CN117750971A - 治疗或预防自身免疫病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码包含T细胞表位和氧化还原酶基序的免疫原性肽的非免疫原性mRNA，及其在对象中治疗和/或预防例如1型糖尿病(T1D)、多发性硬化(MS)、视神经脊髓炎(NMO)或类风湿性关节炎(RA)中的用途。

Description

治疗或预防自身免疫病的方法
技术领域
本发明属于医学领域，并且提供了利用编码肽的非免疫原性mRNA来治疗自身免疫病的方法，所述肽包含自身抗原的T细胞表位和氧化还原酶基序。
背景技术
已经描述了数种策略来防止产生针对抗原的不期望的免疫应答。WO2008/017517描述了使用包含氧化还原酶基序和给定抗原蛋白质的MHC II类表位的肽的新策略。这些肽将CD4+T细胞转化成具有溶细胞特性的细胞类型，称为溶细胞性CD4+T细胞(cCD4)。这些细胞能够通过触发凋亡来杀伤呈递该肽所源自的抗原的那些抗原呈递细胞(antigenpresenting cell，APC)。WO2008/017517证明了用于变态反应和自身免疫病(例如I型糖尿病)的这一概念。在此，胰岛素可用作自身抗原。
WO2009101207和Carlier et al.(2012)Plos one 7，10 e45366更详细地进一步描述了抗原特异性溶细胞性细胞。
WO2016059236、WO2020099356和WO2020099352公开了包含不同改进类型的氧化还原酶基序的经修饰肽。
除包含变应原或抗原的MHC II类表位的肽之外，WO2012069568还公开了使用NKT细胞表位、结合CD1d受体以及导致已显示以抗原特异性方式消除呈递所述特异性抗原的APC的溶细胞性抗原特异性NKT细胞活化的可能性。
WO2018188730公开了用于治疗自身免疫病的非免疫原性RNA。
为了提高使用包含抗原的T细胞表位和氧化还原酶基序的肽的治疗效力，继续寻求施用这样的肽的新方法。
发明内容
本发明提供了施用包含抗原的T细胞表位和氧化还原酶基序的肽的新方式，特别是用于治疗自身免疫病。本发明人已发现，除了施用肽本身之外，还可以向患有例如自身免疫病的患者施用编码所述肽的非免疫原性RNA。这是出乎意料的，因为根据关于施用编码疾病相关自身抗原的非免疫原性mRNA以在小鼠中治疗自身免疫病如实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental auto-immune encephalomyelitis，EAE)的文献(综述于例如Wardelland Levings 2021，Nature Biotechnology第39卷，第419-421页)，后者通过诱导调节性T细胞(Treg)来诱导免疫抑制，而氧化还原表位融合肽被认为是通过产生抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞(cCD4)来杀伤表达所述抗原的抗原呈递细胞(APC)并由此抑制针对所述抗原的免疫应答而发挥作用。因此，出人意料地发现，当使用非免疫原性mRNA递送时，也可以诱导所述溶细胞性T细胞应答。Treg的活化或诱导cCD4细胞群确实是免疫系统中完全不同的耐受途径。此外，在比较性的MOG诱导的小鼠EAE模型系统实验中，在该实验中一方面使用编码已知通过Treg诱导来诱导免疫抑制的MOG自身抗原片段的非免疫原性mRNA，并且另一方面使用编码与氧化还原酶基序融合的所述相同MOG自身抗原片段的非免疫原性mRNA，后者对临床EAE表现具有提高的降低作用。而且，这是出乎意料的，因为不能确定氧化还原酶基序在体内翻译之后将会达到与在体内作为融合肽施用时相同的作用。
因此，本发明人提供了使用编码包含与抗原的T细胞表位连接的氧化还原酶基序的融合肽的非免疫原性mRNA来降低针对所述抗原的免疫应答的概念验证。
因此，本发明涉及以下方面：
1.在对象中治疗或预防选自以下的疾病或病症的方法：自身免疫病、胞内病原体的感染、肿瘤、同种异体移植排斥，或者针对可溶性同种因子、针对变应原暴露或针对用于基因治疗或基因疫苗接种的病毒载体的免疫应答，所述方法包括向对象施用编码肽的非免疫原性RNA，所述肽包含：a)氧化还原酶基序；
b)与所述疾病或病症相关的抗原蛋白质的T细胞表位；和
c)在a)与b)之间的0至7个氨基酸的接头，优选0至4个氨基酸的接头；
其中所述氧化还原酶基序a)具有以下一般结构：
Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-；
其中Z为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，更优选选自包含以下的组：K、H、R和非天然碱性氨基酸，优选K或H；其中m是选自包含以下的组的整数：1、0或2；其中X为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，更优选选自包含以下的组：K、H、R和非天然碱性氨基酸，优选R；其中n是选自0至6、优选0至3的整数，最优选2；其中在本文中公开的所有一般结构中，所述氧化还原酶基序中的连字符(-)表示氧化还原酶基序与接头或T细胞表位的N端末端、或者与接头或T细胞表位的C端末端的连接点。
2.在对象中诱导溶细胞性CD4+T细胞的方法，其包括向对象施用编码肽的非免疫原性RNA，所述肽包含：
a)氧化还原酶基序；
b)与所述疾病相关的抗原蛋白质的T细胞表位；和
c)在a)与b)之间的0至7个氨基酸的接头，优选0至4个氨基酸的接头；
其中所述氧化还原酶基序a)具有以下一般结构：
Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-；
其中Z为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，更优选选自包含以下的组：K、H、R和非天然碱性氨基酸，优选K或H；其中m是选自包含以下的组的整数：1、0或2；其中X为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，更优选选自包含以下的组：K、H、R和非天然碱性氨基酸，优选R；其中n是选自0至6、优选0至3的整数，最优选其中n是2；
其中在本文中公开的所有一般结构中，所述氧化还原酶基序中的连字符(-)表示氧化还原酶基序与接头或表位的N端末端、或者与接头或T细胞表位的C端末端的连接点。
在任一实施方案中，倾向于mRNA翻译机制，通常在用于产生mRNA的DNA编码序列的5’末端包含另外的起始密码子(atg)，因此向本文中公开的编码肽添加了甲硫氨酸(M)残基。在一些情况下，所述甲硫氨酸残基可由于肽的加工而在体内被切除。
在任一实施方案中，由根据本发明的非免疫原性RNA编码的肽对肽或蛋白质的二硫键具有还原活性。
3.方面2所述的方法，其中所述对象患有自身免疫病。
4.方面1或3所述的方法，其中所述自身免疫病选自包含以下的组：1型糖尿病(type-1diabetes，T1D)、脱髓鞘病症例如多发性硬化(multiple sclerosis，MS)或视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)，或者类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)。
优选地，所述抗原蛋白质是自身抗原、变应原、可溶性同种因子、由移植物脱落的同种抗原、胞内病原体的抗原、用于基因治疗或基因疫苗接种的病毒载体的抗原、肿瘤相关抗原或变应原。
示例性抗原可以是：
-在MS情况下，髓鞘抗原、神经元抗原和星形胶质细胞来源的抗原，例如：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)、髓鞘碱性蛋白(myelinbasic protein，MBP)、蛋白脂质蛋白(proteolipid protein，PLP)、少突胶质细胞特异性蛋白(oligodendrocyte-specific protein，OSP)、髓鞘相关抗原(myelin-associatedantigen，MAG)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(myelin-associated oligodendrocytebasic protein，MOBP)以及2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶(2，3′-cyclic-nucleotide 3′-phosphodiesterase，CNPase)、S100β蛋白或转醛醇酶H自身抗原(Riedhammer andWeissert，2015；Front Immunol.2015；6：322)，优选MOG、MBP、PLP和MOBP。。
-在哮喘的情况下，变应原，例如来源于花粉、芽孢、尘螨和宠物毛屑的那些。
-在癌症的情况下，肿瘤或癌症相关抗原，例如癌基因、原癌基因、病毒蛋白、存活因子或者克隆型或独特型决定簇。一些具体实例是：示出了在MHC I类决定簇的背景下由肿瘤细胞自发表达并且同样地由CD8+溶细胞性T细胞识别的MAGE(黑素瘤相关基因)产物。然而，MAGE来源的抗原，例如MAGE-3，也在已从黑素瘤患者中克隆的CD4+特异性T细胞和MHCII类决定簇中表达(Schutz et al.(2000)Cancer Research 60：6272-6275；Schuler-Thumer et al.(2002)J.Exp.Med.195：1279-1288)。由MHC II类决定簇呈递的肽是本领域已知的。其他一些实例包括由P815肥大细胞瘤和黑素瘤细胞表达的gp100抗原(Lapointe(2001；J.Immunol.167：4758-4764；Cochlovius et al.(1999)Int.J.Cancer，83：547-554)。原癌基因包括许多优先在肿瘤细胞中表达而在健康组织中仅最小地表达的多肽和蛋白质。细胞周期蛋白D1是参与G1至S的转变的细胞周期调节因子。细胞周期蛋白D1的高表达已在肾细胞癌、甲状旁腺癌和多发性骨髓瘤中被证实。存活蛋白是抑制凋亡从而赋予存活蛋白表达细胞扩增优势的因子的一个实例。包含第198至212位残基的肽已显示携带在MHCII类决定簇的背景下被识别的T细胞表位(Dengiel et al.(2004)Eur.J.of Immunol.34：3644-3651)。存活蛋白是抑制凋亡从而赋予存活蛋白表达细胞扩增优势的因子的一个实例。存活蛋白在上皮和造血起源的人癌症中异常表达，并且在除了胸腺、睾丸和胎盘之外的健康成人组织中以及在经生长激素刺激的造血祖细胞和内皮细胞中不表达。令人感兴趣的是，在黑素瘤患者的血液中可检测到存活蛋白特异性CD8+T细胞。存活蛋白由广泛多种恶性细胞系包括肾癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤表达，但也在急性髓性白血病以及急性和慢性淋巴性白血病中表达(Schmidt(2003)Blood 102：571-576)。关于凋亡的抑制剂的另一些实例是Bcl2和spi6。独特型决定簇由滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤和一些形式的白血病中的B细胞呈递，以及由T细胞淋巴瘤和一些T细胞白血病呈递。独特型决定簇是B细胞受体(B cellreceptor，BCR)或T细胞受体(T cell receptor，TCR)的抗原特异性受体的一部分。这样的决定簇基本上由受体的高变区编码，所述高变区对应于B细胞中VH或VL区的互补决定区(complementarity-determining region，CDR)，或者T细胞中β链的CDR3。由于受体是由基因的随机重排产生的，因此其对各个体都是独特的。来源于独特型决定簇的肽存在于MHCII类决定簇中(Baskar et al.(2004)J.Clin.Invest.113：1498-1510)。一些肿瘤与病毒来源抗原的表达相关。因此，一些形式的霍奇金病(Hodgkin disease)表达来自EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)的抗原。这样的抗原在I类和II类决定簇二者中均有表达。对EBV抗原具有特异性的CD8+溶细胞性T细胞可以消除霍奇金淋巴瘤细胞(Bollard et al.(2004)J.Exp.Med.200：1623-1633)。抗原决定簇例如LMP-1和LMP-2由MHC II类决定簇呈递。
-在移植排斥的情况下，移植特异性抗原，其将明显取决于被移植的组织或器官的类型。一些实例可以是：组织，例如角膜、皮肤、骨(骨碎片)、血管或筋膜；器官，例如肾、心脏、肝、肺、胰腺或肠；或者甚至单独的细胞，例如胰岛细胞、α细胞、β细胞、肌细胞、软骨细胞、心脏细胞、脑细胞、血细胞、骨髓细胞、肾细胞和肝细胞。参与移植排斥的一些特定示例性抗原是次要组织相容性抗原、主要组织相容性抗原或组织特异性抗原。当同种抗原蛋白质是主要组织相容性抗原时，其是MHC I类抗原或MHC II类抗原。要记住的重要点是同种抗原特异性T细胞识别APC表面处同源肽的机制的可变性。同种反应性T细胞可识别MHC分子本身的同种抗原决定簇、与自体或同种异体来源的MHC分子结合的同种抗原肽、或者位于同种抗原来源的肽和MHC分子(后者是自体或同种异体起源的)内的残基的组合。次要组织相容性抗原的一些实例是来源于由HY染色体编码的蛋白质(H-Y抗原)的那些，例如Dby。另一些实例可见于例如Goulmy E，Current Opinion in Immunology，第8卷，75-81，1996(特别地参见其中的表3)。必须注意的是，人中的许多次要组织相容性抗原是通过使用溶细胞性CD8+T细胞将其呈递到MHC I类决定簇中而被检测到的。然而，这样的肽是通过加工也包含MHCII类限制性T细胞表位的蛋白质而获得的，从而提供了设计本发明肽的可行性。组织特异性同种抗原可使用相同的操作来鉴定。这方面的一个实例是来源于在肾中表达但在脾中不表达的蛋白质并且能够引发对肾细胞具有细胞毒性活性的CD8+T细胞的MHC I类限制性表位(Poindexter et al，Journal of Immunology，154：3880-3887，1995)。
更优选地，所述抗原蛋白质是涉及1型糖尿病(T1D)、脱髓鞘病症例如多发性硬化(MS)或视神经脊髓炎(NMO)或者类风湿性关节炎(RA)的自身抗原。
涉及T1D的自身抗原的一些非限制性实例。
来源：Mallone R et al.，Clin Dev Immunol.2011：513210.
涉及MS的自身抗原的一些非限制性实例。
涉及RA的自身抗原的一些非限制性实例。
自身抗原 UniProtKB标识符
GRP78 P11021
HSP60 P10809
60kDa伴侣蛋白2 P9WPE7
凝溶胶蛋白 P06396
壳多糖酶3样蛋白1 P36222
组织蛋白酶S P25774
血清白蛋白 P02768
组织蛋白酶D P07339
涉及NMO的自身抗原的一些非限制性实例。
5.方面1至4中任一项所述的方法，其中所述非免疫原性RNA通过并入经修饰核苷酸并去除dsRNA而成为非免疫原性的。
6.方面5所述的方法，其中所述经修饰核苷酸抑制RNA介导的固有免疫受体活化。
7.方面5或6所述的方法，其中所述经修饰核苷酸包含用包含经修饰核碱基的核苷对一个或更多个尿苷的替换。
8.方面7所述的方法，其中所述经修饰核碱基是经修饰尿嘧啶。
9.方面7或8所述的方法，其中所述包含经修饰核碱基的核苷选自：3-甲基尿苷(m3U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-氮杂尿苷、6-氮杂尿苷、2-硫代-5-氮杂尿苷、2-硫代尿苷(s2U)、4-硫代尿苷(s4U)、4-硫代假尿苷、2-硫代假尿苷、5-羟基尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基尿苷、5-卤代尿苷(例如，5-碘代尿苷或5-溴代尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基尿苷(cm5U)、1-羧甲基假尿苷、5-羧基羟甲基尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷(mcm5s2U)、5-氨甲基-2-硫代尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨甲基尿苷(mnm5U)、1-乙基假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨甲基-2-硒尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰甲基尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨甲基尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基尿苷、1-丙炔基假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代假尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基假尿苷、3-甲基假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-脱氮假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基二氢尿苷(m5D)、2-硫代二氢尿苷、2-硫代二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代尿苷、4-甲氧基假尿苷、4-甲氧基-2-硫代假尿苷、N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代尿苷(inm5s2U)、α-硫代尿苷、2′-O-甲基尿苷(Um)、5，2′-O-二甲基尿苷(m5Um)、2′-O-甲基假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰甲基-2′-O-甲基尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨甲基-2′-O-甲基尿苷(cmnm5Um)、3，2′-O-二甲基尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2′-O-甲基尿苷(inm5Um)、1-硫代尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖尿苷、5-(2-甲酯基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
10.方面7至9中任一项所述的方法，其中所述包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5U)
11.方面7至10中任一项所述的方法，其中所述包含经修饰核碱基的核苷是N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)。
12.方面1至11中任一项所述的方法，其中所述非免疫原性RNA是mRNA。
13.方面1至12中任一项所述的方法，其中所述非免疫原性RNA是体外转录的RNA。
14.方面1至13中任一项所述的方法，其中所述非免疫原性RNA在所述对象的细胞中瞬时表达。
15.方面1至14中任一项所述的方法，其中所述非免疫原性RNA被递送至树突细胞。
16.方面15所述的方法，其中所述树突细胞是未成熟的树突细胞。
17.方面1至16中任一项所述的方法，其中所述非免疫原性RNA配制在递送载剂中。
18.方面17所述的方法，其中所述递送载剂包含颗粒。
19.方面17或18所述的方法，其中所述递送载剂包含脂质。
20.方面19所述的方法，其中所述脂质包含阳离子脂质。
21.方面19或20所述的方法，其中所述脂质与所述非免疫原性RNA形成复合物和/或包封所述非免疫原性RNA。
22.方面1至21中任一项所述的方法，其中所述非免疫原性RNA配制在脂质体中。
23.方面1至22中任一项所述的方法，其中所述氧化还原酶基序选自以下的氨基酸基序：
(a)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，
其中n是0，并且其中m是选自0、1或2的整数，
其中Z是优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，更优选K或H，最优选K。这样的基序的一些非限制性优选实例是KCC，KKCC(SEQ ID NO：6)，RCC，RRCC(SEQ ID NO：7)，RKCC(SEQ ID NO：8)，或KRCC(SEQ ID NO：9)；
(b)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，
其中n是1，其中X为任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和非天然碱性氨基酸例如L-鸟氨酸，更优选K或R，
其中m是选自0、1或2的整数，
其中Z是优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，更优选K或H，最优选K。这样的基序的一些非限制性优选实例是KCXC(SEQID NO：10)，KKCXC(SEQ ID NO：11)，RCXC(SEQ ID NO：12)，RRCXC(SEQ ID NO：13)，RKCXC(SEQ ID NO：14)，KRCXC(SEQ ID NO：15)，KCKC(SEQ ID NO：16)，KKCKC(SEQ ID NO：17)，KCRC(SEQ ID NO：18)，KKCRC(SEQ ID NO：19)，RCRC(SEQ ID NO：20)，RRCRC(SEQ ID NO：21)，RKCKC(SEQ ID NO：22)，KRCKC(SEQ ID NO：23)；
(c)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是2，从而在氧化还原酶基序内产生内部X1X2氨基酸偶联物，其中X为任意氨基酸，优选地其中至少一个X是选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和非天然碱性氨基酸例如L-鸟氨酸，更优选K或R，
其中m是选自0、1或2的整数，
其中Z是优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，更优选K或H，最优选K。在这些基序中，内部X1X2氨基酸偶联物位于氧化还原酶基序内，其中m是选自0至3的整数，其中Z为任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。优选的是其中m是1或2且Z是选自以下的碱性氨基酸的基序：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。X1和X2各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1和X2是除C、S或T之外的任何氨基酸。在另一个实例中，所述基序中的X1或X2中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸。在基序的另一个实例中，所述基序中的X1或X2中的至少一个是P或Y。氧化还原酶基序内的内部X1X2氨基酸偶联物的一些具体非限制性实例：PY，HY，KY，RY，PH，PK，PR，HG，KG，RG，HH，HK，HR，GP，HP，KP，RP，GH，GK，GR，GH，KH，和RH。这种形式的一些特别优选的基序是[CST]XXC或CXX[CST](SEQ ID NO：1或2)，HCPYC，KHCPYC，KCPYC，RCPYC，HCGHC，KCGHC，和RCGHC(对应于SEQ IDNO：24至30)。这种形式的一些替代优选基序是KKCPYC，KRCPYC，KHCGHC，KKCGHC，和KRCGHC(SEQ ID NO：31至35)；
(d)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是3，从而在氧化还原酶基序内产生内部X1X2X3氨基酸段(amino acid stretch)，其中X为任意氨基酸，优选地其中至少一个X是选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和非天然碱性氨基酸例如L-鸟氨酸，更优选K或R，
其中m是选自0、1或2的整数，
其中Z是优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，更优选K或H。优选的是其中m是1或2且Z是选自以下的碱性氨基酸的基序：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。在某些实例中，X1、X2和X3各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2和X3是除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体的实施方案中，所述基序中的X1、X2或X3中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的一些具体实例是：XPY，PXY，和PYX，其中X可以为任意氨基酸，优选碱性氨基酸例如K、R或H，或非天然碱性氨基酸例如L-鸟氨酸。一些非限制性实例包括KPY，RPY，HPY，GPY，APY，VPY，LPY，IPY，MPY，FPY，WPY，PPY，SPY，TPY，CPY，YPY，NPY，QPY，DPY，EPY，KPY，PKY，PRY，PHY，PGY，PAY，PVY，PLY，PIY，PMY，PFY，PWY，PPY，PSY，PTY，PCY，PYY，PNY，PQY，PDY，PEY，PLY，PYK，PYR，PYH，PYG，PYA，PYV，PYL，PYI，PYM，PYF，PYW，PYP，PYS，PYT，PYC，PYY，PYN，PYQ，PYD，或PYE。
氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的一些替代实例是XHG，HXG，和HGX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KHG，RHG，HHG，GHG，AHG，VHG，LHG，IHG，MHG，FHG，WHG，PHG，SHG，THG，CHG，YHG，NHG，QHG，DHG，EHG，和KHG，HKG，HRG，HHG，HGG，HAG，HVG，HLG，HIG，HMG，HFG，HWG，HPG，HSG，HTG，HCG，HYG，HNG，HQG，HDG，HEG，HLG，HGK，HGR，HGH，HGG，HGA，HGV，HGL，HGI，HGM，HGF，HGW，HGP，HGS，HGT，HGC，HGY，HGN，HGQ，HGD，或HGE中。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的又一些替代实例是XGP，GXP，和GPX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KGP，RGP，HGP，GGP，AGP，VGP，LGP，IGP，MGP，FGP，WGP，PGP，SGP，TGP，CGP，YGP，NGP，QGP，DGP，EGP，KGP，GKP，GRP，GHP，GGP，GAP，GVP，GLP，GIP，GMP，GFP，GWP，GPP，GSP，GTP，GCP，GYP，GNP，GQP，GDP，GEP，GLP，GPK，GPR，GPH，GPG，GPA，GPV，GPL，GPI，GPM，GPF，GPW，GPP，GPS，GPT，GPC，GPY，GPN，GPQ，GPD，或GPE中。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的又一些替代实例是XGH，GXH，和GHX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KGH，RGH，HGH，GGH，AGH，VGH，LGH，IGH，MGH，FGH，WGH，PGH，SGH，TGH，CGH，YGH，NGH，QGH，DGH，EGH，KGH，GKH，GRH，GHH，GGH，GAH，GVH，GLH，GIH，GMH，GFH，GWH，GPH，GSH，GTH，GCH，GYH，GNH，GQH，GDH，GEH，GLH，GHK，GHR，GHH，GHG，GHA，GHV，GHL，GHI，GHM，GHF，GHW，GHP，GHS，GHT，GHC，GHY，GHN，GHQ，GHD，或GHE中。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的又一替代实例是XGF，GXF，和GFX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KGF，RGF，HGF，GGF，AGF，VGF，LGF，IGF，MGF，FGF，WGF，PGF，SGF，TGF，CGF，YGF，NGF，QGF，DGF，EGF，和KGF，GKF，GRF，GHF，GGF，GAF，GVF，GLF，GIF，GMF，GFF，GWF，GPF，GSF，GTF，GCF，GYF，GNF，GQF，GDF，GEF，GLF，GFK，GFR，GFH，GFG，GFA，GFV，GFL，GFI，GFM，GFF，GFW，GFP，GFS，GFT，GFC，GFY，GFN，GFQ，GFD，或GFE中。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的又一替代实例是XRL，RXL，和RLX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KRL，RRL，HRL，GRL，ARL，VRL，LRL，IRL，MRL，FRL，WRL，PRL，SRL，TRL，CRL，YRL，NRL，QRLRL，DRL，ERL，KRL，GKF，GRF，GHF，GGF，GAF，GVF，GLF，GIF，GMF，GFF，GWF，GPF，GSF，GTF，GCF，GYF，GNF，GQF，GDF，GEF，和GLF，RLK，RLR，RLH，RLG，RLA，RLV，RLL，RLI，RLM，RLF，RLW，RLP，RLS，RLT，RLC，RLY，RLN，RLQ，RLD，或RLE中。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的又一替代实例是XHP，HXP，和HPX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KHP，RHP，HHP，GHP，AHP，VHP，LHP，IHP，MHP，FHP，WHP，PHP，SHP，THP，CHP，YHP，NHP，QHP，DHP，EHP，KHP，HKP，HRP，HHP，HGP，HAF，HVF，HLF，HIF，HMF，HFF，HWF，HPF，HSF，HTF，HCF，HYP，HNF，HQF，HDF，HEF，HLP，HPK，HPR，HPH，HPG，HPA，HPV，HPL，HPI，HPM，HPF，HPW，HPP，HPS，HPT，HPC，HPY，HPN，HPQ，HPD，或HPE中。
一些特别优选的实例是：CRPYC，KCRPYC，KHCRPYC，RCRPYC，HCRPYC，CPRYC，KCPRYC，RCPRYC，HCPRYC，CPYRC，KCPYRC，RCPYRC，HCPYRC，CKPYC，KCKPYC，RCKPYC，HCKPYC，CPKYC，KCPKYC，RCPKYC，HCPKYC，CPYKC，KCPYKC，RCPYKC，和HCPYKC(对应于SEQ ID NO：36至60)；
(e)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是4，从而在氧化还原酶基序内产生内部X1X2X3X4(SEQ ID NO：76)氨基酸段，其中m是选自0、1或2的整数，其中Z为任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H，最优选K。优选的是其中m是1或2且Z是选自以下的碱性氨基酸的基序：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。X1、X2、X3和X4各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或如本文中所限定的非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2、X3和X4是除C、S或T之外的任何氨基酸。在某些非限制性实例中，所述基序中的X1、X2、X3或X4中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。一些具体实例包括LAVL(SEQID NO：61)，TVQA(SEQ ID NO：62)或GAVH(SEQ ID NO：63)及其变体，例如：X1AVL，LX2VL，LAX3L，或LAVX4；X1VQA，TX2QA，TVX3A，或TVQX4；X1AVH，GX2VH，GAX3H，或GAVX4(对应于SEQ IDNO：64至75)；其中X1、X2、X3和X4各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸；
(f)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是5，从而在氧化还原酶基序内产生内部X1X2X3X4X5(SEQ ID NO：77)氨基酸段，其中m是选自0、1或2的整数，其中Z为任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H，最优选K。优选的是其中m是1或2且Z是选自以下的碱性氨基酸的基序：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。X1、X2、X3、X4和X5各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2、X3、X4和X5是除C、S或T之外的任何氨基酸。在某些实例中，所述基序中的X1、X2、X3、X4或X5中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。一些具体实例包括PAFPL(SEQ ID NO：78)或DQGGE(SEQ ID NO：79)及其变体，例如：X1AFPL，PX2FPL，PAX3PL，PAFX4L，或PAFPX5；X1QGGE，DX2GGE，DQX3GE，DQGX4E，或DQGGX5(对应于SEQ ID NO：80至89)，其中X1、X2、X3、X4和X5各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或如本文中所限定的非天然氨基酸；
(g)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是6，从而在氧化还原酶基序内产生内部X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：90)氨基酸段，其中m是选自0、1或2的整数，其中Z为任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H，最优选K。优选的是其中m是1或2且Z是选自以下的碱性氨基酸的基序：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。X1、X2、X3、X4、X5和X6各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2、X3、X4、X5和X6是除C、S或T之外的任何氨基酸。在某些实例中，所述基序中的X1、X2、X3、X4、X5或X6中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。一些具体实例包括DIADKY(SEQ IDNO：91)或其变体，例如：X1IADKY，DX2ADKY，DIX3DKY，DIAX4KY，DIADX5Y，或DIADKX6(对应于SEQID NO：92至97)，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸；或者
(h)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是0至6并且其中m是0，并且其中C或[CST]残基之一已被修饰以便在基序的氨基酸残基的N端酰胺上或在C端羧基上携带乙酰基、甲基、乙基或丙酰基。在这样的基序的一些优选实施方案中，n是2并且m是0，其中内部X1X2各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1和X2是除C、S或T之外的任何氨基酸。在另一个实例中，所述基序中的X1或X2中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸。在基序的另一个实例中，所述基序中的X1或X2中的至少一个是P或Y。氧化还原酶基序内的内部X1X2氨基酸偶联物的一些具体非限制性实例：PY，HY，KY，RY，PH，PK，PR，HG，KG，RG，HH，HK，HR，GP，HP，KP，RP，GH，GK，GR，GH，KH，和RH。优选地，所述修饰导致基序中第一半胱氨酸的N端乙酰化(N-乙酰基-半胱氨酸)。
25.根据方面1至24中任一项所述的方法，其中所述氧化还原酶基序的Xn部分包含序列PY，优选地其中所述氧化还原酶基序包含序列CPYC(SEQ ID NO：98)。
26.根据方面1至25中任一项所述的方法，其中所述氧化还原酶基序的氨基酸Z是选自由以下组成的氨基酸的组的碱性氨基酸：H、K、R和任何非天然碱性氨基酸，更优选选自以下的碱性氨基酸：H、K和R，最优选其中Z是H或K。
27.方面1至26中任一项所述的方法，其中所述免疫原性肽具有9至50个氨基酸、优选9至30个氨基酸的长度。
28.方面1至27中任一项所述的方法，其中所述氧化还原酶基序不天然存在于氨基酸序列中位于所述抗原蛋白质的T细胞表位的N端或C端11个氨基酸的区域内，和/或其中所述T细胞表位在其氨基酸序列中不天然包含所述氧化还原酶基序。
29.方面1至28中任一项所述的方法，其中所述抗原蛋白质选自：胰岛素(原)、GAD65、GAD67、IA-2(ICA512)、IA-2(β/phogrin)、IGRP、嗜铬粒蛋白、ZnT8和HSP-60，并且其中所述自身免疫病是1型糖尿病(T1D)。
30.方面1至28中任一项所述的方法，其中所述抗原蛋白质选自：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)和少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)，并且其中所述自身免疫病是多发性硬化(MS)和/或视神经脊髓炎(NMO)。
31.方面1至28中任一项所述的方法，其中所述抗原蛋白质选自：GRP78、HSP60、60kDa伴侣蛋白2、凝溶胶蛋白、壳多糖酶-3样蛋白1、组织蛋白酶S、血清白蛋白和组织蛋白酶D，并且其中所述自身免疫病是类风湿性关节炎(RA)。
32.方面1至28中任一项所述的方法，其中所述抗原蛋白质是肿瘤或癌抗原，例如：癌基因、原癌基因、病毒蛋白、存活因子或者克隆型或独特型决定簇，其中所述疾病是癌症。
33.编码肽的非免疫原性RNA，所述肽包含：
a)氧化还原酶基序；
b)抗原蛋白质的T细胞表位；和
c)在a)与b)之间的0至7个氨基酸的接头，优选0至4个氨基酸的接头；
其中所述氧化还原酶基序a)具有以下一般结构：Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]，其中Z为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，更优选选自包含以下的组：K、H、R和非天然碱性氨基酸，优选K或H，更优选K；其中m是选自包含以下的组的整数：1、0或2；
其中X为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，更优选选自包含以下的组：K、H、R和非天然碱性氨基酸，优选K或H，更优选R；
其中n是选自0至6、优选0至3的整数，最优选2；
其中所述氧化还原酶基序中的连字符(-)表示氧化还原酶基序与接头或T细胞表位的N端末端、或者与接头或T细胞表位的C端末端的连接点。
34.方面33所述的非免疫原性RNA，其中所述非免疫原性RNA通过并入经修饰核苷酸并去除dsRNA而成为非免疫原性的。
35.方面34所述的非免疫原性RNA，其中所述经修饰核苷酸抑制RNA介导的固有免疫受体活化。
36.方面34或35所述的非免疫原性RNA，其中所述经修饰核苷酸包含用包含经修饰核碱基的核苷对一个或更多个尿苷的替换。
37.方面36所述的非免疫原性RNA，其中所述经修饰核碱基是经修饰尿嘧啶。
38.方面36或37所述的非免疫原性RNA，其中所述包含经修饰核碱基的核苷选自：3-甲基尿苷(m3U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-氮杂尿苷、6-氮杂尿苷、2-硫代-5-氮杂尿苷、2-硫代尿苷(s2U)、4-硫代尿苷(s4U)、4-硫代假尿苷、2-硫代假尿苷、5-羟基尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基尿苷、5-卤代尿苷(例如，5-碘代尿苷或5-溴代尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基尿苷(cm5U)、1-羧甲基假尿苷、5-羧基羟甲基尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷(mcm5s2U)、5-氨甲基-2-硫代尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨甲基尿苷(mnm5U)、1-乙基假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨甲基-2-硒尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰甲基尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨甲基尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基尿苷、1-丙炔基假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代假尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基假尿苷、3-甲基假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-脱氮假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基二氢尿苷(m5D)、2-硫代二氢尿苷、2-硫代二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代尿苷、4-甲氧基假尿苷、4-甲氧基-2-硫代假尿苷、N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代尿苷(inm5s2U)、α-硫代尿苷、2′-O-甲基尿苷(Um)、5，2′-O-二甲基尿苷(m5Um)、2′-O-甲基假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰甲基-2′-O-甲基尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨甲基-2′-O-甲基尿苷(cmnm5Um)、3，2′-O-二甲基尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2′-O-甲基尿苷(inm5Um)、1-硫代尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖尿苷、5-(2-甲酯基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
39.方面33至38中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5U)。
40.方面33至39中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述包含经修饰核碱基的核苷是N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)。
41.方面33至40中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述非免疫原性RNA是mRNA。
42.方面33至41中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述非免疫原性RNA是体外转录的RNA。
43.方面33至42中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述非免疫原性RNA在施用药物组合物的对象的细胞中瞬时表达。
44.方面33至43中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述非免疫原性RNA被递送至施用所述药物组合物的对象的树突细胞。
45.方面44所述的非免疫原性RNA，其中所述树突细胞是未成熟的树突细胞。
46.方面33至45中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述非免疫原性RNA配制在递送载剂中。
47.方面46所述的非免疫原性RNA，其中所述递送载剂包含颗粒。
48.方面46或47所述的非免疫原性RNA，其中所述递送载剂包含脂质。
49.方面48所述的非免疫原性RNA，其中所述脂质包含阳离子脂质。
50.方面48或49所述的非免疫原性RNA，其中所述脂质与所述非免疫原性RNA形成复合物和/或包封所述非免疫原性RNA。
51.方面33至50中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述非免疫原性RNA配制在脂质体中。
52.方面33至51中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述肽中的氧化还原酶基序选自以下氨基酸基序：
(a)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，
其中n是0(例如SEQ ID NO：733)，并且其中m是选自0、1或2的整数，
其中Z是优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，更优选K或H，最优选K。这样的基序的一些非限制性优选实例是KCC，KKCC(SEQ ID NO：6)，RCC，RRCC(SEQ ID NO：7)，RKCC(SEQ ID NO：8)，或KRCC(SEQ ID NO：9)；
(b)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，
其中n是1(例如SEQ ID No：734、750和751)，其中X为任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和非天然碱性氨基酸例如L-鸟氨酸，更优选K或R，
其中m是选自0、1或2的整数，
其中Z是优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，更优选K或H，最优选K。这样的基序的一些非限制性优选实例是KCXC(SEQID NO：10)，KKCXC(SEQ ID NO：11)，RCXC(SEQ ID NO：12)，RRCXC(SEQ ID NO：13)，RKCXC(SEQ ID NO：14)，KRCXC(SEQ ID NO：15)，KCKC(SEQ ID NO：16)，KKCKC(SEQ ID NO：17)，KCRC(SEQ ID NO：18)，KKCRC(SEQ ID NO：19)，RCRC(SEQ ID NO：20)，RRCRC(SEQ ID NO：21)，RKCKC(SEQ ID NO：22)，KRCKC(SEQ ID NO：23)；
(c)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是2(SEQ ID No：723、728、735、740、745、752、757和758)，从而在氧化还原酶基序内产生内部X1X2氨基酸偶联物，其中X为任意氨基酸，优选地其中至少一个X是选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和非天然碱性氨基酸例如L-鸟氨酸，更优选K或R，
其中m是选自0、1或2的整数，
其中Z是优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，更优选K或H，最优选K。这些基序，内部X1X2氨基酸偶联物位于氧化还原酶基序内，其中m是选自0至3的整数，其中Z为任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。优选的是其中m是1或2且Z是选自以下的碱性氨基酸的基序：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。X1和X2各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1和X2是除C、S或T之外的任何氨基酸。在另一个实例中，所述基序中的X1或X2中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸。在基序的另一个实例中，所述基序中的X1或X2中的至少一个是P或Y。氧化还原酶基序内的内部X1X2氨基酸偶联物的一些具体非限制性实例：PY，HY，KY，RY，PH，PK，PR，HG，KG，RG，HH，HK，HR，GP，HP，KP，RP，GH，GK，GR，GH，KH，和RH。这种形式的一些特别优选的基序是CPYC(SEQ ID NO：98)，HCPYC，KHCPYC，KCPYC，RCPYC，HCGHC，KCGHC，和RCGHC(对应于SEQ ID NO：24至30)。这种形式的一些替代优选基序是KKCPYC，KRCPYC，KHCGHC，KKCGHC，和KRCGHC(SEQ ID NO：31至35)；
(d)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是3(SEQ ID No：724、729、736、741、746、753、759和760)，从而在氧化还原酶基序内产生内部X1X2X3氨基酸段，其中X为任意氨基酸，优选地其中至少一个X是选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和非天然碱性氨基酸例如L-鸟氨酸，更优选K或R，
其中m是选自0、1或2的整数，
其中Z是优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，更优选K或H。优选的是其中m是1或2且Z是选自以下的碱性氨基酸的基序：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。在某些实例中，X1、X2和X3各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2和X3是除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体的实施方案中，所述基序中的X1、X2或X3中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的一些具体实例是：XPY，PXY，和PYX，其中X可以为任意氨基酸，优选碱性氨基酸例如K、R或H，或非天然碱性氨基酸例如L-鸟氨酸。非限制性实例包括KPY，RPY，HPY，GPY，APY，VPY，LPY，IPY，MPY，FPY，WPY，PPY，SPY，TPY，CPY，YPY，NPY，QPY，DPY，EPY，KPY，PKY，PRY，PHY，PGY，PAY，PVY，PLY，PIY，PMY，PFY，PWY，PPY，PSY，PTY，PCY，PYY，PNY，PQY，PDY，PEY，PLY，PYK，PYR，PYH，PYG，PYA，PYV，PYL，PYI，PYM，PYF，PYW，PYP，PYS，PYT，PYC，PYY，PYN，PYQ，PYD，或PYE。
氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的一些替代实例是XHG，HXG，和HGX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KHG，RHG，HHG，GHG，AHG，VHG，LHG，IHG，MHG，FHG，WHG，PHG，SHG，THG，CHG，YHG，NHG，QHG，DHG，EHG，和KHG，HKG，HRG，HHG，HGG，HAG，HVG，HLG，HIG，HMG，HFG，HWG，HPG，HSG，HTG，HCG，HYG，HNG，HQG，HDG，HEG，HLG，HGK，HGR，HGH，HGG，HGA，HGV，HGL，HGI，HGM，HGF，HGW，HGP，HGS，HGT，HGC，HGY，HGN，HGQ，HGD，或HGE中。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的又一些替代实例是XGP，GXP，和GPX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KGP，RGP，HGP，GGP，AGP，VGP，LGP，IGP，MGP，FGP，WGP，PGP，SGP，TGP，CGP，YGP，NGP，QGP，DGP，EGP，KGP，GKP，GRP，GHP，GGP，GAP，GVP，GLP，GIP，GMP，GFP，GWP，GPP，GSP，GTP，GCP，GYP，GNP，GQP，GDP，GEP，GLP，GPK，GPR，GPH，GPG，GPA，GPV，GPL，GPI，GPM，GPF，GPW，GPP，GPS，GPT，GPC，GPY，GPN，GPQ，GPD，或GPE中。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的又一些替代实例是XGH，GXH，和GHX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KGH，RGH，HGH，GGH，AGH，VGH，LGH，IGH，MGH，FGH，WGH，PGH，SGH，TGH，CGH，YGH，NGH，QGH，DGH，EGH，KGH，GKH，GRH，GHH，GGH，GAH，GVH，GLH，GIH，GMH，GFH，GWH，GPH，GSH，GTH，GCH，GYH，GNH，GQH，GDH，GEH，GLH，GHK，GHR，GHH，GHG，GHA，GHV，GHL，GHI，GHM，GHF，GHW，GHP，GHS，GHT，GHC，GHY，GHN，GHQ，GHD，或GHE中。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的又一些替代实例是XGF，GXF，和GFX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KGF，RGF，HGF，GGF，AGF，VGF，LGF，IGF，MGF，FGF，WGF，PGF，SGF，TGF，CGF，YGF，NGF，QGF，DGF，EGF，和KGF，GKF，GRF，GHF，GGF，GAF，GVF，GLF，GIF，GMF，GFF，GWF，GPF，GSF，GTF，GCF，GYF，GNF，GQF，GDF，GEF，GLF，GFK，GFR，GFH，GFG，GFA，GFV，GFL，GFI，GFM，GFF，GFW，GFP，GFS，GFT，GFC，GFY，GFN，GFQ，GFD，或GFE中。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的又一些替代实例是XRL，RXL，和RLX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KRL，RRL，HRL，GRL，ARL，VRL，LRL，IRL，MRL，FRL，WRL，PRL，SRL，TRL，CRL，YRL，NRL，QRLRL，DRL，ERL，KRL，GKF，GRF，GHF，GGF，GAF，GVF，GLF，GIF，GMF，GFF，GWF，GPF，GSF，GTF，GCF，GYF，GNF，GQF，GDF，GEF，和GLF，RLK，RLR，RLH，RLG，RLA，RLV，RLL，RLI，RLM，RLF，RLW，RLP，RLS，RLT，RLC，RLY，RLN，RLQ，RLD，或RLE中。氧化还原酶基序内的内部X1X2X3氨基酸段的又一些替代实例是XHP，HXP，和HPX，其中X可以为任意氨基酸，例如在KHP，RHP，HHP，GHP，AHP，VHP，LHP，IHP，MHP，FHP，WHP，PHP，SHP，THP，CHP，YHP，NHP，QHP，DHP，EHP，KHP，HKP，HRP，HHP，HGP，HAF，HVF，HLF，HIF，HMF，HFF，HWF，HPF，HSF，HTF，HCF，HYP，HNF，HQF，HDF，HEF，HLP，HPK，HPR，HPH，HPG，HPA，HPV，HPL，HPI，HPM，HPF，HPW，HPP，HPS，HPT，HPC，HPY，HPN，HPQ，HPD，或HPE中。
一些特别优选的实例是：CRPYC，KCRPYC，KHCRPYC，RCRPYC，HCRPYC，CPRYC，KCPRYC，RCPRYC，HCPRYC，CPYRC，KCPYRC，RCPYRC，HCPYRC，CKPYC，KCKPYC，RCKPYC，HCKPYC，CPKYC，KCPKYC，RCPKYC，HCPKYC，CPYKC，KCPYKC，RCPYKC，和HCPYKC
(对应于SEQ ID NO：36至60)；
(e)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是4(SEQ ID No：725、730、737、742、747、754、761和762)，从而在氧化还原酶基序内产生内部X1X2X3X4(SEQ ID NO：76)氨基酸段，其中m是选自0、1或2的整数，其中Z为任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H，最优选K。优选的是其中m是1或2且Z是选自以下的碱性氨基酸的基序：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。X1、X2、X3和X4各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或如本文中所限定的非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2、X3和X4是除C、S或T之外的任何氨基酸。在某些非限制性实例中，所述基序中的X1、X2、X3或X4中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。一些具体实例包括LAVL(SEQ ID NO：61)，TVQA(SEQ ID NO：62)或GAVH(SEQ ID NO：63)及其变体，例如：X1AVL，LX2VL，LAX3L，或LAVX4；X1VQA，TX2QA，TVX3A，或TVQX4；X1AVH，GX2VH，GAX3H，或GAVX4(对应于SEQ ID NO：64至75)；其中X1、X2、X3和X4各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸；
(f)Zm-[CST]-Yn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是5(SEQ ID No：726、731、738、743、748、755、763和764)，从而在氧化还原酶基序内产生内部X1X2X3X4X5(SEQ ID NO：77)氨基酸段，其中m是选自0、1或2的整数，其中Z为任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H，最优选K。优选的是其中m是1或2且Z是选自以下的碱性氨基酸的基序：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。X1、X2、X3、X4和X5各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2、X3、X4和X5是除C、S或T之外的任何氨基酸。在某些实例中，所述基序中的X1、X2、X3、X4或X5中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。一些具体实例包括PAFPL(SEQ ID NO：78)或DQGGE(SEQ ID NO：79)及其变体，例如：X1AFPL，PX2FPL，PAX3PL，PAFX4L，或PAFPX5；X1QGGE，DX2GGE，DQX3GE，DQGX4E，或DQGGX5(对应于SEQ IDNO：80至89)，其中X1、X2、X3、X4和X5各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或如本文中所限定的非天然氨基酸；
(g)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是6(SEQ ID No：727、732、739、744、749、756、765和766)，从而在氧化还原酶基序内产生内部X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO：90)氨基酸段，其中m是选自0、1或2的整数，其中Z为任意氨基酸，优选选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H，最优选K。优选的是其中m是1或2且Z是选自以下的碱性氨基酸的基序：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸，优选K或H。X1、X2、X3、X4、X5和X6各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2、X3、X4、X5和X6是除C、S或T之外的任何氨基酸。在某些实例中，所述基序中的X1、X2、X3、X4、X5或X6中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。一些具体实例包括DIADKY(SEQ ID NO：91)或其变体，例如：X1IADKY，DX2ADKY，DIX3DKY，DIAX4KY，DIADX5Y，或DIADKX6(对应于SEQ ID NO：92至97)，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸；或者
(h)Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中n是0至6并且其中m是0，并且其中C或[CST]残基之一已被修饰以便在基序的氨基酸残基的N端酰胺(SEQ ID No：770至779)或在C端羧基(SEQ ID No：780至789)上携带乙酰基、甲基、乙基或丙酰基。在这样的基序的一些优选实施方案中，n是2并且m是0，其中内部X1X2各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或非天然氨基酸。优选地，所述基序中的X1和X2是除C、S或T之外的任何氨基酸。在另一个实例中，所述基序中的X1或X2中的至少一个是选自以下的碱性氨基酸：H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸，例如L-鸟氨酸。在基序的另一个实例中，所述基序中的X1或X2中的至少一个是P或Y。氧化还原酶基序内的内部X1X2氨基酸偶联物的一些具体非限制性实例：PY，HY，KY，RY，PH，PK，PR，HG，KG，RG，HH，HK，HR，GP，HP，KP，RP，GH，GK，GR，GH，KH，和RH。优选地，所述修饰导致基序中第一半胱氨酸的N端乙酰化(N-乙酰基-半胱氨酸)。
53.方面33至52中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述肽中的氧化还原酶基序的Xn部分包含序列PY，优选地其中所述氧化还原酶基序包含序列CPYC(SEQ ID NO：98)，或具有以下序列中的任一种：
HCPYC，KHCPYC，KCPYC，RCPYC，HCGHC，KCGHC，RCGHC，KKCPYC，KRCPYC，KHCGHC，KKCGHC，和KRCGHC(SEQ ID NO：24至35)。
54.方面33至53中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述肽中的氧化还原酶基序的氨基酸Z是选自以下的碱性氨基酸：H、K、R和任何非天然碱性氨基酸，更优选选自以下的碱性氨基酸：H、K和R，最优选其中Z是H或K。
55.方面33至54中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述免疫原性肽具有9至50个氨基酸、优选9至30个氨基酸的长度。
56.方面33至55中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述肽中的氧化还原酶基序不天然存在于氨基酸序列中位于所述抗原蛋白质的T细胞表位的N端或C端11个氨基酸的区域内，和/或其中所述T细胞表位在其氨基酸序列中不天然包含所述氧化还原酶基序。
57.方面33至56中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述抗原蛋白质选自：胰岛素(原)、GAD65、GAD67、IA-2(ICA512)、IA-2(β/phogrin)、IGRP、嗜铬粒蛋白、ZnT8和HSP-60，并且其中所述自身免疫病是1型糖尿病(T1D)。
58.方面33至56中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述抗原蛋白质选自：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)和少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)，并且其中所述自身免疫病是多发性硬化(MS)和/或视神经脊髓炎(NMO)。
59.方面33至56中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述抗原蛋白质选自：GRP78、HSP60、60kDa伴侣蛋白2、凝溶胶蛋白、壳多糖酶-3样蛋白1、组织蛋白酶S、血清白蛋白和组织蛋白酶D，并且其中所述自身免疫病是类风湿性关节炎(RA)。
60.方面33至56中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述抗原蛋白质是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，其中所述自身免疫病是视神经脊髓炎(NMO)。
61.方面33至60中任一项所述的非免疫原性RNA，其用于权利要求1至32中任一项所述的方法中。
62.药物组合物，其包含根据方面33至60中任一项所述的非免疫原性RNA以及任选地可药用赋形剂。
63.在方面1至62中任一项的一个优选实施方案中，肽中的接头包含至少1个氨基酸、至少2个氨基酸、至少3个氨基酸或至少4个氨基酸。优选地，所述接头包含1至7个氨基酸，例如2至7个氨基酸、3至7个氨基酸、或4至7个氨基酸。
64.在方面1至63中任一项所述的另一个优选实施方案中，肽的T细胞表位在其N端末端，即紧邻接头或氧化还原酶基序，更特别地在接头不存在或仅包含1或2个氨基酸的情况下，不包含碱性氨基酸。更优选地，在所有方面中，T细胞表位在其N端末端，即紧邻接头或氧化还原酶基序，更特别地在接头不存在或仅包含1或2个氨基酸的情况下，不包含碱性氨基酸。
65.在方面1至64中任一项所述的另一个实施方案中，肽的T细胞表位在自其N端末端起计数的位置1、2和/或3中，即紧邻接头或氧化还原酶基序，更特别地在接头不存在或仅包含1或2个氨基酸的情况下，不包含碱性氨基酸。
66.在方面1至65中的任一项中，肽中的氧化还原酶基序形成所述肽的N端末端。在一组替代实施方案中，氧化还原酶基序形成肽的C端末端。
67.在方面1至66中任一项中，针对MS治疗的患者通常具有选自以下的HLA HLA-DRB1*类型：HLA-DRB1*15：01、HLA-DRB1*03：01、HLA-DRB1*04：01和HLA-DRB1*07：01，优选HLA-DRB1*15：01。
68.在方面1至66中任一项中，针对NMO治疗的患者通常具有选自以下的HLA类型：HLA-DRB1*03：01和HLA-DPB1*05：01(对于亚洲)。
69.在方面1至66中任一项中，针对T1D治疗的患者通常具有选自以下的HLA类型：HLA-DRB1*03：01和04：01。
70.在方面1至66中任一项中，针对RA治疗的患者通常具有选自以下的HLA类型：HLA-DRB1*01：01、04：01和04：04。
71.在方面1至70中任一项的一个优选实施方案中，肽中的所述T细胞表位是长度为7至25个氨基酸的NKT细胞表位；或者所述T细胞表位是长度为7至25个氨基酸(优选9至25个氨基酸)的MHC II类T细胞表位。
72.在方面1至71中任一项的一个优选实施方案中，肽中的所述T细胞表位是长度为7至50个氨基酸的NKT细胞表位，或者所述肽包含长度为7至50个氨基酸(优选9至50个氨基酸)的MHC II类T细胞表位。
73.在本文中列出的任一方面中，氧化还原酶基序不是标准的C-XX-[CST]或[CST]-XX-C氧化还原酶基序的重复的一部分，例如所述基序的可通过一个或更多个氨基酸彼此隔开的重复(例如CXXC X CXXC X CXXC(SEQ ID NO：99)：)，彼此相邻的重复(CXXCCXXCCXXC(SEQ ID NO：100))或彼此重叠的重复CXXCXXCXXC(SEQ ID NO：101)或CXCCXCCXCC(SEQ ID NO：102))，特别是当n是0或1并且m是0时。
附图说明
图1：示出了从第7天至第28天每天进行的临床EAE评分(0至5)的盲法评价。在第0天向小鼠注射MOG35-55以诱导EAE，并且不进行处理(载剂)或用IMCY-0189 m1ψLNP包封的mRNA或MOG35-55m1ψLNP包封的mRNA进行治疗性处理(详见表2)。每天确定各组小鼠的平均临床评分。
图2：示出了由图1中针对各组小鼠所显示的EAE评分计算的AUC。如下参考显著性差异：*p＜0.05，**p＜0.01。
图3：示出了由图1中针对各组小鼠所显示的EAE评分计算的MMS。如下参考显著性差异：*p＜0.05。
具体实施方式
本发明针对特定实施方案进行描述，但是本发明不限于此，而仅由权利要求书来限定。权利要求书中的任何引用标记不应被理解为限制范围。仅提供以下术语或定义以帮助理解本发明。除非本文中具体定义，否则本文中使用的所有术语具有如其对于本发明领域的技术人员将理解的相同的含义。本文中提供的定义的范围不应理解为小于本领域普通技术人员所理解的范围。
除非另外指出，否则如对于技术人员将明显的是，可以以自身已知的方式进行并且已经以自身已知的方式进行了未详细具体描述的所有方法、步骤、技术和操作。例如再次参考标准手册，参考以上提及的一般背景技术以及参考其中引用的另外的参考文献。
除非上下文另外明确指出，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词包括一个/种和/或更多个/种。当与本文中使用的方面、权利要求或实施方案相关地使用时，术语“任何”是指提及的所述方面、权利要求或实施方案中任何一个(即任一)以及所有组合。
本文中使用的术语“包含”及其变化形式与“包括”及其变化形式或“含有”及其变化形式同义，并且是包含性的或开放式的且不排除另外的、非记载的成员、要素或方法步骤。所述术语还涵盖“基本上由……组成”和“由……组成”的实施方案。
通过端点对数值范围的记载包括各个范围内包括的所有数字和分数，以及所记载的端点。
本文中当涉及可测量值例如参数、量、时间持续时间等时使用的术语“约/大约”意在涵盖指定的值或自指定的值起的+/-10％或更小，优选+/-5％或更小，更优选+/-1％或更小，并且仍更优选+/-0.1％或更小的变化，只要这样的变化适合于在所公开的发明中进行即可。应理解，修饰语“约/大约”所指的值本身也被具体地并且优选地公开。
如在本文中使用的，如在“用于治疗疾病的组合物”中使用的术语“用于”还应公开了相应的治疗方法和相应的制剂用于制备用于治疗疾病的药物的用途。
本文中使用的术语“肽”是指包含通过肽键连接的9至200个氨基酸的氨基酸序列的分子，但是其可包含非氨基酸结构。
本文中使用的术语“免疫原性肽”是指具有免疫原性的肽，即包含能够引发免疫应答的T细胞表位的肽。
根据本发明的肽可包含任何常规的20种氨基酸或其经修饰形式，或者可包含通过化学肽合成或通过化学或酶修饰并入的非天然存在的氨基酸。
本文中使用的术语“抗原”是指大分子，通常是蛋白质(具有或不具有多糖)的结构或者由包含一种或更多种半抗原以及包含T或NKT细胞表位的蛋白质组合物构成的结构。
本文中使用的术语“抗原蛋白质”是指包含一个或更多个T或NKT细胞表位的蛋白质。本文中使用的自身抗原或自身抗原蛋白质是指存在于体内的人或动物蛋白或其片段，其在同一人或动物体内引发免疫应答。
术语“食品或药物抗原蛋白质”是指存在于食品或药物产品中，例如疫苗中的抗原蛋白质。
术语“表位”是指抗原蛋白质的一个或数个部分(其可限定构象表位)，其被抗体或其部分(Fab’、Fab2’等)或者呈现于B细胞或T细胞或NKT细胞的细胞表面处的受体特异性识别并结合，并且其能够通过所述结合而诱导免疫应答。
在本发明的上下文中，术语“T细胞表位”是指优势、亚优势或次要的T细胞表位，即抗原蛋白质的一部分，其被在T淋巴细胞的细胞表面处的受体特异性地识别并结合。表位是优势、亚优势还是次要的取决于针对该表位引发的免疫反应。优势性取决于这样的表位在蛋白质的所有可能的T细胞表位中被T细胞识别并能够将其活化的频率。T细胞表位可以是由MHC II类分子识别的表位或由CD1d分子识别的NKT细胞表位。
T细胞表位可以是由MHC II类分子识别的表位，其通常由适配于MHC II分子的沟中的9个氨基酸的序列组成。在表示MHC II类T细胞表位的肽序列中，表位之中的氨基酸可以以P1至P9进行编号，表位的N端氨基酸以P-1、P-2等进行编号，表位的C端氨基酸以P+1、P+2等进行编号。被MHC II类分子而非被MHC I类分子识别的肽称为MHC II类限制性T细胞表位。
从抗原蛋白质中鉴定和选择T细胞表位是本领域技术人员已知的。
为了鉴定适合于本发明背景下的表位，通过例如T细胞生物技术测试抗原蛋白质的分离的肽序列，以确定该肽序列是否引发T细胞应答。将发现引发T细胞应答的那些肽序列定义为具有T细胞刺激活性。
人T细胞刺激活性可还通过将从例如患有T1D的个体获得的T细胞与来源于参与T1D的自身抗原的肽/表位一起培养并确定是否应答于该肽/表位而发生T细胞的增殖(如例如通过氚化胸苷的细胞摄取所测量的)来进行测试。可将T细胞对肽/表位的应答的刺激指数作为应答于肽/表位的最大CPM除以对照CPM来计算。等于或大于背景水平两倍的T细胞刺激指数(stimulation index，S.I.)被认为是“阳性”。将阳性结果用于计算受试肽/表位组的每种肽/表位的平均刺激指数。
非天然(或经修饰的)T细胞表位可还任选地针对其与MHC II类分子的结合亲和力进行测试。这可以以不同的方式进行。例如，通过裂解对于给定II类分子呈纯合的细胞获得可溶性HLA II类分子。然后通过亲和色谱进行纯化。将可溶性II类分子与经生物素标记的参考肽进行孵育，该肽根据其对该II类分子的强结合亲和力而产生。然后将待评估II类结合的肽以不同浓度孵育，并通过添加中性抗生物素蛋白来计算所述肽将参考肽从其II类结合中置换出的能力。
为了通过例如精细映射技术确定最佳的T细胞表位，通过在肽的氨基或羧基端处添加或缺失氨基酸残基来修饰具有T细胞刺激活性并因此包含至少一个T细胞表位(如通过T细胞生物技术所确定)的肽，并对其进行测试，以确定针对经修饰肽的T细胞反应性的变化。如果如通过T细胞生物技术确定的发现在天然蛋白质序列中共享重叠区域的两种或更多种肽具有人T细胞刺激活性，则可产生包含这样的肽的全部或部分的另外的肽，并且这些另外的肽可通过类似的操作进行测试。按照该技术，选择肽并重组或合成产生。T细胞表位或肽基于多种因素来选择，所述因素包括在个体群体中对肽/表位的T细胞应答的强度(例如，刺激指数)和对肽的T细胞应答的频率。
另外地和/或作为替代地，可使用一种或更多种体外算法来鉴定抗原蛋白质中的T细胞表位序列。合适的算法包括但不限于描述于以下中的那些：Zhang et al.(2005)Nucleic Acids Res 33，W180-W183(PREDBALB)；Salomon&Flower(2006)BMCBioinformatics 7，501(MHCBN)；Schuler et al.(2007)Methods Mol.Biol.409，75-93(SYFPEITHI)；Donnes&Kohlbacher(2006)Nucleic Acids Res.34，W194-W197(SVMHC)；Kolaskar&Tongaonkar(1990)FEBS Lett.276，172-174；Guan et al.(2003)Appl.Bioinformatics 2，63-66(MHCPred)和Singh and Raghava(2001)Bioinformatics17，1236-1237(Propred)。更特别地，这样的算法允许预测抗原蛋白质中将适配于MHC II分子的沟中的一个或更多个八肽或九肽序列，并且这对于不同的HLA类型也是如此。
术语“MHC”是指“主要组织相容性抗原”。在人中，MHC基因被称为HLA(“人白细胞抗原(human leukocyte antigen)”)基因。尽管没有始终遵循的约定，但是一些文献使用HLA指HLA蛋白分子，而MHC指编码HLA蛋白的基因。照此，当在本文中使用时，术语“MHC”和“HLA”是等同的。人中的HLA系统在小鼠中具有其等同系统，即H2系统。最深入研究的HLA基因是九种所谓的经典MHC基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB 1。在人中，MHC分为三个区域：I、II和III类。A、B和C基因属于MHC I类，而六个D基因属于II类。MHC I类分子由包含3个结构域(α1、2和3)的单多态链构成，所述单多态链与细胞表面处的β2微球蛋白缔合。II类分子由2条多态链构成，每条多态链包含2条链(α1和2，以及β1和2)。
针对MS治疗的患者通常具有选自以下的HLA HLA-DRB1*类型：HLA-DRB1*15：01、HLA-DRB1*03：01、HLA-DRB1*04：01、和HLA-DRB1*07：01、优选HLA-DRB1*15：01。
针对NMO治疗的患者通常具有选自以下的HLA类型：HLA-DRB1*03：01和HLA-DPB1*05：01(对于亚洲)。
针对T1D治疗的患者通常具有选自以下的HLA类型：HLA-DRB1*03：01和04：01。
针对RA治疗的患者通常具有选自以下的HLA类型：HLA-DRB1*01：01、04：01、和04：04。
I类MHC分子几乎在所有有核细胞上表达。
在I类MHC分子情况下呈递的肽片段被CD8+T淋巴细胞(溶细胞性T淋巴细胞或CTL(cytolytic T lymphocyte))识别。CD8+T淋巴细胞频繁成熟为溶细胞性效应物，其可裂解荷带刺激性抗原的细胞。II类MHC分子主要在活化的淋巴细胞和抗原呈递细胞上表达。CD4+T淋巴细胞(辅助性T淋巴细胞或Th)通过识别由通常存在于抗原呈递细胞(如巨噬细胞或树突细胞)上的II类MHC分子呈递的独特肽片段而活化。CD4+T淋巴细胞增殖并分泌支持抗体介导和细胞介导的应答的细胞因子，例如IL-2、IFN-γ和IL-4。
功能性HLA的特征在于深结合沟，内源性以及外来的、潜在抗原肽与之结合。进一步地，该沟的特征在于明确的形状和物理化学特性。HLA I类结合位点是封闭的，因为肽端被钉到沟的末端中。它们还参与了与保守HLA残基的氢键的网络。鉴于这些限制，结合的肽的长度限制于8、9或10个残基。然而，已显示具有多至12个氨基酸残基的肽也能够结合HLAI类。不同HLA复合物的结构的比较确定了其中肽采用相对线性、延伸的构象或者可涉及中央残基从沟中凸出的一般的结合方式。
与HLA I类结合位点相反，II类位点在两端均开放。这允许肽从实际结合区域延伸，从而在两端“悬垂”。因此，II类HLA可结合可变长度(9个至超过25个氨基酸残基)的肽配体。类似于HLA I类，II类配体的亲和力由“恒定”和“可变”分量决定。恒定部分再次由HLAII类沟中保守性残基与结合的肽的主链之间形成的氢键网络形成。然而，该氢键模式不限于肽的N端和C端残基，而是分布在整个链上。后者很重要，因为其将复合肽的构象限制为严格线性结合方式。这对于所有II类同种异型都是共同的。决定肽结合亲和力的第二分量是可变的，这是由于II类结合位点中的某些多态性位置。不同的同种异型在沟内形成不同的互补袋，从而解释了肽的亚型依赖性选择或特异性。重要地，对II类袋中持有的氨基酸残基的限制通常比对I类的“柔和”。在不同的HLA II类同种异型之间，肽存在更多的交叉反应性。适配于MHC II分子的沟中的MHC II类T细胞表位的+/-9个氨基酸(即8、9或10)的序列通常以P1至P9进行编号。表位的N端另外的氨基酸以P-1、P-2等进行编号，表位的C端氨基酸以P+1、P+2等进行编号。
术语“NKT细胞表位”是指抗原蛋白质的一部分，其被NKT细胞的细胞表面处的受体特异性地识别并结合并且通常具有7个氨基酸的长度。特别地，NKT细胞表位是被CD1d分子结合的表位。NKT细胞表位具有一般基序[FWYHT]-X(2)-NILM]-X(2)-[FWYHT](SEQ ID NO：103)。该一般基序的一些替代形式在位置1和/或位置7处具有可选项[FWYH]，因此为[FWYH]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYH](SEQ ID NO：104)。
该一般基序的一些替代形式在位置1和/或位置7处具有可选项[FWYT]，[FWYT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYT](SEQ ID NO：105)。该一般基序的一些替代形式在位置1和/或位置7具有可选项[FWY]，[FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY](SEQ ID NO：106).。
不论在位置1和/或7处的氨基酸如何，一般基序的一些替代形式在位置4具有可选项[ILM]，例如[FWYH]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWYH](SEQ ID NO：107)或[FWYHT]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWYHT](SEQ ID NO：108)或[FWY]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWY](SEQ ID NO：109)。这样的疏水性肽的特征在于这样的基序，其中位置P1和P7被疏水性残基例如苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)占据。然而，P7在其接受苯丙氨酸或色氨酸的替代疏水性残基例如苏氨酸(T)或组氨酸(H)的意义上是允许的。P4位置被脂肪族残基例如异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)占据。这样的肽可具有天然构成CD1d结合基序的疏水性残基。在一些实施方案中，所述基序的氨基酸残基通常通过用提高与CD1d结合的能力的残基进行替换来修饰。在一个具体实施方案中，对基序进行修饰以使其与所述一般基序更紧密地适配。更特别地，产生肽以在第7位包含F或W。
可任意通过使用算法例如ScanProsite De Castro E.et al.(2006)NucleicAcids Res.34(Web Server issue)：W362-W365，任意通过人工来扫描以上序列基序的序列来鉴定蛋白质中的CD1d结合基序。
“自然杀伤T”或“NKT(Natural killer T)”细胞构成识别由非经典MHC复合体分子CD1d呈递的抗原的非常规T淋巴细胞的独特子集。当前描述了NKT细胞的两个子集。I型NKT细胞，也称为不变型NKT细胞(invariant NKT cell，iNKT)，是最丰富的。其特征在于存在由不变型α链构成的αβT细胞受体(T cell receptor，TCR)，小鼠中为Valphal4，而人中为Valpha24。尽管存在有限数目的β链，但该α链与变化相关。2型NKT细胞具有αβTCR，但具有多态性α链。然而，明显的是，NKT细胞的其他子集存在，其表型仍未完全限定，但其共享被在CD1d分子情况下呈递的糖脂活化的特征。
NKT细胞通常表达自然杀伤(natural killer，NK)细胞受体(包括NKG2D和NK1.1)的组合。NKT细胞是固有免疫系统的一部分，所述固有免疫系统可通过其在获得完全效应能力之前不需要扩增的事实而区别于适应性免疫系统。它们的介质中的大多数是预形成的，并且不需要转录。已表明NKT细胞是针对胞内病原体的免疫应答和肿瘤排斥中的主要参与者。还提倡它们在控制自身免疫病和移植排斥中的作用。
识别单元CD1d分子的结构与MHC I类分子的结构极为相似，包括β-2微球蛋白的存在。其特征在于以两条α链为界并包含高度疏水性残基的深裂口，其接受脂质链。所述裂口在两个末端均打开，使其容纳更长的链。CD1d的标准配体是合成的α半乳糖基神经酰胺(alpha galactosylceramide，αGalCer)。然而，已经描述了许多天然的替代配体，包括糖脂和磷脂、存在于髓磷脂中的天然脂质硫苷脂、微生物磷酸肌醇甘露糖苷和α-葡萄糖醛酸神经酰胺。本领域中目前的共识(Matsuda et al(2008)，Curr.Opinion Immunol.，20 358-368；Godfrey et al(2010)，Nature rev.Immunol 11，197-206)仍然是CD1d仅结合包含脂质链的配体，或一般地，由埋入到CD1d中的脂质尾和从CD1d突出的糖残基头基构成的共同结构。
本文中对于本发明上下文中使用的表位所使用的术语“同源物”是指这样的分子：其与天然存在的表位具有至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％氨基酸序列同一性，从而维持表位结合抗体或者B和/或T细胞的细胞表面受体的能力。表位的特定同源物对应于在最多3个，更特别地在最多2个，最特别地在1个氨基酸中修饰的天然表位。
本文中对于本发明的肽所使用的术语“衍生物”是指这样的分子：其包含至少肽活性部分(即，氧化还原酶基序和能够引发溶细胞性CD4+T细胞活性的MHC II类表位)，以及作为其补充，还包含可具有不同的目的，例如使肽稳定或改变肽的药动学或药效学特性的补充部分。
本文中使用的对于两个序列的术语“序列同一性”是指当两个序列进行比对时具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以序列中较短者中核苷酸或氨基酸的数目。特别地，序列同一性为70％至80％、81％至85％、86％至90％、91％至95％、96％至100％、或100％。
本文中使用的术语“肽编码多核苷酸(或核酸)”和“编码肽的多核苷酸(或核酸)”是指这样的核苷酸序列，其当在合适的环境中表达时导致产生相关的肽序列或其衍生物或同源物。这样的多核苷酸或核酸包括编码该肽的正常序列，以及能够表达具有所需活性的肽的这些核酸的衍生物和片段。编码根据本发明的肽或其片段的核酸是编码源自哺乳动物或对应于哺乳动物的肽或其片段、最特别是人肽片段的序列。
术语“氧化还原酶基序”、“硫醇-氧化还原酶基序”、“硫还原酶基序”、“硫氧化还原基序”或“氧化还原基序”在本文中用作同义术语，并且是指参与将电子从一个分子(还原剂，也称为氢或电子供体)转移至另一分子(氧化剂，也称为氢或电子接纳体)的基序。特别地，术语“氧化还原酶基序”可指已知的[CST]XXC(SEQ ID NO：110)或CXX[CST](SEQ ID NO：111)基序，但是特别是指序列基序[CST]XnC(SEQ ID NO：112)或CXn[CST](SEQ ID NO：113)，其中n为选自包含以下的组的整数：0、1、3、4、5或6，并且其中C代表半胱氨酸、S代表丝氨酸、T代表苏氨酸以及X代表任何氨基酸。为了具有还原活性，存在于经修饰的氧化还原酶基序中的半胱氨酸不应该作为胱氨酸二硫桥的一部分出现。更特别地，所述氧化还原酶基序具有以下一般结构：Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，其中Z为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，更优选选自包含以下的组：K、H、R和非天然碱性氨基酸，优选K或H，更优选K；其中m是选自包含以下的组的整数：1、0或2；
其中X为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，更优选选自包含以下的组：K、H、R和非天然碱性氨基酸，优选K或H，更优选R；
其中n是选自0至6、优选0至3的整数，最优选2。在一个优选实施方案中，所述基序包含[CST]-XX-C-(SEQ ID NO：1)或C-XX-[CST]-(SEQ ID NO：2)，其中X为任意氨基酸。
术语“碱性氨基酸”是指像布朗斯特-劳里碱(Bronsted-Lowry base)和路易斯碱(Lewis base)一样发挥作用的任何氨基酸，并且包括天然的碱性氨基酸，例如精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)，或者非天然的碱性氨基酸，例如但不限于：
·赖氨酸变体，如Fmoc-β-Lys(Boc)-OH(CAS号219967-68-7)；Fmoc-Orn(Boc)-OH，也称为L-鸟氨酸或鸟氨酸(CAS号109425-55-0)；Fmoc-β-Homolys(Boc)-OH(CAS号203854-47-1)；Fmoc-Dap(Boc)-OH(CAS号162558-25-0)或Fmoc-Lys(Boc)OH(DiMe)-OH(CAS号441020-33-3)；
·酪氨酸/苯丙氨酸变体，如Fmoc-L-3Pal-OH(CAS号175453-07-3)；Fmoc-β-HomoPhe(CN)-OH(CAS号270065-87-7)；Fmoc-L-β-HomoAla(4-吡啶基)-OH(CAS号270065-69-5)或Fmoc-L-Phe(4-NHBoc)-OH(CAS号174132-31-1)；
·脯氨酸变体，如Fmoc-Pro(4-NHBoc)-OH(CAS号221352-74-5)或Fmoc-Hyp(tBu)-OH(CAS号122996-47-8)；
·精氨酸变体，如Fmoc-β-Homoarg(Pmc)-OH(CAS号700377-76-0)。
本文中公开的免疫原性肽通常可用于治疗由对变应原或(自身)抗原的升高或不受控的免疫应答引起的疾病。通常来说，所述抗原蛋白质是自身抗原、可溶性同种因子、由移植物脱落的同种抗原、胞内病原体的抗原、用于基因治疗或基因疫苗接种的病毒载体的抗原、肿瘤相关抗原或变应原。更优选地，所述抗原蛋白质是涉及1型糖尿病(T1D)、脱髓鞘病症例如多发性硬化(MS)或视神经脊髓炎(NMO)或者类风湿性关节炎(RA)的自身抗原。
术语“免疫病症”或“免疫疾病”是指其中免疫系统的反应导致或维持生物体中的功能障碍或非生理状况的疾病。免疫病症中包括的尤其是变应性病症和自身免疫病。
本文中使用的术语“变应性疾病”或“变应性病症”是指以免疫系统针对称为变应原的特定物质(例如花粉、蜇伤、药物或食物)的超敏反应为特征的疾病。变态反应是无论何时特应性个体患者遇到其已经对其过敏的变应原时所观察到的体征和症状的集合，这可能导致多种疾病，特别是呼吸系统疾病和症状(例如支气管哮喘)的发生。存在多种类型的分类，并且大多数变应性病症具有不同的名称，这取决于其在哺乳动物体内发生的位置。“超敏反应”是在个体中在暴露于个体已经变得对其过敏的抗原时而产生的不期望的(有损害的，产生不适的，并且有时是致命的)反应；“速发型超敏反应”取决于IgE抗体的产生，并因此等同于变态反应。
术语“自身免疫病”或“自身免疫病症”是指由于生物体无法将其自身组成部分(下至亚分子水平)识别为“自身”而引起生物体针对其自身细胞和组织的异常免疫应答而导致的疾病。该疾病组可分为两个类别：器官特异性疾病和全身性疾病。
“变应原”被定义为在具有预先倾向性的个体，特别是在具有遗传倾向性的个体(特应性)患者中引发IgE抗体产生的物质，通常是大分子或蛋白质组合物。类似的定义示于Liebers et al.(1996)Clin.Exp.Allergy 26，494-516中。
本文中使用的术语“脱髓鞘”是指围绕神经元轴突的髓鞘的损伤和/或降解，其结果是病变或斑块的形成。据了解，髓磷脂在脑、视神经和脊髓中发挥保护性覆盖周围神经纤维的作用。由于脱髓鞘，沿着受影响的神经的信号传导受损(即减慢或停止)，并可导致神经症状，例如在感觉、运动、认知和/或其他神经功能上的不足。患有脱髓鞘疾病的患者的具体症状将根据疾病和疾病进展状态而变化。这些症状可包括视力模糊和/或视歧、共济失调、阵挛、构音障碍、疲劳、笨拙、手麻痹、轻偏瘫、生殖器感觉缺失(genital anaesthesia)、协调运动障碍、感觉异常(paresthesias/paraesthesia)、眼麻痹、肌肉协调受损、肌无力、感觉丧失、视力受损、神经症状、行走方式(步态)不稳、痉挛性瘫痪、失禁、听力问题、言语问题等。
因此，本文中使用的且在本领域通常使用的“脱髓鞘疾病”或“脱髓鞘病症”表示涉及损害(例如损伤)的神经系统或神经元的髓鞘的任何病理状况。脱髓鞘疾病可分为中枢神经系统脱髓鞘疾病和周围神经系统。作为替代地，脱髓鞘疾病可根据脱髓鞘的原因进行分类：髓鞘的损坏(脱髓鞘性髓鞘脱失(demyelinating myelinoclastic))，或异常和退化性髓鞘(脱髓鞘性脑白质营养不良(dysmyelinating leukodystrophic))。脱髓鞘疾病的一些非限制性实例是：多发性硬化(MS)-(例如，复发/缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、进展复发型多发性硬化、原发进展型多发性硬化和急性暴发性多发性硬化)、视神经脊髓炎(NMO)、视神经炎、急性播散性脑脊髓炎、巴洛病(Balo’s Disease)、HTLV-I相关脊髓病、希尔德病(Schilder′s Disease)、横贯性脊髓炎、特发性炎性脱髓鞘病、维生素B12诱导的中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解、包括脊髓痨的脊髓病、脑白质营养不良例如肾上腺脑白质营养不良、白质脑病例如进行性多灶性白质脑病(PML)和风疹诱导的智力低下。技术人员理解的是，上述注释中的数种是表示疾病组的通用分类名称，所述疾病的特征在于在分子水平上的相同或类似的异常过程组和/或者相同或类似的(临床)症状组。患有脱髓鞘病症的人患者可具有脱髓鞘病症的一种或更多种症状，例如但不限于视力受损、麻木、四肢无力、震颤或痉挛、热不耐受、言语障碍、失禁、头晕或本体感觉(例如，平衡、协调、肢体位置感觉)受损。出于该方法的目的，具有脱髓鞘病症家族史(例如，脱髓鞘病症的遗传倾向)或者表现出上述脱髓鞘病症的轻度或罕见症状的人(例如，人患者)，可被认为处于发生脱髓鞘病症(例如，多发性硬化)的风险中。在本公开内容的上下文中，优选的脱髓鞘疾病是由MOG自身抗原引起的或涉及抗MOG抗体的那些，其包括但不限于多发性硬化(MS)或视神经脊髓炎(NMO)。
术语“多发性硬化”，在本文中和本领域中缩写为“MS”，表示影响中枢神经系统的自身免疫病症。MS被认为是年轻成人中最常见的非创伤性致残疾病(Dobson andGiovannoni，(2019)Eur.J.Neurol.26(1)，27-40)，以及影响中枢神经系统的最常见的自身免疫病症(Berer and Krishnamoorthy(2014)FEBS Lett.588(22)，4207-4213)。MS可通过从身体到心理至精神问题范围的大量不同症状而在对象中表现其自身。典型的症状包括视力模糊或视歧、肌无力、一只眼失明、以及协调和感觉困难。在大多数情况下，MS可被视为两个阶段的疾病，其中早期炎症是复发缓解型疾病的原因并且延迟的神经退行性变导致非复发性进展，即继发和原发进展型MS。尽管在该领域中取得了进展，但疾病的决定性基本原因迄今仍难以理解，并且超过150个单核苷酸多态性已与MS易感性相关(InternationalMultiple Sclerosis Genetics Consortium Nat Genet.(2013).45(11)：1353-60)。已报道了维生素D缺乏、吸烟、紫外线B(UVB)暴露、儿童肥胖和通过EB病毒的感染都有助于疾病的发生(Ascherio(2013)Expert Rev Neurother.13(12增刊)，3-9)。
因此，MS可被认为是存在于从复发型(其中炎症是优势特征)延伸至进展型(神经退行性变优势)的范围内的单一疾病。因此，明显的是本文中使用的术语多发性硬化涵盖属于任何类型的疾病病程分类的任何类型的多发性硬化。特别地，本发明被设想为针对被诊断患有或怀疑患有临床孤立综合征(CIS)、复发缓解型MS(RRMS)、继发进展型MS(SPMS)、原发进展型MS(PPMS)、以及甚至疑似MS的放射学孤立综合征(RIS)的患者的有效治疗策略。虽然不严格考虑MS的疾病病程，但RIS用于对在对应于MS病变并且不能通过其他诊断初步解释的脑和/或脊髓的磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)上显示异常的对象进行分类。CIS是由中枢神经系统中的炎症和脱髓鞘引起的神经症状的首次发作(根据定义，持续超过24小时)。根据RIS、CIS分类的对象可能继续发生MS或可能不继续发生MS，其中在脑MRI上显示MS样病变的对象更可能发生MS。RRMS是MS的最常见的疾病病程，其中患有MS的对象中85％被诊断患有RRMS。鉴于本发明，经RRMS诊断的患者是优选的患者组。RRMS的特征在于新的或提高的神经症状的攻击，或者是复发或恶化。在RRMS中，所述复发之后是症状的周期或者部分或完全缓解，并且在这些缓解期内没有经历和/或观察到疾病进展。RRMS可进一步分类为活性RRMS(复发和/或新MRI活动的证据)、非活性RRMS、恶化的RRMS(在复发之后在特定时间段内残疾提高)或未恶化的RRMS。一部分经RRMS诊断的对象将进展为SPMS疾病病程，其特征在于神经功能随时间的进展型恶化，即残疾的累积。可对SPMS进行亚分类，例如活性(复发和/或新的MRI活性)、非活性、进展型(疾病随时间恶化)或非进展型SPMS。最后，PPMS是MS疾病病程，其特征在于神经功能恶化以及因此从症状发作开始的残疾累积，无早期复发或缓解。可形成另一些PPMS亚组，例如活性PPMS(偶尔复发和/或新的MRI活性)、非活性PPMS、进展型PPMS(疾病随时间恶化的证据，无论新的MRI活性如何)和非进展型PPMS。一般而言，MS疾病病程的特征在于就复发和缓解期而言，在严重程度(在复发的情况下)和持续时间二者上有基本的对象间可变性。
数种疾病改善治疗可用于MS，并因此本发明可作为替代治疗策略使用，或与这些现有治疗组合使用。活性药物成分的一些非限制性实例包括：干扰素β-1a、干扰素β-1b、乙酸格拉替雷(glatiramer acetate)、乙酸格拉替雷、聚乙二醇干扰素β-1a、特立氟胺(teriflunomide)、芬戈莫德(fingolimod)、克拉屈滨(cladribine)、西尼莫德(siponimod)、富马酸二甲酯、富马酸地洛西美酯、奥扎莫德(ozanimod)、阿仑单抗(alemtuzumab)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥美珠单抗(ocrelizumab)和那他珠单抗(natalizumab)。作为替代地，本发明可与旨在复发管理的治疗或药物，例如但不限于甲基泼尼松龙、强的松和促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)组合使用。此外，本发明可与旨在减轻特定症状的治疗组合使用。一些非限制性实例包括旨在改善或避免选自以下的症状的药物：膀胱问题、肠功能障碍、抑郁、头晕、眩晕、情绪变化、疲劳、瘙痒、疼痛、性问题、痉挛、震颤和行走困难。
MS的特征在于三个交织的标志性特征：1)中枢神经系统中的病变形成，2)炎症，以及3)神经元髓鞘的退化。尽管传统上被认为是中枢神经系统和白质的脱髓鞘疾病，但最近报道表明皮质和深层灰质的脱髓鞘可超过白质脱髓鞘(Kutzelnigg et al.(2005).Brain.128(11)，2705-2712)。已假定关于如何在分子水平上引起MS的两个主要假设。通常可接受的“由外向内假说(outside-in hypothesis)”是基于外周自体反应性效应物CD4+T细胞的活化，该CD4+T细胞迁移到中枢神经系统并启动疾病病程。一旦在中枢神经系统中，所述T细胞通过APC局部再活化并募集另外的T细胞和巨噬细胞以建立炎性病变。值得注意的是，已显示MS病变包含主要存在于病变边缘处的CD8+T细胞以及存在于病变更中心的CD4+T细胞。认为这些细胞引起了脱髓鞘、少突胶质细胞破坏和轴突损伤，导致神经功能障碍。另外，触发免疫调节网络以限制炎症并启动修复，这导致通过临床缓解反映的至少部分髓鞘再生。然而，在没有足够的治疗的情况下，进一步的攻击通常导致疾病的进展。
认为MS的发作远在检测到第一临床症状之前就开始了，如由患者的MRI上明显的较老和不活跃病变的典型出现所证明的。由于在诊断方法的发展中的进步，现可检测到MS，甚至在疾病的临床表现之前(即症状前MS)也是如此。在本发明的上下文中，“MS的治疗”和类似的表达设想了针对有症状MS和症状前MS二者的治疗和治疗策略。特别地，当免疫原性肽和/或所产生的溶细胞性CD4+T细胞可用于治疗症状前MS患者时，疾病在可部分或甚至完全避免临床表现的这样的早期阶段停止。其中对象对干扰素β治疗没有完全响应的MS也涵盖在术语“MS”内。受免疫系统攻击并导致疾病的主要抗原是：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)和少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)。
术语“视神经脊髓炎”或“NMO”和“NMO谱系障碍(NMO Spectrum Disorder，NMOSD)”也称为“德维克氏病(Devic’s disease)”，是指其中白细胞和抗体主要攻击视神经和脊髓但也可攻击脑的自身免疫病症(在Wingerchuk 2006，Int MS J.2006 May；13(2)：42-50中进行了综述)。视神经的损伤产生引起疼痛和视力丧失的肿胀和炎症；脊髓的损伤引起腿或臂的无力或瘫痪、感觉丧失、以及膀胱和肠功能的问题。NMO是复发缓解型疾病。在复发期间，视神经和/或脊髓的新的损伤可导致累积性残疾。与MS不同，没有该疾病的进展期。因此，预防攻击对于良好的长期结局至关重要。在与抗MOG抗体相关的情况下，认为抗MOG抗体可触发对髓鞘的攻击，引起脱髓鞘。在大多数情况下，NMO的原因是由于对自身抗原的特异性攻击。至多三分之一的对象可对针对称为髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的髓鞘组分的自身抗体呈阳性。患有抗MOG相关NMO的患者类似地具有横贯性脊髓炎和视神经炎的发作。
术语“类风湿性关节炎，，或“RA”是在多种关节(最常见于手、腕和膝)中引起疼痛、肿胀、僵硬和功能丧失的自身免疫性炎性疾病。相应关节的衬里(lining)发炎，导致组织损伤以及慢性疼痛、不稳定和畸形。通常存在疾病进展的双侧/对称模式(例如，双手或双膝受到影响)。RA还可影响关节外部位，包括眼、口、肺和心脏。患者可经历其症状的急性恶化(称为突然恶化(flare))，但在早期干预和适当治疗的情况下，症状可在特定持续时间内得到改善(由Sana Iqbal et al.，2019，US Pharm.2019；44(1)(Specialty&Oncology suppl)：8-11综述)。受免疫系统攻击并导致疾病的抗原是多种多样的，但一些实例是：GRP78、HSP60、60kDa伴侣蛋白2、凝溶胶蛋白、壳多糖酶-3样蛋白1、组织蛋白酶S、血清白蛋白和组织蛋白酶D。
术语“1型糖尿病”(T1D)或“糖尿病1型”(也称为“1型糖尿病(type 1 diabetesmellitus)”或“免疫介导的糖尿病”或以前称为“幼年型发作糖尿病”或“胰岛素依赖型糖尿病”)是通常在儿童时期在易感个体中发生的自身免疫病。T1D发病机制的基础是通过自身免疫机制破坏大多数胰岛素产生胰腺β细胞。简言之，生物体失去了针对负责胰岛素产生的胰腺β细胞的免疫耐受，并且诱导主要是细胞介导的、与自身抗体的产生相关的免疫应答，从而导致β细胞的自我破坏。受免疫系统攻击并导致疾病的主要抗原是胰岛素(原)，但另一些实例是：GAD65、GAD67、IA-2(ICA512)、IA-2(β/phogrin)、IGRP、嗜铬粒蛋白、ZnT8和HSP-60。
术语“治疗有效量”是指本发明的编码肽的非免疫原性RNA或其衍生物的在患者中产生期望的治疗或预防作用的量。例如，对于疾病或病症，其是在某种程度上降低该疾病或病症的一种或更多种症状，并且更特别地使与该疾病或病症相关或为其成因的生理或生物化学参数部分或完全地恢复至正常的量。通常来说，治疗有效量是本发明的非免疫原性RNA或其衍生物的将导致正常生理状况的改善或恢复的量。
RNA优选通过肌内注射在含有氯化钠的合适缓冲液中的RNA来施用。
当涉及肽时，术语“天然”是指序列与天然存在的蛋白质(野生型或突变体)的片段相同的事实。与此相比之下，术语“人工”是指本身在自然界中不存在的序列。通过有限的修饰，例如在天然存在的序列中改变/缺失/插入一个或更多个氨基酸或通过添加/去除天然存在的序列的N端或C端氨基酸来由天然序列获得人工序列。
在这种情况下，已经认识到通常在表位扫描的情况下从抗原产生肽片段。巧合的是，这样的肽可在其序列中包含T细胞表位(MHC II类表位或CD1d结合表位)，以及在其附近的具有如本文中所限定的经修饰的氧化还原酶基序的序列。或者，可在所述表位与所述氧化还原酶基序之间存在具有至多11个氨基酸、至多7个氨基酸、至多4个氨基酸、至多2个氨基酸、或者甚至0个氨基酸(换言之，表位与氧化还原酶基序序列彼此紧邻)的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，不要求保护这样的天然存在的肽。
在本文中，氨基酸以其全名、其三字母缩写或其单字母缩写来指代。
氨基酸序列的基序根据Prosite的格式写于本文中。基序用于描述在序列特定部分处的某种序列多样性。符号X用于其中接受任何氨基酸的位置。可选项通过在方括号(“[]”)之间列出给定位置的可接受氨基酸来指明。例如：[CST]代表选自Cys、Ser或Thr的氨基酸。被排除为可选项的氨基酸通过在波形括号(“{}”)之间将其列出来指明。例如：{AM}代表除Ala和Met之外的任何氨基酸。基序中的不同元件任选地由连字符(-)使彼此隔开。在本说明书所公开的基序的上下文中，所公开的一般氧化还原酶基序通常伴有连字符而不与基序外的不同元件形成连接。这些“开放的”连字符指示基序与免疫原性肽的另一部分例如接头序列或表位序列的物理连接的位置。例如，形式“Zm-C-Xn-[CST]-”的基序指示[CST]是与免疫原性肽的其它部分连接的氨基酸，并且Z是免疫原性肽的末端氨基酸。优选的物理连接是肽键。基序内相同元件的重复可通过在该元件后放置圆括号之间的数值或数值范围来指明。在该方面中，“Xn”指的是n个“X”。例如，X(2)对应于X-X或XX；X(2，5)对应于2、3、4或5个X氨基酸，A(3)对应于A-A-A或AAA。为了区分氨基酸，氧化还原酶基序之外的那些可被称为外部氨基酸，氧化还原基序内的那些被称为内部氨基酸。除非另有说明，X表示任何氨基酸，特别是L-氨基酸，更特别是20种天然存在的L-氨基酸中的一种。
编码肽的非免疫原性RNA能够分别产生针对抗原呈递细胞的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞、溶细胞性NKT细胞的群，所述肽包含T细胞表位，例如MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位(或CD1d结合肽表位)和具有还原活性的经修饰的肽基序序列。
因此，以其最广泛的意义上讲，本发明涉及编码肽的非免疫原性RNA，所述肽包含具有触发免疫反应潜能的抗原(自身或非自身)的至少一种T细胞表位(MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位)以及对肽二硫键具有还原活性的经修饰的氧化还原酶序列基序。T细胞表位和经修饰的氧化还原酶基序序列可以在肽中彼此紧邻或任选地被一个或更多个氨基酸(所谓的接头序列)隔开。任选地，该肽另外地包含内体靶向序列和/或另外的“侧翼”序列。
非免疫原性RNA编码的肽包含具有触发免疫反应潜能的抗原(自身或非自身)的T细胞表位和经修饰的氧化还原酶基序。该肽中基序序列的还原活性可针对其还原巯基的能力来测定，例如在其中胰岛素的溶解度在还原之后改变的胰岛素溶解度测定中，或者用经荧光标记的底物例如胰岛素来测定。这样的测定的一个实例使用荧光肽，并且描述于Tomazzolli et al.(2006)Anal.Biochem.350，105-112中。当具有FITC标记的两个肽通过二硫桥彼此共价连接时，其会自猝灭。在被根据本发明的肽还原之后，还原的单独肽再次变为具有荧光。
经修饰的氧化还原酶基序可位于T细胞表位的氨基端侧或T细胞表位的羧基端处。
具有还原活性的肽片段见于硫还原酶中，所述硫还原酶是小的二硫化物还原酶，包括谷氧还蛋白、核氧化还原蛋白、硫氧还蛋白和其他硫醇/二硫化物氧化还原酶(Holmgren(2000)Antioxid.Redox Signal.2，811-820；Jacquot et al.(2002)Biochem.Pharm.64，1065-1069)。它们是多功能的、遍在的并且存在于许多原核生物和真核生物中。已知它们通过保守性活性结构域共有序列中的氧化还原活性半胱氨酸对蛋白质(例如酶)上的二硫键发挥还原活性，这从例如Fomenko et al.((2003)Biochemistry 42，11214-11225；Fomenko et al.(2002)Prot.Science 11，2285-2296)中公知，其中X代表任何氨基酸。以及WO2008/017517包含在位置1和/或4处的半胱氨酸。因此，这里的基序为CXX[CST](SEQ ID NO：111)或[CST]XXC(SEQ ID NO：110)。这样的结构域还存在于较大的蛋白质，例如蛋白质二硫化物异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)和磷酸肌醇特异性磷脂酶C中。本发明已经对所述基序进行了重新设计，以寻求更大的效力和活性。
当用于根据本文中所公开的氧化还原酶基序中存在的氨基酸残基时，术语“半胱氨酸”、“C”，“丝氨酸”、“S”，和“苏氨酸”、“T”分别是指天然存在的半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸氨基酸。除非明确指出不同，否则所述术语因此排除经化学修饰的半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸，例如经修饰以在基序的氨基酸残基的N端酰胺上或在C端羧基上携带乙酰基、甲基、乙基或丙酰基的那些。
在由本发明的非免疫原性RNA编码的肽中，对氧化还原酶基序进行定位以使得当表位适配于MHC沟中时，氧化还原酶基序保持在MHC结合沟的外部。氧化还原酶基序被置于紧邻肽内的表位序列[换句话说，基序与表位之间的接头序列为零个氨基酸]，或者通过包含5个氨基酸或更少的氨基酸序列的接头与T细胞表位隔开。更特别地，接头包含1、2、3、4或5个氨基酸。一些具体的实施方案是在表位序列与经修饰的氧化还原酶基序序列之间存在0、1、2或3个氨基酸的接头的肽。除肽接头之外，其他有机化合物也可以用作接头，以将肽的各部分彼此连接(例如，将经修饰的氧化还原酶基序序列与T细胞表位序列连接)。
由本发明的非免疫原性RNA编码的肽可还在包含T细胞表位和氧化还原酶基序的序列的N端或C端包含另外的短氨基酸序列。这样的氨基酸序列在本文中通常被称为“侧翼序列”。侧翼序列可位于表位与内体靶向序列之间和/或位于经修饰的氧化还原酶基序与内体靶向序列之间。在不包含内体靶向序列的某些肽中，短氨基酸序列可以存在于肽中经修饰的氧化还原酶基序和/或表位序列的N端和/或C端。更特别地，侧翼序列是1至7个氨基酸的序列，最特别地是2个氨基酸的序列。
在本发明的某些实施方案中，非免疫原性RNA编码包含一个T细胞表位序列和单一氧化还原酶基序序列的肽。或者，在T细胞表位序列的N端和C端两处均可提供氧化还原酶基序。
针对由本发明的非免疫原性RNA编码的肽设想的另一些变体包括包含T细胞表位序列的重复的肽，其中每个表位序列在经修饰的氧化还原酶基序之前和/或之后(例如“氧化还原酶基序-表位”的重复或“氧化还原酶基序-表位-氧化还原酶基序”的重复)。本文中，氧化还原酶基序全部均可具有相同的序列，但这不是必须的。
通常来说，由本发明的非免疫原性RNA编码的肽仅包含一个T细胞表位。如下所述，蛋白质序列中的T细胞表位可通过功能测定和/或二氧化硅预测测定中的一种或更多种来鉴定。T细胞表位序列中的氨基酸根据其在MHC蛋白结合沟中的位置进行编号或结合CD1d分子。肽内存在的MHCII类T细胞表位通常由7至30个氨基酸，优选9至30个氨基酸，例如由9至25个氨基酸，还更特别地由9至16个氨基酸组成，还最特别地由9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸组成。肽内存在的NKT细胞表位通常由7至30个氨基酸，例如由7至25个氨基酸，还更特别地由7至16个氨基酸组成，还最特别地由7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸组成。
在一个更具体的实施方案中，T细胞表位由9、10或11个氨基酸的序列组成。在另一个具体实施方案中，T细胞表位是由MHC II类分子呈递至T细胞的表位[MHC II类限制性T细胞表位]。通常来说，T细胞表位序列是指适配于MHC II蛋白的裂口中的八肽序列，或更特别地九肽序列。
在一个更具体的实施方案中，T细胞表位由7、8或9个氨基酸的序列组成。在另一个具体实施方案中，T细胞表位是由CD1d分子呈递的表位[NKT细胞表位]。通常来说，NKT细胞表位序列是指与CD1d蛋白结合并由其呈递的7个氨基酸的肽序列。
由本发明的非免疫原性RNA编码的肽的T细胞表位可对应于蛋白质的天然表位序列，或者可以是其经修饰形式，只要经修饰的T细胞表位保持其结合在MHC裂口内或结合CD1d受体的能力即可，类似于天然T细胞表位序列。经修饰的T细胞表位可与天然表位具有相同的针对MHC蛋白或CD1d受体的结合亲和力，但也可具有降低的亲和力。特别地，经修饰肽的结合亲和力小于原始肽的不小于10倍，更特别地不小于5倍。由本发明的非免疫原性RNA编码的肽对蛋白质复合物具有稳定作用。因此，肽-MHC或CD1d复合物的稳定作用补偿了经修饰的表位对MHC或CD1d分子的降低的亲和力。
在由本发明的非免疫原性RNA编码的肽中，肽中包含T细胞表位和还原性化合物的序列可还与促进肽被摄取到晚期内体中以进行加工并在MHC II类决定簇中呈递的氨基酸序列(或另一有机化合物)连接。晚期内体靶向通过蛋白质的胞质尾中存在的信号介导，并且对应于良好鉴定的肽基序。晚期内体靶向序列允许对抗原来源T细胞表位进行加工并通过MHC II类分子有效呈递。这样的内体靶向序列包含在例如gp75蛋白(Vijayasaradhi etal.(1995)J.Cell.Biol.130，807-820)、人CD3γ蛋白、HLA-BM 11(Copier et al.(1996)J.lmmunol.157，1017-1027)、DEC205受体的胞质尾(Mahnke et al.(2000)J.CellBiol.151，673-683)中。用作对内体的分拣信号的肽的另一些实例公开于Bonifacio andTraub(2003)Annu.Rev.Biochem.72，395-447的综述中。或者，该序列可以是来自蛋白质的亚优势或次要T细胞表位的序列，其促进晚期内体中的摄取而不克服针对抗原的T细胞应答。晚期内体靶向序列可位于抗原来源肽的氨基端处或羧基端处，以有效摄取和加工，并且也可通过侧翼序列(例如多至10个氨基酸的肽序列)连接。当出于靶向目的使用次要T细胞表位时，后者通常位于抗原来源肽的氨基端末端处。
或者，本发明涉及编码肽的非免疫原性RNA的产生，所述肽包含如本文中所限定的NKT表位，所述肽包含赋予与CD1d分子结合之能力的疏水性残基。在施用之后，这样的RNA靶向(未成熟)树突细胞，其中它被翻译成肽，其被引导至晚期内体，在此它们被装载到CD1d上并呈递在APC表面处。
因此，本发明设想了编码抗原蛋白质的肽的非免疫原性RNA及其在引发特异性免疫反应中的用途。这些肽可对应于在其序列中包含即被至多10个，优选7个氨基酸或更少的氨基酸隔开的还原性化合物和T细胞表位的蛋白质片段。或者，并且对于大多数抗原蛋白质，由本发明的非免疫原性RNA编码的肽包含还原性化合物，更特别地如本文中所述的还原性经修饰氧化还原酶基序，其与抗原蛋白质的T细胞表位的N端或C端连接(与其直接相邻或具有至多10个，更特别至多7个氨基酸的接头)。此外，与天然存在的序列相比，可对蛋白质的T细胞表位序列和/或经修饰的氧化还原酶基序进行修饰和/或可引入一个或更多个侧翼序列和/或靶向序列(或对其进行修饰)。因此，根据在目的抗原蛋白质的序列中是否可发现本发明的特征，非免疫原性RNA编码可包含“人工的”或“天然存在的”序列的肽。
由本发明的非免疫原性RNA编码的肽在长度上可显著变化。肽的长度可以为9、10或11个氨基酸(即由分别7、8或9个氨基酸的NKT细胞或MHCII类T细胞表位、与其相邻的2个氨基酸(CC)的最小氧化还原酶基序组成)至多至12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或多至50个氨基酸不等。
在一些具体实施方案中，由本发明的非免疫原性RNA编码的全肽由9个氨基酸多至20、25、30、40、50、75或100个氨基酸组成。例如，由本发明的非免疫原性RNA编码的肽可包含40个氨基酸的内体靶向序列、约2个氨基酸的侧翼序列、2至约11个氨基酸的如本文中所述的氧化还原酶基序、4至7个氨基酸的接头和最小7、8或9个氨基酸的T细胞表位肽。更特别地，在还原性化合物是如本文中所述的经修饰的氧化还原酶基序的情况下，无内体靶向序列的包含任选地通过接头连接的表位和经修饰的氧化还原酶基序的(人工或天然)序列(本文中称为“表位-经修饰的氧化还原酶基序”序列)的长度是至关重要的。“表位-经修饰的氧化还原酶基序”的长度更特别地为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸。这样的9、10、11、12、13或14至19个氨基酸的肽可任选地与尺寸较不关键的内体靶向信号连接。晚期内体靶向由存在于蛋白质的胞质尾部的信号介导，并且对应于充分确定的肽基序，例如基于双亮氨酸的[DE]XXXL[LI](SEQ ID NO：110)或DXXLL(SEQ ID NO：111)基序(例如DXXXLL(SEQ ID NO：112))、基于酪氨酸的YXX0(SEQ ID NO：113)基序或所谓的酸性簇基序。符号0表示具有庞大疏水性侧链的氨基酸残基，例如Phe、Tyr和Trp。晚期内体靶向序列允许通过MHC II类分子或CD1d分子加工和有效呈递抗原来源的T细胞表位。
如上所述，在一些具体实施方案中，由本发明的非免疫原性RNA编码的肽包含与T细胞表位序列连接的如本文中所述的还原性经修饰的氧化还原酶基序。
在另一些具体实施方案中，由本发明的非免疫原性RNA编码的肽是包含T细胞表位的肽，该T细胞表位不包含其天然序列中具有氧化还原特性的氨基酸序列。
然而，在一些替代实施方案中，T细胞表位可包含确保表位与MHC裂口或与CD1d分子结合的任何氨基酸序列。在抗原蛋白质的目的表位在其表位序列中包含例如本文中所述的经修饰的氧化还原酶基序的情况下，由本发明的非免疫原性RNA编码的肽包含如本文中所述的氧化还原酶基序和/或与表位序列N端或C端连接的另一还原性序列的序列，使得(与埋入在裂口中的表位中存在的经修饰的氧化还原酶基序相反)，连接的氧化还原酶基序可确保还原活性。
因此，T细胞表位和基序彼此紧邻或彼此隔开，并且不重叠。为了评估“紧邻”或“隔开”的概念，确定适配于MHC裂口或CD1d分子中的7、8或9个氨基酸的序列，并确定该八肽或九肽与经修饰的氧化还原酶基序之间的距离。
通常，由本发明的非免疫原性RNA编码的肽不是天然的(因此无这样的蛋白质片段)，而是人工肽，其除T细胞表位之外还包含如本文中所述的经修饰的氧化还原酶基序，其中经修饰的氧化还原酶基序通过由多至7个，最特别地多至4个或多至2个氨基酸组成的接头与T细胞表位直接隔开。
先前已经显示，在向哺乳动物施用(即注射)包含氧化还原酶基序和MHC II类T细胞表位的肽(或包含这样的RNA的组合物)之后，该肽引发识别抗原来源T细胞表位的T细胞的活化，并通过还原表面受体向T细胞提供另外的信号。这种超最佳活化产生获得针对呈递T细胞表位的细胞的溶细胞特性以及针对旁观者T细胞的抑制特性的T细胞。本发明通过施用编码这样的肽的非免疫原性RNA而不是肽本身，进一步建立了这一原理。
另外，已经显示，在向哺乳动物施用(即注射)包含氧化还原酶基序和NKT细胞表位的肽(或包含这样的肽的组合物)之后，该肽引发识别抗原来源T细胞表位的T细胞的活化，并通过与CD1d表面受体结合而向T细胞提供另外的信号。这种活化产生获得针对呈递T细胞表位的细胞的溶细胞特性的NKT细胞。本发明通过施用编码这样的肽的非免疫原性RNA而不是肽本身，进一步建立了这一原理。
以该方式，编码如本发明中所述的这样的肽的非免疫原性RNA或包含如本发明中所述的RNA的组合物可用于哺乳动物(包括人类)的直接免疫接种。因此，本发明提供了编码本发明的这样的肽的非免疫原性RNA或包含这样的RNA的组合物，其用作药物。因此，本发明提供了治疗方法，其包括向有此需要的患者施用编码一种或更多种根据本发明的肽的非免疫原性RNA或包含这样的RNA的组合物。
本发明提供了这样的方法，通过该方法，可通过用编码如本文中所述的小肽的RNA进行免疫接种来引发赋有溶细胞特性的抗原特异性T细胞。已经发现包含以下的肽分别引发溶细胞性CD4+T细胞或NKT细胞：(i)编码来自抗原的T细胞表位的序列和(ii)具有氧化还原特性的共有序列，以及所述肽进一步任选地还包含促进该肽被摄取到晚期内体中以进行有效MHC II类呈递或CD1d受体结合的序列。本发明通过施用编码这样的肽的非免疫原性RNA而不是肽本身，进一步建立了这一原理。
在治疗和预防(自身)免疫反应中，由本发明的非免疫原性RNA编码的肽的特性是特别令人感兴趣的。
编码本文中所述肽的非免疫原性RNA或包含这样的RNA的组合物用作药物，更特别地用于制备用于在哺乳动物中，更特别地在人中预防或治疗免疫病症的药物。
本发明描述了治疗或预防需要这样的治疗或预防的哺乳动物的免疫病症的方法，其包括施用编码本文中所述肽的非免疫原性RNA。所述方法包括向患有免疫病症或处于免疫病症风险之中的所述哺乳动物施用治疗有效量的编码本发明肽的非免疫原性RNA、其同源物或衍生物例如以减轻免疫病症的症状的步骤。设想了对人和动物(例如宠物和农场动物)二者的治疗。在一个实施方案中，待治疗的哺乳动物是人。以上提及的免疫病症在一个具体实施方案中选自变应性疾病和自身免疫病。
编码本文中所述的肽的非免疫原性RNA或包含本文中所限定的这样的RNA的药物组合物优选地通过皮下或肌内施用来施用。
在一个实施方案中，可将RNA或包含这样的RNA的药物组合物皮下(sub-cutaneously，SC)注射到上臂(肘与肩之间中部)的侧部的区域中。当需要两次或更多次分开的注射时，其可伴随地在两臂中进行施用。
在一个实施方案中，可将RNA或包含这样的RNA的药物组合物肌内(intra-muscularly，IM)注射到上臂的侧部的区域中，优选臂的三角肌中。当需要两次或更多次分开的注射时，其可伴随地在两臂中进行施用。
编码根据本发明的肽的非免疫原性RNA或包含这样的RNA的药物组合物以治疗有效剂量施用。
由本发明的非免疫原性RNA编码的肽中的氧化还原酶基序由以下通式限定：
Zm-[CST]-Xn-C-或Zm-C-Xn-[CST]-，，如本文中所述方面中所限定，其中所述氧化还原酶基序中的连字符(-)表示氧化还原酶基序与接头或表位的N端末端、或者与接头或T细胞表位的C端末端的连接点。
在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序是CC或CXC，其中X可以为选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H、或非天然碱性氨基酸。优选地，CXC基序中的X为除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体实施方案中，CXC基序中的X为碱性氨基酸，例如H、K或R，或非天然的碱性氨基酸，例如但不限于：
·赖氨酸变体，如Fmoc-β-Lys(Boc)-OH(CAS号219967-68-7)；Fmoc-Om(Boc)-OH，也称为L-鸟氨酸或鸟氨酸(CAS号109425-55-0)；Fmoc-β-Homolys(Boc)-OH(CAS号203854-47-1)；Fmoc-Dap(Boc)-OH(CAS号162558-25-0)或Fmoc-Lys(Boc)OH(DiMe)-OH(CAS号441020-33-3)；
·酪氨酸/苯丙氨酸变体，如Fmoc-L-3Pal-OH(CAS号175453-07-3)；Fmoc-β-HomoPhe(CN)-OH(CAS号270065-87-7)；Fmoc-L-β-HomoAla(4-吡啶基)-OH(CAS号270065-69-5)或Fmoc-L-Phe(4-NHBoc)-OH(CAS号174132-31-1)；
·脯氨酸变体，如Fmoc-Pro(4-NHBoc)-OH(CAS号221352-74-5)或Fmoc-Hyp(tBu)-OH(CAS号122996-47-8)；
·精氨酸变体，如Fmoc-β-Homoarg(Pmc)-OH(CAS号700377-76-0)。
CXC基序的一些具体实例是：CHC，CKC，CRC，CGC，CAC，CVC，CLC，CIC，CMC，CFC，CWC，CPC，CSC，CTC，CYC，CNC，CQC，CDC，和CEC。这些示例性CXC基序中的任一个其前面可以有一个或更多个氨基酸(Zm)，其中m为0至3的整数，优选0或1，并且其中Z为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。这样的基序的一些优选实例是：KCHC，KCKC，KCRC，KCGC，KCAC，KCVC，KCLC，KCIC，KCMC，KCFC，KCWC，KCPC，KCSC，KCTC，KCYC，KCNC，KCQC，KCDC，KCEC，HCHC，HCKC，HCRC，HCGC，HCAC，HCVC，HCLC，HCIC，HCMC，HCFC，HCWC，HCPC，HCSC，HCTC，HCYC，HCNC，HCQC，HCDC，HCEC，RCHC，RCKC，RCRC，RCGC，RCAC，RCVC，RCLC，RCIC，RCMC，RCFC，RCWC，RCPC，RCSC，RCTC，RCYC，RCNC，RCQC，RCDC，和RCEC(SEQ ID NO：114至170)；
在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序是CX2C(SEQ ID NO：171)，即CXXC，通常是CX1X2C，其中X1和X2各自独立地可以是选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。优选地，所述基序中的X1和X2是除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体的实施方案中，所述基序中的X1或X2中的至少一个是碱性氨基酸，例如H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
所述ZmCX1X2C基序中的X1X2氨基酸偶联物的一些具体实例是：PY，HY，KY，RY，PH，PK，PR，HG，KG，RG，HH，HK，HR，GP，HP，KP，RP，GH，GK，GR，GH，KH，和RH。
这些示例性C X1X2C基序中的任一个可在一个或更多个氨基酸(Zm)之前，其中m为0至3的整数，优选0或1，并且其中Z为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
ZmCX1X2C基序的一些具体实例是：HCX1X2C，KHCX1X2C，KCX1X2C，RCX1X2C，HCX1X2C，KCX1X2C，RCX1X2C，KKCX1X2C，KRCX1X2C，KHCX1X2C，KKCX1X2C，和KRCX1X2C(对应于SEQ ID NO：172至183)；
ZmCXXC基序的一些更具体实例是：CPYC(SEQ ID NO：98)，HCPYC，KHCPYC，KCPYC，RCPYC，HCGHC，KCGHC，RCGHC，KKCPYC，KRCPYC，KHCGHC，KKCGHC，和KRCGHC(SEQ ID NO：24至35)；
在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序为CX3C(SEQ ID NO：184)，即CXXXC，通常为CX1X2X3C，其中X1、X2和X3各自独立地可以为选自以下的任何氨基酸：G，A，V，L，I，M，F，W，P，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R，和H或如本文中限定的非天然碱性氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2和X3为除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体实施方案中，所述基序中的X1、X2或X3中的至少一个为碱性氨基酸，例如H、K或R，或如本文中限定的非天然碱性氨基酸。
CXXXC基序的一些具体实例是：CXPYC、CPXYC和CPYXC，其中X可以为任意氨基酸，更优选地是：
CXPYC，例如：CKPYC，CRPYC，CHPYC，CGPYC，CAPYC，CVPYC，CLPYC，CIPYC，CMPYC，CFPYC，CWPYC，CPPYC，CSPYC，CTPYC，CCPYC，CYPYC，CNPYC，CQPYC，CDPYC，和CEPYC(SEQ IDNO：185至205)；或者
CPXYC，例如：CPKYC，CPRYC，CPHYC，CPGYC，CPAYC，CPVYC，CPLYC，CPIYC，CPMYC，CPFYC，CPWYC，CPPYC，CPSYC，CPTYC，CPCYC，CPYYC，CPNYC，CPQYC，CPDYC，CPEYC，和CPLYC(SEQID NO：206至227)；或者
CPYXC，例如：CPYKC，CPYPC，CPYHC，CPYGC，CPYAC，CPYVC，CPYLC，CPYIC，CPYMC，CPYFC，CPYWC，CPYPC，CPYSC，CPYTC，CPYCC，CPYYC，CPYNC，CPYQC，CPYDC，CPYEC，和CPYLC(SEQID NO：228至249)。
CXXXC基序的另一些具体实例是：CXHGC、CHXGC和CHGXC，其中X可以为任意氨基酸，更优选地是：
CXHGC，例如：CKHGC，CRHGC，CHHGC，CGHGC，CAHGC，CVHGC，CLHGC，CIHGC，CNHGC，CFHGC，CWHGC，CPHGC，CSHGC，CTHGC，CCHGC，CYHGC，CNHGC，CQHGC，CDHGC，CEHGC，和CKHGC(SEQID NO：250至271)；或者
CGXHC，例如：CGKHC，CGRHC，CGHHC，CGGHC，CGAHC，CGVHC，CGLHC，CGIHC，CGMHC，CGFHC，CGWHC，CGPHC，CGSHC，CGTHC，CGCHC，CGYHC，CGNHC，CGQHC，CGDHC，CGEHC，和CGLHC(SEQID NO：272至293)；或者
CHGXC，例如：CHGKC，CHGRC，CHGHC，CHG，GC，CHGAC，CHGVC，CHGLC，CHGIC，CHGMC，CHGFC，CHGWC，CHGPC，CHGSC，CHGTC，CHGCC，CHGYC，CHGNC，CHGQC，CHGDC，CHGEC，和CHGLC(SEQID NO：294至315)。
CXXXC基序的另一些具体实例是：CXGPC、CGXPC和CGPXC，其中X可以为任意氨基酸，更优选地是：
CXGPC，例如：CKGPC，CRGPC，CHGPC，CGGPC，CAGPC，CVGPC，CLGPC，CIGPC，CMGPC，CFGPC，CWGPC，CPGPC，CSGPC，CTGPC，CCGPC，CYGPC，CNGPC，CQGPC，CDGPC，CEGPC，和CKGPC(SEQID NO：316至337)；
CGXPC，例如：CGKPC，CGRPC，CGHPC，CGGPC，CGAPC，CGVPC，CGPLC，CGIPC，CGMPC，CGFPC，CGWPC，CGPPC，CGSPC，CGTPC，CGCPC，CGYPC，CGNPC，CGQPC，CGDPC，CGEPC，和CGLPC(SEQID NO：338至359)；
CGPXC，例如：CGPKC，CGPRC，CGPHC，CGPGC，CGPAC，CGPVC，CGPLC，CGPIC，CGPMC，CGPFC，CGPWC，CGPPC，CGPSC，CGPTC，CGPCC，CGPYC，CGPNC，CGPQC，CGPDC，CGPEC，和CGPLC(SEQID NO：360至381)。
CXXXC基序的另一些具体实例是：CXGHC、CGXHC、和CGHXC，其中X可以为任意氨基酸，更优选地是：
CXGHC，例如：CKGHC，CRGHC，CHGHC，CGGHC，CAGHC，CVGHC，CLGHC，CIGHC，CMGHC，CFGHC，CWGHC，CPGHC，CSGHC，CTGHC，CCGHC，CYGHC，CNGHC，CQGHC，CDGHC，CEGHC，和CKGHC(SEQID NO：382至403)；或者
CGXFC，例如：CGKFC，CGRFC，CGHFC，CGGFC，CGAFC，CGVFC，CGLFC，CGIFC，CGMFC，CGFFC，CGWFC，CGPFC，CGSFC，CGTFC，CGCFC，CGYFC，CGNFC，CGQFC，CGDFC，CGEFC，和CGLFC(SEQID NO：404至425)；或者
CGHXC，例如：CGHKC，CGHRC，CGHHC，CGHGC，CGHAC，CGHVC，CGHLC，CGHIC，CGHMC，CGHFC，GGHWC，CGHPC，CGHSC，CGHTC，CGHCC，CGHYC，CGHNC，CGHQC，CGHDC，CGHEC，和CGHLC(SEQID NO：426至447)。
CXXXC基序的另一些具体实例是：CXGFC、CGXFC和CGFXC，其中X可以为任意氨基酸，更优选地是：
CXGFC，例如：CKGFC，CRGFC，CHGFC，CGGFC，CAGFC，CVGFC，CLGFC，CIGFC，CMGFC，CFGFC，CWGFC，CPGFC，CSGFC，CTGFC，CCGFC，CYGFC，CNGFC，CQGFC，CDGFC，CEGFC，和CKGFC(SEQID NO：448至469)；或者
CGXFC，例如：CGKFC，CGRFC，CGHFC，CGGFC，CGAFC，CGVFC，CGLFC，CGIFC，CGMFC，CGFFC，CGWFC，CGPFC，CGSFC，CGTFC，CGCFC，CGYFC，CGNFC，CGQFC，CGDFC，CGEFC，和CGLFC(SEQID NO：470至491)；或者
CGFXC，例如：CGFKC，CGFRC，CGFHC，CGFGC，CGFAC，CGFVC，CGFLC，CGFIC，CGFMC，CGFFC，CGFWC，CGFPC，CGFSC，CGFTC，CGFCC，CGFYC，CGFNC，CGFQC，CGFDC，CGFEC，和CGFLC(SEQID NO：492至513)。
CXXXC基序的另一些具体实例是：CXRLC、CRXLC和CRL XC，其中X可以为任意氨基酸，更优选地是：
CXRLC，例如：CKRLC，CRRLC，CHRLC，CGRLC，CARLC，CVRLC，CLRLC，CIRLC，CMRLC，CFRLC，CWRLC，CPRLC，CSRLC，CTRLC，CCRLC，CYRLC，CNRLC，CQRLC，CDRLC，CERLC，和CKRLC(SEQID NO：514至535)；或者
CRXLC，例如：CRKLC，CRRLC，CRHLC，CRGLC，CRALC，CRVLC，CRLLC，CRILC，CRMLC，CRFLC，CRWLC，CRPLC，CRSLC，CRTLC，CRCLC，CRYLC，CRNLC，CRQLC，CRDLC，CRELC，和CRLLC(SEQID NO：536至557)；或者
CRLXC，例如：CRLKC，CRLRC，CRLHC，CRLGC，CRLAC，CRLVC，CRLLC，CRLIC，CRLMC，CRLFC，CRLWC，CRLPC，CRLSC，CRLTC，CRLCC，CRLYC，CRLNC，CRLQC，CRLDC，CRLEC，和CRLLC(SEQID NO：5S8至579)。
CXXXC基序的另一些具体实例是：CXHPC、CHXPC和CHPXC，其中X可以为任意氨基酸，更优选地是：
CXHPC，例如：CKHPC，CRHPC，CHHPC，CGHPC，CAHPC，CVHPC，CLHPC，CIHPC，CMHPC，CFHPC，CWHPC，CPHPC，CSHPC，CTHPC，CCHPC，CYHPC，CNHPC，CQHPC，CDHPC，CEHPC，和CKHPC(SEQID NO：580至601)；或者
CHXPC，例如：CHKPC，CHRPC，CHHPC，CHGPC，CHAPC，CHVPC，CHLPC，CHIPC，CHMPC，CHFPC，CHWPC，CHPPC，CHSPC，CHTPC，CHCPC，CHYPC，CHNPC，CHQPC，CHDPC，CHEPC，和CHLPC(SEQID NO：602至623)；或者
CHPXC，例如：CHPKC，CHPRC，CHPHC，CHPGC，CHPAC，CHPVC，CHPLC，CHPIC，CHPMC，CHPFC，CHPWC，CHPPC，CHPSC，CHPTC，CHPCC，CHPYC，CHPNC，CHPQC，CHPDC，CHPEC，和CHPLC(SEQID NO：624至645)。
这些示例性CXXXC基序中的任一个其前面可以有一个或更多个氨基酸(Zm)，其中m为0至3的整数，优选0或1，并且其中Z为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序是CX4C(SEQ ID NO：646)，即CXXXXC，通常为CX1X2X3X4C，其中X1、X2、X3和X4各自独立地可以为选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2、X3和X4为除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体实施方案中，所述基序中的X1、X2、X3或X4中的至少一个为碱性氨基酸，例如H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
CXXXXC基序的一些具体实例是：CLAVLC，CTVQAC或CGAVHC及其变体，例如：CX1AVLC，CLX2VLC，CLAX3LC，或CLAVX4C；CX1VQAC，CTX2QAC，CTVX3AC，或CTVQX4C；CX1AVHC，CGX2VHC，CGAX3HC，或CGAVX4C(SEQ ID NO：647至660)；其中X1、X2、X3和X4各自独立地可以为选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
这些示例性CXXXXC基序中的任一个其前面可以有一个或更多个氨基酸(Zm)，其中m为0至3的整数，优选0或1，并且其中Z为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R或如本文中限定的非天然碱性氨基酸。
在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序为CX5C(SEQ ID NO：661)，即CXXXXXC，通常为CX1X2X3X4X5C，其中X1、X2、X3、X4和X5各自独立地可以为选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2、X3、X4和X5为除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体实施方案中，所述基序中的X1、X2、X3、X4或X5中的至少一个为碱性氨基酸，例如H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
CXXXXXC基序的一些具体实例是：CPAFPLC或CDQGGEC及其变体，例如：CX1AFPLC，CPX2FPLC，CPAX3PLC，CPAFX4LC，或CPAFPX5C；CX1QGGEC，CDX2GGEC，CDQX3GEC，CDQGX4EC，或CDQGGX5C(SEQ ID NO：662至673)，其中X1、X2、X3、X4和X5各自独立地可以为选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。这些示例性CXXXXXC基序中的任一个其前面可以有一个或更多个氨基酸(Zm)，其中m为0至3的整数，优选0或1，并且其中Z为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序为CX6C(SEQ ID NO：674)，即CXXXXXXC，通常为CX1X2X3X4X5X6C，其中X1、X2、X3、X4、X5和X6各自独立地可以为选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。优选地，所述基序中的X1、X2、X3、X4、X5和X6为除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体实施方案中，所述基序中的X1、X2、X3、X4、X5或X6中的至少一个为碱性氨基酸，例如H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
CXXXXXXC基序的一个具体实例是：CDIADKYC或其变体，例如：CX1IADKYC，CDX2ADKYC，CDIX3DKYC，CDIAX4KYC，CDIADX5YC，或CDIADKX6C(SEQ ID NO：675至681)，其中X1、X2、X3、X4和X5各自独立地可以为选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
这些示例性CXXXXXXC基序中的任一个其前面可以有一个或更多个氨基酸(Zm)，其中m为0至3的整数，优选0或1，并且其中Z为任意氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R，或如本文中所限定的非天然碱性氨基酸。
这样的氧化还原酶基序的一些特别优选的实例是：
C[KHR]C，CX[KHR]XC，CXX[KHR]C，C[KHR]XXC，[KHR]CC，[KHR]CXC，[KHR]XXXC，CC[KHR]，CXC[KHR]，CXXXC[KHR]，[KHR]CC[KHR]，[KHR]CXC[KHR]，[KHR]CXXXC[KHR]，[KHR]C[KHR]C，C[KHR]C[KHR]，[KHR]CXX[KHR]C，[KHR]CX[KHR]XC，[KHR]C[KHR]XXC，CXX[KHR]C[KHR]，CX[KHR]XC[KHR]，C[KHR]XXC[KHR](SEQ ID NO：682至703)等。
还公开了用于在样品中检测II类限制性CD4+T细胞的体外诊断方法中。在该方法中，使样品与MHC II类分子和由根据本发明的非免疫原性RNA编码的肽的复合物接触。通过测量复合物与样品中细胞的结合来检测CD4+T细胞，其中复合物与细胞结合表明样品中存在CD4+T细胞。该复合物可以是肽与MHC II类分子的融合蛋白。或者，复合物中的MHC分子是四聚体。该复合物可作为可溶性分子提供或可与载体连接。
还公开了用于在样品中检测NKT细胞的体外诊断方法中。在该方法中，使样品与CD1d分子和由根据本发明的非免疫原性RNA编码的肽的复合物接触。通过测量复合物与样品中细胞的结合来检测NKT细胞，其中结合，复合物可以是肽与CD1d分子的融合蛋白。
因此，在一些具体实施方案中，本发明的治疗和预防方法包括施用如本文中所述的编码肽的非免疫原性RNA，其中所述肽包含在待治疗的疾病中发挥作用的抗原蛋白质的T细胞表位(例如如上所述的那些)。在另一些具体实施方案中，使用的表位是优势表位。
在一个优选实施方案中，本文中所述的非免疫原性RNA配制在以下中来施用：载体或递送载剂，例如纳米颗粒制剂，特别是脂质复合物(lipoplex)制剂，例如在WO188730A1中所公开的那些。因此，如本文中所述，本文中所述的非免疫原性RNA分子可配制在载体或递送载剂中(例如在纳米颗粒或纳米颗粒制剂、特别是脂质复合物制剂中)存在。
在一个实施方案中，可使用递送载剂，其在全身性施用之后将非免疫原性RNA分子递送至脾中的抗原呈递细胞，例如树突细胞(dendrite cell，DC)。例如，具有确定颗粒大小的纳米颗粒RNA制剂在全身性施用之后导致RNA向脾DC的大量递送，在所述制剂中颗粒的净电荷接近零或为负，例如RNA与脂质体的电中性或带负电荷的脂质复合物，例如包含DOTMA和DOPE或DOTMA和胆固醇的脂质复合物。特别优选的是纳米颗粒RNA制剂，其中纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比例为1.4∶1或更小和/或纳米颗粒的ζ电位为0或更小。在一个实施方案中，纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比例为1.4∶1至1∶8，优选1.2∶1至1∶4，例如1∶1至1∶3，例如1∶1.2至1∶2、1∶1.2至1∶1.8、1∶1.3至1∶1.7，特别是1∶1.4至1∶1.6，例如约1∶1.5。在一个实施方案中，纳米颗粒的ζ电位为-5或更小、-10或更小、-15或更小、-20或更小或者-25或更小。在多个实施方案中，纳米颗粒的ζ电位为-35或更高、-30或更高或者-25或更高。在一个实施方案中，纳米颗粒具有0mV至-50mV，优选0mV至-40mV或-10mV至-30mV的ζ电位。在一个实施方案中，正电荷由纳米颗粒中存在的至少一种阳离子脂质贡献，并且负电荷由RNA贡献。在一个实施方案中，纳米颗粒包含至少一种辅助脂质。辅助脂质可以是中性或阴离子脂质。
在一个实施方案中，纳米颗粒是包含DOTMA和DOPE的脂质复合物，DOTMA与DOPE的摩尔比为10∶0至1∶9，优选8∶2至3∶7，并且更优选地为7∶3至5∶5，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比例为1.8∶2至0.8∶2，更优选1.6∶2至1∶2，甚至更优选1.4∶2至1.1∶2，并且甚至更优选约1.2∶2。在一个实施方案中，纳米颗粒是包含DOTMA和胆固醇的脂质复合物，DOTMA与胆固醇的摩尔比为10∶0至1∶9，优选8∶2至3∶7，并且更优选地为7∶3至5∶5，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比例为1.8∶2至0.8∶2，更优选1.6∶2至1∶2，甚至更优选1.4∶2至1.1∶2，并且甚至更优选约1.2∶2。
在一个实施方案中，纳米颗粒是包含DOTAP和DOPE的脂质复合物，DOTAP与DOPE的摩尔比为10∶0至1∶9，优选8∶2至3∶7，并且更优选地为7∶3至5∶5，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比例为1.8∶2至0.8∶2，更优选1.6∶2至1∶2，甚至更优选1.4∶2至1.1∶2，并且甚至更优选约1.2∶2。
在一个实施方案中，纳米颗粒是包含DOTMA和DOPE的脂质复合物，DOTMA与DOPE的摩尔比为2∶1至1∶2，优选2∶1至1∶1，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比例为1.4∶1或更小。
在一个实施方案中，纳米颗粒是包含DOTMA和胆固醇的脂质复合物，DOTMA与胆固醇的摩尔比为2∶1至1∶2，优选2∶1至1∶1，并且其中DOTMA中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比例为1.4∶1或更小。
在一个实施方案中，纳米颗粒是包含DOTAP和DOPE的脂质复合物，DOTAP与DOPE的摩尔比为2∶1至1∶2，优选2∶1至1∶1，并且其中DOTAP中的正电荷与RNA中的负电荷的电荷比例为1.4∶1或更小。
在一个实施方案中，根据本发明的非免疫原性RNA配制在F12或F5脂质体(优选F12脂质体)中。本文中使用的术语“F12”表示包含摩尔比为2∶1的DOTMA和DOPE的脂质体和使用这样的脂质体形成的具有RNA的脂质复合物。本文中使用的术语“F5”表示包含摩尔比为1∶1的DOTMA和胆固醇的脂质体和使用这样的脂质体形成的具有RNA的脂质复合物。
本文中使用的术语“纳米颗粒”是指具有使颗粒适合于全身性施用、特别是肠胃外施用的直径(通常小于1000纳米(nm)的直径)的任何颗粒，特别是核酸的颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径为小于600nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径为小于400nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均直径为约SO nm至约1000nm，优选约50nm至约400nm，优选约100nm至约300nm，例如约150nm至约200nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径为约200至约700nm，约200至约600nm，优选约250至约550nm，特别是约300至约500nm或约200至约400nm。
本文中使用的术语“纳米颗粒制剂”或类似术语是指包含至少一种纳米颗粒的任何物质。在一些实施方案中，纳米颗粒制剂是纳米颗粒的均质集合。在一些实施方案中，纳米颗粒制剂是分散体或乳剂。通常来说，当组合至少两种不混溶性物质时，形成分散体或乳剂。
术语“脂质复合物”或“核酸脂质复合物”(特别是“RNA脂质复合物”)当在本文中使用时是指脂质与核酸(特别是RNA)的复合物。当将通常还包含中性“辅助性”脂质的阳离子脂质体与核酸混合时，脂质复合物自发地形成。
如果本公开内容涉及电荷(例如正电荷、负电荷或中性电荷)或者阳离子化合物、负性化合物或中性化合物，这通常意指提到的电荷存在于选定的pH(例如生理pH)下。例如，术语“阳离子脂质”意指在选定pH(例如生理pH)下带有净正电荷的脂质。术语“中性脂质”意指在选定pH(例如生理pH)下无净正电荷或负电荷的脂质并且可以以不带电荷或中性两性离子的形式存在。本文中的“生理pH”意指约7.5的pH。
如本文中所公开的考虑使用的纳米颗粒载体(例如脂质载体)可包括可与核酸(例如RNA)缔合的任何物质或载剂，例如通过与核酸形成复合物或形成核酸被封闭或封装在其中的囊泡来缔合。与裸核酸相比，这可使得提高核酸的稳定性。特别地，可提高血液中核酸的稳定性。阳离子脂质、阳离子聚合物和其他带正电荷的物质可与带负电荷的核酸形成复合物。这些阳离子分子各自可用于与核酸复合，从而形成例如所谓的脂质复合物或多聚复合物(polyplex)，并且这些复合物已被表明将核酸递送到细胞内。
用于如本文中所公开的纳米颗粒核酸制剂可通过多种方案并且由多种核酸复合化合物获得。脂质、聚合物、寡聚物或两亲物是典型的复合剂。在一个实施方案中，复合化合物包含选自以下的至少一种试剂：鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、多聚-L-赖氨酸、多聚-L-精氨酸或组蛋白。鱼精蛋白可用作阳离子载体剂。术语“鱼精蛋白”是指具有相对低分子量的多种强碱性蛋白中的任一种，其富含精氨酸并且被发现在不同动物(例如鱼)的精细胞中替代体细胞组蛋白尤其与DNA缔合。特别地，术语“鱼精蛋白”是指在鱼精中存在的蛋白质，其是强列碱性的，可溶于水，加热不凝固，并且在水解后主要产生精氨酸。以纯化的形式，其用于胰岛素的长效制剂并且用于中和肝素的抗凝作用。根据本发明，本文中使用的术语“鱼精蛋白”意指包含获得自或来源于天然或生物来源的任何鱼精蛋白氨基酸序列(包括其片段)和所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式。此外，该术语涵盖这样的(合成的)多肽，其是人工的且专为特定目的而设计，并且不能从天然或生物来源中分离。如本文中所公开使用的鱼精蛋白可以是硫酸化鱼精蛋白或盐酸鱼精蛋白。在一个优选实施方案中，用于产生本文中所述纳米颗粒的鱼精蛋白来源是鱼精蛋白5000，其在等张盐溶液中包含多于10mg/ml的鱼精蛋白(每毫升5000个肝素中和单位)。
脂质体是微观的脂质囊泡，其通常具有一个或更多个囊泡形成脂质(vesicle-forming lipid)(例如磷脂)双层，并且能够封装药物。在本公开内容的情况中可使用不同类型的脂质体，包括但不限于多层囊泡(multilamellar vesicle，MLV)、小单层囊泡(smallunilamellar vesicle，SUV)、大单层囊泡(large unilamellar vesicle，LUV)、空间稳定脂质体(sterically stabilized liposome，SSL)、多泡囊泡(multivesicular vesicle，MV)和大多泡囊泡(large multivesicular vesicle，LMV)以及本领域中已知的其他双层形式。脂质体的大小和层数(lamellarity)取决于制备方式，并且所使用囊泡类型的选择取决于优选施用模式。存在数种其他其中脂质可存在于水性介质中的超分子组织形式，包含由单层构成的层状相、六角相和反六角相、立方相、胶束、反胶束。这些相也可与DNA或RNA组合获得，并且与RNA和DNA的相互作用可显著影响相态。所述相可存在于本文中所公开的纳米颗粒核酸制剂中。
对于由核酸和脂质体形成核酸脂质复合物，可使用形成脂质体的任何合适方法，只要其提供所考虑的核酸脂质复合物即可。脂质体可使用标准方法形成，例如反蒸发法(reverse evaporation method，REV)、乙醇注入法、脱水-再水合法(dehydration-rehydration method，DRV)、超声处理或其他合适的方法。
脂质体形成后，可对脂质体进行尺寸调节以获得具有基本上均匀的尺寸范围的脂质体群。
双层形成脂质(bilayer-forming lipid)通常具有两条烃链(特别是酰基链)和极性或非极性的头基。双层形成脂质由天然存在脂质构成或是合成来源的，包括磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中两条烃链的长度通常为约14至22个碳原子，并且具有不同的不饱和度。如本文中所公开的组合物中使用的另一些合适脂质包括糖脂和固醇，例如胆固醇及其也可用于脂质体中的多种类似物。
阳离子脂质通常具有亲脂性部分，例如固醇、酰基或二酰基链，并且具有总净正电荷。脂质的头基通常携带正电荷。阳离子脂质优选具有1至10价的正电荷，更优选1至3价的正电荷，并且更优选1价的正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、1，2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1，2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、1，2-二豆蔻酰氧基丙基-1，3-二甲基羟乙基铵(DMRIE)和2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)。优选的是DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。最优选的是DOTMA。
此外，考虑到结构稳定性等，本文中所述的纳米颗粒优选地还包含中性脂质。中性脂质可适当地考虑核酸-脂质复合物的递送效率而选择。中性脂质的实例包括但不限于1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、固醇和脑苷脂。优选的是DOPE和/或DOPC。最优选的是DOPE。在其中阳离子脂质体包含阳离子脂质和中性脂质二者的情况下，可适当地考虑脂质体的稳定性等来确定阳离子脂质与中性脂质的摩尔比。根据一个实施方案，本文中所述的纳米颗粒可包含磷脂。磷脂可以是甘油磷脂。甘油磷脂的实例包括但不限于三种脂质类型：(i)两性离子磷脂，其包括例如磷脂酰胆碱(PC)、卵黄磷脂酰胆碱、天然部分氢化或完全氢化形式的大豆来源PC、二豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、鞘磷脂(SM)；(ii)带负电荷的磷脂，其包括例如磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、二棕榈酰基PG、二豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)，其中缀合物使得两性离子磷脂带负电荷的合成衍生物，例如甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)的情况；以及(iii)阳离子磷脂，其包括例如其中磷酸单酯被O-甲基化以形成阳离子脂质的磷脂酰胆碱或鞘磷脂。
核酸与脂质载体的缔合可例如通过核酸填充载体的空隙空间使得载体物理捕获核酸，或者通过共价键合、离子键合或氢键键合，或者通过经由非特异性键的吸附来发生。
在一个实施方案中，向对象施用编码如本文中所述的包含与自身抗原的T细胞表位连接的氧化还原酶基序的肽的非免疫原性RNA。RNA的翻译产物可在对象的细胞中形成，并且产物可展示给免疫系统用于诱导针对靶向自身抗原的自身反应性T细胞的耐受。
或者，本发明考虑了这样的实施方案，其中将表达如本文中所述的包含与自身抗原的T细胞表位连接的氧化还原酶基序的肽的非免疫原性RNA引入到细胞例如离体抗原呈递细胞(例如取自患者的抗原呈递细胞)中，并将任选地离体克隆繁殖的细胞移植回同一患者体内。可使用本领域中已知的任何方法，优选地通过静脉内、腔内或腹膜内施用以无菌形式将经转染的细胞重新引入到患者中。合适的细胞包括抗原呈递细胞。抗原呈递细胞优选地为树突细胞、巨噬细胞、B细胞、间充质基质细胞、上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞，并且最优选地为树突细胞。因此，本发明还包括用于治疗自身免疫病的方法，其包括向需要的对象施用表达本文中所述的非免疫原性RNA的分离的抗原呈递细胞。细胞可以是与对象自体的、同种异体的、同基因或异源的。本文中使用的术语“核酸”旨在包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，例如eDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。根据本发明，RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。根据本发明，核酸优选是分离的核酸。此外，本文中所述的核酸可以是重组分子。
当在本文中使用时，术语“分离的核酸”意指核酸(i)在体外扩增，例如通过聚合酶链反应(PCR)体外扩增；(ii)通过克隆重组产生；(iii)是纯化的，例如通过切割并通过凝胶电泳分离而纯化的；或(iv)是合成的，例如通过化学合成而合成的。核酸可用于引入到细胞中，即转染细胞，例如以RNA的形式，其可通过体外转录由DNA模板制备。此外，可在应用之前通过稳定化序列、加帽和多聚腺苷酸化对RNA进行修饰。
本文中使用的术语“DNA”涉及包含脱氧核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由脱氧核糖核苷酸残基构成的分子。“脱氧核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2′位处缺乏羟基的核苷酸。术语“DNA”包括分离的DNA，例如部分或完全纯化的DNA、基本上纯的DNA、合成的DNA和重组产生的DNA，并且包括通过一个或更多个核苷酸的添加、缺失、替换和/或改变而不同于天然存在DNA的经修饰DNA。这样的改变可包括将非核苷酸物质添加至例如DNA的末端或内部，例如DNA的一个或更多个核苷酸处。DNA分子中的核苷酸还可包括非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸。这些改变的DNA可称为类似物或天然存在DNA的类似物。
本文中使用的术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2′位处具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，例如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在RNA的经修饰RNA。这样的改变可包括将非核苷酸物质添加至例如RNA的末端或内部，例如RNA的一个或更多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可包括非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物或天然存在RNA的类似物。根据本发明，术语“RNA”包括并优选地涉及“mRNA”，其意指“信使RNA”并且涉及可使用DNA作为模板产生且编码肽或蛋白质的转录物。mRNA通常包含5’非翻译区(5’-UTR)、蛋白质或肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。mRNA在细胞中和在体外具有有限的半衰期。优选地，mRNA使用DNA模板通过体外转录产生。在本发明的一个实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成获得。体外转录方法是技术人员已知的。例如，有多种体外转录试剂盒可商购获得。
可根据需要改变RNA的稳定性和翻译效率。例如，可通过具有稳定化作用和/或提高RNA翻译效率的一种或更多种修饰来使RNA稳定化并提高其翻译。为了提高根据本发明使用的RNA的表达，可在编码区(即编码所表达的肽或蛋白质的序列)内，优选地在不改变所表达肽或蛋白质的序列的情况下对其进行修饰以提高GC含量从而提高mRNA稳定性并进行密码子优化，并因此增强在细胞中的翻译。
在本文中使用的RNA的上下文中，术语“修饰”包括对RNA的非天然存在于所述RNA中的任何修饰。在一个实施方案中，RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。去除这样的未加帽的5’-三磷酸可通过用磷酸酶处理RNA来实现。RNA可具有经修饰的核糖核苷酸以提高其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在RNA中，5-甲基胞苷被部分或完全(优选完全)替换为胞苷。作为替代或补充，在一个实施方案中，在RNA中，假尿苷被部分或完全(优选完全)替换为尿苷。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及向RNA提供5’-帽或5’-帽类似物。术语“5’-帽”是指见于mRNA分子的5’-端上的帽结构，并且通常由通过不寻常的5’至5’三磷酸酯键与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7-位甲基化。术语“常规5’-帽”是指天然存在的RNA5’-帽，优选7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构并且被修饰以具有稳定化RNA和/或增强RNA翻译(如果连接于RNA的话，优选在体内和/或在细胞中)之能力的5’-帽类似物。
RNA可包含另外的修饰。例如，本发明中使用的RNA的另外修饰可以是延伸或截短天然存在的poly(A)尾或者改变5’-或3’-非翻译区(UTR)，例如引入与所述RNA的编码区不相关的UTR，例如用来源于珠蛋白基因的3’-UTR交换已有的3’-UTR或者插入来源于球蛋白基因的3’-UTR的一个或更多个(优选两个)拷贝，所述球蛋白基因例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白。
与具有经掩蔽poly-A序列的RNA相比，具有未掩蔽poly-A序列的RNA更高效地翻译。术语“poly(A)尾”或“poly-A序列”涉及通常位于RNA分子的3’端的腺嘌呤基(A)残基的序列，并且“未掩蔽poly-A序列”意指RNA分子3’端的poly-A序列以poly-A序列的A结束，并且除位于poly-A序列3’端(即下游)的A之外，在此之后没有核苷酸。此外，约120个碱基对的长poly-A序列产生最佳的转录物稳定性和RNA翻译效率。
因此，为了提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可对其进行修饰以使其与poly-A序列联合存在，所述poly-A序列的长度优选为10至500，更优选30至300，甚至更优选65至200，并且尤其是100至150个腺苷残基。在一个尤其优选的实施方案中，poly-A序列的长度为约120个腺苷残基。为了进一步提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，poly-A序列可以是未掩蔽的。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子的一半活性、量或数目所需的时间。在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可能影响RNA的“表达持续时间”。可预期具有长半衰期的RNA将长时间表达。当然，如果根据本发明期望降低RNA的稳定性和/或翻译效率，则可对RNA进行修饰以干扰如上所述提高RNA的稳定性和/或翻译效率的元件的功能。根据本发明施用的RNA是非免疫原性的。
本文中使用的术语“非免疫原性RNA”是指在(例如向哺乳动物)施用之后不诱导免疫系统针对RNA分子本身的应答的RNA，或者诱导比由相同RNA所诱导的应答更弱的RNA，所述相同RNA的不同之处仅在于其未进行使得非免疫原性RNA成为非免疫原性的修饰和处理。然而，所述术语不排除针对溶细胞性CD4+T细胞发育和成熟而引发的间接免疫应答。在一个优选实施方案中，通过将抑制RNA介导的固有免疫受体活化的经修饰核苷酸并入到RNA中并去除双链RNA(dsRNA)使得非免疫原性RNA成为非免疫原性的。为了通过并入经修饰核苷酸而使得非免疫原性RNA成为非免疫原性的，可使用任何经修饰核苷酸，只要其降低或抑制RNA的免疫原性即可。特别优选的是抑制RNA介导的固有免疫受体活化的经修饰核苷酸。在一个实施方案中，经修饰核苷酸包含用包含经修饰核碱基的核苷对一个或更多个尿苷的替换。在一个实施方案中，经修饰核碱基是经修饰尿嘧啶。在一个实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷选自：3-甲基尿苷(m3U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-氮杂尿苷、6-氮杂尿苷、2-硫代-5-氮杂尿苷、2-硫代尿苷(s2U)、4-硫代尿苷(s4U)、4-硫代假尿苷、2-硫代假尿苷、5-羟基尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基尿苷、5-卤代尿苷(例如，5-碘代尿苷或5-溴代尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基尿苷(cm5U)、1-羧甲基假尿苷、5-羧基羟甲基尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷(mcm5s2U)、5-氨甲基-2-硫代尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨甲基尿苷(mnm5U)、1-乙基假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨甲基-2-硒尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰甲基尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨甲基尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基尿苷、1-丙炔基假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代假尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基假尿苷、3-甲基假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-脱氮假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基二氢尿苷(m5D)、2-硫代二氢尿苷、2-硫代二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代尿苷、4-甲氧基假尿苷、4-甲氧基-2-硫代假尿苷、N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代尿苷(inm5s2U)、α-硫代尿苷、2′-O-甲基尿苷(Um)、5，2′-O-二甲基尿苷(m5Um)、2′-O-甲基假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰甲基-2′-O-甲基尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨甲基-2′-O-甲基尿苷(cmnm5Um)、3，2′-O-二甲基尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2′-O-甲基尿苷(inm5Um)、1-硫代尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖尿苷、5-(2-甲酯基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
在一个优选实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷的结构是N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)。
在使用T7 RNA聚合酶通过体外转录(IVT)合成mRNA期间，由于酶的非常规活性，产生了大量的异常产物，包括双链RNA(dsRNA)。dsRNA诱导炎性细胞因子并活化效应酶，导致蛋白质合成抑制。dsRNA可例如通过使用无孔或多孔C-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)基质的离子对反相HPLC从RNA(例如IVT RNA)中去除。或者，可使用基于酶的方法，其使用特异性水解dsRNA而非ssRNA的大肠杆菌(E.coli)RNA酶III(RNaseIII)，从而从IVT RNA制备物中消除dsRNA污染物。此外，可通过使用纤维素材料将dsRNA与ssRNA分离。在一个实施方案中，使RNA制备物与纤维素材料接触，并且在允许dsRNA与纤维素材料结合并且不允许ssRNA与纤维素材料结合的条件下将ssRNA与纤维素材料分离。本文中使用的术语“去除”是指将第一物质群体(例如非免疫原性RNA)的特征与第二物质群体(例如dsRNA)的邻近性区分开，其中第一物质群体不一定缺少第二物质，并且第二物质群体不一定缺少第一物质。然而，与第一物质和第二物质的未分离混合物相比，以去除第二物质群体为特征的第一物质群体具有可测量的较低的第二物质含量。
可通过物理、化学或生物学手段将核酸转移到宿主细胞中。用于将核酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染(lipofection)、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。
用于将目的核酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体并且尤其是反转录病毒载体已成为用于将基因插入到哺乳动物(例如人)细胞中的最广泛使用的方法。另一些病毒载体可来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。用于将核酸引入到宿主细胞中的化学手段包括胶体分散体系，例如大分子复合物、纳米囊、微球、珠；以及基于脂质的体系，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作在体外和体内递送载剂的优选胶体体系是脂质体(即，人工膜性小泡(membrane vesicle))。这样的体系的制备和使用是本领域中公知的。
“编码”是指在具有确定的核苷酸序列或确定的氨基酸序列的生物过程中，核酸中特定核苷酸序列用作用于合成另一些聚合物和大分子之模板的固有特性。因此，如果在细胞或其他生物体系中核酸的表达(翻译和任选地转录)产生蛋白质，则核酸编码蛋白质。根据本发明，术语“表达”以其最一般含义使用并且包括产生RNA和/或肽或多肽，例如通过转录和/或翻译。关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别地涉及产生肽或多肽。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及其中将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，可将RNA翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中优选使用合适的细胞提取物在无细胞系统中体外合成RNA(特别是mRNA)的过程。优选地，克隆载体被应用于产生转录物。这些克隆载体通常被指定为转录载体并且根据本发明被术语“载体”所涵盖。根据本发明，本发明中使用的RNA优选为体外转录的RNA(IVT-RNA)并且可通过合适DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6RNA聚合酶。优选地，根据本发明的体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸(特别是cDNA)，并将其引入到用于体外转录的合适载体中来获得。cDNA可通过RNA的逆转录来获得。
根据本发明的术语“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过该过程，信使RNA的链指导氨基酸序列组装以产生肽或多肽。根据本发明，优选的是编码肽或蛋白质的核酸(例如RNA)一旦被细胞摄取或者引入(即转染或转导)到细胞中，则导致所述肽或蛋白质的表达，所述细胞可存在于体外或对象中。细胞可在细胞内(例如在胞质中和/或在胞核中)表达编码的肽或蛋白质，可分泌编码的肽或蛋白质，或者可将其在表面上表达。
根据本发明，术语例如“核酸表达”和“核酸编码”或类似术语在本文中可互换使用，并且对于特定的肽或多肽意味着核酸(如果存在于适当的环境中的话，优选在细胞中)可被表达以产生所述肽或多肽。
术语例如“转移”、“引入”、“转染”或“转导”在本文中可互换使用，并且涉及将核酸(特别是外源或异源核酸(例如RNA))引入到细胞中。根据本发明，细胞可存在于体外或体内，例如，细胞可形成器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，如果转染的遗传物质仅是瞬时表达的就足够了。由于在转染过程中引入的核酸通常不整合到核基因组中，因此外来核酸将通过有丝分裂被稀释或降解。允许核酸附加型(episomal)扩增的细胞系大辐降低了稀释的速率。如果希望经转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定的转染。可将RNA转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。
本文中所述的药剂可以以任何合适的药物组合物的形式施用。术语“药物组合物”涉及包含治疗有效药剂或其盐的制剂，优选与药物赋形剂(例如缓冲剂、防腐剂和张力调节剂)一起。所述药物组合物可用于通过将所述药物组合物施用于个体来治疗或预防疾病或病症。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。药物组合物可局部或全身性施用。
术语“全身性施用”是指施用治疗有效的药剂以使得药剂以显著量广泛地分布于个体的体内并且产生生物学作用。根据本发明，优选地施用通过肠胃外施用进行。
术语“肠胃外施用”是指施用治疗有效的药剂以使得药剂不通过肠。术语“肠胃外施用”包括静脉内施用、皮下施用、肌内施用、皮内施用或动脉内施用，但不限于此。
本发明的方法还优选地包括进一步向对象提供免疫抑制化合物。如果免疫抑制化合物是肽或多肽，则可通过施用免疫抑制化合物或编码免疫抑制化合物的核酸(例如RNA)而将其提供给对象。免疫抑制化合物可选自转化生长因子β(TGF-β)、白介素10(IL 10)、白介素1受体拮抗剂(IL-1RA)、白介素4(IL-4)、白介素27(IL-27)、白介素35(TL-35)、程序性死亡-配体1(PD-L1)、诱导型T细胞共刺激分子配体(ICOSL)、B7-H4、CD39、CD73、FAS、FAS-IL、吲哚胺2，3-双加氧酶1(IDO1)、吲哚胺2，3-双加氧酶2(ID02)、乙醛脱氢酶1(ALDH1)/视黄醛脱氢酶(RALDH)、精氨酸酶1(ARG1)、精氨酸酶2(ARG2)、氧化亚氮合酶(NOS2)、半乳凝素(galectin)-1、半乳凝素-9、脑信号蛋白(semaphorin)4A及其任何组合。此外，本文中所述的组合物可包含这样的免疫抑制化合物或者编码这样的免疫抑制化合物的核酸(例如RNA)。
根据本发明的药物组合物通常以“药用有效量”和“可药用制剂”施用。
术语“药用有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及抑制疾病进程。这包括减慢疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。治疗疾病的期望反应也可以是延迟所述疾病或所述病症的发生或者预防其发生。本文中所述组合物的有效量将取决于待治疗的病症；疾病的严重程度；患者的个体参数，包括年龄、生理状况、身材大小和体重；治疗持续时间；伴随治疗(如果存在的话)的类型；具体施用途径；以及类似因素。因此，本文中所述组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在采用初始剂量患者的反应不足够的情况下，可使用更高的剂量(或通过不同的更局部化的施用途径实现有效地更高的剂量)。
术语“可药用”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。
本发明的药物组合物可包含盐、缓冲剂、防腐剂、载体和任选地其他治疗剂。优选地，本发明的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
术语“赋形剂”旨在表示药物组合物中不是活性成分的所有物质，例如黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂和/或稀化剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮物(solid suspension)和/或混合介质中的任意一种或更多种。
术语“载体”涉及适用于向人施用的一种或更多种相容性固体或液体填充剂或稀释剂。术语“载体”涉及天然或合成的有机或无机组分，其与活性组分组合以促进活性组分的应用。优选地，载体组分是无菌液体，例如水或油，包括来源于矿物油、动物或植物的那些，例如花生油、大豆油、芝麻油、向日葵油等。盐溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作水性载体化合物。
用于治疗用途的可药用载体或稀释剂在制药领域中是公知的，并且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)中。合适的载体的实例包括例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可豆脂等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。可针对预期的施用途径和标准药学实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。本发明的药物组合物可包含以下作为载体、赋形剂或稀释剂或者除载体、赋形剂或稀释剂之外还可以包含以下：任何合适的黏合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂和/或增溶剂。合适的黏合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖例如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖(free-flow lactose)、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成胶例如阿拉伯胶、西黄蓍胶或藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至矫味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可使用抗氧化剂和助悬剂。在一个实施方案中，该组合物是水性组合物。水性组合物可任选地包含溶质，例如盐。在一个实施方案中，所述组合物为冻干组合物的形式。冻干组合物可通过冷冻干燥相应的水性组合物来获得。通过以下附图和实施例对本发明进行进一步举例说明，所述附图和实施例不应被解释为限制本发明的范围。
由非免疫原性RNA编码的肽可在体外和体内方法中测试T细胞表位之存在，并且可在体外测定中测试其还原活性。作为最终的品质控制，可以在体外测定中测试所述肽，以验证该肽是否可产生通过针对呈递包含表位序列的抗原的抗原呈递细胞的凋亡途径而具有溶细胞性的CD4+T细胞，或NKT细胞，所述表位序列也存在于具有经修饰的氧化还原酶基序的肽中。本文中公开的这样的肽可使用重组DNA技术在细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞中产生。鉴于肽的长度有限，其可通过化学肽合成来制备，其中肽通过将不同的氨基酸彼此偶联来制备。化学合成特别适合于包含例如D-氨基酸、具有非天然存在的侧链的氨基酸或具有经修饰的侧链的天然氨基端等。
化学肽合成方法已充分描述，并且可从公司例如Applied Biosystems和其他公司订购肽。
肽合成可以以固相肽合成(solid phase peptide synthesis，SPPS)或与液相肽合成相反的方式来进行。最著名的SPPS方法是t-Boc和Fmoc固相化学：
在肽合成期间，使用了数个保护基。例如，羟基和羧基官能团通过叔丁基保护，赖氨酸和色氨酸通过t-Boc基团保护，以及天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和组氨酸通过三苯甲基保护，以及精氨酸通过pbf基团保护。如果合适，在合成之后，这样的保护基可以留在肽上。可使用如Kent(Schnelzer&Kent(1992)lnt.J.Pept.Protein Res.40，180-193)最初所描述的以及例如Tam et al.(2001)Biopolymers 60，194-205中综述的连接策略(两个未经保护的肽片段的化学选择性偶联)将肽彼此连接以形成更长的肽，这为实现蛋白质合成提供了巨大的潜能，这超出了SPPS的范围。通过该方法已经成功地合成了尺寸为100至300个残基的许多蛋白质。由于SPPS的巨大进步，合成肽在生物化学、药理学、神经生物学、酶学和分子生物学的研究领域中继续发挥着越来越至关重要的作用。
或者，所述肽可通过在包含编码核苷酸序列的合适的表达载体中使用编码本发明肽的核酸分子来合成。这样的DNA分子可使用自动化DNA合成仪和遗传密码的公知的密码子-氨基酸关系来容易地制备。使用寡核苷酸探针和常规杂交方法，这样的DNA分子也可作为基因组DNA或作为cDNA获得。可将这样的DNA分子并入到表达载体(包括质粒)中，其适合于在合适的宿主例如细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母细胞、动物细胞或植物细胞中表达DNA和产生多肽。
对目的肽的物理和化学特性(例如溶解度、稳定性)进行检查，以确定该肽是否/是否将适合于用于治疗组合物中。通常来说，这通过调节肽的序列来优化。任选地，可在合成之后使用本领域已知的技术对肽进行修饰(化学修饰，例如添加/缺失官能团)。
包含标准氧化还原酶基序和MHC II类T细胞表位的肽的作用机制被以上引用的PCT申请WO2008/017517和本发明人的公开中公开的实验数据证实。包含标准氧化还原酶基序和CD1d结合NKT-细胞表位的免疫原性肽的作用机制被以上引用的PCT申请WO2012/069568和本发明人的公开中公开的实验数据证实。
本发明提供了通过施用编码包含与如本文中所述的氧化还原酶基序连接的T细胞表位(分别为MHC II类或NKT表位)的肽的非免疫原性RNA而在体内或体外产生抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞(当使用如本文中公开的包含MHC II类表位的免疫原性肽时)或抗原特异性溶细胞性NKT细胞(当使用如本文中公开的包含结合CD1d分子的NKT细胞表位的免疫原性肽时)的方法。
本发明描述了用于产生抗原特异性CD4+T细胞或NKT细胞的体内方法。一个具体实施方案涉及通过用编码如本文中公开的肽的非免疫原性RNA对动物(包括人)进行免疫接种并随后从经免疫接种的动物分离CD4+T细胞或NKT细胞来产生或分离CD4+T细胞或NKT细胞的方法。本发明描述了用于产生针对APC的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞或NKT细胞的体外方法。本发明提供了用于产生针对APC的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞和NKT细胞的方法。
在一个实施方案中，提供了这样的方法，其包括分离外周血细胞，通过如本文中所述的肽体外刺激细胞群，以及扩增经刺激的细胞群，更特别地在存在IL-2的情况下进行。根据本发明的方法的优点是产生高数目的CD4+T细胞，并且可产生对抗原蛋白质具有特异性的CD4+T细胞(通过使用包含抗原特异性表位的肽)。
在一个替代实施方案中，CD4+T细胞可以在体内产生，即通过向对象注射如本文中所述的免疫原性肽或编码这样的肽的非免疫原性RNA，以及收集体内产生的溶细胞性CD4+T细胞。
可通过本发明的方法获得的针对APC的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞在预防变应性反应和治疗自身免疫病中向哺乳动物施用免疫治疗是特别令人感兴趣的。设想了使用同种细胞和自体细胞二者。
溶细胞性CD4+T细胞群如下文中所述获得。
在一个实施方案中，本发明提供了扩增特异性NKT细胞的方法，其结果是活性提高，包括但不限于：
(i)细胞因子产生提高
(ii)抗原呈递细胞的接触依赖性消除和可溶性因子依赖性消除提高。因此，结果是对胞内病原体、自身抗原，优选涉及1型糖尿病(T1D)、脱髓鞘病症例如多发性硬化(MS)或视神经脊髓炎(NMO)或者类风湿性关节炎(RA)的自身抗原的更加有效的应答。
本发明还涉及在体液或器官中鉴定具有所需特性的NKT细胞。该方法包括通过其表面表型(包括NK1.1、CD4、NKG2D和CD244的表达)鉴定NKT细胞。然后使细胞与限定为能够由CD1d分子呈递的肽的NKT细胞表位接触。然后将细胞在存在IL-2或IL-15或IL-7的情况下进行体外扩增。
如本文中所述的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞或NKT细胞可用作药物，更特别地用于过继细胞治疗，更特别地用于治疗急性变应性反应和自身免疫病(例如1型糖尿病(T1D)、脱髓鞘病症例如多发性硬化(MS)或视神经脊髓炎(NMO)或者类风湿性关节炎(RA)中)的复发。如所述产生的分离的溶细胞性CD4+T细胞或NKT细胞或细胞群，更特别地抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞或NKT细胞群用于制备用于预防或治疗(自身)免疫病症的药物。公开了通过使用分离的或产生的溶细胞性CD4+T细胞或NKT细胞的治疗方法。
如WO2008/017517中说明的，针对APC的溶细胞性CD4+T细胞可基于细胞的表达特征区别于天然Treg细胞。更特别地，与天然Treg细胞群相比，溶细胞性CD4+T细胞群显示出以下特征中的一种或更多种：
在活化之后表面标志物(包括CD103、CTLA-4、Fasl和ICOS)的表达提高，CD25中等表达，CD4、ICOS、CTLA-4、GITR表达以及CD127(IL7-R)低表达或不表达，CD27不表达，转录因子T-bet和egr-2(Krox-20)表达但转录阻遏物Foxp3不表达，高IFN-γ产生，以及无或仅痕量的IL-10、IL-4、IL-5、IL-13或TGF-β。
此外，溶细胞性T细胞表达CD45RO和/或CD45RA，不表达CCR7、CD27，并且呈现高水平的颗粒酶B和其他颗粒酶以及Fas配体。
如WO2008/017517中所说明的，针对APC的溶细胞性NKT细胞可基于细胞的表达特征区别于非溶细胞性NKT细胞。更特别地，与非溶细胞性NKT细胞群相比，溶细胞性CD4+NKT细胞群显示出以下特征中的一种或更多种：NK1.I、CD4、NKG2D和CD244表达。
如本文中所述的肽或编码这样的肽的非免疫原性RNA在施用于活动物、通常是人类之后引发对旁观者T细胞发挥抑制活性的特异性T细胞。
在一些具体实施方案中，本发明的溶细胞性细胞群的特征在于FasL和/或干扰素γ表达。在一些具体实施方案中，本发明的溶细胞性细胞群的特征还在于颗粒酶B表达。
该机制还蕴含并且实验结果表明，由本文中所述的非免疫原性RNA编码的肽尽管包含某抗原的特定T细胞表位但可用于预防或治疗由针对相同抗原的其他T细胞表位的免疫反应引发的病症，或者在某些情况下，甚至用于治疗由针对其他不同抗原的其他T细胞表位的免疫反应引发的病症，如果它们将通过相同的机制由MHC II类分子或CD1d分子在被所述肽活化的T细胞附近呈递的话(旁观者效应)。
公开了具有上述特征的另外是抗原特异性的，即能够抑制抗原特异性免疫应答的细胞类型的分离的细胞群。
本发明提供了包含一种或更多种编码一种或更多种根据本发明的肽的非免疫原性RNA物质的药物组合物，其还包含可药用载体。如上所述，本发明还涉及用作药物的组合物或涉及通过使用所述组合物治疗哺乳动物的免疫病症的方法，以及涉及所述组合物用于制备用于预防或治疗免疫病症的药物的用途。所述药物组合物可例如是适合于治疗或预防(自身)免疫病症，尤其是空气传播性和食源性变态反应以及变应源疾病的疫苗。
尽管活性成分可单独地施用，但它们通常作为药物制剂存在。如本文中所述的针对兽用和针对人用二者的制剂均包含至少一种如上所述的活性成分以及一种或更多种可药用载体。本发明涉及药物组合物，其包含与可药用载体混合的编码一种或更多种如本文中所述的肽的非免疫原性RNA物质作为活性成分。本发明的药物组合物应包含治疗有效量的活性成分，例如下文中对于治疗或预防方法所指明的。任选地，所述组合物还包含其他治疗成分。合适的其他治疗成分以及其取决于其所属类别的常用剂量对于本领域技术人员是公知的，并且可选自用于治疗(自身)免疫病症的其他已知药物。
根据本发明的非免疫原性RNA可以通过不同的途径施用，包括区域性、全身性、经口(固体形式或吸入)、直肠、经鼻、表面(包括经眼、口含和舌下)、阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)。优选的施用途径可随着例如接受者的病症或随着待治疗的疾病而变化。如本文中所述，在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体最佳地是“可接受的”。所述制剂包括适合于以下的制剂：经口、直肠、经鼻、表面(包括口含和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)施用。
编码包含MHC II类T细胞表位的如本文中所述肽的非免疫原性RNA将被递送至(未成熟的)树突细胞，该树突细胞将在其表面呈递所述肽，成为APC。这些细胞将诱导溶细胞性CD4+T细胞，其(1)在MHC-II类依赖性同源活化之后诱导APC凋亡，影响树突细胞和B细胞二者，如在体外和在体内所表明的，并且(2)通过接触依赖性机制抑制旁观者T细胞。如WO2008/017517中详细讨论的，溶细胞性CD4+T细胞可区别于天然Treg和适应性Treg二者。
编码如本文中所述肽的非免疫原性RNA包含赋予与CD1d分子结合之能力的疏水性残基。在施用之后，RNA被(未成熟的)树突细胞摄取并引导至晚期内体，在此其被装载到CD1d上并呈递在APC表面处。一旦被CD1d分子呈递，编码的肽中的氧化还原酶基序就会增强使NKT细胞活化的能力，从而成为溶细胞性NKT细胞。所述编码的肽活化细胞因子(例如IFN-γ)的产生，其将活化其他效应细胞，包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。如WO2012/069568中详细讨论的，CD4+和CD8+T细胞二者均可参与消除呈递抗原的细胞。
现在将通过以下实施例对本发明进行举例说明，所述实施例在无任何限制意图的情况下提供。此外，本文中所述的所有参考文献均通过引用明确地包含在本文中。
实施例
实施例1：材料和方法
流式细胞术分析
荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting，FACS)表面和细胞内抗体可购自eBioscience或BD Pharmingen，并根据制造商的方案使用。所用的抗体可以是以下：CD11b、CD11c、CD19、CD4、CD40L、CD49b、CD69、CD8、CD86、CD90.1、IFNy和IL-17A。将来自不同器官的单细胞悬液在4℃下针对细胞外标记染色30分钟。对于IFNγ、IL-17A和CD40L的细胞内细胞因子染色，将细胞如所述进行分离并另外在37℃，5％CO2下在包含MOG35-55肽(浓度15μg/ml)、莫能菌素(Monensin)(GolgiStop，BD-Bioscience)和布雷菲德菌素A的培养基中进行刺激持续6小时。在进行活-死染色(生存力染料eBioscience)和细胞表面标志物染色之后，使用来自BD Biosciences的Cytofix/Cytoperm和Perm/Wash缓冲液，根据制造商的方案将细胞固定并透化。将细胞与细胞内抗体在4℃下孵育30分钟，并在FACS分析之前在Perm/Wash中洗涤两次。用FACS Canto II获得样品，并通过使用FlowJo(Tree Star)软件进行分析。
体内生物发光成像(BLI)
使用Xenogen IVIS Spectrum体内成像系统(Caliper Life Sciences)研究脾细胞中非免疫原性mRNA的翻译效率。在非免疫原性LUC-mRNA的RNA-LPX免疫接种之后6小时、24小时、48小时和72小时，用D-萤光素的水溶液(250μl，1.6mg于PBS中)(BD Biosciences)对小鼠进行i.p.注射。5分钟之后，使用IVIS Living Image 4.0软件对来自脾的信号强度进行限定，并通过目的区域(region of interest，ROI)中的体内生物发光进行测量，并量化为总通量(光子/秒)。在分组(binning)4中采集时间为1分钟。在活小鼠的生物发光成像期间，用2.5％异氟烷/氧混合物的剂量麻醉小鼠。将活动物的发射光子的LUC信号强度描绘为灰度图像，其中黑色是最不强烈的而白色是最强烈的生物发光信号。使用IVIS LivingImage软件分析小鼠的图像。
磁活化细胞分选(Magnetic activated cell sorting，MACS)
可通过使用MACS(Miltenyi Biotec)根据制造商的说明通过阳性选择从小鼠脾和淋巴结分离CD4+T细胞。使用CD4(L3T4)微珠纯化CD4+T细胞。
骨髓来源的DC(BMDC)的产生
从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓(bone marrow，BM)细胞，并在37℃下在组织培养瓶中在RPMI 1640+GlutaMAX-I培养基(Gibco)中培养，所述培养基补充有10％FBS(Biochrom)、1％丙酮酸钠100x(Gibco)、1％MEM NEAA 100x(Gibco)、0.5％青霉素-链霉素(Gibco)、50μM 2-巯基乙醇(Life Technologies)和1000U/ml树突细胞(DC)分化因子粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulation factor，GM-CSF)(Peprotech)。在第6天，在37℃下将2×106DC/ml与MOG35-55肽(15μg/ml)预孵育3小时并随后与T细胞共培养，总体积为96孔板中的200μl培养基。
过继性T细胞转移和体内增殖测定
对于增殖研究，可对从小鼠获得的富集的CD4+T细胞进行CTV标记(CellTraceViolet细胞增殖试剂盒，Thermo Fisher Scientific)(根据制造商的说明)，计数并将200μl PBS中的7×106个细胞i.v.注射到麻醉下的原初小鼠接受体小鼠的眶后丛中。在第二天，用10、20或40μg编码wt MOG35-55表位或IMCY-0189的非免疫原性mRNA(参见下面的序列)对小鼠进行免疫接种。对照小鼠接受20μg非免疫原性无关mRNA或盐水。T细胞转移之后4天，处死小鼠并通过流式细胞术分析细胞的增殖。
ELISA
可使用标准ELISA测定根据制造商的说明在小鼠血清中RNA免疫接种之后6小时通过ELISA(PBL)进行小鼠IFN-a的检测。
脾、LN和CNS浸润物的分离
所有基于细胞的分析可均在脾、淋巴结和CNS器官的单细胞悬液上进行。简单地说，将脾和LN用1mg/ml胶原酶D和0.1mg/ml DNA酶I(DNasel)孵育15分钟，并随后在用PBS清洗的同时通过70μm细胞过滤器捣碎。在脾细胞的单细胞悬液上进行红细胞裂解(低张裂解缓冲液：1g KHCO3和8.25g NH4Cl溶解在1l H2O和200μl 0.5M EDTA中)。在用PBS进行另外的洗涤步骤之后，用Vi-Cell细胞计数器对细胞进行计数。
为了从脑和脊髓中分离CNS浸润物，将小鼠用氯胺酮-Rompun麻醉并使用0.9％NaCl通过左心室灌注。将脑和脊髓手动移出，切成小块，并在37℃下用包含胶原酶D(1mg/ml)和DNA酶I(0.1mg/ml)的PBS++(含有钙和镁的PBS，Gibco)消化20分钟。然后通过将组织块吸入到注射器中并再次紧靠15ml falcon管的壁压出而手动均化经消化的组织。将此过程进行多至10次，直至看不到任何块。将单细胞悬液重悬于70％Percoll中并在30∶37Percoll梯度下分层。最终的Percoll梯度为30∶37∶70％，并在室温下以300g离心40分钟。用2％FCS/PBS洗涤位于70％与37％Percoll之间的间期的单个核细胞层，然后进行进一步分析。
实施例2：相关脾细胞活化的非免疫原性mRNA的检测
为了分析脾细胞的活化和所用非免疫原性mRNA的翻译效率，对小鼠可用与F12脂质体复合的萤光素酶-mRNA(10μg)静脉内注射到眶后丛中，如上所述。在RNA-LPX注射之后例如6、24、48和72小时通过体内成像评估萤光素酶活性。用非免疫原性mRNA对小鼠进行免疫接种应导致LUC-mRNA的持续高翻译。因此，在mRNA免疫接种之后72小时内通常可检测到LUC蛋白表达。
此外，用非免疫原性mRNA对小鼠进行免疫接种应导致活化标志物DC上的CD86和淋巴细胞上的CD69没有像未经处理的对照小鼠那样上调。在用非免疫原性LUC-mRNA进行免疫接种的小鼠中，在mRNA免疫接种之后6小时在血液中也不应检测到IENa。
实施例3：非免疫原性mRNA的表征
使用非免疫原性mRNA将特定疾病相关抗原递送至树突细胞以确保在治疗应用中抗原呈递而没有免疫活化。已表明，将N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)并入到mRNA中可增强细胞中的蛋白质表达并降低哺乳动物细胞系中以及小鼠体内的mRNA的免疫原性(Andries etal.，2015，J Control Release.217，337-344)。这种效应最可能依赖于mRNA逃避内体Toll样受体3(TLR3)和下游固有免疫信号传导之活化的能力提高(Andries et al.，2015)。另外，对于在体外转录期间使用N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)代替核苷尿苷并入到mRNA中，也可以进行合成mRNA的HPLC纯化。其进一步消除了免疫活化并改善了经核苷修饰的编码蛋白质的mRNA的翻译(Kariko et al.，2011，Nucleic Acids Res.39，e142)。通过HPLC纯化，在mRNA体外转录之后去除剩余的双链mRNA污染物，得到不诱导干扰素信号传导和炎性细胞因子的mRNA(Kariko et al.，2011)。用于纯化经核苷纯化的mRNA的替代方法是纤维素纯化(PCT/EP20167059056)。
为了研究用于治疗应用的mRNA是否真的是非免疫原性的，可进行生物分析仪和斑点杂交分析以确保mRNA的完整性和纯度。
用于mRNA质量控制的斑点杂交分析
通过斑点杂交分析体外转录的、经修饰的和经HPLC纯化的mRNA的双链mRNA(dsRNA)。将1μg不同的mRNA构建体加载到NYTRAN SPC膜(GE Healthcare)上，封闭，并随后与J2抗体(SCICONS English and Scientific Consulting)一起孵育用于dsRNA的检测。使用二抗抗小鼠HRP抗体(Jackson ImmunoResearch)并用BioRad ChemiDoc对膜进行分析。
实施例4：具有在2个半胱氨酸之间包含不同数目氨基酸的氧化还原酶基序(C-XN-C)的免疫原性肽和编码其的非免疫原性RNA的设计。
设计了IMCY-0443和IMCY-0189肽(表1)。它们包含氧化还原酶基序(H)CPYC(SEQID NO 34和35)、接头GW、鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)MHC II T细胞表位YRSPFSRVV(SEQ ID NO：36)和侧翼序列HLYR(SEQ ID NO：705)。IMCY-0443和IMCY-0189的变体也以这样的方式设计：将序列修饰成在氧化还原酶基序的2个半胱氨酸之间具有不同数目的氨基酸(表1)。在变体的N端处或氧化还原酶基序内添加碱性氨基酸(K或R)。还合成了用丙氨酸代替半胱氨酸残基的对照肽(所谓的AA对照)。还设计了IMCY-0017(其对应于包含MHC II T细胞表位YRSPFSRVV-SEQ ID NO：704的wt MOG35-55肽)、IMCY-0069(包含经典氧化还原酶基序HCPYC(SEQ ID NO：24)和经修饰的鼠前胰岛素原表位的肽)和IMCY-0257(包含经典氧化还原酶基序HCPYC(SEQ ID NO：24)和DBY抗原表位的肽)作为对照(表1)。
表1：具有在2个半胱氨酸之间包含不同数目氨基酸的氧化还原酶基序(C-XN-C)的免疫原性肽。
非免疫原性mRNA编码肽的产生
如下产生编码IMCY-0189和IMCY-0017(wt MOG35-55)的包含N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)代替尿苷的非免疫原性mRNA(缩写为m1ψmRNA)。
用于体外转录的DNA模板产生
用于体外转录的DNA模板通过使用Gibson组装方法将以下编码序列插入pmRVac载体中产生：
-对于IMCY-0189 m1ψmRNA(SEQ ID NO：768-DNA序列)：
编码的肽：M-HCPYC-GWYRSPFSRVVHLYR(SEQ ID NO：767)
-对于MOG35-55m1ψmRNA(SEQ ID NO：769-DNA序列)：
编码的肽：MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO：720)
-对于IMCY-0098 m1ψmRNA(SEQ ID NO：790-DNA序列)
编码的肽：M-HCPY-CSLQPLALEGSLQKRG(SEQ ID NO：791)
-对于IMCY-0141 m1ψmRNA(SEQ ID NO：792-DNA序列)
编码的肽：M-KHCPYC-VRYFLRVPSWKITLFKK(SEQ ID NO：793)。
pmRVac载体包含T7启动子序列、5’UTR(具有Kozak序列)、3’UTR、110nt区段的PolyA和用于终止转录的SapI限制性酶位点。插入位点位于UTR之间。将Gibson组装反应产物转化到大肠杆菌中并平板接种在含有卡那霉素的LB上。通过PCR筛选所得菌落以确定阳性插入事件。通过限制性消化和Sanger测序进一步评价PCR阳性克隆。在LB培养基中培养正确的质粒，并使用无内毒素的质粒midiprep试剂盒对其进行纯化。在紫外-可见分光光度计上测量质粒DNA的浓度和纯度，并随后使用SapI限制酶进行线性化。
mRNA合成
Cap1 mRNA是通过T7体外转录方法以及随后的酶加帽和甲基化产生的。为了产生未加帽的体外RNA转录物，将线性DNA模板与T7 RNA聚合酶、核苷酸三磷酸(nucleotidetriphosphate，NTP)和含镁缓冲液混合以建立体外转录反应。将反应混合物在37℃下孵育2小时。使用N(1)-甲基-假尿苷(m1ψ)代替体外转录的UTP。
Cap1 mRNA是使用牛痘加帽系统产生的。在通过加热使未加帽的转录物变性之后，添加牛痘加帽酶、2’-O甲基转移酶、GTP、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)和加帽缓冲液以建立加帽反应。将反应混合物在37℃下孵育1小时。随后，通过DNA酶I处理去除模板DNA。
使用磁珠进一步纯化加帽转录物。分离的mRNA用酸性缓冲液洗脱并储存在-80℃下。在紫外-可见分光光度计上测量mRNA浓度和纯度。通过变性琼脂糖凝胶分析来测量mRNA完整性。使用mRNA测序来鉴定mRNA分子。
mRNA也可通过HPLC或纤维素处理进一步纯化。对于HPLC纯化，采用Weissman etal.，2013(Methods Mol Bio.969，43-43)的方案，并使用38％至70％梯度的缓冲液B进行mRNA的洗脱。对于所有产生的mRNA进行质量控制(生物分析仪和斑点印迹分析)以确保mRNA的纯度和完整性。
mRNA在脂质纳米粒(lipid nanoparticle，LNP)中的包封
将脂质(可电离的阳离子脂质SM-102、辅助脂质DSPC、胆固醇和聚乙二醇化脂质PEG2000-DMG)以最佳摩尔比溶解在乙醇中。将mRNA在柠檬酸钠的酸化缓冲液中稀释至期望的浓度。通过使用微流体混合器将脂质与mRNA混合来产生LNP。随后，将LNP在透析盒中针对含有蔗糖的Tris-HCl缓冲液进行透析。
在透析之后，将LNP通过0.22μm过滤器并储存在-80℃下。使用RiboGreen测定来量化LNP中的mRNA。使用Zetasizer装置通过动态光散射和ζ电位来确定颗粒尺寸和表面电荷。通过动态显色TAL测定来测量内毒素水平。
在20mM Tris、87mg/mL蔗糖、10.7mM乙酸钠(pH 7.5)中制备LNP分散体。
实施例5：编码肽的非免疫原性RNA的施用在小鼠中对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental auto-immune encephalomyelitis，EAE)发生的作用。
小鼠组和给药
使用C57BL/6雌性小鼠(The Jackson Laboratory，9周龄，在第0天)。在研究开始之前，使小鼠适应7天。根据表2将其分配至3组(16只小鼠/组)。在研究开始时，以平衡的方式进行小鼠分配，以在各组中实现相似的平均重量。
表2-处理方案
小鼠中的EAE诱导
如下在所有小鼠中诱导EAE：：
第0天，第0小时：用MOG35-55/CFA进行免疫接种
第0天，第2小时：注射百日咳毒素
第1天，第0小时：第2次注射百日咳毒素(在初始免疫接种之后24小时)
在小鼠背部的2个部位皮下注射Hooke KitTM MOG35-55/CFA乳剂PTX(目录号EK-2110(Hooke Laboratories，Lawrence MA)的乳剂组分(包含MOG35-55)。第一注射部位位于上背部，在颈线尾部约1cm。第二部位位于下背部，在尾基部颅侧约2cm。每个部位的注射体积为0.1mL。
在乳剂注射的2小时内，并随后在乳剂注射之后24小时再次，腹膜内施用试剂盒的百日咳毒素组分。
RNA制剂和处理
为了确定EAE模型中的保护性免疫，在疾病诱导之后的第7天和第10天，用10.2(第7天)或4.8(第10天)μg编码MOG35-55(IMCY-0017)或IMCY-0189肽(如表1中所示)的非免疫原性的LNP包封的m1ψRNA处理小鼠。使用氧气-异氟烷蒸发器(2.5％异氟烷)，在麻醉下将mRNAi.v.注射到尾静脉中。
第1组：载剂(Tris缓冲液)
用于25只小鼠的制剂(注射16只小鼠)
制备2000μL 20mM Tris缓冲液，并静脉注射到尾静脉中(第7天1×85μL/小鼠，第10天1×40μL/小鼠)。
第2组：MOG35-55mRNA/LNP(MOG35-55_m1ψ)
用于25只小鼠的制剂(注射16只小鼠)
将LNP/mRNA溶液的小瓶在室温下解冻10分钟，涡旋5秒，并合并4个小瓶以获得2000μL 120μg/mL的储液。然后将mRNA静脉注射到尾静脉中(第7天1×85μL/小鼠，第10天1×40μL/小鼠)。
第3组：IMCY-0189 mRNA/LNP(IMCY-0189_m1ψ)
用于25只小鼠的制剂(注射16只小鼠)
将LNP/mRNA溶液的小瓶在室温下解冻10分钟，涡旋5秒，并合并4个小瓶以获得2000μL 120μg/mL的储液。然后将mRNA静脉注射到尾静脉中(第7天1×85μL/小鼠，第10天1×40μL/小鼠)。
读出
EAE评分用作读出。从第7天直至研究结束，每天对动物进行评分。进行评分的人员对处理和每只小鼠的先前评分(盲法评分)二者均不知情。EAE以0至5级评分。当临床体征落入两个以下定义的评分之间时，则分配中间评分。
表3-EAE评分标准
统计学分析
通过进行不配对t检验来分析曲线下面积(area under the curve，AUC)和平均最大评分(Mean Maximal Score，MMS)数据，将处理组与载剂组分别进行比较。如下参考显著性差异：*p＜0.05，**p＜0.01。
结果
EAE评分
通过比较所有组与载剂组的临床EAE读出来评价EAE发生。EAE评分、AUC(曲线下面积)和MMS(平均最大评分)在图1、2和3中示出。
载剂组(阴性对照)的小鼠在该模型的预期范围内发生了EAE。该组中有四(4)只小鼠因严重EAE死亡。
用IMCY-0189 m1ψ或用MOG35-55m1ψ处理的小鼠均表现出延迟的疾病发作(图1)和从EAE评分计算的统计学显著降低的AUC(图2)。每组中有五(5)只小鼠死亡。与载剂对照组相比，IMCY-0189 m1ψ处理还诱导了统计学上显著的MMS降低。MOG35-55m1ψ处理没有诱导任何统计学上显著的MMS降低。我们得出结论，在小鼠EAE处理中，IMCY-0189m1ψ优于MOG35-55m1ψ。

Claims (28)

1.编码肽的非免疫原性RNA，所述肽包含：
a)氧化还原酶基序；
b)抗原蛋白质的T细胞表位；和
c)在a)与b)之间的0至7个氨基酸的接头，优选0至4个氨基酸的接头；
其中所述氧化还原酶基序a)包含以下一般结构：
[CST]XXC-或CXX[CST]-(SEQ ID NO：1或2)，
其中X为任意氨基酸；
其中[CST]表示单个丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸残基；
其中所述氧化还原酶基序中的连字符(-)表示所述氧化还原酶基序与所述接头或所述T细胞表位的N端末端、或者与所述接头或所述T细胞表位的C端末端的连接点。
2.权利要求1所述的非免疫原性RNA，其中编码的肽的第一个氨基酸是甲硫氨酸。
3.权利要求1或2所述的非免疫原性RNA，其中所述非免疫原性RNA通过并入经修饰核苷酸并去除dsRNA而成为非免疫原性的。
4.权利要求3所述的非免疫原性RNA，其中所述经修饰核苷酸包含用包含经修饰核碱基的核苷对一个或更多个尿苷的替换，优选地，其中所述经修饰核碱基是经修饰尿嘧啶。
5.权利要求1至4中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述包含经修饰核碱基的核苷选自：3-甲基尿苷(m3U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-氮杂尿苷、6-氮杂尿苷、2-硫代-5-氮杂尿苷、2-硫代尿苷(s2U)、4-硫代尿苷(s4U)、4-硫代假尿苷、2-硫代假尿苷、5-羟基尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基尿苷、5-卤代尿苷(例如，5-碘代尿苷或5-溴代尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基尿苷(cm5U)、1-羧甲基假尿苷、5-羧基羟甲基尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷(mcm5s2U)、5-氨甲基-2-硫代尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨甲基尿苷(mnm5U)、1-乙基假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨甲基-2-硒尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰甲基尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨甲基尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基尿苷、1-丙炔基假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代假尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基假尿苷、3-甲基假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-脱氮假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5，6-二氢尿苷、5-甲基二氢尿苷(m5D)、2-硫代二氢尿苷、2-硫代二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代尿苷、4-甲氧基假尿苷、4-甲氧基-2-硫代假尿苷、N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代尿苷(inm5s2U)、α-硫代尿苷、2′-O-甲基尿苷(Um)、5，2′-O-二甲基尿苷(m5Um)、2′-O-甲基假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰甲基-2′-O-甲基尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨甲基-2′-O-甲基尿苷(cmnm5Um)、3，2′-O-二甲基尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2′-O-甲基尿苷(inm5Um)、1-硫代尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖尿苷、5-(2-甲酯基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷，优选地，其中所述包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5U)。
6.权利要求1至5中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述包含经修饰核碱基的核苷是N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)。
7.权利要求1至6中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述非免疫原性RNA配制在递送载剂中，优选地其中所述递送载剂包含颗粒、脂质或阳离子脂质。
8.权利要求7所述的非免疫原性RNA，其中所述脂质与所述非免疫原性RNA形成复合物和/或包封所述非免疫原性RNA，或者其中所述非免疫原性RNA配制在脂质体中。
9.权利要求1至8中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述氧化还原酶基序包含由SEQID NO：24至35中任一者限定的序列。
10.权利要求1至9中任一项所述的非免疫原性RNA，其编码长度为9至50个氨基酸的免疫原性肽，优选9至30个氨基酸的免疫原性肽。
11.权利要求1至10中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述免疫原性肽中的所述氧化还原酶基序不天然存在于氨基酸序列中位于所述抗原蛋白质的所述T细胞表位的N端或C端11个氨基酸的区域内，和/或其中所述T细胞表位在其氨基酸序列中不天然包含所述氧化还原酶基序。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的非免疫原性RNA，其中所述T细胞表位是长度为7至25个氨基酸的MHC II类T细胞表位，优选9至25个氨基酸的MHC II类T细胞表位；或者其中所述肽中的所述T细胞表位是长度为7至25个氨基酸的NKT细胞表位。
13.药物组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的非免疫原性RNA，以及任选地可药用赋形剂。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的非免疫原性RNA或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于在对象中治疗或预防选自以下的疾病或病症的方法中：自身免疫病、胞内病原体的感染、肿瘤、同种异体移植排斥，或者针对可溶性同种因子、针对变应原暴露或针对用于基因治疗或基因疫苗接种的病毒载体的免疫应答。
15.在对象中治疗或预防选自以下的疾病或病症的方法：自身免疫病、胞内病原体的感染、肿瘤、同种异体移植排斥，或者针对可溶性同种因子、针对变应原暴露或针对用于基因治疗或基因疫苗接种的病毒载体的免疫应答，所述方法包括向所述对象施用根据权利要求1至12中任一项所述的非免疫原性RNA或根据权利要求13所述的药物组合物。
16.根据权利要求1至12中任一项所述的非免疫原性RNA或根据权利要求13所述的药物组合物用于制备用于在对象中治疗或预防选自以下的疾病或病症的药物的用途：自身免疫病、胞内病原体的感染、肿瘤、同种异体移植排斥，或者针对可溶性同种因子、针对变应原暴露或针对用于基因治疗或基因疫苗接种的病毒载体的免疫应答。
17.在对象中诱导溶细胞性CD4+T细胞的方法，其包括向所述对象施用根据权利要求1至12中任一项所述的编码肽的非免疫原性RNA或根据权利要求13所述的药物组合物。
18.根据权利要求1至12中任一项所述的非免疫原性RNA或根据权利要求13所述的药物组合物用于制备用于在对象中诱导溶细胞性CD4+T细胞的药物的用途。
19.权利要求15或17所述的方法，或者权利要求16或18所述的用途，其中所述对象患有自身免疫病。
20.权利要求19所述的方法或用途，其中所述自身免疫病选自包含以下的组：1型糖尿病(T1D)、脱髓鞘病症例如多发性硬化(MS)或视神经脊髓炎(NMO)，或者类风湿性关节炎(RA)。
21.权利要求19所述的方法或用途，其中所述抗原蛋白质选自：胰岛素(原)、GAD65、GAD67、IA-2(ICA512)、IA-2(β/phogrin)、IGRP、嗜铬粒蛋白、ZnT8和HSP-60，并且其中所述自身免疫病是1型糖尿病(T1D)。
22.权利要求19所述的方法或用途，其中所述抗原蛋白质选自：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)和少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)，并且其中所述自身免疫病是多发性硬化(MS)和/或视神经脊髓炎(NMO)。
23.权利要求19所述的方法或用途，其中所述抗原蛋白质选自：GRP78、HSP60、60kDa伴侣蛋白2、凝溶胶蛋白、壳多糖酶-3样蛋白1、组织蛋白酶S、血清白蛋白和组织蛋白酶D，并且其中所述自身免疫病是类风湿性关节炎(RA)。
24.权利要求15或17所述的方法，或者权利要求16或18所述的用途，其中所述抗原蛋白质是肿瘤或癌抗原，例如：癌基因、原癌基因、病毒蛋白、存活因子或者克隆型或独特型决定簇，其中所述疾病是癌症。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述非免疫原性RNA编码包含MOG的T细胞表位的肽，所述T细胞表位更优选MHC II类T细胞表位YRSPFSRVV(SEQ ID NO：704)，FLRVPCWKI(SEQID NO：4)或FLRVPSWKI(SEQ ID NO：5)。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述非免疫原性RNA由SEQ ID NO.778限定。
27.根据权利要求22所述的方法，其中由所述非免疫原性RNA编码的肽由SEQ IDNO.777或707限定。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述非免疫原性RNA编码包含胰岛素的T细胞表位的肽，优选包含MHC II类T细胞表位LALEGSLQK(SEQ ID NO：3)的肽。
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