TW202328171A - 靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。亦提供該等多肽之用途。

Description

靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽及其用途
本發明係關於靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽，及使用此類多肽調節NK細胞之生物活性的方法。此類方法包括但不限於治療癌症及感染性疾病之方法。在一些實施例中，該靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽為包含靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽及經修飾之IL-2的融合多肽。
NKp46，亦稱為CD335、LY94同源物或NCR1，為表現於自然殺手(NK)細胞上之活化細胞表面受體。其為一般充當受病毒感染、真菌或癌細胞上所呈現之應激配體之受體的天然細胞毒性受體(NCR)家族之部分。NKp46之連接及聚集經由其含有輔受體Fc ε RI及CD3 ζ的基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)驅動活化信號，誘導干擾素-γ之表現及NK介導之細胞毒性。NKp46表現限於NK細胞且不表現於CD4+或CD8+ T細胞、B細胞、單核球或顆粒球上。NKp46基因自人類至食蟹獼猴、大鼠及小鼠中之均得以保全；且此等動物中之表現模式亦限於NK細胞，正如在人類中。此表現模式及物種保全使其成為靶向NK之治療劑之理想NK特異性標記物，並且成為驅動NK介導之細胞毒性的強效NK活化受體。
NK細胞為能夠殺死受病毒感染細胞及癌細胞而無需事先致敏且能夠經由細胞介素及趨化介素信號增強樹突狀細胞、T細胞及B細胞之適應性免疫反應的關鍵免疫細胞(Vidal等人 Curr Opin Virol1(6):497-512 (2011))。NK細胞具有若干識別及殺死目標細胞之機制。應激配體經由諸如NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46及DNAM-1之天然細胞毒性受體(NCR)接合及活化NK細胞去顆粒。MHC I類損失為許多病毒之共同免疫逃避策略且亦在人類癌症中觀測到。NK細胞可藉由自KIR及NKG2A撤回抑制性信號來識別及殺死不表現MHC I類之細胞(Raulet及Vance Nat Rev Immunol6(7):520-531 (2006))。藉由抗體對病毒或癌症抗原進行抗體調理作用可促效NK細胞上之CD16a，誘導NK細胞毒性之強效活化。NK細胞去顆粒釋放細胞毒性蛋白以及免疫刺激細胞介素，諸如干擾素-γ及TNF-α；以及免疫募集趨化介素，如CCL3、CCL4、CCL5、XCL1及XCL2 (Fauriat等人 Blood115(11):2167-2176 (2010)及Bottcher等人 Cell172(5):1022-1037 (2018))。此等分泌之因子活化且募集DC、T細胞及B細胞以調節有效適應性免疫反應。
許多刺激及抑制信號調節NK細胞之整體活化狀態，且控制反應之臨限值及量值。受病毒感染之細胞的NK介導之殺滅的理想條件需要諸如介白素-2 (IL-2)之細胞介素的支援。IL-2為經由CD122及CD132所構成之異二聚體信號傳導受體且經由包括CD122、CD132及CD25之受體的異三聚體高親和力形式刺激T細胞及NK細胞增殖的強效細胞介素。除增強NK細胞存活及增殖以外，IL-2可激活NK細胞以表現在去顆粒後釋放且用於破壞目標細胞之效應分子，諸如顆粒酶-B、穿孔蛋白及干擾素-γ。由感染或癌症引起之病理性炎症可使NK細胞進入耗竭及無效狀態。用IL-2刺激可使耗竭NK細胞再振作且戰勝抑制性免疫信號。
因此，經由NKp46使IL-2靶向NK細胞可增加細胞毒性NK細胞反應之效力及選擇性，且需要靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。
本文提供靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽，及使用靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽治療例如癌症或感染性疾病的方法。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域及經修飾之IL-2。在一些實施例中，靶向之NKp46經修飾之IL-2多肽包含一或多個額外結合域及/或細胞介素序列。
下文提供一些實施例。 實施例1.  一種多肽，其包含至少一個結合NKp46之VHH域及經修飾之IL-2，其中至少一個結合NKp46之VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18、19、20或21之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22、23、24、25、26或27之胺基酸序列的CDR3，且其中相對於包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的野生型人類IL-2，該經修飾之IL-2包含T3A、H16A、P65R、C125S突變以及D84S或D84Y突變。 實施例2.  如實施例1之多肽，其中該經修飾之IL-2包含T3A、H16A、P65R、C125S及D84S突變。 實施例3.  如實施例1之多肽，其中該經修飾之IL-2包含T3A、H16A、E61R、P65R、C125S及D84Y突變。 實施例4.  如實施例1或2之多肽，其中該經修飾之IL-2包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。 實施例5.  如實施例1或3之多肽，其中該經修飾之IL-2包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。 實施例6.  如實施例1至5中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的CDR3。 實施例7.  如實施例1至5中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的CDR3。 實施例8.  如實施例1至5中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的CDR3。 實施例9.  如實施例1至5中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的CDR3。 實施例10.       如實施例1至5中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的CDR3。 實施例11.       如實施例1至5中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的CDR3。 實施例12.       如實施例1至5中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的CDR3。 實施例13.       如實施例1至5中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的CDR3。 實施例14.       如實施例1至5中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列的CDR3。 實施例15.       如實施例1至14中任一例之多肽，其中至少一個VHH域經人源化。 實施例16.       如實施例1至15中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含與SEQ ID NO: 1-16中之任一者之胺基酸序列至少85%、90%、95%或至少99%一致的胺基酸序列。 實施例17.       如實施例1至15中任一例之多肽，其中至少一個VHH域包含SEQ ID NO: 1-16中任一者之胺基酸序列。 實施例18.       如實施例1至17中任一例之多肽，其包含兩個VHH域。 實施例19.       如實施例1至17中任一例之多肽，其包含三個VHH域。 實施例20.       如實施例1至19中任一例之多肽，其中該多肽包含至少一個結合除NKp46外之抗原的結合域。 實施例21.       如實施例1至20中任一例之多肽，其中該多肽包含至少一個結合腫瘤抗原之結合域。 實施例22.       如實施例1至21中任一例之多肽，其中該多肽包含至少一個結合選自以下之抗原的結合域：1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFF、BCMA、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD39、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD73、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、密連蛋白3 (CLAUDIN-3)、密連蛋白4、cMet、膠原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(Endothelin B receptor；ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV之F蛋白、FAP、FAS、FcRH5、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GPRC5D、GRP78、HAVCAR1、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、玻尿酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、間皮素、MICA、MICB、MRP4、MUC1、黏蛋白-16 (MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、呆蛋白(Nicastrin)、NKG2A、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯基-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神經鞘胺醇1磷酸(Sphingosine 1 Phosphate)、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TGFβ受體1 (TGFBR1)、TGFβ受體2 (TGFBR2)、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、運鐵蛋白(Transferrin)、運鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、TROP-2 uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。 實施例23.       如實施例1至19中任一例之多肽，其中各VHH域結合NKp46。 實施例24.       如實施例23之多肽，其中各VHH域包含相同CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列。 實施例25.       如實施例24之多肽，其中各VHH域包含相同VHH序列。 實施例26.       如實施例1至17中任一例之多肽，其包含一個VHH域。 實施例27.        如實施例1至26中任一例之多肽，其中該NKp46為人類NKp46。 實施例28.       如實施例27之多肽，其中該人類NKp46包含SEQ ID NO: 29之序列。 實施例29.       如實施例1至28中任一例之多肽，其中該多肽包含Fc區。 實施例30.       如實施例29之多肽，其中該Fc區包含選自SEQ ID NO: 44及53-89之胺基酸序列。 實施例31.       如實施例29或實施例30之多肽，其在生理條件下形成二聚體。 實施例32.       如實施例29至31中任一例之多肽，其中該經修飾之IL-2與該Fc區之C端融合。 實施例33.       如實施例29至32中任一例之多肽，其中該多肽包含一個結合NKp46之VHH域、Fc區及經修飾之IL-2。 實施例34.       如實施例33之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。 實施例35.       一種複合體，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽為如實施例1至34中任一例之多肽，其中該第一多肽包含第一Fc區，且其中該第二多肽包含至少一個VHH域及第二Fc區，其中該第一Fc區與該第二Fc區相同或不同。 實施例36.       一種複合體，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域及第一Fc區，且該第二多肽包含第二Fc區及經修飾之IL-2，其中至少一個結合NKp46之VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18、19、20或21之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22、23、24、25、26或27之胺基酸序列的CDR3；且其中相對於包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的野生型人類IL-2，該經修飾之IL-2包含T3A或T3G、H16A、P65R、C125S及D84S或D84Y突變。 實施例37.       如實施例36之複合體，其中該經修飾之IL-2包含T3A、H16A、P65R、C125S及D84S突變。 實施例38.       如實施例36之複合體，其中該經修飾之IL-2包含T3A、H16A、E61R、P65R、C125S及D84Y突變。 實施例39.       如實施例36至38中任一例之複合體，其中該經修飾之IL-2包含與SEQ ID NO: 31或32之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。 實施例40.       如實施例36、38及39中任一例之複合體，其中該經修飾之IL-2包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。 實施例41.       如實施例36至40中任一例之複合體，其中至少一個VHH域或各VHH域經人源化。 實施例42.       如實施例36至41中任一項之複合體，其中至少一個VHH域包含與選自SEQ ID NO: 1-16之胺基酸序列至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致的胺基酸序列。 實施例43.       如實施例36至42中任一例之複合體，其中至少一個VHH域包含選自SEQ ID NO: 1-16之胺基酸序列。 實施例44.       如實施例35至43中任一例之複合體，其中該第二多肽包含至少一個抗原結合域。 實施例45.       如實施例44之複合體，其中該第二多肽之至少一個抗原結合域為VHH域。 實施例46.       如實施例45之複合體，其中該第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域。 實施例47.       如實施例35至46中任一例之複合體，其中該第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域。 實施例48.       如實施例47之複合體，其中該第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域，且包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18、19、20或21之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22、23、24、25、26或27之胺基酸序列的CDR3。 實施例49.       如實施例47或48之複合體，其中該第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域，且包含分別包含以下之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3：SEQ ID NO: 17、18及22；17、19及22；17、20及22；17、21及22；17、18及23；17、18及24；17、18及25；17、18及26；或17、18及27。 實施例50.       如實施例47至49中任一例之複合體，其中該第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域，且包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的CDR3。 實施例51.       如實施例47至50中任一例之複合體，其中該第二多肽之至少一個VHH域結合NKp46且包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16之胺基酸序列至少85%、90%、95%或至少99%一致的胺基酸序列。 實施例52.       如實施例47至51中任一例之複合體，其中該第二多肽之至少一個VHH域結合NKp46且包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16之胺基酸序列。 實施例53.       如實施例47至52中任一例之複合體，其中該第二多肽之至少一個VHH域結合NKp46且包含SEQ ID NO: 11或15之胺基酸序列。 實施例54.       如實施例47至53中任一例之複合體，其中該第二多肽包含一個結合NKp46之VHH域。 實施例55.       如實施例35至54中任一例之複合體，其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個結合除NKp46外之抗原的VHH域。 實施例56.       如實施例55之複合體，其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個結合TGFβ受體1、TGFβ受體2或NKG2A之結合域。 實施例57.       如實施例55或實施例56之複合體，其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個結合腫瘤抗原之結合域。 實施例58.       如實施例35至57中任一例之複合體，其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個結合選自以下之抗原的結合域：1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFF、BCMA、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD39、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD73、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、密連蛋白3、密連蛋白-4、cMet、膠原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV之F蛋白、FAP、FAS、FcRH5、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GPRC5D、GRP78、HAVCAR1、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、玻尿酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、間皮素、MICA、MICB、MRP4、MUC1、黏蛋白-16 (MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、呆蛋白、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯基-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神經鞘胺醇1磷酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、TROP-2 uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。 實施例59.       如實施例35至58中任一例之複合體，其中該第二多肽之至少一個VHH域或各VHH域經人源化。 實施例60.       如實施例35至59中任一例之複合體，其中該第一Fc區包含至少一個杵突變且該第二Fc區包含至少一個臼突變；或其中該第一Fc區包含至少一個臼突變且該第二Fc區包含至少一個杵突變。 實施例61.       如實施例60之複合體，其中該第一或第二Fc區包含T366W突變且該第一或第二Fc區中之另一者包含T366S、L368A及Y407V突變。 實施例62.       如實施例61之複合體，其中包含該等T366S、L368A及Y407V突變之該Fc區進一步包含H435R或H435K突變。 實施例63.       如實施例35至62中任一例之複合體，其中該第一多肽包含SEQ ID NO: 34、40、42或43之胺基酸序列。 實施例64.       如實施例35至63中任一例之複合體，其中該第二多肽包含SEQ ID NO: 33或41之胺基酸序列。 實施例65.       如實施例63或實施例64之複合體，其中： i) 該第一多肽包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列且該第二多肽包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列； ii)        該第一多肽包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列且該第二多肽包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列； iii)      該第一多肽包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列且該第二多肽包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列；或 iv)       該第一多肽包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列且該第二多肽包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列。 實施例66.       如實施例35至65中任一例之複合體，其中該複合體在生理條件下形成。 實施例67.       一種免疫結合物，其包含如實施例1至66中任一例之多肽或複合體及細胞毒性劑。 實施例68.       如實施例67之免疫結合物，其中該細胞毒性劑係選自卡奇黴素(calicheamicin)、奧瑞他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、微管素(tubulicin)、類美登素(maytansinoid)、念珠藻素(cryptophycin)、多卡黴素(duocarmycin)、埃斯培拉黴素(esperamicin)、吡咯并苯并二氮呯及烯二炔抗生素。 實施例69.       如實施例67或68之免疫結合物，其中該免疫結合物包含如實施例35至66中任一例之複合體，且其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個結合CD3、T細胞受體(TCR) α、TCRβ、CD28、CD16、CD32A、CD64、CD89或NKG2D之結合域。 實施例70.       一種醫藥組合物，其包含如實施例1至66中任一例之多肽或複合體或如實施例67至69中任一例之免疫結合物，及醫藥學上可接受之載劑。 實施例71.       一種經分離核酸，其編碼如實施例1至34中任一例之多肽。 實施例72.       一種載體，其包含如實施例71之核酸。 實施例73.       一種宿主細胞，其包含如實施例71之核酸或如實施例72之載體。 實施例74.       一種宿主細胞，其表現如實施例1至34中任一例之多肽。 實施例75.       一種產生如實施例1至34中任一例之多肽的方法，其包含在適合於表現該多肽之條件下培育如實施例73或實施例74之宿主細胞。 實施例76.       如實施例75之方法，其進一步包含分離該多肽。 實施例77.       一種經分離核酸，其編碼如實施例35至66中任一例之複合體之該第一多肽及該第二多肽。 實施例78.       一種載體，其包含如實施例77之經分離核酸。 實施例79.       一種宿主細胞，其包含如實施例77之核酸或如實施例78之載體。 實施例80.       一種宿主細胞，其表現如實施例35至66中任一例之複合體。 實施例81.       一種產生如實施例35至66中任一例之複合體的方法，其包含在適合於表現該複合體之條件下培育如實施例73或實施例74之宿主細胞。 實施例82.       如實施例81之方法，其進一步包含分離該複合體。 實施例83.       一種治療癌症的方法，其包含向患有癌症之受試者投與醫藥學上有效量的如實施例1至66中任一例之多肽或複合體、如實施例67至69中任一例之免疫結合物或如實施例70之醫藥組合物。 實施例84.       如實施例83之方法，其中該癌症係選自：基底細胞癌；膽道癌；膀胱癌；骨癌；腦及中樞神經系統癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛膜癌；大腸直腸癌；結締組織癌；消化系統癌；子宮內膜癌；食道癌；眼癌；頭頸癌；胃癌(gastric cancer)(包括胃腸癌)；神經膠母細胞瘤；肝癌；肝腫瘤；上皮內贅瘤；腎癌(kidney or renal cancer)；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神經母細胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口癌及咽癌)；卵巢癌；胰臟癌；前列腺癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統癌；唾液腺癌；肉瘤；皮膚癌；鱗狀細胞癌；胃癌(stomach cancer)；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮或子宮內膜癌；泌尿系統癌；外陰癌；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；非霍奇金氏淋巴瘤；B細胞淋巴瘤；低惡性度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL) NHL；中惡性度/濾泡性NHL；中惡性度瀰漫性NHL；高惡性度免疫母細胞性NHL；高惡性度淋巴母細胞性NHL；高惡性度小型無裂隙細胞NHL；巨瘤症NHL (bulky disease NHL)；套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS相關淋巴瘤；華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母細胞性白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；毛細胞白血病；及慢性骨髓母細胞性白血病。 實施例85.       如實施例83或實施例84之方法，其進一步包含投與額外治療劑。 實施例86.       如實施例85之方法，其中該額外治療劑為抗癌劑。 實施例87.       如實施例86之方法，其中該抗癌劑係選自化學治療劑、抗癌生物製劑、放射線療法、CAR-T療法及溶瘤病毒。 實施例88.       如實施例87之方法，其中該額外治療劑為抗癌生物製劑。 實施例89.       如實施例88之方法，其中該抗癌生物製劑為抑制PD-1及/或PD-L1之藥劑。 實施例90.       如實施例88之方法，其中該抗癌生物製劑為抑制VISTA、gpNMB、B7H3、B7H4、HHLA2、CTLA4或TIGIT之藥劑。 實施例91.       如實施例86至90中任一例之方法，其中該抗癌劑為抗體。 實施例92.       如實施例91之方法，其中該抗體包含結合腫瘤抗原之結合域。 實施例93.       如實施例88之方法，其中該抗癌生物製劑為細胞介素。 實施例94.       如實施例87之方法，其中該抗癌劑為CAR-T療法。 實施例95.       如實施例87之方法，其中該抗癌劑為溶瘤病毒。 實施例96.       如實施例83至95中任一例之方法，其進一步包含腫瘤切除及/或放射線療法。 實施例97.       一種將自然殺手介導之細胞毒性反應導向癌細胞的方法，其包含向患有癌症之受試者投與醫藥學上有效量的如實施例1至66中任一例之多肽或複合體、如實施例67至69中任一例之免疫結合物或如實施例70之醫藥組合物。 實施例98.       一種治療感染性疾病的方法，其包含向患有感染性疾病之受試者投與醫藥學上有效量的如實施例1至66中任一例之多肽或複合體、如實施例67至69中任一例之免疫結合物或如實施例70之醫藥組合物。 實施例99.       如實施例98之方法，其中該感染性疾病為細菌、病毒或真菌感染。 實施例100.    如實施例98或99之方法，其進一步包含投與額外治療劑。 實施例101.    如實施例100之方法，其中該額外治療劑為抗生素、抗病毒劑或抗真菌劑。 實施例102.    一種將自然殺手介導之細胞毒性反應導向病原體的方法，其包含向患有由該病原體引起之感染性疾病的受試者投與醫藥學上有效量的如實施例1至66中任一例之多肽或複合體、如實施例67至69中任一例之免疫結合物或如實施例70之醫藥組合物。 實施例103.    如實施例98至102中任一例之方法，其中該多肽、複合體或免疫結合物包含至少一個結合由該病原體表現之抗原的結合域。
相關申請案之交互參考
本申請案主張2021年8月30日申請之美國臨時申請案第63/238,431號及2022年1月5日申請之美國臨時申請案第63/296,776號之優先權益；其中之各者以全文引用之方式併入本文中以用於任何目的。
本文所提供之實施例係關於靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽及其在治療例如癌症或感染性疾病之各種方法中的用途。
本文提供靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少一個結合NKp46之VHH。在一些實施例中，結合NKp46之VHH連接於經修飾之IL-2以獲得靶向NK細胞之IL-2活性。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽亦結合另一抗原，例如包含結合另一抗原之VHH域。在一些此類實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽為雙特異性的。此雙特異性的靶向NKp46之多肽可將NK介導之細胞毒性導向表現多肽所靶向之另一抗原之細胞。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2為三功能多肽，其結合NKp46及另一抗原且包含經修飾之IL-2。此三功能多肽可使IL-2活性集中於NK細胞，而第二靶向域使多肽靶向特定細胞類型，諸如癌細胞。 定義及各種實施例
本文所用之章節標題僅出於組織目的，且不應理解為限制所描述之主題。
本文所引用之所有參考文獻(包括專利申請案、專利公開案及Genbank寄存編號)均以引用之方式併入本文中，如同各個別參考文獻特定地且單獨地指出以全文引用之方式併入本文中一般。
本文中描述或參考之該等技術及程序一般為熟習此項技術者充分理解且通常使用習知方法而採用，諸如以下中所描述之廣泛利用之方法：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等人編, (2003))；METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson、B. D. Hames及G. R. Taylor編(1995))、Harlow及Lane編(1988) ANTIBODIES、A LABORATORY MANUAL及ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編(1987))；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis編, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney)編, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather及P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle、J. B. Griffiths及D. G. Newell編, 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir及C. C. Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller及M. P. Calos編, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等人編, 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway及P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty.編, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd及C. Dean編, Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti及J. D. Capra編, Harwood Academic Publishers, 1995)；及Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita等人編, J.B. Lippincott Company, 1993)；以及其更新版本。
除非另有定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語將具有一般熟習此項技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另有需要或另外明確地指出，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。關於各種來源或參考文獻之間在定義方面的任何衝突，將以本文所提供之定義為準。
一般而言，免疫球蛋白重鏈中之殘基編號係如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)中之EU索引之編號。「如Kabat中之EU指數」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
應理解，本文所描述之本發明實施例包括「由實施例組成」及/或「基本上由實施例組成」。除非另有指示，否則如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個提及物。術語「或」在本文中之使用不意圖暗示替代方案係互相排斥的。
在本申請案中，除非明確地敍述或如熟習此項技術者所理解，否則「或」之使用意謂「及/或」。在多個附屬項的情形下，「或」之使用重新提及超過一個前述獨立項或附屬項。
片語「參考樣本」、「參考細胞」或「參考組織」表示可用作與具有至少一種未知特徵之樣本進行比較的具有至少一種已知特徵之樣本。在一些實施例中，參考樣本可用作陽性或陰性指示物。參考樣本可用於確定例如在健康組織中存在之蛋白質及/或mRNA之含量，與在具有未知特徵之樣本中存在之蛋白質及/或mRNA之含量形成對比。在一些實施例中，參考樣本來自同一受試者，但來自所測試受試者之不同部位。在一些實施例中，參考樣本來自癌周圍或附近之組織區域。在一些實施例中，參考樣本不來自所測試之受試者，而是為來自已知患有或未患有所討論之病症(例如，特定癌症)的受試者之樣本。在一些實施例中，參考樣本係來自同一受試者，但來自受試者罹患癌症前之時間點。在一些實施例中，參考樣本係來自相同或不同受試者之良性癌樣本。在使用陰性參考樣本進行比較時，陰性參考樣本中所討論分子之表現量或量將指示出假定本發明中無分子及/或具有低含量之分子時，熟習此項技術者將瞭解之含量。在使用陽性參考樣本進行比較時，陽性參考樣本中所討論的分子之表現量或量將指示出假定本發明中存在一定含量之分子時，熟習此項技術者將瞭解之含量。
如本文在受益於治療劑投與或對治療劑投與有反應之情形下所用之術語「益處」、「臨床益處」、「反應」及「治療反應」可藉由評定各種評估指標來量測，例如在一定程度上抑制疾病進展，包括減緩及完全遏止；減少疾病發作及/或症狀之數目；減小病變大小；抑制(亦即，減少、減緩或完全停止)疾病細胞浸潤至鄰近周邊器官及/或組織；抑制(亦即，減少、減緩或完全停止)疾病擴散；在一定程度上減輕與病症相關之一或多種症狀；增加在治療後呈現無病(例如無進展存活期)之時長；增加總存活期；提高反應率；及/或減小在治療後給定時間點之死亡率。「無反應」或「無法反應」之受試者或癌症為無法滿足關於「反應」之上述限制條件之受試者或癌症。
術語「核酸分子」、「核酸」及「聚核苷酸」可互換使用，且係指核苷酸聚合物。此類核苷酸聚合物可含有天然及/或非天然核苷酸且包括但不限於DNA、RNA及PNA。「核酸序列」係指包含於核酸分子或聚核苷酸中之核苷酸線性序列。
術語「多肽」與「蛋白質」可互換使用以指代胺基酸殘基之聚合物，且不限於最小長度。此類胺基酸殘基之聚合物可含有天然或非天然胺基酸殘基，且包括但不限於胺基酸殘基構成之肽、寡肽、二聚體、三聚體及多聚體。全長蛋白質及其片段皆由該定義涵蓋。該等術語亦包括多肽之表現後修飾，例如醣基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾。此外，出於本發明之目的，「多肽」係指一種蛋白質，其包括對原生序列之修飾，諸如缺失、添加及取代(實際上通常係保守的)，只要該蛋白質維持所需活性即可。此等修飾可為有意的，如經由定點突變誘發進行；或可為偶然的，諸如經由產生蛋白質之宿主的突變或由於PCR擴增所引起的錯誤引起。在一些實施例中，多肽為第一多肽及第二多肽之「複合體」。
如本文所用之「NKp46」係指由細胞中之NKp46前驅體之處理產生的任何原生成熟NKp46。除非另有指示，否則該術語包括來自任何脊椎動物來源之NKp46，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類及食蟹獼猴或恆河猴)及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語亦包括NKp46之天然存在之變異體，諸如剪接變異體或對偶基因變異體。非限制性例示性之人類NKp46胺基酸序列以例如UniProt寄存編號O76036展示。參見SEQ ID NO. 29。非限制性的例示性成熟人類NKp46序列將為SEQ ID NO: 29之胺基酸22-304。在一些實施例中，NKp46表現於NK細胞上，但不表現於CD4+或CD8+ T細胞、B細胞、單核球或顆粒球上。NKp46可用以活化NK細胞及觸發效應功能。
術語「自然殺手細胞介導之細胞毒性」或「NK介導之細胞毒性」係指藉由自NK細胞釋放細胞毒性分子殺滅目標細胞。此等細胞毒性分子(諸如顆粒酶及穿孔蛋白)可儲存於當其與目標細胞相互作用時自NK細胞胞吐的分泌性溶酶體(亦稱為溶解顆粒)中。NK細胞之例示性內源目標為受病毒感染細胞或致瘤細胞。調控NK細胞之分泌性溶酶體胞吐以避免無差別細胞毒性。
如本文所用，「導向的NK介導之細胞毒性」係指NK細胞對目標細胞之細胞毒性，其中目標細胞並非NK細胞之內源目標。換言之，導向的NK介導之細胞毒性係指針對並非NK細胞之尋常目標之細胞的NK細胞毒性。導向的NK介導之細胞毒性亦可指代NK細胞對目標細胞之細胞毒性相較於對此目標細胞之內源性NK反應更大。導向的NK介導之細胞毒性可由能夠使NK細胞導向目標細胞的藥劑介導，該藥劑諸如包含至少一個結合NKp46之VHH域及至少一個結合目標細胞上之抗原之VHH的多肽。因而，包含至少一個結合NKp46之VHH域及至少一個結合目標細胞上之抗原之VHH的多肽可用於使NK細胞定向至目標細胞且刺激針對目標細胞的NK介導之細胞毒性。
如本文所用之「IL-2」或「介白素2」係指由在細胞中加工IL-2前驅體產生之任何原生成熟IL-2。除非另有指示，否則該術語包括來自任何脊椎動物來源之IL-2，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類及食蟹獼猴或恆河猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。該術語亦包括IL-2之天然存在之變異體，諸如剪接變異體或對偶基因變異體。非限制性的例示性人類IL-2胺基酸序列展示於例如GenBank寄存編號NP_000577.2中。參見SEQ ID NO. 30 (成熟形式)。
如本文所用之「經修飾之IL-2」係指因至少一個胺基酸位置處之取代而不同於野生型IL-2胺基酸序列的多肽。
如本文所用之術語「IL-2活性」或IL-2之「生物活性」包括IL-2之任一生物效應或生物學相關功能中之至少一者。在一些實施例中，IL-2活性包括IL-2誘導T細胞增殖及/或活化自然殺手(NK)細胞之能力。非限制性的例示性IL-2活性包括增加pSTAT5表現、增加淋巴球及其他周邊血液單核細胞(PBMC)之增殖、增加NK細胞之顆粒酶B表現。
如本文所用，「NKp46結合多肽」及「靶向NKp46之多肽」可互換使用以指代包含結合(諸如特異性結合)於NKp46之結合域的多肽。
術語「特異性結合」於抗原或抗原決定基為此項技術中充分理解之術語，且用於測定此特異性結合之方法亦為此項技術中所熟知。若分子與特定細胞或物質之反應或結合比其與替代性細胞或物質更頻繁、更快速、持續時間更長及/或親和力更大，則稱其展現「特異性結合」或「優先結合」。若單域抗體(sdAb)或含VHH多肽與目標之結合比其與其他物質之結合親和力更大、親合力更大、更容易及/或持續時間更長，則稱其「特異性結合」或「優先結合」於目標。舉例而言，特異性或優先結合於NKp46抗原決定基之sdAb或含VHH多肽為與此抗原決定基之結合比其與其他NKp46抗原決定基或非NKp46抗原決定基之結合親和力更大、親合力更大、更容易及/或持續時間更長的sdAb或含VHH多肽。藉由閱讀此定義，亦應理解，例如特異性或優先結合於第一目標之sdAb或含VHH多肽可能或可能不特異性或優先結合於第二目標。因而，「特異性結合」或「優先結合」不一定要求(儘管其可包括)排他性結合。一般而言但未必，提及結合意謂優先結合。「特異性」係指結合蛋白選擇性結合抗原之能力。
術語「抑制(inhibition/inhibit)」係指任何表現型特徵減少或停止，或彼特徵之發生率、程度或可能性降低或停止。「降低」或「抑制」係使活性、功能及/或量相較於參考減少、降低或停滯。在一些實施例中，「降低」或「抑制」意謂整體減少10%或更多之能力。在一些實施例中，「降低」或「抑制」意謂整體減少50%或更多之能力。在一些實施例中，「降低」或「抑制」意謂整體減少75%、85%、90%、95%或更多之能力。在一些實施例中，相對於一段時間內之對照而言，在同一段時間內抑制或減少上文所提及之量。
如本文所用，術語「抗原決定基」係指抗原結合分子(例如sdAb或含VHH多肽)在目標分子(例如抗原，諸如蛋白質、核酸、碳水化合物或脂質)上結合之位點。抗原決定基常常包括一組表面具有化學活性之分子，諸如胺基酸、多肽或糖側鏈，且具有特定三維結構特徵以及荷質比特徵。抗原決定基可由目標分子之相鄰及/或併接非相鄰殘基(例如胺基酸、核苷酸、糖、脂質部分體(moiety))形成。由相鄰殘基(例如胺基酸、核苷酸、糖、脂質部分體)形成之抗原決定基通常在暴露於變性溶劑時得以保留，而藉由三級摺疊形成之抗原決定基通常在用變性溶劑處理時丟失。抗原決定基可包括但不限於至少3個、至少5個或8至10個殘基(例如胺基酸或核苷酸)。在一些實施例中，抗原決定基之長度小於20個殘基(例如胺基酸或核苷酸)、小於15個殘基或小於12個殘基。若兩個抗體對一抗原展現競爭性結合，則其可結合該抗原內之同一個抗原決定基。在一些實施例中，可藉由距抗原結合分子上之CDR殘基之某一最小距離鑑別抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基可藉由以上距離鑑別，且進一步受限於抗原結合分子之殘基與抗原殘基之間的一鍵(例如氫鍵)所包含之彼等殘基。抗原決定基亦可藉由各種掃描來鑑別，例如丙胺酸或精胺酸掃描可指示抗原結合分子可進行相互作用之一或多個殘基。除非明確表示，否則作為抗原決定基之一組殘基不排除其他殘基作為特定抗原結合分子之抗原決定基的部分。實際上，該組之存在表示最小的抗原決定基系列(或物種組合)。因此，在一些實施例中，鑑別為抗原決定基之一組殘基表示該抗原之最小相關抗原決定基，而非抗原上之抗原決定基的排他性殘基清單。
「非線性抗原決定基」或「構形抗原決定基」包含在對抗原決定基具有特異性之抗原結合分子所結合之抗原蛋白質內的非相鄰多肽、胺基酸及/或糖。在一些實施例中，至少一個殘基將與抗原決定基之其他所指出之殘基不相鄰；然而，一或多個殘基亦可與其他殘基相鄰。
「線性抗原決定基」包含在對抗原決定基具有特異性之抗原結合分子所結合之抗原蛋白質內的相鄰多肽、胺基酸及/或糖。應注意，在一些實施例中，並非線性抗原決定基內之每一個殘基均需要與抗原結合分子直接結合(或包含於鍵中)。在一些實施例中，線性抗原決定基可來自用有效地由線性抗原決定基之序列組成之肽免疫，或來自與蛋白質之其餘部分相對分離的蛋白質之結構部分(使得抗原結合分子可至少首先僅與彼序列部分相互作用)。
術語「抗體」以最廣泛意義使用且涵蓋包含抗體樣抗原結合域之各種多肽，包括但不限於習知抗體(通常包含至少一個重鏈及至少一個輕鏈)、單域抗體(sdAb，包含至少一個VHH域及Fc區)、含VHH多肽(包含至少一個VHH域之多肽)及前述中之任一者之片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。在一些實施例中，抗體包含二聚化域。此類二聚化域包括但不限於重鏈恆定域(包含C H1、鉸鏈、C H2及C H3，其中C H1通常與輕鏈恆定域CL配對，而C H3及/或鉸鏈介導二聚化)及Fc區(包含鉸鏈、C H2及C H3，其中C H3及/或鉸鏈介導二聚化)。
術語抗體亦包括但不限於嵌合抗體、人源化抗體及諸如駱駝(包括駱馬)、鯊魚、小鼠、人類、食蟹獼猴等各種物種之抗體。
如本文所用之術語「抗原結合域」係指抗體足以結合抗原之一部分。在一些實施例中，習知抗體之抗原結合域包含三個重鏈CDR及三個輕鏈CDR。因此，在一些實施例中，抗原結合域包含：重鏈可變區，其包含CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3及維持結合於抗原所需的FR1及/或FR4之任何部分；及輕鏈可變區，其包含CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3及維持結合於抗原所需的FR1及/或FR4之任何部分。在一些實施例中，sdAb或含VHH多肽之抗原結合域包含VHH域之三個CDR。因此，在一些實施例中，sdAb或含VHH多肽之抗原結合域包含VHH域，該VHH域包含CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3及維持結合於抗原所需的FR1及/或FR4之任何部分。
如本文所用之術語「VHH」或「VHH域」或「VHH抗原結合域」係指諸如駱駝抗體或鯊魚抗體之單域抗體之抗原結合部分。在一些實施例中，VHH包含三個CDR及四個構架區，稱為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。在一些實施例中，VHH可在N端或C端截短，使得其僅包含部分FR1及/或FR4，或缺乏彼等構架區中之一者或兩者，只要VHH實質上維持抗原結合及特異性即可。
術語「單域抗體」及「sdAb」在本文中可互換使用以指代包含至少一個無輕鏈單體域(諸如VHH域)及Fc區之抗體。在一些實施例中，sdAb為兩種多肽之二聚體，其中各多肽包含至少一個VHH域及Fc區。如本文所用，術語「單域抗體」及「sdAb」涵蓋包含多個VHH域之多肽，諸如具有結構VHH 1-VHH 2-Fc或VHH 1-VHH 2-VHH 3-Fc之多肽，其中VHH 1、VHH 2及VHH 3可相同或不同。
術語「含VHH多肽」係指包含至少一個VHH域之多肽。在一些實施例中，VHH多肽包含兩個、三個或四個或更多個VHH域，其中各VHH域可相同或不同。在一些實施例中，含VHH多肽包含Fc區。在一些此類實施例中，含VHH多肽可稱作sdAb。此外，在一些此類實施例中，VHH多肽可形成二聚體。含VHH多肽(亦為sdAb)之非限制性結構包括VHH 1-Fc、VHH 1-VHH 2-Fc及VHH 1-VHH 2-VHH 3-Fc，其中VHH 1、VHH 2及VHH 3可相同或不同。在此類結構之一些實施例中，一個VHH可藉由連接子連接至另一VHH，或一個VHH可藉由連接子連接至Fc。在一些此類實施例中，連接子包含1-20個胺基酸，較佳為1-20個主要包含甘胺酸且視情況包含絲胺酸之胺基酸。在一些實施例中，連接子包含：Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 45)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 46)及/或Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser (SEQ ID NO: 47)。在一些實施例中，當含VHH多肽包含Fc時，其形成二聚體。因此，若結構VHH 1-VHH 2-Fc形成二聚體，則認為其為四價的(亦即，二聚體具有四個VHH域)。類似地，若結構VHH 1-VHH 2-VHH 3-Fc形成二聚體，則認為其為六價的(亦即，二聚體具有六個VHH域)。
術語「單株抗體」係指大體上同質之抗體群的抗體(包括sdAb或含VHH多肽)，亦即，構成此群體之個別抗體除可能存在少量天然存在之突變以外均相同。單株抗體針對單一抗原位點具高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，單株抗體之樣本可結合於抗原上之同一抗原決定基。修飾語「單株」指示抗體之特性係自實質上同質之抗體群獲得，且不應理解為需要藉由任何特殊方法來產生該抗體。舉例而言，單株抗體可藉由Kohler及Milstein, 1975, Nature 256:495首次描述之融合瘤方法製造，或可藉由諸如美國專利第4,816,567號中所描述之重組DNA方法製造。舉例而言，單株抗體亦可自使用McCafferty等人，1990, Nature 348:552-554中所描述之技術產生的噬菌體庫中分離。
術語「CDR」表示互補決定區，如由熟習此項技術者藉由至少一種鑑別方式所定義。在一些實施例中，CDR可根據Chothia編號方案、Kabat編號方案、Kabat與Chothia之組合、AbM定義及/或contact定義中之任一者來定義。VHH包含三個CDR，稱為CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，CDR係根據AbM定義來定義。
如本文所用之術語「重鏈恆定區」係指包含至少三個重鏈恆定域C H1、鉸鏈、C H2及C H3的區域。當然，除非另外指出，否則該等域內不改變功能之缺失及更改涵蓋在術語「重鏈恆定區」之範疇內。非限制性例示性重鏈恆定區包括γ、δ及α。非限制性例示性重鏈恆定區亦包括ε及μ。各重鏈恆定區對應於一抗體同型。舉例而言，包含γ恆定區之抗體為IgG抗體，包含δ恆定區之抗體為IgD抗體，且包含α恆定區之抗體為IgA抗體。此外，包含μ恆定區之抗體為IgM抗體，且包含ε恆定區之抗體為IgE抗體。某些同型可進一步細分為子類。舉例而言，IgG抗體包括但不限於IgG1 (包含γ 1恆定區)、IgG2 (包含γ 2恆定區)、IgG3 (包含γ 3恆定區)及IgG4 (包含γ 4恆定區)抗體；IgA抗體包括但不限於IgA1 (包含α 1恆定區)及IgA2 (包含α 2恆定區)抗體；且IgM抗體包括但不限於IgM1及IgM2。
如本文所用之「Fc區」係指包含C H2及C H3之重鏈恆定區之部分。在一些實施例中，Fc區包含鉸鏈、C H2及C H3。在一些實施例中，Fc區不包含鉸鏈。在各種實施例中，當Fc區包含鉸鏈時，鉸鏈及/或C H3介導兩個含Fc之多肽之間的二聚化。在各種實施例中，當Fc區不包含鉸鏈時，C H3介導兩個含Fc多肽之間的二聚化。Fc區可為本文所論述之任何抗體重鏈恆定區同型。在一些實施例中，Fc區為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
如本文所論述，如本文所用之「接受體人類構架」為包含源自人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之重鏈可變域(V H)構架之胺基酸序列的構架。源自人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含與其相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列改變。在一些實施例中，單一抗原結合域(諸如VHH)中之所有人類構架之胺基酸改變之數目少於10，或少於9，或少於8，或少於7，或少於6，或少於5，或少於4，或少於3。
「親和力」係指分子(例如抗體，諸如sdAb，或含VHH多肽)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。分子X對其搭配物Y之親和力或表觀親和力一般可分別由解離常數(K d)或K d- 表觀表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法(諸如ELISA K d、KinExA、流動式細胞測量術及/或表面電漿子共振裝置)，包括本文所描述之方法來量測。此類方法包括(但不限於)涉及BIAcore®、Octet®或流動式細胞測量術之方法。
如本文所用之術語「K d」係指抗原結合分子/抗原相互作用之平衡解離常數。當本文使用術語「K d」時，其包括K d及K d- 表觀。
在一些實施例中，抗原結合分子之K d係藉由流動式細胞測量術使用表現抗原之細胞株及將在各抗體濃度下量測之平均螢光與非線性單點結合方程式擬合(Prism Software GraphPad)來量測。在一些此類實施例中，K d為K d- 表觀。
術語「生物活性」係指分子之任一或多種生物特性(無論係在活體內發現為天然存在，或係藉由重組方式提供或實現)。生物特性包括(但不限於)結合配體，誘導或增加細胞增殖(諸如NK細胞增殖)，誘導或增加細胞活化(諸如NK細胞活化)，及誘導或增加細胞介素表現。
「促效劑」或「活化」抗體為增加及/或活化目標抗原之生物活性的抗體。在一些實施例中，促效劑抗體結合於抗原且使其生物學活性增加至少約20%、40%、60%、80%、85%或更多。
「拮抗劑」、「阻斷」或「中和」抗體為抑制、降低及/或不活化目標抗原之生物活性的抗體。在一些實施例中，中和抗體結合於抗原且使其生物學活性降低至少約20%、40%、60%、80%、85%、90%、95%、99%或更多。
「親和力成熟」之sdAb或含VHH多肽係指sdAb或含VHH多肽在一或多個CDR中具有一或多個改變，相較於沒有此類改變之親本sdAb或含VHH多肽，此類改變造成改善該sdAb或含VHH多肽對抗原之親和力。
如本文所用之「人源化VHH」係指其中一或多個構架區已實質上經人類構架區置換之VHH。在一些情況下，人類免疫球蛋白之某些構架區(FR)殘基經對應非人類殘基置換。此外，人源化VHH可包含不存在於原始VHH或人類構架序列中，但包括在其中以進一步改進及最佳化sdAb或含VHH多肽效能的殘基。在一些實施例中，人源化sdAb或含VHH多肽包含人類Fc區。如將瞭解，人源化序列可藉由其一級序列鑑別，且未必代表產生該抗體之過程。
「效應子陽性Fc區」具有原生序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括Fc受體結合；Clq結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；對細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化等。此類效應功能一般需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合且可使用各種分析來評定。
「原生序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。原生序列人類Fc區包括原生序列人類IgG1 Fc區(非A及A同種異型)；原生序列人類IgG2 Fc區；原生序列人類IgG3 Fc區；及原生序列人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變異體。
「變異Fc區」包含與原生序列Fc區之胺基酸序列相差至少一個胺基酸修飾的胺基酸序列。在一些實施例中，「變異Fc區」包含與原生序列Fc區之胺基酸序列相差至少一個胺基酸修飾，但保留原生序列Fc區之至少一種效應功能的胺基酸序列。在一些實施例中，變異Fc區相較於原生序列Fc區或相較於親本多肽之Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如在原生序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中的約一個至約十個胺基酸取代，且較佳約一個至約五個胺基酸取代。在一些實施例中，本文中之變異Fc區與原生序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有至少約80%序列一致性、至少約90%序列一致性、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。
「Fc受體」或「FcR」描述結合於抗體之Fc區之受體。在一些實施例中，FcγR為原生人類FcR。在一些實施例中，FcR為結合IgG抗體之FcR (γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括彼等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，兩者具有主要在其細胞質域方面不同的類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(ITIM)。(參見例如Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。FcR綜述於例如Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol9:457-92 (1991)；Capel等人, Immunomethods4:25-34 (1994)；及de Haas等人, J. Lab. Clin. Med.126:330-41 (1995)中。本文中之術語「FcR」涵蓋包括將來鑑別之FcR的其他FcR。舉例而言，術語「Fc受體」或「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人, J. Immunol.117:587 (1976)及Kim等人, J. Immunol.24:249 (1994))且調控免疫球蛋白之恆定。與FcRn之結合之量測方法為已知的(參見例如Ghetie及Ward, Immunol. Today18(12):592-598 (1997)；Ghetie等人, Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton等人, J. Biol. Chem.279(8):6213-6216 (2004)；WO 2004/92219 (Hinton等人))。
如本文所用之術語「實質上類似」或「實質上相同」表示兩個或更多個數值之間的類似度足夠高，以使得在藉由該值量測生物特徵之情況下，熟習此項技術者將認為該兩個或更多個值之間的差異具有極小或不具有生物及/或統計顯著性。在一些實施例中，兩個或更多個實質上類似的值相差大致不超過以下中之任一者：5%、10%、15%、20%、25%或50%。
多肽「變異體」意謂在比對序列且必要時引入空位以達到最大序列一致性百分比且不考慮任何保守取代為序列一致性之一部分之後，與原生序列多肽具有至少約80%胺基酸序列一致性的生物活性多肽。此類變異體包括例如在多肽之N端或C端添加或缺失一或多個胺基酸殘基之多肽。在一些實施例中，變異體將具有至少約80%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，變異體將具有至少約90%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，變異體與原生序列多肽將具有至少約95%胺基酸序列一致性。
如本文所用，關於肽、多肽或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」及「同源性」定義為在比對序列且必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比且不考慮任何保守取代為序列一致性之一部分之後，候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基的百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以在此項技術之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於量測比對之適當參數，包括用於達成所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法。
胺基酸取代可包括但不限於將多肽中之一個胺基酸置換為另一胺基酸。例示性取代展示於表1中。胺基酸取代可引入所關注之抗體中且根據所需活性(例如保持/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC)篩選產物。 表1
原始殘基 例示性取代
Ala (A) Val; Leu; Ile
Arg (R) Lys; Gln; Asn
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg
Asp (D) Glu; Asn
Cys (C) Ser; Ala
Gln (Q) Asn; Glu
Glu (E) Asp; Gln
Gly (G) Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 正白胺酸
Leu (L) 正白胺酸; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K) Arg; Gln; Asn
Met (M) Leu; Phe; Ile
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Pro (P) Ala
Ser (S) Thr
Thr (T) Val; Ser
Trp (W) Tyr; Phe
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 正白胺酸
胺基酸可根據共同的側鏈特性分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro； (6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將必然伴有將此等類別中之一者之成員換成另一類別。
術語「載體」用於描述可經工程改造為含有可在宿主細胞中繁殖之一或多個經選殖之聚核苷酸的聚核苷酸。載體可包括以下元件中之一或多個：複製起點、一或多個調控所關注多肽之表現的調控序列(諸如啟動子及/或強化子)及/或一或多個可選標記基因(諸如抗生素抗性基因及可用於比色分析中之基因，例如β-半乳糖苷酶)。術語「表現載體」係指用於表現宿主細胞中之所關注多肽之載體。
「宿主細胞」係指可為或已為載體或經分離聚核苷酸之接受者的細胞。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。例示性真核細胞包括哺乳動物細胞，諸如靈長類動物或非靈長類動物細胞；真菌細胞，諸如酵母；植物細胞；以及昆蟲細胞。非限制性的例示性哺乳動物細胞包括但不限於NSO細胞、PER.C6®細胞(Crucell)以及293及CHO細胞，以及其衍生物，諸如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S及CHO-DS細胞。宿主細胞包括單個宿主細胞之子代，且子代可能由於天然、偶然或有意突變而不一定與原始親本細胞完全一致(在形態或基因體DNA補體方面)。宿主細胞包括在活體內經本文提供之聚核苷酸轉染之細胞。
如本文所用之術語「經分離」係指已與自然界中通常一起發現或產生的至少一些組分分離的分子。舉例而言，當多肽與產生多肽之細胞的至少一些組分分離時，該多肽稱作「經分離」。在多肽在表現後由細胞分泌之情況下，使含有多肽之上清液與產生其之細胞在實體上分離視為「分離」多肽。類似地，當聚核苷酸不為自然界中通常發現其之較大聚核苷酸(諸如在DNA聚核苷酸之情況下為基因體DNA或粒線體DNA)之部分，或與產生其之細胞之至少一些組分分離(例如在RNA聚核苷酸之情況下)時，該聚核苷酸稱作「經分離」。因此，宿主細胞內部之載體中所含的DNA聚核苷酸可稱作「經分離」。
術語「個體(individual)」與「受試者(subject)」在本文中可互換使用以指代動物；例如哺乳動物。在一些實施例中，提供治療哺乳動物之方法，該等哺乳動物包括但不限於人類、嚙齒動物、猿猴、貓科動物、犬科動物、馬科動物、牛科動物、豬科動物、綿羊、山羊、哺乳類實驗室動物、哺乳類農畜、哺乳類競技動物及哺乳類寵物。在一些實例中，「個體」或「受試者」係指需要治療疾病或病症之個體或受試者。在一些實施例中，接受治療之受試者可為患者，表明以下事實：該受試者已鑑別為患有與該治療有關聯之病症，或有極大的風險患上該病症。
如本文所用之「疾病」或「病症」係指需要及/或期望治療之病況。
除非另有指示，否則術語「腫瘤細胞」、「癌細胞」、「癌症」、「腫瘤」及/或「贅瘤」在本文中可互換使用，且係指展現生長不受控及/或細胞存活異常增加及/或抑制細胞凋亡之(多個)細胞，其干擾身體器官及系統之正常功能。此定義包括良性及惡性癌症、血液癌(諸如白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤)、息肉、增生以及休眠腫瘤或微轉移(micrometastases)。
術語「癌症」及「腫瘤」涵蓋實體癌症及血液/淋巴癌，且亦涵蓋惡性、癌前及良性生長，諸如發育不良。例示性癌症包括但不限於：基底細胞癌；膽道癌；膀胱癌；骨癌；腦及中樞神經系統癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛膜癌；大腸直腸癌；結締組織癌；消化系統癌；子宮內膜癌；食道癌；眼癌；頭頸癌；胃癌(包括胃腸癌)；神經膠母細胞瘤；肝癌；肝腫瘤；上皮內贅瘤；腎癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神經母細胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口癌及咽癌)；卵巢癌；胰臟癌；前列腺癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統癌；唾液腺癌；肉瘤；皮膚癌；鱗狀細胞癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮或子宮內膜癌；泌尿系統癌；外陰癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤，以及B細胞淋巴瘤(包括低惡性度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL) NHL；中惡性度/濾泡性NHL；中惡性度瀰漫性NHL；高惡性度免疫母細胞NHL；高惡性度淋巴母細胞NHL；高惡性度小型無裂隙細胞NHL；巨瘤症NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤；以及華氏巨球蛋白血症；急性骨髓性白血病(AML)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母細胞性白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性骨髓母細胞性白血病；以及其他癌瘤及肉瘤；及移植後淋巴增生性病症(PTLD)，以及與母斑病、水腫(諸如與腦瘤相關)及梅格斯氏症候群(Meigs'syndrome)相關之異常血管增生。
如本文所用之術語「非腫瘤細胞」係指正常細胞或組織。例示性非腫瘤細胞包括但不限於：T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、樹突狀細胞、單核球、巨噬細胞、上皮細胞、纖維母細胞、肝細胞、間質性腎細胞、纖維母細胞樣滑膜細胞、骨母細胞以及位於乳房、骨骼肌、胰臟、胃、卵巢、小腸、胎盤、子宮、睪丸、腎臟、肺、心臟、腦、肝、前列腺、大腸、淋巴器官、骨及骨源性間葉幹細胞中之細胞。如本文所用之術語「位於周邊之細胞或組織」係指並非位於腫瘤細胞附近及/或腫瘤微環境內部之非腫瘤細胞。
如本文所用之術語「腫瘤微環境內之細胞或組織」係指圍繞及/或喂飼腫瘤細胞之細胞、分子、細胞外基質及/或血管。腫瘤微環境內之例示性細胞或組織包括但不限於：腫瘤脈管；腫瘤浸潤淋巴球；纖維母細胞網狀細胞；內皮先驅細胞(endothelial progenitor cell；EPC)；癌症相關纖維母細胞；外被細胞；其他基質細胞；細胞外基質(ECM)之組分；樹突狀細胞；抗原呈遞細胞；T細胞；調控性T細胞(Treg細胞)；NK細胞；巨噬細胞；嗜中性球；骨髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell；MDSC)及位於靠近腫瘤處之其他免疫細胞。如下文中所描述，此項技術中熟知用於鑑別腫瘤細胞及/或位於腫瘤微環境內之細胞/組織的方法。
如本文所用之術語「感染性疾病」係指由病原性病毒、細菌或真菌引起之疾病。
在一些實施例中，「增加」或「減少」分別係指統計學上顯著之增加或減少。如熟習此項技術者將顯而易見，「調節」亦可包括相較於相同條件但不存在測試劑之情形，對目標或抗原之配體、結合搭配物、搭配物中之一或多者結合為同多聚體或異多聚體形式或受質之親和力、親合力、特異性及/或選擇性實現改變(可為增加或減少)；對目標或抗原對該目標或抗原所存在之介質或環境中之一或多種條件(諸如pH、離子強度、輔因子之存在等)的敏感度實現改變(可為增加或減少)；及/或細胞增殖或細胞介素產生。視所涉及之目標而定，此可藉由任何合適方式及/或使用本身已知或本文所描述之任何合適分析來測定。
如本文所用，「免疫反應」意謂涵蓋足以抑制或預防疾病發作或改善疾病症狀(例如感染性疾病或癌症或癌轉移)之細胞及/或體液免疫反應。「免疫反應」可涵蓋先天性及後天性免疫系統兩者之態樣。
如本文所用，「治療」為用於獲得有益的或所期望的臨床結果之途徑。如本文所用之「治療」覆蓋針對疾病對包括人類之哺乳動物進行的任何治療劑之投與或施用。出於本發明之目的，有益或所期望的臨床結果包括但不限於以下中之任一種或多種：緩解一或多種症狀、減弱疾病程度、預防或延遲疾病擴散(例如轉移，例如轉移至肺或淋巴結)、預防或延遲疾病復發、延遲或減緩疾病進展、改善疾病狀態、抑制疾病或疾病進展、抑制或減緩疾病或其進展、遏制其發展及緩解(無論部分抑或完全)。「治療」亦涵蓋增生性疾病之病理結果之減輕。本文提供之方法考慮此等治療態樣中之任何一或多者。根據上文，術語治療不需要百分之一百移除病症之所有態樣。
「改善」意謂相較於未投與治療劑，一或多種症狀得以減輕或改善。「改善」亦包括症狀之持續時間縮短或減少。
術語「抗癌劑」在本文中以其最廣含義用於係指用於治療一或多種癌症之藥劑。例示性種類之此等藥劑包括但不限於化學治療劑、抗癌生物製劑(諸如細胞介素、受體細胞外域-Fc融合體及抗體)、放射線療法、CAR-T療法、治療性寡核苷酸(諸如反義寡核苷酸及siRNA)及溶瘤病毒。
術語「生物樣本」意謂一定量的來自活物或先前為活物之物質。此類物質包括但不限於血液(例如全血)、血漿、血清、尿液、羊水、滑液、內皮細胞、白血球、單核球、其他細胞、器官、組織、骨髓、淋巴結及脾臟。
術語「對照」或「參考」係指已知不含分析物之組合物(「陰性對照」)或已知含有分析物之組合物(「陽性對照」)。陽性對照可包含已知濃度之分析物。
如本文所用，「延遲疾病發展」意謂推遲、阻礙、減緩、扼止、穩定、抑制及/或延緩疾病(諸如癌症)之發展。視疾病病史及/或所治療之個體而定，此延遲可具有不同時間長度。如熟習此項技術者顯而易見，充分或顯著延遲可實際上涵蓋預防，使得該個體不罹患疾病。舉例而言，可延遲晚期癌症，諸如癌轉移發展。
如本文所用之「預防」包括在一疾病在受試者中之出現或復發方面提供預防作用，該受試者可能易患該疾病但尚未診斷患有該疾病。除非另有規定，否則術語「降低」、「抑制」或「預防」不表示或不要求一直完全預防，而僅在所量測之時間段內。
物質/分子(促效劑或拮抗劑)之「治療有效量」可根據以下因素改變：諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重以及物質/分子(促效劑或拮抗劑)在個體體內引發所需反應之能力。治療有效量亦為治療學有益作用超過物質/分子(促效劑或拮抗劑)之任何毒性或有害作用的量。治療有效量可在一或多次投與中遞送。治療有效量係指可在所需的劑量及時間段有效達成所需治療及/或預防結果之量。
術語「醫藥調配物」及「醫藥組合物」可互換使用且係指所呈形式允許活性成分之生物活性有效，且不含對調配物將投與之受試者具有不可接受毒性之額外組分的製劑。此類調配物可為無菌的。
「醫藥學上可接受之載劑」係指此項技術中習知的無毒固體、半固體或液體填補劑、稀釋劑、囊封材料、調配助劑或載劑，其與治療劑一起使用，一起構成「醫藥組合物」以供投與受試者。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒且與調配物之其他成分相容。醫藥學上可接受之載劑適於所用之調配物。
與一或多種其他治療劑「組合」投與包括同時(並行)及以任何次序依序投與。
術語「並行」在本文中用以指代投與兩種或更多種治療劑，其中投與之至少部分在時間上重疊，或其中一種治療劑之投與落入針對另一治療劑之投與的一較短時間段內，或其中兩種藥劑之治療作用重疊至少一個時間段。
術語「依序」在本文中用以指代兩種或更多種治療劑之投與在時間上不重疊，或其中該等藥劑之治療作用不重疊。
如本文所用，「結合」係指除一種治療模式以外亦投與另一種治療模式。因此，「結合」係指在向個體投與一種治療模式之前、期間或之後投與另一種治療模式。
術語「藥品說明書」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中的說明，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或警告的資訊。
「製品」為包含至少一種試劑，例如用於治療疾病或病症(例如癌症)之藥物或用於特異性偵測本文所描述之生物標記物之探針的任何製品(例如包裝或容器)或套組。在一些實施例中，製品或套組係以用於執行本文所描述之方法之單元形式推銷、分銷或出售。
術語「標記」及「可偵測標記」意謂附著至例如抗體或抗原以使得特異性結合對之成員之間的反應(例如結合)可偵測之部分體。特異性結合對之經標記成員稱作「經可偵測地標記」。因此，術語「經標記之結合蛋白」係指併入有標記以便鑑別結合蛋白之蛋白質。在一些實施例中，標記為可產生可藉由目視或儀器方式偵測的信號之可偵測標記物，例如併入經放射性標記之胺基酸或連接至可藉由經標記之抗生物素蛋白(例如含有可藉由光學或比色方法偵測之螢光標記物或酶活性的鏈黴親和素)偵測之生物素基部分體的多肽。用於多肽之標記的實例包括但不限於以下：放射性同位素或放射性核素(例如 3H、 14C、 35S、 90Y、 99Tc、 111In、 125I、 131I、 177Lu、 166Ho或 153Sm)；色素原、螢光標記(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系磷光體(lanthanide phosphor))、酶標記(例如辣根過氧化酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；化學發光標記物；生物素基；由二級報導子識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)；及磁化劑，諸如釓螯合物。常用於免疫分析之標記之代表性實例包括產生光之部分體，例如吖錠化合物，及產生螢光之部分體，例如螢光素。就此而言，該部分體自身可能並未經可偵測標記，但可在與又一部分體反應之後變為可偵測的。 例示性的靶向 NKp46 之 經修飾之 IL-2 多肽
本文提供靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在各種實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域且包含經修飾之IL-2。在一些實施例中，NKp46為人類NKp46。在一些實施例中，本文所提供之靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個結合NKp46之VHH域。在一些實施例中，本文所提供之靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含一個、兩個、三個或四個結合NKp46之VHH域。靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可包含一或多個結合除NKp46外之一或多種目標蛋白的VHH域。此類多肽可稱作「多特異性」多肽。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域、Fc區及經修飾之IL-2。在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含一個、兩個、三個或四個VHH域、Fc區及經修飾之IL-2。在一些實施例中，Fc區介導靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽在生理學條件下之二聚化以使得形成NKp46結合位點之數目加倍之二聚體。舉例而言，包含三個結合NKp46之VHH域、Fc區及經修飾之IL-2的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽作為單體為三價的，但在生理條件下，Fc區可介導二聚化，使得靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽在此類條件下以六價二聚體形式存在。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少兩個VHH域，其中第一VHH域結合NKp46之第一抗原決定基且第二VHH域結合NKp46之第二抗原決定基。當靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含結合NKp46之第一抗原決定基之VHH域及結合NKp46之第二抗原決定基的VHH域時，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可稱作「雙抗原決定基的」或「雙特異性的」。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少兩個VHH域，其中第一VHH域結合NKp46且第二VHH域結合除NKp46外之抗原。此類多肽可稱作「雙特異性的」或「多特異性的」。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽為包含結合NKp46之第一VHH域、第一Fc域及經修飾之IL-2多肽的第一多肽與包含結合NKp46之第二VHH域及第二Fc域的第二多肽的複合體。在一些此類實施例中，第一或第二Fc域包含「杵」突變且另一Fc域包含「臼」突變。因此，在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽為第一多肽與第二多肽之複合體，其中該複合體包含兩個NKp46結合VHH域及一個經修飾之IL-2多肽。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽為包含結合NKp46之第一VHH域及第一Fc域的第一多肽與包含第二Fc域、經修飾之IL-2多肽及視情況存在之第二VHH域的第二多肽的複合體。在一些此類實施例中，第一或第二Fc域包含「杵」突變且另一Fc域包含「臼」突變。因此，在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2複合體在複合體之不同多肽內包含NKp46結合VHH域及一個經修飾之IL-2多肽。 結合 NKp46 之例示性的靶向 NKp46 之域
在各種實施例中，結合NKp46之VHH域包含SEQ ID NO: 17之CDR1序列；選自SEQ ID NO: 18、19、20及21之CDR2序列；及選自SEQ ID NO: 22、23、24、25、26及27之CDR3序列。在各種實施例中，結合NKp46之VHH域包含選自以下之CDR1、CDR2及CDR3序列：SEQ ID NO: 17、18及22；SEQ ID NO: 17、19及22；SEQ ID NOs: 17、20及22；SEQ ID NO: 17、21及22；SEQ ID NO: 17、18及23；SEQ ID NO: 17、18及24；SEQ ID NO: 17、18及25；SEQ ID NO: 17、18及26；及SEQ ID NO: 17、18及27。
在一些實施例中，結合NKp46之VHH域包含與選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15及16之胺基酸序列至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，結合NKp46之VHH域包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15及16之胺基酸序列。在一些實施例中，結合NKp46之VHH域包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15及16之胺基酸序列，其中VHH域包含K125D、K125E或K125R突變。
非限制性的例示性靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽展示於表2中。指定單域抗體之序列展示於本文中的某些序列之表格中。 表2：包含至少一個結合NKp46之VHH的多肽
名稱 CDR VHH
5D7 SEQ ID NO: 17、18及22 SEQ ID NO: 1
hz5D7v1 SEQ ID NO: 17、18及22 SEQ ID NO: 2
hz5D7v2 SEQ ID NO: 17、18及22 SEQ ID NO: 3
hz5D7v3 SEQ ID NO: 17、18及22 SEQ ID NO: 4
hz5D7v4 SEQ ID NO: 17、18及22 SEQ ID NO: 5
hz5D7v7 SEQ ID NO: 17、18及22 SEQ ID NO: 6
hz5D7v8 SEQ ID NO: 17、20及22 SEQ ID NO: 7
hz5D7v9 SEQ ID NO: 17、21及22 SEQ ID NO: 8
hz5D7v10 SEQ ID NO: 17、18及22 SEQ ID NO: 9
hz5D7v11 SEQ ID NO: 17、18及23 SEQ ID NO: 10
hz5D7v12 SEQ ID NO: 17、18及24 SEQ ID NO: 11
hz5D7v13 SEQ ID NO: 17、18及25 SEQ ID NO: 12
hz5D7v14 SEQ ID NO: 17、18及26 SEQ ID NO: 13
hz5D7v15 SEQ ID NO: 17、18及27 SEQ ID NO: 14
hz5D7v17 SEQ ID NO: 17、18及24 SEQ ID NO: 15
hz5D7v12L SEQ ID NO: 17、18及24 SEQ ID NO: 16
在各種實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含一個、兩個、三個或四個結合NKp46之VHH域。
在各種實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域及至少一個結合除NKp46外之抗原的結合域。在一些實施例中，至少一個結合除NKp46外之抗原的結合域為VHH域。舉例而言，在一些實施例中，至少一個結合除NKp46外之抗原的VHH域結合T細胞抗原、非NKp46之自然殺手細胞抗原或腫瘤抗原。
在一些此類實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可稱作多特異性抗體。多特異性意謂靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可結合於一或多個除NKp46以外之抗原。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可介導超過一種生物功能，其中一種生物功能為結合於NKp46且一種生物功能為IL-2活性。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽為三功能的(具有三種功能)。舉例而言，如下文所描述，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可結合另一抗原(諸如腫瘤抗原)且亦具有IL-2活性。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少一個結合癌細胞之結合域。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少一個結合腫瘤抗原之結合域。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少一個結合於以下之結合域：1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFF、BCMA、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a),碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD39、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD73、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、密連蛋白3、密連蛋白4、cMet、膠原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV之F蛋白、FAP、FAS、FcRH5、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GPRC5D、GRP78、HAVCAR1、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、玻尿酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、間皮素、MICA、MICB、MRP4、MUC1、黏蛋白-16 (MUC16、CA-125)、Na/K ATPase、NGF、呆蛋白、NKG2A、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯基-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神經鞘胺醇1磷酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TGFβ受體1 (TGFBR1)、TGFβ受體2 (TGFBR2)、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、TROP-2 uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2或WISP-3。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包含至少一個結合在細胞表面上表現病毒蛋白之受病毒感染細胞的結合域。
在一些實施例中，包含於靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽中的結合域可稱為「二級靶向域」，其中該結合域結合並非NK細胞之細胞。因而，二級靶向域可使靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽靶向所關注的細胞且將NK介導之細胞毒性導向表現能夠結合二級靶向域之抗原的此細胞。舉例而言，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽的二級靶向域可為針對腫瘤抗原之抗體，且NKp46結合多肽與表現該腫瘤抗原之癌細胞的結合將NK介導之細胞毒性導向此癌細胞。在一些實施例中，二級靶向域為VHH、單域抗體、scFv、Fab或任何其他類型之抗體。在一些實施例中，二級靶向域不為抗體。在一些實施例中，二級靶向域為天然同源結合搭配物、經工程改造之細胞外結合、抗運載蛋白(Anticalin) (經工程改造脂質運載蛋白(lipocalin))、錨蛋白重複蛋白(Darpin)、菲諾體(Fynomer)、生替林(Centyrin) (經工程改造纖維結合蛋白III域(fibroneticin III域))、胱胺酸結域(cystine-knot domain)、阿菲林(Affilin)、親和抗體(Affibody)或經工程改造CH3域。
在一些實施例中，靶向NKp46之多肽包含結合於TGFβ受體1、TGFβ受體2或NKG2A之結合域，諸如VHH域。
在一些實施例中，靶向NKp46之多肽包含本文所描述之至少一個與Fc區融合的VHH域。在一些實施例中，Fc區具有選自以下之序列：SEQ ID NO: 44、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、85、86、87、88及89。在一些此類實施例中，Fc區進一步包含C端離胺酸。在一些實施例中，Fc區之C端胺基酸為除離胺酸外之胺基酸。
在一些實施例中，結合NKp46之VHH域經人源化。人源化抗體(諸如sdAb或含VHH多肽)適用作治療性分子，此係由於人源化抗體減少或消除對非人類抗體之人類免疫反應，人類免疫反應可引起對抗體治療劑之免疫反應且減小治療劑之有效性。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中CDR (或其部分)來源於非人類抗體，且FR (或其部分)來源於人類抗體序列。人源化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如CDR殘基所來源之抗體)的對應殘基取代，例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法綜述於例如Almagro及Fransson, (2008) Front. Biosci.13: 1619-1633中，且進一步描述於例如Riechmann等人,(1988) Nature332:323-329；Queen等人, (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA86: 10029-10033；美國專利第5, 821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人, (2005) Methods36:25-34；Padlan, (1991) Mol. Immunol.28:489-498 (描述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人, (2005) Methods36:43-60 (描述「FR改組」)；及Osbourn等人, (2005) Methods36:61-68；及Klimka等人, (2000) Br. J. Cancer, 83:252-260 (描述FR改組之「導引選擇」方法)。
可用於人類化之人類構架區包括但不限於：使用「最佳擬合(best-fit)」法選擇之構架區(參見例如Sims等人(1993) J. Immunol.151 :2296)；來源於具有重鏈可變區之特定子組之人類抗體的共有序列之構架區(參見例如Carter等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:4285；及Presta等人(1993) J. Immunol, 151:2623)；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson, (2008) Front. Biosci.13:1619-1633)；及來源於篩選FR庫之構架區(參見例如Baca等人, (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684及Rosok等人, (1996) J. Biol. Chem.271 :22611-22618)。通常，VHH之FR區經人類FR區置換以產生人源化VHH。在一些實施例中，人類FR之某些FR殘基經置換以便改善人源化VHH之一或多個特性。具有此等經置換殘基之VHH域在本文中仍稱作「經人源化」。 例示性的經修飾之 IL-2 多肽
本文提供包含NKP46結合VHH及經修飾之IL-2的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在一些此類實施例中，靶向NKP46之經修飾之IL-2多肽包含NKp46結合VHH、Fc區及經修飾之IL-2。在一些實施例中，經修飾之IL-2相較於野生型IL-2包含至少一個降低經修飾之IL-2對IL-2受體之親和力的胺基酸取代。在各種實施例中，本文所提供之包含經修飾之IL-2的多肽為IL-2R之促效劑。在一些實施例中，經修飾之IL-2為經修飾之人類IL-2，且IL-2R為人類IL-2R。在一些實施例中，經修飾之IL-2以比人類野生型IL-2對人類IL-2R之親和力低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍或至少100倍的親和力結合該IL-2R。
在各種實施例中，經修飾之IL-2包含在至少一個選自T3、H16、E61、P65、D84及C125之胺基酸位置處的至少一個取代。在一些實施例中，經修飾之IL-2包含在胺基酸位置T3、H16、E61、P65、D84及C125處之取代。在一些實施例中，經修飾之IL-2包含在胺基酸位置T3、H16、P65、D84及C125處之取代。在一些實施例中，經修飾之IL-2包含取代T3A、H16A、E61R、P65R、D84Y及C125S。在一些實施例中，經修飾之IL-2包含取代T3A、H16A、P65R、D84S及C125S。在一些實施例中，經修飾之IL-2包含與SEQ ID NO: 31或32至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些此類實施例中，經修飾之IL-2包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。在一些此類實施例中，經修飾之IL-2包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向NKP46之經修飾之IL-2多肽包含NKp46結合VHH、Fc區及經修飾之IL-2。在一些此類實施例中，Fc區包含選自SEQ ID NO: 44及53-89之胺基酸序列。在一些實施例中，經修飾之IL-2與Fc區之C端融合，該C端又與NKp46結合VHH之C端融合。在一些實施例中，NKp46結合VHH及Fc區藉由連接子連接，且Fc區及經修飾之IL-2藉由連接子連接。在一些此類實施例中，連接子包含1-20個胺基酸，較佳為1-20個主要包含甘胺酸且視情況包含絲胺酸之胺基酸。在一些實施例中，連接子包含：Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 45)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 46)及/或Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser (SEQ ID NO: 47)。在一些實施例中，Fc區包含至少一個杵或臼突變。在一些此類實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽為包含第二多肽之複合體的部分，該第二多肽包含NKp46結合域及第二Fc區。在一些實施例中，靶向NKP46之經修飾之IL-2多肽包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。在一些實施例中，複合體包含：包含SEQ ID NO: 34或40之胺基酸序列的第一多肽，及包含NKp46結合域及Fc區的第二多肽。在一些此類實施例中，第二多肽包含SEQ ID NO: 33或35之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽為包含第一多肽及第二多肽之複合體，其中第一多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域及第一Fc區，且第二多肽包含第二Fc區及經修飾之IL-2。在一些此類實施例中，至少一個結合NKp46之VHH域包含：包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18、19、20或21之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22、23、24、25、26或27之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，至少一個VHH域或各VHH域經人類化。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2複合體的至少一個VHH域包含與選自SEQ ID NO: 1-16之胺基酸序列至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致的胺基酸序列。在一些此類實施例中，至少一個VHH域包含選自SEQ ID NO: 1-16之胺基酸序列。在一些實施例中，結合NKp46之VHH域包含選自SEQ ID NO: 1-16之胺基酸序列，其中VHH域包含K125D、K125E或K125R突變。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2複合體的經修飾IL-2相對於野生型人類IL-2包含T3A或T3G、H16A、P65R、C125S及D84S或D84Y突變。在一些實施例中，經修飾之IL-2包含T3A、H16A、P65R、C125S及D84S突變。在一些實施例中，經修飾之IL-2包含T3A、H16A、E61R、P65R、C125S及D84Y突變。在一些實施例中，經修飾之IL-2包含與SEQ ID NO: 31或32之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，經修飾之IL-2包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2複合體的第二多肽包含至少一個抗原結合域。在一些此類實施例中，第二多肽之至少一個抗原結合域為VHH域。在一些實施例中，第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域。
在本文中描述之任一實施例中，經修飾之IL-2可為經修飾之人類IL-2。在各種實施例中，該等取代之胺基酸位置對應於SEQ ID NO: 30中之該等胺基酸位置。
在各種實施例中，包括於靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽中的Fc區為人類Fc區，或來源於人類Fc區。
在一些實施例中，包括於靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽中的Fc區來源於人類Fc區，且包含在低級鉸鏈中對應於IgG1 E233、L234及L235之三個胺基酸缺失，本文中稱作「Fc xELL」。Fc xELL多肽不接合FcγR，且因此稱為「效應子靜默」或「效應子空缺(effector null)」，然而在一些實施例中，xELL Fc區結合FcRn且因此具有延長之半衰期及與FcRn介導之再循環相關之胞吞轉送。
在一些實施例中，包括於靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽中的Fc區來源於人類Fc區且包含突變M252Y及M428V，本文中稱作「Fc-YV」。在一些實施例中，此等突變在胞內體之酸性pH (接近6.5)下增強與FcRn之結合，而在中性pH (約7.2)下失去可偵測之結合，使得FcRn介導之再循環增強且半衰期延長。
在一些實施例中，包括於靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽中之Fc區來源於人類Fc區且包含針對異二聚化經設計之突變，本文中稱作「杵」及「臼」。在一些實施例中，「杵」Fc區包含突變T366W。在一些實施例中，「臼」Fc區包含突變T366S、L368A及Y407V。在一些實施例中，用於異二聚化之Fc區包含額外突變，諸如位於形成不對稱二硫鍵之異二聚體Fc對之第一成員上之突變S354C及位於異二聚體Fc對之第二成員上之對應突變Y349C。在一些實施例，異二聚體Fc對之一個成員包含修飾H435R或H435K以阻止蛋白質A結合，同時維持FcRn結合。在一些實施例中，異二聚體Fc對之一個成員包含修飾H435R或H435K，而異二聚體Fc對之第二成員在H435處未經修飾。在各種實施例中，臼Fc區包含修飾H435R或H435K (在一些情況下當修飾為H435R時稱作「臼-R」)，而杵Fc區不包含該修飾。在一些情況下，相對於可能存在之同二聚體臼Fc區，臼-R突變改良異二聚體之純化。
在一些實施例中，包括於靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽中之Fc區來源於人類Fc區且缺乏C端離胺酸殘基。在一些實施例中，包括於靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽中之Fc區來源於人類Fc區且包含C端離胺酸殘基。
可用於靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽中的非限制性的例示性Fc區包括包含SEQ ID NO: 44及53至89之胺基酸序列的Fc區。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包括包含選自SEQ ID NO: 44、56、57、63至74及80至89之胺基酸序列的Fc區。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽包括包含選自SEQ ID NO: 44及63至74之胺基酸序列的Fc區。
在一些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽之胺基酸序列由SEQ ID NO: 34之胺基酸序列組成且第二多肽之胺基酸序列由SEQ ID NO: 33之胺基酸序列組成。在一些實施例中，第一多肽之胺基酸序列由SEQ ID NO: 40之胺基酸序列組成且第二多肽之胺基酸序列由SEQ ID NO: 33之胺基酸序列組成。在一些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽之胺基酸序列由SEQ ID NO: 42之胺基酸序列組成且第二多肽之胺基酸序列由SEQ ID NO: 41之胺基酸序列組成。在一些實施例中，第一多肽之胺基酸序列由SEQ ID NO: 43之胺基酸序列組成且第二多肽之胺基酸序列由SEQ ID NO: 41之胺基酸序列組成。 靶向 NKp46 之 經修飾之 IL-2 多肽的例示性活性
在各種實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽活體外及/或活體內刺激NK細胞。在一些實施例中，可使用本文中之實例中所提供之方法測定NK細胞在活體外及/或活體內之刺激或活性。在一些實施例中，與單獨使用相比，與NKp46結合VHH融合時，經修飾之IL-2的NK細胞刺激活性更大及/或更特異性地靶向NK細胞。在一些實施例中，IL-2之毒性藉由使其特異性靶向NK細胞來降低。在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽活體外及/或活體內增加NK細胞活化及/或增殖。在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽活體內刺激NK細胞之活化及/或增殖，且因此，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可用於治療癌症或感染性疾病之方法中。在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽上調效應蛋白，諸如顆粒酶B、穿孔蛋白或干擾素γ。
在各種實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽為IL-2R活性之促效劑。在一些實施例中，促效活性可使用本文實例中提供的方法，諸如使用293F細胞或類似細胞測定。在一些實施例中，本文提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽在靶向NK細胞時為IL-2R活性之促效劑，但在不存在靶向之情況下幾乎不或不顯示促效活性。
在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽活體外及/或活體內增加NK細胞之增殖。在一些此等實施例中，NK細胞為活化NK細胞。在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽活體外增加活化NK細胞增殖。在一些實施例中，相對於在不存在靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽的情況下之NK細胞增殖，該多肽將活化NK細胞增殖增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍或至少5倍。在一些實施例中，相對於在不存在多肽之情況下觀測到的增殖，該多肽將活化NK細胞之增殖增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍或至少5倍且基本上不增加無活性NK細胞之增殖。
可藉由此項技術中之任何方法測定活化NK細胞之增殖增加。一種非限制性之例示性分析如下。可自一或多個健康人類供體及/或自一或多個具有特定疾病或病症之人類供體分離NK細胞。使NK細胞染色，隨後與包含經修飾之IL-2得多肽(諸如靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽)接觸，隨後藉由FACS分析。染色損失指示增殖。在一些實施例中，NK細胞增殖之增加係諸如藉由量測自不同人類供體分離之NK細胞之增殖而以一組實驗或合併NK細胞之平均值形式測定。在一些實施例中，NK細胞增殖之增加係以使用來自至少五個或至少十個不同健康供體之NK細胞或來自至少五個或至少十個不同健康供體之NK細胞池進行的實驗之平均值形式測定。在一些實施例中，NK細胞增殖之增加係使用來自患有特定疾病或病症之至少五個或至少十個不同供體之NK細胞或來自患有特定疾病或病症之至少五個或至少十個不同供體之NK細胞池進行的實驗之平均值測定。
在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽活體外及/或活體內增加NK細胞之細胞毒性。在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽活體外增加ADCC。在一些實施例中，相對於在不存在靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽的情況下的ADCC，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽將ADCC增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍或至少5倍。
在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽活體外及/或活體內特異性地增加NK細胞中之pSTAT5表現。pSTAT5表現指示NK細胞活化。在一些實施例中，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽活體外增加NK細胞中之pSTAT5表現。在一些實施例中，相對於在不存在靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽的情況下之pSTAT5表現，該多肽將NK細胞上之pSTAT5表現增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍或至少5倍。NK細胞中之pSTAT5表現之增加可藉由此項技術中之任何方法，諸如本文實例中所提供之方法測定。
在一些實施例中，本發明所提供對靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽降低或減弱調控性T細胞(Treg)之抑制活性。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽將NK細胞上之Treg抑制活性降低至少10%、至少20%、至少30%或至少50%。NK細胞上之Treg抑制活性降低可藉由此項技術中之任何方法測定。在一些實施例中，例如相較於在存在Treg細胞但不存在本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽的情況下之NK細胞活化及增殖，本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽在存在Treg細胞之情況下增加NK細胞活化及增殖。 多肽表現及產生
提供包含編碼靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽之聚核苷酸的核酸分子。在一些實施例中，核酸分子亦可編碼引導靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽之分泌的前導序列，該前導序列通常裂解使得其不存在於所分泌之多肽中。前導序列可為原生重鏈(或VHH)前導序列，或可為另一種異源前導序列。
核酸分子可使用此項技術中習知的重組DNA技術構築。在一些實施例中，核酸分子為適合在所選宿主細胞中表現的表現載體。
提供包含編碼本文所描述之靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽之核酸的載體。此類載體包括但不限於DNA載體、噬菌體載體、病毒載體、反轉錄病毒載體等。在一些實施例中，選擇經最佳化以在所需之細胞類型(諸如CHO或CHO源性細胞)中或在NSO細胞中表現多肽的載體。例示性之此類載體描述於例如Running Deer等人, Biotechnol. Prog.20:880-889 (2004)中。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可表現於原核細胞中，諸如細菌細胞中；或真核細胞中，諸如真菌細胞(諸如酵母)、植物細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞中。此類表現可例如根據此項技術中已知之程序來進行。可用於表現多肽之例示性真核細胞包括但不限於COS細胞，包括COS 7細胞；293細胞，包括293-6E細胞；CHO細胞，包括CHO-S、DG44、Lec13 CHO細胞及FUT8 CHO細胞；PER.C6®細胞(Crucell)；以及NSO細胞。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可表現於酵母中。參見例如美國公開案第US 2006/0270045 A1號。在一些實施例中，特定真核宿主細胞係基於其對多肽產生所需轉譯後修飾的能力來選擇。舉例而言，在一些實施例中，CHO細胞產生多肽，該等多肽之唾液酸化程度高於293細胞中所產生之相同多肽。
向所需宿主細胞中引入一或多種核酸(諸如載體)可藉由任何方法來實現，包括但不限於磷酸鈣轉染、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、陽離子脂質介導之轉染、電穿孔、轉導、感染等。非限制性的例示性方法描述於例如Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Press (2001)中。核酸可根據任何適合方法短暫或穩定轉染於所需宿主細胞中。
亦提供包含本文所描述之任何核酸或載體之宿主細胞。在一些實施例中，提供表現本文所描述之靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽的宿主細胞。可藉由任何適合方法純化表現於宿主細胞中之靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。此類方法包括但不限於使用親和基質或疏水相互作用層析。適合之親和配體包括ROR1 ECD及結合Fc區之藥劑。舉例而言，蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或抗體親和管柱可用於結合Fc區及純化包含Fc區的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。疏水相互作用層析(例如丁基或苯基管柱)亦可適用於純化一些多肽，諸如抗體。離子交換層析(例如陰離子交換層析及/或陽離子交換層析)亦可適合於純化一些多肽，諸如抗體。混合模式層析(例如逆相/陰離子交換、逆相/陽離子交換、親水相互作用/陰離子交換、親水相互作用/陽離子交換等)亦可適合於純化一些多肽，諸如抗體。此項技術中已知許多用於純化多肽之方法。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係在無細胞系統中產生。非限制性的例示性無細胞系統描述於例如Sitaraman等人, Methods Mol. Biol.498: 229-44 (2009)；Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004)；Endo等人, Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)中。
在一些實施例中，提供藉由上文所描述之方法來製備的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係在宿主細胞中製備。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係在無細胞系統中製備。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽經純化。在一些實施例中，提供包含靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽的細胞培養基。
在一些實施例中，提供包含藉由上文所描述之方法製備之抗體的組合物。在一些實施例中，該組合物包含在宿主細胞中製備的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在一些實施例中，該組合物包含在無細胞系統中製備的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在一些實施例中，該組合物包含經純化的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。 使用靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽治療疾病的例示性方法
在一些實施例中，提供治療個體之疾病之方法，其包含投與靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在一些實施例中，提供用於治療個體之癌症或感染性疾病的方法。在一些實施例中，提供用於增加個體中之NK細胞增殖的方法，其包含投與靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在一些實施例中，提供用於增強治療抗體在個體中之ADCC活性的方法，其包含投與靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽與治療抗體之組合。在一些實施例中，提供用於增強個體中NK細胞之細胞毒性能力的方法，其包含投與單獨的或與治療抗體組合的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在一些實施例中，提供克服個體中NK細胞活性之化學治療抑制的方法，其包含在用化學治療劑治療之前、期間或之後投與靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在一些實施例中，提供用於增強正經歷化學療法之個體中治療抗體之ADCC活性的方法，其包含在用化學治療劑治療之前、期間或之後投與靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽與治療抗體之組合。
該方法包含向個體投與有效量的本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽用於導向NK介導之細胞毒性。在一些此類實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽亦包含結合細胞毒性T細胞或另一NK細胞抗原之結合域。在一些實施例中，結合域可為VHH域或抗體結合域，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，諸如VH/VL、scFv、Fab片段等。在一些實施例中，靶向NKp46之多肽包含結合CD3、T細胞受體(TCR) α、TCRβ、CD28、CD16、CD32A、CD64、CD89或NKG2D的結合域。
在一些此類實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽亦包含結合癌細胞之結合域。在一些實施例中，結合癌細胞之結合域將NK介導之細胞毒性導向癌細胞。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽連接至細胞毒性劑以形成免疫結合物。用於免疫結合物之各種細胞毒性劑為此項技術中已知，且包括(但不限於)卡奇黴素、奧瑞他汀、尾海兔素、微管素、類美登素、念珠藻素、多卡黴素、埃斯培拉黴素、吡咯并苯并二氮呯及烯二炔抗生素。在一些實施例中，靶向NKp46之多肽包含結合CD3、T細胞受體(TCR) α、TCRβ、CD28、CD16、CD32A、CD64、CD89或NKG2D的結合域。
本文所描述之治療方法可用於人類或動物。在一些實施例中，提供治療人類之方法。
可用本文所提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽或表現靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽的細胞治療的非限制性例示性癌症包括(但不限於)基底細胞癌；膽道癌；膀胱癌；骨癌；腦及中樞神經系統癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛膜癌；大腸直腸癌；結締組織癌；消化系統癌；子宮內膜癌；食道癌；眼癌；頭頸癌；胃癌(包括胃腸癌)；神經膠母細胞瘤；肝癌；肝腫瘤；上皮內贅瘤；腎癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神經母細胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口癌及咽癌)；卵巢癌；胰臟癌；前列腺癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統癌；唾液腺癌；肉瘤；皮膚癌；鱗狀細胞癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮或子宮內膜癌；泌尿系統癌；外陰癌；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤；非霍奇金氏淋巴瘤；B細胞淋巴瘤；低惡性度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL) NHL；中惡性度/濾泡性NHL；中惡性度瀰漫性NHL；高惡性度免疫母細胞性NHL；高惡性度淋巴母細胞性NHL；高惡性度小型無裂隙細胞NHL；巨瘤症NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤；華氏巨球蛋白血症；急性骨髓性白血病(AML)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母細胞性白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性骨髓母細胞性白血病。
可視需要向受試者投與靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。可由熟習此項技術者，諸如主治醫師，基於考慮所治療病況、所治療受試者之年齡、所治療病況之嚴重程度、所治療受試者之一般健康狀況及其類似因素來確定投與頻率。在一些實施例中，向受試者投與有效劑量的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽一次或多次。在一些實施例中，每天、每半週、每週、每兩週、每月等向受試者投與有效劑量的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。至少向受試者投與一次有效劑量的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。在一些實施例中，有效劑量的靶向NKp46之經修飾的IL-2多肽可投與多次，包括在至少一個月、至少六個月或至少一年之時程內投與多次。
在一些實施例中，醫藥組合物係以有效治療(包括預防)癌症或感染性疾病、增強NK細胞之細胞毒性能力、增加NK細胞增殖或活化及/或克服NK細胞活性之化學治療抑制的量投與。治療有效量通常取決於所治療受試者之體重、其生理或健康狀況、所治療病況之延伸或所治療受試者之年齡。一般而言，抗體可以每次給藥約0.05毫克/公斤體重至約100毫克/公斤體重範圍內的量投與。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可在活體內藉由各種途徑投與，該等途徑包括但不限於靜脈內、動脈內、非經腸、腹膜內或皮下。適當調配物及投與途徑可根據預期應用選擇。
在一些實施例中，藉由使NK細胞靶向表現腫瘤細胞之NKp46來達成使用靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽進行治療性治療。在一些實施例中，藉由增加NK細胞增殖及/或活化來達成使用靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽進行治療性治療。在一些實施例中，藉由增加NK細胞之細胞毒性能力來達成使用靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽進行治療性治療。 醫藥組合物
在一些實施例中，以含各種醫藥學上可接受之載劑之調配物形式提供包含靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽的組合物(參見例如Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 第20版(2003)；Ansel等人, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第7版, Lippencott Williams and Wilkins (2004)；Kibbe等人, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版, Pharmaceutical Press (2000))。可用包括媒劑、佐劑及稀釋劑之各種醫藥學上可接受之載劑。此外，亦可用各種醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、潤濕劑及其類似物質。非限制性的例示性載劑包括鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇，及其組合。
在一些實施例中，醫藥組合物包含至少10 mg/mL之濃度的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽。 組合療法
靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽可單獨或與其他治療模式(諸如其他抗癌劑)組合投與。其可在其他治療模式之前、實質上同時或之後(亦即，並行或依序)提供。在一些實施例中，本文所描述之治療方法可進一步包括投與：放射線療法、化學療法、疫苗接種、靶向腫瘤療法、CAR-T (嵌合抗原受體T細胞)療法、溶瘤病毒療法、癌症免疫療法、細胞介素療法、手術切除、染色質修飾、消融、冷療法、針對腫瘤目標的反義藥劑、針對腫瘤目標的siRNA藥劑、針對腫瘤目標的微小RNA藥劑或抗癌/腫瘤藥劑，或生物製劑，諸如抗體、細胞介素或受體細胞外域-Fc融合體。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係在用化學治療劑治療之前、期間或之後投與。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係與包含結合腫瘤抗原之結合域的抗體組合投與，本文提供可與此類域結合的腫瘤抗原之非限制性實例。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係在用一或多種化學治療劑治療之前、期間或之後與包含結合腫瘤抗原之結合域的抗體組合投與。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係與包含結合域的抗體組合投與，該結合域結合腫瘤抗原BCMA、CD19、CD20、CD38、CD70、EGFR或HER2。在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係與包含結合域之抗體組合投與，該結合域結合腫瘤抗原BCMA、CD19、CD20、CD38、CD70、EGFR或HER2，其中此類投與係在用化學治療劑治療之前、期間或之後。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係與一或多種化學治療劑、CAR-T療法、溶瘤病毒療法、細胞介素療法及/或靶向其他檢查點分子(諸如VISTA、gpNMB、B7H3、B7H4、HHLA2、CD73、CTLA4、TIGIT等)之藥劑組合投與。
在一些實施例中，本文提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係與例如PD-1或PD-L1療法之第二治療劑並行地給與。PD-1/PD-L1療法之實例包括納武單抗(nivolumab)(BMS)；皮立珠單抗(pidilizumab)(CureTech，CT-011)、派立珠單抗(pembrolizumab)(Merck)；德瓦魯單抗(durvalumab)(Medimmune/AstraZeneca)；阿特珠單抗(atezolizumab)(Genentech/Roche)；阿維魯單抗(avelumab)(Pfizer)；AMP-224 (Amplimmune)；BMS-936559；AMP-514 (Amplimmune)；MDX-1105 (Merck)；TSR-042 (Tesaro/AnaptysBio，ANB-011)；STI-A1010 (Sorrento Therapeutics)；STI-A1110 (Sorrento Therapeutics)；以及針對程式化死亡-1 (PD-1)或程式化死亡配體1 (PD-L1)之其他藥劑。
在一些實施例中，本文提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係與免疫刺激劑(例如腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)之成員或B7家族成員之促效劑)並行地給與。免疫刺激TNFRSF成員之非限制性實例包括OX40、GITR、41BB、CD27及HVEM。B7家族成員之非限制性實例包括CD28及ICOS。因此，在一些實施例中，本文提供的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係與OX40、GITR、41BB、CD27、HVEM、CD28及/或ICOS之促效劑(諸如促效劑抗體)並行地給與。
在一些實施例中，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽與額外藥劑調配成單一治療組合物，且靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽與額外藥劑同時投與。或者，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽及額外藥劑彼此分開，例如各自調配成分開之治療組合物，且靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽及額外藥劑同時投與，或靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽及額外藥劑在治療方案期間之不同時間投與。舉例而言，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係在投與額外藥劑之前投與，靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係在投與額外藥劑之後投與，或靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽及額外藥劑係以交替方式投與。靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽及額外藥劑可以單次劑量或以多次劑量投與。 非限制性的例示性診斷及治療方法
在一些實施例中，本文所描述之方法適用於評估受試者及/或來自受試者(例如癌症患者)之試樣。在一些實施例中，評估係診斷、預後及/或對治療之反應中之一或多者。
在一些實施例中，本文所描述之方法包含評估蛋白質之存在、不存在或含量。在一些實施例中，本文所描述之方法包含評估核酸之存在、不存在或表現量。本文所描述之組合物可用於該等量測。舉例而言，在一些實施例中，本文所描述之方法包含使腫瘤或由腫瘤培養之細胞的試樣與本文所描述之治療劑接觸。
在一些實施例中，評估可導引治療(包括用本文所描述之抗體治療)。在一些實施例中，評估可導引輔助療法在切除之後的使用或保留。輔助療法(亦稱作輔助照護)為除初級、主要或初始治療以外給與之治療。藉助於非限制性實例，輔助療法可為通常在手術後當所有可偵測疾病已移除，但由於隱性疾病而仍存在統計學復發風險時所給與之額外治療。在一些實施例中，多肽用作癌症治療中之輔助療法。在一些實施例中，多肽用作癌症治療中唯一之輔助療法。在一些實施例中，本文所描述之多肽被拒絕作為癌症治療中之輔助療法。舉例而言，若患者不大可能對本文所描述之抗體起反應或將具有最低反應，則為生活品質起見及為避免來自無效化學療法之不必要毒性，可不投與治療。在此等情況下，可使用姑息性照護。
在一些實施例中，多肽係作為切除前之新輔助療法投與。在一些實施例中，新輔助療法係指在任何手術之前使腫瘤縮小及/或降等之療法。在一些實施例中，新輔助療法意謂在手術之前向癌症患者投與之化學療法。在一些實施例中，新輔助療法意謂在手術之前向癌症患者投與之抗體。通常考慮新輔助化學療法之癌症類型包括例如乳癌、大腸直腸、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌及肺癌。在一些實施例中，多肽用作癌症治療中之新輔助療法。在一些實施例中，在切除之前使用。
在一些實施例中，本文所描述之方法中考慮之腫瘤微環境包含或為以下中之一或多者：腫瘤脈管；腫瘤浸潤淋巴球；纖維母細胞網狀細胞；內皮先驅細胞(EPC)；癌症相關纖維母細胞；外被細胞；其他基質細胞；細胞外基質(ECM)之組分；樹突狀細胞；抗原呈遞細胞；T細胞；調控性T細胞；NK細胞；巨噬細胞；其他淋巴細胞；嗜中性球；及位於靠近腫瘤處之其他免疫細胞。 套組
亦提供包括如本文所描述之任何靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽及適合之包裝的製品及套組。在一些實施例中，本發明包括一種套組，其具有(i)靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽，及(ii)用於使用套組向個體投與靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽的說明。
適用於本文所描述之組合物的包裝為此項技術中已知，且包括例如小瓶(例如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶子、罐、可撓性包裝(例如密封聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)及其類似物。此等製品可進一步經滅菌及/或密封。亦提供包含本文所描述之組合物之單位劑型。該等單位劑型可按單個或多個單位劑量儲存於適合之包裝中且亦可經進一步滅菌及密封。本發明之套組中供應之說明為通常在標籤或藥品說明書(例如套組中包括之紙張)上之書面說明，但機器可讀說明(例如，磁性或光學儲存磁碟上載有的說明)亦為可接受的。與使用抗體相關之說明一般包括關於用於預期治療或工業用途之劑量、給藥時程及投與途徑之資訊。套組可進一步包含關於選擇適合之個體或治療的描述。
容器可為單位劑量、散裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。舉例而言，亦可提供含有足夠劑量之本文所揭示分子以對個體提供延長週期之有效治療的套組，該延長週期諸如約1週、2週、3週、4週、6週、8週、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月或更多個月中之任一者。套組亦可包括多個單位劑量之分子及使用說明且以對於在藥房(例如醫院藥房及配藥房)中儲存及使用而言足夠之量進行包裝。在一些實施例中，套組包括乾燥(例如凍乾)組合物，其可經復原、再懸浮或復水以形成一般穩定之抗體水性懸浮液。 實例
下文所論述之實例僅意欲例示本發明，且不應視為以任何方式限制本發明。該等實例不意欲表示以下實驗為所執行之所有實驗或唯一實驗。已努力確保關於所使用之數量(例如量、溫度等)的準確性，但應當考量存在一些實驗性誤差及偏差。除非另有指示，否則份數為重量份，分子量為平均分子量，溫度係以攝氏度計，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。 實例 1 ： NKp46 單域抗體
經由對駱馬及羊駝免疫接種人類NKp46細胞外域之重組型式，產生靶向人類NKp46之單域抗體。NKp46VHH域之胺基酸序列提供於下文提供之某些序列之表格中。限制條件為所揭示VHH域中之任一者中殘基125處之離胺酸(K125)可經天冬胺酸(K125D)、麩胺酸(K125E)或精胺酸(K125R)取代。命名為hz5D7v17之VHH (SEQ ID NO: 15)包含殘基125處之精胺酸(R)(在某些序列之表格中加粗且加底線展示)。
藉由流動式細胞測量術評定經型式設計為VHH-Fc融合蛋白的NKp46-結合多肽之結合。使用不具有鉸鏈之IgG1-Fc或同二聚Fc (圖1I至圖1J)(不具有鉸鏈之該Fc標註為Fc*)。使HEK293F細胞經編碼全長人類NKp46、食蟹獼猴NKp46或小鼠NKp46之質體，繼之以IRES及GFP短暫轉染。將表現NKp46及GFP之經轉染細胞用於量測多肽之結合。將經轉染細胞以30,000個細胞/孔塗鋪於96孔盤之FACS緩衝液(PBS，1% BSA，0.1% NaN 3，pH 7.4)中。未經轉染之HEK293F細胞用作NKp46陰性對照且以30,000個細胞/孔塗鋪於單獨的盤中。隨後將測試多肽稀釋至1000 nM之最終濃度的兩倍，且進行3倍、4倍或5倍連續稀釋。最終管柱僅留下FACS緩衝液作為二級唯一對照。將測試品稀釋液添加至等體積之細胞中，且將分析盤在4℃下培育30分鐘。用每孔150 μL FACS緩衝液洗滌兩次之後，將細胞再懸浮於含經二次稀釋為1:1000-2000之α-hFc-647的FACS緩衝液中。隨後使分析盤在4℃下培育20-30分鐘。再一次用150 μL FACS緩衝液洗滌之後，藉由流動式細胞測量術偵測結合之抗體。在Intellicyt iQue Plus或Accuri iQue上進行流動式細胞測量術偵測。經NKp46轉染細胞以GFP陽性圈選且多肽結合以647 nm下之中值螢光形式量測。使用GraphPad Prism分析軟體繪製及分析資料，且結果展示於下表及圖1中。 表3：經人類NKp46轉染之HEK-293-FL的結合
融合蛋白 Bmax (MFI) K d(nM) SEQ ID NO.
NKp46-5D7-Fc* 1043043 0.1716 1, 53
NKp46-hz5D7v1-Fc* 790331 0.1391 2, 53
NKp46-hz5D7v2-Fc* 938268 0.7624 3, 53
NKp46-hz5D7v3-Fc* 1274160 0.5106 4, 53
NKp46-hz5D7v4-Fc* 979738 0.189 5, 53
NKp46-hz5D7v7-Fc* 866073 0.2303 6, 53
NKp46-hz5D7v8-Fc* 930045 0.2032 7, 53
NKp46-hz5D7v9-Fc* 1050045 0.3922 8, 53
NKp46-hz5D7v10-Fc* 883558 0.2685 9, 53
NKp46-hz5D7v11-Fc* 1049076 0.1887 10, 53
表4：經人類NKp46轉染之HEK-293-FL的結合
融合蛋白 Bmax (MFI) K d(nM) SEQ ID NO.
NKp46-hz5D7v3-Fc* 148738 0.1772 4, 53
NKp46-hz5D7v12-Fc* 149338 0.1403 11, 53
NKp46-hz5D7v13-Fc* 149680 0.2336 12, 53
NKp46-hz5D7v14-Fc* 138119 0.1582 13, 53
NKp46-hz5D7v15-Fc* 143134 0.2368 14, 53
表5：經食蟹獼猴NKp46轉染之HEK-293-FL的結合
融合蛋白 Bmax (MFI) K d(nM) SEQ ID NO.
NKp46-5D7-Fc* 58584 0.5384 1, 53
NKp46-hz5D7v1-Fc* 67630 0.6907 2, 53
NKp46-hz5D7v2-Fc* 51506 0.9016 3, 53
NKp46-hz5D7v3-Fc* 51750 0.7264 4, 53
NKp46-hz5D7v4-Fc* 55388 0.4458 5, 53
NKp46-hz5D7v7-Fc* 64599 0.7033 6, 53
NKp46-hz5D7v8-Fc* 53537 0.5262 7, 53
NKp46-hz5D7v9-Fc* 61889 0.6549 8, 53
NKp46-hz5D7v10-Fc* 58615 1.061 9, 53
NKp46-hz5D7v11-Fc* 52344 1.843 10, 53
表6：經食蟹獼猴NKp46轉染之HEK-293-FL的結合
融合蛋白 Bmax (MFI) K d(nM) SEQ ID NO.
NKp46-hz5D7v3-Fc* 19752 0.773 4, 53
NKp46-hz5D7v12-Fc* 17924 0.4548 11, 53
NKp46-hz5D7v13-Fc* 18754 0.7484 12, 53
NKp46-hz5D7v14-Fc* 14322 0.2516 13, 53
NKp46-hz5D7v15-Fc* 16394 0.4281 14, 53
表7：經小鼠NKp46轉染之HEK-293-FL的結合
融合蛋白 Bmax (MFI) K d(nM) SEQ ID NO.
NKp46-5D7-Fc* 1069378 0.4868 1, 53
NKp46-hz5D7v1-Fc* 1173183 0.4683 2, 53
NKp46-hz5D7v2-Fc* 1208032 0.7292 3, 53
NKp46-hz5D7v3-Fc* 1166480 0.6851 4, 53
NKp46-hz5D7v4-Fc* 1272032 0.8874 5, 53
NKp46-hz5D7v7-Fc* 1171975 0.6129 6, 53
NKp46-hz5D7v8-Fc* 1117364 0.6958 7, 53
NKp46-hz5D7v9-Fc* 1217300 0.9408 8, 53
NKp46-hz5D7v10-Fc* 1189995 0.8201 9, 53
NKp46-hz5D7v11-Fc* 722792 1.699 10, 53
表8：經小鼠NKp46轉染之HEK-293-FL的結合
融合蛋白 Bmax (MFI) K d(nM) SEQ ID NO.
NKp46-hz5D7v3-Fc* 56507 0.3126 4, 53
NKp46-hz5D7v12-Fc* 49278 0.5127 11, 53
NKp46-hz5D7v13-Fc* 38140 0.6037 12, 53
NKp46-hz5D7v14-Fc* 11312 6.510 13, 53
NKp46-hz5D7v15-Fc* 34349 0.7289 14, 53
表9：經人類NKp46轉染之HEK-293-FL的結合
融合蛋白 Bmax (MFI) K d(nM) SEQ ID NO.
NKp46-hz5D7v17-Fc 1335271 0.2949 15, 55
如圖1A至圖1B、圖1I以及表3、表4及表9中所示，靶向NKp46之多肽以低於1 nM之親和力結合人類NKp46。圖1C至圖1D以及表5及表6展示靶向NKp46之多肽以低於2 nM之親和力結合食蟹獼猴NKp46。圖1E至圖1F以及表7及表8展示幾乎所有NKp46靶向多肽以低於2 nM之親和力結合小鼠NKp46。圖1G至圖1H及圖1J展示多肽並不結合於未經轉染之HEK-293F細胞。 實例 2 ： 由包含 NKp46 結合 VHH 及 IL-2 變異體之多肽誘導的特異性 IL-2 信號傳導
在磷酸STAT5分析中評定包含NKp46結合VHH域(hz5D7v12或hz5D7v17)、異二聚體臼包杵Fc區及與Fc區之C端融合之IL-2變異體的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽cx10454及cx11314的靶向NKp46之IL-2活性。如下表中所示，對照蛋白質包括：包含hz5D7v12及異二聚體臼包杵Fc區而無IL-2之多肽(cx8411)；包含非靶向VHH及與異二聚臼包杵Fc區之C端融合的IL-2變異體的多肽(cx9452)；及野生型重組IL-2。藉由胞內流動式細胞測量術以IL-2受體接合及信號傳導之近端讀數來量測磷酸化STAT5 (pSTAT5)之含量的增加。將人類PBMC以1,000,000個細胞/孔塗鋪於完全生長培養基(RPMI，10% FBS，1%抗生物質(anti-anti))中之96孔盤中。隨後將測試多肽稀釋至2×最終濃度100 nM且進行5倍連續稀釋。將連續稀釋液添加至細胞中且在37℃下培育15分鐘。隨後將細胞在4℃下於100 µL之Cytofix固定緩衝液(BD)中固定30分鐘。隨後將細胞在200 µL FACS緩衝液中洗滌一次且在4℃下於Perm緩衝液III (BD Phosflow)中滲透30分鐘。將經滲透細胞在1×滲透緩衝液(eBioscience)中洗滌總共三次，且隨後在4℃下於含有針對以下之經螢光標記之抗體的1×滲透緩衝液中培育過夜：CD4 (OKT4，1:100)、CD3 (SP34-2，1:50)、CD16 (3G8，1:1000)、pSTAT5 (SRBCZX，1:70)、CD56 (NCAM16.2，1:500)及CD8 (RPA-T8，1:4000)。次日，將細胞用150 µL FACS緩衝液洗滌且使用ACEA Biosciences Novocyte-Quanteon流式細胞儀分析。經由偵測NK細胞(CD3-CD56 dimCD16+或CD3-CD56 brightCD16-或總NK細胞)或CD4 T細胞(CD3+CD4+)上pSTAT5的經螢光標記之抗體的頻率及中值螢光強度水準之增加對IL-2信號傳導定量。使用GraphPad Prism分析軟體繪製及分析資料。
如圖2中所示，包含NKp46結合VHH域及與異二聚體臼包杵Fc區之C端融合之IL-2變異體的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽(例如cx10454或cx11314)以濃度依賴性方式誘導pSTAT5之含量增加且在CD56 dimCD16+ NK細胞(圖2A至圖2B)及總NK細胞(圖2G)上之EC 50低於0.4 nM，其低於野生型重組IL-2之活性。在CD56 brightCD16- NK細胞上，EC 50低於0.08 nM (圖2C至圖2D)，其與野生型重組IL-2之約0.06 nM EC 50類似。靶向NKp46之變異IL-2未誘導CD4 T細胞上之pSTAT5的可偵測增加(圖2E至圖2F、圖2H至圖2I)。對照多肽均未誘導任何細胞類型中之pSTAT5水準之可偵測增加，表明減毒IL-2需要經由結合域靶向細胞以便實現IL-2受體信號傳導活性。 表10：多肽
多肽或複合體 SEQ ID NO
hz5D7v12-Fc xELL-臼；及 hz5D7v12-Fc xELL-杵-IL2-T3A-H16A-E61R-P65R-D84Y-C125S (cx10454) 11、70；以及11、63、31 (33及34)
hz5D7v17-Fc xELL-臼；及 hz5D7v17-Fc xELL-杵-IL2-T3A-H16A-E61R-P65R-D84Y-C125S (cx11314) 15、44；以及15、63、31 (41及42)
hz5D7v12-Fc xELL-臼；及 hz5D7v12-Fc xELL-杵(cx8411) 11、70；以及11、63 (35及36)
非靶向VHH-Fc xELL-臼；及 非靶向VHH-Fc xELL-杵-IL2-T3A H16A E61R P65R D84Y C125S (cx9452) 非靶向VHH、70；以及非靶向VHH、63、31 (37及38)
WT IL-2 30
實例 3 ： 由包含 NKp46 結合 VHH 及 IL-2 變異體之多肽誘導的抗體依賴性細胞毒性之增強
與展現ADCC活性之西妥昔單抗組合，在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)分析中進一評定包含NKp46結合VHH域hz5D7v12、異二聚體臼包杵Fc區及與Fc區之C端融合之IL-2變異體的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽(cx10454)的靶向NKp46之IL-2活性。將包含非靶向VHH及與異二聚體杵臼包杵Fc區之C端融合之IL-2變異體的多肽(cx9452)及野生型重組IL-2用作對照。用CYTO-ID紅色長期細胞示蹤劑(Enzo)標記A431細胞，隨後在96孔平底盤中以10,000個細胞/孔塗鋪100 µL，且使其黏附4小時。將獲自人類供體之PBMC解凍且藉由流動式細胞測量術測試NK細胞頻率。將最終稀釋為1:2000的25 µL用於細胞凋亡之Incucyte®凋亡蛋白酶-3/7綠色染料(Sartorius)(25 µL培養基)或最終濃度為20 nM或0.2 nM之西妥昔單抗(25 µL培養基)、最終濃度為1 nM之野生型重組IL-2或最終濃度為1 nM之IL-2變異融合多肽以及調節至每1個A431細胞10個NK細胞之濃度的25 µL人類PBMC添加至各孔。使細胞在室溫下穩定10分鐘，隨後在37℃下將盤置於Incucyte成像儀中24小時，每30分鐘獲取影像。藉由凋亡蛋白酶-3/7與CYTO-ID紅色之重疊測定A431殺滅，最多之殺滅由使用20 nM西妥昔單抗時觀測到之水準界定。使用GraphPad Prism分析軟體繪製及分析資料。
如圖3中所示，當使用0.2 nM西妥昔單抗時，西妥昔單抗之ADCC活性降低至最高活性之約65%。此次佳西妥昔單抗劑量之殺滅活性未由包含IL-2變異體、異二聚體Fc及非靶向VHH的多肽(cx9452)增強，而野生型重組IL-2及包含與異二聚體Fc之C端融合之IL-2變異體及靶向NKp46之VHH域的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽((例如cx10454)皆能夠增強0.2 nM西妥昔單抗之活性，使得實現最多殺滅。
在額外之研究中，使用PBMC ADCC生物分析(Promega)評定目標細胞殺滅。套組含有表現HiBit融合蛋白之目標細胞，該HiBit融合蛋白在細胞溶解時釋放且在結合於其互補多肽LgBiT時產生發光信號。在此分析中，在96孔白色U形底盤中將目標細胞與指定測試品(抗BCMA抗體；西妥昔單抗(抗EGFR)；曲妥珠單抗(抗HER2)；以下之序列類似物：利妥昔單抗(抗CD20)、利妥昔單抗之去岩藻糖基化變異體(抗CD20)、達雷木單抗(抗CD38)、達法思單抗(抗CD19)、奧比珠單抗(抗CD19)；單獨的或與cx11314組合)及人類PBMC按比率混合。隨後在37℃培育箱中培育分析盤5小時。隨後，將含有多肽LgBiT之偵測試劑添加至各孔中，且在酶標儀上讀取發光。將其中含100 ug /mL毛地黃皂苷之最高溶解對照添加至含有PBMC及目標細胞之孔中，且各實驗中包括未處理對照。除未處理對照及毛地黃皂苷對照以外，基於各樣本之相對光單位計算比溶解率%。
如圖4及圖5中所示，包含與異二聚體Fc之C端融合之IL-2變異體及靶向NKp46之VHH域的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽(cx11314)大大增強靶向細胞表面抗原之各種抗體之ADCC活性，包括CD20 (圖4A至圖4B及圖5B)、CD19 (圖5B)、CD38 (圖5A)、BCMA (圖5A)、HER2 (圖5C至圖5D)及EGFR (圖5C至圖5D)。 實例 4 ： 由包含 NKp46 結合 VHH 及 IL-2 變異體之多肽誘導的食蟹獼猴 PBMC 亞群之細胞擴增
在非人類靈長類動物中測試包含NKp46結合VHH域hz5D7v12、異二聚體Fc區及與Fc區之C端融合之IL-2變異體的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽cx10454對活體內細胞擴增之作用。靜脈內推注注射向食蟹獼猴投與0.3 mg/kg、1 mg/kg或3 mg/kg之多肽。在給藥之前及給藥後4、10及14天自研究動物收集全血樣本。在Lymphoprep (STEMCELL Technologies)中使用密度離心分離各時間點之PBMC，且用經螢光標記之細胞類型特異性抗體組合對細胞染色。將T細胞歸類為不表現B細胞標記物CD20之CD3 +細胞。調節性T細胞(T regs)定義為亦表現CD25且CD127含量降低的CD4 +T細胞。NK細胞定義為表現NKG2A之CD3-非T且非B細胞，且呈CD16陽性或陰性。CD20染色陽性之群體歸類為B細胞。藉由用給藥後10天每毫升全血之細胞計數除以給藥前每毫升全血之基線計數來計算倍數變化。使用額外固定、滲透及染色步驟在上文所描述之PBMC亞群中兩側顆粒酶B表現。簡言之，用針對細胞表面標記物經螢光標記之細胞類型特異性抗體組合對細胞染色，隨後使用FoxP3轉錄因子染色緩衝液組(eBioscience)固定及滲透。隨後用經螢光標記之特異性抗體偵測顆粒酶B。在ACEA Biosciences Novocyte-Quanteon流動式細胞儀上進行流動式細胞測量術偵測。使用GraphPad Prism分析軟體繪製及分析資料。藉由用第4天及第10天之顆粒酶B中值螢光除以NK細胞之基線中值螢光(給藥前)來計算倍數變化。結果展示於表11及圖6A至圖6C中。 表11：PBMC亞群之倍數擴增
PBMC亞群 第10天、第14天之0.3 mg/kg倍數變化 第10天、第14天之1 mg/kg倍數變化 第10天、第14天之3 mg/kg倍數變化
CD16 +NK細胞 2.1, 1.6 4.1, 2.3 3.7, 4.9
CD16 -NK細胞 3.3, 2.6 3.3, 2.1 4.9, 6.1
如圖6A至圖6B及表11中所示，單次劑量的包含NKp46結合VHH域hz5D7v12、異二聚體Fc區及與Fc區之C端融合之IL-2變異體的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽以劑量依賴性方式引起NK細胞擴增，較高擴增發生在0.3 mg/kg及1 mg/kg劑量之第10天及3 mg/kg劑量之第14天。在所有劑量下於CD16 +及CD16 -NK細胞區室中可見超過2倍擴增，其中在3 mg/kg劑量下可見最大倍數擴增。包括T細胞、B細胞及T reg細胞群體之非NK細胞群體中未見擴增。圖6C展示用單次劑量的包含NKp46結合VHH域hz5D7v12、異二聚體Fc區及與Fc區之C端融合之IL-2變異體的靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽治療亦使得NK細胞殺滅能力增加，如細胞毒性替代標記物顆粒酶B之上調所證實。顆粒酶B之表現在給藥後4天達到峰值，但在給藥後10天保持升高至給藥前水準以上。在0.3 mg/kg、1 mg/kg及3 mg/kg組中，最高顆粒酶B表現增加分別為3.9倍、4.1倍及5.1倍。此等資料展示包含NKp46結合VHH域(例如hz5D7v12)、異性二聚體Fc區及與Fc區之C端融合之減毒IL-2變異體的多肽特異性地誘導NK細胞群體活體內之細胞增殖及活性。 實例 5 ： 包含 NKp46 結合 VHH 及 IL-2 變異體之多肽在人類異種移植腫瘤小鼠模型中誘導的抗腫瘤功效
在異種移植小鼠模型中測試包含NKp46結合VHH域hz5D7v17、異二聚體Fc區及與Fc區之C端融合之減毒IL-2突變體的多肽(cx11314)之活體內抗腫瘤活性。用含3.5×10 6個Raji細胞之100 µL HBSS皮下接種7週齡雌性BALB-Scid小鼠(每組8隻)。當腫瘤塊達至平均100 mm 3時，向動物給藥1 mg/kg之cx1134、5 mg/kg之治療抗體利妥昔單抗之序列類似物、兩個方案之組合或媒劑對照。所有處理每週給藥一次，持續三個連續週。靜脈內給藥Cx11314及媒劑且腹膜內給藥利妥昔單抗類似物。藉由每週量測三次皮下腫塊之長度及寬度來測定腫瘤體積。使用公式V = L×W×W/2計算腫瘤體積。使用GraphPad Prism分析軟體繪製及分析資料。
如圖7中所示，相較於媒劑對照，使用包含NKp46結合VHH域、異二聚體Fc及與Fc區之C端融合之IL-2變異體的多肽(cx11314)之單一藥劑療法延遲Raji異種移植物在BALB-Scid小鼠中之生長。識別Raji腫瘤細胞上之CD20且可使包括NK細胞之效應細胞導向以識別及殺死腫瘤細胞的治療抗體利妥昔單抗之類似物誘導顯著抗腫瘤反應，且引起在腫瘤體積開始再次增大之前維持大約3週的腫瘤停滯。在組合治療中，包含NKp46結合VHH域、異二聚體Fc及與Fc區之C端融合之IL-2變異體的多肽進一步加強利妥昔單抗類似物之活性且引起7/8個動物中腫瘤之完全且持久消除。此等資料展示包含NKp46結合VHH域(例如hz5D7v17)、異二聚體Fc區及與Fc區之C端融合之減毒IL-2變異體的多肽誘導活體內功能性反應，從而呈單一藥劑形式產生抗腫瘤活性，且強效增強如利妥昔單抗之治療抗體之抗腫瘤反應。 實例 6 ： 包含 NKp46 結合 VHH 及 IL-2 變異體的多肽對 NK 細胞 健康及抗腫瘤活性之化學療法誘發之缺陷的修復
與標準照護化學療法試劑地塞米松及來那度胺組合來進一步評定包含NKp46結合VHH域hz5D7v17、異二聚體Fc區及與Fc區之C端融合之減毒IL-2突變體(cx11314)的多肽之活性。將獲自人類供體之PBMC解凍且用500 nM地塞米松、2 µM來那度胺及5 nM cx11314之組合處理三天。所有預處理條件亦包括2 ng/mL IL-2以支援NK細胞存活。藉由流動式細胞測量術對各處理之PBMC樣本中之NK細胞頻率定量且以僅培養基對照標準化。為了評定來自經預處理之PBMC之NK細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)能力，用10個NK細胞比1個MM1S (多發性骨髓瘤)細胞比率之經CellTrace TMViolet標記之MM1S目標細胞以及1nM達雷木單抗序列類似物(抗hCD38-hIgG1)增濃NK細胞且共培養18小時。經由共培養維持預處理條件。經由流動式細胞測量術，藉由量化活/死染料Zombie Aqua及/或細胞凋亡標記物Apotracker綠染色陽性之MM1S細胞的百分比來測定MM1S殺滅。
如圖8A中所示，相較於用單獨的培養基處理，用標準照護治療地塞米松及來那度胺處理人類PBMC引起NK細胞計數在三天後下降大約50%。用cx11314及化學療法方案共處理恢復NK細胞活力及/或增殖且使得NK細胞數目類似或高於培養基對照中之數目。圖8B展示當用地塞米松及來那度胺預處理細胞時，在達雷木單抗類似物(抗hCD38-hIgG1)存在下之NK細胞之ADCC活性降低大約20%。然而，將cx11314添加至預處理方案可修復或甚至增加ADCC活性。此等資料展示包含NKp46結合VHH域hz5D7v17、異二聚體Fc區及與Fc區之C端融合之減毒IL-2突變體的多肽可克服如地塞米松及來那度胺之標準照護化學療法治療對NK細胞之抑制。
在不脫離本發明精神或基本特性之情況下，本發明可以其他特定形式體現。因此，前述實施例應在所有方面視為說明性的而不限制本發明。因此，本發明之範疇由隨附申請專利範圍而非前述描述指示，且因此本文意欲涵蓋申請專利範圍等效性之含義及範圍內出現之所有變化。 某些序列之表格
SEQ ID NO 描述 序列
1 5D7 VHH QVTLRESGASLSLTCAASGRTFASAAMGWFRQAPGEEREFVAAISRSDDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCAAVVPTYGNNIYVHSAAYNYWGQGTQVTVKPG
2 hz5D7v1 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKGREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGNNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
3 hz5D7v2 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGNNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
4 hz5D7v3 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGNNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
5 hz5D7v4 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGNNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
6 hz5D7v7 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGNNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
7 hz5D7v8 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSVGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGNNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
8 hz5D7v9 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSVDDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGNNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
9 hz5D7v10 VHH EVQLVESGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGNNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
10 hz5D7v11 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVYSAAYNYWGQGTLVTVKP
11 hz5D7v12 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
12 hz5D7v13 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGNTIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
13 hz5D7v14 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSSIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
14 hz5D7v15 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGNAIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
15 hz5D7v17 VHH EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTV R P
16 hz5D7v12L VHH EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKP
17 5D7、hz5D7v1、hz5D7v2、hz5D7v3、hz5D7v4、hz5D7v7、hz5D7v8、hz5D7v9、hz5D7v10、hz5D7v11、hz5D7v12、hz5D7v13、hz5D7v14、hz5D7v15、hz5D7v12L及hz5D7v17之CDR1 GRTFASAAMG
18 5D7、hz5D7v1、hz5D7v2、hz5D7v3、hz5D7v4、hz5D7v10、hz5D7v11、hz5D7v12、hz5D7v13、hz5D7v14、hz5D7v15、hz5D7v12L及hzD7v17之CDR2 AISRSDDTY
19 hz5D7v7之CDR2 AISRSGDTY
20 hz5D7v8之CDR2 AISRSVGDTY
21 hz5D7v9之CDR2 AISRSVDDTY
22 5D7、hz5D7v1、hz5D7v2、hz5D7v3、hz5D7v4、hz5D7v7、hz5D7v8、hz5D7v9及hz5D7v10之CDR3 VVPTYGNNIYVHSAAYNY
23 hz5D7v11之CDR3 VVPTYGSNIYVYSAAYNY
24 hz5D7v12、hz5D7v12L及hz5D7v17之CDR3 VVPTYGSNIYVHSAAYNY
25 hz5D7v13之CDR3 VVPTYGNTIYVHSAAYNY
26 hz5D7v14之CDR3 VVPTYGSSIYVHSAAYNY
27 hz5D7v15之CDR3 VVPTYGNAIYVHSAAYNY
29 人類NKp46 MSSTLPALLCVGLCLSQRISAQQQTLPKPFIWAEPHFMVPKEKQVTICCQGNYGAVEYQLHFEGSLFAVDRPKPPERINKVKFYIPDMNSRMAGQYSCIYRVGELWSEPSNLLDLVVTEMYDTPTLSVHPGPEVISGEKVTFYCRLDTATSMFLLLKEGRSSHVQRGYGKVQAEFPLGPVTTAHRGTYRCFGSYNNHAWSFPSEPVKLLVTGDIENTSLAPEDPTFPADTWGTYLLTTETGLQKDHALWDHTAQNLLRMGLAFLVLVALVWFLVEDWLSRKRTRERASRASTWEGRRRLNTQTL
30 野生型人類IL-2 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
31 IL-2-T3A H16A E61R P65R D84Y C125S APASSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLERELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRYLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
32 IL-2-T3A-H16A-P65R-D84S-C125S APASSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRSLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
33 hz5D7v12-Fc xELL-杵-IL2-T3A-H16A-E61R-P65R-D84Y-C125S EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGSAPASSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLERELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRYLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
34 hz5D7v12-Fc xELL-臼    EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG
35 hz5D7v12-Fc xELL-杵    EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
36 hz5D7v12-Fc xELL-臼    EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG
37 非靶向VHH-Fc xELL-杵-IL2-T3A H16A E61R P65R D84Y C125S    EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSINSINVMEWYRQAPGKERDLVAGITSDGDTNYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCRARDWGSLTDYWGQGTLVTVKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGSAPASSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLERELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRYLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
38 非靶向VHH-Fc xELL-臼    EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSINSINVMEWYRQAPGKERDLVAGITSDGDTNYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCRARDWGSLTDYWGQGTLVTVKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
40 hz5D7v12-Fc xELL-臼(具有C端離胺酸)    EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVKPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
41 hz5D7v17-Fc xELL-杵-IL2-T3A-H16A-E61R-P65R-D84Y-C125S EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVRPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSGGSAPASSSTKKTQLQLEALLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLERELKRLEEVLNLAQSKNFHLRPRYLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
42 hz5D7v17-Fc xELL-臼(具有C端離胺酸) EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVRPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
43 hz5D7v17-Fc xELL-臼 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFASAAMGWFRQAPGKEREFVAAISRSDDTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAAVVPTYGSNIYVHSAAYNYWGQGTLVTVRPGGGGDKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG
45 連接子 GGGG
46 連接子 GGSGGS
47 連接子 GGSSGS
53 Fc* GGGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
54 人類IgG1 Fc區 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
55 人類IgG1 xELL Fc區 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
56 Fc區M252Y及M428V (YV) S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG
57 Fc區M252Y、M428V、H435R (YVR) T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG
58 Fc區xELL H435R DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG
59 Fc區xELL M252Y及M428V (YV) DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG
60 Fc區xELL M252Y及M428L (YL) DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPG
61 Fc區xELL M252Y、M428L、H435R (YLR) DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNRYTQKSLSLSPG
62 Fc區xELL M252Y、M428V、H435R (YVR) DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG
63 Fc區xELL S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
64 Fc區xELL H435R S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG
65 Fc區xELL M252Y及M428V (YV) S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG
66 Fc區xELL M252Y及M428L (YL) S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPG
67 Fc區xELL M252Y、M428L、H435R (YLR) S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNRYTQKSLSLSPG
68 Fc區xELL M252Y、M428V、H435R (YVR) S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG
69 Fc區xELL T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
70 Fc區xELL H435R、T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG
44 Fc區xELL H435R、T366S、L368A、Y407V臼(具有C端離胺酸) DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
71 Fc區xELL M252Y及M428V (YV) T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG
72 Fc區xELL M252Y及M428L (YL) T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPG
73 Fc區xELL M252Y、M428L、H435R (YLR) T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNRYTQKSLSLSPG
74 Fc區xELL M252Y、M428V、H435R (YVR) T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG
75 Fc區H435R DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG
76 Fc區M252Y及M428V (YV) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG
77 Fc區M252Y及M428L (YL) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPG
78 Fc區M252Y、M428L、H435R (YLR) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNRYTQKSLSLSPG
79 Fc區M252Y、M428V、H435R (YVR) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG
80 Fc區S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
81 Fc區H435R S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG
82 Fc區M252Y及M428L (YL) S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPG
83 Fc區M252Y、M428L、H435R (YLR) S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNRYTQKSLSLSPG
84 Fc區M252Y、M428V、H435R (YVR) S354C T366W杵 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG
85 Fc區T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
86 Fc區H435R、T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG
87 Fc區M252Y及M428V (YV) T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG
88 Fc區M252Y及M428L (YL) T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPG
89 Fc區M252Y、M428L、H435R (YLR) T366S、L368A、Y407V臼 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNRYTQKSLSLSPG
圖1A至圖1J展示藉由流動式細胞測量術評定的包含NKp46結合VHH域及Fc域之多肽之結合。圖1A至圖1B及圖1I展示與經人類NKp46轉染之HEK-293F細胞的結合。圖1C至圖1D展示與經食蟹獼猴NKp46轉染之HEK-293F細胞之結合。圖1E至圖1F展示與經小鼠NKp46轉染之HEK-293F細胞之結合。與未經轉染之HEK-293F細胞之結合展示於圖1G至圖1H及圖1J中。圖1I至圖1J展示經型式設計為包含二價VHH及同二聚體Fc之多肽的靶向NKp46之VHH域之結合。
圖2A至圖2I展示藉由胞內STAT5磷酸化程度所量測的以下對CD56 dimCD16 +NK細胞(圖2A至圖2B)、CD56 brightCD16 -NK細胞(圖2C至圖2D)、所有NK細胞(圖2G)、CD4 +T細胞(圖2E至圖2F及圖2H)及CD8 +T細胞(圖2I)之活性：包含與異二聚體Fc之C端融合之IL-2變異體及靶向NKp46之VHH域的多肽(cx10454或cx11314)，包含異二聚體Fc及靶向NKp46之VHH域而無IL-2的多肽(cx8411)，包含與異二聚體Fc之C端融合之IL-2變異體及非靶向VHH的多肽(cx9452)，及野生型重組IL-2。NK細胞上展現信號傳導活性之特異性(圖2A至圖2D，及圖2G)，而僅野生型重組IL-2對CD4 +(圖2E至圖2F，及圖2H)或CD8 +T細胞(圖2I)具有活性。
圖3展示以下與次佳劑量之西妥昔單抗(cetuximab)(0.2 nM)之組合相對於最佳劑量之西妥昔單抗(20 nM)之活性的ADCC活性：包含與異二聚體Fc之C端融合之IL-2變異體及靶向NKp46之VHH域的多肽(cx10454)，包含與異二聚體Fc之C端融合之IL-2變異體及非靶向VHH的多肽(cx9452)，及野生型重組IL-2。
圖4A至圖4B展示在與利妥昔單抗(rituximab)之序列類似物、抗CD20抗體或其去岩藻糖基化變異體組合時，包含與異二聚體Fc之C端融合之IL-2變異體及靶向NKp46之VHH域的多肽(cx11314)對於NK細胞針對Raji B細胞淋巴瘤細胞株之ADCC活性的增強。圖4A展示抗CD20抗體之滴定，而圖4B展示在1 nM抗CD20抗體存在下，改變NK細胞與目標細胞(Raji)比率之影響。
圖5A至圖5D展示包含與異二聚體Fc之C端融合之IL-2變異體及靶向NKp46之VHH域的多肽(cx11314)對NK細胞針對以下之ADCC活性的增強：多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929 (圖5A)，在與5 nM之抗CD38抗體達雷木單抗(daratumumab)之序列類似物或5 nM之抗BCMA抗體組合時；B細胞淋巴瘤細胞株Raji (圖5B)，在與10 nM之抗CD19 Fc工程改造抗體達法思單抗(tafasitamab)之序列類似物或1 nM之抗CD19 Fc工程改造抗體奧比珠單抗(obinutuzumab)之序列類似物組合時；肺癌瘤細胞株A549 (圖5C)或乳癌細胞株SKBR3 (圖5D)，在與5 nM之抗EGFR抗體西妥昔單抗或50 nM之抗HER2抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)組合時。本文中比較各種NK細胞與目標細胞比率。在所有組合條件下以1 nM使用cx11314。
圖6A至圖6C展示0.3 mg/kg、1 mg/kg或3 mg/kg之單次劑量的包含NKp46結合VHH域、異二聚體Fc區及與Fc區之C端融合之IL-2變異體的多肽(cx10454)在食蟹獼猴中的活性。在給藥後10天(圖6A)及14天(圖6B)在動物之周邊血內顯示亞群擴增。圖6C展示給藥後4天及10天顆粒酶B表現之增加。
圖7展示藉由皮下Raji腫瘤異種移植小鼠模型中由多肽(cx11314)誘導之腫瘤體積變化所量測的抗腫瘤功效，該多肽包含NKp46結合VHH域、異二聚體Fc及與Fc區之C端融合的IL-2變異體。靶向NKp46之經修飾之IL-2多肽係如箭頭所指示每週給藥一次，持續三個劑量，且呈單一藥劑形式或與利妥昔單抗類似物組合靜脈內給與。對照組包括僅用單獨的媒劑或利妥昔單抗類似物處理。
圖8A至圖8B展示包含NKp46結合VHH域、異二聚體Fc及與Fc區之C端融合的IL-2變異體的多肽(cx11314)對化學療法誘發之NK細胞缺陷的恢復。圖8A展示在用單獨的或與來那度胺(lenalidomide)及/或cx11314組合的地塞米松(dexamethasone)處理三天之後，如藉由流動式細胞測量術所測定，對人類周邊血中NK細胞計數之影響。圖8B展示在與達雷木單抗之序列類似物(抗hCD38-hIgG1)組合時，針對多發性骨髓瘤目標細胞株(MM1S)用單獨的或與cx11314組合的化學療法(地塞米松及來那度胺)預處理的NK細胞之ADCC活性。
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Claims (103)

  1. 一種多肽，其包含至少一個結合NKp46之VHH域及經修飾之IL-2，其中至少一個結合NKp46之VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18、19、20或21之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22、23、24、25、26或27之胺基酸序列的CDR3，且其中相對於包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的野生型人類IL-2，該經修飾之IL-2包含T3A、H16A、P65R、C125S突變以及D84S或D84Y突變。
  2. 如請求項1之多肽，其中該經修飾之IL-2包含T3A、H16A、P65R、C125S及D84S突變。
  3. 如請求項1之多肽，其中該經修飾之IL-2包含T3A、H16A、E61R、P65R、C125S及D84Y突變。
  4. 如請求項1或2之多肽，其中該經修飾之IL-2包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
  5. 如請求項1或3之多肽，其中該經修飾之IL-2包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的CDR3。
  7. 如請求項1至5中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的CDR3。
  8. 如請求項1至5中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的CDR3。
  9. 如請求項1至5中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的CDR3。
  10. 如請求項1至5中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列的CDR3。
  11. 如請求項1至5中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的CDR3。
  12. 如請求項1至5中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列的CDR3。
  13. 如請求項1至5中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的CDR3。
  14. 如請求項1至5中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列的CDR3。
  15. 如請求項1至14中任一項之多肽，其中至少一個VHH域經人源化。
  16. 如請求項1至15中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包含與SEQ ID NO: 1-16中之任一者之胺基酸序列至少85%、90%、95%或至少99%一致的胺基酸序列。
  17. 如請求項1至15中任一項之多肽，其中至少一個VHH域包含SEQ ID NO: 1-16中任一者之胺基酸序列。
  18. 如請求項1至17中任一項之多肽，其包含兩個VHH域。
  19. 如請求項1至17中任一項之多肽，其包含三個VHH域。
  20. 如請求項1至19中任一項之多肽，其中該多肽包含至少一個結合除NKp46外之抗原的結合域。
  21. 如請求項1至20中任一項之多肽，其中該多肽包含至少一個結合腫瘤抗原之結合域。
  22. 如請求項1至21中任一項之多肽，其中該多肽包含至少一個結合選自以下之抗原的結合域：1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFF、BCMA、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD39、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD73、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、密連蛋白3 (CLAUDIN-3)、密連蛋白4、cMet、膠原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(Endothelin B receptor；ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、 RSV之F蛋白、FAP、FAS、FcRH5、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GPRC5D、GRP78、HAVCAR1、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、玻尿酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、間皮素、MICA、MICB、MRP4、MUC1、黏蛋白-16 (MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、呆蛋白(Nicastrin)、NKG2A、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯基-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神經鞘胺醇1磷酸(Sphingosine 1 Phosphate)、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TGFβ受體1 (TGFBR1)、TGFβ受體2 (TGFBR2)、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、運鐵蛋白(Transferrin)、運鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、TROP-2 uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。
  23. 如請求項1至19中任一項之多肽，其中各VHH域結合NKp46。
  24. 如請求項23之多肽，其中各VHH域包含相同CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列。
  25. 如請求項24之多肽，其中各VHH域包含相同VHH序列。
  26. 如請求項1至17中任一項之多肽，其包含一個VHH域。
  27. 如請求項1至26中任一項之多肽，其中該NKp46為人類NKp46。
  28. 如請求項27之多肽，其中該人類NKp46包含SEQ ID NO: 29之序列。
  29. 如請求項1至28中任一項之多肽，其中該多肽包含Fc區。
  30. 如請求項29之多肽，其中該Fc區包含選自SEQ ID NO: 44及53-89之胺基酸序列。
  31. 如請求項29或請求項30之多肽，其在生理條件下形成二聚體。
  32. 如請求項29至31中任一項之多肽，其中該經修飾之IL-2與該Fc區之C端融合。
  33. 如請求項29至32中任一項之多肽，其中該多肽包含一個結合NKp46之VHH域、Fc區及經修飾之IL-2。
  34. 如請求項33之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO: 33或41之胺基酸序列。
  35. 一種複合體，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽為如請求項1至34中任一項之多肽，其中該第一多肽包含第一Fc區，且其中該第二多肽包含至少一個VHH域及第二Fc區，其中該第一Fc區與該第二Fc區相同或不同。
  36. 一種複合體，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域及第一Fc區，且該第二多肽包含第二Fc區及經修飾之IL-2，其中至少一個結合NKp46之VHH域包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18、19、20或21之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22、23、24、25、26或27之胺基酸序列的CDR3；且其中相對於包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列的野生型人類IL-2，該經修飾之IL-2包含T3A或T3G、H16A、P65R、C125S及D84S或D84Y突變。
  37. 如請求項36之複合體，其中該經修飾之IL-2包含T3A、H16A、P65R、C125S及D84S突變。
  38. 如請求項36之複合體，其中該經修飾之IL-2包含T3A、H16A、E61R、P65R、C125S及D84Y突變。
  39. 如請求項36至38中任一項之複合體，其中該經修飾之IL-2包含與SEQ ID NO: 31或32之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。
  40. 如請求項36、38及39中任一項之複合體，其中該經修飾之IL-2包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
  41. 如請求項36至40中任一項之複合體，其中至少一個VHH域或各VHH域經人源化。
  42. 如請求項36至41中任一項之複合體，其中至少一個VHH域包含與選自SEQ ID NO: 1-16之胺基酸序列至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致的胺基酸序列。
  43. 如請求項36至42中任一項之複合體，其中至少一個VHH域包含選自SEQ ID NO: 1-16之胺基酸序列。
  44. 如請求項35至43中任一項之複合體，其中該第二多肽包含至少一個抗原結合域。
  45. 如請求項44之複合體，其中該第二多肽之至少一個抗原結合域為VHH域。
  46. 如請求項45之複合體，其中該第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域。
  47. 如請求項35至46中任一項之複合體，其中該第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域。
  48. 如請求項47之複合體，其中該第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域，且包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18、19、20或21之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 22、23、24、25、26或27之胺基酸序列的CDR3。
  49. 如請求項47或48之複合體，其中該第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域，且包含分別包含以下之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3：SEQ ID NO: 17、18及22；17、19及22；17、20及22；17、21及22；17、18及23；17、18及24；17、18及25；17、18及26；或17、18及27。
  50. 如請求項47至49中任一項之複合體，其中該第二多肽包含至少一個結合NKp46之VHH域，且包括包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的CDR1；包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列的CDR2；及包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列的CDR3。
  51. 如請求項47至50中任一項之複合體，其中該第二多肽之至少一個VHH域結合NKp46且包含與SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16之胺基酸序列至少85%、90%、95%或至少99%一致的胺基酸序列。
  52. 如請求項47至51中任一項之複合體，其中該第二多肽之至少一個VHH域結合NKp46且包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16之胺基酸序列。
  53. 如請求項47至52中任一項之複合體，其中該第二多肽之至少一個VHH域結合NKp46且包含SEQ ID NO: 11或15之胺基酸序列。
  54. 如請求項47至53中任一項之複合體，其中該第二多肽包含一個結合NKp46之VHH域。
  55. 如請求項35至54中任一項之複合體，其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個結合除NKp46外之抗原的VHH域。
  56. 如請求項55之複合體，其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個結合TGFβ受體1、TGFβ受體2或NKG2A之結合域。
  57. 如請求項55或請求項56之複合體，其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個結合腫瘤抗原之結合域。
  58. 如請求項35至57中任一項之複合體，其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個結合選自以下之抗原的結合域：1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFF、BCMA、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD39、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD73、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、密連蛋白-3、密連蛋白-4、cMet、膠原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV之F蛋白、FAP、FAS、FcRH5、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GPRC5D、GRP78、HAVCAR1、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、玻尿酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、間皮素、MICA、MICB、MRP4、MUC1、黏蛋白-16 (MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、呆蛋白、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯基-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神經鞘胺醇1磷酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、TROP-2 uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。
  59. 如請求項35至58中任一項之複合體，其中該第一多肽或該第二多肽之至少一個VHH域或各VHH域經人源化。
  60. 如請求項35至59中任一項之複合體，其中該第一Fc區包含至少一個杵(knob)突變且該第二Fc區包含至少一個臼(hole)突變；或其中該第一Fc區包含至少一個臼突變且該第二Fc區包含至少一個杵突變。
  61. 如請求項60之複合體，其中該第一或第二Fc區包含T366W突變且該第一或第二Fc區中之另一者包含T366S、L368A及Y407V突變。
  62. 如請求項61之複合體，其中包含T366S、L368A及Y407V突變之該Fc區進一步包含H435R或H435K突變。
  63. 如請求項35至62中任一項之複合體，其中該第一多肽包含SEQ ID NO: 34、40、42或43之胺基酸序列。
  64. 如請求項35至63中任一項之複合體，其中該第二多肽包含SEQ ID NO: 33或41之胺基酸序列。
  65. 如請求項63或請求項64之複合體，其中： i) 該第一多肽包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列且該第二多肽包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列； ii)     該第一多肽包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列且該第二多肽包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列； iii)    該第一多肽包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列且該第二多肽包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列；或 iv)    該第一多肽包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列且該第二多肽包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列。
  66. 如請求項35至65中任一項之複合體，其中該複合體在生理條件下形成。
  67. 一種免疫結合物，其包含如請求項1至66中任一項之多肽或複合體及細胞毒性劑。
  68. 如請求項67之免疫結合物，其中該細胞毒性劑係選自卡奇黴素(calicheamicin)、奧瑞他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、微管素(tubulicin)、類美登素(maytansinoid)、念珠藻素(cryptophycin)、多卡黴素(duocarmycin)、埃斯培拉黴素(esperamicin)、吡咯并苯并二氮呯，及烯二炔(enediyne)抗生素。
  69. 如請求項67或68之免疫結合物，其中該免疫結合物包含如請求項35至66中任一項之複合體，且其中該第一多肽或該第二多肽包含至少一個結合CD3、T細胞受體(TCR) α、TCRβ、CD28、CD16、CD32A、CD64、CD89或NKG2D之結合域。
  70. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至66中任一項之多肽或複合體或如請求項67至69中任一項之免疫結合物，及醫藥學上可接受之載劑。
  71. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至34中任一項之多肽。
  72. 一種載體，其包含如請求項71之核酸。
  73. 一種宿主細胞，其包含如請求項71之核酸或如請求項72之載體。
  74. 一種宿主細胞，其表現如請求項1至34中任一項之多肽。
  75. 一種產生如請求項1至34中任一項之多肽的方法，其包含如請求項73或請求項74之宿主細胞在適合表現該多肽之條件下培育。
  76. 如請求項75之方法，其進一步包含分離該多肽。
  77. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項35至66中任一項之複合體之該第一多肽及該第二多肽。
  78. 一種載體，其包含如請求項77之經分離之核酸。
  79. 一種宿主細胞，其包含如請求項77之核酸或如請求項78之載體。
  80. 一種宿主細胞，其表現如請求項35至66中任一項之複合體。
  81. 一種產生如請求項35至66中任一項之複合體的方法，其包含如請求項73或請求項74之宿主細胞在適合表現該複合體之條件下培育。
  82. 如請求項81之方法，其進一步包含分離該複合體。
  83. 一種治療癌症的方法，其包含向患有癌症之個體投與醫藥學上有效量的如請求項1至66中任一項之多肽或複合體、如請求項67至69中任一項之免疫結合物或如請求項70之醫藥組合物。
  84. 如請求項83之方法，其中該癌症係選自基底細胞癌；膽道癌；膀胱癌；骨癌；腦及中樞神經系統癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛膜癌；大腸直腸癌；結締組織癌；消化系統癌；子宮內膜癌；食道癌；眼癌；頭頸癌；胃癌(gastric cancer)(包括胃腸癌)；神經膠母細胞瘤；肝癌；肝腫瘤；上皮內贅瘤；腎癌(kidney or renal cancer)；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神經母細胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口癌及咽癌)；卵巢癌；胰臟癌；前列腺癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統癌；唾液腺癌；肉瘤；皮膚癌；鱗狀細胞癌；胃癌(stomach cancer)；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮或子宮內膜癌；泌尿系統癌；外陰癌；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；非霍奇金氏淋巴瘤；B細胞淋巴瘤；低惡性度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL) NHL；中惡性度/濾泡性NHL；中惡性度瀰漫性NHL；高惡性度免疫母細胞性NHL；高惡性度淋巴母細胞性NHL；高惡性度小型無裂隙(non-cleaved)細胞NHL；巨瘤症NHL (bulky disease NHL)；套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS相關淋巴瘤；華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母細胞性白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；毛細胞白血病；及慢性骨髓母細胞性白血病。
  85. 如請求項83或請求項84之方法，其進一步包含投與另外治療劑。
  86. 如請求項85之方法，其中該另外治療劑為抗癌劑。
  87. 如請求項86之方法，其中該抗癌劑係選自化學治療劑、抗癌生物製劑、放射線療法、CAR-T療法及溶瘤病毒。
  88. 如請求項87之方法，其中該另外治療劑為抗癌生物製劑。
  89. 如請求項88之方法，其中該抗癌生物製劑為抑制PD-1及/或PD-L1之藥劑。
  90. 如請求項88之方法，其中該抗癌生物製劑為抑制VISTA、gpNMB、B7H3、B7H4、HHLA2、CTLA4或TIGIT之藥劑。
  91. 如請求項86至90中任一項之方法，其中該抗癌劑為抗體。
  92. 如請求項91之方法，其中該抗體包含結合腫瘤抗原之結合域。
  93. 如請求項88之方法，其中該抗癌生物製劑為細胞介素。
  94. 如請求項87之方法，其中該抗癌劑為CAR-T療法。
  95. 如請求項87之方法，其中該抗癌劑為溶瘤病毒。
  96. 如請求項83至95中任一項之方法，其進一步包含腫瘤切除及/或放射線療法。
  97. 一種將自然殺手介導之細胞毒性反應導向(redirecting)癌細胞的方法，其包含向患有癌症之個體投與醫藥學上有效量的如請求項1至66中任一項之多肽或複合體、如請求項67至69中任一項之免疫結合物或如請求項70之醫藥組合物。
  98. 一種治療感染性疾病的方法，其包含向患有感染性疾病之個體投與醫藥學上有效量的如請求項1至66中任一項之多肽或複合體、如請求項67至69中任一項之免疫結合物或如請求項70之醫藥組合物。
  99. 如請求項98之方法，其中該感染性疾病為細菌、病毒或真菌感染。
  100. 如請求項98或99之方法，其進一步包含投與另外治療劑。
  101. 如請求項100之方法，其中該另外治療劑為抗生素、抗病毒劑或抗真菌劑。
  102. 一種將自然殺手介導之細胞毒性反應導向病原體的方法，其包含向患有由該病原體引起之感染性疾病的個體投與醫藥學上有效量的如請求項1至66中任一項之多肽或複合體、如請求項67至69中任一項之免疫結合物或如請求項70之醫藥組合物。
  103. 如請求項98至102中任一項之方法，其中該多肽、複合體或免疫結合物包含至少一個結合該病原體表現之抗原的結合域。
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