KR20210113265A - 변형된 il-2 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드로서, 변형된 IL-2는 야생형 IL-2에 비해 IL-2 수용체에 대해 감소된 친화성을 갖는 것인 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 활성화된 T 세포에 결합하고 작용하는 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드의 용도가 또한 제공된다.

Description

변형된 IL-2 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 및 이의 용도

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2019년 1월 7일에 출원된 미국 가출원 제62/789,075호의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 임의의 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.

기술분야

본 발명은 CD25 및 CD122에 대해 감소된 친화성을 갖는 변형된 IL-2 및 표적화 모이어티에 융합된 이러한 변형된 IL-2에 관한 것이다. 본 발명은 비제한적으로 암을 치료하는 방법을 포함하여 변형된 IL-2 및 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드를 사용하는 방법에 관한 것이다.

IL-2는 CD25, CD122 및 CD132로 구성되는 이종삼량체성 IL-2 수용체(IL-2R), 또는 CD122 및 CD132만으로 구성되는 이종이량체성 IL-2 수용체를 통해 T 및 NK 세포 증식을 자극하는 강력한 사이토카인이다. IL-2R의 두 가지 형태는 T 세포 생존, 증식, 및 전반적인 활성화 상태의 강력한 매개체이다. IL-2는 일반적으로 활성화시에 T 세포 및 NK 세포에 의해 생성되고 국소 미세환경에서 시스 및 트랜스로 신호전달을 매개한다. IL-2R 신호전달은 나이브 T 세포의 효과기 및 기억 T 세포로의 분화를 유도할 수 있고, 억제 조절 T 세포를 자극할 수도 있다. IL-2R의 삼량체성 형태는 이량체성 형태보다 IL-2에 대해 더 높은 친화성을 갖지만, 둘 모두는 상당히 높은 친화성을 가지며 신속한 수용체 매개 내재화 및 분해를 일으켜 극도로 짧은 반감기를 초래한다. 재조합 인간 IL-2(rhIL-2, 프로류킨)는 임상적으로 신장 세포 암종 및 악성 흑색종을 치료하는 데 사용되지만, 심각한 독성과 관련이 있다. 혈관 누출 증후군은 높은 친화성 IL-2R을 발현하는 내피 세포에 대한 IL-2 신호전달의 영향으로 인해 프로류킨으로 치료된 암 환자에게 주요 독성 문제이다.

T 세포는 결합된 상보적인 펩타이드를 갖는 MHC를 제시하는 이웃 세포와의 TCR의 결찰을 통해 활성화되어, TCR 복합체의 클러스터링 및 NFAT를 통한 신호전달을 야기한다. CD28을 통한 T 세포의 공동 자극은 T 세포 활성화를 향상시키는 CD80 및 CD86에 의해 유도된다. 초기 활성화 후, T 세포는 사이토카인 수용체뿐만 아니라 T 세포 반응을 조절하는 역할을 하는 많은 공동 자극 및 체크포인트 수용체를 포함하는 다양한 단백질을 상향조절한다.

CTLA-4, PD-1, 및 PD-L1과 같은 체크포인트 수용체에 대한 길항제 항체의 지속성 있는 항종양 임상 반응이 최근에 보고되었다. 그러나, 가장 반응성인 적응증에서도, 반응률은 환자의 약 30%로 제한된다. 따라서, 개선된 T 세포 조절 치료제가 필요하다.

적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 야생형 IL-2에 비해 CD25, CD122, 및/또는 IL-2R에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 야생형 IL-2에 비해 휴지기(resting) 또는 활성화된 T 세포 상에서 감소된 활성을 갖는다.

구현예 1. 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드로서, 변형된 IL-2는 P65, D84, E95, M23, 및 H16으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 2. 구현예 1에 있어서, 변형된 IL-2는 변형된 인간 IL-2인 것인 폴리펩타이드.

구현예 3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 아미노산 위치는 서열번호: 1에서의 아미노산 위치에 상응하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 4. 구현예 1 내지 구현예 3 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 P65에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 5. 구현예 4에 있어서, 치환은 P65R, P65E, P65K, P65H, P65Y, P65Q, P65D, 및 P65N으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 6. 구현예 1 내지 구현예 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 H16에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 7. 구현예 6에 있어서, 치환은 H16A, H16G, H16S, H16T, H16V, 및 H16P로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 8. 구현예 1 내지 구현예 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 D84에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 9. 구현예 8에 있어서, 치환은 D84S, D84G, D84A, D84T, D84V, 및 D84P로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 10. 구현예 1 내지 구현예 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 P65, H16, 및 D84에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 11. 구현예 10에 있어서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, 및 D84S를 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 12. 구현예 1 내지 구현예 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 M23에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 13. 구현예 12에 있어서, 치환은 M23A, M23G, M23S, M23T, M23V, 및 M23P로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 14. 구현예 13에 있어서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, D84S, 및 M23A를 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 15. 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 E95에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 16. 구현예 15에 있어서, 치환은 E95Q, E95G, E95S, E95T, E95V, E95P, E95H, 및 E95N으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 17. 구현예 16에 있어서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, D84S, 및 E95Q를 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 18. 제17항에 있어서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, D84S, M23A, 및 E95Q를 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 19. 구현예 1 내지 구현예 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 F42에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 20. 구현예 19에 있어서, F42에서의 치환은 F42K, F42A, F42R, F42A, F42G, F42S, 및 F42T로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 21. 구현예 1 내지 구현예 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 Y45 및 L72로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 22. 구현예 21에 있어서, 변형된 IL-2는 Y45A 및 L72G로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 23. 구현예 1 내지 구현예 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 T3 및 C125로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 24. 구현예 23에 있어서, 변형된 IL-2는 T3A, 및 C125A로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 25. 구현예 1 내지 구현예 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 H16A-F42K; D84S-F42K; E15S-F42K; M23A-F42K; E95Q-F42K; P65R-H16A; P65R-D84S; P65R-E15S; P65R-M23A; P65R-E95Q; T3A-C125S; T3A-P65R-C125S; T3A-H16A-C125S; T3A-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-C125S; T3A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-M23A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-D84S-E95Q-C125S, 및 T3A-H16A-M23A-P65R-D84S-E95Q-C125S로부터 선택된 치환 세트를 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 26. 구현예 25에 있어서, 변형된 IL-2는 치환 세트를 포함하고, 임의의 추가 치환을 포함하지 않는 것인 폴리펩타이드.

구현예 27. 구현예 1 내지 구현예 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 서열번호: 84와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 28. 구현예 1 내지 구현예 27 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 서열번호: 3-9, 11-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 29. 구현예 1 내지 구현예 28 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 서열번호: 3-9, 11-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 30. 구현예 1 내지 구현예 29 중 어느 한 구현예에 있어서, 폴리펩타이드는 Fc 영역을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 31. 구현예 30에 있어서, 변형된 IL-2는 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 융합되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 32. 구현예 30 또는 구현예 31에 있어서, Fc 영역은 카바트(Kabat) 아미노산 위치 T366에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 33. 구현예 32에 있어서, Fc 영역은 T366W 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 34. 구현예 31에 있어서, Fc 영역은 T366, L368, 및 Y407로부터 선택된 적어도 하나의 카바트 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 35. 구현예 34에 있어서, Fc 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 36. 구현예 30 내지 구현예 35 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 S354 및 Y349로부터 선택된 카바트 위치에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 37. 구현예 36에 있어서, Fc 영역은 S354C 또는 Y349C 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 38. 구현예 30 내지 구현예 37 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 카바트 아미노산 위치 H435에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 39. 구현예 38에 있어서, Fc 영역은 H435R 및 H435K로부터 선택된 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 40. 구현예 30 내지 구현예 39 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 M252 및 M428로부터 선택된 적어도 하나의 카바트 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 41. 구현예 40에 있어서, Fc 영역은 M252Y 및 M428V 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 42. 구현예 30 내지 구현예 41 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 카바트 아미노산 E233, L234, 및 L235의 결실을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 43. 구현예 30 내지 구현예 41 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 L234, L235, 및 P329로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 44. 구현예 43에 있어서, Fc 영역은 L234A, L235A, 및 P329G 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 45. 구현예 30 내지 구현예 44 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 서열번호: 47-83으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 46. 구현예 30 내지 구현예 44 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 중쇄 불변 영역의 일부인 것인 폴리펩타이드.

구현예 47. 구현예 46에 있어서, 중쇄 불변 영역은 IgG 불변 영역인 것인 폴리펩타이드.

구현예 48. 구현예 47에 있어서, 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 불변 영역인 것인 폴리펩타이드.

구현예 49. 구현예 30 내지 구현예 48 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 Fc 영역 또는 중쇄 불변 영역의 C-말단에 융합되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 50. 구현예 49에 있어서, 변형된 IL-2는 1-20개의 아미노산을 포함하는 링커를 통해 Fc 영역 또는 중쇄 불변 영역의 C-말단에 융합되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 51. 구현예 50에 있어서, 링커는 글리신 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 52. 구현예 51에 있어서, 링커는 글리신 및 세린 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 53. 구현예 50 내지 구현예 52 중 어느 한 구현예에 있어서, 링커 내의 아미노산의 대부분, 또는 모두는 글리신 및 세린인 것인 폴리펩타이드.

구현예 54. 구현예 30 내지 구현예 33, 구현예 42, 및 구현예 49 내지 구현예 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호: 86, 87, 102, 103, 또는 104의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 55. 구현예 1 내지 구현예 54 중 어느 한 구현예에 있어서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 56. 구현예 55에 있어서, 폴리펩타이드는 2, 3, 또는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 57. 구현예 55 또는 구현예 56에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 T-세포 항원 또는 자연 살해 세포 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 58. 구현예 55 내지 구현예 57 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 CD4⁺ T-세포 항원 또는 CD8⁺ T-세포 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 59. 구현예 58에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 활성화된 CD4⁺ T-세포 또는 활성화된 CD8⁺ T-세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 60. 구현예 55 내지 구현예 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 작용제인 것인 폴리펩타이드.

구현예 61. 구현예 55 내지 구현예 59 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 길항제인 것인 폴리펩타이드.

구현예 62. 구현예 55 내지 구현예 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-1BB, OX40, GITR, CD8a, CD8b, CD4, NKp30, NKG2A, TIGIT, TGFβR1, TGFβR2, Fas, NKG2D, NKp46, PD-L1, CD107a, ICOS, TNFR2, 또는 CD16a에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 63. 구현예 55 내지 구현예 62 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 PD-1에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 64. 구현예 55 내지 구현예 63 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 인간 또는 인간화된 항원 결합 도메인인 것인 폴리펩타이드.

구현예 65. 구현예 64에 있어서, 각각의 항원 결합 도메인은, 독립적으로, 인간 또는 인간화된 항원 결합 도메인인 것인 폴리펩타이드.

구현예 66. 구현예 55 내지 구현예 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 VHH 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 67. 구현예 66에 있어서, 각각의 항원 결합 도메인은 VHH 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 68. 구현예 55 내지 구현예 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 69. 구현예 68에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, AMP-514, TSR-042, STI-A1110, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 우토밀루맙, 아테졸리주맙, 및 두르발루맙으로부터 선택된 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 70. 구현예 68 또는 구현예 69에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 단쇄 Fv(scFv)를 포함하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 71. 구현예 68 또는 구현예 69에 있어서, 폴리펩타이드는 중쇄 불변 영역을 포함하고, VH 도메인은 중쇄 불변 영역에 융합되며, VL 도메인은 VH 도메인과 회합되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 72. 구현예 71에 있어서, VL 도메인은 경쇄 불변 영역에 융합된 것인 폴리펩타이드.

구현예 73. 구현예 72에 있어서, 경쇄 불변 영역은 카파 및 람다로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.

구현예 74. 구현예 55 내지 구현예 73 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 결합 도메인 각각은 동일한 것인 폴리펩타이드.

구현예 75. 구현예 55 내지 구현예 74 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 결합 도메인 각각은 동일한 항원 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 76. 구현예 55 내지 구현예 73 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 결합 도메인 중 적어도 하나는 나머지 항원 결합 도메인 중 적어도 하나와 다른 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 77. 구현예 55 내지 구현예 73 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 PD-1에 특이적으로 결합하고, 적어도 하나의 다른 항원 결합 도메인은 PD-1 이외의 T-세포 항원 또는 자연 살해 세포 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 78. 구현예 55 내지 구현예 77 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-1BB, OX40, GITR, CD8a, CD8b, CD4, NKp30, NKG2A, TIGIT, TGFβR1, TGFβR2, Fas, NKG2D, NKp46, PD-L1, CD107a, ICOS, TNFR2, 또는 CD16a에 결합하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 79. 구현예 31 내지 구현예 78 중 어느 한 구현예에 있어서, 폴리펩타이드는 생리학적 조건 하에 동종이량체를 형성하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 80. 구현예 1 내지 구현예 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 IL-2R에 대한 인간 야생형 IL-2의 친화성보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 낮은 친화성으로 인간 IL-2R에 결합하는 것인 폴리펩타이드.

구현예 81. 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 복합체로서, 제1 폴리펩타이드는 구현예 1 내지 구현예 79 중 어느 한 구현예의 폴리펩타이드인 것인 복합체.

구현예 82. 구현예 81에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 영역을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 제2 Fc 영역을 포함하는 것인 복합체.

구현예 83. 구현예 81 또는 구현예 82에 있어서, 각각의 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로부터 선택된 아이소타입인 것인 복합체.

구현예 84. 구현예 83에 있어서, 각각의 Fc 영역은 인간 IgG1인 것인 복합체.

구현예 85. 구현예 81 내지 구현예 84 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 Fc 영역은 아미노산 E233, L234, 및 L235의 결실을 포함하는 것인 복합체.

구현예 86. 구현예 81 내지 구현예 85 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 Fc 영역은 H435R 또는 H435K 돌연변이를 포함하는 것인 복합체.

구현예 87. 구현예 81 내지 구현예 86 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 돌연변이 M252Y 및 M428L 또는 돌연변이 M252Y 및 M428V를 포함하는 것인 복합체.

구현예 88. 구현예 81 내지 구현예 87 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 Fc 영역 또는 제2 Fc 영역은 T366W 돌연변이를 포함하고, 다른 하나의 Fc 영역은 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하는 것인 복합체.

구현예 89. 구현예 88에 있어서, 제1 Fc 영역 또는 제2 Fc 영역은 S354C 돌연변이를 포함하는 것인 복합체.

구현예 90. 구현예 81 내지 구현예 89 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 Fc 영역은 독립적으로 서열번호: 47-83으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.

구현예 91. 구현예 81 내지 구현예 90 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 폴리펩타이드는 변형된 IL2를 포함하지 않는 것인 복합체.

구현예 92. 구현예 81 내지 구현예 91 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 복합체.

구현예 93. 구현예 81 내지 구현예 92 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 폴리펩타이드는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 복합체.

구현예 94. 구현예 81 내지 구현예 93 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 제1 항원 결합 도메인, Fc 영역, 및 변형된 IL-2를 포함하는 것인 복합체.

구현예 95. 구현예 94에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 Fc 영역의 N-말단에 융합되고, 변형된 IL-2는 Fc 영역의 C-말단에 융합되는 것인 복합체.

구현예 96. 구현예 94 또는 구현예 95에 있어서, 제2 폴리펩타이드는 제2 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 것인 복합체.

구현예 97. 구현예 96에 있어서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 것인 복합체.

구현예 98. 구현예 97에 있어서,

a) 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인 모두는 PD-1에 결합하거나;

b) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 LAG3에 결합하거나;

c) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하거나;

d) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 4-1BB에 결합하거나;

e) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 OX40에 결합하거나;

f) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 GITR에 결합하거나;

g) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD8a에 결합하거나;

h) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD8b에 결합하거나;

i) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD4에 결합하거나;

j) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 NKp30에 결합하거나;

k) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2A에 결합하거나;

l) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TIGIT에 결합하거나;

m) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2D에 결합하거나;

n) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TGFBR2에 결합하거나;

o) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Fas에 결합하거나;

p) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD107a에 결합하거나;

q) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 NKp46에 결합하거나;

r) 제1 항원 결합 도메인은 CD8a에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TGFRβR2에 결합하거나;

s) 제1 항원 결합 도메인은 CD8a에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Fas에 결합하거나;

t) 제1 항원 결합 도메인은 NKG2D에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TGFRβR2에 결합하거나;

u) 제1 항원 결합 도메인은 NKG2D에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Fas에 결합하거나;

v) 제1 항원 결합 도메인은 NKG2A에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TGFRβR2에 결합하거나;

w) 제1 항원 결합 도메인은 NKG2A에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Fas에 결합하거나;

x) 제1 항원 결합 도메인은 NKp46에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TGFRβR2에 결합하거나;

y) 제1 항원 결합 도메인은 NKp46에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Fas에 결합하거나;

z) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 LAG3에 결합하거나;

aa) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Tim3에 결합하거나;

bb) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 OX40에 결합하거나;

cc) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 GITR에 결합하거나;

dd) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD107a에 결합하거나;

ee) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 NKp46에 결합하거나; 또는

ff) 제1 항원 결합 도메인은 ICOS에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TNFR2에 결합하는 것인 복합체.

구현예 99. 구현예 81 내지 구현예 98 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형된 IL-2는 IL-2R에 대한 인간 야생형 IL-2의 친화성보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 낮은 친화성으로 인간 IL-2R에 결합하는 것인 복합체.

구현예 100. 구현예 1 내지 구현예 80 중 어느 한 구현예의 폴리펩타이드 또는 구현예 81 내지 구현예 99 중 어느 한 구현예의 복합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.

구현예 101. 구현예 1 내지 구현예 80 중 어느 한 구현예의 폴리펩타이드 또는 구현예 81 내지 구현예 99 중 어느 한 구현예의 복합체를 코딩하는 단리된 핵산.

구현예 102. 구현예 101의 핵산을 포함하는 발현 벡터.

구현예 103. 구현예 101의 핵산 또는 구현예 102의 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.

구현예 104. 구현예 1 내지 구현예 80 중 어느 한 구현예의 폴리펩타이드 또는 구현예 81 내지 구현예 99 중 어느 한 구현예의 복합체를 발현하는 단리된 숙주 세포.

구현예 105. 구현예 103 또는 구현예 104의 숙주 세포를 폴리펩타이드 또는 복합체를 발현하는 데 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 구현예 1 내지 구현예 80 중 어느 한 구현예의 폴리펩타이드 또는 구현예 81 내지 구현예 99 중 어느 한 구현예의 복합체를 제조하는 방법.

구현예 106. 구현예 105에 있어서, 폴리펩타이드 또는 복합체를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

구현예 107. T 세포를 구현예 1 내지 구현예 80 중 어느 한 구현예의 폴리펩타이드 또는 구현예 81 내지 구현예 99 중 어느 한 구현예의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식을 증가시키는 방법.

구현예 108. 구현예 107에 있어서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 시험관내의 것인 방법.

구현예 109. 구현예 107에 있어서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 생체내의 것인 방법.

구현예 110. 구현예 107 내지 구현예 109 중 어느 한 구현예에 있어서, 증가는 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배인 것인 방법.

구현예 111. NK 세포를 구현예 1 내지 구현예 80 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 구현예 81 내지 구현예 99 중 어느 한 구현예의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, NK 세포 증식을 증가시키는 방법.

구현예 112. 구현예 111에 있어서, 증가는 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배인 것인 방법.

구현예 113. 구현예 1 내지 구현예 80 중 어느 한 구현예의 폴리펩타이드 또는 구현예 81 내지 구현예 99 중 어느 한 구현예의 복합체, 또는 구현예 100의 약제학적 조성물의 약제학적 유효량을 암을 갖는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법.

구현예 114. 구현예 113에 있어서, 암은 기저 세포 암종, 담도암; 방광암; 골암; 뇌 및 중추신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장 및 직장암; 결합 조직 암; 소화기계의 암; 자궁내막암; 식도암; 안암; 두경부암; 위암; 소화기암; 교모세포종; 간암종; 간종양; 상피내 신생물; 신장 또는 신암; 후두암; 간암; 폐암; 소세포 폐암; 비소 세포 폐암; 폐의 선암종; 폐의 편평상피암; 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암; 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막아세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡기계의 암; 타액선 암종; 육종; 피부암; 편평 세포 암; 위장암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 림프종; 호지킨 림프종; 비호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 병변(bulky disease) NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 및 만성 골수아구성 백혈병으로부터 선택되는 것인 방법.

구현예 115. 구현예 113 또는 구현예 114에 있어서, 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

구현예 116. 구현예 115에 있어서, 추가 치료제는 항암제인 것인 방법.

구현예 117. 구현예 116에 있어서, 항암제는 화학치료제, 항암 생물학적 제제, 방사선 요법, CAR-T 요법, 및 온콜리틱(oncolytic) 바이러스로부터 선택되는 것인 방법.

구현예 118. 구현예 116 또는 구현예 117에 있어서, 추가 치료제는 항암 생물학적 제제인 것인 방법.

구현예 119. 구현예 118에 있어서, 항암 생물학적 제제는 PD-1 및/또는 PD-L1을 억제하는 제제인 것인 방법.

구현예 120. 구현예 118에 있어서, 항암 생물학적 제제는 VISTA, gpNMB, B7H3, B7H4, HHLA2, CTLA4, 또는 TIGIT를 억제하는 제제인 것인 방법.

구현예 121. 구현예 116 내지 구현예 120 중 어느 한 구현예에 있어서, 항암제는 항체인 것인 방법.

구현예 122. 구현예 118에 있어서, 항암 생물학적 제제는 사이토카인인 것인 방법.

구현예 123. 구현예 116에 있어서, 항암제는 CAR-T 요법인 것인 방법.

구현예 124. 구현예 116에 있어서, 항암제는 온콜리틱 바이러스인 것인 방법.

구현예 125. 구현예 113 내지 구현예 124 중 어느 한 구현예에 있어서, 종양 절제 및/또는 방사선 요법을 추가로 포함하는 것인 방법.

도 1a-1h는 다양한 IL-2 융합 단백질 포맷의 개략도를 보여준다. 도 1a는 이종이량체성 노브-인-홀(knob-in-hole) IgG1 Fc의 N-말단에 연결된 IL-2를 보여준다. 도 1b는 단일 도메인 항체의 이종이량체성 IgG1 Fc의 C-말단에 연결된 IL-2를 보여준다. 도 1c-1e는 1개의 VHH(도 1e), 2개의 동일한 VHH(도 1c), 또는 2개의 상이한 VHH(도 1d)에 연결된 IL-2를 보여준다. 도 1f는 통상적인 항체의 동종이량체성 중쇄 불변 영역의 C-말단에 연결된 IL-2를 보여준다. 도 1g는 통상적인 항체의 이종이량체성 중쇄 불변 영역의 C-말단에 연결된 IL-2를 보여준다. 도 1h는 이종이량체성 scFv 항체의 C-말단에 융합된 IL-2를 보여준다.
도 2a-2c는 유세포 분석법에 측정된 바와 같이, IL-2 수용체(CD25, CD122, 및 CD132)의 다양한 조합으로 일시적으로 형질감염된 293F 세포에 대한, 도 1a에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc의 N-말단에 융합된 야생형 IL-2(도 2a) 또는 변형된 IL-2(도 2a-2c)를 포함하는 IL-2 융합 단백질의 결합을 보여준다. "UT 293F"는 형질감염되지 않은 293F 세포를 나타낸다.
도 3a-3b는 유세포 분석법에 측정된 바와 같이, CD25 및 CD122로 일시적으로 형질감염된 293F 세포에 대한, 도 1a에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc의 N-말단에 융합된 야생형 IL-2 또는 변형된 IL-2를 포함하는 융합 단백질의 결합을 보여준다.
도 4a-4b는 유세포 분석법에 측정된 바와 같이, CD122 및 CD132; 또는 CD25, CD122, 및 CD132로 일시적으로 형질감염된 293F 세포에 대한, 도 1a에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc의 N-말단에 융합된 야생형 IL-2 또는 변형된 IL-2를 포함하는 융합 단백질의 결합을 보여준다.
도 5a-5b는 유세포 분석법에 측정된 바와 같이, 휴지기(resting) 및 활성화된 CD4+ T 세포에 대한, 도 1b에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc에 연결된 비표적화 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2 또는 변형된 IL-2를 포함하는 융합 단백질의 결합을 보여준다. "아이소타입 대조군"은 IL-2를 포함하지 않는 대조군 단백질을 나타낸다.
도 6a-6b는 유세포 분석법에 측정된 바와 같이, 농축된 조절 T 세포(Treg, 도 6a), 유도된 조절 T 세포(유도된 Treg, 도 6b), 및 농축된 반응자 CD4+ T 세포(Tresp, 도 6c)에 대한, 도 1b에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc에 연결된 비표적화 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2 또는 변형된 IL-2를 포함하는 융합 단백질의 결합을 보여준다.
도 7a-7d는 휴지기 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서, 도 1b에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc에 연결된 비표적화 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2 또는 변형된 IL-2를 포함하는 융합 단백질의 활성을 보여준다. 증식(도 7a 및 7c) 및 CD71 수준(도 7b 및 7d)이 측정되었다. 도 7e-7f는 세포내 인산화된 STAT5 수준의 유세포측정 검출에 의해 측정된 바와 같이 휴지기 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서, 도 1b에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc에 연결된 비표적화 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2 또는 변형된 IL-2의 활성을 보여준다. "아이소타입"은 IL-2를 포함하지 않는 대조군 단백질을 나타낸다.
도 8a-8b는 도 1b에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc에 연결된 비표적화 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2 또는 변형된 IL-2를 포함하는 융합 단백질로 7일 동안 처리 후 농축된 Treg의 활성화의 마커로서 증식 및 CD25 수준을 보여준다.
도 9a-9d는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에서 펨브롤리주맙, 도 1f에 나타낸 바와 같은 중쇄 C-말단에 융합된 IL-2-RAS를 갖는 펨브롤리주맙의 유사체, 및 IL-2-RAS 단독(도 9c 및 9d)의 활성 및 결합을 보여준다. CD8+(도 9a) 및 CD4+(도 9b) T-세포 상에서의 활성은 CellTrace™ Violet의 유세포측정 검출에 의해 측정되었다. CD8+ T 세포(도 9c) 및 CD4+ T 세포(도 9d)에 대한 결합 정도는 유세포 분석법에 의해 측정되었다.
도 10a-10d는 IL-2에 대한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 증식의 유도의 의존성을 보여준다. 사전 차단되지 않거나(도 10a 및 10b) 또는 포화 농도의 펨브롤리주맙으로 사전 차단된(도 10c 및 10d) CD8+(도 10a 및 10c) 또는 CD4+(도 10b 및 10d) T 세포 증식에 대한, 펩브롤리주맙, 비표적화된 IL-2-RAS, 및 도 1f에 나타낸 바와 같은 중쇄 C-말단에 융합된 IL-2-RAS를 갖는 펨브롤리주맙의 유사체의 효과가 표시된다.
도 11은 도 1f에 나타낸 바와 같은 중쇄 C-말단에 융합된 IL-2-RAS를 갖는 펨브롤리주맙의 유사체뿐만 아니라 도 1b에 나타낸 바와 같은 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 IL-2-RAS 및 도 1b에 나타낸 바와 같은 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2에 의한 CD4+ T 반응자(Tresp) 세포 증식의 회복을 보여준다. Tresp 증식은 CD3 관여(engagement)(Tresp + 비드)에 의해 유도된 다음, 자가 조절 T 세포(Treg)를 사용하여 억제되었다. "Tresp + 비드" 선은 Treg 세포의 부재 하에 CD3 관여를 갖는 기저선 Tresp 세포 증식을 보여준다. "Ab 없음" 선은 Treg 세포의 존재 하에 CD3 관여를 갖는 기저선 Tresp 세포 증식을 보여준다.
도 12a-12b는 플레이트 결합된 비표적화된 야생형 IL-2("IL-2 WT") 또는 도 1b에 나타낸 바와 같은 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 IL-2-RAS에 의한 T 세포의 트랜스-활성화를 보여준다. T 세포 활성화는 세포내 인산화된 STAT5 수준의 유세포측정 검출에 의해 측정되었다. CD8+ T 세포(도 12a) 및 CD4+ T 세포(도 12b) 반응이 나타나 있다.
도 13a-13i는 NK 세포, CD8+ T 세포, 및 CD4+ T 세포 상에서, 도 1h에 나타낸 바와 같은 NKp46을 표적화하는 이종이량체성 scFv 항체의 C-말단에 융합된 IL-2-RAS, NKp46 단독을 표적화하는 이종이량체성 scFv 항체, 및 도 1b에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc에 연결된 비표적화 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2 또는 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질의 활성 및 결합을 보여준다. NK 세포(도 13a), CD8+ T 세포(도 13b), 및 CD4+ T 세포(도 13c)의 증식 및 NK 세포(도 13d), CD8+ T 세포(도 13e), 및 CD4+ T 세포(도 13f)의 pSTAT 수준은 유세포 분석법에 의해 측정되었다. NK 세포(도 13g), CD8+ T 세포(도 13h) 및 CD4+ T 세포(도 13i)에 대한 표시된 폴리펩타이드의 결합은 또한 유세포 분석법에 의해 측정되었다.
도 14a-14h는 도 1g에 나타낸 바와 같은 항-LAG3 이종이량체성 통상적인 항체(MAb)의 C-말단에 융합된 IL-2-RAS, 도 1b에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc를 갖는 항-LAG3 VHH의 C-말단에 융합된 IL-2-RAS, 도 1b에 나타낸 바와 같은 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 IL-2-RAS, 도 1b에 나타낸 바와 같은 비표적화된 이종이량체성 Fc의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2, 또는 IL-2가 없는 LAG3 표적화된 MAb 또는 LAG3 표적화된 VHH-Fc 분자의 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상에서의 활성 및 결합을 보여준다. CD8+ T 세포(도 14c 및 14e) 및 CD4+ T 세포(도 14d 및 14f) 상에서 CD8+ T 세포(도 14a) 및 CD4+ T 세포(도 14b)의 증식 및 활성화 마커 CD25(도 14c 및 14d) 및 CD71(도 14e 및 14f)의 발현은 유세포 분석법에 의해 측정되었다. 도 14g 및 14h는 사전 활성화된 CD8+ T 세포(도 14g) 및 CD4+ T 세포(도 14h)에 대한 결합을 보여준다.
도 15는 VHH의 표적 항원을 발현하지 않고 따라서 리포터 유전자의 유도를 위해 과발현된 IL-2 수용체에 대한 변형된 IL-2의 결합에만 의존하는 HEK-Blue IL-2 리포터 세포 상에서, 도 1b에 나타낸 바와 같은 이종이량체성 Fc를 갖는 VHH의 C-말단에 융합된 표시된 변형된 IL-2를 포함하는 융합 단백질의 활성을 보여준다. 리포터 세포에서 pSTAT5 신호전달의 IL-2 수용체 매개 유도에 대한 반응으로 발현되는 분비된 배아 알칼리 포스파타제의 활성이 측정되었다.

본원에 제공된 구현예는 T 세포의 활성을 조절하는 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드 및 암을 치료하는 다양한 방법에서의 용도에 관한 것이다.

정의 및 다양한 구현예

본원에 사용된 섹션 제목은 단지 조직화를 위한 것이며, 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

특허 출원, 특허 공개, 및 Genbank 등록 번호를 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 참고문헌이 그 전체가 참조로 포함된 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 참고문헌에 의해 본원에 포함된다.

본원에 기재되거나 언급된 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]; 및 이의 업데이트된 버전에 기재된 광범위하게 이용되는 방법과 같이 당업자에 의해 일반적인 방법을 사용하여 일반적으로 이용된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 당해 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되거나 명시적으로 표시되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 다양한 출처 또는 참고문헌 사이에 정의의 임의의 충돌이 있는 경우, 본원에 제공된 정의가 우선할 것이다.

일반적으로, 면역글로불린 중쇄에서 잔기의 번호는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서와 같은 EU 지수의 번호이다. "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호를 지칭한다.

본원에 기재된 본 발명의 구현예는 구현예로 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 달리 표시되지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 본원에서 용어 "또는"의 사용은 대안이 상호 배타적임을 암시하는 것을 의미하지 않는다.

본 출원에서, "또는"의 사용은 명시적으로 언급되거나 당업자에 의해 이해되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 다중 종속항의 맥락에서, "또는"의 사용은 둘 이상의 선행하는 독립 청구항 또는 종속 청구항을 다시 지칭한다.

문구 "참조 샘플", "참조 세포", 또는 "참조 조직"은 적어도 하나의 알려지지 않은 특징을 갖는 샘플과의 비교로서 사용될 수 있는 적어도 하나의 알려진 특징을 갖는 샘플을 나타낸다. 일부 구현예에서, 참조 샘플은 양성 또는 음성 지표로서 사용될 수 있다. 참조 샘플은 알려지지 않은 특징을 갖는 샘플에 존재하는 단백질 및/또는 mRNA의 수준과 대조적으로, 예를 들어, 건강한 조직에 존재하는 단백질 및/또는 mRNA의 수준을 확립하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 참조 샘플은 동일한 대상체로부터 유래하지만, 시험되는 부분과 상이한 대상체의 부분으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 참조 샘플은 암을 둘러싸거나 암에 인접한 조직으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 참조 샘플은 치료되는 대상체로부터 유래되는 것이 아니라, 문제의 장애(예를 들어, 특정 암 또는 T 세포 관련 장애)를 갖거나 갖지 않는 것으로 알려진 대상체로부터의 샘플이다. 일부 구현예에서, 참조 샘플은 동일한 대상체로부터 유래되지만, 대상체가 암이 발병하기 전의 시점으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 참조 샘플은 동일하거나 상이한 대상체로부터 양성 암 샘플로부터 유래된다. 음성 참조 샘플이 비교를 위해 사용되는 경우, 음성 참조 샘플 내의 문제의 분자의 발현 수준 또는 양은 본 개시내용을 고려할 때 당업자가 분자가 없고/또는 낮은 수준이 있음을 이해할 수준을 나타낼 것이다. 양성 참조 샘플이 비교를 위해 사용되는 경우, 양성 참조 샘플 내의 문제의 분자의 발현 수준 또는 양은 본 개시내용을 고려할 때 당업자가 분자의 수준이 있음을 인식할 수준을 나타낼 것이다.

치료제의 투여로부터 이점을 얻거나 치료제의 투여에 반응하는 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "이점", "임상 이점", "반응성", 및 "치료 반응성"은 감속 및 완전한 정지; 질환 에피소드 및/또는 증상의 수의 감소; 병변 크기의 감소; 인접한 말초 장기 및/또는 조직 내로의 질환 세포 침윤의 억제(즉, 감소, 감속 또는 완전한 중지); 질환 확산의 억제(즉, 감소, 감속 또는 완전한 중지); 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 완화; 치료 후 무질환 제시의 길이, 예를 들어, 무진행 생존의 증가; 증가된 전체 생존; 더 높은 반응 속도; 및/또는 치료 후 주어진 시점에서 감소된 사망률을 포함하는, 질환 진행의 다양한 종점, 예컨대 어느 정도의 억제를 평가함으로써 측정될 수 있다. "비반응성"이거나 "반응하지 못하는" 대상체 또는 암은 "반응성"이어야 하는 상기 언급된 자격을 충족하지 못하는 대상체 또는 암이다.

용어 "핵산 분자", "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭한다. 뉴클레오타이드의 이러한 중합체는 천연 및/또는 비천연 뉴클레오타이드를 함유할 수 있고, 비제한적으로, DNA, RNA, 및 PNA를 포함한다. "핵산 서열"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드에 포함된 뉴클레오타이드의 선형 서열을 지칭한다.

용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되고, 최소 길이에 제한되지 않는다. 아미노산 잔기의 이러한 중합체는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있고, 비제한적으로, 아미노산 잔기의 펩타이드, 올리고펩타이드, 이량체, 삼량체, 및 사량체를 포함한다. 전장 단백질 및 이의 단편 모두가 정의에 포함된다. 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 개시내용의 목적을 위해, "폴리펩타이드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 결실, 부가, 및 치환(일반적으로 자연적으로 보존적임)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위 지정 돌연변이유발을 통해서와 같이 고의적일 수 있거나, 또는 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이를 통해 또는 PCR 증폭으로 인한 오류와 같이 우발적일 수 있다. "아미노산 서열"은 폴리펩타이드 또는 단백질에 포함된 아미노산의 선형 서열을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이 "IL-2" 또는 "인터루킨-2"는 세포에서 IL-2 전구체의 가공으로부터 비롯되는 임의의 천연의 성숙한 IL-2를 지칭한다. 용어는 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류(예컨대, 인간 및 시노몰구스 또는 붉은털 원숭이) 및 설치류(예컨대, 마우스 및 랫트)를 포함하는 임의의 척추동물로부터의 IL-2를 포함한다. 용어는 또한 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체와 같은 IL-2의 자연발생 변이체를 포함한다. 비제한적인 예시적인 인간 IL-2 아미노산 서열이, 예컨대, GenBank 등록번호 NP_000577.2에 나타나 있다. 서열번호. 1(성숙한 형태)을 참고한다.

본원에 사용된 바와 같이 "변형된 IL-2"는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환에 의해 야생형 IL-2 아미노산 서열과 상이한 폴리펩타이드를 지칭한다.

용어 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합한다"는 것은 당업계에 잘 알려져 있는 용어이며, 이러한 특이적 결합을 결정하는 방법 역시 당업계에 잘 알려져 있다. 분자가 대안적인 세포 또는 물질과 반응하는 것보다 특정 세포 또는 물질과 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 지속시간으로 및/또는 더 큰 친화성으로 반응하거나 결합하는 경우 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타낸다고 한다. 항원 결합 도메인은 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력으로, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속시간으로 결합하는 경우 항원에 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 sdAb 또는 VHH 함유 폴리펩타이드는 동일한 표적 항원 상의 다른 에피토프 또는 다른 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 것보다 이 에피토프에 더 큰 친화성, 결합력으로, 더 쉽게 및/또는 더 긴 지속시간으로 결합하는 sdAb 또는 VHH 함유 폴리펩타이드이다. 또한 이 정의를 읽으면; 예를 들어, 제1 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항원 결합 도메인은 제2 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 반드시 배타적 결합을 필요로 하지 않는다(포함할 수는 있음). 일반적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다. "특이성"은 항원에 선택적으로 결합하는 결합 단백질의 능력을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, IL-2의 활성과 관련하여 용어 "조절하다"는 IL-2의 활성의 변화를 지칭한다. 일부 구현예에서, "조절하다"는 IL-2 활성의 증가를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항원 결합 분자(예를 들어, 항원 결합 도메인 함유 폴리펩타이드)가 결합하는 표적 분자(예를 들어, 항원, 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 지질) 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 종종 아미노산, 폴리펩타이드 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함하며, 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 표적 분자의 인접한 및/또는 병치된 비인접한 잔기(예를 들어, 아미노산, 뉴클레오타이드, 당, 지질 모이어티) 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 잔기(예를 들어, 아미노산, 뉴클레오타이드, 당, 지질 모이어티)로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프는 비제한적으로 적어도 3개, 적어도 5개 또는 8-10개의 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 에피토프는 20개 미만의 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오타이드) 길이, 15개 미만의 잔기 또는 12개 미만의 잔기이다. 2개의 항체는 항원에 대해 경쟁적 결합을 나타내는 경우 항원 내의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 에피토프는 항원 결합 분자 상의 CDR 잔기까지의 특정 최소 거리에 의해 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 에피토프는 상기 거리에 의해 확인될 수 있고, 항원 결합 분자의 잔기 및 항원 잔기 사이의 결합(예를 들어, 수소 결합)에 관여하는 잔기로 더 한정된다. 에피토프는 또한 다양한 스캔에 의해 확인될 수 있고, 예를 들어 알라닌 또는 아르기닌 스캔은 항원 결합 분자가 상호작용할 수 있는 하나 이상의 잔기를 나타낼 수 있다. 명시적으로 표시되지 않는 한, 에피토프로서 잔기의 세트는 특정 항원 결합 도메인 또는 분자에 대한 에피토프의 일부가 되는 다른 잔기를 배제하지 않는다. 오히려, 이러한 세트의 존재는 에피토프의 최소 시리즈(또는 종의 세트)를 지정한다. 따라서, 일부 구현예에서, 에피토프로서 확인된 잔기의 세트는 항원 상의 에피토프에 대한 잔기의 배타적인 목록보다는 항원에 대한 관련성의 최소 에피토프를 지정한다.

"비선형 에피토프" 또는 "입체형태적 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항원 결합 분자(예를 들어, 항원 결합 도메인 함유 폴리펩타이드)가 결합하는 항원성 단백질 내의 비인접한 폴리펩타이드, 아미노산 및/또는 당을 포함한다. 일부 구현예에서, 잔기 중 적어도 하나는 에피토프의 다른 언급된 잔기와 인접하지 않을 것이지만, 잔기 중 하나 이상은 또한 다른 잔기와 인접할 수 있다.

"선형 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항원 결합 분자(예를 들어, 항원 결합 도메인 함유 폴리펩타이드)가 결합하는 항원성 단백질 내의 인접한 폴리펩타이드, 아미노산 및/또는 당을 포함한다. 일부 구현예에서, 선형 에피토프 내의 잔기 중 모두가 항원 결합 분자에 의해 직접 결합(또는 결합에 관여)할 필요는 없다는 점에 유의한다. 일부 구현예에서, 선형 에피토프는 선형 에피토프의 서열로 효과적으로 구성된 펩타이드를 이용한 면역화로부터, 또는 단지 서열 섹션과 함께, 단백질의 나머지로부터 비교적 단리된(이로써 항원 결합 분자는 적어도 주로 상호작용할 수 있음) 단백질의 구조적 섹션으로부터 유래될 수 있다.

용어 "항체" 및 "항원 결합 분자"는 가장 넓은 의미에서 상호교환적으로 사용되며, 비제한적으로 통상적인 항체(전형적으로 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄를 포함함), 단일-도메인 항체(sdAb, 전형적으로 중쇄와 유사한 단지 하나의 사슬을 포함함), VHH 함유 폴리펩타이드(적어도 하나의 중쇄 단독 항체 가변 도메인, 또는 VHH를 포함하는 폴리펩타이드), 및 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 전술한 것 중 어느 것의 단편을 포함하는, 항원 결합 도메인을 포함하는 다양한 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 이량체화 도메인을 포함한다. 이러한 이량체화 도메인은, 비제한적으로, 중쇄 불변 도메인(CH1, 힌지, CH2, 및 CH3을 포함하고, 여기서 CH1은 전형적으로 경쇄 불변 도메인 CL과 쌍을 이루는 반면, 힌지는 이량체화를 매개함) 및 Fc 영역(힌지, CH2, 및 CH3을 포함하고, 여기서 힌지는 이량체화를 매개함)을 포함한다. 용어 항체는 또한, 비제한적으로, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 다양한 종, 예컨대 낙타과(라마 포함), 상어, 마우스, 인간, 시노몰구스 원숭이 등의 항체를 포함한다.

용어 "단일 도메인 항체" 및 "sdAb"는 경쇄 없이, 단일의 단량체성 도메인, 전형적으로 중쇄(또는 VHH)를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "VHH" 또는 "VHH 도메인" 또는 "VHH 항원 결합 도메인"은 낙타과 항체 또는 상어 항체와 같은 단일 도메인 항체의 항원 결합 부분을 지칭한다. 일부 구현예에서, VHH는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4로 지정된 3개의 CDR 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, VHH는 실질적으로 항원 결합 및 특이성을 유지하는 한 부분적인 FR1 및/또는 FR4만을 포함하거나, 또는 상기 프레임워크 영역 중 하나 또는 둘 모두가 결여되도록 N-말단 또는 C-말단에서 절단될 수 있다.

용어 "VHH 함유 폴리펩타이드"는 적어도 하나의 VHH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, VHH 폴리펩타이드는 2개, 3개, 또는 4개 이상의 VHH 도메인을 포함하고, 각각의 VHH 도메인은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, VHH 함유 폴리펩타이드는 Fc 영역을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, VHH 폴리펩타이드는 이량체를 형성할 수 있다. VHH 함유 폴리펩타이드의 비제한적인 구조는 VHH₁-Fc, VHH₁-VHH₂-Fc, 및 VHH₁-VHH₂-VHH₃-Fc를 포함하고, VHH₁, VHH₂, 및 VHH₃은 동일하거나 상이할 수 있다. 이러한 구조의 일부 구현예에서, 하나의 VHH는 링커에 의해 또 다른 VHH에 연결될 수 있거나, 또는 하나의 VHH는 링커에 의해 Fc에 연결될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 링커는 1-20개의 아미노산, 바람직하게는 주로 글리신 및, 선택적으로, 세린으로 구성된 1-20개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, VHH 함유 폴리펩타이드가 Fc를 포함하는 경우, 그것은 이량체를 형성한다. 따라서, 구조 VHH₁-VHH₂-Fc는 이량체를 형성하는 경우 4가인 것으로 간주된다(즉, 이량체가 4개의 VHH 도메인을 가짐). 유사하게, 구조 VHH₁-VHH₂-VHH₃-Fc는 이량체를 형성하는 경우 6가인 것으로 간주된다(즉, 이량체가 6개의 VHH 도메인을 가짐).

용어 "단클론 항체"는 항체의 실질적으로 균질한 집단의 항체(sdAb 또는 VHH 함유 폴리펩타이드를 포함)를 지칭하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이어서, 단일 항원성 부위에 대한 것이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. 따라서, 단클론 항체의 샘플은 항원 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 수식어 "단클론"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 이는 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 단클론 항체는 문헌[Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]에 의해 처음으로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 단클론 항체는 또한 예를 들어 문헌[McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

용어 "CDR"은 당업자에게 적어도 하나의 확인 방법에 의해 정의되는 바와 같은 상보성 결정 영역을 나타낸다. 일부 구현예에서, CDR은 초티아 넘버링 방식, 카바트 넘버링 방식, 카바트 및 초티아의 조합, AbM 정의, 및/또는 접촉 정의 중 어느 것에 따라 정의될 수 있다. VHH는 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지정된 3개의 CDR을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "중쇄 불변 영역"은 적어도 3개의 중쇄 불변 도메인, C_H1, 힌지, C_H2, 및 C_H3을 포함하는 영역을 지칭한다. 물론, 도메인 내의 기능을 변경하지 않는 결실 및 변경은 달리 지정되지 않는 한 용어 "중쇄 불변 영역"의 범위 내에 포함된다. 비제한적인 예시적인 중쇄 불변 영역은 γ, δ, 및 α를 포함한다. 비제한적인 예시적인 중쇄 불변 영역은 또한 ε 및 μ를 포함한다. 각각의 중쇄 불변 영역은 항체 아이소타입에 해당한다. 예를 들어, γ 불변 영역을 포함하는 항체는 IgG 항체이고, δ 불변 영역을 포함하는 항체는 IgD 항체이며, α 불변 영역을 포함하는 항체는 IgA 항체이다. 또한, μ 불변 영역을 포함하는 항체는 IgM 항체이고, ε 불변 영역을 포함하는 항체는 IgE 항체이다. 특정 아이소타입은 하위분류로 추가로 세분화될 수 있다. 예를 들어, IgG 항체는, 비제한적으로, IgG1(γ₁ 불변 영역 포함), IgG2(γ₂ 불변 영역 포함), IgG3(γ₃ 불변 영역 포함), 및 IgG4(γ₄ 불변 영역 포함) 항체를 포함하고; IgA 항체는, 비제한적으로, IgA1(α₁ 불변 영역 포함) 및 IgA2(α₂ 불변 영역 포함) 항체를 포함하며; IgM 항체는, 비제한적으로, IgM1 및 IgM2를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 "Fc 영역"은 CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 불변 영역의 일부를 지칭한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 힌지, CH2, 및 CH3을 포함한다. 다양한 구현예에서, Fc 영역이 힌지를 포함하는 경우, 힌지는 2개의 Fc 함유 폴리펩타이드 사이에 이량체화를 매개한다. Fc 영역은 본원에 논의된 임의의 항체 중쇄 불변 영역 아이소타입의 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다.

본원에 사용된 바와 같이 "수용자(acceptor) 인간 프레임워크"는 본원에 논의된 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(V_H) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 수용자 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 그것은 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화의 수는 VHH와 같은 단일 항원 결합 도메인 내의 인간 프레임워크 모두에 걸쳐 10개 미만, 또는 9개 미만, 또는 8개 미만, 또는 7개 미만, 또는 6개 미만, 또는 5개 미만, 또는 4개 미만, 또는 3개 미만이다.

"친화성"은 분자(예를 들어, 항체 또는 VHH 함유 폴리펩타이드)의 단일 결합 부위 및 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화성 또는 겉보기 친화성은 일반적으로 각각 해리 상수(K_D) 또는 K_D-_apparent에 의해 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법(예를 들어, ELISA K_D, KinExA, 유세포 분석법, 및/또는 표면 플라즈몬 공명 장치)에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법은, 비제한적으로, BIAcore®, Octet® 또는 유세포 분석법을 포함하는 방법을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "K_D"는 항원 결합 분자/항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다. 용어 "K_D"가 본원에서 사용되는 경우, 그것은 K_D 및 K_D-_apparent를 포함한다.

일부 구현예에서, 항원 결합 분자의 K_D는 항원 발현 세포주를 사용하고 각각의 항체 농도에서 측정된 평균 형광을 비선형 1-부위 결합 방정식(프리즘 소프트웨어 그래프패드)에 피팅하는 유세포 분석법에 의해 측정된다. 일부 이러한 구현예에서, K_D는 K_D-apparent이다.

용어 "생물학적 활성"은 분자의 임의의 하나 이상의 생물학적 특성(생체내에서 발견되는 것과 같이 자연적으로 존재하든지, 또는 재조합 수단에 의해 제공되거나 가능하게 되든지)을 지칭한다. 생물학적 특성은, 비제한적으로, 리간드 결합, 세포 증식(예컨대, T 세포 증식)의 유도 또는 증가, 및 사이토카인의 발현의 유도 또는 증가를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "IL-2 활성" 또는 IL-2의 "생물학적 활성"은 IL-2의 임의의 생물학적 효과 또는 생물학적으로 관련된 특성 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 활성은 T 세포 증식을 유도하고/거나 자연 살해(NK) 세포를 활성화시키는 IL-2의 능력을 포함한다. 비제한적인 예시적인 IL-2 활성은 pSTAT5 발현 증가, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포의 증식 증가, T 세포 상에서 CD71 발현 증가, 및 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 활성화 및 증식에 대한 Treg 세포의 억제 활성 감소를 포함한다.

"작용제" 또는 "활성화" 항체(예컨대, sdAb 또는 VHH 함유 폴리펩타이드)는 표적 항원의 생물학적 활성을 증가시키고/거나 활성화시키는 것이다. 일부 구현예에서, 작용제 항체는 항원에 결합하고, 그의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85% 이상 증가시킨다.

"길항제", "차단" 또는 "중화" 항체는 표적 항원의 생물학적 활성을 감소시키고/거나 불활성화시키는 것이다. 일부 구현예에서, 중화 항체는 항원에 결합하고, 그의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상 감소시킨다.

"친화성 성숙된" VHH 함유 폴리펩타이드는 이러한 변경을 보유하지 않는 부모 VHH 함유 폴리펩타이드와 비교하여 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변경을 갖는 VHH 함유 폴리펩타이드를 지칭하며, 이러한 변경은 항원에 대한 VHH 함유 폴리펩타이드의 친화성을 개선시킨다.

본원에 사용된 바와 같이 "인간화된 VHH"는 하나 이상의 프레임워크 영역이 인간 프레임워크 영역으로 실질적으로 대체된 VHH를 지칭한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 특정 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 VHH는 원래의 VHH 또는 인간 프레임워크 서열에서 발견되지 않지만 VHH 또는 VHH 함유 폴리펩타이드 성능을 더 개선하고 최적화하기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화된 VHH 함유 폴리펩타이드는 인간 Fc 영역을 포함한다. 이해되는 바와 같이, 인간화된 서열은 그의 1차 서열에 의해 확인될 수 있고, 반드시 항체가 생성되는 과정을 나타내지는 않는다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 보유한다. 예시적인 "효과기 기능"은 Fc 수용체 결합; Clq 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC); 식세포작용(phagocytosis); 세포 표면 수용체(예를 들어, B-세포 수용체)의 하향 조절; 및 B-세포 활성화 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 요구하고 다양한 분석을 사용하여 평가될 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 동종이인자형(allotype)); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 그의 자연발생 변이체를 포함한다.

"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이하지만 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 효과기를 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 부모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역 또는 부모 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 및 바람직하게는, 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 부모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성, 이와 적어도 약 90% 서열 동일성, 이와 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 보유할 것이다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 일부 구현예에서, FcγR은 천연 인간 FcR이다. 일부 구현예에서, FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고 수용체의 대립유전자 변이체 및 선택적으로 스플라이스된 형태를 포함하는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA(an "활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 이의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신 기반의 활성화 모티프(ITAM)를 함유하고, 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)를 함유한다(예를 들어, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997) 참고). FcR은, 예를 들어, 문헌[Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin . Med . 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 미래에 확인될 것을 포함하는 다른 FcR은 본원에서 용어 "FcR"에 의해 포함된다. 예를 들어, 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG를 태아로 전달하는 것(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 면역글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 알려져 있다(예를 들어, Ghetie and Ward, Immunol . Today 18(12):592-598(1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640(1997); Hinton et al., J. Biol . Chem . 279(8):6213-6216(2004); WO 제2004/92219호(Hinton et al.) 참고).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 둘 이상의 값 사이의 차이가 상기 값에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락 내에서 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 고려하도록 2개의 이상의 수치 값 사이에 충분히 높은 유사성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 실질적으로 유사한 값은 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 50% 중 어느 하나 이하로 상이하다.

폴리펩타이드 "변이체"는 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 백분율 서열 동일성을 달성하고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후, 천연 서열 폴리펩타이드와 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적 활성 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실되는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체는 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 일부 구현예에서, 변이체는 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 일부 구현예에서, 변이체는 천연 서열 폴리펩타이드와 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체 서열에 대한 "백분율(%) 아미노산 서열 동일성" 및 "상동성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 백분율 서열 동일성을 달성하고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후, 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGNTM(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위에 속하는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.

아미노산 치환은 비제한적으로 폴리펩타이드 내의 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 예시적인 치환이 표 1에 나타나 있다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입될 수 있고, 원하는 활성, 예를 들어, 유지된/개선된 항원 또는 수용체 결합, 감소된 항원 또는 수용체 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.

아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 소수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 바꾸는 것을 수반할 것이다.

용어 "벡터"는 숙주 세포에서 증식될 수 있는 클로닝된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 함유하도록 조작될 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 기술하기 위해 사용된다. 벡터는 다음 요소 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 복제 원점, 관심 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서), 및/또는 하나 이상의 선택 마커 유전자(예를 들어, 항생제 내성 유전자 및 비색 분석에 사용될 수 있는 유전자, 예를 들어, β-갈락토시다제). 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 관심 폴리펩타이드를 발현하는 데 사용되는 벡터를 지칭한다.

"숙주 세포"는 벡터 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드의 수용자일 수 있거나 수용자였던 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물 세포, 예컨대 영장류 또는 비영장류 동물 세포; 진균 세포, 예컨대 효모; 식물 세포; 및 곤충 세포를 포함한다. 비제한적인 예시적인 포유동물 세포는, 비제한적으로, NSO 세포, PER.C6^® 세포(Crucell), 및 293F 및 CHO 세포, 및 이들의 유도체, 예컨대 293-6E, CHO-DG44, CHO-K1, CHO-S, 및 CHO-DS 세포를 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적, 우발적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 원래의 부모 세포와 반드시 완전히 동일한(형태 또는 게놈 DNA 보체에서) 것은 아닐 수 있다. 숙주 세포는 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드(들)로 생체내에서 형질감염된 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "단리된"은 전형적으로 자연에서 발견되거나 생산된 구성 요소 중 적어도 일부로부터 분리된 분자를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 그것이 생산된 세포의 구성요소 중 적어도 일부로부터 분리될 때 "단리된" 것으로 언급된다. 폴리펩타이드가 발현 후에 세포에 의해 분비되는 경우, 폴리펩타이드를 함유하는 상층액을 그것을 생산한 세포로부터 물리적으로 분리하는 것은 폴리펩타이드 "단리"하는 것으로 간주된다. 유사하게, 폴리뉴클레오타이드는 그것이 전형적으로 자연에서 발견되거나, 또는 예를 들어, RNA 폴리뉴클레오타이드의 경우 그것이 생산된 세포의 구성요소 중 적어도 일부와 분리되는 더 큰 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 폴리뉴클레오타이드의 경우 게놈 DNA 또는 미토콘드리아 DNA)의 일부일 때 "단리"되는 것으로 지칭된다. 따라서, 숙주 세포 내부의 벡터에 함유된 DNA 폴리뉴클레오타이드는 "단리된" 것으로 지칭될 수 있다.

용어 "개체" 및 "대상체"는 동물; 예를 들어, 포유동물을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 비제한적으로, 인간, 설치류, 유인원, 고양이, 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 포유동물 실험실 동물, 포유동물 농장 동물, 포유동물 스포츠 동물, 및 포유동물 애완동물을 포함하는 포유동물을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 예에서, "개체" 또는 "대상체"는 질환 또는 장애에 대한 치료를 필요로 하는 개체 또는 대상체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료를 받는 대상체는 대상체가 치료와 관련된 장애를 갖는 것으로 확인되었거나, 또는 장애에 걸릴 충분한 위험에 있는 것으로 확인되었다는 사실을 명시하는 환자일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 "질환" 또는 "장애"는 치료가 필요하고/거나 원하는 병태를 지칭한다.

용어 "종양 세포", "암 세포", "암", "종양", 및/또는 "신생물"은 달리 지정되지 않는 한, 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 제어되지 않은 성장 및/또는 비정상적으로 증가된 세포 생존 및/또는 신체 장기 및 시스템의 정상적인 기능을 방해하는 세포사멸사의 억제를 나타내는 세포(또는 세포들)를 지칭한다. 이 정의에는 양성 및 악성 암, 폴립, 과다형성(hyperplasia) 뿐만 아니라 휴면 종양 또는 미세전이가 포함된다.

용어 "암" 및 "종양"은 고형 및 혈액/림프암을 포함하고, 또한 악성, 전악성, 및 양성 성장, 예컨대 이형성증(dysplasia)을 포함한다. 또한, 이 정의에는 면역 시스템에 의해 방해받지 않는(예컨대, 면역 회피 및 면역 탈출 메커니즘) 비정상적인 증식을 갖는 세포(예컨대, 바이러스 감염된 세포)가 포함된다. 예시적인 암은, 비제한적으로: 기저 세포 암종, 담도암; 방광암; 골암; 뇌 및 중추신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장 및 직장암; 결합 조직 암; 소화기계의 암; 자궁내막암; 식도암; 안암; 두경부암; 위암(소화기암 포함); 교모세포종; 간암종; 간종양; 상피내 신생물; 신장 또는 신암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(예컨대, 소세포 폐암, 비비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평상피암); 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(입술, 혀, 입, 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막아세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡기계의 암; 타액선 암종; 육종; 피부암; 편평 세포 암; 위장암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 호지킨 및 비호지킨 림프종을 포함하는 림프종뿐만 아니라 B-세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 병변 NHL 포함); 맨틀 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 뿐만 아니라 다른 암종 및 육종; 및 이식후 림프증식성 장애(PTLD) 뿐만 아니라 모반증, 부종(예컨대, 뇌종양과 관련된 것), 및 메이그 증후군과 관련된 비정상적인 혈관 증식을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "비종양 세포"는 정상 세포 또는 조직을 지칭한다. 예시적인 비종양 세포는, 비제한적으로: T 세포, B-세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 상피 세포, 섬유아세포, 간세포, 간질 신장 세포, 섬유아세포 유사 활막세포, 조골세포, 및 유방, 골격근, 췌장, 위, 난소, 소장, 태반, 자궁, 고환, 신장, 폐, 심장, 뇌, 간, 전립선, 결장, 림프 기관, 골, 및 골 유래의 간엽 줄기 세포에 위치한 세포를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "주변부에 위치한 세포 또는 조직"은 종양 세포 근처 및/또는 종양 미세환경 내에 위치하지 않은 비종양 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "종양 미세환경 내의 세포 또는 조직"은 종양 세포를 둘러싸고/거나 공급하는 세포, 분자, 세포외 기질 및/또는 혈관을 지칭한다. 종양 미세환경 내의 예시적인 세포 또는 조직은, 비제한적으로: 종양 혈관구조; 종양 침윤 림프구; 섬유아세포 망상 세포; 내피 선조 세포(EPC); 암 관련 섬유아세포; 혈관주위세포; 다른 기질 세포; 세포외 기질(ECM)의 구성요소; 수지상 세포; 항원 제시 세포; T 세포; 조절 T 세포(Treg 세포); 대식세포; 호중구; 골수 유래 억제자 세포(MDSC) 및 종양에 근접하여 위치한 다른 면역 세포를 포함한다. 종양 미세환경 내에 위치한 종양 세포, 및/또는 세포/조직을 확인하는 방법은 하기 본원에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 공지되어 있다.

일부 구현예에서, "증가" 또는 "감소"는 각각 통계적으로 유의한 증가 또는 감소를 지칭한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, "조절"은 시험 제제가 존재하지 않는 동일한 조건과 비교하여 또한 그의 리간드, 결합 파트너, 동종다량체성 또는 이종다량체성 형태로의 회합을 위한 파트너, 또는 기질 중 하나 이상에 대한 표적 또는 항원의 친화성, 결합력, 특이성 및/또는 선택성의 변화(이는 증가 또는 감소일 수 있음)를 가져오는 것; 표적 또는 항원이 존재하는 배지 또는 주변환경(예컨대, pH, 이온 강도, 보조인자의 존재 등)에서 하나 이상의 조건에 대한 표적 또는 항원의 민감도의 변화(이는 증가 또는 감소일 수 있음)를 가져오는 것; 및/또는 세포 증식 또는 사이토카인 생산을 수반할 수 있다. 이것은 관련된 표적에 따라 임의의 적합한 방식으로 및/또는 자체 공지되거나 본원에 기재된 임의의 적합한 분석을 사용하여 결정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "면역 반응"은 질환(예를 들어, 암 또는 암 전이)의 발병을 억제 또는 예방하거나 또는 이의 증상을 개선하기에 충분한 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 포함하는 것을 의미한다. "면역 반응"은 선천 및 후천 면역계 모두의 측면을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 유익하거나 원하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 인간을 포함하는 포유동물에서 질환을 위한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과는, 비제한적으로, 하나 이상의 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 확산(예를 들어, 전이, 예를 들어 폐 또는 림프절로의 전이)의 예방 또는 지연, 질환의 재발의 예방 또는 지연, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선, 질환 또는 질환 진행의 억제, 질환 또는 그의 진행의 억제 또는 늦춤, 그의 발달의 정지, 및 차도(부분적이든 전체적이든)를 포함한다. 증식성 질환의 병리학적 결과의 감소가 또한 "치료"에 포함된다. 본원에 제공된 방법은 이러한 치료 측면 중 어느 하나 이상을 고려한다. 상기의 맥락에서, 용어 치료는 장애의 모든 측면의 100% 제거를 요구하지 않는다.

"개선"은 치료제를 투여하지 않는 것과 비교하여 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선을 의미한다. "개선"은 또한 증상의 지속기간의 단축 또는 감소를 포함한다.

용어 "항암제"는 그의 최광의의 의미로 하나 이상의 암의 치료에 사용되는 제제를 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 이러한 제제의 예시적인 부류는, 비제한적으로, 화학치료제, 항암 생물학적 제제(예컨대, 사이토카인, 수용체 세포외 도메인-Fc 융합, 및 항체), 방사선 요법, CAR-T 요법, 치료 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA) 및 온콜리틱 바이러스를 포함한다.

용어 "생물학적 샘플"은 생물 또는 이전의 생물로부터의 물질의 양을 의미한다. 이러한 물질은, 비제한적으로, 혈액(예를 들어, 전혈), 혈장, 혈청, 소변, 양수, 활액, 내피 세포, 백혈구, 단핵구, 다른 세포, 장기, 조직, 골수, 림프절 및 비장을 포함한다.

용어 "대조군" 또는 "참조"는 분석물을 함유하지 않는 것으로 알려지거나("음성 대조군") 또는 분석물을 함유하는 것으로 알려진("양성 대조군") 조성물을 지칭한다. 양성 대조군은 알려진 농도의 분석물을 포함할 수 있다.

용어 "억제" 또는 "억제하다"는 임의의 표현형 특징의 감소 또는 중지 또는 상기 특징의 발생, 정도, 또는 가능성의 감소 또는 중지를 지칭한다. "감소" 또는 "억제"시키는 것은 참조와 비교하여 활성, 기능, 및/또는 양을 줄이거나, 감소시키거나 또는 정지하는 것이다. 일부 구현예에서, "감소" 또는 "억제"는 10% 이상의 전체 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, "감소" 또는 "억제"는 50% 이상의 전체 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, "감소" 또는 "억제"는 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 전체 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 언급된 양은 동일한 기간 동안 대조군에 비해 일정 기간 동안 억제되거나 감소된다.

본원에 사용된 바와 같이, "질환의 발달을 지연시키는 것"은 질환(예컨대, 암)의 발달을 연기, 방해, 늦춤, 지연, 안정화, 억제 및/또는 미루는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질병의 병력 및/또는 치료받는 개체에 따라 다양한 시간 길이일 수 있다. 당업자에 명백한 바와 같이, 충분하거나 유의한 지연은 사실상 개체가 질환을 발생하지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전이의 발달과 같은 말기 암이 지연될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 "예방"은 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환으로 진단받지 않은 대상체에서 질환의 발생 또는 재발과 관련하여 예방을 제공하는 것을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "감소", "억제", 또는 "예방"은 모든 시간에 걸쳐, 하지만 단지 측정되는 시간 동안, 완전한 예방을 나타내거나 요구하지 않는다.

물질/분자, 작용제 또는 길항제의 "치료적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유발하는 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 또한 물질/분자, 작용제 또는 길항제의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 작은 양이다. 치료적 유효량은 하나 이상의 투여로 전달될 수 있다. 치료적 유효량은 원하는 치료 및/또는 예방 결과를 달성하기 위해 투여량에서 그리고 필요한 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.

용어 "약제학적 제제" 및 "약제학적 조성물"은 활성 성분(들)의 생물학적 활성을 효과적이게 하기 위한 형태이고 제제가 투여될 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가의 구성요소를 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 무균일 수 있다.

"약제학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 투여하기 위한 "약제학적 조성물"을 함께 포함하는 치료제와 함께 사용하기 위한 당업계에 통상적인 비독성 고체, 반고체, 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 제제 보조제, 또는 담체를 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며 제제의 다른 성분과 양립가능하다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 사용되는 제제에 적절하다.

하나 이상의 추가 치료제와 "조합된" 투여는 동시(동시발생) 및 임의의 순서의 순차적 투여를 포함한다.

용어 "동시에"는 2개 이상의 치료제의 투여를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 여기서 투여의 적어도 일부는 시간상 중복되거나, 또는 하나의 치료제의 투여가 다른 치료제의 투여에 비해 짧은 시간에 속하거나, 또는 두 제제의 치료 효과가 적어도 일정 기간 동안 중복된다.

용어 "순차적으로"는 시간상 중복되지 않거나 제제들의 치료 효과가 중복되지 않는 2개 이상의 치료제의 투여를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, "함께"는 또 다른 치료 양식에 추가적인 하나의 치료 양식의 투여를 지칭한다. 이와 같이, "함께"는 개체에게 다른 치료 양식을 투여하기 전, 동안, 또는 후에 하나의 치료 양식의 투여를 지칭한다.

용어 "패키지 삽입물"은 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업적인 패키지에 관례적으로 포함되는 지침을 지칭하기 위해 사용된다.

"제조 물품"은 적어도 하나의 시약, 예를 들어, 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 치료를 위한 약제, 또는 본원에 기재된 바이오마커를 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제조품(예를 들어, 패키지 또는 용기) 또는 키트이다. 일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 단위로서 판촉, 유통 또는 판매된다.

용어 "표지" 및 "검출가능한 표지"는, 예를 들어, 특정 결합 쌍의 구성원 사이의 반응(예를 들어, 결합)을 검출가능하게 만드는 항체 또는 항원에 부착된 모이어티를 의미한다. 특정 결합 쌍의 표지된 구성원은 "검출가능하게 표지된" 것으로 지칭된다. 따라서, 용어 "표지된 결합 단백질"은 결합 단백질의 식별을 제공하는 혼입된 표지를 갖는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 표지는 시각적 또는 도구적 수단, 예를 들어, 방사성 표지된 아미노산의 혼입 또는 표지된 아비딘(예를 들어, 광학 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 형광성 마커 또는 효소적 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 바이오티닐 모이어티의 폴리펩타이드에 대한 부착에 의해 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 검출가능한 마커이다. 폴리펩타이드를 위한 표지의 예는, 비제한적으로, 다음을 포함한다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho, 또는 ¹⁵³Sm); 발색체(chromogen), 형광성 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄계 인광체), 효소적 표지(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제); 화학발광 마커; 바이오티닐기; 2차 리포터(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩타이드 에피토프; 및 자성제, 예컨대 가돌리듐 킬레이트. 면역분석에 일반적으로 사용되는 표지의 대표적인 예는 빛을 생성하는 모이어티, 예를 들어, 아크리디늄 화합물, 및 형광을 생성하는 모이어티, 예를 들어, 플루오레세인(fluorescein)을 포함한다. 이와 관련하여, 모이어티 자체는 검출가능하게 표지되지 않을 수 있지만 또 다른 모이어티와의 반응시에 검출가능하게 될 수 있다.

예시적인 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드

변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 야생형 IL-2와 비교하여 IL-2 수용체에 대한 변형된 IL-2의 친화성을 감소시키는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드는 IL-2R의 작용제이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 변형된 인간 IL-2이고, IL-2R은 인간 IL-2R이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 IL-2R에 대한 인간 야생형 IL-2의 친화성보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 낮은 친화성으로 인간 IL-2R에 결합한다.

다양한 구현예에서, 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드는 T 세포 또는 자연 살해(NK) 세포 항원에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 항원 결합 도메인을 포함하고, 적어도 하나, 또는 모두는 T 세포 또는 자연 살해 세포 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 또는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하고, 적어도 하나, 또는 모두는 T 세포 또는 자연 살해 세포 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2를 함유하는 폴리펩타이드는 항원 결합 도메인의 부재하에 IL-2R에 결합하거나 활성화시키지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2를 함유하는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드가 IL-2R와 동일한 세포 상의 항원에 결합된 항원 결합 도메인을 포함할 때에만 세포 상의 IL-2R에 결합하고/거나 활성화시킨다.

다양한 구현예에서, 변형된 IL-2는 P65, D84, E95, M23, 및 H16으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 P65, H16, 및 D84에 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 P65, H16, D84, 및 M23에 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 P65, H16, D84, 및 E95에 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 P65, H16, D84, M23, 및 E95에 치환을 포함한다.

일부 구현예에서, 아미노산 위치 P65에서의 치환은 P65R, P65E, P65K, P65H, P65Y, P65Q, P65D, 및 P65N으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치 H16에서의 치환은 H16A, H16G, H16S, H16T, H16V, 및 H16P로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치 D84에서의 치환은 D84S, D84G, D84A, D84T, D84V, 및 D84P로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치 M23에서의 치환은 M23A, M23G, M23S, M23T, M23V, 및 M23P로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 아미노산 위치 E95에서의 치환은 E95Q, E95G, E95S, E95T, E95V, E95P, E95H, 및 E95N으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 F42에 치환을 추가로 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, F42에서의 치환은 F42K, F42A, F42R, F42A, F42G, F42S, 및 F42T로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 Y45 및 L72로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 추가로 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 변형된 IL-2는 Y45A 및 L72G로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 T3 및 C125로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 추가로 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 변형된 IL-2는 T3A, 및 C125A로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, 및 D84S를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, D84S, 및 M23A를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, D84S, 및 E95Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, D84S, M23A, 및 E95Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 H16A-F42K; D84S-F42K; E15S-F42K; M23A-F42K; E95Q-F42K; P65R-H16A; P65R-D84S; P65R-E15S; P65R-M23A; P65R-E95Q; T3A-C125S; T3A-P65R-C125S; T3A-H16A-C125S; T3A-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-C125S; T3A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-M23A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-D84S-E95Q-C125S, 및 T3A-H16A-M23A-P65R-D84S-E95Q-C125S로부터 선택된 치환을 포함한다.

본원에 기재된 임의의 구현예에서, 변형된 IL-2는 변형된 인간 IL-2일 수 있다. 다양한 구현예에서, 치환의 아미노산 위치는 서열번호: 1에서의 아미노산 위치에 상응한다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 서열번호: 84와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 본원에 논의된 치환 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 서열번호: 3-9, 11-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 본원에 논의된 치환 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 서열번호: 3-9, 11-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 서열번호: 3, 5-9, 12-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2를 함유하는 폴리펩타이드는 T 세포 또는 자연 살해 세포 항원에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 또는 4개의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 생리학적 조건에서 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드의 이량체화를 매개하여 항원 결합 부위의 수의 2배인 이량체가 형성되게 한다. 예를 들어, 3개의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 단량체로서 3가이지만, 생리학적 조건에서, Fc 영역은 이량체화를 매개할 수 있어, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 이러한 조건 하에 6가 이량체로서 존재한다.

다양한 구현예에서, 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호: 3-9, 11-21, 및 23-31로부터 선택된 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호: 3, 5-9, 및 12-21, 및 23-31로부터 선택된 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호: 21을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 인간화된다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 천연 또는 천연 동족 결합 파트너, 안티칼린(조작된 리포칼린), 다르핀(Darpin), 피노머(Fynomer), 센티린(Centyrin, 조작된 피브로넥틴 III 도메인), 시스틴-매듭 도메인(cystine-knot domain), 아필린(Affilin), 아피바디(Affibody), 또는 조작된 CH3 도메인이다. 일부 구현예에서, 천연 동족 결합 파트너는 종양 관련 항원(TAA)의 천연 동족 결합 파트너의 리간드 또는 세포외 도메인, 또는 이의 결합 단편, 또는 TAA에 대해 결합 활성을 나타내는 이의 변이체를 포함한다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2 및 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 Treg, 말초 T 세포, 및 내피 세포를 피하면서 항-종양 T 세포 반응 또는 자연 살해 세포 반응을 향상시킨다. 일부 이러한 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 변형된 IL-2를 활성화된 T 세포로 표적화한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 IL-2R이 적어도 하나의 항원 결합 도메인에 의해 결합된 항원과 동일한 세포 상에 있을 때에만 IL-2R에 결합하고 조절한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2는 IL-2R이 적어도 하나의 항원 결합 도메인에 의해 결합된 항원을 발현하는 세포와 상이한 세포 상에 있을 때 IL-2R에 결합하지 않거나 활성화시키지 않는다.

다양한 구현예에서, 항원 결합 도메인은 PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-1BB, OX40, GITR, CD8a, CD8b, CD4, NKp30, NKG2A, TIGIT, TGFβR1, TGFβR2, Fas, NKG2D, NKp46, PD-L1, CD107a, ICOS, TNFR2, 및 CD16a로부터 선택된 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드는 니볼루맙(BMS; PD-1); 펨브롤리주맙(Merck; PD-1); AMP-514(Amplimmune; PD-1); TSR-042(Tesaro/AnaptysBio, ANB-011; PD-1); STI-A1110(Sorrento Therapeutics; PD-1), 이필리무맙(BMS; CTLA-4); 트레멜리무맙(AstraZeneca, CTLA-4); 우렐루맙(BMS, 4-1BB); 우토밀루맙(Pfizer, 4-1BB); 아테졸리주맙(Roche, PD-L1), 두르발루맙(AstraZeneca, PD-L1); 모날리주맙(NKG2A, Innate Pharma 및 AstraZeneca); BMS-986016(Bristo- Meyers Squibb, LAG-3)의 항원 결합 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 PD-1에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 LAG3에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 NKp46에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 NKG2D에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 CD8a에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 인간화될 수 있다. 인간화된 항원 결합 도메인(예컨대, VHH 함유 폴리펩타이드)을 포함하는 폴리펩타이드는 인간화된 항원 결합 도메인 및 인간화된 항체가 항체 치료제에 대한 면역 반응 및 치료제의 효과 감소를 초래할 수 있는 비인간 항체에 대한 인간 면역 반응을 감소시키거나 제거하기 때문에 치료 분자로서 유용하다. 일반적으로, 인간화된 항원 결합 도메인 또는 인간화된 항체는 CDR(또는 이의 일부)이 비인간 항체로부터 유래되고, FR(또는 이의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항원 결합 도메인 또는 인간화된 항체는 선택적으로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항원 결합 도메인 또는 인간화된 항체 내의 일부 FR 잔기는 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복시키거나 개선하기 위해 비인간 항체(예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.

인간화된 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633]에서 검토되며, 예를 들어, 문헌[Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al., (1989) Proc . Natl Acad . Sci . USA 86: 10029-10033; 미국 특허 제5, 821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34; Padlan, (1991) Mol . Immunol . 28:489-498 ("재포장(resurfacing)" 설명); Dall'Acqua et al., (2005) Methods 36:43-60 ("FR 셔플링" 설명); 및 Osbourn et al., (2005) Methods 36:61-68 및 Klimka et al., (2000) Br. J. Cancer, 83:252-260 (FR 셔플링에 대한 "가이드된 선택" 접근법 설명)]에 추가로 기재되어 있다.

인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 "최적 적합(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어, Sims et al. (1993) J. Immunol . 151 :2296 참고); 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; 및 Presta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623 참고); 인간 성숙한(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예를 들어, Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633 참고); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, Baca et al.,(1997) J. Biol . Chem. 272: 10678-10684 및 Rosok et al.,(1996) J. Biol . Chem . 271 :22611-22618 참고)을 포함한다. 전형적으로, VHH의 FR 영역은 인간화된 VHH를 만들기 위해 인간 FR 영역으로 대체된다. 일부 구현예에서, 인간 FR의 특정 FR 잔기는 인간화된 VHH의 하나 이상의 특성을 개선하기 위해 대체된다. 이러한 대체된 잔기를 갖는 VHH 도메인은 여전히 본원에서 "인간화된" 것으로 지칭된다.

다양한 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드에 포함된 Fc 영역은 인간 Fc 영역이거나, 또는 인간 Fc 영역으로부터 유래된다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드에 포함된 Fc 영역은 인간 Fc 영역으로부터 유래되고, IgG1 E233, L234, 및 L235에 상응하는 하부 힌지에 3개의 아미노산 결실을 포함하며, 본원에서 "Fc xELL"로 지칭된다. Fc xELL 폴리펩타이드는 FcγR과 결합하지 않으므로 "효과기 침묵(effector silent)" 또는 "효과기 무효(effector null)"로 지칭되지만, 일부 구현예에서, xELL Fc 영역은 FcRn에 결합하므로 FcRn 매개 리사이클링과 관련된 연장된 반감기 및 트랜스사이토시스(transcytosis)를 갖는다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드에 포함된 Fc 영역은 인간 Fc 영역으로부터 유래되고 돌연변이 M252Y 및 M428V를 포함하며, 본원에서 "Fc-YV"로 지칭된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드에 포함된 Fc 영역은 인간 Fc 영역으로부터 유래되고 돌연변이 M252Y 및 M428L를 포함하며, 본원에서 "Fc-YL"로 지칭된다. 일부 구현예에서, 이러한 돌연변이는 엔도솜의 산성 pH(6.5 근처)에서 FcRn에의 결합을 향상시키는 반면, 중성 pH(약 7.2)에서 검출가능한 결합을 상실하여, 향상된 FcRn 매개 리사이클링 및 연장된 반감기를 허용한다.

일부 구현예에서, 본원에서 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드에 포함된 Fc 영역은 인간 Fc 영역으로부터 유래되고 이종이량체화를 위해 설계된 돌연변이를 포함하며, 본원에서 "노브(knob)" 및 "홀(hole)"로 지칭된다. 일부 구현예에서, "노브" Fc 영역은 돌연변이 T366W를 포함한다. 일부 구현예에서, "홀" Fc 영역은 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이량체화에 사용되는 Fc 영역은 이종이량체성 Fc 쌍의 제2 구성원 상의 상응하는 돌연변이 Y349C와 비대칭 디설파이드를 형성하는 이종이량체성 Fc 쌍의 제1 구성원 상의 돌연변이 S354C와 같은 추가의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이량체성 Fc 쌍의 하나의 구성원은 FcRn 결합을 유지하면서 단백질 A 결합을 방지하기 위해 변형 H435R 또는 H435K를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이량체성 Fc 쌍의 하나의 구성원은 변형 H435R 또는 H435K를 포함하는 반면, 이종이량체성 Fc 쌍의 제2 구성원은 H435에서 변형되지 않는다. 다양한 구현예에서, 홀 Fc 영역은 변형 H435R 또는 H435K를 포함하는 반면(변형이 H435R인 일부 경우에 "홀-R"로 지칭됨), 노브 Fc 영역은 포함하지 않는다. 일부 경우, 홀-R 돌연변이는 존재할 수 있는 동종이량체성 홀 Fc 영역보다 이종이량체의 정제를 개선한다.

변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드에서 사용될 수 있는 비제한적인 예시적인 Fc 영역은 서열번호: 47-83의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 서열번호: 3-9, 11-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열의 C-말단에 융합된 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 서열번호: 3, 5-9, 12-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열의 C-말단에 융합된 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 서열번호: 21의 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열의 C-말단에 융합된 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 서열번호: 3-9, 11-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 서열번호: 3, 5-9, 12-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 서열번호: 21의 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 서열번호: 34-43 및 46으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 폴리펩타이드는 서열번호: 43 및 T 세포 또는 자연 살해 세포 상에 발현된 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 46 및 T 세포 또는 자연 살해 세포 상에 발현된 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.

변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드의 예시적인 활성

다양한 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 IL-2R 활성의 작용제이다. 작용제 활성은, 일부 구현예에서, 본원의 실시예에 제공된 방법을 사용하여, 예컨대 293F 세포 또는 유사한 세포를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 T 세포에 표적화될 때 IL-2R 활성의 작용제이지만, 표적화의 부재하에 작용제 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 NK 세포 및/또는 T 세포에 표적화될 때 IL-2R 활성의 작용제이지만, 표적화의 부재하에 작용제 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포를 표적화하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 T 세포 또는 NK 세포 상에 발현된 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 시험관내 및/또는 생체내에서 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포의 증식을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 Treg 세포의 존재 하에 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 증식을 증가시킨다. 일부 이러한 구현예에서, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포는 활성화된 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 시험관내에서 활성화된 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 증식을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 부재 하에 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 증식에 비해 활성화된 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 증식을 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 부재 하에 관찰된 증식에 비해 활성화된 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포의 증식을 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배 증가시키고 휴지기 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포의 증식을 실질적으로 증가시키지 않는다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 시험관내 및/또는 생체내에서 NK 세포의 증식을 증가시킨다. 일부 이러한 구현예에서, NK 세포는 활성화된 NK 세포이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 시험관내에서 활성화된 NK 세포 증식을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 부재 하에 NK 세포 증식에 비해 활성화된 NK 세포 증식을 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 부재 하에 관찰된 증식에 비해 활성화된 NK 세포의 증식을 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배 증가시키고 휴지기 NK 세포의 증식을 실질적으로 증가시키지 않는다.

활성화된 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포의 증식의 증가는 당업계의 임의의 방법, 예를 들어, 본원의 실시예에 제공된 방법에 의해 결정될 수 있다. 비제한적인 예시적인 분석은 다음과 같다. CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포는 하나 이상의 건강한 인간 공여자로부터 단리될 수 있다. T 세포는 CellTrace Violet(CTV)으로 염색되고, 항-CD3 항체로 활성화되며, 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드와 접촉된 다음, FACS에 의해 분석된다. CTV 염색의 손실은 증식을 나타낸다. 일부 구현예에서, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 증식의 증가는 상이한 건강한 인간 공여자로부터 단리된 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포의 증식을 측정함으로써와 같이, 실험 세트로부터 또는 풀링된 T 세포로부터의 평균으로서 결정된다. 일부 구현예에서, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 증식의 증가는 적어도 5명 또는 적어도 10명의 상이한 건강한 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 수행된 실험으로부터, 또는 적어도 5명 또는 적어도 10명의 상이한 건강한 공여자로부터의 T 세포의 풀로부터의 평균으로서 결정된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 Treg 세포의 존재 하에서도 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포의 증식을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 시험관내 및/또는 생체내에서 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현을 증가시킨다. CD71 발현은 T 세포 활성화를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 시험관내에서 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 부재 하에 CD71 발현에 비해 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현을 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 부재 하에 관찰된 CD71 발현에 비해 활성화된 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현을 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배 증가시키고, 휴지기 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현을 실질적으로 증가시키지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 Treg 세포의 존재 하에 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현을 증가시킨다.

CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현의 증가는 당업계의 임의의 방법, 예를 들어, 본원의 실시예에 제공된 방법에 의해 결정될 수 있다. 비제한적인 예시적인 분석은 다음과 같다. CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포는 하나 이상의 건강한 인간 공여자로부터 단리되고 항-CD3 항체로 자극되며, 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드와 접촉된 다음, CD71 발현에 대해 FACS에 의해 분석된다. 일부 구현예에서, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현의 증가는 상이한 건강한 인간 공여자로부터 단리된 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현을 측정함으로써와 같이, 실험 세트로부터 또는 풀링된 T 세포로부터의 평균으로서 결정된다. 일부 구현예에서, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현의 증가는 적어도 5명 또는 적어도 10명의 상이한 건강한 공여자로부터의 T 세포를 사용하여 수행된 실험으로부터, 또는 적어도 5명 또는 적어도 10명의 상이한 건강한 공여자로부터의 T 세포의 풀로부터의 평균으로서 결정된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 Treg 세포의 존재 하에서도 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 CD71 발현을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 시험관내 및/또는 생체내에서 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 내의 pSTAT5 발현을 증가시킨다. pSTAT5 발현은 T 세포 활성화를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 시험관내에서 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 내의 pSTAT5 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 부재 하에 pSTAT5 발현에 비해 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 pSTAT5 발현을 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 Treg 세포의 존재 하에 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 pSTAT5 발현을 증가시킨다. CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 내의 pSTAT5 발현의 증가는 당업계의 임의의 방법, 예를 들어, 본원의 실시예에 제공된 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 Treg 세포의 존재 하에서도 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 내의 pSTAT5 발현을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 시험관내 및/또는 생체내에서 NK 세포 내의 pSTAT5 발현을 증가시킨다. pSTAT5 발현은 NK 세포 활성화를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 시험관내에서 NK 세포 내의 pSTAT5 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 부재 하에 pSTAT5 발현에 비해 NK 세포 상의 pSTAT5 발현을 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 Treg 세포의 존재 하에 NK 세포 내의 pSTAT5 발현을 증가시킨다. NK 세포 내의 pSTAT5 발현의 증가는 당업계의 임의의 방법, 예를 들어, 본원의 실시예에 제공된 방법에 의해 결정될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 조절 T 세포(Treg)의 억제 활성을 감소시키거나 약화시킨다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 Treg 억제 활성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 또는 적어도 50% 감소시킨다. 통상적인 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 상의 Treg 억제 활성의 감소는 당업계의 임의의 방법, 예를 들어, 본원의 실시예에 제공된 방법에 의해 결정될 수 있다. 비제한적인 예시적인 분석은 다음과 같다. Treg 및 CD4⁺ T 세포는 형광성 증식 세포 염료로 상이하게 표지된 후 건강한 인간 공여자 PBMC로부터 단리된다. CD4⁺ T 세포는 항-CD3 항체로 자극되는 반면, Treg 세포는 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드의 존재하에 인큐베이션된다. 2개의 T 세포 집단은 3일 동안 공동 배양되고, CD4⁺ T 세포의 증식 및 활성화는 유세포 분석법에 의해 모니터링된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는, 예를 들어, Treg 세포의 존재하에서 그러나 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드의 부재하에 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 활성화 및 증식과 비교하여, Treg 세포의 존재하에 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 활성화 및 증식을 증가시킨다.

폴리펩타이드 발현 및 생산

변형된 IL-2 함유 결합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 따라서, 다양한 구현예에서, 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 변형된 IL-2 및 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 코딩한다. 다양한 구현예에서, 핵산 분자는 변형된 IL-2 및 Fc 영역 및, 선택적으로, 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 코딩한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 이종이량체화를 위해 설계된 돌연변이, 예컨대 "노브" 또는 "홀" 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2, 적어도 하나의 항원 결합 도메인, 및 Fc 영역을 포함하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자가 제공되며, 여기서 Fc 영역은 적어도 하나의 항원 결합 도메인의 C-말단에 융합되고, 변형된 IL-2는 Fc 영역의 C-말단에 융합된다. 임의의 전술한 구현예에서, 핵산 분자는 또한 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 리더 서열을 코딩할 수 있고, 이 리더 서열은 분비된 폴리펩타이드에 존재하지 않도록 전형적으로 절단된다. 리더 서열은 천연 중쇄(또는 VHH) 리더 서열일 수 있거나, 또는 또 다른 이종 리더 서열일 수 있다.

핵산 분자는 당업계의 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 제작될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 선택된 숙주 세포에서 발현하는 데 적합한 발현 벡터이다.

본원에 기재된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 이러한 벡터는, 비제한적으로, DNA 벡터, 파아지 벡터, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 원하는 세포 유형, 예컨대 293F, CHO, 또는 CHO 유래 세포에서의, 또는 NSO 세포에서의 폴리펩타이드의 발현을 위해 최적화된 벡터가 선택된다. 예시적인 이러한 벡터는, 예를 들어, 문헌[Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889(2004)]에 기재되어 있다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포에서; 또는 진핵 세포, 예컨대 진균 세포(예컨대 효모), 식물 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 발현은, 예를 들어, 당업계에 공지된 절차에 따라 수행될 수 있다. 폴리펩타이드를 발현하는 데 사용될 수 있는 예시적인 진핵 세포는, 비제한적으로, COS 7 세포를 포함하는 COS 세포; 293F 세포를 포함하는 293 세포; CHO-S, DG44. Lec13 CHO 세포, 및 FUT8 CHO 세포를 포함하는 CHO 세포; PER.C6^® 세포(Crucell); 및 NSO 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 효모에서 발현될 수 있다. 예컨대, 미국 공개 US 제2006/0270045호 A1을 참고한다. 일부 구현예에서, 특정 진핵 숙주 세포는 폴리펩타이드에 대한 원하는 번역후 변형을 만드는 그의 능력에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CHO 세포는 293F 세포에서 생산된 동일한 폴리펩타이드보다 더 높은 수준의 시알릴화를 갖는 폴리펩타이드를 생산한다.

하나 이상의 핵산(예컨대, 벡터)을 원하는 숙주 세포 내로 도입하는 것은 비제한적으로, 인산 칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질 매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 등을 포함하는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 비제한적인 예시적인 방법은, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)]에 기재되어 있다. 핵산은 임의의 적합한 방법에 따라 원하는 숙주 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염될 수 있다.

본원에 기재된 임의의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포에서 발현된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 임의의 적합한 방법에 의해 정제될 수 있다. 이러한 방법은, 비제한적으로, 친화성 매트릭스 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피의 사용을 포함한다. 적합한 친화성 리간드는 ROR1 ECD 및 Fc 영역에 결합하는 제제를 포함한다. 예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 또는 항체 친화성 컬럼이 Fc 영역에 결합하고 Fc 영역을 포함하는 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 정제하는 데 사용될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피, 예를 들어, 부틸 또는 페닐 컬럼이 또한 항체와 같은 일부 폴리펩타이드를 정제하는 데 적합할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피)가 또한 항체와 같은 일부 폴리펩타이드를 정제하는 데 적합할 수 있다. 혼합 방식 크로마토그래피(예를 들어, 역상/음이온 교환, 역상/양이온 교환, 친수성 상호작용/음이온 교환, 친수성 상호작용/양이온 교환 등)가 또한 항체와 같은 일부 폴리펩타이드를 정제하는 데 적합할 수 있다. 폴리펩타이드를 정제하기 위한 많은 방법은 당업계에 알려져 있다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 무세포 시스템에서 생산된다. 비제한적인 예시적인 무세포 시스템은, 예를 들어, 문헌[Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44(2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45(2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713(2003)]에 기재되어 있다.

일부 구현예에서, 상기 기재된 방법에 의해 제조된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 제조된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 무세포 시스템에서 제조된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 정제된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다.

일부 구현예에서, 상기 기재된 방법에 의해 제조된 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 숙주 세포에서 제조된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 무세포 시스템에서 제조된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 정제된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 포함한다.

변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 사용하여 질환을 치료하는 예시적인 방법

일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 질환은 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포의 증식 및 활성화를 증가시키는 것으로부터 이익을 얻을 임의의 질환을 포함한다. 일부 구현예에서, 개체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 치료 방법은 인간 또는 동물 내일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드로 치료될 수 있는 비제한적인 예시적인 암은 기저 세포 암종, 담도암; 방광암; 골암; 뇌 및 중추신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장 및 직장암; 결합 조직 암; 소화기계의 암; 자궁내막암; 식도암; 안암; 두경부암; 위암; 소화기암; 교모세포종; 간암종; 간종양; 상피내 신생물; 신장 또는 신암; 후두암; 간암; 폐암; 소세포 폐암; 비비소세포 폐암; 폐의 선암종; 폐의 편평상피암; 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암; 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막아세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡기계의 암; 타액선 암종; 육종; 피부암; 편평 세포 암; 위장암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 및 외음부암; 림프종; 호지킨 림프종; 비호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 병변 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 및 만성 골수아구성 백혈병을 포함한다.

변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 대상체에게 필요에 따라 투여될 수 있다. 투여 빈도의 결정은 치료되는 병태, 치료되는 대상체의 연령, 치료되는 병태의 중증도, 치료되는 대상체의 건강의 일반 상태 등의 고려에 기초하여 주치의와 같은 당업자에 의해 이뤄질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드의 유효량은 대상체에게 1회 이상 투여된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드의 유효량은 대상체에게 매일, 주 2회, 매주, 2주마다, 매월 1회 등으로 투여된다. 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드의 유효량은 대상체에게 적어도 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드의 유효량은 적어도 1개월, 적어도 6개월, 또는 적어도 1년의 과정에 걸쳐 수 회를 포함하는 수 회로 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 암을 치료(예방 포함)하고/거나 T 세포 증식을 증가시키는 데 효과적인 양으로 투여된다. 치료적 유효량은 전형적으로 치료되는 대상체의 체중, 그의 신체적 또는 건강 상태, 치료될 병태의 범위, 또는 치료되는 대상체의 연령에 의존한다. 일반적으로, 폴리펩타이드는 용량당 약 0.05 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중 범위의 양으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 용량당 약 10 μg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 용량당 약 50 μg/kg 체중 내지 약 5 mg/kg 체중 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 용량당 약 100 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 용량당 약 100 μg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 용량당 약 0.5 mg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 용량당 약 0.5 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 용량당 약 0.05 mg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 용량당 약 0.05 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중 범위의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 약 5 mg/kg 체중 이하, 예를 들어 4 미만, 3 미만, 2 미만, 또는 1 mg/kg 미만의 항체 범위의 양으로 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는, 비제한적으로, 정맥내, 동맥내, 비경구, 복강내 또는 피하를 포함하는 다양한 경로에 의해 생체내에서 투여될 수 있다. 적절한 제제 및 투여 경로는 의도된 응용에 따라 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 사용한 치료는 T 세포 증식 및/또는 활성화를 증가시킴으로써 달성된다. 일부 구현예에서, T 세포 증식 및/또는 활성화를 증가시키는 것은 암의 성장을 억제한다.

약제학적 조성물

일부 구현예에서, 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 광범위한 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제제로 제공된다(예를 들어, Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd ed., Pharmaceutical Press (2000) 참고). 비히클, 보조제, 및 희석제를 포함하는 다양한 약제학적으로 허용가능한 담체가 이용가능하다. 더욱이, 다양한 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제, 안정화제, 습윤제 등이 또한 이용가능하다. 비제한적인 예시적인 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/mL, 175 mg/mL, 200 mg/mL, 225 mg/mL, 또는 250 mg/mL의 농도의 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 포함한다.

조합 요법

변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 단독으로 또는 다른 항암제와 같은 다른 치료 방식과 조합하여 투여될 수 있다. 이들은 다른 치료 방식 전에, 실질적으로 동시에, 또는 후에(즉, 동시에 또는 순차적으로) 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법은 방사선 요법, 화학요법, 백신접종, 표적화된 종양 요법, CAR-T 요법, 온콜리틱 바이러스 요법, 암 면역요법, 사이토카인 요법, 외과적 절제술, 크로마틴 변형, 절제, 냉동요법, 종양 표적에 대한 안티센스 제제, 종양 표적에 대한 siRNA 제제, 종양 표적에 대한 microRNA 제제 또는 항암/종양제, 또는 생물학적 제제, 예컨대 항체, 사이토카인, 또는 수용체 세포외 도메인-Fc 융합을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 제2 치료제, 예를 들어, PD-1 항체와 동시에 제공된다. PD-1 항체의 예는 니볼루맙(BMS); 펨브롤리주맙(Merck); AMP-514(Amplimmune); TSR-042(Tesaro/AnaptysBio, ANB-011); STI-A1110(Sorrento Therapeutics); 및 프로그램화된 사멸-1(PD-1)에 대한 다른 제제를 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 제2 치료제, 예를 들어, PD-L1 요법과 동시에 제공된다. PD-L1 요법의 예는 피딜리주맙(CureTech, CT-011); 두르발루맙(Medimmune/AstraZeneca); 아테졸리주맙(Genentech/Roche); 아벨루맙(Pfizer); AMP-224(Amplimmune); BMS-936559(Bristol-Myers Squibb); STI-A1010(Sorrento Therapeutics); 및 프로그램화된 사멸-1 리간드(PD-L1)에 대한 다른 제제를 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드는 CAR-T (키메라 항원 수용체 T 세포) 요법, 온콜리틱 바이러스 요법, 사이토카인 요법, 및/또는 다른 체크포인트 분자, 예컨대 VISTA, gpNMB, B7H3, B7H4, HHLA2, CD73, CTLA4, TIGIT 등을 표적화하는 제제와 동시에 제공된다.

진단 및 치료의 비제한적인 예시적인 방법

일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 대상체 및/또는 대상체(예컨대, 암 환자)로부터의 시료를 평가하는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 평가는 진단, 예후, 및/또는 치료에 대한 반응 중 하나 이상이다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 단백질의 존재, 부재, 또는 수준을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 핵산의 존재, 부재, 또는 발현 수준을 평가하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 조성물은 이러한 측정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 종양의 시료 또는 종양으로부터 배양된 세포를 본원에 기재된 치료제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 평가는 치료(폴리펩타이드 본원에 기재된 폴리펩타이드를 이용한 치료 포함)를 지시할 수 있다. 일부 구현예에서, 평가는 절제 후 보조 요법의 사용 또는 보류를 지시할 수 있다. 보조 치료로도 불리는 보조 요법은 1차, 주요 또는 초기 치료에 추가하여 제공되는 치료이다. 비제한적인 예로서, 보조 요법은 모든 검출가능한 질환이 제거되었지만 잠재 질환으로 인한 재발의 통계적 위험이 남는 수술 후에 일반적으로 제공되는 추가적인 치료일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 암 치료에서 보조 요법으로서 사용된다. 일부 구현예에서, 항체는 암 치료에서 유일한 보조 요법으로서 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 암 치료에서 보조 요법으로서 보류된다. 예를 들어, 환자가 본원에 기재된 항체에 반응할 가능성이 낮거나 최소 반응을 가지면, 삶의 질을 위해 그리고 비효과적인 화학요법으로부터 불필요한 독성을 피하기 위해 치료가 투여될지 않을 수 있다. 이러한 경우, 완화 치료가 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 절제 전에 신보조 요법으로서 투여된다. 일부 구현예에서, 신보조 요법은 임의의 수술 전에 종양을 축소 및/또는 약화시키는 요법을 지칭한다. 일부 구현예에서, 신보조 요법은 수술 전에 암 환자에게 투여되는 화학요법을 의미한다. 일부 구현예에서, 신보조 요법은 폴리펩타이드가 수술 전에 암 환자에게 투여되는 것을 의미한다. 신보조 화학요법이 일반적으로 고려되는 암의 유형은, 예를 들어, 유방, 결장직장, 난소, 자궁경부, 방광, 및 폐를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 암의 치료에서 신보조 요법으로서 사용된다. 일부 구현예에서, 사용은 절제 전이다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에서 고려되는 종양 미세환경은 종양 혈관구조; 종양 침윤 림프구; 섬유아세포 망상 세포; 내피 선조 세포(EPC); 암 관련 섬유아세포; 혈관주위세포; 다른 간질 세포; 세포외 매트릭스(ECM)의 구성요소; 수지상 세포; 항원 제시 세포; T 세포; 조절 T 세포; 대식세포; 호중구; 및 종양에 근접하여 위치한 다른 면역 세포 중 하나 이상이다.

키트

또한 본원에 기재된 바와 같은 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드 중 어느 것, 및 적합한 패키지를 포함하는 제조 물품 및 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 (i) 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드, 및 (ii) 변형된 IL-2 함유 폴리펩타이드를 개체에게 투여하기 위해 키트를 사용하기 위한 설명서를 갖는 키트를 포함한다.

본원에 기재된 조성물을 위한 적합한 패키지는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 바이알(예컨대, 밀봉된 바이알), 용기, 앰플, 병(bottle, jar), 가요성 패키지(예컨대, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 비닐백) 등을 포함한다. 이러한 제조 물품은 추가로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다. 또한 본원에 기재된 조성물을 포함하는 단위 투여 형태가 제공된다. 이러한 단위 투여 형태는 단일 또는 다수의 단위 투여량으로 적합한 패키지에 보관될 수 있고, 또한 추가로 멸균 및 밀봉될 수 있다. 본 발명의 키트에 제공되는 설명서는 전형적으로 표지 또는 패키지 삽입물(예컨대, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 작성된 설명서이지만, 기계 판독가능한 설명서(예컨대, 자성 또는 광학 저장 디스크에 포함된 설명서)도 허용가능하다. 항체의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로 의도된 치료 또는 산업적 사용을 위한 투여량, 투여 일정, 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 키트는 적합한 개체 또는 치료를 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다.

용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예컨대, 다중 용량 패키지) 또는 하위단위 용량일 수 있다. 예를 들어, 약 1주, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월 이상 중 어느 것과 같은 연장된 기간 동안 개체에게 효과적인 치료를 제공하기 위해 본원에 개시된 분자의 충분한 투여량을 함유하는 키트가 또한 제공될 수 있다. 키트는 또한 분자의 다중 단위 용량 및 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있고 약국, 예를 들어 병원 약국 및 조제 약국에서 보관 및 사용하기에 충분한 양으로 패키징될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 일반적으로 폴리펩타이드의 안정한 수성 현탁액을 형성하기 위해 재구성, 재현탁, 또는 재수화될 수 있는 건조(예컨대, 동결건조된) 조성물을 포함한다.

실시예

하기 논의된 실시예는 본 발명을 전적으로 예시하는 것으로 의도되며 본 발명을 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 실시예는 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대해 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만, 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.

실시예 1: IL-2의 P65R 돌연변이는 본질적으로 CD25 결합을 제거한다

IL-2 돌연변이체를 입체 폐색(steric occlusion)(P65R 및 P65E)을 통해 CD25 인터페이스를 파괴하도록 설계하였고, IL-2 수용체의 하나 이상의 구성요소(CD25, CD122, 및/또는 CD132)로 일시적으로 형질감염된 293F 세포에의 결합에 대해 시험하였다. 돌연변이체를 CD25에 대한 감소된 친화성을 갖는 것으로 보고된 돌연변이체인 IL-2-F42K와 비교하였다. "노브(knob)" Fc의 N-말단에 융합되고 "홀(hole)" Fc(서열번호: 44)와 복합체화된 야생형 인간 IL-2(서열번호: 32), IL-2-F42K(서열번호: 33), IL-2-P65R(서열번호: 35), 또는 IL-2-P65E(서열번호: 34)를 포함하는 융합 단백질의 증가하는 농도를 형질감염된 293F 세포에 첨가하고 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다.

결합을 실질적으로 다음과 같이 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 세포를 200 μL의 FACS 완충액(PBS, 2% FBS, 0.05% 나트륨 아지드)에서 1회 세척하고, 세포 펠렛을 100 μl의 표면 마커 염색 용액(FACS 완충액에서 1:300 희석에서 A647 접합된 항-인간 Fcg 2차 항체 함유)에 재현탁시켰다. 세포를 최종 세척 전에 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하고, 유세포 분석기 상에서 분석하였다. 세포 파편을 FSC/SSC 크기 배제에 의해 제외시키고, 죽은 세포를 그들의 양성 프로피듐 아이오다이드 신호에 기초하여 제외시켰다. FSC-A/FSC-H 이중체(doublet) 및 응집체 배제를 사용하여 단일 세포를 선택하였다. 일시적으로 형질감염된 세포는 또한 세포질 EGFP를 발현하였고, FL1 양성인 세포를 분석하였다. 항-인간 2차 항체의 MFI 수준 증가는 IL-2 결합을 나타내었다. FlowJo 소프트웨어를 세포 집단의 분석에 사용하였다. 이후, 각 마커에 대한 원시 평균 형광 강도("MFI")를 내보내고, 엑셀 및 그래프패드 프리즘을 사용하여 분석하였다. 값을 그래프화하고, 적정 곡선을 피팅하여 비선형 회귀 1-부위 -- 총 곡선 피트를 사용하여 용량-반응 관계를 평가하였다.

도 2a-c에 나타낸 바와 같이, IL-2-P65E 변이체를 포함하는 융합 단백질은 야생형 IL-2를 포함하는 융합 단백질에 비해 IL-2R에 대해 약간 감소된 친화성을 나타내었다. IL-2 F42K를 포함하는 융합 단백질은 IL-2-P65E를 포함하는 융합 단백질보다 더 낮은 친화성을 나타낸 반면, IL-2-P65R을 포함하는 융합 단백질은 이종삼량체성 IL-2R에 대해 가장 낮은 친화성을 나타내었다(도 2a). 더욱이, IL-2-P65R을 포함하는 융합 단백질은 CD25/CD132에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않았고 CD25/CD122에 단지 약하게 결합한 반면(도 2c), IL-2-F42K를 포함하는 융합 단백질은 CD25/CD132에 대해 약간의 친화성을 유지하였고(도 2b), IL-2-P65R을 포함하는 융합 단백질보다 더 큰 친화성으로 CD25/CD122에 결합하였다(도 2b 및 2c). 따라서, P65R에서 돌연변이된 IL-2는 IL-2 수용체를 함유하는 CD25에 대한 결합을 유의하게 감소시켰다.

실시예 2: CD122에 대한 친화성을 감소시키는 IL-2 변형

실시예 1에 언급된 바와 같이, P65R IL-2 돌연변이를 입체 폐색을 통해 CD25 인터페이스를 파괴하도록 설계하였다. 또한, IL-2 돌연변이를 특정 접촉 잔기 상호작용(예컨대, D84S, E95Q, M23A, H16A, 및 E15S)의 제거를 통해 CD122 인터페이스에 대한 친화성을 감소시키도록 설계하였다. 단일 또는 이중 돌연변이체를 IL-2R에 대한 1가 IL-2 결합을 위해 이종이량체성 Fc의 "노브" 절반("홀" Fc 서열번호: 44를 포함하는 디설파이드 안정화된 노브 인투 홀(knob into hole))의 N-말단에 융합시켰다. 293F 세포를 CD25 및 CD122로 일시적으로 형질감염시킴으로써 상대적 결합 친화성을 평가하였다(CD132를 이용한 공동 형질감염은 유사한 결과를 나타내었지만, 추가 결합 결합력은 관찰된 친화성의 차이를 감소시켰음). 결합된 IL-2-Fc 융합 단백질을 형광성 항-인간 2차 항체로 검출하고, 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 분석법에 의해 분석하였다.

도 3a-3b에 나타낸 바와 같이, CD122 인터페이스(서열번호: 36-39 및 )에 돌연변이와 함께 F42K를 혼입하는 이중 IL-2 돌연변이체를 포함하는 모든 융합 단백질은 IL-2-F42K-E15S(서열번호: 85)를 제외하고, 단일 돌연변이체 IL-2-F42K(서열번호: 33)를 포함하는 것에 비해 CD25/CD122에 대해 감소된 결합 친화성을 나타내었다.

실시예 3: IL-2-RAS( P65R , H16A , 및 D84S )는 IL-2R의 삼량체성 및 이량체성 형태의 맥락에서 CD122에 대해 감소된 친화성을 갖는다

실시예 2에 기재된 CD122 친화성을 감소시키는 돌연변이를 P65R 돌연변이와 조합하여 IL-2 이중 및 삼중 돌연변이체를 제작하였다. IL-2 돌연변이체를 이종이량체성 Fc의 "노브" 절반의 N-말단에 융합시키고, IL-2 수용체(IL-2R)에 대한 1가 IL-2 결합을 위해 서열번호: 44를 포함하는 "홀" Fc와 쌍을 이루게 하였다. 생성된 융합 단백질의 상대적 결합 친화성을 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 IL-2R 하위단위로 일시적으로 형질감염된 293F 세포 상에서 평가하였다.

야생형 IL-2(서열번호: 32)를 포함하는 융합 단백질과 비해, IL-2-P65R-H16A(서열번호: 41)를 포함하는 융합 단백질 및 IL-2-P65R-D84S(서열번호: 42)를 포함하는 융합 단백질은 CD122/CD132(이종이량체성 IL-2R)(도 4a) 및 이종삼량체성 IL-2R(도 4b) 모두에 대해 감소된 친화성을 가진 반면, 삼중 돌연변이체, IL-2 P65R-H16A-D84S("IL-2-RAS", 서열번호: 43)를 포함하는 융합 단백질의 친화성은 훨씬 더 약화되었다(도 4a-4b). 최대 결합 및 EC₅₀ 모두에서 이들 IL-2 돌연변이체에 대해 관찰된 결합의 이동은 이들 돌연변이가 온 속도(EC₅₀에서 오른쪽 이동) 및 오프 속도(감소된 최대 결합)를 감소시켰음을 시사한다.

실시예 4. IL-2-RAS는 휴지기 T 세포 및 사전 활성화된 T 세포에 대해 감소된 친화성을 갖는다

T 세포를 단리하기 위해, 비-T 세포 집단을 실온에서 20분 동안 CD14, CD16, CD19, CD20, CD36, CD56, CD123, TCRγ/δ(BioLegend)에 대한 바이오틴화된 항-계통 마커 항체로 표지하였다. 이후, 실온에서 20분 동안 자성 스트렙타비딘 입자(100x10⁶당 500 μl 비드 슬러리 + 500 μl 세포 현탁액, 자석 상에서 2x8분 인큐베이션)와 함께 인큐베이션하여 비-T 세포 집단을 고갈시켰다. 결합되지 않은 세포 상층액은 단리된 T 세포를 함유하였다.

단리된 T 세포 중 일부(3 mL에서 5.5 x 10⁶)를 1 μg/ml 항-CD3 OKT3 항체(BD Biosciences)로 사전 코팅된 6웰 플레이트에서 2일 동안 인큐베이션하여 활성화시킨 다음, PBS/2% FBS로 세척하고, RPMI + 10% FBS에서 2x10⁶/mL로 1일 동안 휴지시켰다. 휴지기 또는 사전 활성화된 T 세포를 결합 분석에 직접 사용하였다. 휴지기 또는 사전 활성화된 T 세포에 대한 비표적화 VHH-Fc 아이소타입 대조군 및 이종이량체성 Fc에 연결된 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 IL-2-RAS 또는 야생형 IL-2를 포함하는 융합 단백질의 결합을 하기 2차 항체를 사용한 것을 제외하고 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 분석법에 의해 측정하였다: AF647 항-인간 Fc(1:1000), PI(1:2000), BV785-CD4(1:300), APC/Fire-CD8(1:500) 및 PE/Cy7-CD25(1:100).

비표적화된 IL-2-RAS 융합 단백질(서열번호: 46 포함)은 비표적화 VHH 도메인 및 야생형 IL-2(서열번호: 45 포함)를 포함하는 융합 단백질과 비교하여 휴지기(도 5a) 및 사전 활성화된(도 5b) T 세포에 감소된 친화성으로 결합하였다. IL-2를 포함하지 않는 아이소타입 대조군은 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이 휴지기 또는 사전 활성화된 T 세포에 결합하지 않았다.

실시예 5: IL-2-RAS는 Treg에 대해 감소된 친화성을 갖는다

조절 T 세포("Treg")는 CD25뿐만 아니라 CD122 및 CD132의 높은 내인성 발현을 가지며, 야생형 IL-2에 대해 매우 반응성이다. 비표적화된 VHH의 이종이량체성 Fc(디설파이드 안정화된 노브 인투 홀)의 "노브" 절반의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2(서열번호: 45 포함) 또는 IL-2-RAS 삼중 돌연변이체(서열번호: 46 포함)를 포함하는 융합 단백질의 Treg에 대한 결합을 측정하였다.

Treg 및 CD4+ T 반응자 세포(Tresp)를 제조사의 지침에 따라 EasySep 인간 CD4⁺CD127^lowCD25⁺ 조절 T 세포 단리 키트(Stemcell)를 사용하여 신선하고 건강한 공여자 PBMC로부터 농축 및 단리하였다. Treg를 rhTGF-B1, 올-트랜스 레티노산, CD3/CD28 T 세포 활성제 및 IL-2가 보충된 ImmunoCult-XF T 세포 확장 배지에서 7일 배양을 통해 나이브 CD4+ T 세포로부터 생성하였다.

세포의 두 집단을 구별하기 위해, 농축된 Treg 및 CD4⁺ 반응자 T 세포를 37℃에서 10분 동안 각각 증식 염료 CellTrace Violet(CTV) 및 CFSE로 표지화하였다. 세척 후, Treg 및 CD4⁺ T 세포를 10% FBS 및 1X 항생제/항진균제가 보충된 RPMI에서 1.5x10⁶ 세포/ml로 재현탁시켰다. Treg를 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 75,000 Treg/웰을 생성하는 50 μl 부피로 시딩하였다. Treg를 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 분석법에 의해 10 nM의 IL-2-RAS의 존재 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 야생형 IL-2를 포함하는 융합 단백질과 대조적으로, IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질은 PBMC(도 6a), 유도된 Treg(도 6b), 또는 CD4+ Tresponder(도 6c)로부터 농축된 Treg에 대해 관찰가능한 결합을 나타내지 않았다.

실시예 6: IL-2-RAS는 휴지기 T 세포 상에서 감소된 활성을 갖는다

T 세포를 실질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 자성 비드 분리에 의해 단리하고, CellTrace Violet(CTV)으로 표지화하고, 이종이량체성 Fc에 연결된 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2(서열번호: 45 포함) 또는 IL-2-RAS(서열번호: 46 포함)를 포함하는 융합 단백질로 처리하였다. CD4, CD8, CD71, 및 CTV의 수준을 유세포 분석법에 의해 측정하였다. 증식하는 T 세포는 감소된 CTV 수준을 갖는다.

도 7a 및 도 7c에 나타낸 바와 같이, 휴지기 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 유도하는 데 필요한 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질의 농도는 증식의 동일한 유도를 달성하는 데 필요한 야생형 IL-2를 포함하는 융합 단백질의 농도 또는 IL-2v-유사체를 포함하는 융합 단백질의 농도보다 100배 넘게 높았다.

도 7b 및 도 7d에 나타낸 바와 같이, CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에서 T 세포 활성화의 마커인 CD71 발현을 유도하는 데 필요한 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질의 농도는 활성화의 동일한 유도를 달성하는 데 필요한 야생형 IL-2 또는 IL-2v-유사체를 포함하는 융합 단백질의 농도보다 적어도 100배 더 높았다.

T 세포 활성화는 활성화된 T 세포에서 증가되는 인산화된 STAT5 수준에 의해 측정될 수 있다. T 세포를 자성 비드 분리에 의해 단리하고, 이종이량체성 Fc를 포함하는 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2(서열번호: 45 포함)를 포함하는 융합 단백질 또는 이종이량체성 Fc를 포함하는 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 IL-2-RAS(서열번호: 46 포함)를 포함하는 융합 단백질로 15분 동안 처리하였다. 세포를 BD Cytofix/Cytoperm™(BD Biosciences)로 고정하고, 90% 빙냉 메탄올에서 투과시키고, CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 인산화된 STAT5("pSTAT5")의 수준을 항-pSTAT5-PE 항체(1:70)를 사용한 유세포 분석법을 사용하여 측정하였다. 세포를 하기 항체로 공동 염색하였다: 항-CD3-FITC(1:200), CD56-BV421(1:100), CD4-BV785(1:200), CD8-APC-Fire(1:300).

도 7e 및 도 7f에 나타낸 바와 같이, 비표적화된 IL-2-RAS 융합 단백질은 시험된 최고 농도에서도 휴지기 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 STAT5의 최소 인산화를 달성한 반면, 비표적화된 IL-2-야생형 융합 단백질은 시험된 최고 농도보다 1000배 넘게 낮은 농도에서 STAT5 인산화를 유도하였다.

실시예 7: IL-2 돌연변이체는 Treg에서 감소된 활성을 갖는다

Treg를 EasySep™ 인간 CD4+CD127lowCD25+ 조절 T 세포 단리 키트(Stemcell)를 사용하여 PBMC로부터 단리하였다. Treg를 CellTrace Violet으로 표적화하고, 100 μl의 RPMI/10% FBS에서 웰(96웰, U-바닥)당 0.15x10⁶ 세포로 플레이팅하였다. 세포를 100 nM에서 시작하여 100 μl의 융합 단백질 적정과 조합하여, 1:4로 적정하였다. 세포를 7일 동안 인큐베이션하였다. 7일에, 하기 항체를 사용한 것을 제외하고 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 분석법(Novocyte)에 의해 증식 및 활성화 마커 CD25를 측정하였다: BV785-CD4(1:300), APC/Fire-CD8(1:500) PE/Cy7-CD25(1:100), PI(1:2000).

도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, 이종이량체성 Fc에 연결된 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2(서열번호: 45 포함)를 포함하는 융합 단백질은 Treg 증식 및 활성화 마커 CD25의 발현을 유도하였지만, 야생형 IL-2(서열번호: 46 포함) 대신에 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질은 그렇지 않았다.

실시예 8: PD-1을 발현하는 활성화된 T 세포는 PD-1- 표적화된 IL-2-RAS에 의해 자극된다

PD-1 발현 T 세포에 결합하고 이를 자극시키는 능력을 펨브롤리주맙(항-PD-1 통상적인 항체) 및 펨브롤리주맙 유사체 및 중쇄의 C-말단에 연결된 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 시험하였다(도 1f 참고).

건강한 공여자로부터의 농축된 T 세포를 실질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 활성화시켰다. 6웰 플레이트를 4℃에서 1 μg/ml OKT3 항체로 밤새 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 2회 세척하여 결합되지 않은 OKT3 항체를 제거하였다. 농축된 T 세포를 CTL 배지를 사용하여 해동하고, 완전 RPMI에서 5.5 x 10⁶ 세포/mL로 재현탁하고, 코팅된 플레이트에서 웰당 3 mL로 시딩하였다. 2일 후, 활성화된 T 세포를 수집하고, 1회 세척한 후, OKT3 항체가 없는 배지에 24시간 동안 플레이팅하여 휴지시켰다. 세포를 증식 염료 CellTrace™ Violet(CTV)으로 표지화하였다. T 세포를 계수한 다음, 2x10⁶ 세포/mL로 재현탁시켰다. 100 μL의 재현탁된 세포를 96웰 둥근 바닥 플레이트에 웰마다 시딩하였다. 펨브롤리주맙 또는 펨브롤리주맙 유사체-IL-2-RAS 융합을 100 nM의 최종 농도에서 시작하여 첨가하고 1:5로 적정하였다. 3일에, T 세포를 생존력 마커 PI 및 하기 형광 표지된 항체로 실온에서 20분 동안 염색하였다: CD4-BV785, CD8-APC/Fire, CD25-PE/Cy7, CD71-FITC, 및 CD69-APC. 플레이트를 증식의 측정을 위해 실질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 그리고 결합을 위해 실시예 1에서와 같이 Novocyte 유세포 분석기 상에서 판독하였고, 데이터를 추가 분석을 위해 엑셀로 내보냈다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 펨브롤리주맙 유사체-IL-2-RAS 융합 단백질은 CD8+ T 세포 증식(도 9a) 및 CD4+ T 세포 증식(도 9b)을 자극한 반면, 펨브롤리주맙 단독은 그렇지 않았다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않지만, 관찰된 증식의 2상(biphasic) 성질은 저농도에서의 활성이 PD-1-표적화된 활성에 기인하고, 고농도에서의 증가된 활성이 비표적화된 활성에 기인한다는 것을 시사할 수 있다. 도 9c 및 9d에 나타낸 바와 같이, IL-2R에 대한 IL-2-RAS 결합에 의해 매개되었을 수 있는 10 nM 초과의 희석 범위의 상단에서 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질에 대해 추가의 결합이 관찰된 것을 제외하고, 펨브롤리주맙 및 펨브롤리주맙 유사체-IL-2-RAS 모두는 유사한 친화성으로 활성화된 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 결합하였다.

실시예 9: 활성화된 T 세포 상에서 PD-1을 사전 차단하는 것은 PD-1 표적화된 IL-2-RAS에 의한 신호전달을 방지한다

T 세포를 자성 비드 분리에 의해 건강한 공여자로부터 단리 및 농축하고, 실질적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 OKT3 항체로 코딩된 플레이트 상에서 인큐베이션하여 이들을 활성화시켰다. 세포를 CTV로 표지화하였다. 사전 활성화된 T 세포를 PD-1 결합 부위를 차단하기 위해 항-PD-1 항체인 펨브롤리주맙, 또는 대조군으로서 비표적화된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 펨브롤리주맙 유사체에 융합된 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질, 또는 대조군으로서 비표적화 항체에 융합된 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질과 3일 동안 인큐베이션하였다. IL-2 신호전달의 정도를 실질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 유세포 분석법에 의해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 측정함으로써 평가하였다.

도 10a-10d에 나타낸 바와 같이, 야생형 IL-2는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 모두의 강력한 증식을 유도한 반면, 펨브롤리주맙 또는 IL-2-RAS 및 비표적화 항체를 포함하는 융합 단백질로 처리된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 PD-1의 사전 차단에 의해 영향을 받지 않은 낮은 수준의 증식을 나타내었다. 대조적으로, IL-2-RAS 및 펨브롤리주맙 유사체를 포함하는 융합 단백질로 처리된 CD4+ T 세포(도 10b 및 10d) 및 CD8+ T 세포(도 10a 및 10c)는 유의한 PD-1 의존적 증식(도 10a 및 10b)을 나타내었고, 이는 항-PD-1 항체(도 10c 및 10d)와의 사전 인큐베이션에 의해 차단되었다. 따라서, IL-2-RAS 및 항-PD-1 항체를 포함하는 융합 단백질은 PD-1이 T 세포 상에서 발현되고 접근가능하게 될 때에만 T 세포를 활성화시켰다.

실시예 10: PD-1- 표적화된 IL-2-RAS는 Treg 억제를 극복한다

CD4+ T 반응자 세포 및 Treg를 실시예 5에 기재된 바와 같이 단리하였다. CD4+ 반응자 세포를 CTV로 표지화하고, 단리된 Treg과 2:1의 비율로 혼합하고, 항-CD3 비드(2개의 T 세포당 1개의 비드)로 활성화시켰다. 생성된 혼합물을 도 1b에 나타낸 바와 같이 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2, 도 1b에 나타낸 바와 같이 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질, 또는 항-PD-1 항체에 융합된 IL-2-RAS(펨브롤리주맙 유사체-IL-2-RAS)를 포함하는 융합 단백질의 희석 시리즈로 7일 동안 처리하였다. 증식을 실질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 유세포 분석법에 의해 측정하였다.

도 11에 나타낸 바와 같이, Tresponder 세포는 Treg에 의해 억제되었지만, 비표적화된 야생형 IL-2 및 IL-2-RAS 및 항-PD-1 항체를 포함하는 융합 단백질(펨브롤리주맙 유사체-IL-2-RAS)은 Treg의 존재에도 불구하고 CD4+ T 반응자 세포 증식을 유도하였다. 세포를 IL-2-RAS 및 비표적화된 항체를 포함하는 융합 단백질로 처리하는 것은 증식을 유사한 정도까지 구제하지는 못했다. 비표적화된 IL-2-RAS는 PD-1 표적화된 IL-2-RAS 융합 단백질보다 훨씬 더 높은 온도에서 Tresponder에 대한 Treg의 억제 효과를 반대할 수 있었다. 따라서, PD-1-표적화된 IL-2-RAS는 Treg의 억제 효과를 극복하였고, 이 활성은 T 세포 상에서 발현된 PD-1 결합에 의존하였다.

실시예 11: PD-1 표적화된 IL-2-RAS는 트랜스로 신호를 전달하지 않는다

비드를 제조사의 권장 코팅 절차에 따라 4 x 10⁸ 비드당 200 μg PD-1 항원으로 코팅한다. 간략하게, 비드를 완충액 1(0.1 M 인산나트륨 완충액, pH 7.4-8.0)에서 1회 세척한 다음, PD-1 항원을 함유하는 완충액 1에서 실온에서 18시간 동안 튜브 회전기에서 인큐베이션한다. 이후, 비드를 완충액 2(PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA pH 7.4)으로 4회 세척한다. 완충액 3(0.2 M Tris, 0.1% BSA, pH 8.5)에서 37℃에서 4시간 동안 비드를 인큐베이션하여 유리 토실기를 비활성시킨다. 이후, 비드를 완충액 2에서 1회 세척하고, 400x10⁶ 비드/mL의 농도로 재현탁시킨다.

코팅된 비드를 항-PD-1 항체에 융합된 야생형 IL-2 또는 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질과 함께 인큐베이션하고 세척한다. 이후, 비드를 단리된 휴지기 T 세포와 함께 인큐베이션한다. IL-2 신호전달을 유세포 분석법을 통해 pSTAT5 수준을 측정함으로써 평가한다.

비드에 결합된 야생형 IL-2를 포함하는 융합 단백질은 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 강력하게 활성화하는 반면, 비드에 결합된 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질은 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 상에서 시험된 최고 농도까지 활성을 갖지 않는다. 따라서, IL-2-RAS의 T 세포 표적화는 IL-2 신호전달에 필요하며, 표적화된 IL-2-RAS의 신호전달은 트랜스로 발생하지 않는다.

실시예 12: IL-2-RAS는 트랜스로 신호를 전달하지 않는다

1000 nM에서 시작하여 1:4로 희석된 비표적화된 야생형 IL-2의 희석 시리즈 및 비표적화된 IL-2-RAS의 희석 시리즈를 분석 플레이트 상에 코팅하고, 밤새 인큐베이션하고, 세척하였다. T 세포를 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 실질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 인산화된 STAT5 수준을 검출함으로써 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화를 측정하였다.

도 12a 및 12b에 나타낸 바와 같이, CD8+ 및 CD4+ T 세포는 pSTAT5 유도에 의해 측정된 바와 같이 트랜스로 야생형 IL-2에 의해 활성화되었으나, 비표적화된 IL-2-RAS는 트랜스로 활성화시킬 수 없었다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, CD25 및 CD122에 대한 IL-2-RAS의 감소된 친화성은 하류 신호전달을 유도하기 위해 IL-2R의 효율적인 결합 및 클러스터링을 방지했을 수 있다. 따라서, 표적화된 IL-2-RAS 융합 단백질만이 pSTAT5 신호전달을 유도한다.

실시예 13: NKp46 표적화된 IL-2-RAS는 NK 세포 증식을 특이적으로 유도한다

NK 세포, CD4+ T 세포, 및 CD8+ T 세포 상에서 도 1h에 나타낸 바와 같이 NKp46을 표적화하는 이종이량체성 scFv 항체의 C-말단에 융합된 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질, 도 1b에 나타낸 바와 같이 이종이량체성 Fc에 연결된 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 야생형 IL-2 또는 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질, 및 NKp46만을 표적화하는 이종이량체성 scFv 항체의 효과를 결정하였다.

건강한 공여자로부터의 신선한 PBMC를 CellTrace™ Violet으로 표지화하고, 200,000 세포/웰로 96웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 융합 단백질 및 NKp46 scFv-Fc 대조군의 희석액을 플레이트된 세포에 첨가하고, 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 7일에, 하기 항체를 사용한 것을 제외하고 실질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 세포 증식을 측정하였다: 항-CD3-BV785(1:200), 항-CD56-APC(1:100), 항-CD4-PE(1:200), 항-CD8-APC-Fire(1:300) 및 PI(1:2000).

또한, 건강한 공여자로부터의 신선한 PBMC를 동일한 융합 단백질 또는 NKp46 scFv-Fc 대조군으로 처리하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 및 NK 세포(CD3-, CD56+)에서의 pSTAT5 수준을 실질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 인산화된 STAT5 수준을 검출함으로써 측정하였다.

건강한 공여자로부터의 신선한 PBMC에 대한 융합 단백질 및 NKp46 scFV-Fc 대조군의 결합을 하기 항체를 사용한 것을 제외하고 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다: 항-CD3-FITC(1:100), 항-CD56-BV421(1:100), 항-CD4-BV785(1:200), 항-CD8-APC-Fire(1:300), 항-인간 IgG-Alexa Fluor 647(1:500), 및 PI(1:2000).

도 13a-13i에 나타낸 바와 같이, NKp46-표적화된 IL-2-RAS는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 영향을 미치지 않으면서 NK 세포 증식 및 활성화를 강력하게 활성화시켰다. 대조적으로, 비표적화된 야생형 IL-2는 시험된 모든 림프구(NK, CD4+, 및 CD8+ T 세포)의 증식 및 활성화를 유도하였다. NKp46 scFV-Fc(IL-2-RAS 없음)의 결합은 NK 증식 또는 pSTAT5 유도를 유도하지 않았다. 따라서, NKp46-표적화된 IL-2-RAS는 NK 세포 상에서 IL-2의 시스 신호전달을 유도하였지만, CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 트랜스로 활성화시키지 않았다.

실시예 14: LAG3 표적화된 IL-2-RAS는 사전 활성화된 LAG3 + T-세포를 자극한다

도 1g에 나타낸 바와 같이 항-LAG3 이종이량체성 통상적인 항체(MAb)의 C-말단에 융합된, 도 1b에 나타낸 바와 같이 이종이량체성 Fc를 갖는 항-LAG3 VHH에 융합된, 도 1b에 나타낸 바와 같이 비표적화된 VHH에 융합된 IL-2-RAS를 포함하는 융합 단백질, 또는 도 1b에 나타낸 바와 같이 비표적화된 이종이량체성 Fc의 C-말단의 융합된 야생형 IL-2를 포함하는 융합 단백질, 또는 LAG3-표적화된 Mab(대조군), 또는 LAG3-표적화된 VHH-Fc(대조군)의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 상의 효과를 분석하였다.

건강한 공여자로부터의 농축된 T 세포를 1 μg/mL 코팅된 항-CD3(OKT3) 및 10 μg/mL 가용성 항-CD28로 48시간 동안 자극시킨 다음, 24시간 동안 휴지시켰다. 사전 활성화된 세포를 CellTrace™ Violet으로 표지화하고, 200,000 세포/웰로 시딩하였다. 융합 단백질 및 대조군 단백질의 희석액을 첨가하고, 3일 동안 인큐베이션하였다. 활성화 마커 CD25 및 CD71의 증식 및 발현을 이러한 추가 항체: 항-CD25-FITC(1:100) 및 항-CD71-PE/Cy7를 이용하여 실질적으로 실시예 7에서와 같이 측정하였다.

자극된 CD8+ T 세포는 LAG3을 CD8+ T 세포의 45%까지 상향조절한 반면, CD4+ T 세포는 LAG3을 CD4+ T 세포의 22%까지 상향조절하였다. 대조적으로, 자극되지 않은 T 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상에서 LAG3 발현에 대해 0% 가까운 양성이다.

도 14a-14d에 나타낸 바와 같이, 항-LAG3 Mab-IL-2-RAS 및 항-LAG3 VHH-IL-2-RAS는 CD8+ 및 CD4+ 증식(도 14a 및 14b) 및 CD25(도 14c 및 14d) 및 CD71(도 14e 및 14f) 발현 수준에 의해 표시된 바와 같이 활성화를 증가시켰다. 비표적화된 야생형 IL-2는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 증식 및 활성화의 강한 유도자였으며, 더 높은 친화성 및 포화로 자극된 T 세포에 결합하였다.

실시예 15: IL-2의 조합 돌연변이체는 비표적화된 활성을 추가로 감소시킨다

HEK-Blue IL-2 리포터 세포(InvivoGen)를 사용하여 비표적화된 IL-2 돌연변이체의 상대적 활성을 측정하였다. 리포터 세포를 비표적화된 VHH의 C-말단에 융합된 IL-2-돌연변이체의 희석액으로 처리하고, Quanti-Blue 분석 전에 20시간 동안 인큐베이션하였다.

도 15에 나타낸 바와 같이, IL-2 돌연변이체는 광범위한 활성을 보였다. 상기 기재된 실험은 IL-2-RAS(P65R, H16A, 및 D84S)가 야생형 IL-2와 비교하여 IL-2R에 대해 극적으로 감소된 결합(도 4-6 참고), 및 야생형 IL-2와 비교하여 감소된 활성을 갖는다는 것을 보여주었다(도 7a-7e 참고). 추가의 M23A 돌연변이를 갖는 IL-2-RAS 및 추가의 E95Q 돌연변이를 갖는 IL-2-RAS는 IL-2-RAS와 비교하여 감소된 활성을 나타내었고, M23A 및 E95Q 모두를 갖는 IL-2-RAS의 조합은 훨씬 더 약화된 활성을 가지고 있었다. PD-1-발현 리포터 세포를 이용한 실험에서, 이러한 감소된 친화성 IL-2 돌연변이체 모두는 유사한 PD-1-표적화된 활성을 나타내었고(데이터는 표시되지 않음), 이는 시스로 PD-1에 대한 높은 친화성 결합이 IL-2R에 대한 IL-2 돌연변이체의 감소된 친화성을 보상할 수 있다는 것을 시사한다. HEK-Blue IL-2 리포터 시스템은 상대적 활성 측정에 유용하였지만, 리포터 시스템에서 IL-2 돌연변이체에 대해 관찰된 EC₅₀은 1차 세포 상에서의 더 낮은 IL-2R 수준과 비교하여 아마도 리포터 세포에서 IL-2R 구성요소의 과발현으로 인해, 1차 림프구와 비교하여 왼쪽으로 유의하게 이동하였다.

본 개시내용은 그 사상 또는 본질적인 특징을 벗어나지 않으면서 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 전술한 구현예는 모든 면에서 본 개시내용을 제한하는 것이 아니라 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 개시내용의 범위는 전술한 설명보다는 첨부된 청구범위에 의해 표시되고, 따라서 청구범위의 균등의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화는 본원에 포함되는 것으로 의도된다.

특정 서열의 표

박스 또는 밑줄을 포함하는 서열에서, 개별 문자 주위의 박스는 상응하는 야생형 또는 부모 서열에 대한 아미노산 치환을 나타내며; 문자 그룹 주위의 박스는 링커 서열을 나타낸다. 밑줄 친 문자는 링커 서열이다.

SEQUENCE LISTING <110> INHIBRX, INC. <120> POLYPEPTIDES COMPRISING MODIFIED IL-2 POLYPEPTIDES AND USES THEREOF <130> 01202-0011-00PCT <150> US 62/789,075 <151> 2019-01-07 <160> 104 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Wild type Human IL-2 <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Arg Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: IL-2-H16A <400> 4 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn 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Claims (125)

1. 변형된 IL-2를 포함하는 폴리펩타이드로서, 변형된 IL-2는 P65, D84, E95, M23, 및 H16으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
2. 제1항에 있어서, 변형된 IL-2는 변형된 인간 IL-2인 폴리펩타이드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아미노산 위치는 서열번호: 1에서의 아미노산 위치에 상응하는 것인 폴리펩타이드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 P65에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
5. 제4항에 있어서, 치환은 P65R, P65E, P65K, P65H, P65Y, P65Q, P65D, 및 P65N으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 H16에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
7. 제6항에 있어서, 치환은 H16A, H16G, H16S, H16T, H16V, 및 H16P로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 D84에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
9. 제8항에 있어서, 치환은 D84S, D84G, D84A, D84T, D84V, 및 D84P로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 P65, H16, 및 D84에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
11. 제10항에 있어서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, 및 D84S를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 M23에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
13. 제12항에 있어서, 치환은 M23A, M23G, M23S, M23T, M23V, 및 M23P로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
14. 제13항에 있어서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, D84S, 및 M23A를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 E95에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
16. 제15항에 있어서, 치환은 E95Q, E95G, E95S, E95T, E95V, E95P, E95H, 및 E95N으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
17. 제16항에 있어서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, D84S, 및 E95Q를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
18. 제17항에 있어서, 변형된 IL-2는 치환 P65R, H16A, D84S, M23A, 및 E95Q를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 아미노산 위치 F42에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
20. 제19항에 있어서, F42에서의 치환은 F42K, F42A, F42R, F42A, F42G, F42S, 및 F42T로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 Y45 및 L72로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
22. 제21항에 있어서, 변형된 IL-2는 Y45A 및 L72G로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 T3 및 C125로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
24. 제23항에 있어서, 변형된 IL-2는 T3A, 및 C125A로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 H16A-F42K; D84S-F42K; E15S-F42K; M23A-F42K; E95Q-F42K; P65R-H16A; P65R-D84S; P65R-E15S; P65R-M23A; P65R-E95Q; T3A-C125S; T3A-P65R-C125S; T3A-H16A-C125S; T3A-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-C125S; T3A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-M23A-P65R-D84S-C125S; T3A-H16A-P65R-D84S-E95Q-C125S, 및 T3A-H16A-M23A-P65R-D84S-E95Q-C125S로부터 선택된 치환 세트를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
26. 제25항에 있어서, 변형된 IL-2는 상기 치환 세트를 포함하고, 임의의 추가 치환을 포함하지 않는 것인 폴리펩타이드.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 서열번호: 84와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 서열번호: 3-9, 11-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 서열번호: 3-9, 11-21, 및 23-31로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 Fc 영역을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
31. 제30항에 있어서, 변형된 IL-2는 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 융합되는 것인 폴리펩타이드.
32. 제30항 또는 제31항에 있어서, Fc 영역은 카바트 아미노산 위치 T366에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
33. 제32항에 있어서, Fc 영역은 T366W 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
34. 제31항에 있어서, Fc 영역은 T366, L368, 및 Y407로부터 선택된 적어도 하나의 카바트 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
35. 제34항에 있어서, Fc 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 S354 및 Y349로부터 선택된 카바트 위치에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
37. 제36항에 있어서, Fc 영역은 S354C 또는 Y349C 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 카바트 아미노산 위치 H435에 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
39. 제38항에 있어서, Fc 영역은 H435R 및 H435K로부터 선택된 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 M252 및 M428로부터 선택된 적어도 하나의 카바트 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
41. 제40항에 있어서, Fc 영역은 M252Y 및 M428V 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
42. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 카바트 아미노산 E233, L234, 및 L235의 결실을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
43. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 L234, L235, 및 P329로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 위치에 적어도 하나의 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
44. 제43항에 있어서, Fc 영역은 L234A, L235A, 및 P329G 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
45. 제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 서열번호: 47-83으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
46. 제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 중쇄 불변 영역의 일부인 폴리펩타이드.
47. 제46항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 IgG 불변 영역인 폴리펩타이드.
48. 제47항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 불변 영역인 폴리펩타이드.
49. 제30항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 Fc 영역 또는 중쇄 불변 영역의 C-말단에 융합되는 것인 폴리펩타이드.
50. 제49항에 있어서, 변형된 IL-2는 1-20개의 아미노산을 포함하는 링커를 통해 Fc 영역 또는 중쇄 불변 영역의 C-말단에 융합되는 것인 폴리펩타이드.
51. 제50항에 있어서, 링커는 글리신 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
52. 제51항에 있어서, 링커는 글리신 및 세린 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 내의 아미노산의 대부분, 또는 모두가 글리신 및 세린인 폴리펩타이드.
54. 제30항 내지 제33항, 제42항, 및 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호: 86, 87, 102, 103, 또는 104의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
56. 제55항에 있어서, 폴리펩타이드는 2, 3, 또는 4개의 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 T-세포 항원 또는 자연 살해 세포 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 CD4⁺ T-세포 항원 또는 CD8⁺ T-세포 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
59. 제58항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 활성화된 CD4⁺ T-세포 또는 활성화된 CD8⁺ T-세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 작용제인 폴리펩타이드.
61. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 길항제인 폴리펩타이드.
62. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-1BB, OX40, GITR, CD8a, CD8b, CD4, NKp30, NKG2A, TIGIT, TGFβR1, TGFβR2, Fas, NKG2D, NKp46, PD-L1, CD107a, ICOS, TNFR2, 또는 CD16a에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 PD-1에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
64. 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 인간 또는 인간화된 항원 결합 도메인인 것인 폴리펩타이드.
65. 제64항에 있어서, 각각의 항원 결합 도메인은, 독립적으로, 인간 또는 인간화된 항원 결합 도메인인 것인 폴리펩타이드.
66. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 VHH 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
67. 제66항에 있어서, 각각의 항원 결합 도메인은 VHH 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
68. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
69. 제68항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, AMP-514, TSR-042, STI-A1110, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, 우토밀루맙, 아테졸리주맙, 및 두르발루맙으로부터 선택된 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 단쇄 Fv(scFv)를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
71. 제68항 또는 제69항에 있어서, 폴리펩타이드는 중쇄 불변 영역을 포함하고, VH 도메인은 중쇄 불변 영역에 융합되며, VL 도메인은 VH 도메인과 회합되는 것인 폴리펩타이드.
72. 제71항에 있어서, VL 도메인은 경쇄 불변 영역에 융합되는 것인 폴리펩타이드.
73. 제72항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 카파 및 람다로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
74. 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인 각각은 동일한 것인 폴리펩타이드.
75. 제55항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인 각각은 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
76. 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인 중 적어도 하나는 나머지 항원 결합 도메인 중 적어도 하나와 다른 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
77. 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 PD-1에 특이적으로 결합하고, 적어도 하나의 다른 항원 결합 도메인은 PD-1 이외의 T-세포 항원 또는 자연 살해 세포 항원에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
78. 제55항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 결합 도메인은 PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, 4-1BB, OX40, GITR, CD8a, CD8b, CD4, NKp30, NKG2A, TIGIT, TGFβR1, TGFβR2, Fas, NKG2D, NKp46, PD-L1, CD107a, ICOS, TNFR2, 또는 CD16a에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
79. 제31항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 생리학적 조건 하에 동종이량체를 형성하는 것인 폴리펩타이드.
80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 인간 IL-2R에 대한 인간 야생형 IL-2의 친화성보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 낮은 친화성으로 인간 IL-2R에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
81. 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하는 복합체로서, 제1 폴리펩타이드는 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드인 복합체.
82. 제81항에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 영역을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 제2 Fc 영역을 포함하는 것인 복합체.
83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 각각의 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로부터 선택된 아이소타입인 복합체.
84. 제83항에 있어서, 각각의 Fc 영역은 인간 IgG1인 복합체.
85. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 영역은 아미노산 E233, L234, 및 L235의 결실을 포함하는 것인 복합체.
86. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 영역은 H435R 또는 H435K 돌연변이를 포함하는 것인 복합체.
87. 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 돌연변이 M252Y 및 M428L 또는 돌연변이 M252Y 및 M428V를 포함하는 것인 복합체.
88. 제81항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fc 영역 또는 제2 Fc 영역은 T366W 돌연변이를 포함하고, 다른 하나의 Fc 영역은 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하는 것인 복합체.
89. 제88항에 있어서, 제1 Fc 영역 또는 제2 Fc 영역은 S354C 돌연변이를 포함하는 것인 복합체.
90. 제81항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 Fc 영역은 독립적으로 서열번호: 47-83으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 복합체.
91. 제81항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩타이드는 변형된 IL2를 포함하지 않는 것인 복합체.
92. 제81항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 복합체.
93. 제81항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩타이드는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 것인 복합체.
94. 제81항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 제1 항원 결합 도메인, Fc 영역, 및 변형된 IL-2를 포함하는 것인 복합체.
95. 제94항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인은 Fc 영역의 N-말단에 융합되고, 변형된 IL-2는 Fc 영역의 C-말단에 융합되는 것인 복합체.
96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 제2 폴리펩타이드는 제2 항원 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 것인 복합체.
97. 제96항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 것인 복합체.
98. 제97항에 있어서,
    a) 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인 모두가 PD-1에 결합하거나;
    b) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 LAG3에 결합하거나;
    c) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하거나;
    d) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 4-1BB에 결합하거나;
    e) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 OX40에 결합하거나;
    f) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 GITR에 결합하거나;
    g) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD8a에 결합하거나;
    h) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD8b에 결합하거나;
    i) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD4에 결합하거나;
    j) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 NKp30에 결합하거나;
    k) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2A에 결합하거나;
    l) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TIGIT에 결합하거나;
    m) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 NKG2D에 결합하거나;
    n) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TGFBR2에 결합하거나;
    o) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Fas에 결합하거나;
    p) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD107a에 결합하거나;
    q) 제1 항원 결합 도메인은 PD-1에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 NKp46에 결합하거나;
    r) 제1 항원 결합 도메인은 CD8a에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TGFRβR2에 결합하거나;
    s) 제1 항원 결합 도메인은 CD8a에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Fas에 결합하거나;
    t) 제1 항원 결합 도메인은 NKG2D에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TGFRβR2에 결합하거나;
    u) 제1 항원 결합 도메인은 NKG2D에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Fas에 결합하거나;
    v) 제1 항원 결합 도메인은 NKG2A에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TGFRβR2에 결합하거나;
    w) 제1 항원 결합 도메인은 NKG2A에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Fas에 결합하거나;
    x) 제1 항원 결합 도메인은 NKp46에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TGFRβR2에 결합하거나;
    y) 제1 항원 결합 도메인은 NKp46에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Fas에 결합하거나;
    z) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 LAG3에 결합하거나;
    aa) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 Tim3에 결합하거나;
    bb) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 OX40에 결합하거나;
    cc) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 GITR에 결합하거나;
    dd) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 CD107a에 결합하거나;
    ee) 제1 항원 결합 도메인은 CTLA-4에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 NKp46에 결합하거나;
    ff) 제1 항원 결합 도메인은 ICOS에 결합하고, 제2 항원 결합 도메인은 TNFR2에 결합하는 것인 복합체.
99. 제81항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-2는 인간 IL-2R에 대한 인간 야생형 IL-2의 친화성보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 낮은 친화성으로 인간 IL-2R에 결합하는 것인 복합체.
100. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제81항 내지 제99항 중 어느 한 항의 복합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
101. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제81항 내지 제99항 중 어느 한 항의 복합체를 코딩하는 단리된 핵산.
102. 제101항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
103. 제101항의 핵산 또는 제102항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
104. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제81항 내지 제99항 중 어느 한 항의 복합체를 발현하는 단리된 숙주 세포.
105. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제81항 내지 제99항 중 어느 한 항의 복합체를 제조하는 방법으로서, 제103항 또는 제104항의 숙주 세포를 상기 폴리펩타이드 또는 복합체를 발현하는 데 적합한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 상기 폴리펩타이드 또는 복합체의 제조 방법.
106. 제105항에 있어서, 폴리펩타이드 또는 복합체를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
107. T 세포를 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제81항 내지 제99항 중 어느 한 항의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 증식을 증가시키는 방법.
108. 제107항에 있어서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 시험관내의 것인 방법.
109. 제107항에 있어서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 생체내의 것인 방법.
110. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 증가는 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배인 방법.
111. NK 세포를 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제81항 내지 제99항 중 어느 한 항의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, NK 세포 증식을 증가시키는 방법.
112. 제111항에 있어서, 증가는 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 또는 적어도 5배인 방법.
113. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제81항 내지 제99항 중 어느 한 항의 복합체, 또는 제100항의 약제학적 조성물의 약제학적 유효량을 암을 가진 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법.
114. 제113항에 있어서, 암은 기저 세포 암종, 담도암; 방광암; 골암; 뇌 및 중추신경계암; 유방암; 복막암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장 및 직장암; 결합 조직 암; 소화기계의 암; 자궁내막암; 식도암; 안암; 두경부암; 위암; 소화기암; 교모세포종; 간암종; 간종양; 상피내 신생물; 신장 또는 신암; 후두암; 간암; 폐암; 소세포 폐암; 비소 세포 폐암; 폐의 선암종; 폐의 편평상피암; 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암; 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막아세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡기계의 암; 타액선 암종; 육종; 피부암; 편평 세포 암; 위장암; 고환암; 갑상선암; 자궁 또는 자궁내막암; 비뇨기계의 암; 외음부암; 림프종; 호지킨 림프종; 비호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소형 비절단 세포 NHL; 거대 병변(bulky disease) NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프아구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 및 만성 골수아구성 백혈병으로부터 선택되는 것인 방법.
115. 제113항 또는 제114항에 있어서, 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
116. 제115항에 있어서, 추가 치료제는 항암제인 방법.
117. 제116항에 있어서, 항암제는 화학치료제, 항암 생물학적 제제, 방사선 요법, CAR-T 요법, 및 온콜리틱 바이러스로부터 선택되는 것인 방법.
118. 제116항 또는 제117항에 있어서, 추가 치료제는 항암 생물학적 제제인 방법.
119. 제118항에 있어서, 항암 생물학적 제제는 PD-1 및/또는 PD-L1을 억제하는 제제인 방법.
120. 제118항에 있어서, 항암 생물학적 제제는 VISTA, gpNMB, B7H3, B7H4, HHLA2, CTLA4, 또는 TIGIT를 억제하는 제제인 방법.
121. 제116항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 항암제는 항체인 방법.
122. 제118항에 있어서, 항암 생물학적 제제는 사이토카인인 방법.
123. 제116항에 있어서, 항암제는 CAR-T 요법인 방법.
124. 제116항에 있어서, 항암제는 온콜리틱 바이러스인 방법.
125. 제113항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 절제 및/또는 방사선 요법을 추가로 포함하는 방법.

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