KR20240067081A - Il-2 변이체 및 이의 융합 단백질 - Google Patents

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우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드
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    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Abstract

본 개시내용은 IL-2 변이체 및 상기 IL-2 변이체를 포함하는 폴리펩티드 복합체, 이의 생성 방법 및 이의 용도를 제공한다. IL-2 변이체 및 융합 단백질은 암, 자가면역 및 염증성 질환의 치료를 위한 효능제로서 사용될 수 있다.

Description

IL-2 변이체 및 이의 융합 단백질
상호 참조
본 출원은 2021년 9월 26일에 출원된 국제 특허출원 제 PCT/CN2021/120702 호의 우선권을 주장하며, 이 출원의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 출원은 일반적으로 IL-2 변이체, 상기 IL-2 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 폴리펩티드 복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
인터류킨-2(IL-2)는 T 세포의 성장 인자로서 확인된 4개의 α-나선 다발 사이토카인으로, 많은 면역 세포의 성장 및 증식에 관여한다[[Morgan DA, Ruscetti FW, and Gallo R. Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows. Science 1976; 193: 1007 - 1008]. IL-2는 주로 활성화된 T 세포에 의해 생산된다. IL-2의 생물학적 활성은 3가지 막관통 수용체 서브유닛: IL-2Rα(CD25), IL-2Rβ(CD122) 및 공통 γ 쇄(CD132)를 통해 매개된다. NK 세포 및 정상 상태 T 세포는 IL-2Rβ 및 γ를 발현하고, 조절 T 세포(Treg) 및 활성화된 T 세포만이 IL-2Rβ와 γ 외에 IL-2Rα를 발현한다. IL-2Rα는 IL-2의 다른 2개 서브유닛으로의 전달을 촉진하는 역할을 하며, IL-2Rβ/γ는 STAT5 관련 경로를 통해 활성화 신호를 전달한다. Treg 및 활성화된 T 세포상의 IL-2Rα/β/γ 삼량체는 IL-2의 고 친화성 수용체(KD ~ 10-11 M)로서 작용하고 IL-2Rβ/γ(NK 세포 및 정상 상태 T 세포상의)는 중간 친화성 수용체(KD ~ 10-9 M)이다[Takeshita T, Asao H, Ohtani K, et al. Cloning of the gamma chain of the human IL-2 receptor. Science 1992; 257: 379 - 382]. 고 친화성 수용체는 더 낮은 농도에서 IL-2를 포착하고 Treg 및 활성화된 T 세포를 IL-2에 더 민감하게 만들어 이들 각각의 기능을 지원하는 데 중요하다.
IL-2 및 이의 변이체는 다양한 임상 시험에서 시험되었다. IL-2는 암 면역요법에서 유망한 효능을 보였지만 독성 프로파일로 인해 효능과 사용이 제한되었다. 재조합 IL-2는 반감기가 짧고 혈관 누출 증후군(vascular leak syndrome)(VLS)과 같은 중증 부작용을 나타내었다. IL-2 변이체는 이러한 문제를 완화시키기 위해 개발되었지만, 경감된 효능 또는 면역원성 증가 등의 문제에 직면하였다.
항-PD(L)1 항체 및 기타 면역 조절 약물과 같은 면역 체크포인트 억제제를 사용하는 암 면역요법은 최근 몇 년간 획기적인 발전을 이루었다. 그러나 상당수의 암 환자는 여전히 기존 암 면역요법에 저항성 또는 불응성을 유지하고 있다. T 및 NK 세포 조절 사이토카인으로서 IL-2는 체크포인트(PD1, PD-L1, CTLA4, LAG-3 등) 또는 종양 관련 항원에 대한 치료 항체와 같은 기존 치료법(리툭시맙, 트러투주맙, 다라투무맙 등)에 의해 유도된 반응을 증가시킬 가능성이 있다.
Treg 세포는 면역 항상성 및 자기-관용(self-tolerance)을 유지하는 데 중요한 역할을 하며, 알레르기와 자가면역 질환의 발병을 억제하는 데 중요하다. IL-2는 고 친화성 IL-2 수용체를 통해 신호를 전달함으로써 Treg 세포의 증식을 유도할 수 있다. 따라서 IL-2 요법에 의한 Treg 집단 확대는 염증성 질환에서 병원성 T 세포의 균형을 맞추고 제한할 수 있는 잠재력을 갖는다. 현재 IL-2 요법은 이식편대숙주병(graft-versus-host disease), 1형 당뇨병(type 1 diabetes) 및 전신홍반성루푸스(systemic lupus erythematosus) 등의 염증성 질환에 대해 임상 시험에서 시험 중에 있다[Ye C, Brand D, and Zheng S.G. Targeting IL-2: an unexpected effect in treating immunological diseases.　Sig Transduct Target Ther　2018]. 그럼에도 불구하고, 기존 IL-2 분자는 여전히 빠른 제거와 잠재적인 독성이라는 부담을 안고 있다.
따라서 치료학적 IL-2는 강력한 효능과 제한된 독성을 지닌 이상적인 약물 분자를 생성시키기 위해 여전히 추가적인 탐색과 최적화가 필요다. IL-2 기반 요법은 면역종양학 및 자가면역 질환 치료 분야에서 엄청난 의학적 요구를 충족시킬 수 있다.
본 개시내용은 효능이 감소된 IL-2 변이체 및 이의 IL-2 융합 단백질을 제공하며, 이는 개선된 치료 효능을 갖는 신규의 면역요법제로서 작용할 수 있다.
이들 목적 및 기타 목적은 넓은 의미에서 개선된 효능을 갖는 단백질을 제공하는 화합물, 방법, 조성물 및 제조 물품에 관한 본 개시내용에 의해 제공된다. 본 개시내용에 의해 제공되는 이점은 치료 및 진단 분야에서 광범위하게 적용 가능하며 다양한 표적과 반응하는 항체와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 인간 IL-2 변이체, IL-2 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 폴리펩티드 복합체에 관한 것이다. IL-2는 본원에서 IL-2Rβ/γc, IL-2Rα, 또는 둘 다 및 결합된 IL-2Rα/β/γc 복합체에 대한 친화도가 약화된 변이체를 생성시키기 위한 독특한 접근 방식으로 조작된다. IL-2 변이체는 약화되었음에도 불구하고 IL-2Rα, IL-2Rβ/γc 및 결합된 IL-2Rα/β/γc 복합체에 대한 결합 능력을 여전히 유지한다. IL-2 변이체는 IL-2Rα 또는 IL-2Rβ/γc보다 IL-2Rα/β/γc 복합체에 더 높은 친화성을 갖는다.
IL-2 변이체는 다양한 효능 및 독성을 나타내었다. 따라서 IL-2 변이체는 암 및 자가면역 질환에 대해 신규의 면역요법제로서, 단독 요법으로서, 또는 다른 치료 옵션과 함께 제공될 수 있다. 또한, IL-2 변이체는 자가면역 및 기타 염증성 질환에 대한 면역조절제 역할을 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 IL-2 변이체를 제공하며, 여기서 IL-2 변이체는 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 공통 γ 쇄 중 적어도 하나에 대해 변형되거나 감소된 결합 친화도(binding affinity)를 갖고, 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여, C-말단 절두(C-terminal truncation), 28번 위치의 치환, 32번 위치의 치환, 38번 위치의 치환, 42번 위치의 치환, 52번 위치의 치환, 72번 위치의 치환, 76번 위치의 치환, 78번 위치의 치환, 82번 위치의 치환, 110번 위치의 치환, 111번 위치의 치환, 122번 위치의 치환, 125번 위치의 치환, 127번 위치의 치환, 128번 위치의 치환, 및 129번 위치의 치환, 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택된 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, C-말단 절두는 1 내지 20개 아미노산의 절두, 예를 들어 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산(들)의 절두 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 28번 위치의 치환은 I28A, I28E, I28G, I28V, I28F, I28M, I28W, I28P, I28Q, I28K, I28S, I28T, I28N, I28D, I28R, I28H, I28L 및 I28Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 32번 위치의 치환은 K32A, K32E, K32G, K32V, K32F, K32M, K32W, K32P, K32Q, K32I, K32S, K32T, K32N, K32D, K32R, K32H, K32L 및 K32Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 38번 위치의 치환은 R38W, R38F, R38Y, R38A, R38V, R38G, R38S, R38T, R38L, R38I, R38H, R38K, R38Q, R38N, R38D, R39E, R38M 및 R38P로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 42번 위치의 치환은 F42G, F42V, F42I, F42M, F42W, F42P, F42Q, F42K, F42A, F42S, F42T, F42E, F42N, F42D, F42R, F42H, F42L 및 F42Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 52번 위치의 치환은 E52A, E52K, E52G, E52V, E52F, E52M, E52W, E52P, E52Q, E52I, E52S, E52T, E52N, E52D, E52R, E52H, E52L 및 E52Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 76번 위치의 치환은 K76A, K76E, K76G, K76V, K76F, K76M, K76W, K76P, K76Q, K76I, K76S, K76T, K76N, K76D, K76R, K76H, K76L 및 K76Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 78번 위치의 치환은 F78A, F78K, F78G, F78V, F78E, F78M, F78W, F78P, F78Q, F78I, F78S, F78T, F78N, F78D, F78R, F78H, F78L 및 F78Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 82번 위치의 치환은 P82A, P82E, P82G, P82V, P82F, P82M, P82W, P82K, P82Q, P82I, P82S, P82T, P82N, P82D, P82R, P82H, P82L 및 P82Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 110번 위치의 치환은 E110A, E110K, E110G, E110V, E110F, E110M, E110W, E110P, E110Q, E110I, E110S, E110T, E110N, E110D, E110R, E110H, E110L 및 E110Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 111번 위치의 치환은 T111A, T111E, T111G, T111V, T111I, T111M, T111W, T111P, T111Q, T111K, T111S, T111F, T111N, T111D, T111R, T111H, T111L 및 T111Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 122번 위치의 치환은 I122A, I122E, I122G, I122V, I122F, I122M, I122W, I122P, I122Q, I122K, I122S, I122T, I122N, I122D, I122R, I122H, I122L 및 I122Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 125번 위치의 치환은 C125A, C125E, C125G, C125V, C125F, C125M, C125W, C125P, C125Q, C125K, C125I, C125S, C125T, C125N, C125D, C125R, C125H, C125L 및 C125Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 127번 위치의 치환은 S127A, S127E, S127G, S127V, S127F, S127M, S127W, S127P, S127Q, S127K, S127I, S127T, S127N, S127D, S127R, S127H, S127L 및 S127Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 128번 위치의 치환은 I128A, I128E, I128G, I128V, I128F, I128M, I128W, I128P, I128Q, I128K, I128S, I128T, I128N, I128D, I128R, I128H, I128L 및 I128Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 129번 위치의 치환은 I129A, I129E, I129G, I129V, I129T, I129M, I129W, I129P, I129Q, I129K, I129S, I129F, I129N, I129D, I129R, I129H, I129L 및 I129Y로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1과 단지 C-말단 절두만 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 2-10에 제시된 바와 같은 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1과 단지 38번 위치의 치환만 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시된 바와 같다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1과 단지 42번 위치의 치환만 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 11-13에 제시된 바와 같은 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1과 단지 111번 위치의 치환만 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1과 단지 129번 위치의 치환만 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 38번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 19에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(identity)(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열(homologous sequence) 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 42번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 14-18에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 111번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 20-21에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 129번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 23-27에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 129 및 42번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 28-29에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 129 및 38번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 30에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 127번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 31-33에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 127 및 129번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 34에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 125번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 35에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 128번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 36에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 110번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 37-39에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 122번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 40-42에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 28번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 43에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 32번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 44에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 52번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 45에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 76번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 46에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 78번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 47에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 82번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 48에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 110 및 129번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 49-51에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 122 및 129번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 52-54에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 28 및 129번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 55에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 32 및 129번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 56에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 52 및 129번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 57에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 76 및 129번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 58에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 78 및 129번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 59에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 82 및 129번 위치의 치환과 함께 C-말단 절두를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 60에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(예를 들어, 적어도 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성 또는 99% 동일성)을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
IL-2Rα, IL-2Rβ 및 공통 γ 쇄 중 적어도 하나에 대한 IL-2 변이체의 결합 친화도는 FACS 결합 분석에 의해 측정될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 비-IL-2 모이어티(non-IL-2 moiety)에 작동적으로 연결된 상기 기재된 바와 같은 IL-2 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게, 비-IL-2 모이어티는 생체내에서 IL-2 변이체의 반감기를 연장시킬 수 있다. 융합 단백질은 단량체, 이량체 또는 다량체일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-IL-2 모이어티는 Fc 영역, 인간 혈청 알부민, 항-인간 혈청 알부민 부분, PEG 및 지질 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상(예를 들어 2, 3, 4, 6, 8개 이상)의 IL-2 변이체를 포함하며, 여기서 IL-2 변이체는 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 2개의 아미노산 쇄를 포함하며, 여기서:
(a) 각 쇄는 Fc 영역의 N-말단에서 Fc 영역의 한 쇄에 융합된 하나의 IL-2 변이체를 포함하고;
(b) 각 쇄는 Fc 영역의 C-말단에서 Fc 영역의 한 쇄에 융합된 하나의 IL-2 변이체를 포함하고;
(c) 한 쇄는 Fc 영역의 N-말단에서 Fc 영역의 한 쇄에 융합된 하나의 IL-2 변이체를 포함하고, 다른 쇄는 Fc 영역의 C-말단에서 Fc 영역의 다른 쇄에 융합된 하나의 IL-2 변이체를 포함하거나; 또는
(d) 각 쇄는 각각 Fc 영역의 한 쇄의 N-말단 및 C-말단에 융합된 2개의 IL-2 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 융합 단백질의 각 쇄는, 함께 작동적으로 연결된 후 Fc 영역의 N 또는 C 말단에 융합되는 하나 초과의 IL-2 변이체를 포함한다. 바람직하게, 2개의 쇄는 동일한 수의 IL-2 변이체를 가져 대칭적인 배열을 형성한다.
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 융합 단백질은 서열번호 138 또는 139에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 IL-2 모이어티, 항원-결합 모이어티, 힌지 영역(hinge region) 및 Fc 영역을 포함하는 이작용성 폴리펩티드 복합체를 제공하며, 여기서:
IL-2 모이어티는 야생형 IL-2 또는 상기에 기재된 바와 같은 IL-2 변이체를 포함하고,
항원-결합 모이어티는 Fab, VHH, scFv, 앱타머 및 TCR 중에서 선택되고,
여기서 항원-결합 모이어티는 힌지 영역 및 Fc 영역의 N-말단 또는 Fc 영역의 C-말단에 작동적으로 연결되고, IL-2 모이어티는 힌지 영역의 N-말단 또는 Fc 영역의 C-말단에 작동적으로 연결된다. 폴리펩티드 복합체는 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다.
일부 구현예에서, 이작용성 폴리펩티드 복합체는 2개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함하며, 여기서 항원-결합 모이어티는 Fab이고,
제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함하고:
(a) IL-2 모이어티;
(b) 선택적으로, 링커(linker); 및
(c) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄;
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함하고:
(d) Fab의 중쇄; 및
(e) 힌지 영역 및 Fc 영역의 다른 쇄,
경쇄는 Fab의 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 이작용성 폴리펩티드 복합체는 2개의 쇄를 포함하며, 여기서 항원-결합 모이어티는 VHH이고,
제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함하고:
(a) IL-2 모이어티;
(b) 선택적으로, 링커; 및
(c) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄;
제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함한다:
(d) VHH; 및
(e) 힌지 영역 및 Fc 영역의 다른 쇄.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하며, 여기서 항원-결합 모이어티는 Fab이고,
제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함하고:
(a) Fab의 중쇄;
(b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄;
(c) 선택적으로, 링커; 및
(d) IL-2 모이어티,
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함하고:
(e) Fab의 중쇄; 및
(f) 힌지 영역 및 Fc 영역의 다른 쇄;
2개의 경쇄는 각각 Fab의 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 이작용성 폴리펩티드 복합체는 2개의 쇄를 포함하며, 여기서 항원-결합 모이어티는 VHH이고,
제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함하고:
(a) VHH;
(b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄;
(c) 선택적으로, 링커; 및
(d) IL-2 모이어티,
제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함한다:
(e) VHH; 및
(f) 힌지 영역 및 Fc 영역의 다른 쇄.
일부 구현예에서, 이작용성 폴리펩티드 복합체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하며, 여기서 항원-결합 모이어티는 Fab이고,
2개의 중쇄는 각각 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함하고:
(a) Fab의 중쇄;
(b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄;
(c) 선택적으로, 링커; 및
(d) IL-2 모이어티;
2개의 경쇄는 각각 Fab의 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 이작용성 폴리펩티드 복합체는 2개의 쇄를 포함하며, 여기서 항원-결합 모이어티는 VHH이고,
각 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함한다:
(a) VHH;
(b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄;
(c) 선택적으로, 링커; 및
(d) IL-2 모이어티.
일부 구현예에서, 이작용성 폴리펩티드 복합체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하며, 여기서 항원-결합 모이어티는 Fab이고,
2개의 중쇄는 각각 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함하고:
(a) IL-2 모이어티
(b) 선택적으로, 링커; 및
(c) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄;
(d) Fab의 중쇄,
2개의 경쇄는 각각 Fab의 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 이작용성 폴리펩티드 복합체는 2개의 쇄를 포함하며, 여기서 항원-결합 모이어티는 VHH이고,
각 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함한다:
(a) IL-2 모이어티;
(b) 선택적으로, 링커; 및
(c) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄;
(d) VHH.
일부 구현예에서, 이작용성 폴리펩티드 복합체는 2개의 쇄를 포함하며, 여기서 항원-결합 모이어티는 scFv이고,
각 쇄는 N-말단에서 C-말단으로, 하기를 포함한다:
(a) IL-2 모이어티;
(b) 선택적으로, 링커; 및
(c) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄;
(d) scFv.
일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIM4, 4-1BB, OX-40, OX-40L, GITR, A2aR, TIGIT, CD96, PVRIG, CD226, 5T4, VISTA, VSIG3, VSIG4, ICOS, CD28, CD3, CD4, CD8, CD45, CD44v6, CD27, CD47, SIRPAα, SLAMF7, CD24, Siglec10, Siglec15, Siglec8, VSIR, VSIG4, PSGL-1, C5AR1, BTN1A1, BTN3A1, CD70, RANKL, CSF1R, CSF2RB, TNFRSF1/1a/1b, BDCA2, BTLA, C5aR, N㎏2A, N㎏2D, NKp30, NKp46, CD16a, CD56, CD166, FCGR3, CD2, 뉴로필린-1, CCR8, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, GCGR, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CALCRL, ETAR, GLP1R, CX3CR1, GPR1, GPR17, GPR20, GPR30, GPR34, GPR-65, GPCR78, GPRC5D, GPR84, LGR4, LGR5, VEGF, VEGFR, HER2, HER3, Trop2, pCAD, ERα, EGFR, de2-7 EGFR, EGFRvIII, PSMA, PSCA, PSA, TAG-72, SEZ6, SEZ6L, SEZ6L2, SEMA4D, DLL3, GD2, GPC3, KLB, KLRB1, KLRG1, GPC1, PCSK9, EpCAM, p-카데린, Caludin 6, Caludin 18.2, FGFR2b, FGFR3, FGFR4, MUC1, MUC13, MUC16, MUC17, MUCL3, FolRa, TfR, TF, TFR, TFPI, c-Met, NY-ESO-1, GUCY2C, LIV-1, 인테그린 αvβ6, 인테그린 α10β1, 인테그린 α3, 인테그린 α5β4, 인테그린 αvβ3, 인테그린 αvβ8, ROR1, ROR2, PRLR, PTK7, B7-H3, 넥틴-4, NetG1, Ax1, CD147, LRRC15, Napi2b, STEAP1, LY6G6D, LYPD1, MACRO, MerTK, MICA, MICB, MSLN, Mkars, G12D, CDH3, CDH6, CDH17, APLA2, CAIX, CD46, CD47, CLDN6, EphA3, 푸코실-GM1, ITGA3, 칼리크레인, MISRII, 포도칼릭신, RON, ROBO1, PAUF, PLA2, 포도칼릭신, PRLR, PTK7, TM4SF1, TMEFF2, TREAKR, TREM-1, TREM-2, uPARAP, TYRP1, KAAG1, RU2AS, CD146, CD63, 엔도글린, Globo H, IGF-1R, TEM1, TEM8, TAX1BP3, ADAM-9, ENPP3, EphA2, EphA3, FcRH5, NaPi3b, TWEAK, DLK1, SORT1, SSTR2, STEAP1, CD25, CD39, GARP, LRRC33, LAIR1, LAMP3, LAP, LEPR, LILRB1, LILRB2, LILRB4, RAGE, FGL1, TPBG, PDGFRB, TGFBR2, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, 암태아 항원(CEA), ICAM1, A33, CAMPATH-1(CDw52), 카보안하이드라제 IX(MN/CA IX), CD248, PDPN, ITGB1, ITGAV, CD20, CD19, CD21, CD22, CLL, BCMA, DCLK1, DDR1, DLK1, DPEP3, DKK1, CD5, CD13, CD30, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD43, CD52, CD55, CD94, CD99, CD7, CD71, CD73, CD74, CD79a, CD79b, CD229, CD132, CD133, G250, CSF1R(CD115), HLA-DR, HLA-G, HTRA1, TRA-1-60, IGFR, IL-2 수용체, MCSP(흑색종(Melanoma)-관련 세포 표면 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸), ART1, ASGR1, B7H3, B7-H4, B7H6, CD124, c-Kit (CD117), CD7, Clex12A, Clever-1, IL-13RA2, IL-11RA, IL-31RA, IL-4RA, IFNAR, ActRIIb, IL-7R, SLAMF7, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT-3, CD135), GFRA1, BTLA, GloboH, CSF2RB, 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4, 흑색종-관련 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸), ITGA4, Clec5a, Clec7a, Clec9a, Clec12a, CLEC14, CD205, CD206, CD200R1, CD228, CD229, CD40, CD40L, FcRn, TLR8, TLR9, TNFR2, LTBR, CD44, CD93, PDGF, PDGFR-알파(CD140a), PDGFR-베타(CD140b), CD146, CD147, CRTH2, TNF-α, TGF-β, IL1RAcP, TSLP, DR5, ST2, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), CDCP1, Derlin1, 테나신, 프리즐드 1-10, 혈관 항원 VEGFR2(KDR/FLK1), VEGFR3(FLT4, CD309), 엔도겔린, Tie2 및 다른 종양 관련 항원(TAA), I/O 체크포인트, 종양 미세환경 표적, 또는 자가면역 및 염증성 질환 관련 표적 중에서 선택될 수 있는 표적 항원(target antigen)에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 링커는 n=0-5인 (G4S)n 링커이다.
일부 구현예에서, 힌지 영역은 야생형 힌지 영역에 비해 절두된 힌지 영역이다. 예를 들어, 힌지 영역은 N-말단 또는 C-말단으로부터 1 내지 10개 아미노산의 절두, 예를 들어 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산(들)의 절두를 갖는다.
일부 구현예에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 영역이다. IgG1 Fc 영역은 LALA 돌연변이를 가질 수 있으며, IgG4 Fc 영역은 FALA 돌연변이를 가질 수 있다. 대안적으로/추가로, Fc 변이체의 각 쇄는 다양한 목적을 위해, 예를 들어 효과기 기능을 제거하기 위해(예를 들어, D265A), 이종이량체화(heterodimerization)를 촉진하기 위해(예를 들어, 구멍에 손잡이 구조, 전하 상호작용, 단쇄 Fc), 또는 반감기를 변화시키기 위해(예를 들어, YTE, LS 또는 Ala-스캔 돌연변이), 또는 N-글리코실화를 제거하기 위해(예를 들어, N297D), 야생형 인간 Fc와 비교하여 하나 이상의 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 하기를 포함한다:
(a) 서열번호 62-130에 제시된 아미노산 서열 및 적어도 95% 동일성을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
(b) 서열번호 131-133에 제시된 아미노산 서열 및 적어도 95% 동일성을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
(c) 서열번호 134에 제시된 아미노산 서열 및 적어도 95% 동일성을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 특정한 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 하기를 포함한다:
서열번호 62, 63, 65 및 67에 제시된 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 131에 제시된 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 특정한 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 하기를 포함한다:
서열번호 64, 66 및 68-95에 제시된 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 특정한 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 하기를 포함한다:
서열번호 96-130에 제시된 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 이러한 핵산을 포함하는 벡터(vector), 및 본원에 개시된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 폴리펩티드 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 화학요법제, 방사성 입자 또는 독소와 같은 제제(agent)에 접합된(conjugated), 본원에 개시된 바와 같은 IL-2 변이체 또는 본원에 개시된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 하기의 단계를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체를 생산하기 위한 방법을 제공한다:
- 폴리펩티드 복합체의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포에서 폴리펩티드 복합체를 발현시키는 단계; 및
- 숙주 세포 배양물로부터 폴리펩티드 복합체를 단리하는 단계.
일부 양태에서, 본 개시내용은, 대상체(subject)에게 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계을 포함하고, 선택적으로 면역 반응이 NK 세포, CD8+ 세포, 또는 CD4+ T 세포(특히 Treg)와 관련된, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 유효량의, 본원에 개시된 바와 같은 IL-2 변이체 또는 폴리펩티드 복합체를 암호화하는 DNA 또는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 방법은 추가의 항-종양 요법, 예를 들어 종양-침윤 림프구(TIL) 요법, T 세포 수용체(TCR) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법, 대식세포 요법 및 NK 세포 요법을 포함한 세포 면역요법뿐만 아니라, 표적화된 요법 및 화학요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 렌티바이러스, AAV, 폭스바이러스, 대상포진 바이러스, 종양용해성 바이러스 및 IL-2 변이체를 암호화하는 다른 RNA/DNA 벡터를 포함하는 유전자 요법과 같은 추가의 항-종양 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 난소암(ovarian cancer), 흑색종(melanoma), 방광암(bladder cancer), 신세포 암종(renal cell carcinoma), 간암(liver cancer), 전립선암(prostate cancer), 위암(stomach cancer), 췌장암(pancreatic cancer), NSCLC, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 및 다발성 골수종(multiple myeloma) 중에서 선택되나, 이들로 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 암을 치료 또는 예방하기 위한 약제(medicament)의 제조에 있어서 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체의 용도를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 약제로서 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체 또는 본원에 개시된 바와 같은 면역접합체를 포함하는 용기(container)를 포함하는, 암을 치료 또는 진단하기 위한 키트(kit)를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 자가면역 또는 염증성 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체를 제공한다.
전술한 내용은 요약이며, 따라서 필요에 따라 단순화, 일반화 및 세부 사항 생략을 포함한다. 결과적으로, 당업자는 요약이 단지 예시일 뿐이며 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아니라는 점을 이해할 것이다. 본원에 기재된 방법, 조성물 및/또는 장치 및/또는 다른 발명의 요지의 다른 양태, 특징 및 장점은 본원에 제시된 교시에서 명백해질 것이다.
도 1은 본 개시내용의 일부 구현예에 따른, 야생형 IL-2 또는 IL-2 변이체를 포함하는 다양한 융합 단백질 및 폴리펩티드 복합체 포맷의 도식적 설명을 예시한다. 원뿔 모양은 IL-2 모이어티를 나타내고, 사다리 모양은 힌지 영역을 나타내며, 타원형 모양은 항원-결합 모이어티와 Fc 영역을 나타낸다. 상부 열은 IL-2 모이어티와 항원-결합 모이어티를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 도시한다: 하나의 IL-2 모이어티 + 하나의 항원 모이어티(a, Fab; b, VHH), 둘 다 N-말단; C-말단에 1개의 IL-2 모이어티 + N-말단에 2개의 항원 모이어티(c, Fab; d, VHH); C-말단에 2개의 IL-2 모이어티 + N-말단에 2개의 항원 모이어티(e, Fab; f, VHH); N-말단에 2개의 IL-2 모이어티 + C-말단에 2개의 항원 모이어티(t, Fab; u, VHH; v, scFv). 이러한 포맷은 다양한 에피토프/항원에 표적화된 가변 영역을 포함하는 Fab, VHH 및 scFv와 같은 다양한 항원-결합 모이어티를 수용할 수 있다. 두 번째 및 세 번째 열은 Fc 영역에 융합된 1개, 2개, 4개 이상의 IL-2 모이어티를 포함하는 융합 단백질 또는 폴리펩티드 복합체를 도시한다: (m) 비-IL-2 모이어티에 융합된 1개의 IL-2 모이어티(원형), 단쇄; (g, n) N-말단에 2개의 IL-2 모이어티; (h, o) C-말단에 2개의 IL-2 모이어티; (i, p) N-말단에 하나의 IL-2 모이어티 및 C-말단에 하나의 IL-2 모이어티; (j, q) N-말단에 2개의 IL-2 모이어티 및 C-말단에 2개의 IL-2 모이어티; (k, r) N-말단에 4개 이상의 IL-2 모이어티; (l, s) C-말단에 4개 이상의 IL-2 모이어티. n1 및 n2는 IL-2 모이어티의 반복을 나타낸다. Fc 영역의 "손잡이"는 Fc 영역의 2개 쇄가 이량체화를 촉진하도록 변형됨을 나타낸다. 하나 초과의 IL-2 모이어티를 포함하는 경우, IL-2 모이어티는 동일하거나 상이할 수 있다.
도 2는 Fc의 N 또는 C 말단에 융합된 wt IL-2로 처리한 후 NK92(a) 및 HH(b) 세포에서의 결합 곡선을 예시한다.
도 3은 인간 IgG1 또는 IgG4 포맷의 wt IL-2를 포함하는 폴리펩티드 복합체로 처리된 NK92(a) 및 HH(b) 세포에서의 결합 곡선을 예시한다.
도 4는 1차 인간 CD8+ T 세포에 대한 STAT5 인산화에 이어서 다양한 포맷의 wt IL-2 또는 IL-2 변이체를 포함하는 폴리펩티드 복합체에 의한 처리의 중간 형광 강도(MFI)를 예시한다.
도 5는 절두된 IL-2 변이체를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 IL-2Rβ/γ를 갖는 세포에서 상이한 친화도 및 효능을 나타내었음을 예시한다. (a) 1차 인간 CD8+ T 세포에 대한 STAT5 인산화에 이어서 IL-2 변이체에 의한 처리의 MFI. (b) HH 세포에서 IL-2 변이체의 결합 곡선.
도 6은 절두된 IL-2 변이체를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 IL-2Rα/β/γ를 갖는 세포에서 상이한 친화도 및 효능을 나타내었음을 예시한다. (a) IL-2 변이체로 처리 한 후 인간 Treg 세포에서 STAT5 인산화의 MFI. (b) NK92 세포에서 IL-2 변이체의 결합 곡선.
도 7은 아미노산 돌연변이가 있는 절두된 IL-2 변이체가 IL-2Rβ/γ를 발현하는 세포에서 상이한 친화도 및 효능을 나타내었음을 예시한다. (a) 1차 인간 CD8+T 세포에 대한 STAT5 인산화에 이어서 IL-2 변이체에 의한 처리의 중간 형광 강도(MFI). (b) IL-2 변이체로 처리한 후 HH 세포에서의 결합 곡선.
도 8은 아미노산 돌연변이가 있는 절두된 IL-2 변이체가 IL-2Rα/β/γ를 발현하는 세포에서 유사한 친화도 및 효능을 나타내었음을 예시한다. (a) 인간 Treg 세포에 대한 STAT5 인산화에 이어서 IL-2 변이체에 의한 처리의 중간 형광 강도(MFI). (b) IL-2 변이체로 처리한 후 MJ20 세포에서의 결합 곡선.
도 9는 IL-2 변이체가 IL-2Rβ/γ를 발현하는 세포에서 상이한 친화도 및 효능을 나타내었음을 예시한다. (a) 1차 인간 CD8+T 세포에 대한 STAT5 인산화에 이어서 IL-2 변이체에 의한 처리의 중간 형광 강도(MFI). (b) IL-2 변이체로 처리한 후 HH 세포에서의 결합 곡선.
도 10은 IL-2 변이체가 IL-2Rα/β/γ를 발현하는 세포에서 유사한 친화도 및 효능을 나타내었음을 예시한다. (a) 인간 Treg 세포에 대한 STAT5 인산화에 이어서 IL-2 변이체에 의한 처리의 중간 형광 강도(MFI). (b) IL-2 변이체로 처리한 후 MJ20 세포에서의 결합 곡선.
도 11은 IL-2Rα 계면에 아미노산 돌연변이가 있는 IL-2 변이체가 IL-2Rα/β/γ를 발현하는 세포에서 유사한 친화도 및 효능을 나타내었음을 예시한다. (a) 인간 Treg 세포에 대한 STAT5 인산화에 이어서 IL-2 변이체에 의한 처리의 중간 형광 강도 (MFI). (b) IL-2 변이체로 처리한 후 NK92 세포에서의 결합 곡선.
도 12는 IL-2Rα 계면에 아미노산 돌연변이가 있는 IL-2 변이체가 IL-2Rβ/γ를 발현하는 세포에서 상이한 친화도 및 효능을 나타내었음을 예시한다. (a) 1차 인간 CD8+T 세포에 대한 STAT5 인산화에 이어서 IL-2 변이체에 의한 처리의 중간 형광 강도(MFI). (b) IL-2 변이체로 처리한 후 HH 세포에서의 결합 곡선.
도 13은 IL-2 변이체로 처리한 후 HH(a) 및 NK92(b) 세포에서의 결합 곡선을 예시한다.
도 14는 IL-2 변이체가 STAT5 인산화 분석에 의해 측정된 바와 같이, 1차 인간 CD8+ T 세포(a) 및 Treg(b)에서 상이한 효능을 나타내었음을 예시한다.
도 15는 IL-2 변이체로 처리한 후 HH(a) 및 MJ20(b) 세포에서의 결합 곡선을 예시한다.
도 16은 IL-2 변이체가 STAT5 인산화 분석에 의해 측정된 바와 같이, 1차 인간 CD8+ T 세포(a) 및 Treg(b)에서 상이한 효능을 나타내었음을 예시한다.
도 17은 2가 IL-2 변이체로 처리한 후 HH(a) 및 MJ20(b) 세포에서의 결합 곡선을 예시한다.
도 18은 2가 IL-2 변이체가 STAT5 인산화 분석에 의해 측정된 바와 같이, 1차 인간 CD8+ T 세포(a) 및 Treg(b)에서 상이한 효능을 나타내었음을 예시한다.
도 19는 센서 칩상에 고정화된 인간 IL-2Rγc에 대한, IL-2 변이체와 미리-복합체화된 인간 IL-2Rβ(1:1)의 결합을 나타내는 SPR 곡선을 예시한다.
도 20은 최대 허용 용량(MTD) 분석의 체중 변화를 예시한다. 마우스를 다양한 용량의 IL-2 변이체로 처리하였다: W3XX115-T2U0.E44-1.uIgG4V322 및 W3XX115-T3U0.E44-1.uIgG4V322(a); W3XX115-T2U0.E44-6.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-15.uIgG4V322 및 W3XX115-T3U0.E44-20.uIgG4V322(b); W3XX115-T2U0.E44-26.uIgG4V322 및 W3XX115-T3U0.E44-33.uIgG4V322(c); W3XX115-T2.Z20-1.uIgG4V322 및 W3XX115-T2.Z20-2.uIgG4V322(d).
도 21은 IL-2 변이체로 처리한 후 MC38 결장 암종 모델의 종양 부피 변화를 예시한다. MC38 동계 모델은 W3XX115-T2U0.E44-1.uIgG4V322 및 W3XX115-T3U0.E44-1.uIgG4V322(a)에 의해 처리되었고; MTD 또는 고용량(b) 또는 상이한 용량 범위(c, d)의 IL-2 변이체에 의해 처리되었다.
도 22는 W3XX115-T2U0.E44-1.uIgG4V322 및 W3XX115-T3U0.E44-1.uIgG4V322로 처리시 종양 내 Treg 및 CD8+ T 세포의 약역학 효과를 예시한다.
도 23 (a)-(l)은 IL-2 변이체로 처리 시 다양한 종류의 종양 침윤된 면역 세포의 약역학 효과를 예시한다.
도 24 (a)-(f)는 IL-2 변이체로 처리 시 말초 T 세포의 약역학 효과를 예시한다.
도 25는 IL-2 변이체로 처리 시 DSS-유발 대장염(colitis) 마우스 모델의 체중(a) 및 결장 길이(b)의 변화를 예시한다.
본 개시내용이 다양한 형태로 구현될 수 있지만, 본원은 본 개시내용의 원리를 예시하는 특정한 예시적인 구현예를 개시한다. 본 개시내용은 예시된 특정 구현예에 제한되지 않는다는 것이 강조되어야 한다. 더욱이, 본원에 사용된 모든 섹션 제목은 구성 목적만을 위한 것이며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다. 보다 구체적으로, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "단백질"에 대한 언급은 복수의 단백질을 포함하고; "세포"에 대한 언급은 세포의 혼합물을 포함하는 등이다. 본원에서 "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, "포함하는"이라는 용어뿐만 아니라 "포함하다" 및 "포함한"과 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 첨부된 청구범위에 제공된 범위는 양 끝점과 양 끝점 사이의 모든 점을 포함한다.
일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 기법은 당업계에 주지되어 있으며 통상적으로 사용되는 것들이다. 본 개시내용의 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 주지되어 있는 통상적인 방법에 따라서, 및 달리 명시되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 하기의 문헌을 참조하시오: Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); and Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 이들의 실험 절차 및 기법은 당해 분야에 주지되고 통상적으로 사용되는 것이다.
정의
본 개시내용을 보다 잘 이해하기 위해서, 관련 용어의 정의 및 설명을 하기와 같이 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 "IL-2" 또는 "인터류킨-2"라는 용어는 IL-2의 모든 형태, 예를 들어 1) 고유의 가공되지 않은 IL-2 분자, "전장(full-length)" IL-2 단백질 또는 IL-2의 자연 발생 변이체; 2) 세포 내 가공으로 인해 생성되는 모든 형태의 IL-2; 또는 3) 전장, 단편(예를 들어, 절두된 형태) 또는 변형된 형태를 포함하고자 한다. IL-2는 활성화된 T세포로부터 주로 생성되는 사이토카인이며 다양한 면역 세포의 증식 및 활성화에 기여한다. 인간 성숙 IL-2의 분자량은 약 15 kDa(서열번호 1에 나타낸 바와 같이, 133개 아미노산)이며 4-α-나선 다발 구조를 갖는다. 본 개시내용에 사용된 바와 같이, "IL-2"는 야생형 IL-2 또는 IL-2 변이체일 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 "변이체"라는 용어는 고유 단백질 서열에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 생물학적 활성 폴리펩티드를 의미한다. 선택적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이에는 아미노산 서열의 특정 위치에서의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 포함된다. 변이체는 상응하는 고유 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 95%(예를 들어, 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상)의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 이러한 변이체에는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산(자연 발생 아미노산 및/또는 비-자연 발생 아미노산) 잔기가 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 부가되거나 결실된 폴리펩티드가 포함된다. 변이체에는 또한 고유 서열의, 전형적으로 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 단편(예를 들어, 하위서열, 절두 등)이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "IL-2 변이체"라는 용어는 야생형 IL-2에 임의의 변형을 가하여 생성된 모든 단백질을 포함하며, 야생형 IL-2와 유사한 기능, 예를 들어 특히, IL-R2α, IL-2Rβ/γc 및/또는 결합된 IL-R2α/β/γc 복합체(바람직하게는 야생형 IL-2에 비해 결합 친화도가 약화됨)에의 특이적인 결합, T 세포(예를 들어, CD8+ T 세포, NK 세포 및 Treg 세포)와 같은 면역 세포의 활성화, STAT5의 인산화를 갖는다. 변이체의 예에는 wt IL-2가 아미노산 변형(예를 들어, 결실, 치환 또는 부가)에 의해 변형된 IL-2 변이체, wt IL-2가 사카라이드 변형에 의해 변형된 IL-2 변이체, 및 wt IL-2가 화학적 변형에 의해 변형된 IL-2 변이체를 포함한다.
본원에서 "항체" 또는 "Ab"라는 용어는 다클론 항체, 단일특이성 및 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체) 및 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체를 포함하여, 다양한 항체 구조를 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 고유의 온전한 항체는 일반적으로 공유 디설파이드 결합 및 비-공유 상호작용에 의해 함께 유지된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L) 폴리펩티드를 포함하는 Y-모양 사량체성 단백질이다. 항체의 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류될 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 및 ε으로 분류될 수 있으며, 이들은 항체의 아이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 정의한다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역은 약 12개 이상 아미노산의 "J" 영역을 통해 불변 영역에 연결되고, 중쇄는 약 3개 이상 아미노산의 "D" 영역을 추가로 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 비교적 보존적인 영역(프레임워크 영역(FR)이라고 함)이 사이에 배치된 고가변 영역(상보성 결정 영역(CDR)이라고 함)으로 추가로 나뉠 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 N-말단에서 C-말단으로, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순으로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 각 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(VH 및 VL)은 각각 항원 결합 부위를 형성한다. 다양한 영역 또는 도메인에서의 아미노산 분포는 하기 문헌의 정의에 따른다: Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:878-883, Contact numbering, AbM numbering or IMGT numbering. 항체는 다양한 항체 아이소타입, 예를 들어 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다. 넓은 의미에서, 항원-결합 모이어티를 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체가 또한 항체에 속한다.
본원에 사용된 바와 같은 "항원-결합 모이어티"라는 용어는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부로부터 형성된 항체 단편, 또는 항원에 결합하지만 온전한 고유의 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 모이어티의 예에는 비제한적으로, 가변 도메인, 가변 영역, 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디설파이드 안정화된 Fv 단편(dsFv), a(dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 디설파이드 안정화된 디아바디(ds 디아바디), 다중특이성 항체, 카멜화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, VHH, 2가 도메인 항체 및 TCR이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 "Fab"라는 용어는 VH, CH1, VL 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 항원-결합 모이어티는 모 항체가 결합하는 것과 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역에 그라프트된(grafted) 특정 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 항원-결합 모이어티의 더 많은 상세한 포맷은 하기의 문헌에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 내용 전체가 본원에 포함된다: Spiess et al., Molecular Immunology, 67(2), pp.95-106 (2015), 및 Brinkman et al., mAbs, 9(2), pp.182-212 (2017).
본원에 사용된 바와 같은 "힌지 영역"이라는 용어는 항체와 관련하여 사용된 바와 동일한 의미를 가지며, 이는 Fab(단편 항원 결합) 영역을 Fc(결정화 가능한 단편) 영역에 연결하는 면역글로불린 중쇄(H)의 짧은 서열을 지칭한다. 힌지 영역은 전체 또는 부분 힌지 영역일 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩티드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 유연한 또는 반-유연한 연결을 생성시키는 적어도 2개(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체에 포함된 힌지 영역은 C-말단 또는 N-말단 절두된 힌지 영역이다. 힌지 영역은 특정한 링커이며 본원에서 융합 단백질 또는 폴리펩티드 복합체를 작제할 때 다른 링커 서열에 의해 적합하게 대체될 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "Fc"라는 용어는 항체와 관련하여 사용된 것과 동일한 의미를 가지며, 이는 디설파이드 결합을 통해 제2 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역에 결합된 제1 중쇄의 제2(CH2) 및 제3(CH3) 불변 영역을 포함하는 항체의 부분을 지칭한다. 항체의 Fc 영역은 ADCC, CDC 등의 다양한 효과기 기능을 담당하지만, 일반적으로 항원 결합에는 기능하지 않는다. 본 개시내용에서, "Fc"라는 용어는 야생형 Fc, Fc 변이체 및 그라프트된 Fc를 모두 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 아미노산 잔기/위치와 관련하여, "변형"이라는 용어는 출발 아미노산 서열과 비교하여 1차 아미노산 서열의 변화를 지칭하며, 여기서 변화는 상기 아미노산 잔기/위치와 관련된 서열 변경으로부터 발생한다. 예를 들어, 전형적인 변형에는 잔기(또는 상기 위치)의 다른 아미노산에 의한 치환(예를 들어, 보존적 또는 비보존적 치환), 상기 잔기/위치에 인접한 하나 이상의 아미노산의 삽입, 및 상기 잔기/위치의 결실이 포함된다. "아미노산 치환" 또는 이의 변형은 미리 결정된 (출발) 아미노산 서열의 기존 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 변형은 출발(또는 "야생형") 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 변이체 폴리펩티드의 적어도 하나의 물리생화학적 활성의 변경을 초래한다. 예를 들어, IL-2 변이체에서, 변경되는 물리생화학적 활성은 표적 분자에 대한 결합 친화도, 결합 능력 및/또는 결합 효과일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 서열에서 2개 이상의 치환은 각 치환 사이에 "+" 또는 "/"로 표현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "융합 단백질"이라는 용어는 작동적으로 함께 연결된 IL-2 모이어티 및 비-IL-2 모이어티(및 선택적으로 더 많은 부분)을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭하며, 여기서 각 부분은 상이한 특성을 갖는 폴리펩티드이다. 특성은 시험관내 또는 생체내 활성과 같은 생물학적 특성일 수 있다. 특성은 표적 항원에 대한 결합, 반응 촉매 작용 등과 같은 단순한 화학적 또는 물리적 특성일 수도 있다. 두 부분은 단일 펩티드 결합에 의해 직접 연결되거나 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 두 부분과 링커는 서로 판독 프레임 내에 있을 것이다. 바람직하게, 비-IL-2 모이어티는 생체내에서 IL-2의 반감기를 연장시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 비-IL-2 모이어티는 힌지 영역 및 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 불변 영역이므로, 생성된 융합 단백질은 IL-2/Fc 융합 단백질로 지칭된다. IL-2/Fc 융합 단백질은 Fc 영역에 작동적으로 연결된(임의로 힌지 영역을 통해 연결된) IL-2 모이어티를 포함하며, 일반적으로 이량체이다.
"폴리펩티드 복합체"라는 용어는 본원에서 "융합 단백질"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. "이작용성 폴리펩티드 복합체"라는 용어는 IL-2 모이어티, 항원-결합 모이어티 및 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 이러한 융합 단백질은 IL-2 모이어티가 기존 항체의 Fab 또는 VHH를 대체하거나 항체의 C 말단에 부가된다는 점에서 기존 항체와 구조적으로 유사하다. "이작용성"이라는 용어는 항원 결합 특이성과 IL-2 조절 효과를 겸비한 폴리펩티드 복합체를 의미한다.
"작동적으로 연결된"이란 용어는 스페이서 또는 링커 유무에 관계없이, 2개 이상의 생물학적 관심 서열이 의도된 방식으로 기능하게 하는 관계에 있도록 하는 방식으로 병치된 것을 지칭한다. 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우, 이는 연결된 생성물이 의도된 생물학적 기능을 갖도록 허용하는 방식으로 폴리펩티드 서열이 연결된다는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 항원-결합 모이어티는 항원 결합 활성을 갖는 안정한 생성물을 제공하기 위해 Fc 영역에 작동적으로 연결될 수 있다. "작동적으로 연결됨"에 의해, 항원-결합 모이어티는 두 부분이 정상적으로 기능할 수 있는 한, Fc 영역에 직접 연결될 수 있거나, 보다 바람직하게는 항원-결합 모이어티는 힌지 영역과 같은 링커 서열을 통해 Fc 영역에 간접적으로 연결될 수 있다. 이 용어는 또한 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일런서 서열 등)에 작동적으로 연결되는 경우, 이는 폴리뉴클레오티드 서열이 상기 폴리뉴클레오티드로부터 폴리펩티드의 조절된 발현을 허용하는 방식으로 연결된다는 것을 의미하고자 한다.
본원에 사용된 바와 같은 "유전자요법"이라는 용어는 신체 내부(생체내) 또는 신체 외부(생체외)에서 유전자를 대체하거나, 불활성화하거나 세포에 도입함으로써 질병을 치료하는 것을 목표로 하는 치료법을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 변이체(들)를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 대상체에게 투여한다. 유전자요법은 IL-2 변이체를 암호화하는 DNA 또는 RNA를 전달하기 위해 렌티바이러스, AAV, 폭스바이러스, 대상포진 바이러스, 종양용해성 바이러스 및 기타 RNA/DNA 벡터를 사용하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "세포요법"이라는 용어는 특정 세포 세트를 복원 또는 변경하거나 세포를 사용하여 신체를 통해 치료를 수행함으로써 질병을 치료하는 것을 목표로 하는 치료법을 지칭한다. 세포요법의 경우, 세포를 환자에게 주입하기 전에 신체 밖에서 배양하거나 변형시킨다. 세포는 환자(자기유래 세포) 또는 공여자(동종이계 세포)로부터 유래될 수 있다. 현행 세포요법에는 CAR-T, TCR-T, TIL, CAR-NK, CAR-γδ T, CAR-대식세포 및 기타 조작된 면역 세포를 사용하는 것이 포함된다. 본원의 일부 구현예에서, 치료 방법은 세포요법을 추가로 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "EC50"(또한 "최대 유효 농도의 절반"으로도 지칭된다)이라는 용어는 특정 노출 시간 후 기준선과 최대치 사이의 중간 반응을 유도하는 약물, 항체 또는 독성물질의 농도를 지칭한다. 본 출원의 맥락에서 EC50은 "nM" 단위로 표현된다.
본원에 사용된 바와 같은 "단리된"이라는 용어는 자연 상태에서 인공적인 수단에 의해 획득된 상태를 지칭한다. 특정한 "단리된" 물질 또는 성분이 자연에 존재하는 경우, 이는 자연 환경이 변하거나 물질이 자연 환경으로부터 단리되거나 또는 둘 다이므로 가능하다. 예를 들어, 어떤 살아있는 동물의 몸에는 어떤 단리되지 않은 폴리뉴클레오티드나 폴리펩티드가 자연적으로 존재하며, 이와 같은 자연상태에서 단리된 고순도의 동일한 폴리뉴클레오티드나 폴리펩티드를 단리된 폴리뉴클레오티드나 폴리펩티드라고 한다. "단리된"이라는 용어는 혼합된 인공 또는 합성물질이나 그 밖에 단리된 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 불순한 물질은 제외한다.
본원에 사용된 바와 같은 "벡터"라는 용어는 내부에 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클(vehicle)을 지칭한다. 벡터가 내부에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 벡터를 발현 벡터라고 한다. 벡터는 숙주 세포 내로의 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 숙주 세포에서 발현된 운반된 유전 물질 요소를 가질 수 있다. 플라스미드, 파지, 코스미드, 인공 염색체, 예를 들어 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC); λ 파지 또는 M13 파지와 같은 파지 및 동물 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 벡터가 당업자에게 주지되어 있다. 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스에는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, 헤르페스 단순 바이러스), 폭스 바이러스, 바큘로바이러스, 유두종 바이러스, 파포바 바이러스(예를 들어, SV40) 등이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 발현 조절을 위한 다중 요소를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기원을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"라는 용어는 관심 단백질, 단백질 단편 또는 펩티드를 생성하도록 조작될 수 있는 세포 시스템을 지칭한다. 숙주 세포에는 배양된 세포, 예를 들어 CHO, BHK, NSO, SP2/0, YB2/0과 같은 설치류(래트, 마우스, 기니 피그 또는 햄스터)로부터 유래된 포유동물 배양된 세포; 또는 인간 조직 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포 및 곤충 세포, 및 트랜스제닉 동물 또는 배양된 조직 내에 포함된 세포가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손도 포함한다. 돌연변이나 환경 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 "숙주 세포"라는 용어의 범위 내에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "동일성"이라는 용어는 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정되는, 2개 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 지칭한다. "동일성 백분율"은 비교된 분자의 아미노산 또는 뉴클레오티드간의 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하며, 비교되는 분자 중 가장 작은 크기를 기준으로 계산된다. 이러한 계산을 위해, 정렬의 끊김(있는 경우)을 바람직하게는 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 다룬다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하는 데 사용될 수 있는 방법에는 하기의 문헌에 기재된 것이 포함된다: Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073.
본원에 사용된 바와 같은 "형질감염"이라는 용어는 핵산이 진핵 세포, 특히 포유동물 세포에 도입되는 과정을 지칭한다. 형질감염을 위한 프로토콜 및 기법에는 지질 형질감염 및 일렉트로포레이션과 같은 화학적, 물리적 방법이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 다수의 형질감염 기법이 당업계에 주지되어 있으며 본원에 개시되어 있다. 예를 들어, 하기의 문헌을 참조하시오: Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 폴리펩티드 복합체의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 벡터를 293F 세포에 형질감염시켰다.
본원에 사용된 바와 같은 "형광-활성화 세포 분류" 또는 "FACS"라는 용어는 특수 유형의 유세포 분석(flow cytometry)을 지칭한다. 이는 생물학적 세포의 이종 혼합물을 2개 이상의 용기에, 각 세포의 특정 광 산란 및 형광 특성을 기반으로 한 번에 한 세포씩 분류하는 방법을 제공한다(FlowMetric. "Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting". Retrieved 2017-11-09). FACS를 수행하기 위한 장비는 당업자에게 공지되어 있으며 공개적으로 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 장비의 예로는 FACS Star Plus, FACScan 및 FACSort 장비(Becton Dickinson(Foster City, Calif.)로부터), Epics C(Coulter Epics Division(Hialeah, Fla.)으로부터) 및 MoFlo(Cytomation(Colorado Springs, Colo.)으로부터)가 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"라는 용어는, 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비된 Ig가, 이들 세포독성 효과기 세포가 항원 함유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 표적 세포를 세포독소로 죽일 수 있게 하는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키며 그러한 살해에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국특허 제 5,500,362 호 또는 제 5,821,337 호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"대상체"라는 용어는 임의의 인간 또는 비인간 동물, 바람직하게는 인간을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "암"이라는 용어는 의학적 상태를 유발할 수 있는 임의의 종양 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이-매개된, 고형 종양 및 백혈병과 같은 비-고형 종양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "자가면역 질환"이라는 용어는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 전신홍반성루푸스(systemic lupus erythematosus), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같이, 기능하는 신체 부위에 대한 비정상적인 면역 반응으로 인해 발생하는 모든 상태를 지칭하며, 이는 의학적 상태를 유발할 수 있다.
상태를 치료하는 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 "치료", "치료하는" 또는 "치료된"이라는 용어는 일반적으로 인간이든 동물이든 간에, 원하는 치료 효과가 달성되는, 예를 들어 상태의 진행 억제가 달성되는 치료 및 치료법에 관한 것이며, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 정지, 상태의 퇴행, 상태의 개선 및 상태의 치유가 포함된다. 예방적 조치(즉, 예방, 방지)로서의 치료도 포함된다. 암의 경우, "치료하는"은 종양이나 악성 세포의 성장, 증식, 전이, 또는 이들의 일부 조합을 약화시키거나 늦추는 것을 지칭할 수 있다. 종양의 경우, "치료"에는 종양 전체 또는 일부의 제거, 종양 성장 및 전이의 억제 또는 둔화, 종양의 발달 예방 또는 지연, 또는 이들의 일부 조합이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "유효량"이라는 용어는 원하는 치료 요법에 따라 투여시 합리적인 이익/위험 비에 상응하는, 일부 원하는 치료 효과를 생성하는데 유효한 활성 화합물, 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 투여 형태의 양에 관한 것이다. 예를 들어, 암과 같은 질병 또는 상태의 치료와 관련하여 사용되는 경우 "유효량"은 상기 질병 또는 상태를 치료하는데 유효한 활성제, 약물 또는 항체 또는 이의 항원-결합 모이어티의 양 또는 농도를 지칭한다.
포유동물의 특정 질병 상태와 관련하여 본원에서 사용된 "예방하다", "예방" 또는 "예방하는"이라는 용어는 질병의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 또는 이의 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 예방하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는"이라는 용어는 비히클, 희석제, 부형제(excipient) 및/또는 이의 염이 제형 내 다른 성분과 화학적으로 및/또는 물리적으로 양립성이고, 수용자와 생리학적으로 양립할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제"라는 용어는 대상체 및 활성제와 약리학적으로 및/또는 생리학적으로 상용성인 담체 및/또는 부형제를 지칭하며, 이는 당해 분야에 주지되어 있고(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995]을 참조하시오), pH 조절제, 계면활성제, 아주반트(adjuvant) 및 이온 강도 증강제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 비제한적으로 포스페이트 완충액을 포함하고; 계면활성제는 비제한적으로 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 Tween-80을 포함하고; 이온 강도 증강제는 비제한적으로 염화나트륨을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원보강제"라는 용어는 항원과 함께 유기체에 전달되거나 미리 유기체에 전달될 때 유기체에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시키거나 면역 반응 유형을 변화시킬 수 있는 비-특이적인 면역강화제를 지칭한다. 알루미늄 항원보강제(예를 들어, 수산화알루미늄), 프로인트 항원보강제(예를 들어, 프로인트 완전 항원보강제 및 프로인트 불완전 항원보강제), 코리네박테리움 파르붐, 리포폴리사카라이드, 사이토카인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 항원보강제가 존재한다. 프로인트 항원보강제는 현재 동물 실험에서 가장 흔히 사용되는 항원보강제이다. 수산화알루미늄 항원보강제는 임상 시험에서 더 통상적으로 사용된다.
IL-2 변이체
일부 양태에서, 본 개시내용은 야생형 IL-2 단백질, 예를 들어 인간 야생형 IL-2 단백질과 비교하여 하나 이상의 변형(들), 예를 들어 삽입, 치환 및/또는 결실을 포함하는 IL-2 변이체를 제공한다. 인간 야생형 IL-2 단백질의 성숙한 형태는 서열번호 1에 예시되어 있다.
잔기는 본원에서 IL-2 아미노산 위치가 이어지는 한 글자 아미노산 암호로 지정된다, 예를 들어 F42는 서열번호 1의 42번 위치에 있는 페닐알라닌 잔기이다. 치환은 본원에서 한 문자 아미노산 암호에 이은 IL-2 아미노산 위치, 이어서 치환하는 한 문자 아미노산 암호에 의해 지정된다, 예를 들어 F42V는 서열번호 1의 42번 위치에 있는 페닐알라닌 잔기의 발린 잔기에 의한 치환이다. 아미노산 서열에 변형(들)을 도입시킴으로써, 본원에 개시된 바와 같은 IL-2 변이체는 IL-R2α, IL-2Rβ/γc 및 /또는 IL-2Rα/β/γc 복합체에 대해 감소된 결합 친화도를 제공하여, 결과적으로 면역 세포를 자극하는 효능을 감소시키고 따라서 생체내 독성을 감소시킨다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 야생형 IL-2의 C 말단으로부터 하나 이상의 아미노산의 절두를 갖는다. 상기 하나 이상의 아미노산의 절두는, IL-2 변이체가 IL-R2α, IL-2Rβ/γc 및 /또는 결합된 IL-2Rα/β/γc 복합체에 대한 결합 능력을 유지(바람직하게는 약화)하는 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상 아미노산(들)의 절두일 수 있다. IL-2 변이체는 C-말단 절두만이 서열번호 1과 상이한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 특정 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 2-10에 제시된 바와 같은 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 치환(들)은 IL-2/Rα 또는 IL-2Rβ/γc 결합 계면에 위치한 아미노산에서 발생할 수 있다. 구체적으로, 치환은 서열번호 1에 상응하는 28, 32, 38, 42, 45, 52 , 72, 76, 78, 82, 110, 111 , 122, 125, 127, 128 및 129번 위치 중 하나 이상에서 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 25, 28, 37, 38, 41, 42, 43, 45, 52, 61, 62, 65, 68, 72, 76, 78, 82, 107, 110, 111, 122, 125, 127, 128 및 129번 위치에 하나 이상의 치환을 포함한다. 각 위치에서, 아미노산은 시스테인 및 원래의 아미노산을 제외한 임의의 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 42번 위치에 치환을 포함하고, 원래의 아미노산 페닐알라닌(F)은 시스테인 및 페닐알라닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 세린(S), 글리신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 리신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 프롤린(P), 글루타민(Q), 아르기닌 (R), 쓰레오닌(T), 발린(V), 트립토판(W), 티로신(Y), 보다 구체적으로는 G, V, I 또는 M에 의해 치환될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 11-13에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 38번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 아르기닌(R)은 시스테인 및 아르기닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, I, S, T, V, W, Y, 보다 구체적으로 W에 의해 치환될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 22 및 적어도 95% 동일성을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 28번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 이소류신(I)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, T, K, M, N, P, Q, R, S, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 P에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 32번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 리신(K)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, T, I, M, N, P, Q, R, S, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 D에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 52번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 글루탐산(E)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, T, K, M, N, P, Q, R, S, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 G에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 76번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 리신(K)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, T, I, M, N, P, Q, R, S, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 R에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 78번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 페닐알라닌(F)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, K, G, H, T, I, M, N, P, Q, R, S, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 G에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 82번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 프롤린(P)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, K, G, H, T, I, M, N, F, Q, R, S, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 Y에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 110번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 글루탐산(E)은 시스테인 및 쓰레오닌의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, T, K, M, N, P, Q, R, S, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 R, I 및 T에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 111번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 쓰레오닌(T)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 A 또는 E에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 122번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 이소류신(I)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 Y, T 또는 V에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 125번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 시스테인(C)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 A에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 127번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 세린(S)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, T, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 A, T, D 또는 N에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 128번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 이소류신(I)은 시스테인 및 쓰레오닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, R, S, T, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 A에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열의 129번 위치에 치환을 포함하고, 원래 아미노산 이소류신(I)은 시스테인 및 이소류신 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어 A, D, E, F, G, H, T, K, M, N, P, Q, R, S, L, V, W, Y, 보다 구체적으로 L, V, A, S 또는 T에 의해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 C-말단에서의 절두, 및 28, 32, 38, 42, 45, 52, 72, 76, 78, 82, 110, 111, 122, 125, 127, 128 및 129번 위치 중에서 선택된 하나 이상의 치환(들)을 모두 포함한다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 28번 위치의 치환, 예를 들어 I28P를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 I28P의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 32번 위치의 치환, 예를 들어 K32D를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 K32D의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 38번 위치의 치환, 예를 들어 R38W를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 R38W의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 42번 위치의 치환, 예를 들어 F42V, F42I, F42G, 또는 F42M을 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 F42V, F42I, F42G, 또는 F42M의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 52번 위치의 치환, 예를 들어 E52G를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 E52G의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 76번 위치의 치환, 예를 들어 K76R을 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 K76R의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 78번 위치의 치환, 예를 들어 F78G를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 F78G의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 82번 위치의 치환, 예를 들어 P82Y를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 P82Y의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 110번 위치의 치환, 예를 들어 E110R, E110I, 또는 E110T를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 E110R, E110I, 또는 E110T의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 111번 위치의 치환, 예를 들어 T111A 또는 T111E를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 T111A 또는 T111E의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 122번 위치의 치환, 예를 들어 I122Y, I122T, 또는 I122V를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 I122Y, I122T, 또는 I122V의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 125번 위치의 치환, 예를 들어 C125A를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 C125A의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 127번 위치의 치환, 예를 들어 S127A, S127T, S127D 또는 S127N을 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 S127A, S127T, S127D 또는 S127N의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 128번 위치의 치환, 예를 들어 I128A를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 I128A의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 129번 위치의 치환, 예를 들어 I129L, I129V, I129A, I129S 또는 I129T를 포함한다. 구체적으로, IL-2 변이체는 4 또는 5개 아미노산(들)의 C-말단 절두 및 I129L, I129V, I129A, I129S 또는 I129T의 치환을 포함할 수 있다.
일부 특정한 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 14-21, 23-60에 제시된 것 및 적어도 95% 동일성, 예를 들어 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성 또는 적어도 99% 동일성 이상을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체는 서열번호 1에 상응하는 28, 32, 38, 42, 45, 52, 72, 76, 78, 82, 110, 111, 122, 125, 127, 128 및 129번 위치 중 하나 이상에서 발생한 적어도 2개의 치환을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, IL-2 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 28-30, 34, 49-60 및 적어도 95% 동일성을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된다.
두 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17(1988))을 사용하여, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 끊김 길이 벌점 및 4의 끊김 벌점을 사용하여 결정될 수 있다. 또한 두 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com에서 이용 가능함)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))에 의해, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 끊김 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 결정될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 개시내용의 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "조회 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-10]의 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색을 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행하여 본 개시내용의 항체 분자와 상동성인 아미노산 서열을 획득할 수 있다. 비교 목적으로 끊김 정렬을 획득하기 위해, 끊김 BLAST를 문헌[Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 활용할 수 있다. BLAST 및 끊김 BLAST 프로그램을 활용하는 경우, 해당 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 기본 매개변수를 사용할 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조하시오.
IL-2-포함 융합 단백질 및 폴리펩티드 복합체
일부 양태에서, 본 개시내용은 비-IL-2 모이어티에 융합된 IL-2를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. PEG, PEG의 기능적 유사체, 지질 및 장시간 생존(long-lived) 혈청 단백질과 같은 비-IL-2 모이어티의 통합은 반감기 연장의 목적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-IL-2 모이어티는 항체 Fc 영역이다. 일부 다른 구현예에서, 비-IL-2 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 일부 다른 구현예에서, 비-IL-2 모이어티는 항-HSA 모이어티이다. 생성된 융합 단백질은 단량체 또는 이량체일 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, Fc 및 알부민 융합은 둘 다 융합 단백질의 크기를 증가시킬 뿐만 아니라 신체의 자연적인 재순환 기전: 신생아 Fc 수용체, FcRn을 활용함으로써 연장된 반감기를 달성한다. FcRn에 대한 이들 단백질의 pH 의존적 결합은 엔도솜 내 융합 단백질의 분해를 방지한다. 항체 Fc와의 융합은 융합 단백질의 용해도 및 안정성을 향상시킬 수 있다.
Fc와 HSA/항-HSA 모이어티 간의 주요 차이점은 Fc의 이량체 특성 대 has/항-HSA 모이어티의 단량체 구조이며, 이는 융합 상대의 선택에 따라 융합 단백질을 이량체 또는 단량체로서 제시한다. Fc 융합 단백질의 이량체 성질은 표적 수용체가 서로 충분히 가깝게 간격을 두고 있거나 그 자체가 이량체인 결합활성(avidity) 효과를 생성시킬 수 있다.
또한, 본원에 개시된 융합 단백질은 형성되는 입체 장애, 수소 결합, 염 가교, 소수성 효과 또는 기타 분자내 상호작용을 통해 IL-2Rβ/γc, IL-2Rα, 또는 이들 둘 다 및 결합된 IL-2Rα/β/γc 복합체에 대한 친화성을 추가로 약화시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 IL-2 모이어티, 항원-결합 모이어티 및 전체 또는 부분 힌지 영역 + Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 복합체를 제공한다. 항원-결합 모이어티는 Fab, scFv , 나노바디(VHH) 또는 TCR일 수 있다.
일부 구현예에서, 항원-결합 부분은 Fab이다. IL-2 모이어티는 Fab와 다른 쇄상에서 작제될 수 있다. 대안적으로, IL-2 모이어티는 Fab의 VH 영역과 동일한 중쇄 상에 있을 수 있다. IL-2 모이어티가 VH 영역과 동일한 중쇄상에 있는 경우, IL-2 모이어티는 힌지 영역 및 Fc 영역에(선택적으로 링커를 통해) 작동적으로 연결될 수 있으며, 이는 다시 VH 영역에 작동적으로 연결된다, 즉 IL-2 모이어티와 Fab는 힌지 영역 및 Fc 영역의 개입에 의해 분리된다. 일부 다른 구현예에서, IL-2 모이어티 및 Fab는 Fc 영역의 같은 쪽(보통 N 말단)에 있다.
일부 구현예에서, 항원-결합 부분은 VHH이다. IL-2 모이어티는 VHH와 다른 쇄상에서 작제될 수 있다. 대안적으로, IL-2 모이어티는 VHH의 VH 영역과 동일한 중쇄 상에 있을 수 있다. IL-2 모이어티가 VHH 영역과 동일한 쇄상에 있는 경우, IL-2 모이어티는 힌지 영역 및 Fc 영역에(선택적으로 링커를 통해) 작동적으로 연결될 수 있으며, 이는 다시 VHH 영역에 작동적으로 연결된다, 즉 IL-2 모이어티와 VHH는 힌지 영역 및 Fc 영역의 개입에 의해 분리된다. 일부 다른 구현예에서, IL-2 모이어티 및 VHH는 Fc 영역의 같은 쪽(보통 N 말단)에 있다.
일부 구현예에서, 항원-결합 부분은 TCR이다. IL-2 모이어티는 TCR과 다른 쇄상에서 작제될 수 있다. 대안적으로, IL-2 모이어티는 TCR의 한 쇄(알파 또는 베타 쇄)와 동일한 중쇄 상에 있을 수 있다. IL-2 모이어티가 TCR 영역과 동일한 쇄상에 있는 경우, IL-2 모이어티는 힌지 영역 및 Fc 영역에(임의로 링커를 통해) 작동적으로 연결될 수 있으며, 이는 다시 TCR 영역에 작동적으로 연결된다, 즉 IL-2 모이어티와 TCR은 힌지 영역 및 Fc 영역의 개입에 의해 분리된다. 일부 다른 구현예에서, IL-2 모이어티 및 TCR은 Fc 영역의 같은 쪽(보통 N 말단)에 있다.
원하는 생화학(예를 들어 용해도 및 안정성) 및 약동학 특성에 따라, 다양한 구성 포맷이 적용될 수 있다, 예를 들어 폴리펩티드 복합체는 하나 초과의 IL-2 모이어티 또는 하나 초과의 항원-결합 모이어티를 포함할 수 있다.
도 1(a)에 묘사된 바와 같이, 폴리펩티드 복합체는 2개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항원-결합 모이어티는 Fab 또는 TCR이고, 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (a) IL-2 모이어티; (b) 선택적으로, 링커; 및 (c) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄를 포함하고;
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (d) Fab의 중쇄; 및 (e) 힌지 영역 및 Fc 영역의 다른 쇄를 포함하고,
경쇄는 Fab 또는 TCR의 경쇄를 포함한다.
도 1(b)에 묘사된 바와 같이, 폴리펩티드 복합체는 2개의 쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항원-결합 모이어티는 VHH이고, 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (a) IL-2 모이어티 ; (b) 선택적으로, 링커; 및 (c) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄를 포함하고;
제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (d) VHH; 및 (e) 힌지 영역 및 Fc 영역의 다른 쇄를 포함한다.
도 1(c)에 묘사된 바와 같이, 폴리펩티드 복합체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항원-결합 모이어티는 Fab 또는 TCR이고, 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (a) Fab 또는 TCR의 중쇄; (b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄; (c) 선택적으로, 링커; 및 (d) IL-2 모이어티를 포함하고;
제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (e) Fab 또는 TCR의 중쇄; 및 (f) 힌지 영역 및 Fc 영역의 다른 쇄를 포함하고;
2개의 경쇄는 각각 Fab 또는 TCR의 경쇄를 포함한다.
도 1(d)에 묘사된 바와 같이, 폴리펩티드 복합체는 2개의 쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항원-결합 모이어티는 VHH이고, 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (a) VHH; (b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄; (c) 선택적으로, 링커; 및 (d) IL-2 모이어티를 포함하고,
제2 쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (e) VHH; 및 (f) 힌지 영역 및 Fc 영역의 다른 쇄를 포함한다.
도 1(e)에 묘사된 바와 같이, 폴리펩티드 복합체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항원-결합 모이어티는 Fab 또는 TCR이고,
2개의 중쇄는 각각 N-말단에서 C-말단으로: (a) Fab 또는 TCR의 중쇄; (b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄; (c) 선택적으로, 링커; 및 (d) IL-2 모이어티를 포함하고,
2개의 경쇄는 각각 Fab 또는 TCR의 경쇄를 포함한다.
도 1(f)에 묘사된 바와 같이, 폴리펩티드 복합체는 2개의 쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항원-결합 모이어티는 VHH이고,
각 쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (a) VHH; (b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄; (c) 선택적으로, 링커; 및 (d) IL-2 모이어티를 포함한다.
도 1(t)에 묘사된 바와 같이, 폴리펩티드 복합체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항원-결합 모이어티는 Fab 또는 TCR이고,
2개의 중쇄는 각각 N-말단에서 C-말단으로: (a) IL-2 모이어티; 선택적으로, 링커; 및 (b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄; (c) Fab 또는 TCR의 중쇄를 포함하고,
2개의 경쇄는 각각 Fab 또는 TCR의 경쇄를 포함한다.
도 1(u)에 묘사된 바와 같이, 폴리펩티드 복합체는 2개의 쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항원-결합 모이어티는 VHH이고,
각 쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (a) IL-2 모이어티; 선택적으로, 링커; 및 (b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄; (c) VHH의 중쇄를 포함한다.
도 1(v)에 묘사된 바와 같이, 폴리펩티드 복합체는 2개의 쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항원-결합 모이어티는 scFv이고,
각 쇄는 N-말단에서 C-말단으로: (a) IL-2 모이어티; 선택적으로, 링커; 및 (b) 힌지 영역 및 Fc 영역의 한 쇄; (c) scFv의 중쇄를 포함한다.
항원-결합 모이어티에 대한 표적 항원은 특히 체크포인트 분자, 예를 들어 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM-3, A2aR, TIGIT, VISTA, 또는 종양 관련 항원, 예를 들어 HER2 및 BCMA, 혈관형성 관련 인자, 예를 들어 VEGF 및 PDGF 중에서 선택 될 수 있다. 이러한 항원에 대한 수많은 다양한 항체가 이미 개발되어 있으며 당업자에게 친숙하다.
항원-결합 모이어티 모이어티는 이미 시장에 알려져 있거나 새로 개발된 항체, 예를 들어 트라스투주맙, 페르투주맙, 사시투주맙, 압식시맙, 아달리무맙, 알레파셉트, 알렘투주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베즐로톡수맙, 베바시주만. 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에팔리주맙, 골리무맙, 젬투주맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 익세키주맙, 나탈리주맙, 니볼루맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 오파투무맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 리툭시맙, 라니비주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 세쿠키누맙, 및 우스테키누맙 중 어느 하나와 같은 항체로부터 나오거나 유래될 수 있다. 항원-결합 모이어티의 가변 영역(또는 적어도 CDR 영역)은 이미 알려져 있거나 새롭게 개발된 항체의 것과 동일할 수 있다. "로부터 유래된"이란, 가변 영역이 모 항체의 것과 동일하거나 적어도 80% 상동성(예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95% 이상)을 가지면서도 여전히 표적 항원에 대한 결합 능력을 유지함을 의미한다. 예를 들어, 모 항체의 가변 영역은 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체로 구성되기 전에 인간화되거나, 친화성 성숙되거나, 글리코실화 변형될 수 있다. CDR 및 프레임워크 영역을 포함한 가변 영역의 변형 방법은 당업자에게 친숙하다.
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 한 쇄의 C 말단에 작동적으로 연결된 IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 야생형 IL-2 단백질로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 62에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 131에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 기재된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-U0T2.F114-1.uIgG1V320).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 야생형 IL-2 단백질로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 64 또는 65에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 131 또는 132 에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-1.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-2.uIgG1V320).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 아미노산에 의해 절두된)에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 68-76 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 132에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-3.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-4.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-5.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-6.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-7.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-8.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-9.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-10.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-11.uIgG4V1에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 절두된 힌지에 의해 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 아미노산에 의해 절두된)에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어지고, 절두된 힌지 모이어티는 N-말단 절두(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 아미노산에 의해 절두된)에 의해 WT 힌지와 상이한 힌지 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 89-90 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 132에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-24.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-25.uIgG4V1에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 F42번 위치에서 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 77-79 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 132에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-12.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-13.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-14.uIgG4V1에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4 또는 5개 아미노산에 의해 절두된) 및 R38번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 85 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 132에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-20.uIgG4V1에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4 또는 5개 아미노산에 의해 절두된) 및 F42번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 80-84 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 132에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-15.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-16.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-17.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-18.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-19.uIgG4V1에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4 또는 5개 아미노산에 의해 절두된) 및 T111번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 86-87 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 132에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-21.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-22.uIgG4V1에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 R38번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 88 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 132에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-23.uIgG4V1에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 I129번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 91-95 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 132에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-26.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-27.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-28.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-29.uIgG4V1, W3XX115-T2U0.E44-30.uIgG4V1에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 I129T번 위치의 치환 및 F42번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 96-97 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-31.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-32.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 I129T번 위치의 치환 및 R38번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 98 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-33.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 S127번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 99-101 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-34.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-35.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-36.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 S127 및 I129번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 102 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-37.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 C125번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 103 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-38.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 I128번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 104 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-39.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 E110번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 105-107 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-40.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-41.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-42.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 I122번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 108-110 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-43.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-43.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-45.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 I28번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 111 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-47.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 K32번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 112 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-47.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 E52번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 113 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-48.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 K76번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 114 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-49.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 F78번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 115 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-50.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 P82번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 116 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-51.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 E110 및 I129번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 117-119 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-52.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-53.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-54.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 I122 및 I129번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 120-122 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-55.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-56.uIgG4V322, W3XX115-T2U0.E44-57.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 I128 및 I129번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 123 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-58.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 K32 및 I129번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 124 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-59.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 E52 및 I129번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 125 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-60.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 K76 및 I129번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 126 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-61.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 F78 및 I129번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 127 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-62.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 C-말단 절두(예를 들어 4개 아미노산에 의해 절두된) 및 P82 및 I129번 위치의 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 128 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T2U0.E44-63.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역의 한 쇄에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 다른 쇄의 N 말단에 작동적으로 연결된(선택적으로 링커를 통해) IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 다중 치환(예를 들어 F42V/Y45A/L72G)에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 폴리펩티드 복합체는 서열번호 66, 67 및 130 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 131-133에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-T3U0.E44-1.uIgG4V1, W3XX115-T3U0.E44-2.uIgG1V320, W3XX115-T3U0.E44-1.uIgG4V322에 상응함).
일부 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 Fc 영역에 작동적으로 연결된 Fab 모이어티 및 Fc 영역의 한 쇄의 C 말단에 작동적으로 연결된 IL-2 모이어티를 포함하며, 여기서 IL-2 모이어티는 상술한 바와 같이 다중 치환에 의해 WT IL-2와 상이한 IL-2 변이체로 이루어진다. 구체적으로, 이종이량체성 폴리펩티드 복합체는 서열번호 63에 제시된 바와 같은 제1 중쇄, 서열번호 131에 제시된 바와 같은 제2 중쇄, 및 서열번호 134에 제시된 바와 같은 경쇄를 포함한다(W3XX115-U0T3.F114-1.uIgG1V320).
FC 도메인
본 개시내용은 Fc 영역 및 상술한 바와 같은 인간 IL-2 변이체를 포함하는 Fc-융합 단백질 및 폴리펩티드 복합체를 제공한다. Fc 도메인은 야생형 Fc 또는 Fc 변이체일 수 있다. 야생형 Fc는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc일 수 있다. 일부 구현예에서, 야생형 Fc는 인간 IgG1 Fc이다. Fc 변이체는 야생형 Fc(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc)와 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기 변형(예를 들어 치환, 삽입 및/또는 결실)을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG1 Fc와 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기 변형(예를 들어 치환, 삽입 및/또는 결실)을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 변이체는 야생형 인간 IgG4 Fc와 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기 변형(예를 들어 치환, 삽입 및/또는 결실)을 포함한다.
ADCC, ADCP 및 CDC를 증가시키거나 감소시키기 위해 존재하는 다수의 공지된 돌연변이가 존재한다. 인간 IgG1 중쇄 돌연변이의 한 예는 모든 효과기 기능, 즉 본질적으로 ADCC, ADCP 및 CDC에 대한 기능을 방지하는 LALA 돌연변이이다. hIgG1 LALA 서열은 FcgR 결합을 억제하는 2개의 돌연변이 L234A 및 L235A(EU 넘버링)를 포함한다. "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 언급할 때 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th　Ed.), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242]에 보고된 EU 인덱스). "Kabat에서와 같은 EU 넘버링" 또는 "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역의 불변 도메인 내 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 넘버링을 의미한다.
Fc 변이체에 포함된 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합을 변경시키고, FcRn 수용체에 대한 결합을 변경시킬 수 있는 등이다. 특정 구현예에서, 융합 단백질의 Fc 도메인은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 pH 의존적 결합을 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 이러한 변이체는 산성 pH에서 FcRn에 결합하여 리소솜 내 분해로부터 탈출한 후 전위되어 세포 밖으로 방출되기 때문에 연장된 약동학적 반감기를 가질 수 있다. FcRn과의 결합 친화도를 향상시키기 위해 항체 및 이의 항원-결합 단편을 조작하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다, 예를 들어, 하기의 문헌을 참조하시오: Vaughn, D. et al, Structure, 6(1): 63-73, 1998; Kontermann, R. et al, Antibody Engineering, Volume 1, Chapter 27: Engineering of the Fc region for improved PK, published by Springer, 2010; Yeung, Y. et al, Cancer Research, 70: 3269-3277 (2010); 및 Hinton, P. et al, J. Immunology, 176:346-356 (2006).
Fc 도메인의 두 쇄는 디설파이드 결합을 통해 함께 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 이종이량체화를 촉진 및/또는 증진시키기 위해 Fc 영역의 계면에 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인의 두 쇄는 이종이량체화를 촉진하기 위해 "구멍에 손잡이(knob-into-hole)" 구조를 포함하도록 조작되며, 이는 제1 Fc 폴리펩티드 내로 돌기("손잡이") 및 제2 Fc 폴리펩티드 내로 공동("구멍")의 도입을 포함하고, 여기서 돌기는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 상호작용을 촉진하여 이종이량체 또는 복합체를 형성하도록 공동에 위치할 수 있다. 이들 변형을 갖는 항체의 생성 방법은 예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 구체적으로, Fc 도메인은 적어도 하나의 "손잡이"(돌기) 및 적어도 하나의 "구멍"(공동)을 포함할 수 있으며, 여기서 "손잡이" 및 "구멍"의 존재는 복합체 또는 이종이량체의 형성을 향상시킨다(상세한 내용에 대해서 WO 2005/063816을 참조하시오). 일부 구현예에서, 본원에 개시된 Fc 도메인은 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 야생형 인간 IgG1 Fc에 대해 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. IL-2 도메인은 "손잡이" 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인의 한 쇄에 융합될 수 있는 반면, 항원-결합 모이어티의 VH 영역은 "구멍" 돌연변이를 포함하는 다른 쇄에 융합되거나, 그 반대일 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, "구멍" 돌연변이는 Y349C, T366S, L368A 및/또는 Y407V이고, "손잡이" 돌연변이는 S354C 및/또는 T366W이다.
특정 구현예에서, 융합 단백질의 Fc 도메인은 항체-의존성 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 변경시키는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. Fc 영역의 CH2 도메인에 있는 특정 아미노산 잔기는 감소된 ADCC 활성을 제공하기 위해 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 수용체 또는 보체 수용체와의 결합을 감소시키는 "FALA" 돌연변이(즉, F234A/L235A)를 포함하는 IgG4 Fc 변이체이다. 일부 다른 구현예에서, Fc 도메인은 절두된 힌지 영역을 갖는 IgG4 Fc 변이체이다. 또 다른 일부 구현예에서, Fc 도메인은 S228P 돌연변이를 포함하는 IgG4 Fc 변이체이며, 이는 IgG4 Fab-가지 교환을 감소시킬 수 있다.
일부 특정 구현예에서, Fc 변이체는 2개의 쇄를 포함하고, 여기서 제1 쇄의 아미노산 서열은 야생형 인간 IgG1, IgG2, IgG4, 또는 힌지가 절두된 IgG4와 적어도 80%, 예를 들어 80%, 85%, 90%, 95% 이상(예를 들어 100%) 서열 동일성을 갖는다.
폴리펩티드 복합체의 특성
본 개시내용은 친화도가 약화되고 효능이 감소된 IL-2 변이체 및 상기 IL-2 변이체를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 제공한다. IL-2 변이체는 효능/독성, PK 및 PD가 조절될 가능성이 있으므로, 개선된 항-종양 효능 및 자가면역 질환 치료법을 갖는 신규한 면역요법제로서 역할을 할 수 있다.
이들 IL-2 변이체 및 IL-2 포함 폴리펩티드 복합체의 기능성을 시험관내 또는 생체내 분석에 의해 평가할 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2Rα 또는 IL-2β에 대한 IL-2 포함 폴리펩티드 복합체의 친화도는 BIAcore 결합 분석에서 결정된다.
대안적으로, IL-2 포함 폴리펩티드 복합체의 결합 친화도는 IL-2Rβ(중간 친화성 수용체) 및/또는 IL-2 Rα(고 친화성 수용체)를 발현하는 세포주, 예를 들어 HH 세포, NK92 및 MJ20 세포를 사용하여, FACS에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, IL-2 변이체 및 폴리펩티드 복합체의 효과는 STAT5 인산화와 같은 특정 인자의 인산화에 의해 측정되는 신호전달 경로를 정량화함으로써 평가된다. STAT5는 정상적인 면역 기능과 항상성(이들은 둘 다 사이토카인의 IL-2 패밀리의 특정 구성원에 의해 조절된다)의 유지에 중요한 역할을 한다.
조절 T 세포(Treg)는 면역 항상성 및 자기-관용을 유지하는 데 중요한 역할을 하며, 알레르기 및 자가면역 질환의 발병을 조절하는 데 중요하다. 활성화된 CD8+ T 세포는 종양에 대한 면역 방어에 매우 중요하다. IL-2는 고 친화성 IL-2 수용체를 통해 신호를 전달함으로써 Treg 세포의 증식을 유도하고 CD8+ T를 활성화할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-2 변이체 및 폴리펩티드 복합체의 효과는 CD8+ T 세포 또는 Treg 세포 활성화와 같은 T 세포 활성화를 평가함으로써 평가된다.
본 개시내용의 폴리펩티드 복합체를 포함하는 IL-2는 하기의 특성 중 적어도 하나를 제공한다:
(a) IL-2Rα, IL-2Rβ/γc 및 결합된 IL-2Rα/β/γc 복합체 중 적어도 하나 에 대해 약화된 결합 친화도;
(b) CD8+ T 세포 및 NK 세포 증식과 같은 면역 세포 증식을 시뮬레이션하는 데 있어서 보다 중간 정도의 효능;
(c) 활성화된 CD8+ T 세포 또는 Treg 세포와 같은 면역 세포 활성화에 있어서 감소된 효능; 및
(d) 생체내에서 명백한 독성 없음.
IL-2 변이체를 암호화하는 핵산 분자
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 IL-2 변이체 또는 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 개시내용의 핵산은 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 수득될 수 있다. IL-2 변이체를 암호화하는 단리된 핵산은 Fc 도메인을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다. 유사하게, 항원-결합 모이어티를 암호화하는 핵산은 Fc 도메인을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭을 통해 수득될 수 있다.
IL-2 모이어티, 항원-결합 모이어티 및 Fc 도메인(또는 불변 영역)을 암호화하는 DNA 단편이 수득되면, 이들 DNA 단편을 예를 들어 당업계에 공지된 바와 같이 발현 벡터에 통합되는 표준 재조합 DNA 기법에 의해 추가로 조작할 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 DNA 단편을 암호화하는 핵산은 일반적으로 상이하거나 동일한 프로모터 조절 하에서 단일 발현 벡터 내에 각각 함유된다. 일부 다른 구현예에서, 이들 DNA 단편을 암호화하는 핵산은 작동적으로 연결되어 동일한 프로모터의 조절 하에서 단일 발현 벡터에 함유된다. 본 문맥에서 사용된 바와 같은 "작동적으로 연결된"이라는 용어는 2개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 프레임-내에 유지되도록 상기 2개의 DNA 단편이 결합됨을 의미하는 것으로 의도된다.
숙주 세포
본 개시내용에 개시된 바와 같은 숙주 세포는 본 개시내용의 융합 단백질을 발현하는데 적합한 임의의 세포, 예를 들어 세균 세포, 효모, 포유동물 세포일 수 있다. 본 개시내용의 융합 단백질을 발현하기 위한 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어 문헌[R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택성 마커와 함께 사용되는, 문헌[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 융합 단백질은 숙주 세포에서 융합 단백질의 발현, 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지내로의 융합 단백질의 분비를 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 융합 단백질은 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지에서 회수될 수 있다.
약제학적 조성물
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 융합 단백질 또는 폴리펩티드 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 융합 단백질 또는 폴리펩티드 복합체를 암호화하는 핵산 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
조성물의 성분
약제학적 조성물은 항체와 같은 하나 이상의 추가적인 약학 활성 성분을 선택적으로 함유할 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 예를 들어 또 다른 면역자극제, 항암제, 항바이러스제 또는 백신과의 조합 요법으로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 약제학적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 매질, 비-수성 매질, 항균제, 등장화제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁/분산제, 킬레이트제, 희석제, 항원보강제, 부형제 또는 무독성 보조 물질, 기타 당업계에 공지된 다양한 성분 또는 그 이상의 조합을 포함할 수 있다.
적합한 성분에는 예를 들어 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 풍미제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정제, 예를 들어 당 및 사이클로덱스트린이 포함될 수 있다. 적합한 항산화제에는 예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 나트륨 티오설페이트, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 머캅토 글리세롤, 티오글리콜산, 머캅토 소르비톨, 부틸 메틸 아니솔, 부틸화된 하이드록시 톨루엔 및/또는 프로필갈락테가 포함될 수 있다. 본 개시내용에 개시된 바와 같이, 조성물은 산화될 수 있는 메티오닌, 환원 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함할 수 있다. 산화 환원은 결합 친화도 감소를 방지 또는 감소시켜 단백질 안정성을 향상시키고 유통기한을 연장시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용은 융합 단백질 및 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 융합 단백질을 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제와 혼합하여 융합 단백질의 산화를 방지하고, 그의 저장 수명을 연장하고/하거나 활성을 증가시킬 수 있는 다양한 방법을 추가로 제공한다.
추가 예시를 위해, 약제학적으로 허용되는 담체에는 예를 들어 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 등장성 덱스트로스 주사제, 멸균수 주사제, 또는 덱스트로스 및 젖산화된 링거 주사제와 같은 수성 비히클, 식물성 기원의 고정유, 면실유, 옥수수유, 참기름 또는 땅콩유와 같은 비-수성 비히클, 세균발육정지 또는 진균발육정지 농도의 항균제, 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장화제, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제와 같은 완충제, 나트륨 비설페이트와 같은 항산화제, 프로카인 하이드로클로라이드와 같은 국소 마취제, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 현탁 및 분산제, 폴리소르베이트 80(TWEEN-80)과 같은 유화제, 격리 또는 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산), 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화 나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산이 포함된다. 담체로 사용되는 항균제를 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화 벤즈알코늄 및 염화 벤즈에토늄을 포함하는 다회 용량 용기의 약제학적 조성물에 첨가할 수 있다. 적합한 부형제에는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이 포함될 수 있다. 적합한 무독성 보조 물질에는 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해도 증강제, 또는 나트륨 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트 또는 사이클로덱스트린과 같은 제제가 포함될 수 있다.
투여, 제형 및 투여량
본 발명의 약제학적 조성물은 비제한적으로, 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 비경구, 비강내, 근육내, 두개내, 심장내, 뇌실내, 기관내, 협측, 직장, 복강내, 피내, 국소, 경피 및 척수강내, 또는 기타 이식 또는 흡입에 의해 상기 조성물이 필요한 대상체에게 생체내 투여될 수 있다. 대상 조성물을 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화할 수 있으며; 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 관장제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적절한 제형 및 투여 경로는 의도된 적용 및 치료 섭생에 따라 선택될 수 있다.
장내 투여에 적합한 제형에는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 알약, 코팅정을 포함한 정제, 엘릭서, 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 이의 조절된 방출 형태가 포함된다.
비경구 투여(예를 들어, 주사에 의한)에 적합한 제형에는 활성 성분이 용해되거나, 현탁되거나 달리 제공되는(예를 들어, 리포솜 또는 기타 미립자 내) 수성 또는 비-수성, 등장성, 발열원이 없는 멸균 액체(예를 들어, 용액, 현탁액)가 포함된다. 이러한 액체는 항산화제, 완충제, 보존제, 안정제, 세균발육저지제, 현탁화제, 증점제, 및 제형을 의도된 수용자의 혈액(또는 기타 관련 체액)과 등장성으로 만드는 용질과 같은 기타 약제학적으로 허용되는 성분을 추가로 함유할 수 있다. 부형제의 예에는 물, 알코올, 폴리올, 글리세롤, 식물성 오일 등이 포함된다. 이러한 제형에 사용하기에 적합한 등장성 담체의 예에는 염화나트륨 주사액, 링거액 또는 젖산화된 링거 주사액이 포함된다. 유사하게, 용량, 타이밍 및 반복을 포함한 특정 투여 섭생은 특정 개인과 그 개인의 병력뿐만 아니라 약동학(예를 들어, 반감기, 제거율 등)과 같은 경험적 고려사항에 따라 달라질 것이다.
투여 빈도는 치료 과정 전반에 걸쳐 결정 및 조정될 수 있으며, 이는 증식성 또는 종양성 세포 수의 감소, 이러한 신생물 세포의 감소 유지, 신생물 세포의 증식 감소 또는 전이 진행 지연을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 투여되는 투여량은 잠재적인 부작용 및/또는 독성을 관리하기 위해 조정되거나 약화될 수 있다. 대안적으로, 대상 치료 조성물의 서방성 연속 제형이 적절할 수 있다.
적절한 투여량은 환자마다 다를 수 있음을 당업자라면 이해할 수 있을 것이다. 최적의 투여량을 결정하는 것은 일반적으로 위험이나 유해한 부작용에 대한 치료 이익 수준의 균형을 맞추는 것을 포함한다. 선택된 투여량 수준은 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 기타 병용하여 사용되는 약물, 화합물 및/또는 물질, 상태의 중증도, 및 환자의 종, 성별, 연령, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전 병력을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 화합물의 양 및 투여 경로는 궁극적으로 의사, 수의사 또는 임상의의 재량에 따라 결정되지만, 일반적으로 투여량은 실질적으로 해롭거나 유해한 부작용을 초래하지 않고 원하는 효과를 달성하는 작용 부위의 국소 농도를 달성하도록 선택된다.
본 개시내용의 폴리펩티드 복합체는 다양한 범위로 투여될 수 있다. 여기에는 용량당 약 100 ㎍/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎/㎏ 체중; 용량당 약 100 ㎍/㎏ 체중 내지 약 1 ㎎/㎏ 체중; 용량당 약 1 ㎍/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎/㎏ 체중이 포함된다. 다른 범위에는 용량당 약 100 ㎍/㎏ 체중 내지 약 200 ㎍/㎏ 체중; 용량당 약 200 ㎍/㎏ 체중 내지 약 300 ㎍/㎏ 체중; 용량당 약 300 ㎍/㎏ 체중 내지 약 400 ㎍/㎏ 체중; 용량당 약 400 ㎍/㎏ 체중 내지 약 0.5 ㎍/㎏ 체중; 및 용량당 약 0.5 ㎎/㎏ 체중 내지 약 1 ㎎/㎏ 체중이 포함된다. 특정 구현예에서, 투여량은 적어도 약 100 ㎍/㎏ 체중, 적어도 약 250 ㎍/㎏ 체중, 적어도 약 750 ㎍/㎏ 체중, 적어도 약 3 ㎎/㎏ 체중, 적어도 약 5 ㎎/㎏ 체중, 적어도 약 10 ㎎/㎏ 체중이다.
어쨌든, 본 개시내용의 폴리펩티드 복합체는 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상체에게 필요에 따라 투여된다. 투여 빈도의 결정은 치료되는 상태, 치료되는 대상체의 연령, 치료되는 상태의 중증도, 치료되는 대상체의 일반적인 건강 상태 등을 고려하여 주치의와 같은 당업자에 의해 이루어질 수 있다.
특정의 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 복합체를 수반하는 치료 과정은 수주 또는 수개월에 걸쳐 선택된 약물 제품의 다중 용량을 포함할 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용의 폴리펩티드 복합체는 4일마다, 매주, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 매월, 6주마다, 2개월마다, 10주마다 또는 3개월마다 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 투여량은 환자 반응 및 임상 실습에 기초하여 변경되거나 간격이 조정될 수 있음이 이해될 것이다.
투여량 및 섭생은 또한 1회 이상의 투여(들)가 제공된 개인에서 상기 개시된 치료 조성물에 대해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 개인에게는 본원에 기재된 바와 같이 생성된 치료 조성물의 증분 투여량이 제공될 수 있다. 선택된 구현예에서, 투여량은 경험적으로 결정되거나 관찰된 부작용 또는 독성에 기초하여 각각 점진적으로 증가되거나 감소되거나 약화될 수 있다. 선택된 조성물의 효능을 평가하기 위해, 특정 질병, 장애 또는 상태의 마커를 앞서 설명한 대로 따를 수 있다. 암의 경우, 촉진 또는 육안 관찰을 통한 종양 크기의 직접적인 측정, 엑스레이 또는 기타 영상 기법을 통한 종양 크기의 간접적인 측정; 직접적인 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사에 의해 평가된 개선; 간접적인 종양 마커(예를 들어, 전립선암에 대한 PSA) 또는 본원에 기재된 방법에 따라 확인된 종양형성 항원의 측정, 통증 또는 마비의 감소; 종양과 관련된 언어, 시력, 호흡 또는 기타 장애 개선; 식욕 증가; 또는 승인된 시험 또는 생존 연장으로 측정된 삶의 질 향상이 포함된다. 투여량은 개인, 신생물 상태의 유형, 신생물 상태의 단계, 신생물 상태가 개인에서 다른 위치로 전이되기 시작했는지 여부, 및 사용되는 과거 및 현행 치료에 따라 달라질 것이라는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
비경구 투여(예를 들어, 정맥내 주사)에 적합한 제형은 투여에 적합한 것으로 간주되고 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있는 농도, 예를 들어 약 10 ㎍/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 농도로 본원에 개시된 폴리펩티드 복합체를 포함할 것이다.
개시내용의 적용
본 개시내용의 폴리펩티드 복합체, 약제학적 조성물 및 방법은 예를 들어 면역 반응의 향상을 포함하는 수많은 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이러한 분자는 다양한 상황에서 면역성을 향상시키기 위해 시험관내 또는 생체외에서 배양물 중의 세포에, 또는 예를 들어 생체내에서 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 면역 반응을 변형, 예를 들어 증대, 자극 또는 상향 조절할 수 있다.
예를 들어, 대상체는 면역 반응의 향상이 필요한 인간 환자를 포함한다. 이 방법은 면역 반응(예를 들어, NK/T-세포 매개된 면역 반응)을 증대시켜 치료될 수 있는 장애를 앓고 있는 인간 환자를 치료하는 데 특히 적합하다. 특정 구현예에서, 이 방법은 생체내 암 치료에 특히 적합하다. 면역력을 증대시키기 위해 폴리펩티드 복합체를 단독으로 투여하거나 다른 치료법과 병용하여 투여할 수 있다. 폴리펩티드 복합체를 또 다른 제제와 함께 투여하는 경우, 상기 둘을 어느 한 순서로 또는 동시에 투여할 수 있다.
예를 들어, 대상체는 면역 반응의 억제가 필요한 인간 환자를 포함한다. 이 방법은 면역 반응을 억제(예를 들어 Treg 매개된 면역 억제)하여 치료될 수 있는 장애를 앓고 있는 인간 환자를 치료하는 데 특히 적합하다. 특정 구현예에서, 방법은 생체내 자가면역 질환의 치료에 특히 적합하다. 면역 억제를 달성하기 위해 폴리펩티드 복합체를 단독으로 투여하거나 다른 치료법과 병용하여 투여할 수 있다. 폴리펩티드 복합체가 또 다른 제제와 함께 투여되는 경우, 상기 둘을 어느 한 순서로 또는 동시에 투여할 수 있다.
암을 포함한 장애의 치료
일부 양태에서, 본 개시내용은 치료가 필요한 대상체(예를 들어, 인간)에게 치료 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 장애 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 치료가 필요한 대상체(예를 들어, 인간)에게 치료 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 장애 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 장애 또는 질환은 암일 수 있다.
다양한 암은 악성이든 양성이든, 원발성이든 이차성이든, 본 개시내용에 의해 제공되는 방법으로 치료되거나 예방될 수 있다. 암은 고형암 또는 혈액학적 악성종양일 수 있다. 이러한 암의 예에는 폐암, 예를 들어 기관지 암종(bronchogenic carcinoma)(예를 들어, 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 소세포암종(small cell carcinoma), 대세포암종(large cell carcinoma) 및 선암종(adenocarcinoma)), 폐포세포암종(alveolar cell carcinoma), 기관지선종(bronchial adenoma), 연골종성(chondromatous hamartoma)(비암성) 및 육종(sarcoma)(암성); 심장암(heart cancer), 예를 들어 점액종(myxoma), 섬유종(fibromas) 및 횡문근종(rhabdomyomas); 골암(bone cancer), 예를 들어 골연골종(osteochondromas), 콘드로종(condromas), 연골모세포종(chondroblastomas), 연골점액섬유종(chondromyxoid fibromas), 유골성 골종(osteoid osteomas), 거대세포종양(giant cell tumors), 연골육종(chondrosarcoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골육종(osteosarcoma), 섬유육종(fibrosarcomas), 악성섬유성조직구종(malignant fibrous histiocytomas), 유잉종양(Ewing's tumor)(유잉육종(Ewing's sarcoma)), 및 세망세포육종(reticulum cell sarcoma); 뇌암(brain cancer), 예를 들어 신경교종(gliomas)(예를 들어, 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme)), 역형성 성상세포종(anaplastic astrocytomas), 성상세포종(astrocytomas), 희돌기교종(oligodendrogliomas), 수모세포종(medulloblastomas), 척색종(chordoma), 신경조종(Schwannomas), 뇌실막종(ependymomas), 수막종(meningiomas), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 송과체종(pinealoma), 골종(osteomas), 혈관모세포종(hemangioblastomas), 두개인두종(craniopharyngiomas), 척삭종(chordomas), 배아종(germinomas), 기형종(teratomas), 유피 낭종(dermoid cysts), 및 혈관종(angiomas); 소화기계암(cancers in digestive system), 예를 들어 결장암(colon cancer), 평활근종(leiomyoma), 표피양암종(epidermoid carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 위 선암종(stomach adenocarcinomas), 장 지방종(intestinal lipomas), 장 신경섬유종(intestinal neurofibromas), 장 섬유종(intestinal fibromas), 대장 폴립(polyps in large intestine), 및 결장직장암(colorectal cancers); 간암(liver cancers), 예를 들어 간세포선종(hepatocellular adenomas), 혈관종(hemangioma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 섬유층판 암종(fibrolamellar carcinoma), 담관암종(cholangiocarcinoma), 간모세포종(hepatoblastoma) 및 혈관육종(angiosarcoma); 신장암(kidney cancers), 예를 들어 신장 선암종(kidney adenocarcinoma), 신세포암종(renal cell carcinoma), 신장종(hypernephroma), 및 신우의 이행세포암종(transitional cell carcinoma of the renal pelvis); 방광암(bladder cancers); 혈액암(hematological cancers), 예를 들어 급성 림프구성(림프모구성) 백혈병(acute lymphocytic(lymphoblastic) leukemia), 급성 골수성(acute myeloid)(골수구성(myelocytic), 골수성(myelogenous), 골수모구성(myeloblasts), 골수단구성(myelomonocytic)) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)(예를 들어, 세자리 증후군(Sezary syndrome) 및 털세포 백혈병(hairy cell leukemia)), 만성 골수구성(chronic myelocytic)(골수성(myeloid), 골수성(myelogenous), 과립구성(granulocytic)) 백혈병, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), B 세포 림프종(B cell lymphoma), 균상식육종(mycosis fungoides), 및 골수증식성 장애(myeloproliferative disorders)(진성적혈구증가증(polycythemia vera), 골수섬유증(myelofibrosis), 혈소판증가증(thrombocythemia) 및 만성 골수성 백혈병과 같은 골수증식성 장애 포함); 피부암(skin cancers), 예를 들어 기저세포암종(basal cell carcinoma), 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 흑색종(melanoma), 카포시육종(Kaposi's sarcoma) 및 파제트병(Paget's disease); 두경부암(head and neck cancers); 눈-관련 암(eye-related cancers), 예를 들어 망막모세포종(retinoblastoma) 및 안내 흑색암종(intraoccular melanocarcinoma); 남성 생식계암(male reproductive system cancers), 예를 들어 양성 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia), 전립선암(prostate cancer) 및 고환암(testicular cancers)(예를 들어, 정상피종(seminoma), 기형종(teratoma), 배아암종(embryonal carcinoma) 및 융모막암종(choriocarcinoma)); 유방암(breast cancer); 여성 생식기암(female reproductive system cancers), 예를 들어 자궁암(uterine cancer)(자궁내막암종(endometrial carcinoma)), 자궁경부암(cervical cancer)(자궁경부암종(cervical carcinoma)), 난소암(cancer of the ovaries)(난소암종(ovarian carcinoma)), 외음부암종(vulvar carcinoma), 질암종(vaginal carcinoma), 나팔관암(fallopian tube cancer), 및 포상기태(hydatidiform mole); 갑상선암(thyroid cancer)(유두암(papillary), 여포암(follicular), 역형성암(anaplastic) 또는 수질암(medullary cancer) 포함); 갈색세포종(pheochromocytomas)(부신(adrenal gland)); 부갑상선의 비암성 성장(noncancerous growths of the parathyroid glands); 췌장암(pancreatic cancers); 및 혈액암(hematological cancers), 예를 들어 백혈병, 골수종, 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종이 있다. 특정 구현예에서, 암은 결장암이다.
일부 구현예에서, 암의 예는 B 세포 림프종(B-cell lymphoma)(저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL); 소림프구성(SL) NHL; 중간등급/여포성 NHL; 중간등급 미만성(intermediate grade diffuse) NHL; 고등급 면역모세포성(high grade lymphoblastic) NHL; 고등급 소형 비-절단 세포(high grade small non-cleaved cell) NHL; 부피가 큰 질병(bulky disease) NHL; 맨틀세포 림프종(mantle cell lymphoma); AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 털세포 백혈병; 만성 골수모구성 백혈병; 및 이식 후 림프증식성 장애(post-transplant lymphoproliierative disorder)(PTLD)뿐만 아니라 파코마토시스와 관련된 비정상적인 혈관 증식(abnormal vascular proliferation associated with phakomatoses), 부종(edema)(예를 들어 뇌종양과 관련된 것), B-세포 증식성 장애, 및 메이그스 증후군(Meigs' syndrome)을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 보다 구체적인 예는 재발성 또는 불응성(relapsed or refractory) NHL, 1차 저등급(front line low grade) NHL, III/IV기 NHL, 화학요법 내성 NHL, 전구체 B 림프구성 백혈병 및/또는 림프종, 소 림프구성 백혈병, B-세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 전림프구성 백혈병 및/또는 소 림프구성 림프종, B-세포 전림프구성 림프종, 면역세포종(immunocytoma) 및/또는 림프형질세포성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma), 림프형질세포성 림프종, 변연부 B-세포 림프종(marginal zone B-cell lymphoma), 비장 변연부 림프종(splenic marginal zone lymphoma), 림프절외 변연부-MALT 림프종(extranodal marginal zone-MALT lymphoma), 결절 변연부 림프종(nodal marginal zone lymphoma), 털세포 백혈병, 형질세포종(plasmacytoma) 및/또는 형질세포 골수종(plasma cell myeloma), 저등급/여포성 림프종, 중간등급/여포성 NHL, 맨틀세포 림프종, 여포 중심 림프종(여포성)(follicle center lymphoma (follicular)), 중간등급 미만성 NHL, 미만성 거대 B-세포 림프종, 공격성 NHL(aggressive NHL)(공격성 1차 NHL 및 공격성 재발성 NHL(aggressive relapsed NHL) 포함), 자기유래 줄기세포 이식 후 재발 또는 불응성 NHL(NHL relapsing after or refractory to autologous stem cell transplantation), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종(primary mediastinal large B-cell lymphoma), 원발성 삼출성 림프종(primary effusion lymphoma), 고등급 면역모세포(high grade immunoblastic) NHL, 고등급 림프모구성(high grade lymphoblastic) NHL, 고등급 소형 비-절단 세포 NHL, 부피가 큰 NHL, 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 전구체(말초) 거대 과립형 림프구성 백혈병(precursor (peripheral) large granular lymphocytic leukemia), 균상식육종 및/또는 세자리 증후군, 피부(피부) 림프종(skin(cutaneous) lymphomas), 역형성 대세포 림프종, 혈관중심성 림프종(angiocentric lymphoma)을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 암의 예는 비제한적으로 B-세포 증식성 장애를 추가로 포함하며, 상기 장애는 비제한적으로 림프종(예를 들어, B-세포 비-호지킨 림프종(NH)), 및 림프구성 백혈병을 추가로 포함한다. 이와 같은 림프종 및 림프구성 백혈병은 예를 들어 a) 여포성 림프종, b) 작은 비-절단된 세포 림프종/버킷 림프종(풍토성 버킷 림프종(endemic Burkitt's lymphoma), 산발성 버킷 림프종(sporadic Burkitt's lymphoma) 및 비-버킷 림프종 포함), c) 변연부 림프종(결절외 변연부 B-세포 림프종(extranodal marginal zone B-cell lymphoma)(점막-관련 림프 조직 림프종(Mucosa-associated lymphatic tissue lymphomas), MALT), 결절 변연부 B-세포 림프종 및 비장 변연부 림프종 포함), d) 맨틀 세포 림프종(MCL), e) 거대 세포 림프종(B-세포 미만성 거대 세포 림프종(DLCL), 미만성 혼합 세포 림프종(Diffuse Mixed Cell Lymphoma), 면역모세포성 림프종(Immunoblastic Lymphoma), 원발성 종격동 B-세포 림프종(Primary Mediastinal B-Cell Lymphoma), 혈관중심성 림프종-폐 B-세포 림프종(Angiocentric Lymphoma-Pulmonary B-Cell Lymphoma) 포함), f) 털세포 림프종, g) 림프구성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, h) 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma)(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, i) 형질세포 신생물(plasma cell neoplasms), 형질세포 골수종, 다발성 골수종, 형질세포종(plasmacytoma), 및/또는 j) 호지킨병을 포함한다.
다른 구현예에서, 장애 또는 질환은 자가면역 및 염증성 질환, 비제한적으로 1형 당뇨병(type 1 diabetes), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 루푸스(lupus), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신홍반성루푸스(Systemic Lupus Erythematosus), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 항인지질 증후군(Antiphospholipid Syndrome), 베게너 육아종증(Wegener's Granulomatosis), 수포성 유천포창(Bullous Pemphigoid), 츄러그 스트라우스 증후군(Churg Strauss Syndrome), 그레이브스병(Graves' disease)을 포함한 갑상선 질환, 염증성 장 질환(Inflammatory bowel disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 건선(Psoriasis), 중증 근무력증(Myasthenia gravis) 및 혈관염(Vasculitis)을 포함한다.
세포독성 유발 없이 면역반응의 자극/억제
일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 대상체의 면역 반응이 원치않는 부작용을 나타내지 않으면서 향상되도록 상기 대상체에게 본 개시내용의 폴리펩티드 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 향상(예를 들어, 자극)시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 대상체는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
"면역 반응 향상"이라는 용어 또는 그 문법적 변형은 포유동물의 면역계의 모든 반응을 자극, 유발, 증가, 개선 또는 증대시키는 것을 의미한다. 면역 반응은 세포 반응(즉, 세포-매개, 예를 들어 세포독성 T 림프구 매개) 또는 체액 반응(즉, 항체 매개 반응)일 수 있으며, 1차 또는 2차 면역 반응일 수 있다. 면역 반응 향상의 예는 증가된 CD4+ T 증가, 특히 헬퍼 T 세포 활성 및 세포용해성 T 세포의 생성을 포함한다. 면역 반응의 향상은, 비제한적으로 세포독성 T 림프구 분석, 사이토카인 방출(예를 들어 IL-15 생성 또는 IFN-γ 생성), 종양의 퇴행, 종양 보유 동물의 생존, 항체 생성, 면역 세포 증식, 세포 표면 마커의 발현 및 세포독성을 포함하여, 당업자에게 공지된 다수의 시험관내 또는 생체내 측정을 사용하여 평가될 수 있다. 전형적으로, 본 개시내용의 방법은 치료되지 않은 포유동물 또는 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료되지 않은 포유동물에 의한 면역 반응과 비교할 때 포유동물에 의한 면역 반응을 향상시킨다. 한 구현예에서, 면역 반응은 사이토카인 생산, 특히 IFN-γ 생산 또는 IL-12 생산이다. 다른 구현예에서, 면역 반응은 향상된 B 세포 증식이다. 반대로, "면역 반응을 억제하는 것"은 포유동물의 면역계의 반응을 감소시키거나, 완화시키거나, 줄이거나 또는 낮추는 것을 의미하며, 이는 면역계가 과도하게 활동하는 자가면역 질환에서 종종 바람직하다. 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 단독 요법으로서 단독으로 사용될 수 있거나, 보다 종종 세포 면역요법, 표적화된 요법, 화학요법 또는 방사선요법과 조합하여 사용될 수 있다.
세포 면역요법 및 유전자요법에 적용
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 IL-2 융합 단백질 및 변이체는 IL-2 변이체 분비와 함께 세포 면역요법에 사용된다. IL-2 변이체 유전자는 종양 침윤성 림프구(TIL), 조작된 T 세포 수용체(TCR-T), 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포, CAR NK 세포, CAR 대식세포 세포, 자연 살해(NK) 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 치료학적으로 조작된 면역 세포로 작제된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 IL-2 융합 단백질 및 변이체는 유전자요법에 사용된다. IL-2 변이체를 암호화하는 유전자는 렌티바이러스, AAV, 폭스바이러스, 대상 포진 바이러스, 종양용해성 바이러스 및 기타 RNA/DNA 벡터와 같은 치료 벡터에 통합된다.
세포 면역요법과의 병용
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 IL-2 융합 단백질은 입양 세포 요법으로도 공지된 세포 면역요법과 조합하여 사용된다. 일반적으로 공지된 바와 같이, 세포 면역요법은 인체의 면역계 세포를 이용하여 암을 제거하는 치료법의 한 형태이다. 이러한 접근법 중 일부는 우리 자신의 면역 세포를 직접 단리하고 단순히 그 수를 확대시키는 것(예를 들어, 환자의 면역 세포를 체외에서 활성화 및 확대시키고 환자에게 주입하여 수행됨)을 포함하는 반면, 다른 접근법은 암 투병 능력을 향상시키기 위해 유전공학 면역 세포를 포함한다(유전자 요법을 통해). 세포 면역요법은 종양 침윤성 림프구(TIL) 요법, 조작된 T 세포 수용체(TCR-T) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법, CAR NK 세포 요법, CAR 대식세포 세포 요법, 자연 살해(NK) 세포 요법을 포함하나 이들로 제한되지 않는 다양한 방식으로 효율적으로 사용될 수 있다.
유전자 요법과의 병용
일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-2 융합 단백질은 유전자 요법과 조합하여 사용된다. IL-2 변이체를 암호화하는 유전자는 렌티바이러스, AAV, 폭스 바이러스, 대상포진 바이러스, 종양용해성 바이러스를 비롯한 바이러스와 같은 치료 벡터에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 유전자 전달은 특정 조건에서 유전자가 세균 세포에 의해 직접 흡수되는 형질전환, 박테리오파지를 사용하여 유전 물질을 전달하는 형질도입, 마지막으로 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 사용하여 강제로 유전자를 전달하는 형질감염을 통해 수행될 수 있다. 비-바이러스 형질감염 방법은 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 세분된다. 물리적 방법에는 일렉트로포레이션, 바이오리스틱(biolistic), 미세주입, 레이저, 고온, 초음파 및 유체역학적 유전자 전달이 포함된다. 화학적 방법은 형질감염을 위해 칼슘-포스페이트, DAE-덱스트란, 리포솜 및 나노입자를 활용한다. 생물학적 방법은 유전자 전달을 위해 바이러스를 점점 더 많이 사용하고 있으며, 이러한 바이러스는 숙주 세포의 게놈 내에 통합되어 안정적인 유전자 발현을 제공할 수 있는 반면, 다른 비-통합 바이러스는 에피솜이고 그 발현은 세포 분열에 비례하여 희석된다.
표적화된 요법 및 화학요법과의 병용
본원에 개시된 이종이량체 및 동종이량체 융합 단백질은 예를 들어 상기 언급한 질환의 치료 또는 예방을 위해, 단독 활성 성분으로서 또는 다른 약물, 예를 들어 항암제, 면역조절제 또는 기타 소염제와 함께, 예를 들어 항원보강제로서 함께 또는 조합하여 투여될 수 있다.
"항암제" 또는 "증식방지제"라는 용어는 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료하는 데 사용될 수 있는 모든 제제를 의미하며, 치료용 항체, 세포독성제, 세포증식억제제, 혈관형성방지제, 용적축소제, 화학요법제, 방사선요법 및 방사선요법제, 표적항암제, BRM, 암 백신, 사이토카인, 호르몬 요법, 방사선요법 및 항전이제 및 면역요법제를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질은 광범위하게 다양한 단클론 항체, 특히 예를 들어 종양 관련 항원, 기질 관련 항원 또는 경로, 예를 들어 PD-1/PD-L1, TIM-3, LAG-3, VEGF, HER2, CTLA-4에 대한 항체; 백혈구 수용체, 예를 들어 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 또는 이들의 리간드에 대한 항체; CD3 관여 항체, NK 관여 항체; 항-종양 관련 항원 을 가능하게 하는 ADCC; TNF에 대한 단클론 항체와 함께 사용될 수 있다. 항체는 압식시맙, 아달리무맙, 알레파셉트, 알렘투주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베즈로톡수맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에팔리주맙, 골리무맙, 인플렉트라, 이필리무맙, 익세키주맙, 나탈리주맙, 니볼루맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 세쿠키누맙 및 우스테키누맙을 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다.
항체는 단일특이성이거나 다중-특이성일 수 있다. 예를 들어, 항체는 항원 결합을 위한 2개의 가변 분절 및 면역 세포를 모집하는 Fc 성분을 갖는 삼중특이성 항체(TrAb 또는 TrioMab)일 수 있다. TrAb의 일례는 EpCam 양성 위 및 난소 종양 치료를 위한 카투막소맙이다. 항체는 또한 이중특이성 T 세포 관여 항체(BiTE), 예를 들어 블리나투모맙, MEHD7945A, ABT-122, XmAb5871 등일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 이종이량체 및 동종이량체 융합 단백질은 면역조절 화합물, 예를 들어 CTLA4의 세포외 도메인의 적어도 일부를 갖는 재조합 결합 분자 또는 이의 돌연변이; 부착 분자 억제제, 예를 들어 LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 -3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제; 염증전 사이토카인 차단제, IL-1 차단제; 케모카인 차단제; 또는 화학요법제와 함께 사용될 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위해, "화학요법제"는 암 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 비-특이적으로 감소시키거나 억제하는 화학적 화합물(예를 들어, 세포독성제 또는 세포증식억제제)을 포함한다. 이러한 화학 물질은 흔히 세포 성장이나 분열에 필요한 세포내 과정에 사용되므로, 일반적으로 빠르게 성장하고 분열하는 암세포에 특히 유효하다. 예를 들어, 빈크리스틴은 미세소관을 해중합하여 세포가 유사분열에 들어가는 것을 억제한다. 일반적으로, 화학요법제는 암성 세포 또는 암으로 되거나 또는 종양형성 자손(예를 들어 TIC)을 생성할 가능성이 있는 세포를 억제하거나 억제하도록 설계된 임의의 화학 제제를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 종종 CHOP 또는 FOLFIRI와 같은 요법과 함께 조합하여 투여되며 종종 가장 유효하다. 본 개시내용의 부위 특이적 작제물과 조합하여(부위 특이적 접합체의 성분으로서 또는 접합되지 않은 상태로) 사용될 수 있는 항암제의 예에는 예를 들어 파클리탁셀, 젬시타빈, 시스플라티늄, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 콤브레타스타틴, 류코보린 등이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 이종이량체 및 동종이량체 융합 단백질은 DMARD, 예를 들어 금염, 설파살라진, 항말라리아제, 메토트렉세이트, D-페니실라민, 아자티오프린, 마이코페놀산, 사이클로스포린 A, 타크로리무스, 시롤리무스, 미노사이클린, 레플루노미드, 글리코코르티코이드; 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 사이클로스포린 A 또는 FK 506; 림프구 재순환 조절제, 예를 들어 FTY720 및 FTY720 유사체; mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신, 40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, CCI779, ABT578, AP23573 또는 TAFA-93; 면역억제 특성을 갖는 아스코마이신, 예를 들어 ABT-281, ASM981 등; 코르티코스테로이드; 사이클로포스파미드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 레플루노마이드; 미조리빈; 마이코페놀산; 마이코-페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구아린 또는 이의 면역억제 동족체, 유사체 또는 유도체; 면역억제제와 함께 사용될 수 있다.
상기 논의된 바와 같은 선택된 구현예에서, 이러한 항암제는 접합체를 포함할 수 있고 투여 전에 개시된 이종이량체 및 동종이량체 폴리펩티드 복합체와 회합될 수 있음이 인식될 것이다. 보다 구체적으로, 특정 구현예에서 선택된 항암제는, 조작된 폴리펩티드 복합체의 짝을 이루지 않은 시스테인에 연결되어 본원에 제시된 바와 같은 조작된 접합체를 제공할 것이다. 따라서, 이러한 조작된 접합체는 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 명백히 고려된다. 다른 구현예에서, 개시된 항암제는 상기 제시된 바와 같은 다양한 치료제를 포함하는 부위-특이적 접합체와 조합하여 제공될 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 이종이량체 및 동종이량체 폴리펩티드 복합체와 조합하여 사용되는 항암제 또는 면역조절제는 폴리펩티드 복합체와 상용성이어야 한다, 즉 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체의 효과를 감소, 방해 또는 제거하지 않고 바람직하게는 조화 또는 심지어 시너지 효과를 제공해야 한다는 것이 쉽게 이해될 것이다.
다중특이적 항체의 면역 강화 성분/모이어티
본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 제2 항원 특이성 결합 부분 과 회합되어 다중특이성 항체 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 부분(예를 들어, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 포함)은 IL-2 모이어티의 N 말단 또는 C 말단과 융합될 수 있다. 이러한 다중특이성 항체 복합체는 표적 항원에 대한 높은 친화성을 가질 뿐만 아니라 면역 세포 활성화를 촉진하는 IL-2의 효능도 갖는다.
방사선요법과의 병용
본 개시내용은 또한 이종이량체 및 동종이량체 폴리펩티드 복합체와 방사선요법(즉, 감마선 조사, X-선, UV 조사, 마이크로파, 전자 방출 등과 같이 종양 세포 내에서 국소적으로 DNA 손상을 유도하기 위한 임의의 기전)과의 조합을 제공한다. 종양 세포에 방사성동위원소를 직접 전달하는 병용 요법도 고려되며, 개시된 접합체는 표적 항암제 또는 다른 표적화 수단과 연결하여 사용될 수 있다. 전형적으로, 방사선요법은 약 1주 내지 약 2주에 걸쳐 펄스로 투여된다. 방사선요법은 두경부암 환자에게 약 6 내지 7주 동안 투여될 수 있다. 선택적으로, 방사선요법은 단일 용량으로 또는 다중 연속 용량으로 투여될 수 있다.
세포독성을 일으키지 않는 면역억제로서
일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 원치 않는 부작용이 나타나지 않으면서 대상체의 면역 반응이 감소되도록 상기 대상체에게 본 개시내용의 폴리펩티드 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 대상체는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
"면역 반응을 억제하는"이라는 용어 또는 그 문법적 변형은 포유동물의 면역계의 임의의 반응을 감소시키는 것을 의미한다. 면역 반응은 세포 반응(즉, 세포-매개, 예를 들어 세포독성 T 림프구 매개) 또는 체액 반응(즉, 항체 매개 반응)일 수 있으며, 1차 또는 2차 면역 반응일 수 있다. 면역 반응 억제의 예는 증가된 Treg 세포 활성 및 증식을 포함한다. 면역 반응의 억제는, 비제한적으로 Treg 림프구 분석, 사이토카인 방출(예를 들어 IL-15 생성 또는 IFN-γ 생성), 자가면역 질환 퇴행, 자가면역 동물의 생존, 자가-항체 생성, 면역세포 증식 및 세포독성을 포함하여, 당업자에게 공지된 다수의 시험관내 또는 생체내 측정을 사용하여 평가될 수 있다. 전형적으로, 본 개시내용의 방법은 치료되지 않은 포유동물 또는 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료되지 않은 포유동물에 의한 면역 반응과 비교할 때 포유동물에 의한 면역 반응을 향상시킨다. 한 구현예에서, 면역 반응은 사이토카인 생성, 특히 IFN-γ 생성 또는 IL-17 생성이다. 또 다른 구현예에서, 면역 반응은 B 세포 활성 억제이다.
본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 복합체는 단독 요법으로서 단독으로 사용될 수 있거나, 보다 종종 세포 면역요법, 유전자 요법, 표적화된 요법 또는 화학요법과 조합하여 사용될 수 있다.
약제 팩 및 키트
하나 이상의 용량의 폴리펩티드 복합체를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하는 약제 팩 및 키트를 또한 제공한다. 특정 구현예에서, 단위 투여량이 소정량의, 예를 들어 하나 이상의 추가 제제와 함께 또는 상기 없이 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물을 함유하는 단위 투여량을 제공한다. 다른 구현예의 경우, 이러한 단위 투여량은 일회용 사전-충전된 주사용 주사기로 공급된다. 또 다른 구현예에서, 단위 투여량에 포함된 조성물은 식염수, 슈크로스 등; 포스페이트 등과 같은 완충제를 포함할 수 있고/있거나; 안정적이고 유효한 pH 범위 내에서 제형화될 수 있다. 대안적으로, 특정 구현예에서, 접합체 조성물은 적절한 액체, 예를 들어 멸균수 또는 식염수 용액의 첨가 시 재구성될 수 있는 동결건조된 분말로 제공될 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서, 조성물은 슈크로스 및 아르기닌을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 단백질 응집을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 용기(들) 상의 또는 이와 연관된 임의의 표지는 동봉된 접합체 조성물이 선택된 종양성 질병 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다.
본 개시내용은 또한 부위-특이적 접합체 및 선택적으로 하나 이상의 항암제의 단일 용량 또는 다중 용량 투여 단위를 생성시키기 위한 키트를 제공한다. 키트는 용기, 및 상기 용기 상의 또는 이와 연관된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있으며 약제학적 유효량의, 접합되거나 접합되지 않은 형태의 개시된 접합체를 함유할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 용기(들)는 멸균 접근 포트를 포함한다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 이러한 키트는 일반적으로 적합한 용기에, 조작된 접합체의 약제학적으로 허용되는 제형 및 선택적으로 동일하거나 상이한 용기 중의 하나 이상의 항암제를 함유할 것이다. 키트는 또한 진단 또는 병용 요법을 위한 기타 약제학적으로 허용되는 제형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 본 개시내용의 폴리펩티드 복합체에 더하여, 화학요법 또는 방사선요법 약물과 같은 일련의 항암제 중 임의의 하나 이상; 혈관형성방지제; 항전이제; 표적항암제; 세포독성제; 및/또는 기타 항암제를 함유할 수 있다.
보다 구체적으로, 키트는 추가 성분과 함께 또는 상기 없이 개시된 폴리펩티드 복합체를 함유하는 단일 용기를 가질 수 있거나, 각각의 원하는 제제에 대해 별개의 용기를 가질 수 있다. 접합을 위해 복합 치료제가 제공되는 경우, 단일 용액은 몰 당량의 조합으로 또는 한 성분이 다른 성분보다 과량으로 미리 혼합될 수 있다. 대안적으로, 키트의 접합체 및 임의의 선택적 항암제는 환자에게 투여하기 전에 별개의 용기 내에 별도로 유지될 수 있다. 키트는 또한 멸균된 약제학적으로 허용되는 완충액 또는 기타 희석제, 예를 들어 정균 주사용수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수(PBS), 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 함유하기 위한 제2/제3 용기 수단을 포함할 수 있다.
키트의 성분이 하나 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 바람직하게는 수용액이고, 멸균 수성 또는 식염수 용액이 특히 바람직하다. 그러나, 키트의 성분은 건조 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 또는 성분이 건조 분말로서 제공되는 경우, 적합한 용매를 첨가하여 분말을 재구성할 수 있다. 용매를 또한 다른 용기에 제공할 수도 있음이 구상된다.
상기에서 간략하게 나타낸 바와 같이, 키트는 폴리펩티드 복합체 및 임의의 선택적 성분을 환자에게 투여하기 위한 수단, 예를 들어 하나 이상의 바늘, IV 주머니 또는 주사기, 심지어 점안기, 피펫 또는 기타 이와 같은 수단을 또한 포함할 수 있으며, 이들로부터 제형이 동물에게 주사 또는 도입되거나 신체의 병든 부위에 적용될 수 있다. 본 개시내용의 키트는 또한 전형적으로 바이알 등을 함유하기 위한 수단, 및 상업적 판매를 위해 밀봉된 다른 성분, 예를 들어 원하는 바이알 및 기타 기구를 배치하여 유지시키는 사출 또는 취입-성형된 플라스틱 용기를 포함할 것이다.
서열 목록 요약
하기의 표 A-B는 포함된 서열의 요약을 제공한다. 폴리펩티드 복합체의 명칭은 그의 구조를 나타낸다. "E44" 또는 "F114"는 IL-2 모이어티가 Fc 영역의 N 말단에 있는지 C 말단에 있는지를 명시하고, "Z20"은 2개의 IL-2 모이어티가 Fc 영역의 N 말단에 있음을 명시하고(도 1 참조), "uIgG1V320"은 LALA 돌연변이가 있는 IgG1 Fc를 지칭하고, "uIgG4V322"는 FALA 돌연변이가 있는 IgG4 Fc를 지칭하고, "uIgG4V1"은 S228P 및/또는 짧은 힌지가 있는 IgG4 Fc를 지칭한다. 간략하게 하기 위해 접두사 "W3xx115-"를 생략할 수 있다.
서열번호 1-61은 야생형 IL-2 및 IL-2 변이체 서열의 아미노산 서열을 지칭하고; 서열번호 62-130은 IL-2 모이어티를 포함하는 폴리펩티드 복합체의 제1 중쇄의 아미노산 서열을 지칭하고; 서열번호 131-133은 폴리펩티드 복합체의 제2 중쇄의 아미노산 서열을 지칭하고; 서열번호 134는 폴리펩티드 복합체 중의 항원-결합 모이어티가 Fab일 때 존재하는 경쇄의 아미노산 서열을 지칭한다.
[표 A]
실시예
이와 같이 일반적으로 기재된 본 개시내용은 예시로서 제공되며, 본 개시내용을 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예를 참조함으로써 보다 용이하게 이해될 것이다. 실시예는 하기 실험이 수행된 실험 전부 또는 유일한 실험임을 나타내고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
물질, IL-2 변이체 및 융합 단백질의 제조
1.1 물질 제조
실시예에 사용된 시판 물질에 대한 정보는 표 1에 제공된다.
[표 1]
1.2 야생형 IL-2 또는 IL-2 변이체를 포함하는 IL-2/Fc 융합 단백질의 생성
IL-2/Fc 융합 단백질의 발현을 위한 플라스미드의 구성
IL-2/Fc 융합 단백질의 구조는 도 1에 도시된 바와 같다. E44 포맷은 IL-2 모이어티가 Fc 영역의 N 말단에 링커("E44-2"라고도 함)로 또는 링커 없이("E44-1"이라고도 함) 연결됨을 나타낸다. F114-1 포맷은 IL-2 모이어티가 Fc 영역의 C 말단에서 링커로 연결됨을 나타낸다. Z20 포맷은 2개의 IL-2 모이어티가 링커 없이 Fc 영역의 N 말단에 각각 연결됨을 나타낸다.
[표 2]
Fc 융합 IL-2 단백질의 다양한 포맷
선택된 항체의 VL, VH, Ck, CH1 및 VHH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 DNA 주형으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 야생형 IL-2 및 IL-2 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 Sangon Biotech Inc.에 의해 합성되었다. 항체의 고유 경쇄 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CMV 프로모터 및 카파 또는 람다 신호 펩티드를 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. 항-표적 VH-CH1 및 야생형 IL-2 또는 IL-2 변이체의 DNA 단편을, (G4S)n 링커가 있거나 없는 인간 IgG1 또는 IgG4의 불변 영역 CH2-CH3, 또는 포맷에 따른 힌지 절두된 IgG4를 포함하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. 벡터는 CMV 프로모터 및 인간 항체 중쇄 신호 펩티드를 함유한다.
생성된 IL-2/Fc 융합 단백질 및 이의 상응하는 IL-2 포맷(WT 또는 변이체)은 표 3에 나열되어 있다. IL-2/Fc 융합 단백질의 ID는 이의 구조를 나타낸다: "E44" 또는 "F114"는 IL-2 모이어티가 Fc 영역의 N 말단에 있는지 C 말단에 있는지를 명시하고, "Z20"은 2가 IL-2 모이어티를 지칭하고, "uIgG1V320", "uIgG4V322" 및 "uIgG4V1"은 각각 LALA 돌연변이가 있는 IgG1 Fc, FALA 돌연변이가 있는 IgG4 Fc 및 야생형 IgG4 Fc를 지칭한다. 간략하게 하기 위해 접두사 "W3xx115-"를 생략할 수 있다.
[표 3]
IL-2/Fc 융합 단백질
Expi293 세포에서 IL-2/Fc 융합 단백질의 생성
Expi293 세포(Thermofisher, A14635) 또는 ExpiCHO 세포(Thermofisher, A29133)를 단백질 발현을 위해 준비하고 미리 예열된 Expi293 발현 배지로 희석하였다. 형질감염 시약은 A 및 B로 구성되었다. 여기서, 시약 A는 미리 예열된 Opti-MEM에 플라스미드를 첨가하여 제조되었고, 시약 B는 또한 Opti-MEM에 형질감염 시약을 첨가하여 제조되었다. 이어서 시약 A 및 B를 부드럽게 혼합하고 실온에서 20분 동안 배양하였다. 형질감염 절차를 위해, 상기 혼합물을 세포에 첨가한 다음 37℃, 8% CO2의 진탕기에서 배양하고 18-20시간 동안 120 rpm으로 회전시켰다. 형질감염 후, 인핸서 1 및 인핸서 2를 배지에 추가하여 추가로 5일 동안 배양하여 상등액을 수확하였다.
IL-2/Fc 융합 단백질의 정제
상기에 기재된 바와 같이 Expi293 세포 또는 ExpiCHO 세포의 상등액을 수집하고 정제를 위해 단백질 A 컬럼(GE Healthcare, Cat. 175438) 또는 단백질 G 컬럼(GE Healthcare, Cat. 170618)을 사용하여 여과하였다. 정제된 Fc-융합 단백질의 농도를 280 ㎚에서의 흡광도에 의해 결정하였다. 분자량 및 순도를 각각 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC로 시험하였다.
IL-2 및 이의 변이체의 Fc 융합 단백질이 90% 이상의 순도로 생성되었으며, 이는 상기 단백질이 생리학적 조건 하에서 온전하고 잘 조립된 분자임을 나타낸다.
1.3 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 IL-2Rγ의 생성
C-말단 상에 6xHig를 갖는 IL2Rα(CD25, 서열번호 135) 및 IL2Rβ(CD122, 서열번호 136) 및 IL2Rγ(CD132, 서열번호 137)의 세포외 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 Sangon Biotech Inc.에서 합성되었다. 이어서 CMV 프로모터가 있는 벡터를 Expi293 세포에 형질감염시켰다. 형질감염된 Expi293 세포의 상등액을 상기 기재된 바와 같이 수집하고 정제를 위해 Ni-컬럼(GE Healthcare, Cat. 173712)을 사용하여 여과하였다. 정제된 His-태그된 단백질의 농도를 280 ㎚에서의 흡광도에 의해 결정하였으며, 분자량 및 순도를 각각 SDS-PAGE와 SEC-HPLC로 시험하였다.
실시예 2
시험관내 특성화
2.1 HH, NK92 및 MJ20 세포주에서 결합 분석(FACS)
인간 피부 T 세포 림프종 HH 세포, 악성 비-호지킨 림프종 NK92 세포 및 피부 T 세포 림프종 MJ20 세포를 결합 분석에 사용하였다. 이들은 모두 IL-2Rβ(CD122) 및 γc(CD132)를 구성적으로 발현하며, NK92 및 MJ20는 IL-2Rα(CD25)를 또한 발현한다. HH, NK92 및 MJ20 세포를 ATCC 지침에 따라 배양한 다음, 결합 분석을 위해 96-플레이트로 옮겼다. 내재화를 피하기 위해 세포를 지시된 농도의 IL-2/Fc 융합 단백질과 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 결합이 PE-항-인간 Fc의 2차 항체에 의해 4℃에서 추가로 30분 동안 검출되었다. HH 및 NK92 세포의 평균 형광 강도(MFI)를 FACS를 사용하여 측정하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, N-말단 융합 단백질(E44 포맷)은 NK92(고 친화성 수용체) 및 HH(중간 친화성 수용체) 세포 모두에서 결합을 나타낸 반면, C-말단 융합 단백질(F114)은 NK92 세포에서 더 낮은 친화성을 나타내었으며, 이는 IL-2Rα에 대한 그의 친화력이 낮다는 것을 의미한다.
IL-2 구조는 그의 N 말단이 C 말단에 가깝고 둘 다 IL-2Rβ/γc 결합 계면 상에 있음을 알려준다. 따라서, Fc와의 융합 단백질에서 IL-2의 유연성이 또한 그의 친화도에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 도 3에 도시된 바와 같이, IgG1에서 (G4S)n 링커의 존재는 IL-2의 친화도에 영향을 덜 미친다. 유사하게, 더 짧은 힌지를 갖는 IgG4는 HH 및 NK92 세포의 결합 곡선에 나타난 바와 같이, 고/중간 친화성 수용체에 대한 결합에서 약한 감소를 나타내었다(도 3). 융합 단백질의 다양한 Fc 아이소타입은 IL-2의 친화도에 그다지 영향을 미치지 않는다.
[표 5]
다양한 포맷의 IL-2/Fc 융합 단백질의 결합 친화도
2.2 인간 CD8+ T 세포의 pSTAT5 활성화 분석
STAT5는 T 세포 활성화와 엄격하게 연관된 하류 신호 마커이다. PBMC의 인간 휴지 CD8+T를, WT IL-2 또는 IL-2 변이체를 포함하는 IL-2 융합 단백질과 함께 30분간 배양한 후 STAT5 인산화에 대해 분석하였다. 처리의 끝에서, PBMC를 BD Phosflow Fix 완충제 I로 즉시 고정한 다음 미리 냉각된 BD Phosflow Perm 완충제 III와 함께 배양하였다. 배양 및 고정 후, 세포를 실온에서 30분 동안 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD8 항체로 염색하였다. 그 후, 세포를 Perm 완충제 III로 처리하여 투과화시키고, 항-pSTAT5 항체로 30분간 염색하였다.
림프구를 먼저 SSC 및 FSC에 기초하여 게이팅하고 이어서 CD3에 이어서 CD4 및 CD8 발현에 기초하여 게이팅하여 CD8+T 세포를 식별하였다. 최종적으로, CD8+T 집단에서 STAT5의 인산화 수준을 결정하였다.
인간 CD8+ T 세포와 배양 시, WT IL-2 모이어티를 함유하는 다양한 포맷은 STAT5 인산화에 의해 측정된 바와 같이 유사한 CD8 활성화를 나타내었다(도 4). 즉, IL-2 융합 단백질에 도입된 다양한 포맷 또는 유연성은 IL-2의 IL-2Rβ/γc 효능에 약간의 영향을 미쳤다(표 5의 결과와 일치한다).
1차 인간 CD8+ T(중간 친화성 수용체, IL-2Rβ/γc 발현)는 IL-2 변이체를 포함하는 IL-2/Fc 융합 단백질에 의해 활성화되었으며, 이는 다양한 정도의 STAT5 인산화로서 반영된다(도 5a, 표 6). T2U0.E44-7은 T2U0.E44-1에 비해 535배 효능 감소를 나타내었고, 이어서 T2U0.E44-6(18배) 및 T2U0.E44-9(10배)가 그 뒤를 이었다. HH 세포(IL-2Rα/β/γc)의 결합 곡선은 유사한 패턴을 나타내었다(도 5b).
[표 6]
절두된 IL-2를 포함하는 IL-2/Fc 융합 단백질의 요약된 친화도 및 효능
2.3 인간 Treg 세포의 pSTAT5 활성화 분석
신선한 PBMC로부터의 인간 Treg는 EasySep™ Human CD4+CD127 low CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit(Stemcell-18063)에 의해 단리되었다. 신선한 인간 PBMC를 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에서 완충액에 현탁시켰다. CD25+CD4+ T 세포를 양성 선택하기 위해 CD25 양성 선택 칵테일 및 CD4+ T 세포 농축 칵테일을 첨가하였다. 이어서, CD127high 고갈 칵테일을 사용하여 CD127high CD25+CD4+ T 세포를 표지하였으며, 표지되지 않은 세포는 Treg였다.
인간 Treg 확대 키트(Miltenyi-130-095-353)를 Treg 확대에 사용하였다. 이들 단리된 Treg를 CD3/CD28 비드와 혼합하고 500 IU/㎖ IL-2가 함유된 배양 배지로 현탁하였다.
인간 Treg 세포(고 친화도 수용체, IL-2Rα/β/γc 발현)를 또한 지정된 IL-2 변이체와 함께 30분간 배양한 후 STAT5 인산화에 대해 분석하였다. 확대된 인간 Treg 세포를 CD8+ T 세포에 대해 상기에 기재된 바와 동일한 방법으로 조작하였지만, 표면 CD 마커 대신 항-Foxp3 항체가 사용되었다.
Treg 세포에서, T2U0.E44-3, T2U0.E44-4, T2U0.E44-5, T2U0.E44-6, T2U0.E44-7 및 T2U0.E44-9 처리 그룹의 pSTAT5의 EC50은 다양한 정도로 감소되었으며(도 6a, 표 6), 이는 도 5a의 결과와 일치한다. NK-92 세포(IL-2Rα/β/γc)의 결합 곡선도 또한 동일한 효능 추세를 지지한다(도 6b). 상기 결과는 IL-2Rβ/γ 약화된 IL-2 변이체로 이어지는 C-말단 절두를 나타낸다.
2.4 IL-2Rβγ 계면에서 IL-2 변이체의 친화도 및 효능
C-말단 절두된 IL-2 변이체에 기반하여, C-말단에서의 치환(125, 126, 128 및 129 포함) 및 힌지 절두가 IL-2R βγ 친화도를 조절하는 데 관련되었다. 1차 인간 CD8+ T 및 HH 세포는 IL-2R β/γ 친화도 측정에 사용되었고, 인간 Treg 및 MJ20 세포는 IL-2Rα/β/γ 친화도 측정에 사용되었다.
도 7 및 표 7에 나타낸 바와 같이, T2U0.E44-26, T2U0.E44-27, T2U0.E44-28, T2U0.E44-29 및 T2U0.E44-30은 T2U0.E44-1에 비해 18 내지 32배 친화도 감소를 유도하였고, T2U0.E44-24 및 T2U0.E44-25는 T2U0.E44-6보다 적은 약화를 유도하였다. IL-2Rα/β/γ에 대한 IL-2 변이체의 친화도는 동일한 결과를 지지하였다(도 8 및 표 7). T2U0.E44-24, T2U0.E44-25 및 T2U0.E44-28은 T2U0.E44-6에 비해 뚜렷한 약화를 나타내지 않았다. 또, T2U0.E44-26, T2U0.E44-27, T2U0.E44-29 및 T2U0.E44-30은 T2U0.E44-1에 비해 Treg에서 수백 내지 수천의 친화도 감소를 유도하였다. MJ20 세포(IL-2Rα/β/γ)의 결합 곡선도 또한 유사한 추세를 달성하였다(도 8b). 결과적으로, C-말단 절두 및 129의 치환 방법을 활용하여 IL-2R βγ 약화된 IL-2 변이체를 달성할 수 있었다.
[표 7]
IL-2 변이체(129번 위치에서의 치환 및 힌지 절두)를 포함하는 IL-2/Fc 융합 단백질의 요약된 친화도 및 효능
절두된 IL-2 변이체(T2U0.E44-6)를 기반으로, 125, 127의 치환 및 글리코실화(S127N/I129S)를 생성시켰다. 도 9 및 표 8은 IL-2Rβ/γ에 대한 이들 변이체, T2U0.E44-34, T2U0.E44-38 및 T2U0.E44-39의 친화도가 T2U0.E44-6에 비해 유사한 감소 배수를 유도하고, T2U0.E44-35, T2U0.E44-36 및 T2U0.E44-37은 1차 CD8+T에서 훨씬 더 약함을 보였다. Treg 및 MJ20 세포(도 10 및 표 8)에서, T2U0.E44-35 및 T2U0.E44-36은 T2U0.E44-6과 유사한 효능을 보였고, T2U0.E44-37, T2U0.E44-38 및 T2U0.E44-39는 더 큰 친화도 약화를 유도하였다.
[표 8]
IL-2 변이체(125, 127, 129에서의 치환)를 포함하는 IL-2/Fc 융합 단백질의 요약된 친화도 및 효능
2.5 IL-2Rα 계면에서 IL-2 변이체의 친화도 및 효능
IL-2의 F42 및 R38 아미노산은 IL-2Rα(CD25) 결합에 중요한 아미노산이었으며, 따라서 Treg 및 활성 CD8+ T 세포에 대한 IL-2의 친화도를 조절하였다. IL-2 모이어티에 F42V/Y45A/L72G 돌연변이가 있는 T3U0.E44-1은 인간 Treg에 대해 652배 효능 감소를 보여주었다(도 11 및 표 9). T2U0.E44-12, T2U0.E44-13 및 T2U0.E44-14와 같은 F42의 다른 IL-2 돌연변이체는 모두 인간 Treg에서 효능이 수십 배에서 수백 배 감소한 것으로 나타났다(표 9). 그러나 이들은 모두 T2U0.E44-1로서 IL-2Rβ/γ 복합체에 대한 효능을 유지하였다(도 12). HH 및 NK92 세포의 결합 곡선이 또한 이를 지지하였다.
[표 9]
IL-2 돌연변이체에 대해 요약된 친화도 및 효능
2.6 콤보 돌연변이를 갖는 IL-2 변이체의 효능 감소 결정
C-말단 절두 변이체 T2U0.E44-6을 F42, R38 또는 T111의 단일 점 돌연변이와 조합하여 IL-2 변이체를 생성시켰다. 도 13 및 표 10에서 고 친화성 IL-2 수용체를 발현하는 NK92 세포 및 중간 친화성 수용체를 발현하는 HH 세포에 대한 결합 곡선도 또한 약화를 입증하였다. 따라서, 도 14 및 표 11에 나타낸 바와 같이, STAT5 인산화를 유도하는데 있어 인간 1차 CD8+ T 및 Treg 세포에 대한 이들 변이체의 효능도 둘 다 감소되었다.
[표 10]
HH 및 NK92 세포의 결합 매개변수
[표 11]
인간 CD8+ T 및 Treg 세포에서의 STAT5 인산화의 EC50
F42 또는 R38의 돌연변이가 T2U0.E44-26에 관여하여 IL-2 변이체를 생성시켰다. MJ20 세포에 대한 결합 곡선은 약화를 입증하였다(도 15 및 표 12). 따라서, 도 16 및 표 13에 나타낸 바와 같이, Treg 세포에 대한 이들 변이체의 효능도 감소되었다.
[표 12]
HH 및 MJ20 세포의 결합 매개변수
[표 13]
인간 CD8+ T 및 Treg 세포에서의 STAT5 인산화의 EC50
2.7 2가 IL-2 변이체의 효능 감소 결정
T2U0.E44-6 및 T2U0.E44-26의 IL-2 변이체를 사용하여 2가 변이체 W3XX115-T2.Z20-1.uIgG4V322 및 W3XX115-T2.Z20-2.uIgG4V322를 각각 구성하였다. HH 및 MJ20 세포에 대한 결합 친화도는 도 17 및 표 14에 나타내었으며, T2.Z20-1은 T2U0.E44-6(6배)과 유사하게, 6.9배 IL-2R β/γ 약화를 유도하였다. 또, T2.Z20-2의 약화 배수는 9.4로, T2U0.E44-26(20배)보다 더 효능이 있었다. 친화도 분화는 IL-2R α/β/γ 세포에서 더 현저하였고, 2가 IL-2 변이체(EC50, 5 pM 및 8 pM)는 1가 보다 훨씬 더 효능이 있었으며, T2U0.E44-1(EC50, 8.3 nM)보다 훨씬 더 양호하였다.
인간 1차 CD8+ T 및 Treg 세포를 2가 IL-2 변이체의 효능 결정에 사용하였다(도 18, 표 15). STAT5 인산화 분석 결과는 결합 분석과 일치하였다. 2가 및 1가 IL-2 변이체의 감소 배수는 1차 CD8+ T 세포에서 13 내지 48배였다. T2.Z20-1 및 T2.Z20-2는 T2U0.E44-1(7 pM)과 유사하게 2 pM 및 8 pM의 EC50으로 Treg 활성화를 유도하였다. 그 결과, 2가 IL-2 변이체는 Treg/CD8+T의 효능 비가 10,000이 넘는 것으로 나타났으며, 이는 BMK8(∞)과 유사한 특징을 공유한다.
[표 14]
HH 및 MJ20 세포에서 2가 IL-2 변이체의 결합 매개변수
[표 15]
인간 CD8+ T 및 Treg 세포에서 2가 IL-2 변이체의 효능 요약
2.7 IL-2 변이체의 SPR 분석
IL-2 수용체에 대한 IL-2 변이체 결합 친화도를 Biacore 8K를 사용하여 SPR에 의해 검출하였다. IL-2Rα 결합 분석을 위해, 각 변이체를 항-인간 Fc 고정화된 CM5 센서 칩(cytiva)에 포착하였다. 상이한 농도의 W3XX115-hPro1.ECD.His를 60초의 결합 단계 동안 30 uL/분의 유량으로 센서 칩 위에 주입한 다음 90초의 해리를 수행하였다. 이어서 각 결합 주기 후에 칩을 10 mM 글리신-HCl pH 1.5로 재생시켰다. IL-2Rγ 결합 분석을 위해, IL-2 변이체를 분석 전에 W369-hPro2.ECD.His와 1:1로 혼합하고, Biacore 8K를 사용하여 SPR에 의해 검출하였다. W3XX115-hPro1.ECD.His를 항-His 고정화된 CM5 센서 칩(cytiva)상에 포착하였다. 혼합물을 상기에 기재된 바와 같이 센서 칩 위에 주입하였다. 블랭크 표면과 완충액 채널의 센서그램을 시험 센서그램에서 제하였다. 실험 데이터를 정상 상태 친화도 모델에 의해 피팅하였다. W3XX115-hPro1.ECD.His 또는 W369- hPro1.ECD.His의 분자량을 사용하여 분석물의 몰 농도를 계산하였다.
도 16에 도시된 바와 같이, T20.E44-1은 IL-2Rα 및 IL-2Rγ에 대해 정상적인 친화도를 나타내었다. IL-2Rα에 대한 T2U0.E44-6 및 T2U0.E44-26의 KD는 T20.E44-1에 가까웠고, T2U0.E44-20 및 T2U0.E44-33은 T2U0.E44-1에 비해 대략 10배의 친화도 감소를 나타내었다. T3U0.E44-1 및 T2U0.E44-33의 경우, IL-2Rα에 대한 결합이 검출되지 않았다.
IL-2 변이체는 IL-2Rβ에 대해 유사한 친화성을 나타내었다. IL-2Rγ에 대한 IL-2 변이체의 친화도는 너무 약해서 직접 측정할 수 없었다. IL-2 변이체는 T20.E44-1에 비해 감소된 IL-2Rγ 결합을 가졌으며(도 19), 이는 세포에서 관찰된 감소된 IL-2Rβ/γ가 IL-2Rγ와의 손상된 상호작용에 기인함을 나타낸다.
2가 IL-2 변이체는 그의 1가 모체보다 더 약한 IL-2Rγc 결합 및 유사하거나 더 양호한 IL-2Rα 결합을 나타내었지만, IL-2Rβ에 대해서는 감소된 친화도를 나타내었다. 2가 변이체의 Fc 융합 부분은, IL-2의 N 또는 C 말단이 모두 IL-2Rβ/γc 결합 계면 상에 있기 때문에, 상기 융합이 IL-2의 N 또는 C 말단에 있는 지에 관계 없이 IL-2 분자간의 입체 장애로 이어질 수도 있다. Fc 모이어티 외에도, 이량체를 형성하는 다른 융합 전략이 또한 IL-2의 IL-2Rβ/γc에 대한 친화도 감소에 기여할 수 있었다.
[표 16]
IL-2 변이체와 IL2Rα, IL-2Rβ 및 IL2Rγ와의 친화도 요약
실시예 3
생체내 특성화
연구에서 동물 취급, 관리 및 치료와 관련된 모든 절차는 동물 관리 연구실 평가 및 인증 협회(AAALAC)의 지침에 따라 WuXi Biologics의 LARC의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인한 지침에 따라 수행되었다.
3.1 IL-2 변이체의 마우스 MTD
C57BL/6N 마우스를 최대 허용 용량(MTD) 연구에 사용하였다. 마우스는 각 그룹에 3마리의 마우스를 포함하여 무작위로 상이한 그룹들로 나뉘었다. 마우스는 3일마다 상이한 투여량으로 시험 물품을 수용하였다. 이어서 1주일에 2회 체중을 측정하고 매일 마우스 관찰을 수행하였다.
도 20에 도시된 바와 같이, 약화된 IL-2 변이체의 MTD는 T2U0.E44-1(1.5 ㎎/㎏)과 비교하여 다양한 범위에서 모두 개선되었다. T2U0.E44-6, T2U0.E44-20, T2U0.E44-2, T2U0.E44-33의 MTD는 2 ㎎/㎏이었고, T2U0.E44-15의 MTD는 3 ㎎/㎏이었다. 게다가, 2가 IL-2 변이체는 7.2 ㎎/㎏ 이상으로 명백한 MTD 개선을 보인다.
3.2 IL-2 변이체의 항-종양 효능
MC38 동계 모델을 효능 연구에 사용하였다. MC38 세포를 C57BL/6N 마우스의 오른쪽 옆구리에 이식하였다(sc). 종양의 부피가 약 60-80 ㎣에 도달하면, 종양이 있는 마우스를 무작위로 여러 그룹으로 나누어 0일 및 3일차에 IL-2 변이체를 투여하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 측정하고, 부피를 ㎣으로 표시하였다. 결과를 평균 및 표준오차(Mean±SEM)로 나타내었다. 통계 분석은 양방향 ANOVA로 수행되었으며, P<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
먼저, 비-α IL-2(IL-2Rα에 결합하지 않는 IL-2 변이체를 포함하는 W3XX115-T3U0.E44-1.uIgG4V322)를 사용하여 MC38 동계 모델에서 야생형 IL-2(W3XX115-T2U0.E44-1.uIgG4V322)와 비교하였다. 도 21a에 도시된 바와 같이, T3U0.E44-1 처리 후에는 효능이 관찰되지 않았고, T2U0.E44-1 처리는 현저한 항-MC38 종양 효과를 나타내었는데, 이는 면역 세포에서의 시험관내 효능과 일치하였다(도 18). 이는 IL-2Rα 결합이 IL-2 변이체에 필요하다는 것을 입증하였으며, 비-Treg 친화도는 비-활성화된 CD8+ T 선호도를 의미한다.
다양한 용량의 IL-2 변이체를 야생형 IL-2 및 BMK7(BMK8의 대용물)과 비교하여 MC38 동계 모델에서 추가로 시험하였다. MTD 용량(2 ㎎/㎏)에서 T2U0.E44-6, T2U0.E44-20, T2U0.E44-26 및 T2U0.E44-33의 처리는 PBS 처리와 비교하여 유의한 항-종양 효과를 나타내었으며(도 21b), 이때 TGI는 각각 34%, 53%, 54%, 및 62%였다. T2U0.E44-6/20/26/33과 T2U0.E44-1(TGI=52%, 1.5 ㎎/㎏) 사이에는 유의한 차이가 없었다. 2가 IL-2 변이체의 경우, 고 용량(7.2 ㎎/㎏, BMK7 10 ㎎/㎏에 해당)의 T2.Z20-2는 59%의 TGI로, 상기 IL-2 변이체와 유사한 종양 억제를 나타내었다. T2.Z20-1(TGI=88.7%) 및 BMK7(TGI=77.7%)의 효능은 T2U0.E44-1보다 훨씬 양호하였으며, 이때 15일차 평균 종양 부피는 478 ㎣ 및 518 ㎣이었다. T2.Z20-1의 처리는 50% 무-종양(6마리 마우스에서 3마리 무-종양)을 유도하였고, BMK7 및 T2U0.E44-33의 비는 33%(6마리 마우스에서 2마리 무-종양)였고, T2.Z20-2의 경우 16.7%(6마리 마우스에서 1마리 무-종양)였다.
T2U0.E44-6, T2U0.E44-20, T2U0.E44-26 및 T2U0.E44-33의 용량 반응 연구를 도 21c에 나타내었으며, 1.5 ㎎/㎏ 또는 2 ㎎/㎏의 투약 모두 현저한 항-종양 효과 및 유사한 TGI를 유도한다. 2가 IL-2 변이체 및 BMK7은 1.1, 4.3, 7.2 ㎎/㎏ 또는 등가 용량에서 명백한 용량 반응을 나타내었다(도 21d). 상이한 용량의 T2.Z20-1의 TGI는 낮은 수준에서 높은 수준으로 29.6, 64.4 및 88.7%였으며, 등가 용량에서 BMK7의 TGI는 각각 38.9, 79.8, 77.7%였다.
3.3 IL-2 변이체의 약역학적 효과
MC38 동계 모델을 IL-2 변이체의 PD 연구에 사용하였다. 종양이 있는 마우스를 무작위로 여러 그룹으로 나누어 0일 및 3일차에 투약하였다. 모든 마우스를 5일차에 안락사시킨 후 분석을 위해 이들 마우스의 종양 및 비장을 수집하였다.
도 22에 도시된 바와 같이, 비-α IL-2(W3XX115-T3U0.E44-1.uIgG4V322)의 처리는 또한 종양 침윤 Treg를 확대시켰고, TIL에서 CD8+/CD4+ 비를 상승시키지 않았다. W3XX115-T2U0.E44-1.uIgG4V322는 TIL에서 Treg 선호를 나타내지 않았지만, 종양 억제를 지원하기 위해 CD8+ T(Tem)의 보다 많은 효과 기억 하위유형을 소비하였으며, 이는 항-종양 IL-2 변이체에 대한 IL-2Rα 결합의 필요성을 시사한다.
도 23은 IL-2 변이체 처리 후 종양에서의 면역 세포 반응을 도시한다. IL-2 및 변이체는 PBS 처리와 비교하여 TIL에서 CD8+/CD4+ 비를 증가시켰으며(도 23a), Treg를 소비하는 것을 선호하지 않았다(도 23b, f). T2U0.E44-6 및 T2U0.E44-26은 BMK7과 유사하게 NK 세포 침윤 및 증식을 유도하였다(도 23c). 전체 CD8+ T 세포에서, Ki-67(증식, 도 23d) 및 그랜자임 B(세포독성, 도 23e) 마커는 T2U0.E44-6 및 T2U0.E44-26을 제외하고 그다지 상향조절되지 않았다. CD8+ T 세포는 CD44 및 CD62L에 의해 미경험 및 효과기 기억 하위유형으로 추가로 나뉘어졌다. IL-2 변이체는 미경험 하위유형보다는 Tem을 더 많이 확대시켰으며(도 23g, h), IL-2 변이체의 기능은 Tem 백분율 및 증식에서 BMK7보다 약간 더 양호하였다(도 23i). 이는 이러한 IL-2 변이체가 IL-2의 기능 및 생물학을 유지하지만 효능은 더 양호하고 독성은 더 낮다는 것을 의미한다.
TIL, 활성화된 CD8+ T에서, 고 친화성 IL-2 수용체(αβγ)의 발현은 IL-2에 더 민감하였다. 상이한 IL-2 변이체 처리 시 활성화된 CD8+ T 백분율은 유사하였다(도 23j). IL-2 변이체는 야생형(T2U0.E44-1)보다 활성화된 CD8+ T의 더 많은 증식을 유도하였다(도 23l). 게다가, 도 24k는 다른 것보다 T2U0.E44-6 및 T2U0.E44-26 처리 그룹에서 활성화된 CD8+ T의 더 강한 세포독성을 나타내었는데, 이는 T2U0.E44-6 및 T2U0.E44-26이 두 IL-2R αβγ 세포(활성화된 CD8+ T) 및 IL-2Rβγ 세포(NK) 모두에서 작용하였음을 암시한다. 2가 IL-2 변이체인 T2.Z20-1은 TIL에서 Tem은 더 많이, Treg는 덜 확대시켰으며(도 23b, g), 이는 더 양호한 항-종양 효과를 특징으로 한다.
도 24는 IL-2 변이체 처리 후 말초 면역 세포 반응을 기재한다. T2U0.E44-15는 T2.Z20-1, T2.Z20-2, T2U0.E44-1 및 BMK1 보다 더 양호한, 더 많은 말초 Treg 증식을 유도하였다(도 24a, b). 모든 IL-2 변이체는 말초 CD8+/CD4+ 비나 Tem 또는 Tcm 백분율을 증가시키지 않았으며(도 24d, e, f), 이는 생체내 안전성을 시사한다. 그 결과, T2.Z20-1, T2.Z20-2 및 T2U0.E44-15는 자가면역 질환 요법에 이용 가능한 말초 면역 억제를 조절할 가능성을 나타내었다.
3.4 자가면역 질환에서 IL-2 변이체의 효율성
대장염(colitis)은 자가면역 질환의 일종인 장질환이다. 여기서 우리는 자가면역 질환에서 IL-2 변이체의 효능을 탐색하기 위해 DSS 유발 대장염 모델을 사용하였다. 8주 후 C57BL/6N 마우스를 체중에 따라 무작위로 상이한 그룹으로 나누었다. 대장염을 유발하기 위해 3% DSS를 마우스에게 6일 동안 먹였다. 분류 후 1, 4, 7일차에 마우스에 IL-2 변이체를 처리하였다. 이어서 체중 및 질병 활성 지수(DAI)를 매일 수집하였다.
도 25는 IL-2 변이체 처리 후 대장염 마우스의 체중 변화를 도시하며, 모든 변이체는 비-처리 그룹과 비교하여 대장염으로 인한 체중 감소를 완화할 수 있었다. T2.Z20-1은 체중 변화(a) 및 결장 길이(b)에서 야생형 IL-2(T2U0.E44-1)보다 더 양호한 효과를 나타내었다. 결과적으로, IL-2 변이체는 자가면역 질환 치료에 잠재적인 적용 가능성을 보여주었다.
당업자는 본 발명이 본 발명의 진의 또는 중심 속성으로부터 이탈됨 없이 다른 특정 형태로 구현될 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다. 본 개시내용의 전술한 설명은 단지 그의 예시적인 구현예를 제공한다는 점에서, 다른 변화가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 본원에 상세히 기재된 특정 구현예에 제한되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 내용을 나타내는 첨부된 청구범위를 참조해야 한다.
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Claims (47)

  1. 인터류킨-2(IL-2) 변이체로서, 여기서 IL-2 변이체가 IL-2Rα, IL-2Rβ 및 공통 γ 쇄 중 적어도 하나에 대해 변형된 결합 친화도(modified binding affinity)를 가지며, 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 C-말단 절두(C-terminal truncation)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는, IL-2 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    C-말단 절두가 1 내지 20개 아미노산의 절두, 예를 들어 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산(들)의 절두 중에서 선택되는, IL-2 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    아미노산 서열이 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는, IL-2 변이체.
  4. 제3항에 있어서,
    치환이 28번 위치의 치환, 32번 위치의 치환, 38번 위치의 치환, 42번 위치의 치환, 52번 위치의 치환, 76번 위치의 치환, 78번 위치의 치환, 82번 위치의 치환, 110번 위치의 치환, 111번 위치의 치환, 122번 위치의 치환, 125번 위치의 치환, 127번 위치의 치환, 128번 위치의 치환, 129번 위치의 치환, 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택되는, IL-2 변이체.
  5. 제4항에 있어서,
    치환이
    (a) R38W, R38F, R38Y, R38A, R38V, R38G, R38S, R38T, R38L, R38I, R38H, R38K, R38Q, R38N, R38D, R39E, R38M으로 이루어지는, 38번 위치의 치환 그룹;
    (b) F42G, F42V, F42I, F42M, F42W, F42P, F42Q, F42K, F42A, F42S, F42T, F42E, F42N, F42D, F42R, F42H, F42L 및 F42Y로 이루어지는, 42번 위치의 치환 그룹;
    (c) T111A, T111E, T111G, T111V, T111I, T111M, T111W, T111P, T111Q, T111K, T111S, T111F, T111N, T111D, T111R, T111H, T111L 및 T111Y로 이루어지는, 111번 위치의 치환 그룹;
    (d) I129A, I129E, I129G, I129V, I129F, I129M, I129W, I129P, I129Q, I129K, I129S, I129T, I129N, I129D, I129R, I129H, I129L 및 I129Y로 이루어지는, 129번 위치의 치환 그룹;
    (e) C125A, C125E, C125G, C125V, C125F, C125M, C125W, C125P, C125Q, C125K, C125I, C125S, C125T, C125N, C125D, C125R, C125H, C125L 및 C125Y로 이루어지는, 125번 위치의 치환 그룹;
    (f) S127A, S127E, S127G, S127V, S127F, S127M, S127W, S127P, S127Q, S127K, S127I, S127T, S127N, S127D, S127R, S127H, S127L 및 S127Y로 이루어지는, 127번 위치의 치환 그룹;
    (g) I128A, I128E, I128G, I128V, I128F, I128M, I128W, I128P, I128Q, I128K, I128S, I128T, I128N, I128D, I128R, I128H, I128L 및 I128Y로 이루어지는, 128번 위치의 치환 그룹;
    (h) I28A, I28E, I28G, I28V, I28F, I28M, I28W, I28P, I28Q, I28K, I28S, I28T, I28N, I28D, I28R, I28H, I28L 및 I28Y로 이루어지는, 28번 위치의 치환 그룹;
    (i) K32A, K32E, K32G, K32V, K32F, K32M, K32W, K32P, K32Q, K32I, K32S, K32T, K32N, K32D, K32R, K32H, K32L 및 K32Y로 이루어지는, 32번 위치의 치환 그룹;
    (j) E52A, E52K, E52G, E52V, E52F, E52M, E52W, E52P, E52Q, E52I, E52S, E52T, E52N, E52D, E52R, E52H, E52L 및 E52Y로 이루어지는, 52번 위치의 치환 그룹;
    (k) K76A, K76E, K76G, K76V, K76F, K76M, K76W, K76P, K76Q, K76I, K76S, K76T, K76N, K76D, K76R, K76H, K76L 및 K76Y로 이루어지는, 76번 위치의 치환 그룹;
    (l) F78A, F78K, F78G, F78V, F78E, F78M, F78W, F78P, F78Q, F78I, F78S, F78T, F78N, F78D, F78R, F78H, F78L 및 F78Y로 이루어지는, 78번 위치의 치환 그룹;
    (m) P82A, P82E, P82G, P82V, P82F, P82M, P82W, P82K, P82Q, P82I, P82S, P82T, P82N, P82D, P82R, P82H, P82L 및 P82Y로 이루어지는, 82번 위치의 치환 그룹;
    (n) E110A, E110K, E110G, E110V, E110F, E110M, E110W, E110P, E110Q, E110I, E110S, E110T, E110N, E110D, E110R, E110H, E110L 및 E110Y로 이루어지는, 110번 위치의 치환 그룹; 및
    (o) I122A, I122E, I122G, I122V, I122F, I122M, I122W, I122P, I122Q, I122K, I122S, I122T, I122N, I122D, I122R, I122H, I122L 및 I122Y로 이루어지는, 122번 위치의 치환 그룹
    중에서 선택되는, IL-2 변이체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    IL-2 변이체의 아미노산 서열이 서열번호 2 내지 10에 제시된 바와 같은 서열 및 적어도 95% 동일성(identity)을 갖는 이의 상동성 서열(homologous sequence) 중에서 선택되는, IL-2 변이체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-2 변이체의 아미노산 서열이
    (a) 서열번호 14-21 및 23-27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열;
    (b) 서열번호 31-33 및 35-48에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; 및
    (c) 적어도 95% 동일성을 갖는 (a) 및 (b)의 상동성 서열
    중에서 선택되는, IL-2 변이체.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-2 변이체의 아미노산 서열이
    (a) 서열번호 28-30, 34, 49-60에 제시된 바와 같은 아미노산 서열; 및
    (b) 적어도 95% 동일성을 갖는 (a)의 상동성 서열
    중에서 선택되는, IL-2 변이체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-2Rα, IL-2Rβ 및 공통 γ 쇄 중 적어도 하나에 대한 결합 친화도가 SPR 또는 FACS 결합 분석에 의해 측정되는, IL-2 변이체.
  10. 비-IL-2 모이어티(non-IL-2 moiety)에 작동적으로 연결된, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 IL-2 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서,
    비-IL-2 모이어티가 PEG, 지질, Fc 영역, 인간 혈청 알부민(HSA) 및 항-HSA 모이어티, 예를 들어 Fc 영역 중에서 선택되는, 융합 단백질.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    단량체, 이량체 또는 다량체인 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서,
    2개의 아미노산 쇄를 포함하고, 여기서:
    (a) 각 쇄가 Fc 영역의 N-말단에서 Fc 영역의 한 쇄에 융합된 하나의 IL-2 변이체를 포함하고;
    (b) 각 쇄가 Fc 영역의 C-말단에서 Fc 영역의 한 쇄에 융합된 하나의 IL-2 변이체를 포함하고;
    (c) 한 쇄가 Fc 영역의 N-말단에서 Fc 영역의 한 쇄에 융합된 하나의 IL-2 변이체를 포함하고, 다른 쇄는 Fc 영역의 C-말단에서 Fc 영역의 다른 쇄에 융합된 하나의 IL-2 변이체를 포함하거나; 또는
    (d) 각 쇄가 각각 Fc 영역의 한 쇄의 N-말단 및 C-말단에 융합된 2개의 IL-2 변이체를 포함하는,
    융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    융합 단백질에 포함된 IL-2 변이체가 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는, 융합 단백질.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG4 Fc 영역, 그라프트된(grafted) Fc 영역 또는 이의 변이체인, 융합 단백질.
  16. IL-2 모이어티, 항원-결합 모이어티 및 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 복합체로서,
    IL-2 모이어티가 야생형 IL-2 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 IL-2 변이체를 포함하고,
    항원-결합 모이어티가 Fab, VHH, scFv 및 TCR 중에서 선택되는
    폴리펩티드 복합체.
  17. 제16항에 있어서,
    2개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함하고, 여기서
    항원-결합 모이어티가 Fab이고,
    제1 중쇄가 N-말단에서 C-말단으로:
    (a) IL-2 모이어티; 및
    (b) Fc 영역의 한 쇄
    를 포함하고,
    제2 중쇄가 N-말단에서 C-말단으로:
    (c) Fab의 중쇄; 및
    (d) Fc 영역의 다른 쇄
    를 포함하고,
    경쇄가 Fab의 경쇄를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  18. 제16항에 있어서,
    2개의 쇄를 포함하고, 여기서
    항원-결합 모이어티가 VHH이고,
    제1 쇄가 N-말단에서 C-말단으로:
    (a) IL-2 모이어티; 및
    (b) Fc 영역의 한 쇄
    를 포함하고,
    제2 쇄가 N-말단에서 C-말단으로:
    (d) VHH; 및
    (e) Fc 영역의 다른 쇄
    를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  19. 제16항에 있어서,
    2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 여기서
    항원-결합 모이어티가 Fab이고,
    제1 중쇄가 N-말단에서 C-말단으로:
    (a) Fab의 중쇄;
    (b) Fc 영역의 한 쇄;
    (c) IL-2 모이어티
    를 포함하고,
    제2 중쇄가 N-말단에서 C-말단으로:
    (d) Fab의 중쇄; 및
    (e) Fc 영역의 다른 쇄
    를 포함하고,
    2개의 경쇄가 각각 Fab의 경쇄를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  20. 제16항에 있어서,
    2개의 쇄를 포함하고, 여기서
    항원-결합 모이어티가 VHH이고,
    제1 쇄가 N-말단에서 C-말단으로:
    (a) VHH;
    (b) Fc 영역의 한 쇄; 및
    (c) IL-2 모이어티
    를 포함하고,
    제2 쇄가 N-말단에서 C-말단으로:
    (e) VHH; 및
    (f) Fc 영역의 다른 쇄
    를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  21. 제16항에 있어서,
    2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, 여기서
    항원-결합 모이어티가 Fab이고,
    2개의 중쇄가 각각 N-말단에서 C-말단으로 또는 C-말단에서 N-말단으로:
    (a) Fab의 중쇄;
    (b) Fc 영역의 한 쇄; 및
    (c) 하나의 IL-2 모이어티
    를 포함하고,
    2개의 경쇄가 각각 Fab의 경쇄를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  22. 제16항에 있어서,
    2개의 쇄를 포함하고, 여기서
    항원-결합 모이어티가 VHH 또는 scFv이고,
    각 쇄가 N-말단에서 C-말단으로 또는 C-말단에서 N-말단으로:
    (a) VHH 또는 scFv;
    (b) Fc 영역의 한 쇄; 및
    (d) 하나의 IL-2 모이어티
    를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 모이어티가 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIM4, 4-1BB, OX-40, OX-40L, GITR, A2aR, TIGIT, CD96, PVRIG, CD226, 5T4, VISTA, VSIG3, VSIG4, ICOS, CD28, CD3, CD4, CD8, CD45, CD44v6, CD27, CD47, SIRPAα, SLAMF7, CD24, Siglec10, Siglec15, Siglec8, VSIR, VSIG4, PSGL-1, C5AR1, BTN1A1, BTN3A1, CD70, RANKL, CSF1R, CSF2RB, TNFRSF1/1a/1b, BDCA2, BTLA, C5aR, N㎏2A, N㎏2D, NKp30, NKp46, CD16a, CD56, CD166, FCGR3, CD2, 뉴로필린-1, CCR8, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, GCGR, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CALCRL, ETAR, GLP1R, CX3CR1, GPR1, GPR17, GPR20, GPR30, GPR34, GPR-65, GPCR78, GPRC5D, GPR84, LGR4, LGR5, VEGF, VEGFR, HER2, HER3, Trop2, pCAD, ERα, EGFR, de2-7 EGFR, EGFRvIII, PSMA, PSCA, PSA, TAG-72, SEZ6, SEZ6L, SEZ6L2, SEMA4D, DLL3, GD2, GPC3, KLB, KLRB1, KLRG1, GPC1, PCSK9, EpCAM, p-카데린, Caludin 6, Caludin 18.2, FGFR2b, FGFR3, FGFR4, MUC1, MUC13, MUC16, MUC17, MUCL3, FolRa, TfR, TF, TFR, TFPI, c-Met, NY-ESO-1, GUCY2C, LIV-1, 인테그린 αvβ6, 인테그린 α10β1, 인테그린 α3, 인테그린 α5β4, 인테그린 αvβ3, 인테그린 αvβ8, ROR1, ROR2, PRLR, PTK7, B7-H3, 넥틴-4, NetG1, Ax1, CD147, LRRC15, Napi2b, STEAP1, LY6G6D, LYPD1, MACRO, MerTK, MICA, MICB, MSLN, Mkars, G12D, CDH3, CDH6, CDH17, APLA2, CAIX, CD46, CD47, CLDN6, EphA3, 푸코실-GM1, ITGA3, 칼리크레인, MISRII, 포도칼릭신, RON, ROBO1, PAUF, PLA2, 포도칼릭신, PRLR, PTK7, TM4SF1, TMEFF2, TREAKR, TREM-1, TREM-2, uPARAP, TYRP1, KAAG1, RU2AS, CD146, CD63, 엔도글린, Globo H, IGF-1R, TEM1, TEM8, TAX1BP3, ADAM-9, ENPP3, EphA2, EphA3, FcRH5, NaPi3b, TWEAK, DLK1, SORT1, SSTR2, STEAP1, CD25, CD39, GARP, LRRC33, LAIR1, LAMP3, LAP, LEPR, LILRB1, LILRB2, LILRB4, RAGE, FGL1, TPBG, PDGFRB, TGFBR2, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, 암태아 항원(CEA), ICAM1, A33, CAMPATH-1(CDw52), 카보안하이드라제 IX(MN/CA IX), CD248, PDPN, ITGB1, ITGAV, CD20, CD19, CD21, CD22, CLL, BCMA, DCLK1, DDR1, DLK1, DPEP3, DKK1, CD5, CD13, CD30, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD43, CD52, CD55, CD94, CD99, CD7, CD71, CD73, CD74, CD79a, CD79b, CD229, CD132, CD133, G250, CSF1R(CD115), HLA-DR, HLA-G, HTRA1, TRA-1-60, IGFR, IL-2 수용체, MCSP(흑색종(Melanoma)-관련 세포 표면 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸), ART1, ASGR1, B7H3, B7-H4, B7H6, CD124, c-Kit (CD117), CD7, Clex12A, Clever-1, IL-13RA2, IL-11RA, IL-31RA, IL-4RA, IFNAR, ActRIIb, IL-7R, SLAMF7, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT-3, CD135), GFRA1, BTLA, GloboH, CSF2RB, 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4, 흑색종-관련 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸), ITGA4, Clec5a, Clec7a, Clec9a, Clec12a, CLEC14, CD205, CD206, CD200R1, CD228, CD229, CD40, CD40L, FcRn, TLR8, TLR9, TNFR2, LTBR, CD44, CD93, PDGF, PDGFR-알파(CD140a), PDGFR-베타(CD140b), CD146, CD147, CRTH2, TNF-α, TGF-β, IL1RAcP, TSLP, DR5, ST2, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), CDCP1, Derlin1, 테나신, 프리즐드 1-10, 혈관 항원 VEGFR2(KDR/FLK1), VEGFR3(FLT4, CD309), 엔도겔린, Tie2 및 다른 TAA, I/O 체크포인트, 종양 미세환경 표적, 또는 자가면역 및 염증성 질환 관련 표적 중에서 선택된 표적 항원(target antigen)에 특이적으로 결합하는, 폴리펩티드 복합체.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-2 모이어티와 Fc 영역 사이 및/또는 항원-결합 모이어티와 Fc 영역 사이에 힌지 영역(hinge region)을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  25. 제24항에 있어서,
    힌지 영역이 면역글로불린 힌지 영역과 비교하여, N-말단 또는 C-말단으로부터 1 내지 10개 아미노산의 절두(truncation), 예를 들어 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산(들)의 절두를 갖는, 폴리펩티드 복합체.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-2 모이어티와 Fc 영역 사이 및/또는 항원-결합 모이어티와 Fc 영역 사이에 링커(linker)를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  27. 제26항에 있어서,
    링커가 n=0-5인 (G4S)n 링커인, 폴리펩티드 복합체.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG4 또는 그래프팅된(grafted) Fc 영역인, 폴리펩티드 복합체.
  29. 제16항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역이 이종이량체화(heterodimerization) 또는 동종이량체화를 촉진하거나, 반감기를 변화시키거나, 또는 N-글리코실화를 제거하기 위해, 야생형 인간 Fc와 비교하여 하나 이상의 치환을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  30. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역이 IgG1 Fc 영역이고 임의로 LALA 돌연변이를 갖는, 폴리펩티드 복합체.
  31. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역이 IgG4 Fc 영역이고, 선택적으로 FALA 또는 S228P 돌연변이를 갖는, 폴리펩티드 복합체.
  32. 제16항 및 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 62-129에 제시된 아미노산 서열 및 적어도 95% 동일성을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄;
    (b) 서열번호 131-133에 제시된 아미노산 서열 및 적어도 95% 동일성을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및
    (c) 서열번호 134에 제시된 아미노산 서열 및 적어도 95% 동일성을 갖는 이의 상동성 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
  33. 단리된 핵산 분자로서, 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  34. 제33항의 핵산 분자를 포함하는 벡터(vector).
  35. 제34항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  36. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  37. 화학요법제, 방사성 입자 또는 독소와 같은 제제(agent)에 접합된(conjugated), 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 IL-2 변이체, 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체를 포함하는 면역접합체.
  38. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체를 생산하기 위한 방법으로서,
    - 폴리펩티드 복합체의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포에서 융합 단백질 또는 폴리펩티드 복합체를 발현시키는 단계; 및
    - 숙주 세포 배양물로부터 융합 단백질 또는 폴리펩티드 복합체를 단리하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  39. 대상체(subject)에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체 또는 제46항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 선택적으로 면역 반응이 NK 세포, CD8+ 세포 또는 CD4+T 세포(특히 Treg) 관련되는, 방법.
  40. 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의, 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체 또는 제36항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    추가적인 항-종양 요법, 예를 들어 종양-침윤 림프구(TIL) 요법, T 세포 수용체(TCR) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법, 대식세포 요법, 및 NK 세포 요법을 포함하는 세포 면역요법, 표적화된 요법, 화학요법 및 유전자 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    암이 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 결장암(colon cancer), 난소암(ovarian cancer), 흑색종(melanoma), 방광암(bladder cancer), 신세포암종(renal cell carcinoma), 간암(liver cancer), 전립선암(prostate cancer), 위암(stomach cancer), 췌장암(pancreatic cancer), NSCLC, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma) 및 다발성 골수종(multiple myeloma) 중에서 선택되는, 방법.
  43. 대상체에서 자가면역(autoimmune) 및 염증성(inflammatory) 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의, 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체 또는 제36항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    자가면역 및 염증성 질환이 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신홍반성루푸스(systemic lupus erythematosus), 재생 불량성 빈혈(aplastic anemia), 체강 질환(coeliac disease), 1형 당뇨병(type 1 diabetes), 그레이브스병(graves' disease), 건선(psoriasis), 피부경화증(scleroderma) 중에서 선택되는, 방법.
  45. 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체의 용도.
  46. 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체.
  47. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제16항 내지 제32항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 복합체 또는 제37항의 면역접합체를 포함하는 용기(container)를 포함하는, 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 치료 또는 진단을 위한 키트(kit).
KR1020247011132A 2021-09-26 2022-09-26 Il-2 변이체 및 이의 융합 단백질 KR20240067081A (ko)

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