BR112021012294A2

BR112021012294A2 - Polipeptídeos compreendendo polipeptídeos de il-2 modificada e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112021012294A2
Application number: BR112021012294-0A
Authority: BR
Inventors: John C. Timmer; Brendan P. Eckelman; Katelyn Mckabe Willis; Florian J. Sulzmaier; Bryan R. Becklund
Original assignee: Inhibrx, Inc.
Priority date: 2019-01-07
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2021-09-08
Also published as: MX2021008147A; IL284633A; CA3125529A1; AR117770A1; AU2020206672A1; CL2021001779A1; WO2020146221A1; EP3908596A1; TW202043259A; SG11202106700WA; JP2022516557A; CN113924311A; US20220089667A1; KR20210113265A

Abstract

polipeptídeos compreendendo polipeptídeos de il-2 modificada e usos dos mesmos. são aqui fornecidos polipeptídeos compreendendo uma il-2 modificada, em que a il-2 modificada tem afinidade reduzida para o receptor de il-2 em relação à il-2 tipo selvagem. em algumas modalidades, polipeptídeos compreendendo uma il-2 modificada que se ligam e agonizam células t ativadas são fornecidos. os usos dos polipeptídeos compreendendo uma il-2 modificada também são fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “POLI- PEPTÍDEOS COMPREENDENDO POLIPEPTÍDEOS DE IL-2 MODI- FICADA E USOS DOS MESMOS”.

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório US 62/789.075, depositado em 7 de janeiro de 2019, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade para qualquer finalidade.

CAMPO

[002] A presente invenção refere-se a IL-2 modificada com afini- dade reduzida para CD25 e CD122 e essa IL-2 modificada fundida a porções de direcionamento. A invenção também se refere a métodos de utilização de IL-2 modificada e polipeptídeos compreendendo IL-2 modificada, incluindo, mas não se limitando a, métodos de tratamento de câncer.

ANTECEDENTES

[003] IL-2 é uma potente citocina que estimula a proliferação de células T e NK por meio de um receptor de IL-2 heterotrimérico (IL-2R) composto de CD25, CD122 e CD132, ou de um receptor de IL-2 hete- rodimérico composto de apenas CD122 e CD132. Ambas as formas do IL-2R são mediadores potentes da sobrevivência, proliferação e esta- do de ativação geral das células T. A IL-2 é geralmente produzida por células T e células NK após ativação e media a sinalização em cis e trans no microambiente local. A sinalização de IL-2R pode induzir a diferenciação de células T virgens em células T efetoras e de memó- ria, e também pode estimular células T reguladoras de supressão. Embora a forma trimérica do IL-2R tenha uma afinidade maior para a IL-2 do que a forma dimérica, ambas têm afinidade razoavelmente alta e causam rápida internalização e degradação mediada por receptor, resultando em uma meia-vida extremamente curta. IL-2 humana re-

combinante (rhIL-2, Proleucina) é usada clinicamente para tratar carci- noma de células renais e melanoma maligno; no entanto, está associ- ado a toxicidade grave. A síndrome de vazamento vascular é uma grande preocupação de toxicidade para pacientes com câncer tratados com Proleucina devido aos efeitos da sinalização de IL-2 nas células endoteliais que expressam o IL-2R de alta afinidade.

[004] As células T são ativadas por meio da ligação de seu TCR a uma célula vizinha apresentando MHC com peptídeo complementar ligado, causando agrupamento do complexo TCR e sinalizando atra- vés do NFAT. A coestimulação de células T através de CD28 é condu- zida por CD80 e CD86, que aumenta a ativação de células T. Após a ativação inicial, as células T regulam positivamente uma variedade de proteínas, incluindo receptores de citocinas, bem como muitos recep- tores coestimulatórios e de ponto de checagem que servem para mo- dular a resposta das células T.

[005] Respostas clínicas antitumorais duráveis foram relatadas recentemente para anticorpos antagonistas para receptores de ponto de checagem, como CTLA-4, PD-1 e PD-L1. No entanto, mesmo nas indicações mais responsivas, a taxa de resposta é limitada a cerca de 30 % dos pacientes. Consequentemente, há uma necessidade de te- rapêuticas de modulação de células T melhoradas.

SUMÁRIO

[006] São fornecidos aqui polipeptídeos compreendendo uma IL- 2 modificada compreendendo pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada tem afinidade de ligação reduzida para CD25, CD122 e/ou IL-2R em relação à IL-2 tipo selvagem. Em algumas modalidades, a IL- 2 modificada tem atividade reduzida em células T em repouso ou ati- vadas em relação à IL-2 tipo selvagem.

[007] Modalidade 1. Um polipeptídeo compreendendo uma IL-2 modificada, em que a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido selecionada de P65, D84, E95, M23 e H16.

[008] Modalidade 2. O polipeptídeo, de acordo com a modalidade 1, em que a IL-2 modificada é uma IL-2 humana modificada.

[009] Modalidade 3. O polipeptídeo da modalidade 1 ou modali- dade 2, em que as posições de aminoácidos correspondem às posi- ções de aminoácidos em SEQ ID NO: 1.

[010] Modalidade 4. O polipeptídeo de qualquer uma das modali- dades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende uma substi- tuição na posição de aminoácido P65.

[011] Modalidade 5. O polipeptídeo, de acordo com a modalidade 4, em que a substituição é selecionada a partir de P65R, P65E, P65K, P65H, P65Y, P65Q, P65D e P65N.

[012] Modalidade 6. O polipeptídeo de qualquer uma das modali- dades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende uma substi- tuição na posição de aminoácido H16.

[013] Modalidade 7. O polipeptídeo, de acordo com a modalidade 6, em que a substituição é selecionada a partir de H16A, H16G, H16S, H16T, H16V e H16P.

[014] Modalidade 8. O polipeptídeo de qualquer uma das modali- dades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende uma substi- tuição na posição de aminoácido D84.

[015] Modalidade 9. O polipeptídeo, de acordo com a modalidade 8, em que a substituição é selecionada a partir de D84S, D84G, D84A, D84T, D84V e D84P.

[016] Modalidade 10. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende substitui- ções nas posições de aminoácidos P65, H16 e D84.

[017] Modalidade 11. O polipeptídeo, de acordo com a modalida-

de 10, em que a IL-2 modificada compreende as substituições P65R, H16A e D84S.

[018] Modalidade 12. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende uma substi- tuição na posição de aminoácido M23.

[019] Modalidade 13. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 12, em que a substituição é selecionada a partir de M23A, M23G, M23S, M23T, M23V e M23P.

[020] Modalidade 14. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 13, em que a IL-2 modificada compreende as substituições P65R, H16A, D84S e M23A.

[021] Modalidade 15. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende uma substi- tuição na posição de aminoácido E95.

[022] Modalidade 16. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 15, em que a substituição é selecionada a partir de E95Q, E95G, E95S, E95T, E95V, E95P, E95H e E95N.

[023] Modalidade 17. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 16, em que a IL-2 modificada compreende as substituições P65R, H16A, D84S e E95Q.

[024] Modalidade 18. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 17, em que a IL-2 modificada compreende as substituições P65R, H16A, D84S, M23A e E95Q.

[025] Modalidade 19. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende uma substi- tuição na posição de aminoácido F42.

[026] Modalidade 20. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 19, em que a substituição em F42 é selecionada a partir de F42K, F42A, F42R, F42A, F42G, F42S e F42T.

[027] Modalidade 21. O polipeptídeo de qualquer uma das moda-

lidades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido selecio- nada a partir de Y45 e L72.

[028] Modalidade 22. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 21, em que a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substi- tuição selecionada de Y45A e L72G.

[029] Modalidade 23. O polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a IL-2 modificada compre- ende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido selecionada a partir de T3 e C125.

[030] Modalidade 24. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 23, em que a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substi- tuição selecionada de T3A e C125A.

[031] Modalidade 25. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende um conjunto de substituições selecionadas a partir de H16A-F42K; D84S-F42K; E15S-F42K; M23A-F42K; E95Q-F42K; P65R-H16A; P65R-D84S; P65R-E15S; P65R-M23A; P65R-E95Q; T3A-C125S; T3A-P65R- C125S; T3A-H16A-C125S; T3A-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R- C125S; T3A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-D84S-C125S; T3A- H16A-M23A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-D84S-E95Q- C125S, and T3A-H16A-M23A-P65R-D84S-E95Q-C125S.

[032] Modalidade 26. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 25, em que a IL-2 modificada compreende o conjunto de substitui- ções e não compreende quaisquer substituições adicionais.

[033] Modalidade 27. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende uma se- quência de aminoácidos de pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 84.

[034] Modalidade 28. O polipeptídeo de qualquer uma das moda-

lidades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende uma se- quência de aminoácidos de pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 3-9, 11-21 e 23-31.

[035] Modalidade 29. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades anteriores, em que a IL-2 modificada compreende uma se- quência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 3-9, 11-21 e 23-

31.

[036] Modalidade 30. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades anteriores, em que o polipeptídeo compreende uma região de Fc.

[037] Modalidade 31. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 30, em que a IL-2 modificada é fundida ao terminal N ou ao terminal C da região de Fc.

[038] Modalidade 32. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 30 ou modalidade 31, em que a região de Fc compreende uma substituição na posição de aminoácido T366 de Kabat.

[039] Modalidade 33. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 32, em que a região de Fc compreende uma substituição T366W.

[040] Modalidade 34. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 31, em que a região de Fc compreende pelo menos uma substitui- ção em pelo menos uma posição de aminoácido de Kabat selecionada a partir de T366, L368 e Y407.

[041] Modalidade 35. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 34, em que a região de Fc compreende mutações T366S, L368A e Y407V.

[042] Modalidade 36. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 30-35, em que a região de Fc compreende uma substituição em uma posição Kabat selecionada de S354 e Y349.

[043] Modalidade 37. O polipeptídeo, de acordo com a modalida-

de 36, em que a região de Fc compreende uma substituição S354C ou Y349C.

[044] Modalidade 38. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 30-37, em que a região de Fc compreende uma substituição na posição de aminoácido H435 de Kabat.

[045] Modalidade 39. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 38, em que a região de Fc compreende uma substituição selecio- nada de H435R e H435K.

[046] Modalidade 40. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 30-39, em que a região de Fc compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido de Kabat se- lecionada a partir de M252 e M428.

[047] Modalidade 41. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de40, em que a região de Fc compreende substituições M252Y e M428V.

[048] Modalidade 42. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 30-41, em que a região de Fc compreende uma deleção dos aminoácidos de Kabat E233, L234 e L235.

[049] Modalidade 43. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 30-41, em que a região de Fc compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido selecionada de L234, L235 e P329.

[050] Modalidade 44. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de43, em que a região de Fc compreende as substituições L234A, L235A e P329G.

[051] Modalidade 45. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 30-44, em que a região de Fc compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a uma sequência de amino- ácidos selecionada de SEQ ID NOs: 47-83.

[052] Modalidade 46. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 30-44, em que a região de Fc é parte de uma região constante de cadeia pesada.

[053] Modalidade 47. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 46, em que a região constante de cadeia pesada é uma região constante de IgG.

[054] Modalidade 48. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de47, em que a região constante de cadeia pesada é uma região constante IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

[055] Modalidade 49. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 30-48, em que a IL-2 modificada é fundida ao terminal C da região de Fc ou região constante de cadeia pesada.

[056] Modalidade 50. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 49, em que a IL-2 modificada é fundida ao terminal C da região de Fc ou região constante de cadeia pesada por meio de um ligante com- preendendo 1-20 aminoácidos.

[057] Modalidade 51. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 50, em que o ligante compreende aminoácidos glicina.

[058] Modalidade 52. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 51, em que o ligante compreende os aminoácidos glicina e serina.

[059] Modalidade 53. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 50-52, em que a maioria, ou todos, os aminoácidos no ligante são glicina e serina.

[060] Modalidade 54. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 30-33, 42 e 49-53, em que o polipeptídeo compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86, 87, 102, 103 ou 104.

[061] Modalidade 55. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades anteriores, em que o polipeptídeo compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno.

[062] Modalidade 56. O polipeptídeo, de acordo com a modalida-

de 55, em que o polipeptídeo compreende dois, três ou quatro domí- nios de ligação ao antígeno.

[063] Modalidade 57. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 55 ou modalidade 56, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um antígeno de célula T ou a um antígeno de célula exterminadora natural.

[064] Modalidade 58. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 55-57, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um antígeno de célula T CD4+ ou a um antí- geno de célula T CD8+.

[065] Modalidade 59. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 58, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um antígeno em uma célula T CD4+ ativada ou em uma célula T CD8+ ativada.

[066] Modalidade 60. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 55-59, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno é um agonista.

[067] Modalidade 61. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 55-59, em que o domínio de ligação ao antígeno é um antago- nista.

[068] Modalidade 62. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 55-61, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-1BB, OX40, GITR, CD8a, CD8b, CD4, NKp30, NKG2A, TIGIT, TGFβR1, TGFβR2, Fas, NKG2D, NKp46, PD-L1, CD107a, ICOS, TNFR2 ou CD16a.

[069] Modalidade 63. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 55-62, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a PD-1.

[070] Modalidade 64. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 55-63, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno humano ou humanizado.

[071] Modalidade 65. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 64, em que cada domínio de ligação ao antígeno é, independente- mente, um domínio de ligação ao antígeno humano ou humanizado.

[072] Modalidade 66. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 55-65, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VHH.

[073] Modalidade 67. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 66, em que cada domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VHH.

[074] Modalidade 68. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 55-65, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno compreende um domínio VH e um domínio VL.

[075] Modalidade 69. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 68, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno com- preende o domínio VH e o domínio VL de um anticorpo selecionado a partir de pembrolizumabe, nivolumabe, AMP-514, TSR-042, STI- A1110, ipilimumabe, tremelimumabe, urelumabe, utomilumabe, atezo- lizumabe e durvalumabe.

[076] Modalidade 70. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 68 ou 69, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno compreende um Fv de cadeia única (scFv).

[077] Modalidade 71. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 68 ou 69, em que o polipeptídeo compreende uma região constante de cadeia pesada, em que o domínio VH é fundido à região constante de cadeia pesada e em que o domínio VL está associado ao domínio VH.

[078] Modalidade 72. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 71, em que o domínio VL é fundido a uma região constante de ca- deia leve.

[079] Modalidade 73. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 72, em que a região constante de cadeia leve é selecionada a partir de capa e lambda.

[080] Modalidade 74. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 55-73, em que cada um dos domínios de ligação ao antígeno é igual.

[081] Modalidade 75. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 55-74, em que cada um dos domínios de ligação ao antígeno se liga especificamente ao mesmo antígeno.

[082] Modalidade 76. O polipeptídeo, de acordo com a modalida- de 55-73, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno se liga especificamente a um antígeno diferente de pelo menos um dos outros domínios de ligação ao antígeno.

[083] Modalidade 77. O polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 55-73, em que pelo menos um domínio de liga- ção ao antígeno se liga especificamente a PD-1 e pelo menos um ou- tro domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um antí- geno de célula T ou antígeno de célula exterminadora natural diferente de PD-1 .

[084] Modalidade 78. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 55-77, em que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-1BB, OX40, GITR, CD8a, CD8b, CD4, NKp30, NKG2A, TIGIT, TGFβR1, TGFβR2, Fas, NKG2D, NKp46, PD-L1, CD107a, ICOS, TNFR2 ou CD16a.

[085] Modalidade 79. O polipeptídeo de qualquer uma das moda- lidades 31-78, em que o polipeptídeo forma um homodímero sob con- dições fisiológicas.

[086] Modalidade 80. O polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-79, em que a IL-2 modificada se liga a um IL- 2R humano com uma afinidade de pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 ve-

zes, 5 vezes, 6 vezes, 7- vezes, 8 vezes, 9 vezes, pelo menos 10 ve- zes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 ve- zes, ou pelo menos 100 vezes menor do que a afinidade de IL-2 tipo selvagem humana para o IL-2R.

[087] Modalidade 81. Um complexo compreendendo um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o primeiro polipeptí- deo é o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-79.

[088] Modalidade 82. O complexo da modalidade 81, em que o primeiro polipeptídeo compreende uma primeira região de Fc e o se- gundo polipeptídeo compreende uma segunda região de Fc.

[089] Modalidade 83. O complexo da modalidade 81 ou modali- dade 82, em que cada região de Fc é um isótipo selecionado de IgG1, IgG2, IgG3, uma IgG4 humana.

[090] Modalidade 84. O complexo da modalidade 83, em que ca- da região de Fc é uma IgG1 humana.

[091] Modalidade 85. O complexo de qualquer uma das modali- dades 81-84, em que cada região de Fc compreende uma deleção dos aminoácidos E233, L234 e L235.

[092] Modalidade 86. O complexo de qualquer uma das modali- dades 81-85, em que cada região de Fc compreende uma mutação H435R ou H435K.

[093] Modalidade 87. O complexo de qualquer uma das modali- dades 81-86, em que a região de Fc compreende mutações M252Y e M428L ou mutações M252Y e M428V.

[094] Modalidade 88. O complexo de qualquer uma das modali- dades 81-87, em que a primeira região de Fc ou a segunda região de Fc compreende uma mutação T366W e a outra região de Fc compre- ende mutações T366S, L368A e Y407V.

[095] Modalidade 89. O complexo da modalidade 88, em que a primeira região de Fc ou a segunda região de Fc compreende uma mutação S354C.

[096] Modalidade 90. O complexo de qualquer uma das modali- dades 81-89, em que cada região de Fc compreende independente- mente uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 47-83.

[097] Modalidade 91. O complexo de qualquer uma das modali- dades 81-90, em que o segundo polipeptídeo não compreende uma IL2 modificada.

[098] Modalidade 92. O complexo de qualquer uma das modali- dades 81-91, em que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno.

[099] Modalidade 93. O complexo de qualquer uma das modali- dades 81-92, em que o segundo polipeptídeo compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno.

[0100] Modalidade 94. O complexo de qualquer uma das modali- dades 81-93, em que o primeiro polipeptídeo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno, uma região de Fc e uma IL-2 modifi- cada.

[0101] Modalidade 95. O complexo da modalidade 94, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido ao terminal N da região de Fc e a IL-2 modificada é fundida ao terminal C da região de Fc.

[0102] Modalidade 96. O complexo da modalidade 94 ou modali- dade 95, em que o segundo polipeptídeo compreende um segundo domínio de ligação ao antígeno e uma região de Fc.

[0103] Modalidade 97. O complexo da modalidade 96, em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de liga- ção ao antígeno são iguais ou diferentes.

[0104] Modalidade 98. O complexo da modalidade 97, em que:

a) o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno ligam-se a PD-1; b) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a LAG3; c) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4; d) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a 4-1BB; e) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a OX40; f) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a GITR; g) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD8a; h) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD8b; i) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD4; j) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKp30; k) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2A; l) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TIGIT; m) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD- 1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2D; n) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TGFBR2; o) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Fas;

p) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD107a; q) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKp46; r) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD8a e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TGFRβR2; s) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD8a e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Fas; t) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2D e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TGFRβR2; u) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2D e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Fas; v) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2A e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TGFRβR2; w) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2A e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Fas; x) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKp46, e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TGFRβR2; y) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKp46, e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Fas; z) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a LAG3; aa) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Tim3; bb) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a OX40; cc) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a

CTLA-4 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a GITR; dd) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD107a; ee) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4, e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKp46; ou ff) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a ICOS e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TNFR2.

[0105] Modalidade 99. O complexo de qualquer uma das modali- dades 81-98, em que a IL-2 modificada se liga a um IL-2R humano com uma afinidade de pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7- vezes, 8 vezes, 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes menor do que a afinidade de IL-2 tipo selvagem humana para o IL-2R.

[0106] Modalidade 100. Uma composição farmacêutica que com- preende um polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-80 ou o complexo de qualquer uma das modalidades 81-99 e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0107] Modalidade 101. Um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-80 ou o complexo de qualquer uma das modalidades 81-99.

[0108] Modalidade 102. Um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico da modalidade 101.

[0109] Modalidade 103. Uma célula hospedeira isolada compreen- dendo o ácido nucleico da modalidade 101 ou o vetor de expressão da modalidade 102.

[0110] Modalidade 104. Uma célula hospedeira isolada que ex- pressa o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-80 ou o complexo de qualquer uma das modalidades 81-99.

[0111] Modalidade 105. Um método para produzir o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-80 ou o complexo de qualquer uma das modalidades 81-99, caracterizado pelo fato de que compre- ende a incubação da célula hospedeira da modalidade 103 ou modali- dade 104 sob condições adequadas para expressar o polipeptídeo ou complexo.

[0112] Modalidade 106. O método da modalidade 105, compreen- dendo ainda isolar o polipeptídeo ou complexo.

[0113] Modalidade 107. Um método para aumentar a proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+, caracterizado pelo fato de que compre- ende o contato das células T com o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-80 ou o complexo de qualquer uma das modalidades 81-99.

[0114] Modalidade 108. O método da modalidade 107, em que as células T CD4+ e/ou CD8+ são in vitro.

[0115] Modalidade 109. O método da modalidade 107, em que as células T CD4+ e/ou CD8+ estão in vivo.

[0116] Modalidade 110. O método de qualquer uma das modalida- des 107-109, em que o aumento é pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes.

[0117] Modalidade 111. Um método para aumentar a proliferação de células NK, caracterizado pelo fato de que compreende o contato das células NK com o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 1-80 ou o complexo de qualquer uma das modalidades 81-99.

[0118] Modalidade 112. O método da modalidade 111, em que o aumento é pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 ve- zes ou pelo menos 5 vezes.

[0119] Modalidade 113. Método de tratamento de câncer, caracte- rizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo com câncer de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do polipep- tídeo de qualquer uma das modalidades 1-80 ou o complexo de qual- quer uma das modalidades 81-99 ou a composição farmacêutica da modalidade 100.

[0120] Modalidade 114. Método, de acordo com a modalidade 113, em que o câncer é selecionado a partir de carcinoma de células ba- sais, câncer do trato biliar; câncer de bexiga; câncer nos ossos; câncer do cérebro e do sistema nervoso central; câncer de mama; câncer do peritônio; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer de cólon e reto; cân- cer do tecido conjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer do en- dométrio; câncer de esôfago; câncer de olho; câncer de cabeça e pes- coço; câncer gástrico; câncer gastrointestinal; glioblastoma; carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intraepitelial; câncer dos rins ou renal; câncer de laringe; câncer de fígado; câncer de pulmão; câncer de pul- mão de células pequenas; câncer de pulmão de células não pequenas; adenocarcinoma do pulmão; carcinoma escamoso do pulmão; mela- noma; mieloma; neuroblastoma; câncer de cavidade oral; câncer do ovário; câncer de pâncreas; câncer de próstata; retinoblastoma; rab- domiossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; carcino- ma de glândula salivar; sarcoma; câncer de pele; câncer de células escamosas; câncer de estômago; câncer de testículo; câncer de tireoi- de; câncer uterino ou endometrial; câncer do sistema urinário; câncer de vulva; linfoma; linfoma de Hodgkin; linfoma não-Hodgkin; linfoma de células B; linfoma não-Hodgkin (NHL) de baixo grau/folicular; NHL lin- focítico pequeno (SL); grau intermediário/NHL folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de células pequenas não clivadas de alto grau; do- ença volumosa NHL; linfoma de células de revestimento; linfoma rela- cionado à AIDS; macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocí- tica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de cé-

lulas pilosas; e leucemia mieloblástica crônica.

[0121] Modalidade 115. O método da modalidade 113 ou 114, compreendendo ainda a administração de um agente terapêutico adi- cional.

[0122] Modalidade 116. Método, de acordo com a modalidade 115, em que o agente terapêutico adicional é um agente anticâncer.

[0123] Modalidade 117. Método, de acordo com a modalidade 116, em que o agente anticâncer é selecionado a partir de um agente qui- mioterápico, um biológico anticâncer, radioterapia, terapia com T CAR e um vírus oncolítico.

[0124] Modalidade 118. O método da modalidade 116 ou modali- dade 117, em que o agente terapêutico adicional é um biológico anti- câncer.

[0125] Modalidade 119. Método, de acordo com a modalidade 118, em que o biológico anticâncer é um agente que inibe PD-1 e/ou PD- L1.

[0126] Modalidade 120. Método, de acordo com a modalidade 118, em que o biológico anticâncer é um agente que inibe VISTA, gpNMB, B7H3, B7H4, HHLA2, CTLA4 ou TIGIT.

[0127] Modalidade 121. O método de qualquer uma das modalida- des 116-120, em que o agente anticâncer é um anticorpo.

[0128] Modalidade 122. O método da modalidade 118, em que o biológico anticâncer é uma citocina.

[0129] Modalidade 123. O método da modalidade 116, em que o agente anticâncer é a terapia com T CAR.

[0130] Modalidade 124. Método, de acordo com a modalidade 116, em que o agente anticâncer é um vírus oncolítico.

[0131] Modalidade 125. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 113-124, compreendendo ainda a ressecção do tumor e/ou radioterapia.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0132] As FIG. 1A-1H mostram esquemas de vários formatos de proteína de fusão IL-2. A FIG. 1A mostra IL-2 ligada ao terminal N de um Fc de IgG1 heterodimérico, knob-in-hole. A FIG. 1B mostra IL-2 ligada ao terminal C de um Fc de IgG1 heterodimérico de um anticorpo de domínio único. A FIG. 1C-1E mostra IL-2 ligada a um VHH (FIG. 1E), dois VHHs idênticos (FIG. 1C) ou dois VHHs diferentes (FIG. 1D). A FIG. 1F mostra IL-2 ligada ao terminal C de uma região constante de cadeia homodimérica de um anticorpo convencional. A FIG. 1G mostra IL-2 ligada ao terminal C de uma região constante de cadeia pesada heterodimérica de um anticorpo convencional. A FIG. 1H mostra IL-2 fundida ao terminal C de um anticorpo scFv heterodimérico.

[0133] As FIG. 2A-2C mostram a ligação de proteínas de fusão de IL-2 compreendendo IL-2 tipo selvagem (FIG. 2A) ou uma IL-2 modifi- cada (FIG. 2A-2C) fundida ao terminal N de um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1A, para células 293F transientemente trans- fectadas com várias combinações do receptor de IL-2 (CD25, CD122 e CD132), conforme medido por citometria de fluxo. “UT 293F” indica células 293F não transfectadas.

[0134] As FIG. 3A-3B mostram a ligação de proteínas de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem ou uma IL-2 modificada fundida ao terminal N de um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1A, para células 293F transitoriamente transfectadas com CD25 e CD122, con- forme medido por citometria de fluxo.

[0135] As FIG. 4A-4B mostram a ligação de proteínas de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem ou uma IL-2 modificada fundida ao terminal N de um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1A, para células 293F transientemente transfectadas com CD122 e CD132; ou CD25, CD122 e CD132, conforme medido por citometria de fluxo.

[0136] As FIG. 5A-5B mostram a ligação de proteínas de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem ou uma IL-2 modificada fundida ao terminal C de um VHH não direcionado ligado a um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1B, para células T CD4+ em repouso e ativa- das, conforme medido por citometria de fluxo. “Controle de isótipo” in- dica uma proteína de controle que não compreende IL-2.

[0137] As FIG. 6A-6C mostram a ligação de proteínas de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem ou uma IL-2 modificada fundida ao terminal C de um VHH não direcionado ligado a um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1B, para células T reguladoras enriquecidas (Tregs, FIG. 6A), células T reguladoras induzidas (Tregs induzidas, FIG. 6B) e células T CD4+ respondedoras enriquecidas (Tresps, FIG. 6C), conforme medido por citometria de fluxo.

[0138] As FIG. 7A-7D mostram a atividade de proteínas de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem ou uma IL-2 modificada fundida ao terminal C de um VHH não direcionado ligado a um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1B, em células T CD4+ e CD8+ em repouso. A proliferação (FIG. 7A e 7C) e os níveis de CD71 (FIG. 7B e 7D) foram medidos. A FIG. 7E-7F mostram atividade de IL-2 tipo selvagem ou uma IL-2 modificada fundida ao terminal C de um VHH não direciona- do ligado a um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1B, em cé- lulas T CD4+ e CD8+ em repouso, conforme medido por detecção de citometria de fluxo de níveis de STAT5 intracelulares fosforilados. “Isó- tipo” indica uma proteína de controle que não compreende IL-2.

[0139] A FIG. 8A-8B mostram a proliferação e os níveis de CD25 como um marcador de ativação de Tregs enriquecidas após o trata- mento por 7 dias com uma proteína de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem ou uma IL-2 modificada fundida ao terminal C de um VHH não direcionado ligado a um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1B.

[0140] As FIG. 9A-9D mostram atividade e ligação de pembrolizu-

mabe, um análogo de pembrolizumabe com IL-2-RAS fundido ao ter- minal C da cadeia pesada, como mostrado na FIG. 1F, e IL-2-RAS so- zinho (FIG. 9C e 9D) em células T CD8+ e CD4+. A atividade em célu- las T CD8+ (FIG. 9A) e CD4+ (FIG. 9B) foi medida por detecção de ci- tometria de fluxo de CellTrace™ Violet. A extensão de ligação a célu- las T CD8+ (FIG. 9C) e células T CD4+ (FIG. 9D) foi medida por cito- metria de fluxo.

[0141] As FIG. 10A-10D mostram dependência de indução de pro- liferação de células T CD8+ e CD4+ em IL-2. Efeitos de pembrolizuma- be, IL-2-RAS não direcionado e um análogo de pembrolizumabe com IL-2-RAS fundido ao terminal C da cadeia pesada, como mostrado na FIG. 1F, em CD8+ (FIG. 10A e 10C) ou CD4+ (FIG. 10B e 10D) prolife- ração de células T sem pré-bloqueio (FIG. 10A e 10B) ou pré- bloqueado com uma concentração saturante de pembrolizumabe (FIG. 10C e 10D) são mostrados.

[0142] A FIG. 11 mostra a recuperação da proliferação de células CD4+ T respondedoras (Tresp) por um análogo de pembrolizumabe com IL-2-RAS fundido ao terminal C da cadeia pesada, como mostra- do na FIG. 1F, bem como IL-2-RAS fundido ao terminal C de um VHH não direcionado, como mostrado na FIG. 1B e IL-2 tipo selvagem fun- didos ao terminal C de um VHH não direcionado, como mostrado na FIG. 1B. A proliferação de Tresp foi induzida por engajamento de CD3 (Tresp + contas), e então suprimida usando células T reguladoras au- tólogas (Treg). A linha "Tresp + contas" mostra a proliferação de célu- las Tresp de base com engajamento de CD3 na ausência de células Treg. A linha "No Ab" mostra a proliferação de células Tresp de base com engajamento de CD3 na presença de células Treg.

[0143] As FIG. 12A-12B mostram a transativação de células T por IL-2 tipo selvagem não direcionado ligado à placa ("IL-2 WT") ou IL-2- RAS fundido ao terminal C de um VHH não direcionado, como mostra-

do na FIG. A ativação das células 1B.T foi medida por detecção de ci- tometria de fluxo de níveis de STAT5 intracelulares fosforilados. As respostas das células T CD8+ (FIG. 12A) e das células T CD4+ (FIG. 12B) são mostradas.

[0144] As FIG. 13A-13I mostram a atividade e a ligação de IL-2- RAS fundido ao terminal C de um anticorpo scFv heterodimérico dire- cionado a NKp46, como mostrado na FIG. 1H, o anticorpo scFv hete- rodimérico direcionado a NKp46 sozinho e proteínas de fusão compre- endendo IL-2 ou IL-2-RAS tipo selvagem fundido ao terminal C de um VHH não direcionado ligado a um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1B, em células NK, células T CD8+ e células T CD4+. Prolifera- ção de células NK (FIG. 13A), células T CD8+ (FIG. 13B) e células T CD4+ (FIG. 13C) e níveis de pSTAT de células NK (FIG. 13D), células T CD8+ (FIG. 13E) e células T CD4+ (FIG. 13F) foram medidas por ci- tometria de fluxo. A ligação dos polipeptídeos indicados às células NK (FIG. 13G), células T CD8+ (FIG. 13H) e células T CD4+ (FIG. 13I) também foi medida por citometria de fluxo.

[0145] As FIG. 14A-14H mostram atividade e ligação em células T CD8+ ou CD4+ de IL-2-RAS fundidas ao terminal C de um anticorpo convencional heterodimérico anti-LAG3 (MAb), como mostrado na FIG. 1G, IL-2-RAS fundido ao terminal C de um VHH anti-LAG3 com um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1B, IL-2-RAS fundido ao ter- minal C de um VHH não direcionado, como mostrado na FIG. 1B, IL-2 tipo selvagem fundido ao terminal C de um Fc heterodimérico não di- recionado, como mostrado na FIG. 1B, ou moléculas VHH-Fc direcio- nadas a LAG3 direcionadas a LAG3 sem IL-2. Proliferação de células T CD8+ (FIG. 14A) e células T CD4+ (FIG. 14B) e expressão dos mar- cadores de ativação CD25 (FIG. 14C e 14D) e CD71 (FIG. 14E e 14F) em células T CD8+ (FIG. 14C e 14E) e células T CD4+ (FIG. 14D e 14F) foram medidas por citometria de fluxo. A FIG. 14G e 14H mos-

tram ligação a células T CD8+ pré-ativadas (FIG. 14G) e células T CD4+ (FIG. 14H).

[0146] A FIG. 15 mostra a atividade de proteínas de fusão com- preendendo a IL-2 modificada indicada fundida ao terminal C de um VHH com um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1B, em célu- las repórter HEK-Blue IL-2 que não expressam o antígeno alvo de VHH e, portanto, dependem apenas da ligação da IL-2 modificada ao receptor de IL-2 superexpresso para indução do gene repórter. A ativi- dade da fosfatase alcalina embrionária segregada expressa em res- posta à indução mediada pelo receptor de IL-2 da sinalização de pSTAT5 na célula repórter foi medida.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0147] As modalidades fornecidas neste documento referem-se a polipeptídeos compreendendo uma IL-2 modificada que modula a ati- vidade de células T e seu uso em vários métodos de tratamento de câncer. Definições e Várias Modalidades

[0148] Os títulos das seções usados neste documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitan- do o assunto descrito.

[0149] Todas as referências citadas neste documento, incluindo pedidos de patentes, publicações de patentes e números de acesso do Genbank são incorporados aqui por referência, como se cada referên- cia individual fosse específica e individualmente indicada para ser in- corporada por referência em sua totalidade.

[0150] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados neste documento são geralmente bem compreendidos e comumente empregados usando metodologia convencional por aqueles versados na técnica, tal como, por exemplo, as metodologias amplamente utili- zadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory

Manual 3a. edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIO- LOGY (F. M. Ausubel, et al.eds., (2003)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL AP- PROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATO- RY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Note- book (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Cul- ture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunol- ogy (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Proto- cols in Immunology (J. E. Coliganet al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibod- ies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Mon- oclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Ac- ademic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of On- cology (V. T. DeVitaet al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993); e suas versões atualizadas.

[0151] A menos que definido de outra forma, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente descrição devem ter os significados que são comumente entendidos por aqueles versados na técnica. Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo contexto ou expressamente indicado, os termos no singular devem incluir plura- lidades e os termos no plural devem incluir o singular. Para qualquer conflito nas definições entre várias fontes ou referências, a definição fornecida neste documento prevalecerá.

[0152] Em geral, a numeração dos resíduos em uma cadeia pesa- da de imunoglobulina é aquela do índice EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). O “índice EU como em Kabat” refere-se à numeração de resíduos do anticorpo IgG1 EU humano.

[0153] Entende-se que as modalidades da invenção aqui descritas incluem "consistindo" e/ou "consistindo essencialmente em" modalida- des. Quando usado neste documento, a forma singular "um", "uma" e "o" inclui referências no plural, a menos que indicado de outra forma. O uso do termo "ou" aqui não significa que as alternativas sejam mutua- mente exclusivas.

[0154] Neste pedido, o uso de "ou" significa "e/ou", a menos que expressamente declarado ou entendido por alguém versado na técni- ca. No contexto de uma reivindicação dependente múltipla, o uso de "ou" refere-se a mais de uma reivindicação independente ou depen- dente anterior.

[0155] A frase "amostra de referência", "célula de referência" ou "tecido de referência" denota uma amostra com pelo menos uma ca- racterística conhecida que pode ser usada como uma comparação com uma amostra com pelo menos uma característica desconhecida. Em algumas modalidades, uma amostra de referência pode ser usada como indicador positivo ou negativo. Uma amostra de referência pode ser usada para estabelecer um nível de proteína e/ou mRNA que está presente, por exemplo, em tecido saudável, em contraste com um ní- vel de proteína e/ou mRNA presente na amostra com características desconhecidas. Em algumas modalidades, a amostra de referência vem do mesmo indivíduo, mas é de uma parte do indivíduo diferente daquela que está sendo testada. Em algumas modalidades, a amostra de referência é de uma área de tecido circundante ou adjacente ao câncer. Em algumas modalidades, a amostra de referência não é do indivíduo sendo testado, mas é uma amostra de um indivíduo conheci- do por ter, ou não ter, um distúrbio em questão (por exemplo, um cân- cer específico ou distúrbio relacionado a células T). Em algumas mo- dalidades, a amostra de referência é do mesmo indivíduo, mas de um ponto no tempo antes de o indivíduo desenvolver câncer. Em algumas modalidades, a amostra de referência é de uma amostra de câncer benigno, do mesmo indivíduo ou de um indivíduo diferente. Quando uma amostra de referência negativa é usada para comparação, o nível de expressão ou quantidade da molécula em questão na amostra de referência negativa irá indicar um nível no qual alguém versado na técnica apreciará, dada a presente descrição, que não há e/ou um bai- xo nível da molécula. Quando uma amostra de referência positiva é usada para comparação, o nível de expressão ou quantidade da molé- cula em questão na amostra de referência positiva indicará um nível no qual alguém versado na técnica apreciará, dada a presente descri- ção, que existe um nível da molécula.

[0156] Os termos "benefício", "benefício clínico", "capacidade de resposta" e "capacidade de resposta terapêutica", quando usados neste documento no contexto de se beneficiar ou responder à adminis- tração de um agente terapêutico, podem ser medidos avaliando vários pontos finais, por exemplo, inibição, até certo ponto, de progressão da doença, incluindo desaceleração e parada completa; redução do nú- mero de episódios e/ou sintomas da doença; redução no tamanho da lesão; inibição (isto é, redução, desaceleração ou parada completa) da infiltração de células da doença em órgãos e/ou tecidos periféricos ad- jacentes; inibição (isto é, redução, desaceleração ou parada completa) da propagação da doença; alívio, até certo ponto, de um ou mais sin- tomas associados ao distúrbio; aumento na duração da apresentação livre de doença após o tratamento, por exemplo, sobrevida livre de progressão; aumento da sobrevida geral; maior taxa de resposta; e/ou diminuição da mortalidade em um determinado ponto do tempo após o tratamento. Um indivíduo ou câncer que “não é responsivo” ou “não responde” é aquele que falhou em atender às qualificações menciona- das acima para ser “responsivo”.

[0157] Os termos "molécula de ácido nucleico", "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" podem ser usados indistintamente e referem-se a um polímero de nucleotídeos. Esses polímeros de nucleotídeos podem conter nucleotídeos naturais e/ou não naturais e incluem, mas não es- tão limitados a, DNA, RNA e PNA. "Sequência de ácido nucleico" refe- re-se à sequência linear de nucleotídeos compreendidos na molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo.

[0158] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados indistintamente para se referir a um polímero de resíduos de aminoá- cidos e não estão limitados a um comprimento mínimo. Esses políme- ros de resíduos de aminoácidos podem conter resíduos de aminoáci- dos naturais ou não naturais e incluem, mas não estão limitados a, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, trímeros e multímeros de resíduos de aminoácidos. Ambas as proteínas de comprimento total e seus fra- gmentos são abrangidos pela definição. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosila- ção, sialilação, acetilação, fosforilação e semelhantes. Além disso, pa- ra os fins da presente descrição, um "polipeptídeo" refere-se a uma proteína que inclui modificações, tais como deleções, adições e substi-

tuições (geralmente de natureza conservadora), na sequência nativa, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Essas modifica- ções podem ser deliberadas, como por meio de mutagênese direcio- nada ao sítio, ou podem ser acidentais, como por meio de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplifi- cação por PCR. "Sequência de aminoácidos" refere-se à sequência linear de aminoácidos compreendidos em um polipeptídeo ou proteína.

[0159] "IL-2" ou "Interleucina-2", quando usado neste documento, refere-se a qualquer IL-2 madura nativa que resulta do processamento de um precursor de IL-2 em uma célula. O termo inclui IL-2 de qual- quer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos e macacos cinomolgo ou reso) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra for- ma. O termo também inclui variantes de ocorrência natural de IL-2, tais como variantes de splice ou variantes alélicas. Uma sequência de aminoácidos de IL-2 humana exemplar não limitante é mostrada, por exemplo, no GenBank No. de Acesso NP_000577.2. Veja, SEQ ID NO. 1 (forma madura).

[0160] "IL-2 modificada", quando usada neste documento, refere- se a um polipeptídeo que difere de uma sequência de aminoácidos de IL-2 tipo selvagem por uma substituição de pelo menos uma posição de aminoácido.

[0161] O termo "liga-se especificamente" a um antígeno ou epitopo é um termo que é bem compreendido na técnica e os métodos para determinar tal ligação específica também são bem conhecidos na téc- nica. Diz-se que uma molécula exibe "ligação específica" ou "ligação preferencial" se ela reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma célula ou substância particular do que com células ou substâncias al- ternativas. Um domínio de ligação ao antígeno "se liga especificamen-

te" ou "se liga preferencialmente" a um antígeno se ele se liga com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias. Por exemplo, o polipeptídeo conten- do asdAb ou VHH que se liga especificamente ou preferencialmente a um epitopo é um polipeptídeo contendo sdAb ou VHH que se liga a este epitopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros epitopos em o mesmo antígeno alvo ou epitopos em outros antígenos alvo. Também é entendido ao ler esta definição que; por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente ou preferencialmente a um primeiro antí- geno pode ou não se ligar especificamente ou preferencialmente a um segundo antígeno. Como tal, "ligação específica" ou "ligação preferen- cial" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclu- siva. Geralmente, mas não necessariamente, a referência à ligação significa ligação preferencial. "Especificidade" refere-se à capacidade de uma proteína de ligação de se ligar seletivamente a um antígeno.

[0162] Quando usado neste documento, o termo "modular" em re- lação à atividade de IL-2 se refere a uma mudança na atividade de IL-

2. Em algumas modalidades, "modular" se refere a um aumento na atividade de IL-2.

[0163] Quando usado neste documento, o termo "epitopo" refere- se a um local em uma molécula alvo (por exemplo, um antígeno, como uma proteína, ácido nucleico, carboidrato ou lipídeo) ao qual uma mo- lécula de ligação ao antígeno (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno contendo polipeptídeo) se liga. Os epitopos frequentemente incluem um agrupamento de moléculas de superfície quimicamente ativa, como aminoácidos, polipeptídeos ou cadeias laterais de açúcar e têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epitopos podem ser formados a partir de resíduos não contíguos contíguos e/ou justapostos (por exemplo, aminoácidos, nucleotídeos, açúcares, porção lipídica) da mo- lécula alvo. Os epitopos formados a partir de resíduos contíguos (por exemplo, aminoácidos, nucleotídeos, açúcares, porção lipídica) nor- malmente são retidos na exposição a solventes desnaturantes, en- quanto os epitopos formados por duplicação terciária normalmente são perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo po- de incluir, mas não está limitado a pelo menos 3, pelo menos 5 ou 8- 10 resíduos (por exemplo, aminoácidos ou nucleotídeos). Em algumas modalidades, um epitopo tem menos de 20 resíduos (por exemplo, aminoácidos ou nucleotídeos) de comprimento, menos de 15 resíduos ou menos de 12 resíduos. Dois anticorpos podem se ligar ao mesmo epitopo dentro de um antígeno se exibirem ligação competitiva para o antígeno. Em algumas modalidades, um epitopo pode ser identificado por uma certa distância mínima a um resíduo de CDR na molécula de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, um epitopo pode ser identificado pela distância acima e ainda limitado aos resíduos envol- vidos em uma ligação (por exemplo, uma ligação de hidrogênio) entre um resíduo da molécula de ligação ao antígeno e um resíduo de antí- geno. Um epitopo também pode ser identificado por várias varreduras, por exemplo, uma varredura de alanina ou arginina pode indicar um ou mais resíduos com os quais a molécula de ligação ao antígeno pode interagir. A menos que explicitamente denotado, um conjunto de resí- duos como um epitopo não exclui outros resíduos de fazerem parte do epitopo para um determinado domínio de ligação ao antígeno ou mo- lécula. Em vez disso, a presença de tal conjunto designa uma série mínima (ou conjunto de espécies) de epitopos. Assim, em algumas modalidades, um conjunto de resíduos identificados como um epitopo designa um epitopo mínimo de relevância para o antígeno, em vez de uma lista exclusiva de resíduos para um epitopo em um antígeno.

[0164] Um "epitopo não linear" ou "epitopo conformacional" com-

preende polipeptídeos não contíguos, aminoácidos e/ou açúcares den- tro da proteína antigênica à qual se liga uma molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, um polipeptídeo contendo um domínio de liga- ção ao antígeno) específico ao epitopo. Em algumas modalidades, pe- lo menos um dos resíduos será não contíguo com os outros resíduos observados do epitopo; no entanto, um ou mais dos resíduos também podem ser contíguos com os outros resíduos.

[0165] Um "epitopo linear" compreende polipeptídeos contíguos, aminoácidos e/ou açúcares dentro da proteína antigênica à qual se liga uma molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, um polipeptí- deo contendo um domínio de ligação ao antígeno) específico ao epito- po. É notado que, em algumas modalidades, nem todos os resíduos dentro do epitopo linear precisam ser diretamente ligados (ou envolvi- dos em uma ligação) pela molécula de ligação ao antígeno. Em algu- mas modalidades, os epitopos lineares podem ser de imunizações com um peptídeo que consistia efetivamente na sequência do epitopo linear ou de seções estruturais de uma proteína que são relativamente isoladas do restante da proteína (de modo que a molécula de ligação ao antígeno possa interagir, pelo menos principalmente), apenas com essa seção de sequência.

[0166] Os termos "anticorpo" e "molécula de ligação ao antígeno" são usados alternadamente no sentido mais amplo e abrangem vários polipeptídeos que compreendem domínios de ligação ao antígeno, in- cluindo, mas não se limitando a anticorpos convencionais (tipicamente compreendendo pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve), - anticorpos de domínio (sdAbs, compreendendo apenas uma cadeia, que é tipicamente semelhante a uma cadeia pesada), po- lipeptídeos contendo VHH (polipeptídeos compreendendo pelo menos um domínio variável de anticorpo apenas de cadeia pesada, ou VHH) e fragmentos de qualquer um dos anteriores, desde que exibam a ati-

vidade de ligação ao antígeno desejada. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende um domínio de dimerização. Tais domínios de dimerização incluem, mas não estão limitados a, domínios constan- tes de cadeia pesada (compreendendo CH1, articulação, CH2 e CH3, onde CH1 normalmente emparelha com um domínio constante de ca- deia leve, CL, enquanto a articulação media a dimerização) e regiões de Fc (compreendendo articulação, CH2 e CH3, onde a articulação media a dimerização). O termo anticorpo também inclui, mas não está limitado a, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticor- pos de várias espécies, tais como camelídeo (incluindo lhama), tuba- rão, camundongo, humano, macaco cinomolgo, etc.

[0167] Os termos "anticorpo de domínio único" e "sdAb" são usa- dos indistintamente aqui para se referir a um anticorpo com um único domínio monomérico, tipicamente uma cadeia pesada (ou VHH), sem uma cadeia leve.

[0168] O termo "VHH" ou "domínio VHH" ou "domínio de ligação ao antígeno VHH", quando usado neste documento, refere-se à porção de ligação ao antígeno de um anticorpo de domínio único, como um anticorpo de camelídeo ou anticorpo de tubarão. Em algumas modali- dades, um VHH compreende três CDRs e quatro regiões estruturais, designadas FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Em algumas modalidades, um VHH pode ser truncado no terminal N ou terminal C de modo que compreende apenas uma FR1 e/ou FR4 parcial, ou não tem uma ou ambas as regiões estruturais, desde que o VHH mantenha substancialmente a ligação ao antígeno e especificidade.

[0169] O termo "polipeptídeo contendo VHH" refere-se a um poli- peptídeo que compreende pelo menos um domínio VHH. Em algumas modalidades, um polipeptídeo VHH compreende dois, três ou quatro ou mais domínios VHH, em que cada domínio VHH pode ser igual ou diferente. Em algumas modalidades, um polipeptídeo contendo VHH compreende uma região de Fc. Em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo VHH pode formar um dímero. Estruturas não limitantes de polipeptídeos contendo VHH incluem VHH1-Fc, VHH1-VHH2-Fc e VHH1-VHH2-VHH3-Fc, em que VHH1, VHH2 e VHH3 podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades de tais estruturas, um VHH pode ser conectado a outro VHH por um ligante, ou um VHH po- de ser conectado ao Fc por um ligante. Em algumas de tais modalida- des, o ligante compreende 1-20 aminoácidos, de preferência 1-20 aminoácidos predominantemente compostos de glicina e, opcional- mente, serina. Em algumas modalidades, quando um polipeptídeo contendo VHH compreende um Fc, ele forma um dímero. Assim, a es- trutura VHH1-VHH2-Fc, se formar um dímero, é considerada tetrava- lente (isto é, o dímero tem quatro domínios VHH). Da mesma forma, a estrutura VHH1-VHH2-VHH3-Fc, se formar um dímero, é considerada hexavalente (isto é, o dímero tem seis domínios VHH).

[0170] O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo (incluindo um polipeptídeo contendo sdAb ou VHH) de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, isto é, os anticorpos indi- viduais que compreendem a população são idênticos, exceto por pos- síveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente es- pecíficos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra dife- rentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcio- nado contra um único determinante no antígeno. Assim, uma amostra de anticorpos monoclonais pode se ligar ao mesmo epitopo no antíge- no. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de an- ticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do an-

ticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiro des- crito por Kohler e Milstein, 1975, Nature 256: 495, ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante, como descrito na Pat. No.

4.816.567. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de fagos geradas usando as técnicas descritas em McCaf- ferty et al., 1990, Nature 348: 552-554, por exemplo.

[0171] O termo "CDR" denota uma região determinante de com- plementaridade conforme definido por pelo menos uma maneira de identificação para alguém versado na técnica. Em algumas modalida- des, os CDRs podem ser definidos de acordo com qualquer um dos esquemas de numeração de Chothia, o esquema de numeração de Kabat, uma combinação de Kabat e Chothia, a definição AbM e/ou a definição de contato. Um VHH compreende três CDRs, designados CDR1, CDR2 e CDR3.

[0172] O termo "região constante de cadeia pesada", quando usa- do neste documento, refere-se a uma região que compreende pelo menos três domínios constantes da cadeia pesada, CH1, articulação, CH2 e CH3. Obviamente, as deleções e alterações que não alteram a função dentro dos domínios são abrangidas pelo escopo do termo "re- gião constante de cadeia pesada", a menos que designado de outra forma. As regiões constantes de cadeia pesada exemplares não limi- tantes incluem γ, δ e α. As regiões constantes de cadeia pesada exemplares não limitantes também incluem ε e μ. Cada região cons- tante pesada corresponde a um isótipo de anticorpo. Por exemplo, um anticorpo compreendendo uma região constante γ é um anticorpo IgG, um anticorpo compreendendo uma região constante δ é um anticorpo IgD e um anticorpo compreendendo uma região constante α é um anti- corpo IgA. Além disso, um anticorpo compreendendo uma região cons- tante μ é um anticorpo IgM, e um anticorpo compreendendo uma regi-

ão constante ε é um anticorpo IgE. Certos isótipos podem ser subdivi- didos em subclasses. Por exemplo, os anticorpos IgG incluem, mas não estão limitados a, anticorpos IgG1 (compreendendo uma região constante γ1), IgG2 (compreendendo uma região constante γ2), IgG3 (compreendendo uma região constante γ3) e IgG4 (compreendendo uma região constante γ4); Os anticorpos IgA incluem, mas não estão limitados a, anticorpos IgA1 (compreendendo uma região constante α1) e IgA2 (compreendendo uma região constante α2); e os anticorpos IgM incluem, mas não estão limitados a, IgM1 e IgM2.

[0173] Uma "região de Fc", quando usado neste documento, refe- re-se a uma porção de uma região constante de cadeia pesada que compreende CH2 e CH3. Em algumas modalidades, uma região de Fc compreende uma articulação, CH2 e CH3. Em várias modalidades, quando uma região de Fc compreende uma articulação, a articulação media a dimerização entre dois polipeptídeos contendo Fc. Uma regi- ão de Fc pode ser de qualquer isótipo da região constante de cadeia pesada do anticorpo aqui discutido. Em algumas modalidades, uma região de Fc é uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

[0174] Uma "estrutura humana aceptora", quando usada neste do- cumento, é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoáci- dos de uma estrutura de domínio variável de cadeia pesada (VH) deri- vada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana, conforme discutido aqui. Uma estrutura humana aceitadora derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana pode compreender a mesma se- quência de aminoácidos da mesma, ou pode conter alterações na se- quência de aminoácidos. Em algumas modalidades, o número de alte- rações de aminoácidos é menor do que 10, ou menor do que 9, ou menor do que 8, ou menor do que 7, ou menor do que 6, ou menor do que 5, ou menor do que 4, ou menor do que 3, em todas as estruturas humanas em um único domínio de ligação ao antígeno, como um VHH.

[0175] "Afinidade" refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo ou polipeptídeo contendo VHH) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A afinidade ou afinidade apa- rente de uma molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser re- presentada pela constante de dissociação (KD) ou a KD-aparente, respec- tivamente. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conheci- dos na técnica (como, por exemplo, ELISA KD, KinExA, citometria de fluxo e/ou dispositivos de ressonância de plasmon de superfície), inclu- indo aqueles descritos neste documento. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos envolvendo BIAcore®, Octet® ou cito- metria de fluxo.

[0176] O termo "KD", quando usado neste documento, refere-se à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação molécula de ligação ao antígeno/antígeno. Quando o termo "KD" é usado neste do- cumento, ele inclui KD e KD aparente.

[0177] Em algumas modalidades, a KD da molécula de ligação ao antígeno é medida por citometria de fluxo usando uma linhagem celu- lar que expressa o antígeno e ajustando a fluorescência média medida em cada concentração de anticorpo a uma equação de ligação não linear de um sítio (Prism Software graphpad). Em algumas de tais mo- dalidades, a KD é KD-aparente.

[0178] O termo "atividade biológica" refere-se a qualquer uma ou mais propriedades biológicas de uma molécula (quer presente natu- ralmente como encontrada in vivo, ou fornecida ou ativada por meios recombinantes). As propriedades biológicas incluem, mas não estão limitadas a, ligação a um ligante, indução ou aumento da proliferação celular (como a proliferação de células T) e indução ou aumento da expressão de citocinas.

[0179] O termo "atividade de IL-2" ou "atividade biológica" de IL-2, quando usado neste documento, inclui qualquer efeito biológico ou pe- lo menos uma das funções biologicamente relevantes de IL-2. Em al- gumas modalidades, a atividade de IL-2 inclui a capacidade de IL-2 de induzir a proliferação de células T e/ou ativar células exterminadoras naturais (NK). Atividades exemplares de IL-2 não limitantes incluem aumento da expressão de pSTAT5, aumento da proliferação de célu- las T CD4+ e/ou CD8+, aumentando a expressão de CD71 em células T e reduzindo a atividade supressora de células Treg na ativação e proliferação de células T CD4+ e CD8+.

[0180] Um anticorpo “agonista” ou “ativador” (tal como um polipep- tídeo contendo sdAb ou VHH) é aquele que aumenta e/ou ativa uma atividade biológica do antígeno alvo. Em algumas modalidades, o anti- corpo agonista se liga a um antígeno e aumenta sua atividade biologi- camente em pelo menos cerca de 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 85 % ou mais.

[0181] Um "antagonista", um anticorpo "bloqueador" ou "neutrali- zante" é aquele que diminui e/ou inativa uma atividade biológica do antígeno alvo. Em algumas modalidades, o anticorpo neutralizante se liga a um antígeno e reduz sua atividade biologicamente em pelo me- nos cerca de 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 85 % 90 %, 95 %, 99 % ou mais.

[0182] Um polipeptídeo contendo VHH "amadurecido por afinida- de" refere-se a um polipeptídeo contendo VHH com uma ou mais alte- rações em um ou mais CDRs em comparação com um polipeptídeo contendo VHH origem que não possui tais alterações, tais alterações resultando em uma melhoria na afinidade do polipeptídeo contendo VHH para antígeno.

[0183] Um "VHH humanizado", quando usado neste documento,

refere-se a um VHH em que uma ou mais regiões estruturais foram substancialmente substituídas por regiões estruturais humanas. Em alguns casos, certos resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobu- lina humana são substituídos por resíduos não humanos correspon- dentes. Além disso, o VHH humanizado pode compreender resíduos que não são encontrados nem no VHH original nem nas sequências estruturais humanas, mas são incluídos para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do polipeptídeo contendo VHH ou VHH. Em al- gumas modalidades, um polipeptídeo contendo VHH humanizado compreende uma região de Fc humana. Como será apreciado, uma sequência humanizada pode ser identificada por sua sequência primá- ria e não denota necessariamente o processo pelo qual o anticorpo foi criado.

[0184] Uma "região de Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região de Fc de sequência nativa. "Funções efetoras" exem- plares incluem ligação ao receptor de Fc; Ligação de Clq e citotoxici- dade dependente do complemento (CDC); Ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B, etc. Es- sas funções efetoras geralmente requerem que a região de Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio va- riável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios.

[0185] Uma "região de Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região de Fc encontrada na natureza. As regiões de Fc humanas de sequência nativa incluem uma região de Fc de IgG1 humana de sequência nativa (alotipos não A e A); região de Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região de Fc de IgG3 humana de sequência nati- va; e região de Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como suas variantes de ocorrência natural.

[0186] Uma "região de Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região de Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Em algumas modalidades, uma "região de Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região de Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de ami- noácido, ainda retém pelo menos uma função efetora da região de Fc de sequência nativa. Em algumas modalidades, a região de Fc varian- te tem pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com uma região de Fc de sequência nativa ou com a região de Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos e, de preferência, de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região de Fc de sequência nativa ou na região de Fc do polipeptídeo parental. Em al- gumas modalidades, a região de Fc variante aqui possuirá pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência com uma região de Fc de sequência nativa e/ou com uma região de Fc de um polipeptídeo pa- rental, pelo menos cerca de 90 % de identidade de sequência com a mesma, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 % ou pelo menos cer- ca de 99 % de identidade de sequência com o mesmo.

[0187] “Receptor de Fc” ou “FcR” descreve um receptor que se liga à região de Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, um FcγR é um FcR humano nativo. Em algumas modalidades, um FcR é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui re- ceptores das subclasses FcγRI, FcγRII e FcγRIII, incluindo variantes alélicas e formas de splicing alternativo desses receptores. Os recep- tores FcγRII incluem FcγRIIA (um "receptor de ativação") e FcγRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos seme-

lhantes que diferem principalmente em seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcγRIIA contém um motivo de ativação basea- do em tirosina imunorreceptor (ITAM) em seu domínio citoplasmático O receptor de inibição FcγRIIB contém um motivo de inibição baseado em tirosina imunorreceptor (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (Ve- ja, por exemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs são revisados, por exemplo, in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Labe. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são engloba- dos pelo termo "FcR" neste documento. Por exemplo, o termo "recep- tor de Fc" ou "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) e regulação da homeostase de imunoglobulinas. Métodos de medição de ligação a FcRn são conhecidos (veja, por exemplo, Ghetieand Ward, Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetieet al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

[0188] O termo "substancialmente semelhante" ou "substancial- mente o mesmo", quando usado neste documento, denota um grau suficientemente alto de semelhança entre dois ou mais valores numé- ricos, de modo que alguém versado na técnica consideraria a diferen- ça entre os dois ou mais valores como sendo de pouca ou nenhuma significância biológica e/ou estatística no contexto da característica biológica medida pelo referido valor. Em algumas modalidades, os dois ou mais valores substancialmente semelhantes diferem em não mais do que cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % ou 50 %.

[0189] Um polipeptídeo "variante" significa um polipeptídeo biolo- gicamente ativo com pelo menos cerca de 80 % de identidade de se-

quência de aminoácidos com o polipeptídeo de sequência nativa após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. Tais variantes incluem, por exemplo, polipeptídeos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou deletados, no terminal N ou C do polipeptídeo. Em algumas modalidades, uma variante terá pelo menos cerca de 80 % de identidade de sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, uma variante terá pelo menos cerca de 90 % de identidade de sequência de aminoácidos. Em algu- mas modalidades, uma variante terá pelo menos cerca de 95 % de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo de se- quência nativa.

[0190] Quando usado neste documento, "porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" e "homologia" em relação a um peptídeo, polipeptídeo ou sequência de anticorpo são definidas como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos em a se- quência específica do peptídeo ou polipeptídeo, após o alinhamento das sequências e a introdução de lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não conside- rando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da identidade percentual da sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da perícia na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou MEGALIGNTM (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados pa- ra medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas.

[0191] Uma substituição de aminoácido pode incluir, mas não está limitada à substituição de um aminoácido em um polipeptídeo por ou- tro aminoácido. Substituições exemplares são mostradas na Tabela 1. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anti- corpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade de- sejada, por exemplo, antígeno retido/melhorado ou ligação ao recep- tor, antígeno reduzido ou ligação ao receptor, imunogenicidade diminu- ída ou melhor ADCC ou CDC.

Tabela 1 Resíduo Original Substituições Exemplares Ala (A) Val; Leu; Ile Arg (R) Lys; Gln; Asn Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu; Asn Cys (C) Ser; Ala Gln (Q) Asn; Glu Glu (E) Asp; Gln Gly (G) Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg; Gln; Asn Met (M) Leu; Phe; Ile Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ser (S) Thr Thr (T) Val; Ser

Trp (W) Tyr; Phe Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina

[0192] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com pro- priedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[0193] As substituições não conservativas implicarão na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[0194] O termo "vetor" é usado para descrever um polinucleotídeo que pode ser modificado para conter um polinucleotídeo ou polinucleo- tídeos clonados que podem ser propagados em uma célula hospedei- ra. Um vetor pode incluir um ou mais dos seguintes elementos: uma origem de replicação, uma ou mais sequências regulatórias (como, por exemplo, promotores e/ou realçadores) que regulam a expressão do polipeptídeo de interesse e/ou um ou genes marcadores mais selecio- náveis (como, por exemplo, genes de resistência a antibióticos e ge- nes que podem ser usados em ensaios colorimétricos, por exemplo, β- galactosidase). O termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor que é usado para expressar um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira.

[0195] Uma "célula hospedeira" refere-se a uma célula que pode ser ou foi receptora de um vetor ou polinucleotídeo isolado. As células hospedeiras podem ser células procarióticas ou células eucarióticas. Células eucarióticas exemplares incluem células de mamíferos, tais como células de animais primatas ou não primatas; células fúngicas, como levedura; células de plantas; e células de insetos. Células exemplares não limitantes de mamíferos incluem, mas não estão limi- tadas a, células NSO, células PER.C6® (Crucell) e células 293F e CHO e seus derivados, tais como 293-6E, CHO-DG44, CHO-K1, CHO- célu- las S e CHO-DS. As células hospedeiras incluem a progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula-mãe original devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo (s) fornecido (s) aqui.

[0196] O termo "isolado", quando usado neste documento, refere- se a uma molécula que foi separada de pelo menos alguns dos com- ponentes com os quais é tipicamente encontrada na natureza ou pro- duzida. Por exemplo, um polipeptídeo é referido como "isolado" quan- do é separado de pelo menos alguns dos componentes da célula na qual foi produzido. Quando um polipeptídeo é secretado por uma célu- la após a expressão, separar fisicamente o sobrenadante contendo o polipeptídeo da célula que o produziu é considerado como "isolar" o polipeptídeo. Da mesma forma, um polinucleotídeo é referido como "isolado" quando não faz parte do polinucleotídeo maior (como, por exemplo, DNA genômico ou DNA mitocondrial, no caso de um polinu- cleotídeo de DNA) no qual é tipicamente encontrado na natureza, ou é separado de pelo menos alguns dos componentes da célula na qual foi produzido, por exemplo, no caso de um polinucleotídeo de RNA. As- sim, um polinucleotídeo de DNA que está contido em um vetor dentro de uma célula hospedeira pode ser referido como "isolado".

[0197] Os termos "indivíduo" e "sujeito" são usados indistintamente neste documento para se referir a um animal; por exemplo, um mamí- fero. Em algumas modalidades, métodos de tratamento de mamíferos,

incluindo, mas não se limitando a, humanos, roedores, símios, felinos, caninos, equinos, bovinos, porcinos, ovinos, caprinos, animais de labo- ratório mamíferos, animais de fazenda mamíferos, animais esportivos mamíferos e animais de estimação mamíferos, são fornecidos. Em al- guns exemplos, um "indivíduo" ou "sujeito" refere-se a um indivíduo ou sujeito com necessidade de tratamento para uma doença ou distúrbio. Em algumas modalidades, o indivíduo a receber o tratamento pode ser um paciente, designando o fato de que o indivíduo foi identificado co- mo tendo um distúrbio relevante para o tratamento ou estando em ris- co adequado de contrair o distúrbio.

[0198] Uma "doença" ou "distúrbio", quando usado neste docu- mento, refere-se a uma condição em que o tratamento é necessário e/ou desejado.

[0199] O termo "célula tumoral", "célula cancerosa", "câncer", "tu- mor" e/ou "neoplasma", a menos que seja designado de outra forma, são usados aqui indistintamente e referem-se a uma célula (ou célu- las) exibindo um crescimento descontrolado e/ou aumento anormal da sobrevivência celular e/ou inibição da apoptose que interfere com o funcionamento normal dos órgãos e sistemas corporais. Incluídos nes- ta definição estão os cânceres benignos e malignos, pólipos, hiperpla- sia, bem como tumores latentes ou micrometástases.

[0200] Os termos "câncer" e "tumor" abrangem cânceres sólidos e hematológicos/linfáticos e também abrangem crescimento maligno, pré-maligno e benigno, como displasia. Além disso, estão incluídas nesta definição células com proliferação anormal que não é impedida (por exemplo, evasão imune e mecanismos de escape imune) pelo sistema imunológico (por exemplo, células infectadas com vírus). Cân- ceres exemplares incluem, mas não estão limitados a: carcinoma ba- socelular, câncer do trato biliar; câncer de bexiga; câncer nos ossos; câncer do cérebro e do sistema nervoso central; câncer de mama;

câncer do peritônio; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer de cólon e reto; câncer do tecido conjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer do endométrio; câncer de esôfago; câncer de olho; câncer de cabeça e pescoço; câncer gástrico (incluindo câncer gastrointestinal); glioblas- toma; carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intraepitelial; câncer dos rins ou renal; câncer de laringe; leucemia; câncer de fígado; cân- cer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pul- mão e carcinoma escamoso do pulmão); melanoma; mieloma; neu- roblastoma; câncer de cavidade oral (lábio, língua, boca e faringe); câncer do ovário; câncer de pâncreas; câncer de próstata; retinoblas- toma; rabdomiossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; carcinoma de glândula salivar; sarcoma; câncer de pele; câncer de cé- lulas escamosas; câncer de estômago; câncer de testículo; câncer de tireoide; câncer uterino ou endometrial; câncer do sistema urinário; câncer de vulva; linfoma incluindo linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, bem como linfoma de células B (incluindo linfoma não-Hodgkin folicu- lar de baixo grau (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL folicular de grau intermediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblás- tico; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de células pequenas não cli- vadas de alto grau; NHL de doença volumosa; linfoma de células de revestimento; linfoma relacionado à AIDS; e macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); Leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crô- nica; bem como outros carcinomas e sarcomas; e distúrbio linfoprolife- rativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anor- mal associada a facomatoses, edema (como aquele associado a tumo- res cerebrais) e síndrome de Meigs.

[0201] O termo "célula não tumoral", quando usado neste docu- mento, refere-se a células ou tecido normal. Células não tumorais exemplares incluem, mas não estão limitadas a: células T, células B, células exterminadoras naturais (NK), células T exterminadoras natu- rais (NKT), células dendríticas, monócitos, macrófagos, células epiteli- ais, fibroblastos, hepatócitos, células renais intersticiais, sinoviócitos semelhantes a fibroblastos, osteoblastos e células localizadas na ma- ma, músculo esquelético, pâncreas, estômago, ovário, intestino delga- do, placenta, útero, testículo, rim, pulmão, coração, cérebro, fígado, próstata, cólon, órgãos linfoides, osso e células tronco mesenquimais derivadas de osso. O termo "uma célula ou tecido localizado na perife- ria", quando usado neste documento, refere-se a células não tumorais não localizadas perto das células tumorais e/ou dentro do microambi- ente tumoral.

[0202] O termo "células ou tecido dentro do microambiente tumo- ral", quando usado neste documento, refere-se às células, moléculas, matriz extracelular e/ou vasos sanguíneos que circundam e/ou alimen- tam uma célula tumoral. Células ou tecido exemplares dentro do mi- croambiente tumoral incluem, mas não estão limitados a: vasculatura tumoral; linfócitos infiltrantes de tumor; células reticulares de fibroblas- to; células progenitoras endoteliais (EPC); fibroblastos associados ao câncer; pericitos; outras células estromais; componentes da matriz ex- tracelular (ECM); células dendríticas; células apresentadoras de antí- geno; células T; células T reguladoras (células Treg); macrófagos; neutrófilos; células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) e outras células imunes localizadas próximas a um tumor. Métodos para identificar células tumorais e/ou células/tecidos localizados dentro do microambiente tumoral são bem conhecidos na técnica, como descrito aqui, abaixo.

[0203] Em algumas modalidades, um "aumento" ou "diminuição" se refere a um aumento ou diminuição estatisticamente significativo, respectivamente. Como ficará claro para alguém versado na técnica,

"modular" também pode envolver efetuar uma mudança (que pode ser um aumento ou uma diminuição) na afinidade, avidez, especificidade e/ou seletividade de um alvo ou antígeno, para um ou mais de seus ligantes, parceiros de ligação, parceiros para associação em uma for- ma homomultimérica ou heteromultimérica, ou substratos; efetuar uma mudança (que pode ser um aumento ou uma diminuição) na sensibili- dade do alvo ou antígeno para uma ou mais condições no meio ou ar- redores em que o alvo ou antígeno está presente (como pH, força iôni- ca, a presença de cofatores, etc.); e/ou proliferação celular ou produ- ção de citocinas, em comparação com as mesmas condições, mas sem a presença de um agente teste. Isto pode ser determinado de qualquer maneira adequada e/ou usando qualquer ensaio adequado conhecido per se ou descrito aqui, dependendo do alvo envolvido.

[0204] Quando usado neste documento, "uma resposta imune" destina-se a abranger as respostas imunes celulares e/ou humorais que são suficientes para inibir ou prevenir o início ou melhorar os sin- tomas da doença (por exemplo, câncer ou metástase de câncer). “Uma resposta imune” pode abranger aspectos tanto do sistema imune inato quanto do adaptativo.

[0205] Quando usado neste documento, "tratamento" é uma abor- dagem para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. "Trata- mento", quando usado neste documento, abrange qualquer adminis- tração ou aplicação de um agente terapêutico para doenças em um mamífero, incluindo um ser humano. Para os fins desta descrição, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, qualquer um ou mais dos seguintes: alívio de um ou mais sintomas, diminuição da extensão da doença, prevenção ou retarda- mento da propagação (por exemplo, metástase, por exemplo, metás- tase para o pulmão ou para o nódulo linfático) da doença, prevenindo ou retardando a recorrência da doença, retardando ou desacelerando a progressão da doença, melhorando o estado da doença, inibindo a doença ou progressão da doença, inibindo ou retardando a doença ou sua progressão, interrompendo seu desenvolvimento e remissão (seja parcial ou total). Também englobado por “tratamento” está a redução das consequências patológicas de uma doença proliferativa. Os méto- dos fornecidos neste documento contemplam qualquer um ou mais desses aspectos do tratamento. Em consonância com o exposto aci- ma, o termo tratamento não requer a remoção de cem por cento de todos os aspectos do distúrbio.

[0206] "Melhorar" significa uma diminuição ou melhora de um ou mais sintomas em comparação com a não administração de um agen- te terapêutico. “Melhorar” também inclui encurtamento ou redução na duração de um sintoma.

[0207] O termo "agente anticâncer" é usado neste documento em seu sentido mais amplo para se referir a agentes que são usados no tratamento de um ou mais cânceres. Classes exemplares de tais agen- tes incluem, mas não estão limitados a, agentes quimioterapêuticos, biológicos anticâncer (tais como citocinas, fusões de domínio extrace- lular do receptor-Fc e anticorpos), radioterapia, terapia com T CAR, oligonucleotídeos terapêuticos (tais como oligonucleotídeos antisense e siRNAs) e vírus oncolíticos.

[0208] O termo “amostra biológica” significa uma quantidade de uma substância de um ser vivo ou anteriormente vivo. Essas substân- cias incluem, mas não estão limitadas a, sangue, (por exemplo, san- gue total), plasma, soro, urina, líquido amniótico, líquido sinovial, célu- las endoteliais, leucócitos, monócitos, outras células, órgãos, tecidos, medula óssea, linfonodos e baço.

[0209] O termo "controle" ou "referência" refere-se a uma compo- sição conhecida por não conter um analisado ("controle negativo") ou por conter um analisado ("controle positivo"). Um controle positivo po-

de compreender uma concentração conhecida de analisado.

[0210] Os termos "inibição" ou "inibir" referem-se a uma diminuição ou cessação de qualquer característica fenotípica ou à diminuição ou cessação na incidência, grau ou probabilidade dessa característica. “Reduzir” ou “inibir” é diminuir, reduzir ou interromper uma atividade, função e/ou quantidade em comparação com uma referência. Em al- gumas modalidades, por "reduzir" ou "inibir" entende-se a capacidade de causar uma diminuição geral de 10 % ou mais. Em algumas moda- lidades, por "reduzir" ou "inibir" entende-se a capacidade de causar uma diminuição geral de 50 % ou mais. Em algumas modalidades, por "reduzir" ou "inibir" entende-se a capacidade de causar uma diminui- ção geral de 75 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais. Em algumas modalida- des, a quantidade observada acima é inibida ou diminuída ao longo de um período de tempo, em relação a um controle durante o mesmo pe- ríodo de tempo.

[0211] Quando usado neste documento, "retardar o desenvolvi- mento de uma doença" significa adiar, impedir, diminuir a velocidade, retardar, estabilizar, suprimir e/ou adiar o desenvolvimento da doença (como o câncer). Esse retardo pode ser de vários períodos de tempo, dependendo da história da doença e/ou do indivíduo a ser tratado. Como é evidente para um especialista na técnica, um retardo suficien- te ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, em que o indivíduo não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer em está- gio avançado, como o desenvolvimento de metástases, pode ser re- tardado.

[0212] "Prevenção", quando usado neste documento, inclui o for- necimento de profilaxia com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado com a doença. A menos que especifi- cado de outra forma, os termos “reduzir”, “inibir” ou “prevenir” não de-

notam ou exigem prevenção completa ao longo do tempo, mas apenas durante o período de tempo sendo medido.

[0213] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma subs- tância/molécula, agonista ou antagonista pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade da substância/molécula, agonista ou antagonista de indu- zir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeutica- mente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da substância/molécula, agonista ou antagonista são supe- rados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade tera- peuticamente eficaz pode ser liberada em uma ou mais administra- ções. Uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma quan- tidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico e/ou profilático desejado.

[0214] Os termos "formulação farmacêutica" e "composição farma- cêutica" referem-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do (s) ingrediente (s) ativo (s) seja eficaz e que não contém componentes adicionais que são inaceitavel- mente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação seria adminis- trada. Essas formulações podem ser estéreis.

[0215] Um "transportador farmaceuticamente aceitável" refere-se a um enchimento não tóxico sólido, semissólido ou líquido, diluente, ma- terial de encapsulamento, formulação auxiliar ou transportador con- vencional na técnica para uso com um agente terapêutico que, em conjunto, compreende uma "composição farmacêutica" para adminis- tração para um assunto. Um transportador farmaceuticamente aceitá- vel não é tóxico para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas e são compatíveis com outros ingredientes da formulação. O transportador farmaceuticamente aceitável é apropriado para a formu- lação utilizada.

[0216] A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui a administração simultânea (concorrente) e sequencial em qualquer ordem.

[0217] O termo "simultaneamente" é usado neste documento para se referir à administração de dois ou mais agentes terapêuticos, onde pelo menos parte da administração se sobrepõe no tempo, ou onde a administração de um agente terapêutico cai dentro de um curto perío- do de tempo em relação à administração do outro agente terapêutico, ou em que os efeitos terapêuticos de ambos os agentes se sobrepõem por pelo menos um período de tempo.

[0218] O termo "sequencialmente" é usado neste documento para se referir à administração de dois ou mais agentes terapêuticos que não se sobrepõem no tempo, ou em que os efeitos terapêuticos dos agentes não se sobrepõem.

[0219] Quando usado neste documento, "em conjunto com" refere- se à administração de uma modalidade de tratamento além de outra modalidade de tratamento. Como tal, "em conjunto com" refere-se à administração de uma modalidade de tratamento antes, durante ou após a administração da outra modalidade de tratamento ao indivíduo.

[0220] O termo "encarte de embalagem" é usado para se referir a instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de pro- dutos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas ao uso de tais produtos terapêuticos.

[0221] Um "artigo de fabricação" é qualquer fabricação (por exem- plo, uma embalagem ou recipiente) ou kit compreendendo pelo menos um reagente, por exemplo, um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio (por exemplo, câncer), ou uma sonda para especificamente detectar um biomarcador aqui descrito. Em algumas modalidades, a fabricação ou kit é promovido, distribuído ou vendido como uma unidade para executar os métodos descritos neste docu- mento.

[0222] Os termos "rótulo" e "rótulo detectável" significam uma por- ção ligada, por exemplo, a um anticorpo ou antígeno para tornar detec- tável uma reação (por exemplo, ligação) entre os membros do par de ligação específico. O membro rotulado do par de ligação específico é referido como "rotulado de forma detectável". Assim, o termo "proteína de ligação marcada" refere-se a uma proteína com um rótulo incorpo- rado que fornece a identificação da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o rótulo é um marcador detectável que pode produzir um sinal detectável por meios visuais ou instrumentais, por exemplo, in- corporação de um aminoácido radiomarcado ou ligação a um polipep- tídeo de porções de biotinil que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um rótulo fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Exemplos de marcadores para polipeptídeos inclu- em, mas não estão limitados aos seguintes: radioisótopos ou radionu- clídeos (por exemplo, 3H, 14 C, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I, 177 Lu, 166 Ho 153 ou Sm); cromógenos, rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, ro- damina, fósforos de lantanídeos), rótulos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, luciferase, fosfatase alcalina); rótulos quimioluminescentes; grupos biotinila; epitopos polipeptídicos prede- terminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, marcadores de epitopo); e agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio. Exemplos re- presentativos de marcadores comumente empregados para imunoen- saios incluem frações que produzem luz, por exemplo, compostos de acridínio, e porções que produzem fluorescência, por exemplo, fluo- resceína. A este respeito, a própria porção pode não ser marcada de forma detectável, mas pode tornar-se detectável após reação com ain- da outra porção. Polipeptídeos contendo IL-2 modificada exemplares

[0223] Os polipeptídeos que compreendem uma IL-2 modificada são aqui fornecidos. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substituição de aminoácido que reduz a afinidade da IL-2 modificada para um receptor de IL-2 em comparação com uma IL-2 tipo selvagem. Em várias modalidades, o polipeptídeo compreendendo um IL-2 modificada aqui fornecido é um agonista de um IL-2R. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada é uma IL-2 humana modificada e o IL-2R é um IL-2R humano. Em algumas moda- lidades, a IL-2 modificada se liga a um IL-2R humano com uma afini- dade de pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes menor do que a afinidade da IL-2 humana tipo selvagem para o IL-2R.

[0224] Em várias modalidades, os polipeptídeos que compreen- dem uma IL-2 modificada compreendem pelo menos um domínio de ligação ao antígeno que se liga a uma célula T ou antígeno de célula exterminadora natural (NK). Em algumas modalidades, um polipeptí- deo compreendendo uma IL-2 modificada aqui fornecida compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito domínios de ligação ao antígeno, em que pelo menos um ou todos se ligam a uma célula T ou antígeno de célula exterminadora natural. Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo uma IL-2 modificada aqui fornecida compreende um, dois, três ou quatro domínios de ligação ao antígeno, em que pelo menos um ou todos se ligam a uma célula T ou antígeno de célula exterminadora natural. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo contendo IL-2 modificada não se liga ou ativa IL-2R na ausência de um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contendo IL-2 modificada liga e/ou ativa IL-2R em uma célula apenas quando o polipeptídeo compreende um domínio de liga- ção ao antígeno que está ligado a um antígeno na mesma célula que o IL-2R.

[0225] Em várias modalidades, uma IL-2 modificada compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoá- cido selecionada de P65, D84, E95, M23 e H16. Em algumas modali- dades, uma IL-2 modificada compreende substituições nas posições de aminoácidos P65, H16 e D84. Em algumas modalidades, uma IL-2 modificada compreende substituições nas posições de aminoácidos P65, H16, D84 e M23. Em algumas modalidades, uma IL-2 modificada compreende substituições nas posições de aminoácidos P65, H16, D84 e E95. Em algumas modalidades, uma IL-2 modificada compre- ende substituições nas posições de aminoácidos P65, H16, D84, M23 e E95.

[0226] Em algumas modalidades, a substituição na posição de aminoácido P65 é selecionada a partir de P65R, P65E, P65K, P65H, P65Y, P65Q, P65D e P65N. Em algumas modalidades, a substituição na posição de aminoácido H16 é selecionada a partir de H16A, H16G, H16S, H16T, H16V e H16P. Em algumas modalidades, a substituição na posição de aminoácido D84 é selecionada a partir de D84S, D84G, D84A, D84T, D84V e D84P. Em algumas modalidades, a substituição na posição de aminoácido M23 é selecionada a partir de M23A, M23G, M23S, M23T, M23V e M23P. Em algumas modalidades, a substituição na posição de aminoácido E95 é selecionada de E95Q, E95G, E95S, E95T, E95V, E95P, E95H e E95N.

[0227] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compreende ainda uma substituição na posição de aminoácido F42. Em algumas de tais modalidades, a substituição em F42 é selecionada de F42K, F42A, F42R, F42A, F42G, F42S e F42T.

[0228] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compreende ainda pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido selecionada de Y45 e L72. Em algumas de tais modalida- des, a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substituição sele- cionada de Y45A e L72G.

[0229] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compreende ainda pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido selecionada de T3 e C125. Em algumas de tais modalida- des, a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substituição sele- cionada de T3A e C125A.

[0230] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compreende as substituições P65R, H16A e D84S. Em algumas modalidades, a IL- 2 modificada compreende as substituições P65R, H16A, D84S e M23A. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compreende as substituições P65R, H16A, D84S e E95Q. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compreende as substituições P65R, H16A, D84S, M23A e E95Q. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compre- ende substituições selecionadas de H16A-F42K; D84S-F42K; E15S- F42K; M23A-F42K; E95Q-F42K; P65R-H16A; P65R-D84S; P65R- E15S; P65R-M23A; P65R-E95Q; T3A-C125S; T3A-P65R-C125S; T3A- H16A-C125S; T3A-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-C125S; T3A-P65R- D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-M23A-P65R- D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-D84S-E95Q-C125S, and T3A-H16A- M23A-P65R-D84S-E95Q-C125S.

[0231] Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a IL-2 modificada pode ser uma IL-2 humana modificada. Em várias modali- dades, as posições de aminoácidos das substituições correspondem às posições de aminoácidos em SEQ ID NO: 1.

[0232] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %,

94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 84, e incluindo uma ou mais das substituições aqui discutidas. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compreende uma sequência de ami- noácidos pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 3-9, 11-21 e 23-31, e incluindo uma ou mais das substituições aqui discutidas. Em algumas modalidades, a IL- 2 modificada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 3-9, 11-21 e 23-31. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 3, 5-9, 12-21 e 23-31.

[0233] Em algumas modalidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificada compreende pelo menos um domínio de ligação ao antíge- no que se liga a uma célula T ou antígeno de célula exterminadora na- tural e uma região de Fc. Em algumas modalidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificada aqui fornecido compreende um, dois, três ou quatro domínios de ligação ao antígeno e uma região de Fc. Em algu- mas modalidades, uma região de Fc media a dimerização do polipep- tídeo contendo IL-2 modificada em condições fisiológicas de modo que um dímero seja formado que duplique o número de sítios de ligação ao antígeno. Por exemplo, um polipeptídeo contendo IL-2 modificada compreendendo três domínios de ligação ao antígeno e uma região de Fc é trivalente como um monômero, mas em condições fisiológicas, a região de Fc pode mediar a dimerização, de modo que o polipeptídeo contendo IL-2 modificada exista como um dímero hexavalente sob tais condições.

[0234] Em várias modalidades, um polipeptídeo compreendendo uma IL-2 modificada compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 3-9, 11-21 e 23-31. Em várias modalidades, um polipeptídeo compreendendo uma IL-2 modificada compreende uma sequência se-

lecionada de SEQ ID NOs: 3, 5-9 e 12-21 e 23-31. Em várias modali- dades, um polipeptídeo compreendendo uma IL-2 modificada compre- ende a SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende ainda um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é humanizado.

[0235] Em algumas modalidades, o pelo menos um domínio de ligação ao antígeno é um parceiro de ligação cognato natural ou nati- vo, uma Anticalina (lipocalina modificada), um Darpin, um Fynomer, uma Centyrin (domínio de fibroneticina III modificado), um domínio de nó de cistina, uma Affilin, um Affibody ou um domínio CH3 modificado. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação cognato natural com- preende um ligante ou um domínio extracelular, ou fragmento de liga- ção do mesmo, do parceiro de ligação cognato nativo do antígeno as- sociado ao tumor (TAA), ou uma variante do mesmo que exibe ativida- de de ligação ao TAA.

[0236] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo a IL-2 modificada e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno au- menta as respostas das células T antitumorais ou as respostas das células exterminadoras naturais, evitando Tregs, células T periféricas e células endoteliais. Em algumas de tais modalidades, o pelo menos um domínio de ligação ao antígeno tem como alvo a IL-2 modificada para células T ativadas. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada se liga e modula um IL-2R apenas quando o IL-2R está na mesma cé- lula que o antígeno ligado pelo pelo menos um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada não se liga ou ativa um IL-2R quando o IL-2R está em uma célula diferente da célula que expressa o antígeno ligado pelo pelo menos um domínio de liga- ção ao antígeno.

[0237] Em várias modalidades, o domínio de ligação ao antígeno liga-se a uma proteína selecionada de PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-

1BB, OX40, GITR, CD8a, CD8b, CD4, NKp30, NKG2A, TIGIT, TGFβR1, TGFβR2 , Fas, NKG2D, NKp46, PD-L1, CD107a, ICOS, TNFR2 e CD16a. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compre- endendo uma IL-2 modificada compreende um domínio de ligação ao antígeno de nivolumabe (BMS; PD-1); pembrolizumabe (Merck; PD-1); AMP-514 (Amplimmune; PD-1); TSR-042 (Tesaro/AnaptysBio, ANB- 011; PD-1); STI-A1110 (Sorrento Therapeutics; PD-1), ipilimumabe (BMS; CTLA-4); tremelimumabe (AstraZeneca, CTLA-4); urelumabe (BMS, 4-1BB); utomilumabe (Pfizer, 4-1BB); atezolizumabe (Roche, PD-L1), durvalumabe (AstraZeneca, PD-L1); monalizumabe (NKG2A, Innate Pharma e AstraZeneca); BMS-986016 (Bristo-Meyers Squibb, LAG-3).

[0238] Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a PD-1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a LAG3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a NKp46. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a NKG2D. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD8a.

[0239] Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno pode ser humanizado. Os polipeptídeos que compreendem do- mínios de ligação ao antígeno humanizado (como polipeptídeos con- tendo VHH) são úteis como moléculas terapêuticas porque os domí- nios de ligação ao antígeno humanizado e os anticorpos humanizados reduzem ou eliminam a resposta imune humana a anticorpos não hu- manos, o que pode resultar em uma resposta imune a um anticorpo terapêutico, e diminuição da eficácia do terapêutico. Geralmente, um domínio de ligação ao antígeno humanizado ou anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis em que os CDRs (ou por- ções dos mesmos) são derivados de um anticorpo não humano e os FRs (ou porções dos mesmos) são derivados de sequências de anti- corpos humanos. Um domínio de ligação ao antígeno humanizado ou anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um domínio de ligação ao an- tígeno humanizado ou anticorpo humanizado são substituídos por re- síduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos de CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar o anticorpo especificidade ou afinidade.

[0240] Anticorpos humanizados e métodos para produzi-los são revisados, por exemplo, in Almagro and Fransson, (2008) Front. Bios- ci. 13: 1619-1633, e também são descritos, por exemplo, em Riech- mannet al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; Patente Norte-americana Nos.

5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34; Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28:489-498 (descre- vendo "refacejamento"); Dall'Acquaet al., (2005) Methods 36:43-60 (descrevendo "embaralhamento de FR"); e Osbourn et al., (2005) Me- thods 36:61-68 e Klimkaet al., (2000) Br. J. Cancer, 83:252-260 (des- crevendo a abordagem de “seleção guiada” para embaralhamento de FR).

[0241] As regiões estruturais humanas que podem ser usadas pa- ra humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões estrutu- rais selecionadas usando o método de "melhor ajuste" (veja, por exemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151: 2296); regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis da cadeia pesada (veja, por exemplo, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285; e Prestaet al. (1993) J. Immunol, 151: 2623); regiões estruturais huma- nas maduras (mutadas somaticamente) ou regiões estruturais da linha germinativa humana (veja, por exemplo, Almagro e Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633); e regiões estruturais derivadas de biblio- tecas de FR de triagem (veja, por exemplo, Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 e Rosoket al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 22611 -22618). Normalmente, as regiões de FR de um VHH são subs- tituídas por regiões de FR humanas para fazer um VHH humanizado. Em algumas modalidades, certos resíduos de FR da FR humana são substituídos a fim de melhorar uma ou mais propriedades do VHH hu- manizado. Os domínios VHH com tais resíduos substituídos ainda são aqui referidos como "humanizados".

[0242] Em várias modalidades, uma região de Fc incluída em um polipeptídeo contendo IL-2 modificada é uma região de Fc humana ou é derivada de uma região de Fc humana.

[0243] Em algumas modalidades, uma região de Fc incluída em um polipeptídeo contendo IL-2 modificada é derivada de uma região de Fc humana e compreende uma deleção de três aminoácidos na ar- ticulação inferior correspondente a IgG1 E233, L234 e L235, aqui refe- rido como “ Fc xELL. ” Os polipeptídeos Fc xELL não envolvem FcγRs e, portanto, são referidos como "efetor silencioso" ou "efetor nulo", no entanto, em algumas modalidades, as regiões xELL Fc ligam FcRn e, portanto, têm meia-vida estendida e transcitose associada à recicla- gem mediada por FcRn.

[0244] Em algumas modalidades, a região de Fc incluída em um polipeptídeo contendo IL-2 modificada é derivada de uma região de Fc humana e compreende mutações M252Y e M428V, aqui referidas co- mo "Fc-YV". Em algumas modalidades, a região de Fc incluída em um polipeptídeo contendo IL-2 modificada é derivada de uma região de Fc humana e compreende mutações M252Y e M428L, aqui referidas co- mo "Fc-YL". Em algumas modalidades, tais mutações aumentam a li- gação a FcRn no pH ácido do endossomo (próximo a 6,5), enquanto perdem a ligação detectável em pH neutro (cerca de 7,2), permitindo a reciclagem mediada por FcRn realçada e meia-vida estendida.

[0245] Em algumas modalidades, a região de Fc incluída em um polipeptídeo contendo IL-2 modificada aqui é derivada de uma região de Fc humana e compreende mutações modificadas para heterodime- rização, aqui referidas como "knob" e "hole". Em algumas modalida- des, a região de Fc "knob" compreende a mutação T366W. Em algu- mas modalidades, a região de Fc de "hole" compreende mutações T366S, L368A e Y407V. Em algumas modalidades, as regiões de Fc usadas para heterodimerização compreendem mutações adicionais, como a mutação S354C em um primeiro membro de um par de Fc he- terodimérico que forma um dissulfeto assimétrico com uma mutação Y349C correspondente no segundo membro de um par de Fc hetero- dimérico. Em algumas modalidades, um membro de um par de Fc he- terodimérico compreende a modificação H435R ou H435K para evitar a ligação da proteína A enquanto mantém a ligação FcRn. Em algu- mas modalidades, um membro de um par de Fc heterodimérico com- preende a modificação H435R ou H435K, enquanto o segundo mem- bro do par de Fc heterodimérico não é modificado em H435. Em várias modalidades, a região de hole-Fc compreende a modificação H435R ou H435K (referida como "hole-R" em alguns casos quando a modifi- cação é H435R), enquanto a região de do knob Fc não. Em alguns ca- sos, a mutação hole-R melhora a purificação do heterodímero sobre as regiões hole Fc homodimérico que podem estar presentes.

[0246] As regiões de Fc exemplares não limitantes que podem ser utilizadas em um polipeptídeo contendo IL-2 modificada incluem regi-

ões de Fc compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 47-83.

[0247] Em algumas modalidades, uma IL-2 modificada contendo polipeptídeo que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno e uma região de Fc compreende uma sequência de aminoá- cidos selecionada de SEQ ID NOs: 3-9, 11-21 e 23-31 e uma região de Fc fundida ao terminal C dessa sequência de aminoácidos. Em algu- mas modalidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificada que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno e uma região de Fc compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 3, 5-9, 12 -21, e 23-31 e uma região de Fc fundida ao terminal C dessa sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, uma IL-2 modificada contendo polipeptídeo que compre- ende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno e uma região de Fc compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região de Fc fundida ao terminal C dessa sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, uma IL-2 modificada contendo polipeptídeo que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno e uma região de Fc compreende uma sequência de aminoácidos seleci- onada das SEQ ID NOs: 3-9, 11-21, e 23-31e uma região de Fc fundi- da ao terminal N dessa sequência de aminoácidos. Em algumas mo- dalidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificada que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno e uma região de Fc compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 3, 5-9, 12-21 e 23-31 e uma região de Fc fundida ao terminal N dessa sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, uma IL-2 modificada contendo polipeptídeo que compreende pelo menos uma ligação ao antígeno domínio e uma região de Fc compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região de Fc fundi- da ao terminal N dessa sequência de aminoácidos. Em algumas mo-

dalidades, uma IL-2 modificada contendo polipeptídeo que compreen- de pelo menos um domínio de ligação ao antígeno e uma região de Fc compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 34-43 e 46. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreen- de SEQ ID NO: 43 e um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno expresso em uma célula T ou célula exterminadora natu- ral. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende a SEQ ID NO: 46 e um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antíge- no expresso em uma célula T ou célula exterminadora natural. Atividades exemplares de polipeptídeos contendo IL-2 modificada

[0248] Em várias modalidades, os polipeptídeos contendo IL-2 modificada aqui fornecidos são agonistas da atividade de IL-2R. A ati- vidade agonista pode ser determinada, em algumas modalidades, usando os métodos fornecidos nos Exemplos neste documento, como o uso de células 293F ou células semelhantes. Em algumas modalida- des, os polipeptídeos contendo IL-2 modificada fornecidos aqui são agonistas da atividade de IL-2R quando direcionados para células T, mas mostram pouca ou nenhuma atividade agonista na ausência de direcionamento. Em algumas modalidades, os polipeptídeos contendo IL-2 modificada aqui fornecidos são agonistas da atividade de IL-2R quando direcionados para células NK e/ou células T, mas mostram pouca ou nenhuma atividade agonista na ausência de direcionamento. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo polipeptídeos que têm como alvo células T ou células NK compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um antígeno expresso em células T ou células NK.

[0249] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo poli- peptídeos fornecidos aqui aumenta a proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ in vitro e/ou in vivo. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo aumenta a proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ na presença de células Treg. Em algumas dessas modalidades, as células T CD4+ e/ou CD8+ são células T CD4+ e/ou CD8+ ativadas. Em algumas moda- lidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificada aqui fornecido au- menta a proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ ativadas in vitro. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo polipeptídeo au- menta a proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ ativadas em pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes ou pelo me- nos 5 vezes em relação a CD4+ e/ou proliferação de células T CD8+ na ausência do polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo aumenta a proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ ativadas em pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, ou pelo me- nos 5 vezes e não aumenta substancialmente a proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ em repouso, em relação à proliferação observada na ausência do polipeptídeo.

[0250] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo poli- peptídeos fornecidos aqui aumentam a proliferação de células NK in vitro e/ou in vivo. Em algumas dessas modalidades, as células NK são células NK ativadas. Em algumas modalidades, um polipeptídeo con- tendo IL-2 modificada aqui fornecido aumenta a proliferação de células NK ativadas in vitro. Em algumas modalidades, o polipeptídeo conten- do IL-2 modificada aumenta a proliferação de células NK ativadas em pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes em relação à proliferação de células NK na ausência de polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo aumenta a proliferação de células NK ativadas em pelo menos 1,5 vez, pelo me- nos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes e não au- menta substancialmente a proliferação de células NK em repouso, em relação à proliferação observada na ausência do polipeptídeo.

[0251] O aumento na proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ ativadas pode ser determinado por qualquer método na técnica, como,

por exemplo, os métodos fornecidos nos Exemplos neste documento. Um ensaio exemplar não limitativo é o seguinte. As células T CD4+ e/ou CD8+ podem ser isoladas de um ou mais doadores humanos saudáveis. As células T são manchadas com CellTrace Violet (CTV) e ativadas com anticorpo anti-CD3, colocadas em contato com um poli- peptídeo compreendendo uma IL-2 modificada e, em seguida, analisa- das por FACS. A perda de coloração com CTV indica proliferação. Em algumas modalidades, um aumento na proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ é determinado como uma média de um conjunto de experi- mentos ou de células T agrupadas, como medindo a proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ isoladas de diferentes doadores humanos saudáveis. Em algumas modalidades, um aumento na proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ é determinado como uma média de experi- mentos realizados usando células T de pelo menos cinco ou pelo me- nos dez doadores saudáveis diferentes, ou de um pool de células T de pelo menos cinco ou pelo menos dez diferentes doadores saudáveis. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo polipeptídeos aqui fornecidos aumenta a proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+, mesmo na presença de células Treg.

[0252] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo poli- peptídeos fornecidos aqui aumenta a expressão de CD71 nas células T CD4+ e/ou CD8+ in vitro e/ou in vivo. A expressão de CD71 indica ativação de células T. Em algumas modalidades, um polipeptídeo con- tendo IL-2 modificada aqui fornecido aumenta a expressão de CD71 nas células T CD4+ e/ou CD8+ in vitro. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contendo IL-2 modificada aumenta a expressão de CD71 nas células T CD4+ e/ou CD8+ em pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes em relação à ex- pressão de CD71 na ausência do polipeptídeo. Em algumas modalida- des, o polipeptídeo aumenta a expressão de CD71 em células T CD4+ e/ou CD8+ ativadas em pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes e não aumenta substancial- mente a expressão de CD71 em células T CD4+ e/ou CD8+ em repou- so, em relação à expressão de CD71 observada na ausência do poli- peptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo aumenta a expres- são de CD71 em células T CD4+ e/ou CD8+ na presença de células Treg.

[0253] O aumento na expressão de CD71 em células T CD4+ e/ou CD8+ pode ser determinado por qualquer método na técnica, como, por exemplo, os métodos fornecidos nos Exemplos neste documento. Um ensaio exemplar não limitativo é o seguinte. As células T CD4+ e/ou CD8+ podem ser isoladas de um ou mais doadores humanos saudáveis e estimuladas com um anticorpo anti-CD3, colocadas em contato com um polipeptídeo contendo IL-2 modificada e, em seguida, analisadas por FACS quanto à expressão de CD71. Em algumas mo- dalidades, um aumento na expressão de CD71 em células T CD4+ e/ou CD8+ é determinado como uma média de um conjunto de experi- mentos ou de células T agrupadas, como medindo a expressão de CD71 em células T CD4+ e/ou CD8+ isoladas de diferentes doadores humanos saudáveis. Em algumas modalidades, um aumento na ex- pressão de CD71 em células T CD4+ e/ou CD8+ é determinado como uma média de experimentos realizados usando células T de pelo me- nos cinco ou pelo menos dez doadores saudáveis diferentes, ou de um pool de células T de pelo menos cinco ou pelo menos dez dadores saudáveis diferentes. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo polipeptídeos aqui fornecidos aumenta a expressão de CD71 em células T CD4+ e/ou CD8+, mesmo na presença de células Treg.

[0254] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo poli- peptídeos aqui fornecidos aumenta a expressão de pSTAT5 em célu- las T CD4+ e/ou CD8+ in vitro e/ou in vivo. A expressão de pSTAT5 in-

dica ativação de células T. Em algumas modalidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificada aqui fornecido aumenta a expressão de pSTAT5 em células T CD4+ e/ou CD8+ in vitro. Em algumas modalida- des, o polipeptídeo contendo IL-2 modificada aumenta a expressão de pSTAT5 em células T CD4+ e/ou CD8+ em pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes em rela- ção à expressão de pSTAT5 na ausência do polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo aumenta a expressão de pSTAT5 em cé- lulas T CD4+ e/ou CD8+ na presença de células Treg. O aumento na expressão de pSTAT5 em células T CD4+ e/ou CD8+ pode ser deter- minado por qualquer método na técnica, tal como, por exemplo, os métodos fornecidos nos Exemplos aqui. Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo polipeptídeos aqui fornecidos aumenta a ex- pressão de pSTAT5 em células T CD4+ e/ou CD8+, mesmo na presen- ça de células Treg.

[0255] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo poli- peptídeos aqui fornecidos aumenta a expressão de pSTAT5 em célu- las NK in vitro e/ou in vivo. A expressão de pSTAT5 indica ativação de células NK. Em algumas modalidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificada aqui fornecido aumenta a expressão de pSTAT5 em célu- las NK in vitro. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contendo IL-2 modificada aumenta a expressão de pSTAT5 em células NK em pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, ou pelo me- nos 5 vezes em relação à expressão de pSTAT5 na ausência do poli- peptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo aumenta a expres- são de pSTAT5 em células NK na presença de células Treg. O aumen- to na expressão de pSTAT5 em células NK pode ser determinado por qualquer método na técnica, como, por exemplo, os métodos forneci- dos nos Exemplos aqui.

[0256] Em algumas modalidades, a IL-2 modificada contendo poli-

peptídeos aqui fornecidos reduz ou atenua a atividade supressora de células T reguladoras (Tregs). Em algumas modalidades, a IL-2 modi- ficada contendo polipeptídeos reduz a atividade supressora de Treg nas células T CD4+ e/ou CD8+ em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 % ou pelo menos 50 %. A diminuição da atividade supressora de Treg em células T CD4+ e/ou CD8+ convencionais pode ser determinada por qualquer método na técnica, tal como, por exem- plo, os métodos fornecidos nos Exemplos neste documento. Um en- saio exemplar não limitativo é o seguinte. Células Tregs e T CD4+ são diferencialmente marcadas com corantes celulares proliferativos fluo- rescentes após o isolamento de PBMCs de doadores humanos saudá- veis. As células T CD4+ são estimuladas com um anticorpo anti-CD3, enquanto as células Treg são incubadas na presença de polipeptídeo contendo IL-2 amodificado fornecido aqui. As duas populações de cé- lulas T são cocultivadas por 3 dias e a proliferação e ativação de célu- las T CD4+ são monitoradas por citometria de fluxo. Em algumas mo- dalidades, a IL-2 modificada contendo polipeptídeos fornecidos aqui aumenta a ativação e proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ na presença de células Treg, por exemplo, em comparação com a ativa- ção e proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+ no presença de célu- las Treg, mas a ausência de um polipeptídeo contendo IL-2 modificada aqui fornecido. Expressão e Produção de Polipeptídeo

[0257] São fornecidas moléculas de ácido nucleico compreenden- do polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de ligação conten- do IL-2 modificada. Assim, em várias modalidades, são fornecidas mo- léculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo compreen- dendo uma IL-2 modificada. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma IL-2 modificada e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno. Em várias modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma IL-2 modificada e uma região de Fc e, opcional- mente, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, a região de Fc compreende mutações modificadas para heterodimerização, como mutações de "knob" ou "hole". Em algumas modalidades, é fornecida uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo contendo IL-2 modificada que compreende uma IL-2 modificada, pelo menos um domínio de ligação ao antígeno e uma re- gião de Fc, em que a região de Fc é fundida ao terminal C do pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, e a IL-2 modificada é fun- dida ao terminal C da região de Fc. Em qualquer uma das modalida- des anteriores, a molécula de ácido nucleico pode também codificar uma sequência líder que direciona a secreção do polipeptídeo conten- do IL-2 modificada, cuja sequência líder é tipicamente clivada de modo que não esteja presente no polipeptídeo secretado. A sequência líder pode ser uma sequência líder de cadeia pesada nativa (ou VHH) ou pode ser outra sequência líder heteróloga.

[0258] As moléculas de ácido nucleico podem ser construídas usando técnicas de DNA recombinante convencionais na técnica. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico é um vetor de expressão que é adequado para expressão em uma célula hospedeira selecionada.

[0259] São fornecidos vetores compreendendo ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos contendo IL-2 modificada descritos neste documento. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores de DNA, vetores de fago, vetores virais, vetores retrovirais, etc. Em algumas modalidades, um vetor é selecionado que é otimiza- do para a expressão de polipeptídeos em um tipo de célula desejado, como células 293F, CHO ou derivadas de CHO, ou em células NSO. Exemplos de tais vetores são descritos, por exemplo, em Running De- er et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004).

[0260] Em algumas modalidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificada pode ser expresso em células procarióticas, como células bacterianas; ou em células eucarióticas, como células fúngicas (como leveduras), células vegetais, células de insetos e células de mamífe- ros. Tal expressão pode ser realizada, por exemplo, de acordo com procedimentos conhecidos na técnica. Células eucarióticas exempla- res que podem ser usadas para expressar polipeptídeos incluem, mas não estão limitadas a, células COS, incluindo células COS 7; células 293, incluindo células 293F; células CHO, incluindo células CHO-S, DG44. Lec13 CHO e células FUT8 CHO; células PER.C6® (Crucell); e células NSO. Em algumas modalidades, os polipeptídeos contendo IL- 2 modificada podem ser expressos em levedura. Veja, por exemplo, Publicação norte-americana Nº US 2006/0270045 A1. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucariótica particular é selecio- nada com base na sua capacidade de fazer as modificações pós- translação desejadas no polipeptídeo. Por exemplo, em algumas mo- dalidades, as células CHO produzem polipeptídeos que têm um nível mais alto de sialilação do que o mesmo polipeptídeo produzido em cé- lulas 293F.

[0261] A introdução de um ou mais ácidos nucleicos (como veto- res) em uma célula hospedeira desejada pode ser realizada por qual- quer método, incluindo, mas não se limitando a, transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção medi- ada por lipídeo catiônico, eletroporação, transdução, infecção, etc. Mé- todos exemplares não limitantes são descritos, por exemplo, em Sam- brook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Os ácidos nucleicos podem ser transfectados de forma transitória ou estável nas células hospedei- ras desejadas, de acordo com qualquer método adequado.

[0262] As células hospedeiras que compreendem qualquer um dos ácidos nucleicos ou vetores aqui descritos também são fornecidas. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula hospedeira que expres- sa um polipeptídeo contendo IL-2 modificada aqui descrito. Os polipep- tídeos contendo IL-2 modificada expressos em células hospedeiras podem ser purificados por qualquer método adequado. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, o uso de matrizes de afinidade ou cromatografia de interação hidrofóbica. Os ligandos de afinidade ade- quados incluem o ECD ROR1 e agentes que se ligam às regiões de Fc. Por exemplo, uma proteína A, proteína G, proteína A/G ou uma coluna de afinidade de anticorpo pode ser usada para ligar a região de Fc e para purificar um polipeptídeo contendo IL-2 modificada que compreende uma região de Fc. A cromatografia hidrofóbica interativa, por exemplo, uma coluna de butil ou fenil, também pode ser adequada para purificar alguns polipeptídeos, como anticorpos. A cromatografia de permuta iônica (por exemplo, cromatografia de permuta aniônica e/ou cromatografia de permuta catiônica) também pode ser adequada para purificar alguns polipeptídeos, tais como anticorpos. A cromato- grafia de modo misto (por exemplo, fase reversa/permuta aniônica, fase reversa/permuta catiônica, interação hidrofílica/permuta aniônica, interação hidrofílica/permuta catiônica, etc.) também pode ser adequa- da para purificar alguns polipeptídeos, como anticorpos. Muitos méto- dos de purificação de polipeptídeos são conhecidos na técnica.

[0263] Em algumas modalidades, o polipeptídeo contendo IL-2 modificada é produzido em um sistema livre de células. Sistemas isen- tos de células exemplares não limitantes são descritos, por exemplo, em Sitaramanet al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).

[0264] Em algumas modalidades, IL-2 modificada contendo poli- peptídeos preparados pelos métodos descritos acima são fornecidos.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo contendo IL-2 modificada é preparado em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contendo IL-2 modificada é preparado em um sistema li- vre de células. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contendo IL-2 modificada é purificado. Em algumas modalidades, é fornecido um meio de cultivo de células compreendendo um polipeptídeo contendo IL-2 modificada.

[0265] Em algumas modalidades, são fornecidas composições compreendendo anticorpos preparados pelos métodos descritos aci- ma. Em algumas modalidades, a composição compreende um polipep- tídeo contendo IL-2 modificada preparado em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a composição compreende um polipeptídeo contendo IL-2 modificada preparado em um sistema livre de células. Em algumas modalidades, a composição compreende um polipeptídeo contendo IL-2 modificada purificado. Métodos exemplares de tratamento de doenças usando polipeptídeos contendo IL-2 modificada

[0266] Em algumas modalidades, métodos de tratamento de do- enças em um indivíduo, compreendendo a administração de um poli- peptídeo contendo IL-2 modificado são fornecidos. Essas doenças in- cluem qualquer doença que se beneficiaria com o aumento da prolife- ração e ativação de células T CD4+ e/ou CD8+. Em algumas modalida- des, métodos para o tratamento de câncer em um indivíduo são forne- cidos. O método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo contendo IL-2 modificado aqui fornecido. Esses métodos de tratamento podem ser em humanos ou animais. Em algumas modalidades, métodos de tratamento de huma- nos são fornecidos. Cânceres exemplares não limitantes que podem ser tratados com polipeptídeos contendo IL-2 modificados fornecidos aqui incluem carcinoma basocelular, câncer do trato biliar; câncer de bexiga; câncer nos ossos; câncer do cérebro e do sistema nervoso central; câncer de mama; câncer do peritônio; câncer cervical; corio- carcinoma; câncer de cólon e reto; câncer do tecido conjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer do endométrio; câncer de esôfago; cân- cer de olho; câncer de cabeça e pescoço; câncer gástrico; câncer gas- trointestinal; glioblastoma; carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intraepitelial; câncer dos rins ou renal; câncer de laringe; câncer de fígado; câncer de pulmão; câncer de pulmão de células pequenas; câncer de pulmão de células não pequenas; adenocarcinoma do pul- mão; carcinoma escamoso do pulmão; melanoma; mieloma; neu- roblastoma; câncer de cavidade oral; câncer do ovário; câncer de pân- creas; câncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; carcinoma de glândula salivar; sarcoma; câncer de pele; câncer de células escamosas; câncer de es- tômago; câncer de testículo; câncer de tireoide; câncer uterino ou en- dometrial; câncer do sistema urinário; e câncer vulvar; linfoma; linfoma de Hodgkin; linfoma não Hodgkin; linfoma de células B; linfoma não Hodgkin (NHL) de baixo grau/folicular; NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de células pequenas não clivadas de alto grau; NHL de doença volumosa; linfoma de células do revestimento; linfoma relacionado à AIDS; ma- croglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; e leu- cemia mieloblástica crônica.

[0267] Os polipeptídeos contendo IL-2 modificada podem ser ad- ministrados aos indivíduos conforme necessário. A determinação da frequência de administração pode ser feita por pessoas versadas na técnica, como um médico assistente com base em considerações da condição a ser tratada, idade do indivíduo a ser tratado, gravidade da condição a ser tratada, estado geral de saúde do indivíduo a ser trata- do e semelhantes. Em algumas modalidades, uma dose eficaz de uma IL-2 modificada contendo polipeptídeos é administrada a um indivíduo uma ou mais vezes. Em algumas modalidades, uma dose eficaz de um polipeptídeo contendo IL-2 modificado é administrada ao indivíduo dia- riamente, quinzenalmente, semanalmente, a cada duas semanas, uma vez por mês, etc. Uma dose eficaz de um polipeptídeo contendo IL-2 modificado é administrada ao indivíduo pelo menos uma vez. Em al- gumas modalidades, a dose eficaz de um polipeptídeo contendo IL-2 modificado pode ser administrada várias vezes, incluindo várias vezes ao longo de pelo menos um mês, pelo menos seis meses ou pelo me- nos um ano.

[0268] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas que compreendem um polipeptídeo contendo IL-2 modificado são ad- ministradas em uma quantidade eficaz para o tratamento (incluindo profilaxia de) câncer e/ou aumento da proliferação de células T. A quantidade terapeuticamente eficaz é tipicamente dependente do peso do indivíduo a ser tratado, sua condição física ou de saúde, a extensão da condição a ser tratada ou a idade do indivíduo a ser tratado. Em geral, os polipeptídeos podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 0,05 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, os poli- peptídeos podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 10 μg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 50 μg/kg de peso corporal a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 100 μg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalida-

des, os polipeptídeos podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 100 μg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por do- se. Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ser administra- dos em uma quantidade na faixa de cerca de 0,5 mg/kg de peso cor- poral a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 0,05 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 0,05 mg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 5 mg/kg de peso corporal ou inferior, por exemplo, menos do que 4, menos do que 3, menos do que 2 ou menos do que 1 mg/kg do anticorpo.

[0269] Em algumas modalidades, os polipeptídeos contendo IL-2 modificados podem ser administrados in vivo por várias rotinas, inclu- indo, porém, não se limitando a, intravenosa, intra-arterial, parenteral, intraperitoneal ou subcutânea. A formulação apropriada e a rotina de administração podem ser selecionadas de acordo com a aplicação pretendida.

[0270] Em algumas modalidades, um tratamento terapêutico usando um polipeptídeo contendo IL-2 modificado é alcançado pelo aumento da proliferação e/ou ativação de células T. Em algumas mo- dalidades, o aumento da proliferação e/ou ativação de células T inibe o crescimento do câncer. Composições Farmacêuticas

[0271] Em algumas modalidades, as composições que compreen-

dem IL-2 modificada contendo polipeptídeos são fornecidas em formu- lações com uma ampla variedade de transportadores farmaceutica- mente aceitáveis (veja, por exemplo, Gennaro, Remington: The Scien- ce and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. ( 2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3th ed., Pharmaceutical Press (2000)). Vários transportadores farmaceutica- mente aceitáveis, que incluem veículos, adjuvantes e diluentes, estão disponíveis. Além disso, várias substâncias auxiliares farmaceutica- mente aceitáveis, tais como agentes de ajuste e tamponamento de pH, agentes de ajuste de tonicidade, estabilizadores, agentes umectantes e semelhantes, também estão disponíveis. Os transportadores exem- plares não limitativos incluem solução salina, solução salina tampona- da, dextrose, água, glicerol, etanol e suas combinações.

[0272] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um polipeptídeo contendo IL-2 modificado a uma concen- tração de pelo menos 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL , 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/mL, 175 mg/mL, 200 mg/mL, 225 mg/mL ou 250 mg/mL. Terapia Combinada

[0273] A IL-2 modificada contendo polipeptídeos pode ser adminis- trada sozinha ou em combinação com outros modos de tratamento, tais como outros agentes anticâncer. Eles podem ser fornecidos antes, substancialmente ao mesmo tempo ou após outros modos de trata- mento (ou seja, simultaneamente ou sequencialmente). Em algumas modalidades, o método de tratamento aqui descrito pode incluir ainda a administração de: radioterapia, quimioterapia, vacinação, terapia di- recionada ao tumor, terapia com T CAR, terapia de vírus oncolítico,

imunoterapia do câncer, terapia com citocinas, ressecção cirúrgica, modificação da cromatina, ablação, crioterapia , um agente antissenso contra um alvo tumoral, um agente de siRNA contra um alvo tumoral, um agente microRNA contra um alvo tumoral ou um agente anticân- cer/tumoral ou um agente biológico, como um anticorpo, citocina ou fusão de domínio extracelular do receptor-Fc.

[0274] Em algumas modalidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificado fornecido aqui é dado simultaneamente com um segundo agente terapêutico, por exemplo, um anticorpo PD-1. Exemplos de an- ticorpos PD-1 incluem nivolumabe (BMS); pembrolizumabe (Merck); AMP-514 (Amplimmune); TSR-042 (Tesaro/AnaptysBio, ANB-011); STI-A1110 (Sorrento Therapeutics); e outros agentes que são direcio- nados contra a morte programada-1 (PD-1).

[0275] Em algumas modalidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificado fornecido aqui é dado simultaneamente com um segundo agente terapêutico, por exemplo, uma terapia com PD-L1. Exemplos de terapias com PD-L1 incluem pidilizumabe (CureTech, CT-011); dur- valumabe (Medimmune/AstraZeneca); atezolizumabe (Genen- tech/Roche); avelumabe (Pfizer); AMP-224 (Amplimmune); BMS- 936559 (Bristol-Myers Squibb); STI-A1010 (Sorrento Therapeutics); e outros agentes direcionados contra o ligante de morte programada-1 (PD-L1).

[0276] Em algumas modalidades, um polipeptídeo contendo IL-2 modificado aqui fornecido é dado simultaneamente com terapia com T CAR (célula T do receptor de antígeno quimérico), terapia com vírus oncolítico, terapia com citocinas e/ou agentes que têm como alvo ou- tras moléculas de ponto de checagem, como VISTA, gpNMB , B7H3, B7H4, HHLA2, CD73, CTLA4, TIGIT, etc. Métodos exemplares não limitativos de diagnóstico e tratamento

[0277] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste do-

cumento são úteis para avaliar um indivíduo e/ou um espécime de um indivíduo (por exemplo, um paciente com câncer). Em algumas moda- lidades, a avaliação é um ou mais dentre diagnóstico, prognóstico e/ou resposta ao tratamento.

[0278] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste do- cumento compreendem a avaliação da presença, ausência ou nível de uma proteína. Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento compreendem a avaliação de uma presença, ausência ou nível de expressão de um ácido nucleico. As composições aqui descri- tas podem ser usadas para essas medições. Por exemplo, em algu- mas modalidades, os métodos descritos neste documento compreen- dem o contato de uma amostra do tumor ou células cultivadas a partir do tumor com um agente terapêutico, conforme descrito neste docu- mento.

[0279] Em algumas modalidades, a avaliação pode direcionar o tratamento (incluindo o tratamento com os polipeptídeos descritos nes- te documento). Em algumas modalidades, a avaliação pode direcionar o uso ou suspensão da terapia adjuvante após a ressecção. A terapia adjuvante, também chamada de cuidado adjuvante, é um tratamento que é administrado além do tratamento primário, principal ou inicial. A título de exemplo não limitativo, a terapia adjuvante pode ser um tra- tamento adicional geralmente administrado após a cirurgia, onde todas as doenças detectáveis foram removidas, porém, onde permanece um risco estatístico de recidiva devido à doença oculta. Em algumas mo- dalidades, os polipeptídeos são usados como uma terapia adjuvante no tratamento de um câncer. Em algumas modalidades, os anticorpos são usados como a única terapia adjuvante no tratamento de um cân- cer. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste docu- mento são mantidos como uma terapia adjuvante no tratamento de um câncer. Por exemplo, se é improvável que um paciente responda a um anticorpo descrito aqui ou terá uma resposta mínima, o tratamento po- de não ser administrado no interesse da qualidade de vida e para evi- tar toxicidade desnecessária de quimioterapias ineficazes. Nesses casos, os cuidados paliativos podem ser usados.

[0280] Em algumas modalidades, os polipeptídeos são administra- dos como uma terapia neoadjuvante antes da ressecção. Em algumas modalidades, a terapia neoadjuvante se refere à terapia para encolher e/ou diminuir o tumor antes de qualquer cirurgia. Em algumas modali- dades, terapia neoadjuvante significa quimioterapia administrada a pa- cientes com câncer antes da cirurgia. Em algumas modalidades, tera- pia neoadjuvante significa um polipeptídeo administrado a pacientes com câncer antes da cirurgia. Os tipos de câncer para os quais a qui- mioterapia neoadjuvante é comumente considerada incluem, por exemplo, mama, colorretal, ovário, cervical, bexiga e pulmão. Em al- gumas modalidades, os anticorpos são usados como uma terapia ne- oadjuvante no tratamento de um câncer. Em algumas modalidades, o uso é anterior à ressecção.

[0281] Em algumas modalidades, o microambiente tumoral con- templado nos métodos descritos neste documento é um ou mais den- tre: vasculatura tumoral; linfócitos infiltrantes de tumor; células reticula- res de fibroblasto; células progenitoras endoteliais (EPC); fibroblastos associados ao câncer; pericitos; outras células estromais; componen- tes da matriz extracelular (ECM); células dendríticas; células apresen- tadoras de antígeno; células T; células T reguladoras; macrófagos; neutrófilos; e outras células imunes localizadas próximas a um tumor. Kits

[0282] Também são fornecidos artigos de fabricação e kits que incluem qualquer um dos polipeptídeos contendo IL-2 modificada, con- forme descrito neste documento, e embalagem adequada. Em algu- mas modalidades, a invenção inclui um kit com (i) um polipeptídeo contendo IL-2 modificado e (ii) instruções para usar o kit para adminis- trar o polipeptídeo contendo IL-2 modificado a um indivíduo.

[0283] Embalagens adequadas para composições aqui descritas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, frascos (por exem- plo, frascos selados), vasos, ampolas, garrafas, jarros, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos plásticos) e semelhan- tes. Esses artigos de fabricação podem ser posteriormente esteriliza- dos e/ou selados. Também são fornecidas formas de dosagem unitária compreendendo as composições aqui descritas. Estas formas de do- sagem unitária podem ser armazenadas em uma embalagem adequa- da em dosagens unitárias simples ou múltiplas e também podem ser posteriormente esterilizadas e seladas. As instruções fornecidas nos kits da invenção são normalmente instruções escritas em um rótulo ou encarte da embalagem (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), porém, as instruções legíveis por máquina (por exemplo, instru- ções transportadas em um disco de armazenamento magnético ou óti- co) também são aceitáveis. As instruções relativas ao uso dos anticor- pos geralmente incluem informações quanto à dosagem, esquema de dosagem e rotina de administração para o tratamento pretendido ou uso industrial. O kit pode compreender ainda uma descrição da sele- ção de um indivíduo adequado ou tratamento.

[0284] Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens de múltiplas doses) ou doses subu- nitárias. Por exemplo, também podem ser fornecidos kits que contêm dosagens suficientes de moléculas aqui descitas para fornecer um tra- tamento eficaz para um indivíduo por um período prolongado, tal como cerca de uma semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 sema- nas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses ou mais. Os kits também podem incluir várias doses unitárias de moléculas e instruções de uso e embalados em quantida-

des suficientes para armazenamento e uso em farmácias, por exem- plo, farmácias hospitalares e farmácias de manipulação. Em algumas modalidades, o kit inclui uma composição seca (por exemplo, liofiliza- da) que pode ser reconstituída, ressuspensa ou reidratada para formar geralmente uma suspensão aquosa estável de polipeptídeo.

EXEMPLOS

[0285] Os exemplos discutidos abaixo pretendem ser puramente exemplares da invenção e não devem ser considerados como limitan- do a invenção de qualquer forma. Os exemplos não pretendem repre- sentar que os experimentos abaixo sejam todos ou os únicos experi- mentos realizados. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, tempe- ratura, etc.), porém, alguns erros experimentais e desvios devem ser levados em consideração. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular mé- dio, a temperatura é em graus Centígrados e a pressão é atmosférica ou próxima da atmosférica. Exemplo 1: Mutação de P65R de IL-2 elimina essencialmente a li- gação a CD25

[0286] Mutantes de IL-2 foram projetados para interromper a inter- face de CD25 através de oclusão estérica (P65R e P65E), e foram tes- tados para ligação a células 293F transitoriamente transfectadas com um ou mais componentes do receptor de IL-2 (CD25, CD122 e/ou CD132). Os mutantes foram comparados com IL-2-F42K, um mutante relatado como tendo afinidade reduzida para CD25. Concentrações crescentes de uma proteína de fusão compreendendo IL-2 humana tipo selvagem (SEQ ID NO: 32), IL-2-F42K (SEQ ID NO: 33), IL-2- P65R (SEQ ID NO: 35) ou IL- 2-P65E (SEQ ID NO: 34) fundido ao terminal N de um "knob" Fc e complexado com um "hole" Fc (SEQ ID NO: 44) foram adicionadas às células 293F transfectadas e incubadas a 4ºC por 45 minutos.

[0287] A ligação foi analisada por citometria de fluxo, substancial- mente como segue. As células foram lavadas uma vez em 200 µL de tampão FACS (PBS, 2 % de FBS, 0,05 % de azida de sódio) e as péle- tes celulares foram ressuspensas em 100 µl de uma solução de colo- ração de marcador de superfície (contendo anticorpo secundário Fcg anti-humano conjugado com A647 em diluição de 1:300 em tampão FACS). As células foram incubadas por 45 minutos a 4ºC antes da la- vagem final e analisadas em citômetro de fluxo. Detritos celulares fo- ram excluídos por exclusão de tamanho de FSC/SSC e células mortas foram excluídas com base em seu sinal de iodeto de propídio positivo. As células individuais foram selecionadas usando dupleto FSC-A/FSC- H e exclusão de agregado. As células transfectadas transitoriamente também expressaram EGFP citoplasmático e as células que eram FL1 positivas foram analisadas. Níveis crescentes de MFI de anticorpo se- cundário anti-humano indicaram ligação de IL-2. O software FlowJo foi usado para análise das populações de células. As intensidades mé- dias brutas de fluorescência (“MFI”) para cada marcador foram, então, exportadas e analisadas usando Excel e GraphPad PRISM. Os valores foram representados graficamente e as curvas de titulação foram ajus- tadas para avaliar uma relação dose-resposta usando o ajustamente de curva One-site -- Total de regressão não linear.

[0288] Como mostrado na FIG.2A-C, a proteína de fusão compre- endendo a variante IL-2-P65E exibiu afinidade ligeiramente reduzida para IL-2R em relação à proteína de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem. A proteína de fusão compreendendo IL-2F42K exibiu afini- dade mais baixa do que a proteína de fusão compreendendo IL-2- P65E, enquanto a proteína de fusão compreendendo IL-2-P65R exibiu a menor afinidade para IL-2R heterotrimérico (FIG. 2A). Além disso, a proteína de fusão compreendendo IL-2-P65R não exibiu ligação detec-

tável a CD25/CD132 e apenas ligou-se fracamente a CD25/CD122 (FIG. 2C), enquanto a proteína de fusão compreendendo IL-2-F42K manteve alguma afinidade para CD25/CD132 (FIG. 2B) e CD25/CD122 ligado com maior afinidade do que a proteína de fusão compreendendo IL-2-P65R (FIG. 2B e 2C). Assim, IL-2 com mutação em P65R reduziu significativamente a ligação a CD25 contendo recep- tores de IL-2. Exemplo 2: Modificações de IL-2 que reduzem a afinidade para CD122

[0289] Conforme observado no Exemplo 1, a mutação P65R IL-2 foi projetada para interromper a interface CD25 através da oclusão es- térica. Além disso, as mutações de IL-2 foram projetadas para reduzir a afinidade para a interface CD122 através da eliminação de certas interações de resíduo de contato (por exemplo, D84S, E95Q, M23A, H16A e E15S). Mutantes simples ou duplos foram fundidos ao terminal N da metade de "knob" de um Fc heterodimérico (knob estabilizado por dissulfeto em hole compreendendo "hole" Fc SEQ ID NO: 44) para ligação monovalente de IL-2 a IL-2R. As afinidades de ligação relativas foram avaliadas por transfecção transitória de células 293F com CD25 e CD122 (a cotransfecção com CD132 mostrou resultados semelhan- tes, embora a avidez de ligação adicional reduzisse as diferenças na afinidade observada). As proteínas de fusão IL-2-Fc ligadas foram de- tectadas com anticorpo secundário anti-humano fluorescente e anali- sadas por citometria de fluxo, substancialmente como descrito no Exemplo 1.

[0290] Como mostrado na FIG. 3A-3B, todas as proteínas de fusão compreendendo mutantes duplos de IL-2 incorporando F42K com mu- tações na interface de CD122 (SEQ ID NOs: 36-39 e) mostraram afini- dade de ligação reduzida para CD25/CD122 em relação àqueles que compreendem o mutante único IL- 2-F42K (SEQ ID NO: 33), com ex-

ceção de IL-2-F42K-E15S (SEQ ID NO: 85). Exemplo 3: IL-2-RAS (P65R, H16A e D84S) tem afinidade reduzida para CD122 no contexto de formas triméricas e diméricas de IL-2R

[0291] As mutações para reduzir a afinidade de CD122 descritas no Exemplo 2 foram combinadas com a mutação P65R para construir mutantes duplos e triplos de IL-2. Os mutantes de IL-2 foram fundidos ao terminal N da metade de “knob” de um Fc heterodimérico e pareado com um Fc de “hole” compreendendo SEQ ID NO: 44 para a ligação monovalente de IL-2 ao receptor de IL-2 (IL- 2R). As afinidades de li- gação relativas das proteínas de fusão resultantes foram avaliadas em células 293F transitoriamente transfectadas com subunidades de IL- 2R, substancialmente como descrito no Exemplo 1.

[0292] Em relação à proteína de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem (SEQ ID NO: 32), a proteína de fusão compreendendo IL-2- P65R-H16A (SEQ ID NO: 41) e a proteína de fusão compreendendo IL-2-P65R-D84S (SEQ ID NO: 42) teve afinidade reduzida tanto para CD122/CD132 (IL-2R heterodimérico) (FIG. 4A) quanto para IL-2R he- terotrimérico (FIG. 4B), enquanto a afinidade da proteína de fusão compreendendo mutante triplo, IL-2 P65R-H16A-D84S ("IL-2-RAS", SEQ ID NO: 43), foi ainda mais atenuada (FIG. 4A-4B). As mudanças na ligação observadas para esses mutantes de IL-2 na ligação máxima e EC50 sugerem que essas mutações reduziram a taxa de ativação (deslocamento à direita em EC50) e a taxa de desativação (ligação má- xima reduzida). Exemplo 4. IL-2-RAS tem afinidade reduzida para células T em re- pouso e células T pré-ativadas

[0293] Para isolar as células T, as populações de células não T foram marcadas com anticorpos marcadores antilinhagem biotinilados contra CD14, CD16, CD19, CD20, CD36, CD56, CD123, TCRγ/δ (Bio- Legend) por 20 minutos em temperatura ambiente. As populações de células não T foram, então, esgotadas por incubação por 20 minutos à temperatura ambiente com partículas de estreptavidina magnética (500 µl de suspensão de contas mais 500 µl de suspensão de células por 100x106, 2x8 minutos de incubação no ímã). O sobrenadante da célula não ligada continha células T isoladas.

[0294] Algumas das células T isoladas (5,5 x 106 em 3 mL) foram ativadas por incubação em uma placa de 6 cavidades pré-revestida com 1 µg/mL de anticorpo anti-CD3 OKT3 (BD Biosciences) por 2 dias, depois lavadas com PBS/FBS a 2 % e repouso a 2x106/mL em RPMI + FBS a 10 % por 1 dia. Células T em repouso ou pré-ativadas foram usadas diretamente no ensaio de ligação. Ligação de um controle de isótipo VHH-Fc não direcionado e proteínas de fusão compreendendo IL-2-RAS ou IL-2 tipo selvagem fundido ao terminal C de um VHH não direcionado ligado a um Fc heterodimérico a células T em repouso ou pré-ativadas foi medida por citometria de fluxo, substancialmente como descrito no Exemplo 1, exceto que os seguintes anticorpos secundá- rios foram usados: AF647 Fc anti-humano (1:1000), PI (1:2000), BV785-CD4 (1:300), APC/Fire-CD8 (1:500) e PE/Cy7-CD25 (1:100).

[0295] A proteína de fusão IL-2-RAS não direcionada (compreen- dendo SEQ ID NO: 46) se ligou com afinidade reduzida a células T em repouso (FIG. 5A) e pré-ativadas (FIG. 5B) em comparação com a pro- teína de fusão compreendendo um domínio VHH não direcionado e IL- 2 tipo selvagem (compreendendo SEQ ID NO: 45). Um controle de isó- tipo não compreendendo IL-2 não se ligou a células T em repouso ou pré-ativadas, como mostrado na FIG. 5A e 5B. Exemplo 5: IL-2-RAS reduziu afinidade para Tregs

[0296] As células T regulatórias ("Tregs") têm alta expressão en- dógena de CD25, bem como de CD122 e CD132, e são altamente responsivas à IL-2 tipo selvagem. Ligação a Tregs de uma proteína de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem (compreendendo SEQ ID

NO: 45) ou o mutante triplo IL-2-RAS (compreendendo SEQ ID NO: 46) fundido ao terminal C da metade de “knob” de um Fc heterodiméri- co (knob em hole estabilizado por dissulfeto no buraco) de um VHH não direcionado foi medido.

[0297] As células Tregs e respondedoras T CD4+ (Tresp) foram enriquecidas e isoladas a partir de PBMCs de doadores saudáveis e frescos usando um kit de isolamento de células T reguladoras Easy- Sep Human CD4+CD127baixoCD25+ (Stemcell) seguindo as instruções do fabricante. Tregs foram geradas a partir de células T CD4+ virgens por meio de cultura de 7 dias em Meio de Expansão de Células T ImmunoCult-XF suplementado com rhTGF-B1, ácido all-trans retinoico, ativador de células T CD3/CD28 e IL-2.

[0298] A fim de distinguir as duas populações de células, Tregs enriquecidas e células T respondedoras CD4+ foram marcadas com os corantes proliferativos CellTrace Violet (CTV) e CFSE, respectivamen- te, por 10 minutos a 37 °C. Após a lavagem, células Tregs e T CD4+ foram ressuspensas a 1,5x106 células/ml em RPMI suplementado com FBS a 10 % e 1X antibiótico/antimicótico. Tregs foram semeadas em 50 µl de volume rendendo 75.000 Tregs/cavidade em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. Tregs foram incubadas durante a noi- te a 37°C na presença de 10 nM de IL-2-RAS por citometria de fluxo, conforme descrito no Exemplo 1.

[0299] Como mostrado na FIG. 6, em contraste com a proteína de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem, a proteína de fusão com- preendendo IL-2-RAS não mostrou nenhuma ligação observável a Tregs enriquecidas de PBMCs (FIG. 6A), Tregs induzidas (FIG.6B) ou Trespondedoras CD4+ (FIG. 6C). Exemplo 6: IL-2-RAS reduziu a atividade em células T em repouso

[0300] As células T foram isoladas por separação magnética de contas, substancialmente como descrito no Exemplo 4, marcadas com

CellTrace Violet (CTV) e tratadas com uma proteína de fusão compre- endendo IL-2 tipo selvagem (compreendendo SEQ ID NO: 45) ou IL-2- RAS (compreendendo SEQ ID NO: 46) fundido ao terminal C de um VHH não direcionado ligado a um Fc heterodimérico. Os níveis de CD4, CD8, CD71 e CTV foram medidos por citometria de fluxo. As cé- lulas T em proliferação reduziram os níveis de CTV.

[0301] Como mostrado na FIG. 7A e FIG. 7C, a concentração da proteína de fusão compreendendo IL-2-RAS necessária para induzir a proliferação de células T CD4+ e CD8+ em repouso era mais de 100 vezes maior do que a concentração de uma proteína de fusão com- preendendo IL-2 tipo selvagem ou a concentração de uma proteína de fusão compreendendo o análogo de IL-2v é necessária para alcançar a mesma indução de proliferação.

[0302] Como mostrado na FIG. 7B e FIG. 7D, a concentração da proteína de fusão compreendendo IL-2-RAS necessária para induzir a expressão de CD71, um marcador de ativação de células T, em célu- las T CD8+ e CD4+, era pelo menos 100 vezes maior do que a concen- tração da proteína de fusão compreendendo análogo de tipo selvagem IL-2 ou IL-2v necessário para atingir a mesma indução de ativação.

[0303] A ativação das células T também pode ser medida pelos níveis de STAT5 fosforilados, que são aumentados nas células T ati- vadas. As células T foram isoladas por separação magnética de con- tas e tratadas com a proteína de fusão compreendendo IL-2 tipo sel- vagem (compreendendo SEQ ID NO: 45) fundida ao terminal C de um VHH não direcionado compreendendo um Fc heterodimérico ou prote- ína de fusão compreendendo IL -2-RAS (compreendendo SEQ ID NO: 46) fundido ao terminal C de um VHH não direcionado compreendendo um Fc heterodimérico por 15 minutos. As células foram fixadas com BD Cytofix/Cytoperm™ (BD Biosciences), permeabilizadas em 90 % de metanol gelado e os níveis de STAT5 fosforilado ("pSTAT5") em células T CD4+ e CD8+ foram medidos usando citometria de fluxo usando um anticorpo anti-pSTAT5-PE (1:70). As células foram cocora- das com os seguintes anticorpos: anti-CD3-FITC (1:200), CD56-BV421 (1:100), CD4-BV785 (1:200), CD8-APC-Fire (1:300).

[0304] Como mostrado na FIG. 7E e FIG. 7F, a proteína de fusão IL-2-RAS não direcionada alcançou fosforilação mínima de STAT5 em células T CD4+ e CD8+ em repouso, mesmo na concentração mais alta testada, enquanto a proteína de fusão IL-2-tipo selvagem não direcio- nada induziu fosforilação de STAT5 em uma concentração mais de 1000 vezes menor do que a concentração mais alta testada. Exemplo 7: Mutantes de IL-2 têm atividade reduzida em Tregs

[0305] Tregs foram isolados de PBMCs usando o Kit de Isolamen- to de Célula T Reguladora EasySep™ Human CD4+CD127baixoCD25+ (Stemcell). Tregs foram marcadas com CellTrace Violet e semeadas em 0,15x106 células por cavidade (96 cavidades, fundo em U) em 100 µl de RPMI/10% de FBS. As células foram combinadas com 100 µl de uma titulação de proteína de fusão começando em 100 nM, titulada 1:4. As células foram incubadas durante 7 dias. No dia 7, o marcador de proliferação e ativação CD25 foi medido por citometria de fluxo (Novocyte) substancialmente como descrito no Exemplo 1, exceto que os seguintes anticorpos foram usados: BV785-CD4 (1:300), APC/Fire- CD8 (1:500) PE/Cy7-CD25 (1:100), PI (1:2000).

[0306] Como mostrado na FIG. 8A e 8B, proteína de fusão com- preendendo IL-2 tipo selvagem (compreendendo SEQ ID NO: 45) fun- dida ao terminal C de um VHH não direcionado ligado a Fc heterodi- mérico, porém, não proteína de fusão compreendendo IL-2-RAS no lugar de IL-2 tipo selvagem (compreendendo SEQ ID NO: 46), prolife- ração de Treg induzida e expressão do marcador de ativação CD25. Exemplo 8: Células T ativadas que expressam PD-1 são estimula- das por IL-2-RAS direcionado a PD-1

[0307] A capacidade de se ligar e estimular células T que expres- sam PD-1 foi testada usando pembrolizumabe (um anticorpo conven- cional anti-PD-1) e uma proteína de fusão compreendendo um análogo de pembrolizumabe e IL-2-RAS ligado ao terminal C da cadeia pesada (veja a FIG. 1F).

[0308] As células T enriquecidas de um dador saudável foram ati- vadas, substancialmente como descrito no Exemplo 4. Placas de 6 ca- vidades foram revestidas durante a noite com 1 µg/ml de anticorpo OKT3 a 4 °C. No dia seguinte, as placas foram lavadas duas vezes para remover o anticorpo OKT3 não ligado. As células T enriquecidas foram descongeladas usando meio CTL e ressuspensas em 5,5 x 106 células/mL em RPMI completo e semeadas em 3 mL por cavidade nas placas revestidas. Dois dias depois, as células T ativadas foram cole- tadas e lavadas uma vez antes da semeadura em meio sem anticorpo OKT3 por 24 horas para repouso. As células foram marcadas com o corante proliferativo CellTrace™ Violet (CTV). As células T foram con- tadas e, então, ressuspensas em 2x106 células/mL. 100 µL de células ressuspensas foram semeados por cavidade em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. Pembrolizumabe ou uma fusão de análogo- IL-2-RAS de pembrolizumabe foi adicionado começando em uma con- centração final de 100 nM e titulado 1:5. No terceiro dia, as células T foram coradas por 20 min em temperatura ambiente com o marcador de viabilidade PI e os seguintes anticorpos fluorescentemente marca- dos: CD4-BV785, CD8-APC/Fire, CD25-PE/Cy7, CD71-FITC e CD69- APC. A placa foi lida no citômetro de fluxo Novocyte substancialmente como descrito no Exemplo 7 para medição de proliferação e como no Exemplo 1 para ligação e os dados foram exportados para Excel para análise posterior.

[0309] Como mostrado na FIG. 9, a proteína de fusão do análogo- IL-2-RAS de pembrolizumabe estimulou a proliferação de células T

CD8+ (FIG. 9A) e a proliferação de células T CD4+ (FIG. 9B), enquanto o pembrolizumabe sozinho não o fez. Sem a intenção de se vincular a qualquer teoria particular, a natureza bifásica da proliferação observa- da pode sugerir que a atividade em baixa concentração seja devido à atividade direcionada de PD-1 e o aumento da atividade em concen- tração mais elevada seja devido à atividade não direcionada. Como mostrado na FIG. 9C e 9D, tanto o pembrolizumabe quanto o análogo- IL-2-RAS de de pembrolizumabe se ligaram às células T CD8+ e CD4+ ativadas com afinidades semelhantes, exceto que a ligação adicional foi observada para a proteína de fusão compreendendo IL-2-RAS na extremidade superior da faixa de diluição acima de 10 nM, que pode ter sido mediado pela ligação de IL-2-RAS a IL-2R. Exemplo 9: Pré-bloqueio de PD-1 em células T ativadas evita a si- nalização por IL-2-RAS direcionado a PD-1

[0310] As células T foram isoladas e enriquecidas de um doador saudável por separação magnética de contas e incubadas em placas revestidas com anticorpo OKT3 para ativá-las, substancialmente como descrito no Exemplo 4. As células foram marcadas com CTV. As célu- las T pré-ativadas foram incubadas com pembrolizumabe, um anticor- po anti-PD-1, para bloquear os sítios de ligação ao PD-1 ou um anti- corpo não direcionado como controle. As células foram, então, incuba- das com uma proteína de fusão compreendendo IL-2-RAS fundido a um análogo de pembrolizumabe, ou uma proteína de fusão compreen- dendo IL-2-RAS fundido a um anticorpo não direcionado como um controle, por 3 dias. A extensão da sinalização de IL-2 foi avaliada medindo a proliferação de células T CD4+ e CD8+ por citometria de flu- xo, substancialmente como descrito no Exemplo 7.

[0311] Como mostrado na FIG. 10A-10D, IL-2 tipo selvagem indu- ziu proliferação robusta de células T CD8+ e CD4+, enquanto células T CD4+ e células T CD8+ tratadas com pembrolizumabe ou a proteína de fusão compreendendo IL-2-RAS e o anticorpo não direcionado exibi- ram níveis baixos de proliferação que não foi afetada pelo pré-bloqueio de PD-1. Em contraste, ambas as células T CD4+ (FIG. 10B e 10D) e células T CD8+ (FIG. 10A e 10C) tratadas com a proteína de fusão compreendendo IL-2-RAS e um análogo de pembrolizumabe exibiram proliferação dependente de PD-1 significativa (FIG. 10A e 10B), que foi bloqueado por pré-incubação com um anticorpo anti-PD-1 (FIG. 10C e 10D). Assim, uma proteína de fusão compreendendo IL-2-RAS e um anticorpo anti-PD-1 ativou células T apenas quando PD-1 foi expresso e acessível nas células T. Exemplo 10: IL-2-RAS direcionado a PD-1 supera a supressão de Treg

[0312] As células T respondedoras CD4+ e Tregs foram isoladas conforme descrito no Exemplo 5. As células respondedoras CD4+ fo- ram marcadas com CTV, misturadas com Tregs isoladas em uma rela- ção de 2:1 e ativadas com contas anti-CD3 (1 conta por 2 células T). A mistura resultante foi tratada com uma série de diluições de uma IL-2 tipo selvagem fundida ao terminal C de um VHH não direcionado, co- mo mostrado na FIG. 1B, uma proteína de fusão compreendendo IL-2- RAS fundida ao terminal C de um VHH não direcionado, como mostra- do na FIG. 1B, ou com uma proteína de fusão compreendendo IL-2- RAS fundido a um anticorpo anti-PD-1 (análogo de pembrolizumabe- IL-2-RAS) por 7 dias. A proliferação foi medida por citometria de fluxo, substancialmente como descrito no Exemplo 7.

[0313] Como mostrado na FIG. 11, células Trespondedoras foram suprimidas por Tregs, porém, IL-2 tipo selvagem não direcionado e a proteína de fusão compreendendo IL-2-RAS e um anticorpo anti-PD-1 (análogo de pembrolizumabe-IL-2-RAS) induziu a proliferação de célu- las T respondedoras CD4+, apesar da presença de células Treg. O tra- tamento de células com uma proteína de fusão compreendendo IL-2-

RAS e um anticorpo não direcionado não salvou a proliferação em uma extensão similar. O IL-2-RAS não direcionado só foi capaz de combater os efeitos supressivos de Tregs em Trespondedoras em concentrações muito mais altas do que a proteína de fusão IL-2-RAS direcionada a PD-1. Assim, IL-2-RAS direcionada a PD-1 superou os efeitos supressivos de Tregs, e esta atividade era dependente de PD-1 de ligação expressa nas células T. Exemplo 11: IL-2-RAS direcionado a PD-1 não sinaliza em trans

[0314] As contas são revestidas com 200 µg de antígeno PD-1 por 4 x 108 contas de acordo com o procedimento de revestimento reco- mendado pelo fabricante. Em resumo, as contas são lavadas uma vez em tampão 1 (tampão de fosfato sódico 0,1 M, pH 7,4-8,0) e, em se- guida, incubadas em um rotador de tubo por 18 horas em temperatura ambiente em tampão 1 contendo antígeno PD-1. As contas são, então, lavadas 4 vezes com tampão 2 (PBS, 0,1 % de BSA, 2 mM de EDTA pH 7,4). Os grupos tosila livres são desativados por incubação de con- tas por 4 horas a 37 °C em tampão 3 (0,2 M de Tris, 0,1 % de BSA, pH 8,5). As contas são, então, lavadas uma vez em tampão 2 e ressus- pensas a uma concentração de 400x106 contas/mL.

[0315] As contas revestidas são incubadas com uma proteína de fusão compreendendo IL-2 ou IL-2-RAS tipo selvagem fundido a um anticorpo anti-PD-1 e lavadas. As contas são, então, incubadas com células T em repouso isoladas. A sinalização de IL-2 é avaliada me- dindo os níveis de pSTAT5 por meio de citometria de fluxo.

[0316] A proteína de fusão compreendendo IL-2 tipo selvagem li- gada às contas ativa robustamente as células T CD8+ e células T CD4+, enquanto a proteína de fusão compreendendo IL-2-RAS ligada às contas não tem atividade até a concentração mais alta testada em células T CD4+ ou CD8+. Assim, o direcionamento de células T de IL-2- RAS é necessário para a sinalização de IL-2, e a sinalização de IL-2-

RAS direcionada não ocorre em trans. Exemplo 12: IL-2-RAS não sinaliza em trans

[0317] Séries de diluições de IL-2 tipo selvagem não direcionado e de IL-2-RAS não direcionado, começando em 1000 nM e diluídas 1:4, foram revestidas em placas de ensaio, incubadas durante a noite e lavadas. As células T foram adicionadas e incubadas a 37ºC por 30 minutos. A ativação das células T CD8+ e CD4+ foi medida pela detec- ção dos níveis de STAT5 fosforilados, substancialmente como descrito no Exemplo 6.

[0318] Como mostrado na FIG. 12A e 12B, células T CD8+ e CD4+ foram ativadas por IL-2 tipo selvagem em trans, conforme medido por indução de pSTAT5; no entanto, o IL-2-RAS não direcionado foi inca- paz de ativar em trans. Sem a intenção de ser limitado por qualquer teoria particular, as afinidades reduzidas de IL-2-RAS para CD25 e CD122 podem ter impedido a ligação e agrupamento eficientes do IL- 2R para induzir a sinalização a jusante. Assim, apenas as proteínas de fusão IL-2-RAS direcionadas conduzem a sinalização de pSTAT5. Exemplo 13: IL-2-RAS direcionado a NKp46 conduz especifica- mente à proliferação de células NK

[0319] Os efeitos de uma proteína de fusão compreendendo IL-2- RAS fundido ao terminal C de um anticorpo scFv heterodimérico dire- cionado a NKp46, como mostrado na FIG. 1H, proteínas de fusão compreendendo IL-2 ou IL-2-RAS tipo selvagem fundido ao terminal C de um VHH não direcionado ligado a um Fc heterodimérico, como mostrado na FIG. 1B, e o anticorpo scFv heterodimérico direcionado a NKp46 sozinho em células NK, células T CD4+ e células T CD8+ foram determinados.

[0320] PBMCs frescos de um doador saudável foram marcados com CellTrace ™ Violet e semeados em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades em 200.000 células/cavidade. Diluições das proteínas de fusão e controle de NKp46 scFv-Fc foram adicionadas às células semeadas e incubadas a 37 °C por 7 dias. No dia 7, a proliferação ce- lular foi medida, substancialmente como descrito no Exemplo 7, exceto que os seguintes anticorpos foram usados: anti-CD3-BV785 (1:200), anti-CD56-APC (1:100), anti-CD4- PE (1:200), anti-CD8-APC-Fire (1:300) e PI (1:2000).

[0321] Além disso, PBMCs frescas de um doador saudável foram tratados com as mesmas proteínas de fusão ou controle NKp46 scFv- Fc e incubadas a 37ºC por 15 minutos. Os níveis de pSTAT5 em célu- las T CD8+, células T CD4+ e células NK (CD3-, CD56+) foram medi- dos pela detecção de níveis de STAT5 fosforilados, substancialmente como descrito no Exemplo 6.

[0322] A ligação das proteínas de fusão e do controle NKp46 scFV-Fc a PBMCs frescas de um doador saudável foi medida, subs- tancialmente como descrito no Exemplo 1, exceto que os seguintes anticorpos foram usados: anti-CD3-FITC (1:100), anti-CD56-BV421 (1:100), anti-CD4-BV785 (1:200), anti-CD8-APC-Fire (1:300), IgG- Alexa Fluor 647 anti-humano (1:500) e PI (1:2000).

[0323] Como mostrado na FIG. 13A-13I, IL-2-RAS direcionado a NKp46 ativou potentemente a proliferação e ativação de células NK, embora não afete as células T CD4+ ou CD8+. Em contraste, a IL-2 tipo selvagem não direcionada conduziu a proliferação e ativação de todos os linfócitos testados (células T NK, CD4+ e CD8+). A ligação de NKp46scFV-Fc (sem IL-2-RAS) não conduziu a proliferação de NK ou indução de pSTAT5. Assim, IL-2-RAS direcionado a NKp46 conduziu a sinalização cis de IL-2 em células NK, porém, não ativou células T CD4+ ou CD8+ em trans. Exemplo 14: IL-2-RAS direcionado a LAG3 estimula células T LAG3+ pré-ativadas

[0324] Os efeitos nas células T CD4+ e nas células T CD8+ de pro-

teínas de fusão compreendendo IL-2-RAS fundido ao terminal C de um anticorpo convencional heterodimérico anti-LAG3 (MAb), como mos- trado na FIG. 1G, fundido a um VHH anti-LAG3 com um Fc heterodi- mérico como mostrado na FIG. 1B, fundido a um VHH não direciona- do, como mostrado na FIG. 1B, ou uma proteína de fusão compreen- dendo IL-2 tipo selvagem fundida ao terminal C de um Fc heterodimé- rico não direcionado, como mostrado na FIG. 1B, ou um Mabe direcio- nado a LAG3 (controle), ou um VHH-Fc direcionado a LAG3 (controle) foram ensaiados.

[0325] Células T enriquecidas de um doador saudável foram esti- muladas por 48 horas com 1µg/mL de anti-CD3 revestido (OKT3) e 10 µg/mL de anti-CD28 solúvel, e, então, deixadas em repouso por 24 horas. As células pré-ativadas foram marcadas com CellTrace™ Violet e semeadas a 200.000 células/cavidade. Diluições das proteínas de fusão e proteínas de controle foram adicionadas e incubadas por 3 di- as. A proliferação e a expressão dos marcadores de ativação CD25 e CD71 foram medidos, substancialmente como no Exemplo 7, porém, com estes anticorpos adicionais: anti-CD25-FITC (1:100) e anti-CD71- PE/Cy7.

[0326] As células T CD8+ estimuladas sub-regularam LAG3 para 45 % das células T CD8+, enquanto as células T CD4+ sub-regularam LAG3 para 22 % das células T CD4+. Em contraste, as células T não estimuladas são quase 0 % positivas para a expressão de LAG3 nas células T CD8+ ou CD4+.

[0327] Como mostrado na FIG. 14A-14D, tanto Mab-IL-2-RAS anti- LAG3 quanto VHH anti-LAG3-IL-2-RAS aumentaram a proliferação de CD8+ e CD4+ (FIG. 14A e 14B) e ativação conforme indicado por CD25 (FIG. 14C e 14D) e níveis de expressão de CD71 (FIG. 14E e 14F). A IL-2 tipo selvagem não direcionada foi um forte indutor da proliferação e ativação de células T CD8+ e CD4+ e ligou células T estimuladas com maior afinidade e saturação. Exemplo 15: Mutantes de combinação de IL-2 reduzem ainda mais a atividade não direcionada

[0328] Células repórter HEK-Blue IL-2 (InvivoGen) foram usadas para medir as atividades relativas de mutantes de IL-2 não direciona- dos. As células repórter foram tratadas com diluições de mutantes de IL-2 fundidos ao terminal C de um VHH não direcionado e incubadas por 20 horas antes da análise de Quanti-Blue.

[0329] Como mostrado na FIG. 15, os mutantes de IL-2 mostraram uma variedade de atividades. Os experimentos descritos acima mos- traram que IL-2-RAS (P65R, H16A e D84S) reduziu drasticamente a ligação a IL-2Rs em comparação com IL-2 tipo selvagem (veja FIG. 4- 6) e atividade reduzida em comparação com IL-2 tipo selvagem (veja FIG. 7A-7E). IL-2-RAS com uma mutação M23A adicional e IL-2-RAS com uma mutação E95Q adicional mostraram atividade reduzida em comparação com IL-2-RAS, e a combinação de IL-2-RAS com M23A e E95Q teve atividade ainda mais atenuada. Em experimentos com célu- las repórter que expressam PD-1, todos esses mutantes de IL-2 de afinidade reduzida mostraram atividade direcionada de PD-1 compará- vel (dados não mostrados), sugerindo que a ligação de alta afinidade a PD-1 em cis pode compensar a afinidade reduzida de mutantes de IL- 2 para IL-2R. Embora o sistema repórter HEK-Blue IL-2 tenha sido útil para a medição da atividade relativa, a EC50 observada para mutantes de IL-2 no sistema repórter foi deslocada significativamente para a es- querda em comparação com os linfócitos primários, provavelmente devido à superexpressão de componentes de IL-2R na célula repórter em comparação com níveis mais baixos de IL-2R nas células primá- rias.

[0330] A descrição pode ser incorporada em outras formas especí- ficas sem se afastar do espírito ou das características essenciais da mesma. As modalidades anteriores devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos ilustrativos, em vez de limitantes da descrição. O escopo da descrição é, portanto, indicado pelas reivindicações ane- xas, em vez da descrição anterior, e todas as alterações que incluem- se no significado e faixa de equivalência das reivindicações, portanto, devem ser aqui abrangidas. Tabela de Certas Sequências SEQ ID NO Descrição Sequência 1 IL-2 Humana APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- tipo selvagem TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 2 IL-2v APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF AQSIISTLT 3 IL-2-P65R APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 4 IL-2-H16A APTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 5 IL-2-D84S APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 6 IL-2-E15S APTSSSTKKTQLQLSHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 7 IL-2-M23A APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQAILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 8 IL-2-E95Q APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLQLKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 9 IL-2-P65E APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEEL-

KELEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 10 IL-2-F42K APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT KKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 11 IL-2-H16A-F42K APTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT KKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 12 IL-2-D84S-F42K APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT KKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 13 IL-2-E15S-F42K APTSSSTKKTQLQLSHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTKKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 14 IL-2-M23A-F42K APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQAILNGINNYKNPKLTRMLTKKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 15 IL-2-E95Q-F42K APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT KKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLQLKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 16 IL-2-P65R-H16A APTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 17 IL-2-P65R-D84S APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 18 IL-2-P65R-E15S APTSSSTKKTQLQLSHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 19 IL-2-P65R- APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQAILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- M23A TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 20 IL-2-P65R- APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- E95Q TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLQLKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 21 IL-2-P65R- APTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- H16A-D84S (IL- TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 2-RAS) 22 IL-2-T3A-C125S APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA-

TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT

23 IL-2-T3A-P65R- APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- C125S TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 24 IL-2-T3A-H16A- APASSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- C125S TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 25 IL-2-T3A-D84S- APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- C125S TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT 26 IL-2-T3A-H16A- APASSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- P65R-C125S TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 27 IL-2-T3A-P65R- APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- D84S-C125S TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 28 IL-2-T3A-H16A- APASSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- P65R-D84S- TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT C125S 29 IL-2-no9-H16A- TQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK RLEEVLN- P65R-C125S LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 30 IL-2-no9-P65R- TQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK RLEEVLN- D84S-C125S LAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 31 IL-2-no9-H16A- TQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELK RLEEVLN- P65R-D84S- LAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT C125S 32 IL-2-xELL APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- “knob” Fc tipo TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- selvagem TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 33 IL-2-F42K-xELL APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTKKFYMPKKA- “knob” Fc TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 34 IL-2-P65E-xELL APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEEL- “knob” Fc KELEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWIT- FCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED- PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI- EKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN-

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 35 IL-2-P65R-xELL APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- “knob” Fc TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 36 IL-2-F42K- APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTKKFYMPKKA- D84S-xELL TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- “knob” Fc TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 37 IL-2-F42K- APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTKKFYMPKKA-

E95Q-xELL TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLQLKGSETTFMCEYADETA- “knob” Fc TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 38 IL-2-F42K- APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQAILNGINNYKNPKLTRMLTKKFYMPKKA- M23A-xELL TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- “knob” Fc TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 85 IL-2-F42K- APTSSSTKKTQLQLSHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTKKFYMPKKA- E15S-xELL TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- “knob” Fc TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 39 IL-2-H16A- APTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLT KKFYMPKKA- F42K- xELL TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- “knob” Fc TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 40 IL-2-H16A-xELL APTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- “knob” Fc TELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 41 IL-2-P65R- APTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- H16A-xELL TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- “knob” Fc TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 42 IL-2-P65R- APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- D84S-xELL TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- “knob” Fc TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 43 IL-2-RAS-xELL APTSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKA- “knob” Fc TELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETA- TIVEFLNRWITFCQSIISTLTPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 44 Ligante-EVN KPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV- xELL “hole” Fc DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

45 xELL “knob” Fc- DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- IL-2-T3G-C125S GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGSAPGSSSTKKT- QLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN-

LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT 46 xELL “knob” Fc- DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- IL-2-RAS-T3G- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- C125S KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGSAPGSSSTKKT- QLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLN-

LAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT 47 Região de Fc 1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- (IgG1 tipo GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- selvagem KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- humana) GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 48 Região de Fc 2 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- (xELL de IgG1 GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- humana “knob”) KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 49 Região de Fc 3 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- (EVN xELL de GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- IgG1 humana KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- “hole” I253R) GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 50 Região de Fc DKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREE-

QYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLS-

LSPGK 51 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST xELL YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPS-

DIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 52 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST xELL H435R YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPS-

DIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK 53 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPS VFLFPPKPKD TLYISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST xELLM252Y e YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV M428V (YV) KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVVH EALHNHYTQK SLSL-

SPGK 54 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPS VFLFPPKPKD TLYISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST xELLM252Y e YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV M428L (YL) KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVLH EALHNHYTQK SLSL-

SPGK 55 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPS VFLFPPKPKD TLYISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST xELLM252Y, YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPS- M428L, H435R DIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVLH EALHNRYTQK SLSLSPGK (YLR) 56 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPS VFLFPPKPKD TLYISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST xELLM252Y, YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPS- M428V, H435R DIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVVH EALHNRYTQK SLSLSPGK (YVR) 57 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST xELL S354C YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPCRDELT KNQVSLWCLV T366W knob KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSL-

SPGK 58 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST xELLH435R YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPCRDELT KNQVSLWCLV KGFYPS- S354C T366W DIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK knob 59 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- xELLM252Y e GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- M428V (YV) KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- S354C T366W GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPGK knob 60 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- xELLM252Y e GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA-

M428L (YL) KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- S354C T366W GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK knob 61 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- xELLM252Y, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- M428L, H435R KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- (YLR) S354C GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNRYTQKSLSLSPGK T366W knob 62 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- xELLM252Y, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- M428V, H435R KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- (YVR) S354C GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPGK T366W knob 63 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- xELLT366S, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- L368A, Y407V KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- hole GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 64 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- xELL H435R, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- T366S, L368A, KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- Y407V hole GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK 65 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- xELLM252Y e GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- M428V (YV) KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- T366S, L368A, GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPGK Y407V hole 66 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- xELLM252Y e GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- M428L (YL) KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- T366S, L368A, GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK Y407V hole 67 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- xELLM252Y, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- M428L, H435R KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- (YLR) T366S, GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNRYTQKSLSLSPGK L368A, Y407V hole 68 Região de Fc DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- xELLM252Y, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- M428V, H435R KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- (YVR) T366S, GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPGK L368A, Y407V hole 69 Região de Fc DKTHTCPPCP APELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT H435R KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHN-

RYTQK SLSLSPGK 70 Região de Fc DKTHTCPPCP APELLGGPS VFLFPPKPKD TLYISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT M252Y e KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT M428V (YV) KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVVH

EALHNHYTQK SLSLSPGK 71 Região de Fc DKTHTCPPCP APELLGGPS VFLFPPKPKD TLYISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT M252Y e M428L KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT (YL) KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVLH

EALHNHYTQK SLSLSPGK 72 Região de Fc DKTHTCPPCP APELLGGPS VFLFPPKPKD TLYISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREE- M252Y, M428L, QYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV H435R (YLR) KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVLH EALHNRYTQK SLS-

LSPGK 73 Região de Fc DKTHTCPPCP APELLGGPS VFLFPPKPKD TLYISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREE- M252Y, M428V, QYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV H435R (YVR) KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVVH EALHNRYTQK SLS-

LSPGK 74 Região de Fc DKTHTCPPCP APELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT S354C T366W KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPCRDELT knob KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

EALHNHYTQK SLSLSPGK 75 Região de Fc DKTHTCPPCP APELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREE- H435R S354C QYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPCRDELT KNQVSLWCLV T366W knob KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLS-

LSPGK 76 Região de Fc DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- M252Y e M428L GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- (YL) S354C KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- T366W knob GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK 77 Região de Fc DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- M252Y, M428L, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- H435R (YLR) KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- S354C T366W GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNRYTQKSLSLSPGK knob 78 Região de Fc DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- M252Y, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- M428V, H435R KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- (YVR) S354C GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPGK T366W knob 79 Região de Fc DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- T366S, L368A, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- Y407V hole KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD-

GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 80 Região de Fc DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- H435R, T366S, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- L368A, Y407V KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- hole GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK 81 Região de Fc DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- M252Y e GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- M428V (YV) KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- T366S, L368A, GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPGK Y407V hole 82 Região de Fc DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- M252Y e M428L GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- (YL) T366S, KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- L368A, Y407V GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK hole 83 Região de Fc DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- M252Y, M428L, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- H435R (YLR) KGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- T366S, L368A, GSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNRYTQKSLSLSPGK Y407V hole 84 IL-2 humana QLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN- tipo selvagem LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSII truncada 86 xELL-Knob Fc- DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- IL2-T3A, C125S GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGSAPASSSTKKT- QLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLN-

LAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 87 xELL-Knob Fc- DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- IL2-RAS-T3A, GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- C125S KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGSAPASSSTKKT- QLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLN-

LAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 88 Análogo de QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTN- Pembrolizuma- FNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVS- be Knob Fc-IL2- SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- RAS-T3A, VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPGG- C125S PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT-

KNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGGSGGSAPASSSTKKTQLQLEALLLDLQMILN- GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLIS-

NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 89 Análogo de QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTN- Pembrolizuma- FNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVS- be Hole Fc SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDKLT- KNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEW KSNGQPENNYKTTPPVLDSKGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 90 Análogo de EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGV- Cadeia Leve de PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS- Pembrolizuma- DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS- be LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 91 Análogo de QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTN- Pembrolizuma- FNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVS- be IL2-RAS- SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- T3G, C125S VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG- PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMT- KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGSGGSAPGSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILN- GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLIS-

NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 92 NKp46-scFv QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVINWGKQRSGQGLEWIGEIYPGSG- xELL-Knob Fc- TNYYNEKFKAKATLTADKSSNIAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRGRYGLYAMDYWGQG- IL2-RAS-T3A, TSVTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIS- C125S NYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTINNLEQEDIA- TYFCQQGNTRPWTFGGGTKLEIKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGGSGGSAPASSSTKKTQLQLEALLLDLQMILN- GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLIS-

NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 93 NKp46-scFv QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVINWGKQRSGQGLEWIGEIYPGSG- xELL-Hole Fc TNYYNEKFKAKATLTADKSSNIAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRGRYGLYAMDYWGQG- TSVTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIS- NYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTINNLEQEDIA- TYFCQQGNTRPWTFGGGTKLEIKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDKLT- KNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEW KSNGQPENNYKTTPPVLDSKGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 94 NKp46-scFv QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYVINWGKQRSGQGLEWIGEIYPGSG- xELL-Fc TNYYNEKFKAKATLTADKSSNIAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRGRYGLYAMDYWGQG- TSVTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIS- NYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTINNLEQEDIA- TYFCQQGNTRPWTFGGGTKLEIKPGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT- KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 95 LAG3-MAb QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINANSGG- xELL-Knob Fc- TNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDIYDSSDQLNVWGQGTMVTVS- IL2-RAS-TGCS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL- LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE- QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCR- DELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR-

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GGSGGSAPGSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILN- GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLIS-

NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 96 LAG3-MAb QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINANSGG- xELL-Hole Fc TNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDIYDSSDQLNVWGQGTMVTVS- SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPGG- PSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT- KNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 97 LAG3-MAb EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPAR- Cadeia Leve FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQASIWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS- DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS-

LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 98 LAG3-MAb IgG1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINANSGG- TNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDIYDSSDQLNVWGQGTMVTVS- SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL- LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE- QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR- DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR-

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 99 LAG3-VHH EVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAASGRTFSDYVMGWFRQAPGKEREFVAAISES- xELL-Knob Fc- GGRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCATTLLWW- IL2-RAS-TGCS TSEYAPIKANDYDYWGQGTLVTVKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGSAPGSSSTKKTQLQLEALLLDLQMILN- GINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLIS-

NINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 100 LAG3-VHH EVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAASGRTFSDYVMGWFRQAPGKEREFVAAISES- xELL- GGRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCATTLLWW- Hole_H435R Fc TSEYAPIKANDYDYWGQGTLVTVKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELT- KNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK 101 LAG3-VHH EVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAASGRTFSDYVMGWFRQAPGKEREFVAAISES- xELL-KnobFc GGRTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCATTLLWW- TSEYAPIKANDYDYWGQGTLVTVKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELT- KNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN-

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 102 xELL-Knob Fc- DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- IL2-RAS-M23A- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- T3A, C125S KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGSAPASSSTKKT- QLQLEALLLDLQAILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLN-

LAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT 103 xELL-Knob Fc- DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- IL2-RAS-E95Q- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- T3A, C125S KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGSAPASSSTKKT- QLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLN-

LAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLQLKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF SQSIISTLT 104 xELL-Knob Fc- DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- IL2-RAS-M23A- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- E95Q-T3A, KGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD- C125S

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[0331] Em sequências que contêm caixas ou sublinhado, as caixas em torno das letras individuais indicam substituições de aminoácidos em relação a uma sequência parental ou tipo selvagem corresponden- te; caixas ao redor de grupos de letras indicam sequências de ligante. As letras sublinhadas são sequências de ligante.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo compreendendo uma IL-2 modificada, ca- racterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende pelo me- nos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido se- lecionada dentre P65, D84, E95, M23 e H16.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a IL-2 modificada é uma IL-2 humana modifica- da.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca- racterizado pelo fato de que as posições de aminoácidos correspon- dem às posições de aminoácidos em SEQ ID NO: 1.

4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende uma substituição na posição de aminoácido P65.

5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zado pelo fato de que a substituição é selecionada dentre P65R, P65E, P65K, P65H, P65Y, P65Q, P65D e P65N.

6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende uma substituição na posição de aminoácido H16.

7. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zado pelo fato de que a substituição é selecionada dentre H16A, H16G, H16S, H16T, H16V e H16P.

8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende uma substituição na posição de aminoácido D84.

9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracteri- zado pelo fato de que a substituição é selecionada dentre D84S, D84G, D84A, D84T, D84V e D84P.

10. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi-

cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende substituições nas posições de aminoácidos P65, H16 e D84.

11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 10, carac- terizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende as substitui- ções P65R, H16A e D84S.

12. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende uma substituição na posição de aminoácido M23.

13. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 12, carac- terizado pelo fato de que a substituição é selecionada dentre M23A, M23G, M23S, M23T, M23V e M23P.

14. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, carac- terizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende as substitui- ções P65R, H16A, D84S e M23A.

15. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende uma substituição na posição de aminoácido E95.

16. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 15, carac- terizado pelo fato de que a substituição é selecionada dentre E95Q, E95G, E95S, E95T, E95V, E95P, E95H e E95N.

17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 16, carac- terizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende as substitui- ções P65R, H16A, D84S e E95Q.

18. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 17, carac- terizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende as substitui- ções P65R, H16A, D84S, M23A e E95Q.

19. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende uma substituição na posição de aminoácido F42.

20. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 19, carac- terizado pelo fato de que a substituição em F42 é selecionada dentre F42K, F42A, F42R, F42A, F42G, F42S e F42T.

21. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posi- ção de aminoácido selecionada dentre Y45 e L72.

22. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 21, carac- terizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substituição selecionada dentre Y45A e L72G.

23. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posi- ção de aminoácido selecionada dentre T3 e C125.

24. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 23, carac- terizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende pelo menos uma substituição selecionada dentre T3A e C125A.

25. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende um conjunto de substituições selecionadas dentre H16A- F42K; D84S-F42K; E15S-F42K; M23A-F42K; E95Q-F42K; P65R- H16A; P65R-D84S; P65R-E15S; P65R-M23A; P65R-E95Q; T3A- C125S; T3A-P65R-C125S; T3A-H16A-C125S; T3A-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-C125S; T3A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R- D84S-C125S; T3A-H16A-M23A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R- D84S-E95Q-C125S, e T3A-H16A-M23A-P65R-D84S-E95Q-C125S.

26. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 25, carac- terizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende o conjunto de substituições e não compreende quaisquer substituições adicionais.

27. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi-

cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90 %, 91%, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 84.

28. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idênti- ca a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOs: 3-9, 11-21 e 23-31.

29. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOs: 3-9, 11-21 e 23-31.

30. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo com- preende uma região de Fc.

31. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 30, carac- terizado pelo fato de que a IL-2 modificada é fundida ao terminal N ou ao terminal C da região de Fc.

32. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que a região de Fc compreende uma substi- tuição na posição de aminoácido T366 de Kabat.

33. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 32, carac- terizado pelo fato de que a região de Fc compreende uma substituição T366W.

34. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 31, carac- terizado pelo fato de que a região de Fc compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido de Kabat se- lecionada dentre T366, L368 e Y407.

35. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 34, carac- terizado pelo fato de que a região de Fc compreende mutações T366S, L368A e Y407V.

36. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 35, caracterizado pelo fato de que a região de Fc com- preende uma substituição em uma posição de Kabat selecionada den- tre S354 e Y349.

37. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 36, carac- terizado pelo fato de que a região de Fc compreende uma substituição S354C ou Y349C.

38. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 37, caracterizado pelo fato de que a região de Fc com- preende uma substituição na posição de aminoácido H435 de Kabat.

39. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 38, carac- terizado pelo fato de que a região de Fc compreende uma substituição selecionada dentre H435R e H435K.

40. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 39, caracterizado pelo fato de que a região de Fc com- preende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido de Kabat selecionada dentre M252 e M428.

41. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 40, carac- terizado pelo fato de que a região de Fc compreende substituições M252Y e M428V.

42. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 41, caracterizado pelo fato de que a região de Fc com- preende uma deleção dos aminoácidos de Kabat E233, L234 e L235.

43. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 41, caracterizado pelo fato de que a região de Fc com- preende pelo menos uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido selecionada dentre L234, L235 e P329.

44. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 43, carac- terizado pelo fato de que a região de Fc compreende substituições L234A, L235A e P329G.

45. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 44, caracterizado pelo fato de que a região de Fc com- preende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOs: 47-

83.

46. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 44, caracterizado pelo fato de que a região de Fc é parte de uma região constante de cadeia pesada.

47. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, carac- terizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é uma região constante de IgG.

48. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 47, carac- terizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

49. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 48, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada é fundida ao terminal C da região de Fc ou região constante de cadeia pesada.

50. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 49, carac- terizado pelo fato de que a IL-2 modificada é fundida ao terminal C da região de Fc ou região constante de cadeia pesada por meio de um ligante compreendendo 1-20 aminoácidos.

51. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 50, carac- terizado pelo fato de que o ligante compreende aminoácidos glicina.

52. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 51, carac- terizado pelo fato de que o ligante compreende aminoácidos glicina e serina.

53. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 50 a 52, caracterizado pelo fato de que a maioria, ou todos, os aminoácidos no ligante são glicina e serina.

54. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 30 a 33, 42 e 49 a 53, caracterizado pelo fato de que o polipep- tídeo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86, 87, 102, 103 ou 104.

55. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo com- preende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno.

56. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 55, carac- terizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende dois, três ou qua- tro domínios de ligação ao antígeno.

57. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 55 ou 56, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um antígeno de célula T ou a um antígeno de célula exterminadora natural.

58. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 55 a 57, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domí- nio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um antígeno de célula T CD4+ ou a um antígeno de célula T CD8+.

59. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 58, carac- terizado pelo fato de que pelo menos um domínio de ligação ao antí- geno se liga especificamente a um antígeno em uma célula T CD4+ ativada ou em uma célula T CD8+ ativada.

60. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 55 a 59, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domí- nio de ligação ao antígeno é um agonista.

61. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi-

cações 55 a 59, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno é um antagonista.

62. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 55 a 61, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domí- nio de ligação ao antígeno se liga especificamente a PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-1BB, OX40, GITR, CD8a, CD8b, CD4, NKp30, NKG2A , TIGIT, TGFβR1, TGFβR2, Fas, NKG2D, NKp46, PD-L1, CD107a, ICOS, TNFR2 ou CD16a.

63. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 55 a 62, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domí- nio de ligação ao antígeno se liga especificamente a PD-1.

64. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 55 a 63, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domí- nio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno hu- mano ou humanizado.

65. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 64, carac- terizado pelo fato de que cada domínio de ligação ao antígeno é, inde- pendentemente, um domínio de ligação ao antígeno humano ou hu- manizado.

66. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 55 a 65, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domí- nio de ligação ao antígeno compreende um domínio VHH.

67. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 66, carac- terizado pelo fato de que cada domínio de ligação ao antígeno com- preende um domínio VHH.

68. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 55 a 65, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domí- nio de ligação ao antígeno compreende um domínio VH e um domínio VL.

69. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 68, carac-

terizado pelo fato de que pelo menos um domínio de ligação ao antí- geno compreende o domínio VH e o domínio VL de um anticorpo sele- cionado dentre pembrolizumabe, nivolumabe, AMP-514, TSR-042, STI-A1110, ipilimumabe, tremelimumabe, urelumabe, utomilumabe, atezolizumabe e durvalumabe.

70. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 68 ou 69, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domínio de ligação ao antígeno compreende um Fv de cadeia única (scFv).

71. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 68 ou 69, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma região constante de cadeia pesada, em que o domínio VH é fundido à região constante de cadeia pesada e em que o domínio VL está associado ao domínio VH.

72. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 71, carac- terizado pelo fato de que o domínio VL é fundido a uma região cons- tante de cadeia leve.

73. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 72, carac- terizado pelo fato de que a região constante de cadeia leve é selecionada a partir de capa e lambda.

74. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 55 a 73, caracterizado pelo fato de que cada um dos domínios de ligação ao antígeno é igual.

75. Polipeptídeo, de acordo com as reivindicações 55 a 74, caracterizado pelo fato de que cada um dos domínios de ligação ao antígeno se liga especificamente ao mesmo antígeno.

76. Polipeptídeo, de acordo com as reivindicações 55 a 73, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos domínios de liga- ção ao antígeno se liga especificamente a um antígeno diferente de pelo menos um dos outros domínios de ligação ao antígeno.

77. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi-

cações 55 a 73, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domí- nio de ligação ao antígeno se liga especificamente a PD-1 e pelo me- nos um outro domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um antígeno de célula T ou antígeno de célula exterminadora natural diferente de PD-1 .

78. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 55 a 77, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domí- nio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4- 1BB, OX40, GITR, CD8a, CD8b, CD4, NKp30, NKG2A, TIGIT, TGFβR1, TGFβR2, Fas, NKG2D, NKp46, PD-L1, CD107a, ICOS, TNFR2 ou CD16a.

79. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 31 a 78, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo forma um homodímero sob condições fisiológicas.

80. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 79, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada se liga a um IL-2R humano com uma afinidade de pelo menos 2 vezes, 3 ve- zes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes menor do que a afinidade de IL-2 tipo selvagem humana para o IL-2R.

81. Complexo, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o primei- ro polipeptídeo é o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 79.

82. Complexo, de acordo com a reivindicação 81, caracteri- zado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende uma primei- ra região de Fc e o segundo polipeptídeo compreende uma segunda região de Fc.

83. Complexo, de acordo com a reivindicação 81 ou 82, ca-

racterizado pelo fato de que cada região de Fc é um isótipo seleciona- do dentre IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana.

84. Complexo, de acordo com a reivindicação 83, caracteri- zado pelo fato de que cada região de Fc é uma IgG1 humana.

85. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 81 a 84, caracterizado pelo fato de que cada região de Fc com- preende uma deleção dos aminoácidos E233, L234 e L235.

86. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 81 a 85, caracterizado pelo fato de que cada região de Fc com- preende uma mutação H435R ou H435K.

87. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 81 a 86, caracterizado pelo fato de que a região de Fc compre- ende mutações M252Y e M428L ou mutações M252Y e M428V.

88. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 81 a 87, caracterizado pelo fato de que a primeira região de Fc ou a segunda região de Fc compreende uma mutação T366W e a ou- tra região de Fc compreende mutações T366S, L368A e Y407V.

89. Complexo, de acordo com a reivindicação 88, caracteri- zado pelo fato de que a primeira região de Fc ou a segunda região de Fc compreende uma mutação S354C.

90. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 81 a 89, caracterizado pelo fato de que cada região de Fc com- preende independentemente uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada den- tre SEQ ID NOs: 47-83.

91. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 81 a 90, caracterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo não compreende uma IL2 modificada.

92. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 81 a 91, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno.

93. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 81 a 92, caracterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno.

94. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 81 a 93, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno, uma região de Fc e uma IL-2 modificada.

95. Complexo, de acordo com a reivindicação 94, caracteri- zado pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno é fundido ao terminal N da região de Fc e a IL-2 modificada é fundida ao terminal C da região de Fc.

96. Complexo, de acordo com a reivindicação 94 ou 95, ca- racterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo compreende um segundo domínio de ligação ao antígeno e uma região de Fc.

97. Complexo, de acordo com a reivindicação 96, caracteri- zado pelo fato de que o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno são iguais ou diferentes.

98. Complexo, de acordo com a reivindicação 97, caracteri- zado pelo fato de que: a) o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno ligam-se a PD-1; b) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a LAG3; c) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4; d) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a 4-1BB; e) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a OX40; f) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a GITR; g) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD8a; h) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD8b; i) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD4; j) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKp30; k) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2A; l) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TIGIT; m) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD- 1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2D; n) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TGFBR2; o) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Fas; p) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD107a; q) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a PD-1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKp46; r) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD8a e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TGFRβR2; s) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD8a e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Fas; t) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a

NKG2D e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TGFRβR2; u) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2D e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Fas; v) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2A e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TGFRβR2; w) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKG2A e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Fas; x) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKp46, e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TGFRβR2; y) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKp46, e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Fas; z) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a LAG3; aa) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a Tim3; bb) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a OX40; cc) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a GITR; dd) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4 e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a CD107a; ee) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a CTLA-4, e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a NKp46; ou ff) o primeiro domínio de ligação ao antígeno liga-se a ICOS e o segundo domínio de ligação ao antígeno liga-se a TNFR2.

99. Complexo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 81 a 98, caracterizado pelo fato de que a IL-2 modificada se liga a um IL-2R humano com uma afinidade de pelo menos 2 vezes, 3 ve- zes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes menor do que a afinidade de IL-2 tipo selvagem humana para o IL-2R.

100. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 80, ou o complexo, como definido em qualquer uma das reivindicações 81 a 99, e um transportador farmaceuticamen- te aceitável.

101. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 80, ou o complexo, como definido em qualquer uma das reivindicações 81 a 99.

102. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 101.

103. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 101, ou o vetor de expressão, como definido na reivindicação 102.

104. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de que expressa o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 80, ou o complexo, como definido em qualquer uma das reivindicações 81 a 99.

105. Método de produção do polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 80, ou complexo, como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 81 a 99, caracterizado pelo fato de que compreende a incubação da célula hospedeira, como defi- nida na reivindicação 103 ou 104, sob condições adequadas para ex-

pressar o polipeptídeo ou complexo.

106. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda isolar o polipeptídeo ou com- plexo.

107. Método para aumentar a proliferação de células T CD4+ e/ou CD8+, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de células T com o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 80, ou o complexo, como definido em qualquer uma das reivindicações 81 a 99.

108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que as células T CD4+ e/ou CD8+ são in vitro.

109. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que as células T CD4+ e/ou CD8+ estão in vivo.

110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 107 a 109, caracterizado pelo fato de que o aumento é pelo me- nos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes.

111. Método de aumentar a proliferação de células NK, ca- racterizado pelo fato de que compreende o contato das células NK com o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 80, ou o complexo, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 81 a 99.

112. Método, de acordo com a reivindicação 111, caracteri- zado pelo fato de que o aumento é pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes.

113. Método de tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo com câncer de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 80, ou complexo, como definido em qualquer uma das reivindicações 81 a 99, ou com-

posição farmacêutica, como definida na reivindicação 100.

114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteri- zado pelo fato de que o câncer é selecionado dentre carcinoma baso- celular, câncer do trato biliar; câncer de bexiga; câncer nos ossos; câncer do cérebro e do sistema nervoso central; câncer de mama; câncer do peritônio; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer de cólon e reto; câncer do tecido conjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer do endométrio; câncer de esôfago; câncer de olho; câncer de cabeça e pescoço; câncer gástrico; câncer gastrointestinal; glioblastoma; carci- noma hepático; hepatoma; neoplasia intraepitelial; câncer dos rins ou renal; câncer de laringe; câncer de fígado; câncer de pulmão; câncer de pulmão de células pequenas; câncer de pulmão de células não pe- quenas; adenocarcinoma do pulmão; carcinoma escamoso do pulmão; melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer de cavidade oral; câncer do ovário; câncer de pâncreas; câncer de próstata; retinoblastoma; ra- bdomiossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; carci- noma de glândula salivar; sarcoma; câncer de pele; câncer de células escamosas; câncer de estômago; câncer de testículo; câncer de tireoi- de; câncer uterino ou endometrial; câncer do sistema urinário; câncer de vulva; linfoma; linfoma de Hodgkin; linfoma de não Hodgkin; linfoma de células B; linfoma de não Hodgkin de baixo grau/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL lin- foblástico de alto grau; NHL de células pequenas não clivadas de alto grau; NHL de doença volumosa; linfoma de células do revestimento; linfoma relacionado à AIDS; macroglobulinemia de Waldenstrom; leu- cemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; e leucemia mieloblástica crônica.

115. Método, de acordo com a reivindicação 113 ou 114, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de um agente terapêutico adicional.

116. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracteri- zado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um agente anti- câncer.

117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracteri- zado pelo fato de que o agente anticâncer é selecionado dentre um agente quimioterápico, um agente biológico anticâncer, radioterapia, terapia com CAR-T e um vírus oncolítico.

118. Método, de acordo com a reivindicação 116 ou 117, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um bio- lógico anticâncer.

119. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracteri- zado pelo fato de que o biológico anticâncer é um agente que inibe PD-1 e/ou PD-L1.

120. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracteri- zado pelo fato de que o biológico anticâncer é um agente que inibe VISTA, gpNMB, B7H3, B7H4, HHLA2, CTLA4 ou TIGIT.

121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 116 a 120, caracterizado pelo fato de que o agente anticâncer é um anticorpo.

122. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracteri- zado pelo fato de que o biológico anticâncer é uma citocina.

123. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracteri- zado pelo fato de que o agente anticâncer é a terapia com CAR-T.

124. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracteri- zado pelo fato de que o agente anticâncer é um vírus oncolítico.

125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 113 a 124, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a ressecção do tumor e/ou radioterapia.