibodies for gQ1 were produced in HHV-6A
- HHV-6B an antigen composition related to an antibody or antigen-binding fragment having an epitope of a specific amino acid sequence of gQ1 or an antigen or a dimeric complex (gQ1 / gQ2) containing a specific amino acid sequence of gQ1, or the antigen composition
- a vaccine containing a product Patent Document 1
- the dimeric complex (gQ1 / gQ2) cannot produce a sufficient yield as an antigen due to the low survival rate of peptide-expressing cells. Therefore, a suitable antigen is required.
- An object of the present invention is to provide an antigen composition relating to HHV-6B that can be stably and supplied in large quantities and a method for producing the same. It is another object of the present invention to provide a vaccine containing the antigen composition.
- the present inventors can solve the above problems by using a tetrameric complex containing gH, gL, gQ1 and gQ2 among the surface proteins of HHV-6B as an antigen composition.
- the present invention has been completed.
- the present invention comprises the following. (1) An antigen composition of HHV-6B comprising a tetrameric complex containing gH, gL, gQ1 and gQ2 among the surface proteins of HHV-6B. (2) An antigen composition comprising a tetrameric complex, wherein each of gH, gL, gQ1 and gQ2 comprises a polypeptide comprising any amino acid sequence specified in the column “Mode for Carrying Out the Invention” . (3) HHV-6B vaccine containing the antigen composition. (4) A pharmaceutical composition comprising the antigen composition as an active ingredient. (5) A method for producing the antigen composition.
- a tetrameric complex containing gH, gL, gQ1, and gQ2 can provide an antigen composition that can be stably and supplied in large quantities.
- Example 1-1 It is a conceptual diagram which shows the structure of HHV-6B. In particular, it is a conceptual diagram showing the structure of the HHV-6B antigen tetrameric complex.
- Example 1-1 It is a figure which shows the dimer as one example of the embodiment of a HHV-6B antigen tetramer complex, and a comparative example. (Examples 1-1 and 1-6) It is a figure which shows that HHV-6B antigen tetramer complex and gQ1 / gQ2 couple
- Example 1-1 It is a conceptual diagram which shows the preparation method and purification method of a HHV-6B antigen tetramer complex.
- Example 1-2 In the production process of HHV-6B antigen tetramer complex, the protein eluted by Ni-affinity chromatography was subjected to Western blotting and detected using antibodies against gH, gL, gQ1, and gQ2, respectively.
- Example 1-2 It is a figure which shows the result of having used the protein secreted by the culture supernatant of the cell which established the HHV-6B antigen tetramer complex to the western blot, and using the antibody with respect to gH, gL, gQ1, and gQ2.
- Example 1-2 After concentrating the culture supernatant of cells established with the HHV-6B antigen tetramer complex, it is reacted with a protease for cleaving GST fusion protein to cleave the HHV-6B antigen tetramer complex and hIgG1Fc His and put it on a gel filtration column. It is a figure which shows the elution pattern when passing.
- Example 1-2 It is a figure which shows the administration schedule of a HHV-6B antigen tetramer complex to a mouse
- Example 1-3 It is a figure which shows the result of a cellular immunity test as an immunity test of HHV-6B antigen tetramer complex.
- Example 1-5) It is a figure which shows transition of the number of all living cells about a tetramer complex expression cell.
- Example 1-6 It is a figure which shows transition 1 of the number of living cells of a floating cell or an adhesion cell about a tetramer complex expression cell.
- Example 1-6 It is a figure which shows transition 2 of the number of living cells according to a floating cell or an adhesion cell about a tetramer complex expression cell.
- Example 1-6 It is a figure which shows the administration schedule of the HHV-6B antigen to a mouse
- Comparative Example 1-2 It is a figure which shows the ELISA antibody titer measurement result as an immunity test of various HHV-6B antigens of a monomer or a dimer.
- Comparative Example 1-2 It is a figure which shows the administration schedule to a mouse
- Example 2 It is a figure which shows the ELISA antibody titer measurement result as an immunity test for confirmation of the combined use effect of HHV-6B antigen tetramer complex and DPT-IPV.
- Example 2 It is a figure which shows a cellular immunity measurement result as an immunity test for confirmation of the combined use effect of HHV-6B antigen tetramer complex and DPT-IPV.
- the present invention relates to an antigen composition of HHV-6B. Furthermore, the present invention relates to a vaccine comprising an antigen composition of HHV-6B.
- antigen composition refers to a composition for inducing an immune response against a selected antigen in a vertebrate such as a human.
- the antigen composition of HHV-6B is an immunogenic composition related to HHV-6B.
- the antigenic composition is described in detail below, but in the present invention encodes a natural product, synthetic product or genetically engineered protein, peptide, or such protein purified from HHV-6B or HHV-6B It may be a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence.
- the “vaccine” includes the “antigen composition” and refers to a factor that can be administered in vivo to produce an antibody, a factor that can enhance cellular immunity, or produce such a factor. A substance that can be used.
- the term “HHV-6B” includes both wild type and mutant types of human herpesvirus 6B.
- wild type of HHV-6B refers to a type of herpesvirus strain (HHV-6B) isolated from nature that has not been artificially modified. Examples of the HHV-6B wild strain include, but are not limited to, the HST strain.
- the “mutant type” of HHV-6B refers to a type of HHV-6B that has been mutagenized by wild-type mutagenesis or multiple subcultures. In the case of mutagenesis, this mutagenesis may be random mutagenesis or site-directed mutagenesis. Mutant forms also include those obtained by a technique such as gene recombination.
- the HHV-6B antigen composition of the present invention refers to an antigen composition comprising an HHV-6B antigen tetrameric complex containing gH, gL, gQ1 and gQ2 among the surface proteins of HHV-6B (FIGS. 1 and 2). reference).
- gH, gL, gQ1 and gQ2 are one molecule forming the HHV-6B antigen tetramer complex, and the gene for forming each protein can be found in GenBank: NC — 000898.
- the gene encoding gH among the surface proteins of HHV-6B can be identified by, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and gH can be specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. .
- the gene encoding gL can be specified by the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, for example, gL can be specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the gene encoding gQ1 is, for example, the sequence GQ1 can be specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the gene encoding gQ2 can be specified by the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, for example.
- GQ2 can be identified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
- GH, gL, gQ1 and gQ2 used in the antigen composition of the present invention are not limited to substances specified by the above sequences.
- any surface protein may be used as long as it includes a portion that can function as an antigen and the HHV-6B antigen tetrameric complex composed of gH, gL, gQ1, and gQ2 can form a three-dimensional structure.
- gH, gL, gQ1 and gQ2 used in the antigen composition comprising the HHV-6B antigen tetramer complex of the present invention will be described in detail.
- gH gH is one of the proteins forming the HHV-6B antigen tetramer complex of the present invention.
- GH usable as one of the antigen compositions is a polypeptide (10-a) or a polypeptide shown in any one of (10-b) to (10-f) specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 Can be included.
- the polypeptide specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be used.
- the polypeptide specified by any of the following (10-a) to (10-f) may further include the polypeptide specified by SEQ ID NO: 11 (see FIG. 2).
- a polypeptide in which the polypeptide specified by SEQ ID NO: 11 is bound to the polypeptide specified by SEQ ID NO: 10 is the polypeptide specified by SEQ ID NO: 9.
- the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and does not include a signal sequence and includes a portion having an antigenic function as gH.
- the polypeptide specified by SEQ ID NO: 9 is also included in the gH of the present invention.
- gL gL is one of the proteins forming the HHV-6B antigen tetrameric complex of the present invention.
- GL that can be used as one of the antigen compositions is the polypeptide (12-a) or the polypeptide shown in any one of (12-b) to (12-f) specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
- the polypeptide specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 may be used.
- the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and does not include a signal sequence and includes a portion having an antigenic function as gL.
- gQ1 used in the present specification is a protein, and in HHV-6B, the gQ gene encodes a 37 kDa protein and is derived from an alternative splicing transcript.
- gQ1 is one of the proteins forming the HHV-6B antigen tetramer complex of the present invention.
- GQ1 which can be used as one of the antigen compositions, is a polypeptide (13-a) or a polypeptide shown in any one of (13-b) to (13-f) specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
- the polypeptide specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 may be used.
- the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 is a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and does not include a signal sequence and includes a portion having an antigenic function as gQ1.
- GQ2 usable as one of the antigen compositions is a polypeptide (14-a) or a polypeptide shown in any of (14-b) to (14-f) specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
- the polypeptide specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 may be used.
- the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and does not include a signal sequence and includes a portion having an antigenic function as gQ2.
- a vaccine refers to a factor that includes the antigen composition and is administered in vivo to produce antibodies, a factor that can enhance cellular immunity, or a substance that can produce such factors.
- the present invention also extends to a pharmaceutical composition comprising the antigen composition of the present invention as an active ingredient.
- the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above active ingredients.
- the immunological effect of the antigen composition as an active ingredient in the present invention can be confirmed using any method known in the art. Examples of such methods include, but are not limited to, the ELISA method, neutralization method, HI method, RCF method, INF- ⁇ Elispot method, and attack test.
- the “effective amount” of a pharmaceutical composition containing the antigen composition of the present invention as an active ingredient refers to an amount capable of exerting the intended medicinal effect.
- the most effective route for the prevention or treatment of the pharmaceutical composition containing the antigen composition as an active ingredient for example, rectal, intranasal, intradermal, subcutaneous, muscle.
- parenteral administration such as intravenous and intravenous administration and oral administration.
- the dosage form include injections, emulsions, suppositories, patches, nasal drops and capsules, tablets, granules, powders, syrups and the like.
- pharmaceutically acceptable carrier refers to a substance that is used when a pharmaceutical is produced, and that does not adversely affect active ingredients.
- Such pharmaceutically acceptable carriers include, for example, antioxidants, stabilizers, preservatives, antibiotics, colorants, inactivators, isotonic agents, pH adjusters, diluents, emulsifiers, suspensions. Examples include, but are not limited to, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffers, thickeners, delivery vehicles, excipients and / or pharmaceutical adjuvants.
- the pharmaceutical composition containing the antigen composition of the present invention as an active ingredient can be used for the prevention or treatment of diseases caused by HHV-6B (for example, sudden rash etc.), or both.
- the present invention also extends to the method for producing the antigen composition of the present invention.
- the method for producing the antigen composition as a peptide is not particularly limited, and can be produced in the same manner as known per se for peptide synthesis.
- organic synthesis methods solid phase synthesis method, liquid phase synthesis method, etc.
- a genetic recombination technique it can be produced by cell culture.
- the cell that can be used is not particularly limited as long as it can be applied as a host cell to the gene recombination technique.
- animal cells, fungal cells, plant cells, insect cells and prokaryotic cells may be used.
- the gene expression vector, host cell transformation method, cell culture method, purification method and the like are not particularly limited, and a method known per se or any method developed in the future can be applied.
- FIG. 1 One example for the example of the HHV-6B antigen tetramer complex produced in this example is shown in FIG.
- FIG. 1 An example of a dimeric complex as a comparative example is also shown in FIG.
- Example 1-1 Production of HHV-6B Antigen Tetramer Complex
- a method for producing an HHV-6B antigen tetramer complex is described.
- the gQ1, gQ2, gH and gL cDNAs of HHV-6B HST strain with humanized codons were inserted into the pCAGGS-MCS vector to prepare each expression vector.
- the signal sequence and transmembrane region were deleted from the gH cDNA, and the IL-2 signal sequence, human IgG1Fc, PreScission Proteinase cleavage site, and His tag were added.
- gH from which the signal sequence (ss) and transmembrane region (TM) have been deleted is identified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, and human IgG1Fc, PreScission Protease cleavage site and His tag (hIgG1Fc His) are: It is specified by SEQ ID NO: 11.
- GH obtained by binding the polypeptide specified by SEQ ID NO: 11 to the polypeptide specified by SEQ ID NO: 10 is the polypeptide specified by SEQ ID NO: 9, and is referred to as “gH-hIgG1Fc” for convenience in the following examples. There is a case.
- the gQ2 and gL expression vectors prepared in (1) above are amplified by PCR using primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 15 and 16 below, and the product is treated with the restriction enzyme HindIII.
- a gQ2 expression cassette or a gL expression cassette was prepared.
- Primer 1 aca aagctt ATTGATTATTGACTAG (SEQ ID NO: 15)
- Primer 2 aca aagctt GGGCTGCAGGTC (SEQ ID NO: 16)
- each primer consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 19 and 20 below was amplified by PCR, and the product was treated with restriction enzyme XhoI to prepare a neomycin expression cassette.
- Primer 5 acactcgagCAGTGTGGTTTTCAAG (SEQ ID NO: 19)
- Primer 6 acactcgagGGATCCGAACAAACGAC (SEQ ID NO: 20)
- the gQ1 and gQ2 vectors prepared in (4) above and the gH and gL expression vectors prepared in (6) above are mixed, and HEK293sGnTI-cells (ATCC: CRL-3022) using Lipofectamin2000 (Invitrogen) Introduced.
- the introduced cells were cultured in a medium supplemented with 1 ⁇ g / ⁇ L of puromycin, and the cells expressing all 4 genes were cloned by the limiting dilution method to establish 4 gene-expressing cells.
- HHV-6B antigen tetramer complex obtained by reacting the culture supernatant of 4 gene expressing cells with CD134 expressing cells and fusing hIgG1Fc to gH bound to the CD134 expressing cell surface.
- the complex (sometimes referred to as “Fc + ”) was detected by flow cytometry using an anti-Fc fusion protein antibody.
- the secreted HHV-6B antigen bound to CD134, an entry receptor for HHV-6B (FIG. 3).
- Example 1-2 Purification of HHV-6B antigen tetramer complex
- Fc + purification of HHV-6B antigen tetramer complex
- PreScission Protease PreScission Protease: GE-Healthcare
- Protein was purified using a liquid chromatography system (AKTA pure 25) at 4 ° C.
- the elution peak was analyzed by SDS-PAGE, and the elution peak corresponding to the HHV-6B antigen tetramer complex was recovered.
- the HHV-6B antigen tetramer complex eluted as a single peak and could be fractionated (FIG. 7).
- the cation exchange column MonoQ 5/50 GL (GE-Healthcare) was equilibrated with the above buffer A under the condition of 4 ° C. by the liquid chromatography system (AKTA pure 25), and the HHV-6B antigen tetrameric complex (Fc + ) Fraction was added. After washing with 5 mL of buffer A, elute with a concentration gradient from buffer A to buffer B (20 mM Tris-HCl pH8.0, 1 M NaCl), equivalent to HHV-6B antigen tetramer complex (Fc + ) A peak was collected.
- Pentobarbital Somnopentyl: 50 mg / mL 100 ⁇ L was administered to the abdominal cavity of the mouse, and blood was collected under anesthesia (23G needle, 1 mL syringe), and the spleen was collected. Approximately 1 mL of blood was placed in a 1.5 mL tube, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and centrifuged at 14000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes. Serum (upper layer) was transferred to another 1.5-mL tube, inactivated in a block incubator at 56 ° C for 30 minutes, and used for antibody titer measurement.
- the spleen was transported on ice in a 50 mL tube containing 20 mL of RPMI medium. Mononuclear cells were collected by density gradient centrifugation using Ficoll-conray solution and used for measurement of cellular immunity.
- the antibody titer against the HHV-6B antigen was measured by the indirect fluorescent antibody method (IFA) for the serum.
- IFA indirect fluorescent antibody method
- HHV-6B HST strain-infected MT4 cells Cell to cell 4th day cells, late protein expression confirmed
- tetrameric complex-expressing 293T cells were used for antigen plates.
- An antigen plate with tetrameric complex-expressing 293T cells was prepared by the following method. 293T cells are seeded in 2 ⁇ 10 6 cells / 12 mL DMEM: 8% FBS in a 10 cm dish, and transferred to the next day by calcium phosphate method. After the transfection, the cells were collected on the third day of culture to prepare an antigen plate (the expression of each protein was confirmed using anti-gH, gL, gQ1, and gQ2 antibodies).
- Mouse serum diluted serially (10-1280 times) with PBS / 2% BSA was placed on each antigen plate and allowed to react by incubation at 37 ° C. for 30 minutes. Each plate was washed with PBS / 0.02% Tween20 and dried. A secondary antibody (using 100-fold diluted FITC conjugate rabbit anti-mouse IgG) was put on, reacted at 37 ° C. for 20 minutes, washed with PBS / 0.02% Tween 20, and dried. Encapsulated and observed for fluorescence under a fluorescence microscope. The antibody dilution was defined as the maximum dilution of mouse serum that allows observation of fluorescence. HHV-6B antigen tetrameric complexes (Fc +) in mice treated with antibody production against HHV-6B antigen tetrameric complexes (Fc +) was confirmed.
- Example 1-4 Immunity test of HHV-6B antigen tetramer complex (neutralizing antibody titer) Using the serum obtained in Example 1-3 as a sample, the neutralizing antibody titer of HHV-6B antigen tetramer complex (Fc + ) produced in the serum was measured.
- the mouse serum obtained in Example 1-3 was serially diluted (40 to 1280 times) in RPMI medium containing 3% FBS. 100 ⁇ L of HHV-6B (HST strain) virus solution was added to 100 ⁇ L of diluted serum and reacted at 37 ° C. for 30 minutes (rocking every 10 minutes).
- 3 ⁇ 10 6 MT4 cells were suspended in 1 mL of FBS-containing RPMI medium, and 10 ⁇ L of each mouse serum + virus solution (3 ⁇ 10 4 cells) was added. Infection was performed by centrifugation at 490 ⁇ g, 40 minutes, at 35 ° C. Cells were transferred to a square-bottom 96-well plate and pelleted down at 490 xg for 5 minutes at room temperature. The cell pellet was washed with 200 ⁇ L of 3% FBS-containing RPMI medium. The cell pellet was suspended by adding 200 ⁇ L of 3% FBS-containing RPMI medium, transferred to a 96-well plate (flat bottom), and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 4 days.
- the infected cells were transferred to a square-bottom 96-well plate and centrifuged at 490 ⁇ g ⁇ 5 min ⁇ room temperature, and the supernatant was aspirated leaving about 20 ⁇ L of culture broth. All cells are collected and suspended in 30 ⁇ L of 5 ⁇ sample buffer (including 2ME), and HHV-6B protein IE1 is detected by Western blot (anti-BIE1 ⁇ 1000, anti- ⁇ -tubulin ⁇ 10000 as internal control). The presence or absence of infection was confirmed. The maximum dilution ratio of mouse serum in which IE1 was not detected was defined as neutralizing antibody titer. Neutralizing antibody production against HHV-6B was confirmed in mice administered with HHV-6B antigen tetrameric complex (Fc + ).
- Example 1-5 Immunity test of HHV-6B antigen tetramer complex (cellular immunity) Cellular immunity was measured in mice administered with HHV-6B antigen tetrameric complex (Fc + ). IFN- ⁇ Elispot assay was performed using mouse spleen-derived mononuclear cells collected by the same method as in Example 1-3. The number of IFN- ⁇ producing cells was measured using HHV-6B or varicella virus (VZV) as a stimulating factor. In mice administered with the HHV-6B antigen tetramer complex (Fc + ), IFN- ⁇ was produced by stimulation with HHV-6B (FIG. 9).
- VZV varicella virus
- Example 1-6 Transition of cells into which HHV-6B antigen tetrameric complex has been introduced
- Cells into which HHV-6B antigen tetrameric complex (Fc + ) has been introduced (tetrameric complex expressing cells), and gQ1-hIgG1FcQ1 The number of viable cells at the time of culture of cells (gQ1 / Q2 expressing cells) into which / Q2 (see FIG. 2) was introduced was compared.
- HEK293T cells were used as a control. As each cell concentration of 1 ⁇ 10 5 / well, 2 ⁇ 10 5 / well, 3 ⁇ 10 5 / well, 5 ⁇ 10 5 / well, were seeded in 6-well plates.
- sequence cDNAs of gH2, gL, and gQ1 of HHV-6B HST strain with humanized codons, and gQ2 with sbp (streptavidin binding peptide sequence) tag consisting of a streptavidin binding peptide sequence were prepared.
- Each cDNA containing gH or gQ1 was inserted into a pCAGGS-MCS vector to prepare each expression vector.
- gL and gQ2 expression cassettes (including promoter and polyA sequence) were amplified and inserted into plasmids incorporating gH and gQ1, respectively, using HindIII.
- expression plasmids (gH-expression plasmid, gH / gL-expression plasmid, gQ1-expression plasmid, gQ1 / gQ2-expression plasmid) containing each of the four genes were prepared.
- Expression plasmids containing each of the four genes were introduced into 293T cells using the calcium phosphate method and cultured. After 2 days of culture, the cells were collected and solubilized with TNE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.8], 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [Nacalai Tesque]) containing protease inhibitors (Sigma). Streptavidin sepharose (GE Healthcare) cross-linked with an antibody against gH or gQ1 was added to the solubilized cells and reacted at 4 ° C. for 8 hours.
- TNE buffer 10 mM Tris-HCl [pH 7.8], 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [Nacalai Tesque]
- Streptavidin sepharose GE Healthcare
- cross-linked with an antibody against gH or gQ1 was added to the solubilized cells and reacted at 4 ° C. for
- Sepharose was washed with TNE buffer, and the HHV-6B antigens gH, gH / gL, gQ1 and gQ1 / gQ2 were eluted with 8 mM biotin solution.
- the eluate was replaced with PBS with Millipore (TM) Amicon (TM) 30 (Millipore), and each antigen was purified.
- each antigen sample was subcutaneously administered to the back of a mouse (BALB / c, female, 4 weeks old, 3 mice in each group, Control: PBS) using a 23G needle and 1 mL syringe.
- the administration schedule was 3 times in total, 0, 4, and 8 weeks. Blood was collected 4 weeks after the third administration (FIG. 13).
- Pentobarbital Somnopentyl: 50 mg / mL 100 ⁇ L was administered into the abdominal cavity of the mouse, and blood was collected under anesthesia (23G needle, 1 mL syringe). Approximately 1 mL of blood was placed in a 1.5 mL tube, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and centrifuged at 14000 rpm at 4 ° C. for 30 minutes. Serum (upper layer) was transferred to another 1.5-mL tube and inactivated with a block incubator at 56 ° C for 30 minutes, and used as a test sample for confirmation of immunity induction ability.
- the HHV-6B antigen tetramer complex used for ELISA was prepared by the following method.
- the sequence cDNA of gH2, gL, and gQ1 of HHV-6B HST strain with humanized codons and gQ2 with sbp (streptavidin binding peptide sequence) tag composed of streptavidin binding peptide sequence was prepared.
- Each cDNA containing gH or gQ1 was inserted into a pCAGGS-MCS vector to prepare each expression vector.
- gL and gQ2 expression cassettes were amplified and inserted into plasmids incorporating gH and gQ1, respectively, using HindIII.
- Two types of expression plasmids were introduced into 293T cells using the calcium phosphate method, and after 2 days in culture, the cells were collected and TNE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.8], 0.15 M NaCl, containing protease inhibitors (Sigma) was collected. 1 mM EDTA, 1% NP40 [Nacalai Tesque]). Streptavidin sepharose (GE Healthcare) was added to the solubilized cells and reacted at 4 ° C.
- the cells were cultured in RPMI (3% FBS), and the cells were collected after 1 day.
- the neutralizing antibody titer was measured by the indirect fluorescent antibody method (IFA) using an antibody against IE1 (Table 4).
- IFA indirect fluorescent antibody method
- Example 2 Confirmation of combined effect of HHV-6B antigen tetramer complex and DPT-IPV
- the HHV-6B antigen tetramer complex of the present invention and DPT- which is a known four-type mixed vaccine, are used.
- DPT-IPV is a preventive vaccine against diphtheria, pertussis, tetanus and polio, and has been confirmed to have antibody-inducing ability for tetanus and pertussis.
- the HHV-6B antigen tetramer complex of the present invention was prepared by the same method as in Example 1 except that it did not contain the hIgG1Fc portion of gH.
- the HHV-6B antigen tetramer complex that does not contain gH hIgG1Fc used in this Example is referred to as HHV-6B antigen tetramer complex (Fc ⁇ ).
- HHV-6B antigen tetrameric complexes (Fc -) and pentathlon combination vaccine containing DPT-IPV, DPT-IPV alone, HHV-6B antigen tetrameric complexes (Fc -) using a mouse ( BALB / c, female, 4 weeks old) was subjected to immunity induction treatment (7 mice in each group).
- HHV-6B antigen tetramer complex (Fc ⁇ ) was administered at 100 ⁇ g
- DPT-IPV was administered at 1/8 of the human dose.
- Each vaccine was subcutaneously administered 500 ⁇ L on the back of a mouse (BALB / c, female, 4 weeks old, 7 mice in each group, Control: PBS).
- Example 1-3 Blood samples were collected by the same method as in Example 1-3 at the start of administration, 2, 6, 12, and 18 weeks, and whole blood was collected at 20 weeks (FIG. 15). The collected blood was processed by the same method as in Comparative Example 1 to prepare a test sample for confirmation of immunity induction ability.
- the HHV-6B antigen tetramer complex containing gH, gL, gQ1 and gQ2 among the surface proteins of HHV-6B provides an antigen composition that can be supplied stably and in large quantities. Yes. Since an antigen composition can be stably and supplied in large quantities, a vaccine or a pharmaceutical composition containing such an antigen composition can be stably supplied, which is industrially advantageous.
- GenBank nucleotide sequence of gene encoding gH based on NC_000898 information
- GenBank amino acid sequence of gH based on NC_000898 information
- GenBank gene encoding gL based on NC_000898 information
- GenBank gene encoding gL based on NC_000898 information
- GenBank base sequence of gene encoding gQ1 based on NC_000898 information
- GenBank gQ1 based on NC_000898 information
- Amino acid sequence SEQ ID NO: 7)
- GenBank nucleotide sequence of a gene encoding gQ2 based on NC_000898 information
- GenBank gQ2 amino acid sequence based on NC_000898 information
- GH amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) hIgG1Fc amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) Among amino acid sequences specified by SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of gL from which the signal sequence was deleted (SEQ ID NO: 13) specified by SEQ ID NO: 6 GQ1 amino acid sequence from which the signal sequence was deleted (SEQ ID NO: 14) Among the amino acid sequences identified from SEQ ID NO: 8, the amino acid sequence of gQ2 from which the signal sequence was deleted (SEQ ID NO: 15) Primer 1 Sequence (SEQ ID NO: 16) Sequence specifying primer 2 (SEQ ID NO: 17) Sequence specifying primer 3 (SEQ ID NO: 18) Sequence specifying primer 4 (SEQ ID NO: 19) Sequence specifying primer 5 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 20) Sequence specifying primer 6
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Abstract
ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（HHV-6B）に関する、安定的かつ大量供給が可能な抗原組成物を提供する。さらに上記抗原組成物を含むワクチンを提供する。さらには、上記抗原組成物の作製方法を提供する。HHV-6Bの表面タンパク質のうちgH、gL、gQ1及びgQ2を含むHHV-6B抗原四量複合体を抗原組成物とすることによる。HHV-6B抗原四量複合体によれば、安定的かつ大量供給が可能な抗原組成物を提供しうる。抗原組成物が安定的かつ大量供給できることから、係る抗原組成物を含むワクチンや医薬組成物を安定に供給することができ、産業上有利である。
Description
本発明は、ヒトヘルペスウイルス６Ｂの抗原組成物に関する。さらにはヒトヘルペスウイルス６Ｂの抗原組成物を含むワクチンに関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2015-069965号優先権を請求する。
ヘルペスウイルスとは、ヘルペスウイルス科に属するウイルスの総称である。ヒトヘルペスウイルス６（human herpes virus 6: HHV-6）又は７（HHV-7）は、いずれもヘルペスウイルス科βヘルペスウイルス亜科に属する２本鎖DNAウイルスであり、突発性発疹（Exanthom subitum）の原因ウイルスである。HHV-6は２種の変種としてHHV-6A及びHHV-6Bに分類することができる。特にHHV-6Bは、乳幼児の突発性発疹の原因とされている。HHV-6Bによる乳幼児の脳炎は我が国で年間150-200例であり、その50％に神経学的後遺症を残すことが知られているが、これまでに有効な制御法は開発されていなかった。近年、HHV-6Bの表面タンパク質の一種として知られるgQ1における特定のアミノ酸配列が、HHV-6B特異的な中和抗体を誘導することが明らかになり、該配列を含む抗原を利用したHHV-6Bワクチンの開発が期待されてきた。特に表面タンパク質gQ1とgQ2の複合体である二量複合体（gQ1/gQ2）は、HHV-6Bの細胞侵入に必要なリガンド部位として公知であり、HHV-6Bワクチン抗原の有効な候補となり得ると考えられてきた。
HHV-6の主要な標的はT細胞系統のリンパ球とされているが、HHV-6Bは、ほとんどの成人に潜伏感染しており、乳幼児期の突発性発疹の原因ウイルスである。HHV-6Aに関してはその病原性はまだ報告されていない。HHV-6に感染した細胞では、gQ1はgQ2及びgH/gL複合体に結合してgH/gL/gQ1/gQ2（以下「四量複合体」という。）を形成する。この四量複合体は、ウイルスエンベロープにおいて見出される。HHV-6Aの四量複合体はヒトCD46に結合し、HHV-6BのものはヒトCD134に結合するとされている（非特許文献１～３；非特許文献２の図８参照）。また、CD134との結合において機能的に働くHHV-6Bのリガンド構造は二量複合体（gQ1/gQ2）であって、四量複合体構造はレセプターとの結合に必須な構造でないことが知られている（非特許文献４）。非特許文献１は、gQ1及びgQ2に関する細胞内プロセシングに関する分析を行なったことを開示する。非特許文献２は、U100遺伝子産物についての解析並びにgH及びgLとの複合体形成に関する分析結果を開示する。
HHV-6AにおいてgQ1についての中和抗体が作製されたことは知られている（特許文献１）。一方、HHV-6Bにおいて、gQ1の特定アミノ酸配列をエピトープとする抗体又は抗原結合性断片やgQ1の特定アミノ酸配列を含む抗原や二量複合体（gQ1/gQ2）に関する抗原組成物や、当該抗原組成物を含むワクチンについて開示がある（特許文献１）。しかしながら、gQ1の特定アミノ酸配列を含む抗原は安定したペプチド発現量を得るのが困難である。例えば二量複合体（gQ1/gQ2）は、ペプチド発現細胞の生存率が低いことに起因して、抗原としては十分な収量が得られないため、安定的かつ大量供給が求められるワクチンの製造のために適した抗原が求められている。
Journal of Virology, 2004, Vol. 78(15) pp. 7969-7983
Journal of Virology, 2003, Vol. 77(4) pp. 2452-2458
Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 May 28; 110(22): 9096-9099
Journal of Virology, 2014, Vol. 88(18) pp. 10875-10882
Cellular Microbiology, 2009, 11(7), 1001-1006
Journal of Virology, 1993, Vol. 67(8) pp. 4611-4620
Journal of Virology, 2004, Vol. 78(9) pp. 4609-4616
本発明は、HHV-6Bに関する、安定的かつ大量供給が可能な抗原組成物とその作製方法を提供することを課題とする。さらに上記抗原組成物を含むワクチンを提供することを課題とする。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、HHV-6Bの表面タンパク質のうちgH、gL、gQ1及びgQ2を含む四量複合体を抗原組成物とすることで、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、すなわち以下よりなる。
（１）HHV-6Bの抗原組成物であって、HHV-6Bの表面タンパク質のうち、gH、gL、gQ1及びgQ2を含む四量複合体からなる抗原組成物。
（２）gH、gL、gQ1及びgQ2が、各々、「発明を実施するための形態」の欄で特定されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、四量複合体からなる抗原組成物。
（３）前記抗原組成物を含むHHV-6Bワクチン。
（４）前記抗原組成物を有効成分として含む、医薬組成物。
（５）前記抗原組成物の作製方法。
（１）HHV-6Bの抗原組成物であって、HHV-6Bの表面タンパク質のうち、gH、gL、gQ1及びgQ2を含む四量複合体からなる抗原組成物。
（２）gH、gL、gQ1及びgQ2が、各々、「発明を実施するための形態」の欄で特定されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、四量複合体からなる抗原組成物。
（３）前記抗原組成物を含むHHV-6Bワクチン。
（４）前記抗原組成物を有効成分として含む、医薬組成物。
（５）前記抗原組成物の作製方法。
HHV-6Bの表面タンパク質のうち、gH、gL、gQ1及びgQ2を含む四量複合体によれば、安定的かつ大量供給が可能な抗原組成物を提供しうる。これにより、従来公知の二量複合体（gQ1/gQ2）に関する抗原組成物と比較してより優れた中和抗体誘導能を有する抗原組成物を得ることができた。
本発明は、HHV-6Bの抗原組成物に関する。さらにはHHV-6Bの抗原組成物を含むワクチンに関する。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。本明細書において「抗原組成物」とは、選択された抗原に対する免疫応答をヒトなどの脊椎動物において誘発するための組成物をいう。HHV-6Bの抗原組成物とは、HHV-6Bに関する免疫原組成物である。抗原組成物は以下に詳述するが、本発明においてはHHV-6B又はHHV-6Bから精製された天然の産生物、合成生成物又は遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、又はそのようなタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子であってもよい。本明細書において「ワクチン」とは、前記「抗原組成物」を含み、生体内に投与されて、抗体を産生しうる因子、細胞性免疫能を増強しうる因子をいい、又は係る因子を産生しうる物質をいう。
本明細書において使用される場合、用語「HHV-6B」は、ヒトヘルペスウイルス６Ｂの野生型、変異型のいずれをも含む。本明細書において、HHV-6Bの「野生株型」とは、人工的な改変を受けていない、天然より単離されたヘルペスウイルス株（HHV-6B）の型をいう。HHV-6B野生株の例としてHST株が挙げられるが、これに限定されない。本明細書においてHHV-6Bの「変異型」とは、野生型に変異誘発、多数回の継代培養などによって変異誘発をしたHHV-6Bの型をいう。変異誘発する場合、この変異誘発は、ランダムな変異導入であっても、部位特異的変異導入であってもよい。また、変異型には遺伝子組換え等の手法により得られたものも含まれる。
本発明のHHV-6Bの抗原組成物は、HHV-6Bの表面タンパク質のうちgH、gL、gQ1及びgQ2を含むHHV-6B抗原四量複合体からなる抗原組成物をいう（図１及び図２参照）。gH、gL、gQ1及びgQ2は、HHV-6B抗原四量複合体を形成する１つの分子であり、各タンパク質を形成するための遺伝子はGenBank：NC_000898において見出すことができる。
本明細書において、HHV-6Bの表面タンパク質のうちgHをコードする遺伝子は、例えば配列番号１に示す塩基配列で特定することができ、gHは配列番号２に示すアミノ酸配列で特定することができる。同様に、gLをコードする遺伝子は、例えば配列番号３に示す塩基配列で特定することができ、gLは配列番号４に示すアミノ酸配列で特定することができ、gQ1をコードする遺伝子は、例えば配列番号５に示す塩基配列で特定することができ、gQ1は配列番号６に示すアミノ酸配列で特定することができ、gQ2をコードする遺伝子は、例えば配列番号７に示す塩基配列で特定することができ、gQ2は配列番号８に示すアミノ酸配列で特定することができる。本発明の抗原組成物に使用されるgH、gL、gQ1及びgQ2は、上記配列で特定される物質に限定されるものではない。例えば各表面タンパク質について抗原として機能しうる部分を含み、gH、gL、gQ1及びgQ2からなるHHV-6B抗原四量複合体が立体構造を形成しうるものであればよい。以下、本発明のHHV-6B抗原四量複合体からなる抗原組成物に使用されるgH、gL、gQ1及びgQ2について詳述する。
（１）gHについて
gHは、本発明のHHV-6B抗原四量複合体を形成するタンパク質の１つである。抗原組成物の１つとして使用可能なgHは、配列番号１０に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチド（１０－ａ）又は（１０－ｂ）～（１０－ｆ）のいずれかに示すポリペプチドを含むことができる。例えば配列番号２に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチドであってもよい。以下の（１０－ａ）～（１０－ｆ）のいずれかに示すポリペプチドにさらに配列番号１１で特定されるポリペプチドが含まれていてもよい（図２参照）。例えば配列番号１０で特定されるポリペプチドに配列番号１１で特定されるポリペプチドが結合したポリペプチドは、配列番号９で特定されるポリペプチドである。配列番号１０に示すアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列であって、シグナル配列を含まず、gHとしての抗原性の機能を有する部分を含むアミノ酸配列である。本明細書において、配列番号９で特定されるポリペプチドも本発明のgHに包含される。
gHは、本発明のHHV-6B抗原四量複合体を形成するタンパク質の１つである。抗原組成物の１つとして使用可能なgHは、配列番号１０に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチド（１０－ａ）又は（１０－ｂ）～（１０－ｆ）のいずれかに示すポリペプチドを含むことができる。例えば配列番号２に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチドであってもよい。以下の（１０－ａ）～（１０－ｆ）のいずれかに示すポリペプチドにさらに配列番号１１で特定されるポリペプチドが含まれていてもよい（図２参照）。例えば配列番号１０で特定されるポリペプチドに配列番号１１で特定されるポリペプチドが結合したポリペプチドは、配列番号９で特定されるポリペプチドである。配列番号１０に示すアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列の部分配列であって、シグナル配列を含まず、gHとしての抗原性の機能を有する部分を含むアミノ酸配列である。本明細書において、配列番号９で特定されるポリペプチドも本発明のgHに包含される。
（１０－ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１０－ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１０－ｃ）配列番号１０をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１０－ｄ）配列番号１０に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１０－ｅ）（１０－ａ）～（１０－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１０－ｆ）（１０－ａ）～（１０－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
（１０－ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１０－ｃ）配列番号１０をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１０－ｄ）配列番号１０に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１０－ｅ）（１０－ａ）～（１０－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１０－ｆ）（１０－ａ）～（１０－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
（２）gLについて
gLは、本発明のHHV-6B抗原四量複合体を形成するタンパク質の１つである。抗原組成物の１つとして使用可能なgLは、配列番号１２に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチド（１２－ａ）又は（１２－ｂ）～（１２－ｆ）のいずれかに示すポリペプチドを含むことができる。例えば配列番号４に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチドであってもよい。ここで、配列番号１２に示すアミノ酸配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列の部分配列であって、シグナル配列を含まず、gLとしての抗原性の機能を有する部分を含むアミノ酸配列である。
gLは、本発明のHHV-6B抗原四量複合体を形成するタンパク質の１つである。抗原組成物の１つとして使用可能なgLは、配列番号１２に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチド（１２－ａ）又は（１２－ｂ）～（１２－ｆ）のいずれかに示すポリペプチドを含むことができる。例えば配列番号４に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチドであってもよい。ここで、配列番号１２に示すアミノ酸配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列の部分配列であって、シグナル配列を含まず、gLとしての抗原性の機能を有する部分を含むアミノ酸配列である。
（１２－ａ）配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１２－ｂ）配列番号１２に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１２－ｃ）配列番号１２をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１２－ｄ）配列番号１２に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１２－ｅ）（１２－ａ）～（１２－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１２－ｆ）（１２－ａ）～（１２－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
（１２－ｂ）配列番号１２に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１２－ｃ）配列番号１２をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１２－ｄ）配列番号１２に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１２－ｅ）（１２－ａ）～（１２－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１２－ｆ）（１２－ａ）～（１２－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
（３）gQ1について
本明細書で使用される「gQ」とはタンパク質であって、HHV-6Bでは、gQ遺伝子は37kDaタンパク質をコードするものであり、オルタナティブスプライシング転写物に由来するものである。gQ1は、本発明のHHV-6B抗原四量複合体を形成するタンパク質の１つである。抗原組成物の１つとして使用可能なgQ1は、配列番号１３に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチド（１３－ａ）又は（１３－ｂ）～（１３－ｆ）のいずれかに示すポリペプチドを含むことができる。例えば配列番号６に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチドであってもよい。ここで、配列番号１３に示すアミノ酸配列は、配列番号６に示すアミノ酸配列の部分配列であって、シグナル配列を含まず、gQ1としての抗原性の機能を有する部分を含むアミノ酸配列である。
本明細書で使用される「gQ」とはタンパク質であって、HHV-6Bでは、gQ遺伝子は37kDaタンパク質をコードするものであり、オルタナティブスプライシング転写物に由来するものである。gQ1は、本発明のHHV-6B抗原四量複合体を形成するタンパク質の１つである。抗原組成物の１つとして使用可能なgQ1は、配列番号１３に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチド（１３－ａ）又は（１３－ｂ）～（１３－ｆ）のいずれかに示すポリペプチドを含むことができる。例えば配列番号６に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチドであってもよい。ここで、配列番号１３に示すアミノ酸配列は、配列番号６に示すアミノ酸配列の部分配列であって、シグナル配列を含まず、gQ1としての抗原性の機能を有する部分を含むアミノ酸配列である。
（１３－ａ）配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１３－ｂ）配列番号１３に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１３－ｃ）配列番号１３をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１３－ｄ）配列番号１３に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１３－ｅ）（１３－ａ）～（１３－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１３－ｆ）（１３－ａ）～（１３－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
（１３－ｂ）配列番号１３に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１３－ｃ）配列番号１３をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１３－ｄ）配列番号１３に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１３－ｅ）（１３－ａ）～（１３－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１３－ｆ）（１３－ａ）～（１３－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
（４）gQ2について
gQ2は、本発明のHHV-6B抗原四量複合体を形成するタンパク質の１つである。抗原組成物の１つとして使用可能なgQ2は、配列番号１４に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチド（１４－ａ）又は（１４－ｂ）～（１４－ｆ）のいずれかに示すポリペプチドを含むことができる。例えば配列番号８に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチドであってもよい。ここで、配列番号１４に示すアミノ酸配列は、配列番号８に示すアミノ酸配列の部分配列であって、シグナル配列を含まず、gQ2としての抗原性の機能を有する部分を含むアミノ酸配列である。
gQ2は、本発明のHHV-6B抗原四量複合体を形成するタンパク質の１つである。抗原組成物の１つとして使用可能なgQ2は、配列番号１４に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチド（１４－ａ）又は（１４－ｂ）～（１４－ｆ）のいずれかに示すポリペプチドを含むことができる。例えば配列番号８に示すアミノ酸配列で特定されるポリペプチドであってもよい。ここで、配列番号１４に示すアミノ酸配列は、配列番号８に示すアミノ酸配列の部分配列であって、シグナル配列を含まず、gQ2としての抗原性の機能を有する部分を含むアミノ酸配列である。
（１４－ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１４－ｂ）配列番号１４に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１４－ｃ）配列番号１４をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１４－ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１４－ｅ）（１４－ａ）～（１４－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１４－ｆ）（１４－ａ）～（１４－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
（１４－ｂ）配列番号１４に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１４－ｃ）配列番号１４をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１４－ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１４－ｅ）（１４－ａ）～（１４－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１４－ｆ）（１４－ａ）～（１４－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチドであり得る。
本明細書においてワクチンとは、前記抗原組成物を含み、生体内に投与されて、抗体を産生しうる因子、細胞性免疫能を増強しうる因子をいい、又は係る因子を産生しうる物質をいう。本発明は、本発明の抗原組成物を有効成分として含む医薬組成物にも及ぶ。本発明の医薬組成物には上記有効成分の他、薬学的に受容可能な担体を含むことができる。
本発明における有効成分としての抗原組成物の免疫学的な効果は、当該分野において公知の任意の方法を用いて確認することができる。そのような方法としては、例えば、ELISA法、中和法、HI法、RCF法、INF-γ Elispot法、攻撃試験等が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、本発明の抗原組成物を有効成分として含む医薬組成物の「有効量」とは、その有効成分が目的とする薬効を発揮することができる量をいう。
本明細書において、抗原組成物を有効成分として含む医薬組成物の投与経路は、予防又は治療に際し最も効果的なものを使用するのが好ましく、例えば直腸内、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口投与や経口投与が挙げられる。投与形態としては、注射剤、乳剤、座剤、貼付剤、点鼻剤やカプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。
本明細書において「薬学的に受容可能な担体」は、医薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能な担体としては、例えば、抗酸化剤、安定剤、保存剤、抗生物質、着色剤、不活化剤、等張化剤、pH調節剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、増粘剤、送達ビヒクル、賦形剤及び／又は薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明の抗原組成物を有効成分として含む医薬組成物は、HHV-6Bに起因する疾患（例えば、突発性発疹等）の予防又は治療、あるいはその両方に使用することができる。
本発明は、上記本発明の抗原組成物の製造方法にも及ぶ。ペプチドとしての抗原組成物の製造方法は特に制限されず、ペプチドを合成する自体公知の方法と同様にして製造することができ、例えば、有機合成法（固相合成法、液相合成法等）及び生化学的合成法、遺伝子組換法等によって合成することができる。遺伝子組換えの手法による場合は、細胞培養により製造することができる。使用可能な細胞は、遺伝子組換の手法に宿主細胞として適用可能な細胞であればよく、特に限定されない。例えば動物細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞や原核細胞等であっても良い。遺伝子発現ベクター、宿主細胞の形質転換方法、細胞培養方法、精製方法等は、特に限定されるものではなく、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。なお、HHV-6Bに存在する特異的なタンパク質の概念を図１に示した。本実施例で作製するHHV-6B抗原四量複合体の実施例用の１例を図２に示した。又比較例としての二量複合体の例も図２に示した。
（実施例１－１）HHV-6B抗原四量複合体の作製
本実施例では、HHV-6B抗原四量複合体の作製方法について説明する。
本実施例では、HHV-6B抗原四量複合体の作製方法について説明する。
（１）コドンをヒト化したHHV-6B HST株のgQ1、gQ2、gH及びgLのcDNAそれぞれをpCAGGS-MCSベクターに挿入し、各発現ベクターを作製した。gHのcDNAではシグナル配列とトランスメンブレン領域を削除し、IL-2のシグナル配列とhuman IgG1FcとPreScission Protease cleavage siteとHis tagを付加した。本実施例において、シグナル配列（ss）とトランスメンブレン領域（TM）を削除したgHは、配列番号１０に示すアミノ酸配列で特定され、human IgG1FcとPreScission Protease cleavage siteとHis tag（hIgG1Fc His）は、配列番号１１で特定される。配列番号１０で特定されるポリペプチドに配列番号１１で特定されるポリペプチドを結合させたgHは配列番号９で特定されるポリペプチドであり、以下の実施例では、便宜上「gH-hIgG1Fc」という場合がある。
（２）上記（１）で作製したgQ2及びgL発現ベクターを、下記の配列番号１５及び１６に示す塩基配列からなる各プライマーを用いてPCR法で増幅し、その産物を制限酵素HindIIIで処理し、gQ2発現カセット又はgL発現カセットを作製した。
プライマー１: acaaagcttATTGATTATTGACTAG（配列番号１５）
プライマー２: acaaagcttGGGCTGCAGGTC（配列番号１６）
プライマー１: acaaagcttATTGATTATTGACTAG（配列番号１５）
プライマー２: acaaagcttGGGCTGCAGGTC（配列番号１６）
（３）上記（１）で作製したgQ1及びgH発現ベクターを各々制限酵素HindIIIで処理した。上記（２）で作製したgQ2発現カセットをgQ1発現ベクターと、gL発現カセットをgH発現ベクターと、各々ライゲーションした。pPurベクターをテンプレートとし、下記の配列番号１７及び１８に示す塩基配列からなる各プライマーを用いてPCR法で増幅し、その産物を制限酵素XhoIで処理し、ピューロマイシン発現カセットを作製した。
プライマー３: acactcgagTTGTGTCAGTTAGGGTG（配列番号１７）
プライマー４: acactcgagagACATGATAAGATAC（配列番号１８）
プライマー３: acactcgagTTGTGTCAGTTAGGGTG（配列番号１７）
プライマー４: acactcgagagACATGATAAGATAC（配列番号１８）
（４）上記（３）で作製したgQ1、gQ2発現ベクターを制限酵素SalIで処理し、ピューロマイシン発現カセットとライゲーションした。
（５）pMC1neoベクターをテンプレートとし、下記の配列番号１９及び２０に示す塩基配列からなる各プライマーを用いてPCR法で増幅し、その産物を制限酵素XhoIで処理し、ネオマイシン発現カセットを作製した。
プライマー５: acactcgagCAGTGTGGTTTTCAAG（配列番号１９）
プライマー６: acactcgagGGATCCGAACAAACGAC（配列番号２０）
プライマー５: acactcgagCAGTGTGGTTTTCAAG（配列番号１９）
プライマー６: acactcgagGGATCCGAACAAACGAC（配列番号２０）
（６）上記（３）で作製したgH、gL発現ベクターを制限酵素SalIで処理し、ネオマイシン発現カセットとライゲーションした。
（７）上記（４）で作製したgQ1、gQ2ベクターと、上記（６）で作製したgH、gL発現ベクターとを混合し、Lipofectamin2000（Invitrogen）を用いてHEK293sGnTI-細胞（ATCC:CRL-3022） に導入した。導入された細胞を1μg/μLのピューロマイシンを添加した培地で培養し、４遺伝子とも発現した細胞を限界希釈法でクローニングし、４遺伝子発現細胞を樹立した。
（８）上記樹立した４遺伝子発現細胞の培地を1μg/μLのピューロマイシンを添加した Ex-cell 293培地（ニチレイ; 24561C-10L）に変更し、２日ごとにEx-cell 293培地を回収、交換した。
（９）４遺伝子発現細胞の培養上清をCD134発現細胞と反応させ、CD134発現細胞表面に結合したgHにhIgG1Fcが融合した HHV-6B抗原四量複合体（以下、「HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）」という場合がある。）を、抗Fc融合タンパク抗体を用いてフローサイトメトリー（Flow cytometry）により検出した。分泌されたHHV-6B抗原はHHV-6Bの侵入レセプター（entry receptor）であるCD134と結合した（図３）。
（実施例１－２）HHV-6B抗原四量複合体の精製
本実施例では、HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）の精製について説明する。製法の概念図を図４に示した。実施例１－１で回収した４遺伝子発現細胞の培養上清に200 mM Na2PO4溶液を1/20当量と50% スラリーのNi-NTAアガロース樹脂（Qiagen）を1/500当量加え、4℃で14時間撹拌した。
本実施例では、HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）の精製について説明する。製法の概念図を図４に示した。実施例１－１で回収した４遺伝子発現細胞の培養上清に200 mM Na2PO4溶液を1/20当量と50% スラリーのNi-NTAアガロース樹脂（Qiagen）を1/500当量加え、4℃で14時間撹拌した。
Ni-NTAアガロース樹脂体積に対し20当量の洗浄バッファー（20 mM リン酸ナトリウム pH 7.4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole）を用いて洗浄し、2当量の溶出バッファー（20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 120 mM imidazole）で、Ni-アフィニティクロマトグラフィーによりタンパク質を溶出した。溶出したタンパク質をウエスタンブロットに供し、gH、gL、gQ1、gQ2それぞれに対する抗体を用いて検出した（図５）。実施例１の（７）で樹立した４遺伝子発現細胞の培養上清にHHV-6B抗原四量複合体（Fc+）が分泌されていた（図６）。
HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）が分泌されていた培養上清を、分画分子量 50,000の遠心式フィルターAmicon Ultra-0.5（Merck Millipore）を用いて吸光度A280 = 0.2-0.5まで13,500g, 4℃で限外濾過濃縮を行なった。1 mg当たり8単位（unit）のGST融合タンパク質切断用プロテアーゼ（PreScission Protease：GE-Healthcare）を用意し、これに終濃度5 mMのジチオスレイトールを加えて氷上で30分静置したのち、上記HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を含む試料に添加して4℃で48時間反応させた。
液体クロマトグラフィーシステム（AKTA pure 25）を用いて4℃の条件でタンパク質を精製した。ゲル濾過カラムHiLoad 16/600 Superdex 200 pg（GE-Healthcare）をバッファーA（20 mM Tris-HCl pH8.0, 100 mM NaCl）で平衡化し、試料を2 mLずつ添加して濾過した。溶出ピークをSDS-PAGEで分析し、HHV-6B抗原四量複合体に相当する溶出ピークを回収した。HHV-6B抗原四量複合体は単一ピークとして溶出し、分取可能であった（図７）。
前記液体クロマトグラフィーシステム（AKTA pure 25）により4℃の条件下で陽イオン交換カラムMonoQ 5/50 GL（GE-Healthcare）を上記バッファーAで平衡化し、HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）画分を添加した。5 mLのバッファーAで洗浄後、バッファーAからバッファーB（20 mM Tris-HCl pH8.0, 1 M NaCl）への濃度勾配によって溶出させ、HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）に相当するピークを回収した。
分画分子量 50,000の遠心式フィルターAmicon Ultra-0.5（Merck Millipore）を用いて13,500g, 4℃で限外濾過濃縮を行ない、本発明のHHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を作製した（図６）。
（実施例１－３）HHV-6B抗原四量複合体の免疫試験（抗体産生）
実施例１－２で作製したHHV-6B抗原四量複合体（Fc+） 100μgと溶液として等量のTiter Max Gold（フナコシ、Titer Max Gold, Inc、Cat No. CYT: G-1x5）を混合し、超音波処理（Sonication: output=3）を氷上で10秒間4回行なった。23Gの針、1 mLシリンジを用いてマウス（BALB/c、メス、4週齢、各群3匹、Control : PBS）の背中に100μgずつ皮下投与した。投与スケジュールは2週間間隔で3回行った。3回目の投与から4週間後に、血液と脾臓を回収した（図８）。
実施例１－２で作製したHHV-6B抗原四量複合体（Fc+） 100μgと溶液として等量のTiter Max Gold（フナコシ、Titer Max Gold, Inc、Cat No. CYT: G-1x5）を混合し、超音波処理（Sonication: output=3）を氷上で10秒間4回行なった。23Gの針、1 mLシリンジを用いてマウス（BALB/c、メス、4週齢、各群3匹、Control : PBS）の背中に100μgずつ皮下投与した。投与スケジュールは2週間間隔で3回行った。3回目の投与から4週間後に、血液と脾臓を回収した（図８）。
ペントバルビタール（ソムノペンチル: 50mg/ mL）100μLをマウスの腹腔に投与し、麻酔下で心臓採血（23Gの針、1 mLシリンジ）し、及び脾臓を採取した。血液約1 mLを1.5 mLチューブに入れ、37℃で1時間インキュベーションし、14000rpm、4℃で30分間遠心処理した。血清（上層）を別の1.5 mLチューブに移し、56℃で30分間、ブロックインキュベーターにて非働化処理した後、抗体価測定に使用した。脾臓は採取後、20 mLのRPMI培地を加えた50 mLチューブに入れて氷上で運搬した。Ficoll-conray液を用いた密度勾配遠心により単核球を回収し、細胞性免疫能の測定に使用した。
上記血清について間接蛍光抗体法（IFA）により、HHV-6B抗原に対する抗体価を測定した。HHV-6B HST株感染MT4細胞（Cell to cell 4日目の細胞、後期タンパク質の発現確認済）又は、四量複合体発現293T細胞を抗原プレートのために使用した。四量複合体発現293T細胞による抗原プレートは以下の方法により作製した。293T細胞を2×106個/12 mL DMEM: 8% FBSで10cmディッシュに播種し、翌日リン酸カルシウム法で、pCAGGSMCS-gH 3μg、pCAGGSMCS-gL 6μg、pCAGGSMCS-gQ1 3μg、pCAGGSMCS-gQ2 6μgを各々トランスフェクション後、培養3日目に細胞を回収し、抗原プレートを作製した（抗gH、gL、gQ1、gQ2 のそれぞれの抗体を用いて各タンパク質の発現を確認した）。
PBS/ 2% BSAを用いて段階希釈（10～1280倍）したマウス血清を、各抗原プレートにのせ、37℃で30分間インキュベーションにより反応させた。各プレートをPBS/ 0.02% Tween20を用いて洗浄後、乾燥した。2次抗体（100倍希釈FITC conjugate rabbit anti-mouse IgGを使用）をのせ、37℃・20分インキュベーションで反応させ、PBS/ 0.02% Tween20 にて洗浄後、乾燥した。封入し、蛍光顕微鏡下で蛍光を観察した。蛍光が観察可能なマウス血清の最大希釈倍率を抗体価とした。HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を投与したマウスで、HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）に対する抗体産生が確認された。
（実施例１－４）HHV-6B抗原四量複合体の免疫試験（中和抗体価）
実施例１－３で取得した血清を試料として、血清中に産生したHHV-6B抗原四量複合体（Fc+）の中和抗体価を測定した。実施例１－３で取得したマウス血清を3% FBS含有RPMI培地で段階希釈（40～1280倍）した。希釈した血清100μLにHHV-6B（HST株）ウイルス液100μLを加え、37℃で30分間、反応させた（10分おきにロッキング）。3×106 個のMT4細胞をFBS含有RPMI培地1 mLに懸濁し、各マウス血清＋ウイルス液を10μLずつ（3×104 個）添加した。490×g・40分・35℃で遠心して感染させた。細胞を角底96ウェルプレートへ移し、490×g・5分間・室温でペレットダウンした。細胞ペレットを3% FBS含有RPMI培地200μLで洗浄した。細胞ペレットに3% FBS含有RPMI培地200μLを加えて懸濁し、96ウェルプレート（平底）に移し、37℃ 5% CO2インキュベータで4日培養した。培養4日後、感染細胞を角底96ウェルプレートに移して490×g・5 min・室温で遠心し、培養液を20μL程度残して上清を吸引した。細胞を全て回収して30μLの5×sample buffer（2ME含む）に懸濁し、ウエスタンブロット（anti-BIE1×1000、Internal controlとしてanti-α-tubulin×10000）にてHHV-6Bタンパク質IE1を検出し、感染の有無を確認した。IE1が検出されないマウス血清の最大希釈倍率を中和抗体価とした。HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を投与したマウスで、HHV-6Bに対する中和抗体産生が確認された。
実施例１－３で取得した血清を試料として、血清中に産生したHHV-6B抗原四量複合体（Fc+）の中和抗体価を測定した。実施例１－３で取得したマウス血清を3% FBS含有RPMI培地で段階希釈（40～1280倍）した。希釈した血清100μLにHHV-6B（HST株）ウイルス液100μLを加え、37℃で30分間、反応させた（10分おきにロッキング）。3×106 個のMT4細胞をFBS含有RPMI培地1 mLに懸濁し、各マウス血清＋ウイルス液を10μLずつ（3×104 個）添加した。490×g・40分・35℃で遠心して感染させた。細胞を角底96ウェルプレートへ移し、490×g・5分間・室温でペレットダウンした。細胞ペレットを3% FBS含有RPMI培地200μLで洗浄した。細胞ペレットに3% FBS含有RPMI培地200μLを加えて懸濁し、96ウェルプレート（平底）に移し、37℃ 5% CO2インキュベータで4日培養した。培養4日後、感染細胞を角底96ウェルプレートに移して490×g・5 min・室温で遠心し、培養液を20μL程度残して上清を吸引した。細胞を全て回収して30μLの5×sample buffer（2ME含む）に懸濁し、ウエスタンブロット（anti-BIE1×1000、Internal controlとしてanti-α-tubulin×10000）にてHHV-6Bタンパク質IE1を検出し、感染の有無を確認した。IE1が検出されないマウス血清の最大希釈倍率を中和抗体価とした。HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を投与したマウスで、HHV-6Bに対する中和抗体産生が確認された。
（実施例１－５）HHV-6B抗原四量複合体の免疫試験（細胞性免疫）
HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を投与したマウスにおける細胞性免疫の測定をした。実施例１－３と同手法で回収したマウス脾臓由来単核球を用いて、IFN-γ Elispotアッセイを行なった。刺激因子としてHHV-6B又は水痘ウイルス（VZV）を用い、IFN-γ産生細胞の数を測定した。HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を投与したマウスで、HHV-6B刺激によりIFN-γが産生された（図９）。
HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を投与したマウスにおける細胞性免疫の測定をした。実施例１－３と同手法で回収したマウス脾臓由来単核球を用いて、IFN-γ Elispotアッセイを行なった。刺激因子としてHHV-6B又は水痘ウイルス（VZV）を用い、IFN-γ産生細胞の数を測定した。HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を投与したマウスで、HHV-6B刺激によりIFN-γが産生された（図９）。
（実施例１－６）HHV-6B抗原四量複合体を導入した細胞の推移
HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を導入した細胞（四量複合体発現細胞）と、gQ1-hIgG1FcQ1/Q2（図２参照）を導入した細胞（gQ1/Q2発現細胞）の培養時の生細胞数を比較した。コントロールとしてHEK293T細胞を用いた。各細胞濃度が1×105/ well 、2×105/ well、 3×105/ well、 5×105/ wellになるように、６ウェルプレートに播種した。３日後、1μg/μL ピューロマイシン含み、無血清のEx-cell 293培地（ニチレイ; 24561C-10L）に交換し、培養を開始した。培養上清中に分泌されたHHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を回収するときと同じスケジュールで、培養上清の回収と培地交換を行い、培養を続け、上清中の浮遊細胞を回収し、経時的に生細胞数をカウントした。生細胞数は、上清中の浮遊細胞と接着細胞について各々カウントした。
その結果、gQ1/gQ2発現細胞よりも四量複合体発現細胞の方が生細胞数が多く、長期の培養に適していた（図１０～１２）。
HHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を導入した細胞（四量複合体発現細胞）と、gQ1-hIgG1FcQ1/Q2（図２参照）を導入した細胞（gQ1/Q2発現細胞）の培養時の生細胞数を比較した。コントロールとしてHEK293T細胞を用いた。各細胞濃度が1×105/ well 、2×105/ well、 3×105/ well、 5×105/ wellになるように、６ウェルプレートに播種した。３日後、1μg/μL ピューロマイシン含み、無血清のEx-cell 293培地（ニチレイ; 24561C-10L）に交換し、培養を開始した。培養上清中に分泌されたHHV-6B抗原四量複合体（Fc+）を回収するときと同じスケジュールで、培養上清の回収と培地交換を行い、培養を続け、上清中の浮遊細胞を回収し、経時的に生細胞数をカウントした。生細胞数は、上清中の浮遊細胞と接着細胞について各々カウントした。
その結果、gQ1/gQ2発現細胞よりも四量複合体発現細胞の方が生細胞数が多く、長期の培養に適していた（図１０～１２）。
（比較例１－１）各種HHV-6B抗原の作製
本比較例では、実施例１で作製したHHV-6B抗原四量複合体との比較のため、HHV-6B抗原一量体（gH）、HHV-6B抗原二量複合体（gH/gL）、HHV-6B抗原一量体（gQ1）及びHHV-6B抗原二量複合体（gQ1/gQ2）の各抗原について、免疫誘導能等を確認した。まず、各種HHV-6B抗原の作製の作製方法について示す。
本比較例では、実施例１で作製したHHV-6B抗原四量複合体との比較のため、HHV-6B抗原一量体（gH）、HHV-6B抗原二量複合体（gH/gL）、HHV-6B抗原一量体（gQ1）及びHHV-6B抗原二量複合体（gQ1/gQ2）の各抗原について、免疫誘導能等を確認した。まず、各種HHV-6B抗原の作製の作製方法について示す。
コドンをヒト化したHHV-6B HST株のgH、gL、gQ1と、ストレプトアビジン結合ペプチド配列からなるsbp（streptavidin binding peptide sequence）タグ付きgQ2の配列cDNAをそれぞれ作製した。gH又はgQ1を含むcDNAを各々pCAGGS-MCSベクターに挿入し、各発現ベクターを作製した。gLとgQ2の発現カセット（プロモーターとpolyA配列を含む）を増幅し、それぞれgHとgQ1を組込んだプラスミドに、HindIIIを用いて挿入した。これにより４種の各遺伝子を含む発現プラスミド（gH-発現プラスミド、gH/gL-発現プラスミド、gQ1-発現プラスミド、gQ1/gQ2-発現プラスミド）を作製した。
４種の各遺伝子を含む発現プラスミドをリン酸カルシウム法を用いて293T細胞に導入し、培養した。培養２日後、細胞を回収し、protease inhibitors（Sigma）を含むTNE バッファー（10 mM Tris-HCl [pH 7.8], 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [Nacalai Tesque]）で可溶化した。可溶化した細胞にgH又はgQ1に対する抗体を架橋したストレプトアビジンセファロース（GE Healthcare）を加え、4℃で8時間反応させた。セファロースをTNEバッファーで洗浄し、8 mMビオチン溶液を用いてHHV-6B抗原であるgH、gH/gL、gQ1及びgQ1/gQ2を各々溶出した。溶出液をMillipore(TM) Amicon(TM) 30（Millipore）でPBSに置換し、各抗原を精製した。
（比較例１－２）免疫誘導能の確認
本比較例では、比較例１－１で作製した一量体（gH）、二量複合体（gH/gL）、一量体（gQ1）及び二量複合体（gQ1/gQ2）の各HHV-6B抗原について、免疫誘導能を確認した。各抗原溶液と等量のTiter Max Gold（フナコシ、Titer Max Gold, Inc、Cat No. CYT: G-1x5）を混合し、超音波処理（Sonication: output=3）を氷上で10秒間4回行ない、各抗原試料とした。23Gの針、1 mLシリンジを用いてマウス（BALB/c、メス、4週齢、各群3匹、Control : PBS）の背中に各抗原試料を50μgずつ皮下投与した。投与スケジュールは0、4、8週間の計3回行った。3回目の投与から4週間後に採血した（図１３）。
本比較例では、比較例１－１で作製した一量体（gH）、二量複合体（gH/gL）、一量体（gQ1）及び二量複合体（gQ1/gQ2）の各HHV-6B抗原について、免疫誘導能を確認した。各抗原溶液と等量のTiter Max Gold（フナコシ、Titer Max Gold, Inc、Cat No. CYT: G-1x5）を混合し、超音波処理（Sonication: output=3）を氷上で10秒間4回行ない、各抗原試料とした。23Gの針、1 mLシリンジを用いてマウス（BALB/c、メス、4週齢、各群3匹、Control : PBS）の背中に各抗原試料を50μgずつ皮下投与した。投与スケジュールは0、4、8週間の計3回行った。3回目の投与から4週間後に採血した（図１３）。
ペントバルビタール（ソムノペンチル: 50mg/ mL）100μLをマウスの腹腔に投与し、麻酔下で心臓採血（23Gの針、1 mLシリンジ）した。血液約1 mLを1.5 mLチューブに入れ、37℃で1時間インキュベーションし、14000rpm、4℃で30分間遠心処理した。血清（上層）を別の1.5 mLチューブに移し、56℃で30分間、ブロックインキュベーターにて非働化処理したものを、免疫誘導能確認のための試験用試料として使用した。
（１）ELISA法による免疫誘導能の確認
上記各免疫誘導処理を行った試験用試料について、免疫誘導能をELISA法により確認した。ELISA法に使用するHHV-6B抗原四量複合体は以下の方法により作製した。コドンをヒト化したHHV-6B HST株のgH、gL、gQ1と、ストレプトアビジン結合ペプチド配列からなるsbp（streptavidin binding peptide sequence）タグ付きgQ2の配列cDNAをそれぞれ作製した。gH又はgQ1を含むcDNAを各々pCAGGS-MCSベクターに挿入し、各発現ベクターを作製した。gLとgQ2の発現カセット（プロモーターとpolyA配列を含む）を増幅し、それぞれgHとgQ1を組込んだプラスミドに、HindIIIを用いて挿入した。２種の発現プラスミドをリン酸カルシウム法を用いて293T細胞に導入し、培養２日後、細胞を回収し、protease inhibitors（Sigma）を含むTNE バッファー（10 mM Tris-HCl [pH 7.8], 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [Nacalai Tesque]）で可溶化した。可溶化した細胞にストレプトアビジンセファロース（GE Healthcare）を加え、4℃で8時間反応させてビオチンでHHV-6B抗原四量複合体を溶出した。溶出液をMillipore(TM) Amicon(TM) 30（Millipore）でPBSに置換し、HHV-6B抗原四量複合体を精製した。上記作製した精製HHV-6B抗原四量複合体を用いてELISA測定用プレートを作製した。25倍から51,200倍までの各希釈した試験用試料について、ELISA測定用プレート上で常法に従い各々抗原抗体反応を行い、波長405nmでの吸光度を測定し免疫誘導能を確認した（図１４及び表３）。その結果、各種抗原のうち、一量体に比べて二量複合体からなる抗原で処理した方が高い免疫誘導能が確認された。
上記各免疫誘導処理を行った試験用試料について、免疫誘導能をELISA法により確認した。ELISA法に使用するHHV-6B抗原四量複合体は以下の方法により作製した。コドンをヒト化したHHV-6B HST株のgH、gL、gQ1と、ストレプトアビジン結合ペプチド配列からなるsbp（streptavidin binding peptide sequence）タグ付きgQ2の配列cDNAをそれぞれ作製した。gH又はgQ1を含むcDNAを各々pCAGGS-MCSベクターに挿入し、各発現ベクターを作製した。gLとgQ2の発現カセット（プロモーターとpolyA配列を含む）を増幅し、それぞれgHとgQ1を組込んだプラスミドに、HindIIIを用いて挿入した。２種の発現プラスミドをリン酸カルシウム法を用いて293T細胞に導入し、培養２日後、細胞を回収し、protease inhibitors（Sigma）を含むTNE バッファー（10 mM Tris-HCl [pH 7.8], 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [Nacalai Tesque]）で可溶化した。可溶化した細胞にストレプトアビジンセファロース（GE Healthcare）を加え、4℃で8時間反応させてビオチンでHHV-6B抗原四量複合体を溶出した。溶出液をMillipore(TM) Amicon(TM) 30（Millipore）でPBSに置換し、HHV-6B抗原四量複合体を精製した。上記作製した精製HHV-6B抗原四量複合体を用いてELISA測定用プレートを作製した。25倍から51,200倍までの各希釈した試験用試料について、ELISA測定用プレート上で常法に従い各々抗原抗体反応を行い、波長405nmでの吸光度を測定し免疫誘導能を確認した（図１４及び表３）。その結果、各種抗原のうち、一量体に比べて二量複合体からなる抗原で処理した方が高い免疫誘導能が確認された。
（２）中和法による免疫誘導能の確認
上記各免疫誘導処理を行った試験用試料について、免疫誘導能を中和法により確認した。採取した血液約1 mLを1.5 mLチューブに入れ、37℃で1時間インキュベーションし、14000rpm、4℃で30分間遠心処理し、非働化処理していないものを、中和抗体価測定による免疫誘導能確認のための試験用試料として使用した。10、20、40、80、160倍に段階希釈した試験用試料を、ウイルス液（HHV-6B、HST株）と混合して37℃で30分反応させ、試験用試料とウイルスの各混合液をMT4細胞に感染させた後37℃で1時間遠心処理を行った。細胞をRPMI（3%FBS）にて培養し、１日経過後細胞を回収し、IE1に対する抗体を用いて間接蛍光抗体法（IFA）にて中和抗体価を測定した（表４）。その結果、一量体と、二量複合体からなる抗原での処理では、免疫誘導能がほとんど確認されず、HHV-6B抗原四量複合体のほうが免疫誘導能は高かった。
上記各免疫誘導処理を行った試験用試料について、免疫誘導能を中和法により確認した。採取した血液約1 mLを1.5 mLチューブに入れ、37℃で1時間インキュベーションし、14000rpm、4℃で30分間遠心処理し、非働化処理していないものを、中和抗体価測定による免疫誘導能確認のための試験用試料として使用した。10、20、40、80、160倍に段階希釈した試験用試料を、ウイルス液（HHV-6B、HST株）と混合して37℃で30分反応させ、試験用試料とウイルスの各混合液をMT4細胞に感染させた後37℃で1時間遠心処理を行った。細胞をRPMI（3%FBS）にて培養し、１日経過後細胞を回収し、IE1に対する抗体を用いて間接蛍光抗体法（IFA）にて中和抗体価を測定した（表４）。その結果、一量体と、二量複合体からなる抗原での処理では、免疫誘導能がほとんど確認されず、HHV-6B抗原四量複合体のほうが免疫誘導能は高かった。
（実施例２）HHV-6B抗原四量複合体とDPT-IPVとの併用効果の確認
本実施例では、本願発明のHHV-6B抗原四量複合体と公知の四種混合ワクチンであるDPT-IPVを併用したときのHHV-6Bに対する免疫誘導能について確認した。ここでDPT-IPVは、ジフテリア、百日せき、破傷風及びポリオに対する予防ワクチンであり、破傷風や百日せき等についての抗体誘導能が確認されている。本実施例では、本発明のHHV-6B抗原四量複合体は、gHのhIgG1Fc部分を含まない以外は実施例１と同手法により作製したものを使用した。本実施例で使用するgHのhIgG1Fcを含まないHHV-6B抗原四量複合体をHHV-6B抗原四量複合体（Fc-）という。
本実施例では、本願発明のHHV-6B抗原四量複合体と公知の四種混合ワクチンであるDPT-IPVを併用したときのHHV-6Bに対する免疫誘導能について確認した。ここでDPT-IPVは、ジフテリア、百日せき、破傷風及びポリオに対する予防ワクチンであり、破傷風や百日せき等についての抗体誘導能が確認されている。本実施例では、本発明のHHV-6B抗原四量複合体は、gHのhIgG1Fc部分を含まない以外は実施例１と同手法により作製したものを使用した。本実施例で使用するgHのhIgG1Fcを含まないHHV-6B抗原四量複合体をHHV-6B抗原四量複合体（Fc-）という。
本実施例では、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-） とDPT-IPVを含む五種混合ワクチン、DPT-IPV単独、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-） を用いてマウス（BALB/c、メス、4週齢）に免疫誘導処理を行った（各群7匹）。HHV-6B抗原四量複合体（Fc-） は100μg、DPT-IPVはヒト投与量の1/8量を投与した。各ワクチンは、マウス（BALB/c、メス、4週齢、各群7匹、Control : PBS）の背中に500μLずつ皮下投与した。投与は0、4、10、16週目の計4回行った。投与開始2、6、12、18週目に、実施例１－３と同手法により採血し、20週目に全血採血した（図１５）。採取した血液を比較例１と同手法により処理し、免疫誘導能確認のための試験用試料を調製した。
（１）ELISA法による免疫誘導能の確認
比較例１同手法に従い、ELISA法にて血清中の抗体価を確認した（図１６、表５）。その結果、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）でもHHV-6Bに対する高い免疫誘導能が得られたが、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）とDPT-IPVとを併用した五種混合ワクチンでさらに高い免疫誘導能が確認された。一方、DPT-IPV単独の場合にはPBSの場合と同様に殆ど免疫誘導がされていなかった。HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）とDPT-IPVを併用することにより、相乗効果が確認された。
比較例１同手法に従い、ELISA法にて血清中の抗体価を確認した（図１６、表５）。その結果、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）でもHHV-6Bに対する高い免疫誘導能が得られたが、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）とDPT-IPVとを併用した五種混合ワクチンでさらに高い免疫誘導能が確認された。一方、DPT-IPV単独の場合にはPBSの場合と同様に殆ど免疫誘導がされていなかった。HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）とDPT-IPVを併用することにより、相乗効果が確認された。
（２）中和法による免疫誘導能の確認
比較例１と同手法に従い、間接蛍光抗体法（IFA）にて中和抗体価を測定した（表６）。その結果、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）でもHHV-6Bに対する高い免疫誘導能が得られ、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）とDPT-IPVとを併用した五種混合ワクチンでは同等以上の高い免疫誘導能が確認された。一方、DPT-IPV単独の場合にはPBSの場合と同様に殆ど免疫誘導がされていなかった。
比較例１と同手法に従い、間接蛍光抗体法（IFA）にて中和抗体価を測定した（表６）。その結果、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）でもHHV-6Bに対する高い免疫誘導能が得られ、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）とDPT-IPVとを併用した五種混合ワクチンでは同等以上の高い免疫誘導能が確認された。一方、DPT-IPV単独の場合にはPBSの場合と同様に殆ど免疫誘導がされていなかった。
（３）細胞性免疫法による免疫誘導能の確認 （Elispot法）
実施例１－３と同手法で回収したマウス脾臓由来単核球を用いて、 Elispotプレート（ミリポア）を用いてアッセイを行なった。ELISpotアッセイは、T細胞の応答を誘導する能力を測定することによって、ワクチンの効果を判定するために使用される。Elispotプレート（ミリポア）はFBSを含むRPMIでブロッキング処理を行った後、マウスの脾臓細胞を1×106又は0.5×106個／ウェル加え、100μLのPHAで刺激し、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）等又はPBSを加え、40時間37℃で培養し、形成されたIFN-γ産生細胞のスポットをKS ELISPOT（Carl Zeiss）を用いてカウントした（図１７）。その結果、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）でもHHV-6Bに対する細胞免疫誘導能が得られたが、HHV-6B抗原四量複合体とDPT-IPVとを併用した五種混合ワクチンではより高い免疫誘導能が確認された。一方、DPT-IPV単独の場合にはPBSの場合と同様に殆ど免疫誘導がされなかった。
実施例１－３と同手法で回収したマウス脾臓由来単核球を用いて、 Elispotプレート（ミリポア）を用いてアッセイを行なった。ELISpotアッセイは、T細胞の応答を誘導する能力を測定することによって、ワクチンの効果を判定するために使用される。Elispotプレート（ミリポア）はFBSを含むRPMIでブロッキング処理を行った後、マウスの脾臓細胞を1×106又は0.5×106個／ウェル加え、100μLのPHAで刺激し、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）等又はPBSを加え、40時間37℃で培養し、形成されたIFN-γ産生細胞のスポットをKS ELISPOT（Carl Zeiss）を用いてカウントした（図１７）。その結果、HHV-6B抗原四量複合体（Fc-）でもHHV-6Bに対する細胞免疫誘導能が得られたが、HHV-6B抗原四量複合体とDPT-IPVとを併用した五種混合ワクチンではより高い免疫誘導能が確認された。一方、DPT-IPV単独の場合にはPBSの場合と同様に殆ど免疫誘導がされなかった。
以上詳述したように、HHV-6Bの表面タンパク質のうち、gH、gL、gQ1及びgQ2を含むHHV-6B抗原四量複合体によれば、安定的かつ大量供給が可能な抗原組成物を提供しうる。抗原組成物を安定的かつ大量供給できることから、係る抗原組成物を含むワクチンや医薬組成物を安定に供給することができ、産業上有利である。
（配列番号１）GenBank：NC_000898情報に基づくgHをコードする遺伝子の塩基配列
（配列番号２）GenBank：NC_000898情報に基づくgHのアミノ酸配列
（配列番号３）GenBank：NC_000898情報に基づくgLをコードする遺伝子の塩基配列
（配列番号４）GenBank：NC_000898情報に基づくgLのアミノ酸配列
（配列番号５）GenBank：NC_000898情報に基づくgQ1をコードする遺伝子の塩基配列
（配列番号６）GenBank：NC_000898情報に基づくgQ1のアミノ酸配列
（配列番号７）GenBank：NC_000898情報に基づくgQ2をコードする遺伝子の塩基配列
（配列番号８）GenBank：NC_000898情報に基づくgQ2のアミノ酸配列
（配列番号９）配列番号１０及び１１に示すアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列
（配列番号１０）配列番号２で特定されるアミノ酸配列のうち、シグナル配列とトランスメンブレン領域を削除したgHのアミノ酸配列
（配列番号１１）hIgG1Fcのアミノ酸配列
（配列番号１２）配列番号４で特定されるアミノ酸配列のうち、シグナル配列を削除したgLのアミノ酸配列
（配列番号１３）配列番号６で特定されるアミノ酸配列のうち、シグナル配列を削除したgQ1のアミノ酸配列
（配列番号１４）配列番号８で特定されるアミノ酸配列のうち、シグナル配列を削除したgQ2のアミノ酸配列
（配列番号１５）プライマー１を特定する配列
（配列番号１６）プライマー２を特定する配列
（配列番号１７）プライマー３を特定する配列
（配列番号１８）プライマー４を特定する配列
（配列番号１９）プライマー５を特定する配列
（配列番号２０）プライマー６を特定する配列
（配列番号２）GenBank：NC_000898情報に基づくgHのアミノ酸配列
（配列番号３）GenBank：NC_000898情報に基づくgLをコードする遺伝子の塩基配列
（配列番号４）GenBank：NC_000898情報に基づくgLのアミノ酸配列
（配列番号５）GenBank：NC_000898情報に基づくgQ1をコードする遺伝子の塩基配列
（配列番号６）GenBank：NC_000898情報に基づくgQ1のアミノ酸配列
（配列番号７）GenBank：NC_000898情報に基づくgQ2をコードする遺伝子の塩基配列
（配列番号８）GenBank：NC_000898情報に基づくgQ2のアミノ酸配列
（配列番号９）配列番号１０及び１１に示すアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列
（配列番号１０）配列番号２で特定されるアミノ酸配列のうち、シグナル配列とトランスメンブレン領域を削除したgHのアミノ酸配列
（配列番号１１）hIgG1Fcのアミノ酸配列
（配列番号１２）配列番号４で特定されるアミノ酸配列のうち、シグナル配列を削除したgLのアミノ酸配列
（配列番号１３）配列番号６で特定されるアミノ酸配列のうち、シグナル配列を削除したgQ1のアミノ酸配列
（配列番号１４）配列番号８で特定されるアミノ酸配列のうち、シグナル配列を削除したgQ2のアミノ酸配列
（配列番号１５）プライマー１を特定する配列
（配列番号１６）プライマー２を特定する配列
（配列番号１７）プライマー３を特定する配列
（配列番号１８）プライマー４を特定する配列
（配列番号１９）プライマー５を特定する配列
（配列番号２０）プライマー６を特定する配列
Claims (9)
- ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（HHV-6B）の抗原組成物であって、HHV-6Bの表面タンパク質のうち、gH、gL、gQ1及びgQ2を含む四量複合体からなる抗原組成物。
- gHが、以下（１０－ａ）～（１０－ｆ）のいずれかで特定されるポリペプチドを含む、請求項１に記載の抗原組成物：
（１０－ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１０－ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１０－ｃ）配列番号１０をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１０－ｄ）配列番号１０に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１０－ｅ）（１０－ａ）～（１０－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１０－ｆ）（１０－ａ）～（１０－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド。 - gHが、以下（１０－ａ）～（１０－ｆ）のいずれかで特定されるポリペプチドに加えてさらに配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載の抗原組成物：
（１０－ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１０－ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１０－ｃ）配列番号１０をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１０－ｄ）配列番号１０に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１０－ｅ）（１０－ａ）～（１０－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１０－ｆ）（１０－ａ）～（１０－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド。 - gLが、以下（１２－ａ）～（１２－ｆ）のいずれかで特定されるポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれかに記載の抗原組成物：
（１２－ａ）配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１２－ｂ）配列番号１２に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１２－ｃ）配列番号１２をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１２－ｄ）配列番号１２に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１２－ｅ）（１２－ａ）～（１２－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；又は
（１２－ｆ）（１２－ａ）～（１２－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド。 - gQ1が、以下の（１３－ａ）～（１３－ｆ）より選択される、請求項１～４のいずれかに記載の抗原組成物：
（１３－ａ）配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１３－ｂ）配列番号１３に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１３－ｃ）配列番号１３をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１３－ｄ）配列番号１３に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１３－ｅ）（１３－ａ）～（１３－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１３－ｆ）（１３－ａ）～（１３－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド。 - gQ2が、以下の（１４－ａ）～（１４－ｆ）より選択される、請求項１～５のいずれかに記載の抗原組成物：
（１４－ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１４－ｂ）配列番号１４に示すアミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸が置換、付加及び欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１４－ｃ）配列番号１４をコードする塩基配列のスプライス変異体又は対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（１４－ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；
（１４－ｅ）（１４－ａ）～（１４－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも70％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（１４－ｆ）（１４－ａ）～（１４－ｄ）のいずれか１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド。 - 請求項１～６のいずれかに記載の抗原組成物を含むHHV-6Bワクチン。
- 請求項１～６のいずれかに記載の抗原組成物を有効成分として含む、医薬組成物。
- 請求項１～６のいずれかに記載の抗原組成物の作製方法。
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