KR20240013773A - 자가면역 질환의 치료 또는 예방 방법 - Google Patents

자가면역 질환의 치료 또는 예방 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 T 세포 에피토프 및 산화환원효소 모티프를 포함하는 면역원성 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 mRNA, 및 예를 들어 제1형 당뇨병(T1D), 다발성 경화증(MS), 시신경척수염(NMO), 또는 류마티스 관절염(RA)의 치료 및/또는 예방을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

자가면역 질환의 치료 또는 예방 방법
본 발명은 의료 분야에 관한 것으로, 자가항원(autoantigen)의 T 세포 에피토프 및 산화환원효소 모티프(oxidoreductase motif)를 포함하는 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 mRNA를 사용하여 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
항원에 대한 원치 않는 면역 반응의 발생을 막기 위한 몇 가지 전략이 기술되어 있다. WO2008/017517은 산화환원 효소 모티프 및 주어진 항원성 단백질의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하는 펩티드를 사용하는 새로운 전략을 기술한다. 이러한 펩티드는 CD4+ T 세포를 세포용해성 CD4+ T 세포(cCD4)로 불리는 세포용해 특성을 갖는 세포형으로 전환시킨다. 이들 세포는 펩티드가 유래하는 항원을 제시하는 항원 제시 세포 (APC)의 세포자멸 유발을 통해 사멸이 가능하다. WO2008/017517은 알레르기 및 제1형 당뇨병과 같은 자가 면역 질환에 대한 이러한 개념을 입증한다. 여기서 인슐린은 자가항원으로 작용할 수 있다.
WO2009101207 및 Carlier et al. (2012) Plos one 7,10 e45366에는 항원 특이적 세포용해 세포가 더 자세히 기술되어 있다.
WO2016059236, WO2020099356 및 WO2020099352는 다양한 개선된 유형의 산화환원효소 모티프를 포함하는 변형된 펩티드를 개시한다.
알레르겐 또는 항원의 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하는 펩티드 외에도, WO2012069568에서는 CD1d 수용체에 결합하여 항원 특이적 방식으로 상기 특정 항원을 제시하는 APC를 제거하는 것으로 나타난 세포용해성 항원 특이적 NKT 세포의 활성화를 초래하는 NKT 세포 에피토프의 사용 가능성을 추가로 개시했다.
WO2018188730은 자가면역 질환 치료를 위한 비면역원성 RNA를 개시한다.
항원의 T 세포 에피토프와 산화환원효소 모티프를 포함하는 펩티드를 사용한 치료의 효능을 향상시키기 위해, 이러한 펩티드를 투여하는 새로운 방식에 대한 연구가 계속되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 특히 자가면역 질환을 치료하기 위해 항원의 T 세포 에피토프와 산화환원효소 모티프를 포함하는 펩티드를 투여하는 새로운 방식을 제공한다. 본 발명자들은 펩티드 자체를 투여하기 보다, 예를 들어 자가면역 질환을 앓고 있는 환자에게 상기 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA를 투여하는 것도 가능하다는 것을 발견하였다. 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)과 같은 자가면역 질환을 치료하기 위해 질환 관련 자가항원을 코딩하는 비면역원성 mRNA 투여에 관한 문헌에 따르면(예를 들어, Wardell and Levings 2021, Nature Biotechnology volume 39, pages 419-421에서 검토됨), 후자는 조절 T 세포(Treg)의 유도를 통해 면역 억제를 유도하는 반면, 산화환원-에피토프 융합 펩티드는 상기 항원을 발현하는 항원 제시 세포(APC)를 살해하여 상기 항원에 대한 면역 반응을 억제하는 항원 특이적 세포용해성 CD4+ T 세포(cCD4)의 생성을 통해 작용하는 것으로 여겨지기 때문에 상기 본 발명자들이 발견한 가능성은 예기치 못한 것이다. 따라서 비면역원성 mRNA 전달을 사용할 때 상기 세포용해성 T 세포 반응도 유도될 수 있다는 사실은 놀라운 일이었다. Treg의 활성화 또는 cCD4 세포 집단의 유도는 실제로 면역 체계에서 완전히 다른 관용 경로이다. 또한, 한편으로는 Tregs 유도에 의해 면역억제를 유도하는 것으로 알려진 MOG 자가항원의 단편을 인코딩하는 비면역원성 mRNA를 사용하고 다른 한편으로는 산화환원효소 모티프에 융합된 MOG 자가항원의 동일한 단편을 인코딩하는 비면역원성 mRNA를 사용하는 비교 MOG 유도 마우스 EAE 모델 시스템 실험에서, 후자는 임상 EAE 징후에 대한 개선된 감소 효과를 나타내었다. 또한, 이는 생체 내에서 번역된 산화환원효소 모티프가 생체 내에서 융합 펩티드로 투여되었을 때와 동일한 효과에 도달할 것인지 확실치 않았기 때문에 예상치 못한 일이었다.
따라서, 본 발명자는 항원에 대한 면역 반응을 감소시키기 위해 항원의 T 세포 에피토프에 결합된 산화환원효소 모티프를 포함하는 융합 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 mRNA를 사용하는 개념의 증거를 제공한다.
따라서 본 발명은 다음 측면에 관한 것이다:
1. 대상체에서 자가면역 질환, 세포내 병원체에 의한 감염, 종양, 동종이식 거부반응, 또는 용해성 동종인자, 알레르겐 노출 또는 유전자 치료 또는 유전자 백신접종에 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응으로부터 선택된 질환 또는 상태를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 펩티드는 다음을 포함하는 방법:
a) 산화환원효소 모티프;
b) 상기 질환 또는 상태와 관련된 항원성 단백질의 T 세포 에피토프; 및
c) a)와 b) 사이의 0 내지 7개 아미노산, 바람직하게는 0 내지 4개 아미노산의 링커;
여기서 상기 산화환원효소 모티프 a)는 하기 일반 구조를 갖고:
Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-;
여기서 Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산으로, 보다 바람직하게는 K, H, R 및 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 K 또는 H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
m은 1, 0, 또는 2로 이루어진 군으로부터 선택된 정수이고;
X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산으로, 보다 바람직하게는 K, H, R 및 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 R로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n은 0 내지 6, 바람직하게는 0 내지 3, 가장 바람직하게는 2로부터 선택된 정수이고;
본원에 개시된 모든 일반 구조에서, 상기 산화환원효소 모티프에서의 하이픈(-)은 산화환원효소 모티프가 링커 또는 T 세포 에피토프의 N-말단 끝, 또는 링커 또는 T 세포 에피토프의 C-말단 끝에 부착되는 지점을 나타낸다.
2. 다음을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 세포용해성 CD4+ T 세포를 유도하는 방법:
a) 산화환원효소 모티프;
b) 상기 질환 또는 상태와 관련된 항원성 단백질의 T 세포 에피토프; 및
c) a)와 b) 사이의 0 내지 7개 아미노산, 바람직하게는 0 내지 4개 아미노산의 링커;
여기서 상기 산화환원효소 모티프 a)는 하기 일반 구조를 갖고:
Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-;
여기서 Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산으로, 보다 바람직하게는 K, H, R 및 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 K 또는 H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
m은 1, 0, 또는 2로 이루어진 군으로부터 선택된 정수이고;
X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산으로, 보다 바람직하게는 K, H, R 및 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 R로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n은 0 내지 6, 바람직하게는 0 내지 3, 가장 바람직하게는 2로부터 선택된 정수이고;
본원에 개시된 모든 일반 구조에서, 상기 산화환원효소 모티프에서의 하이픈(-)은 산화환원효소 모티프가 링커 또는 T 세포 에피토프의 N-말단 끝, 또는 링커 또는 T 세포 에피토프의 C-말단 끝에 부착되는 지점을 나타낸다.
실시양태 중 어느 하나에서, mRNA 번역 메커니즘이 발생하기 쉬운 추가 개시 코돈(atg)은 일반적으로 mRNA를 생성하는 데 사용된 DNA 코딩 서열의 5' 말단에 포함되어 본원에 개시된 인코딩된 펩티드에 메티오닌(M) 잔기를 추가한다. 상기 메티오닌 잔기는 일부 경우 펩티드 처리로 인해 생체 내에서 절단될 수 있다.
실시양태 중 어느 하나에서, 본 발명에 따른 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 펩티드 또는 단백질의 디설파이드 가교에서 환원 활성을 갖는다.
3. 측면 2에 있어서, 대상체는 자가면역 질환을 앓고 있는 방법.
4. 측면 1 또는 3에 있어서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병(T1D), 다발성 경화증(MS) 또는 시신경척수염(NMO)과 같은 탈수초성 장애, 또는 류마티스 관절염(RA)을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
바람직하게는, 상기 항원성 단백질은 자가항원, 알레르겐, 가용성 동종인자(allofactor), 이식편에 의해 배출된(shed) 동종항원, 세포내 병원체의 항원, 유전자 치료 또는 유전자 백신접종에 사용되는 바이러스 벡터의 항원, 종양 관련 항원 또는 알레르렌이다.
예시적인 항원은 다음의 것일 수 있다:
- MS의 경우 미엘린 항원, 뉴런성 항원, 및 성상교세포 유래 항원, 예를 들어 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG), 미엘린 염기성 단백질(MBP), 프로테오리피드(Proteolipid) 단백질(PLP), 희소돌기아교세포 특이적 단백질(OSP), 미엘린 관련 항원(MAG), 미엘린 관련 희돌기아교세포 염기성 단백질(MOBP), 및 2',3'-사이클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제(CNPase), S100β 단백질 또는 트랜스알돌라제 H 자가항원(Riedhammer and Weissert, 2015; Front Immunol. 2015; 6: 322), 바람직하게는 MOG, MBP, PLP 및 MOBP.
- 천식의 경우 꽃가루, 포자, 집먼지 진드기 및 애완동물 비듬 등에서 유래한 것과 같은 알레르겐.
- 암의 경우 종양유전자, 원발암유전자, 바이러스 단백질, 생존 인자 또는 클론타입 또는 이디오타입 결정인자와 같은 종양 또는 암 관련 항원. 구체적인 예는 다음과 같다: MAGE(흑색종 관련 유전자) 산물은 MHC 클래스 I 결정인자의 맥락에서 종양 세포에 의해 자발적으로 발현되는 것으로 나타났으며, 따라서 CD8+ 세포용해 T 세포에 의해 인식된다. 그러나 MAGE-3과 같은 MAGE 유래 항원도 MHC 클래스 II 결정인자에서 발현되며 CD4+ 특이적 T 세포는 흑색종 환자로부터 클로닝되었다(Schutz et al. (2000) Cancer Research 60: 6272-6275; Schuler-Thurner et al. (2002) J. Exp. Med. 195: 1279-1288). MHC 클래스 II 결정인자에 의해 제시된 펩티드는 당업계에 공지되어 있다. 다른 예에는 P815 비만세포종 및 흑색종 세포에 의해 발현되는 gp100 항원이 포함된다(Lapointe (2001; J. Immunol. 167: 4758-4764; Cochlovius et al. (1999) Int. J. Cancer, 83: 547- 554). 원발암유전자에는 종양 세포에서 우선적으로 발현되고 건강한 조직에서는 최소한으로만 발현되는 다수의 폴리펩티드와 단백질이 포함되어 있다. 사이클린(Cyclin) D1은 G1에서 S로의 전이에 관여하는 세포 주기 조절인자이다. 사이클린 D1의 높은 발현이 신장 세포 암종, 부갑상선 암종 및 다발성 골수종에서 입증되었다. 잔기 198 내지 212를 포함하는 펩티드는 MHC 클래스 II 결정인자와 관련하여 인식되는 T 세포 에피토프를 운반하는 것으로 나타났다(Dengiel et al. (2004) Eur. J. of Immunol. 34: 3644-3651). 서바이빈은 세포자멸사를 억제하는 인자의 한 예로서 서바이빈 발현 세포에 확장 이점을 부여한다. 서바이빈은 상피 및 조혈 기원의 인간 암에서 비정상적으로 발현되며 흉선, 고환 및 태반을 제외한 건강한 성인 조직, 및 성장 호르몬 자극 조혈 전구 세포 및 내피 세포에서는 발현되지 않았다. 흥미롭게도, 서바이빈 특이적 CD8+ T 세포는 흑색종 환자의 혈액에서 검출 가능하다. 서바이빈은 신장 암종, 유방암 및 다발성 골수종을 비롯한 다양한 악성 세포주에서 발현될 뿐만 아니라 급성 골수성 백혈병, 급성 및 만성 림프성 백혈병에서도 발현된다(Schmidt (2003) Blood 102: 571-576). 세포자멸사 억제제에 대한 다른 예는 Bcl2 및 spi6이다. 이디오타입 결정인자는 여포성 림프종, 다발성 골수종 및 일부 백혈병 형태의 B 세포와 T 세포 림프종 및 일부 T 세포 백혈병에서 나타난다. 이디오타입 결정인자는 B 세포 수용체(BCR) 또는 T 세포 수용체(TCR)의 항원 특이적 수용체의 일부이다. 이러한 결정인자는 본질적으로 B 세포의 VH 또는 VL 영역의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 T 세포의 베타 사슬의 CDR3에 해당하는 수용체의 초가변 영역에 의해 인코딩된다. 수용체는 유전자의 무작위 재배열에 의해 생성되므로 각 개인마다 고유하다. 이디오타입 결정인자로부터 유래된 펩티드는 MHC 클래스 II 결정인자에 제시된다(Baskar et al. (2004) J. Clin. Invest. 113: 1498-1510). 일부 종양은 바이러스 유래 항원의 발현과 관련이 있다. 따라서 일부 형태의 호지킨병은 엡스타인-바 바이러스(EBV)로부터의 항원을 발현한다. 이러한 항원은 클래스 I 및 클래스 II 결정인자 모두에서 발현된다. EBV 항원에 특이적인 CD8+ 세포용해 T 세포는 호지킨 림프종 세포를 제거할 수 있다(Bollard et a/. (2004) J. Exp. Med. 200: 1623-1633). LMP-1 및 LMP-2와 같은 항원 결정인자는 MHC 클래스 II 결정인자로 제시된다.
- 이식 거부의 경우 이식 특이적 항원 - 이식되는 조직이나 장기의 유형에 따를 것임이 분명함 -. 예로는 각막, 피부, 뼈(뼈조각), 혈관 또는 근막과 같은 조직; 신장, 심장, 간, 폐, 췌장 또는 장과 같은 기관; 또는 심지어는 췌장 섬 세포, 알파 세포, 베타 세포, 근육 세포, 연골 세포, 심장 세포, 뇌 세포, 혈액 세포, 골수 세포, 신장 세포 및 간 세포와 같은 개별 세포가 있을 수 있다. 이식 거부와 관련된 구체적인 예시 항원은 소수 조직적합성 항원, 주요 조직적합성 항원 또는 조직 특이적 항원이다. 동종항원성 단백질이 주요 조직적합성 항원인 경우, 이는 MHC 클래스 I 항원 또는 MHC 클래스 II 항원이다. 명심해야 할 중요한 점은 동종항원 특이적 T 세포가 APC 표면에서 동족 펩티드를 인식하는 메커니즘의 가변성이다. 동종반응성 T 세포는 MHC 분자 자체의 동종항원 결정인자, 자가 또는 동종이계 소스의 MHC 분자에 결합된 동종항원 펩티드, 또는 동종항원 유래 펩티드와 MHC 분자 내에 위치한 잔기의 조합을 인식할 수 있으며, 후자는 자가 기원 또는 동종 기원의 것이다. 소수 조직적합성 항원의 예는 Dby와 같은 HY 염색체에 의해 인코딩된 단백질에서 유래된 항원(H-Y 항원)이다. 다른 예는 예를 들어 [Goulmy E, Current Opinion in Immunology, vol 8, 75-81, 1996(특히 표 3 참조)]에서 찾을 수 있다. 인간의 많은 소수 조직적합성 항원이 세포용해성 CD8+ T 세포를 사용하여 MHC 클래스 I 결정인자로 제시되는 방식으로 검출되었다는 점에 유의해야 한다. 그러나, 이러한 펩티드는 MHC 클래스 II 제한 T 세포 에피토프도 함유하는 단백질의 처리에 의해 유래되며, 이에 따라 본 발명의 펩티드를 설계할 가능성을 제공한다. 동일한 절차를 사용하여 조직 특이적 동종항원을 식별할 수 있다. 이에 대한 일례는 신장에서는 발현되지만 비장에서는 발현되지 않고 신장 세포에서 세포독성 활성을 갖는 CD8+ T 세포를 유도할 수 있는 단백질로부터 유래된 MHC 클래스 I 제한 에피토프이다(Poindexter et al, Journal of Immunology, 154: 3880-3887, 1995).
보다 바람직하게는, 상기 항원성 단백질은 제1형 당뇨병(T1D), 다발성 경화증(MS) 또는 시신경척수염(NMO)과 같은 탈수초성 질환, 또는 류마티스 관절염(RA)과 관련된 자가항원이다.
5. 측면 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 변형된 뉴클레오티드의 혼입 및 dsRNA의 제거에 의해 비면역원성 RNA가 비면역원성이 되는 방법.
6. 측면 5에 있어서, 변형된 뉴클레오티드가 선천적 면역 수용체의 RNA 매개 활성화를 억제하는 방법.
7. 측면 5 또는 6에 있어서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드로의 하나 이상의 우리딘의 대체를 포함하는 방법.
8. 측면 7에 있어서, 변형된 핵염기는 변형된 우라실인 방법.
9. 측면 7 또는 8에 있어서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드는 3-메틸-우리딘 (m3U), 5-메톡시-우리딘 (mo5U), 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘 (s2U), 4-티오-우리딘 (s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘 (ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘 (예를 들어, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산 (cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르 (mcmo5U), 5-카복시메틸-우리딘 (cm5U), 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 (chm5U), 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르 (mchm5U), 5-메톡시카보닐메틸-우리딘 (mcm5U), 5-메톡시카보닐메틸-2-티오-우리딘 (mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘 (nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘 (mnm5U), 1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘 (mnm5se2U), 5-카바모일메틸-우리딘 (ncm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-우리딘 (cmnm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (cmnm5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘 (τm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘 (τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 5-메틸-2-티오-우리딘 (m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘 (D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘 (m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N(1)-메틸-슈도우리딘 (m1ψ), 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘 (acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필)슈도우리딘 (acp3 ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘 (inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘 (inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘 (Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘 (m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘 (ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘 (s2Um), 5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm5Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm5Um), 5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘 (m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm5Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-ara-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-ara-우리딘, 5-(2-카보메톡시비닐)우리딘, 및 5-[3-(1-E- 프로페닐아미노)우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
10. 측면 7 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (ψ), N(1)-메틸-슈도우리딘 (m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘 (m5U)인 방법.
11. 측면 7 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드는 N(1)-메틸-슈도우리딘 (m1ψ)인 방법.
12. 측면 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 mRNA인 방법.
13. 측면 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 시험관 내에서 전사된 RNA인 방법.
14. 측면 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 대상체의 세포에서 일시적으로 발현되는 방법.
15. 측면 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 수지상 세포에 전달되는 방법.
16. 측면 15에 있어서, 수지상 세포는 미성숙 수지상 세포인 방법.
17. 측면 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 전달 비히클에 제형화되는 방법.
18. 측면 17에 있어서, 전달 비히클은 입자를 포함하는 방법.
19. 측면 17 또는 18에 있어서, 전달 비히클은 지질을 포함하는 방법.
20. 측면 19에 있어서, 지질은 양이온성 지질을 포함하는 방법.
21. 측면 19 또는 20에 있어서, 지질은 비면역원성 RNA와 복합체를 형성하고/하거나 캡슐화하는 방법.
22. 측면 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 리포솜에 제형화되는 방법.
23. 측면 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 산화환원효소 모티프는 다음 아미노산 모티프로부터 선택되는 방법:
(a) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서,
n은 0이고,
m은 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고,
Z는 바람직하게는 H, K, R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 보다 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 이러한 모티프의 비제한적인 바람직한 예는 KCC, KKCC (서열 번호 6), RCC, RRCC (서열 번호 7), RKCC (서열 번호 8), 또는 KRCC (서열 번호 9)이다);
(b) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서,
n은 1이고,
X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K, R, 및 L-오르니틴과 같은 비천연 염기성 아미노산, 보다 바람직하게는 K 또는 R로부터 선택되는 염기성 아미노산이고,
0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고,
Z는 바람직하게는 H, K, R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 보다 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 이러한 모티프의 비제한적인 바람직한 예는 KCXC (서열 번호 10), KKCXC (서열 번호 11), RCXC (서열 번호 12), RRCXC (서열 번호 13), RKCXC (서열 번호14), KRCXC (서열 번호 15), KCKC (서열 번호 16), KKCKC (서열 번호 17), KCRC (서열 번호 18), KKCRC (서열 번호 19), RCRC (서열 번호 20), RRCRC (서열 번호 21), RKCKC (서열 번호 22), KRCKC (서열 번호 23)이다);
(c) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서 n은 2이므로 산화환원효소 모티프 내에 내부 X1X2 아미노산 쌍이 생성되고, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 적어도 하나의 X는 H, K, R, 및 L-오르니틴과 같은 비천연 염기성 아미노산, 보다 바람직하게는 K 또는 R로부터 선택되는 염기성 아미노산이고,
m은 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고,
Z는 바람직하게는 H, K, R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 보다 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 이들 모티프에서, 내부 X1X2 아미노산 쌍은 산화환원효소 모티프 내에 위치하며, 여기서 m은 0 내지 3에서 선택된 정수이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K, R 및 본원에 정의된 바와 같은 비-천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. m이 1 또는 2이고 Z가 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비-천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산인 모티프가 바람직하다. X1 및 X2는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 모티프의 X1 및 X2는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 추가 예에서, 상기 모티프에서 X1 또는 X2 중 적어도 하나는 H, K, , 또는 L-오르니틴과 같은 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으R로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 모티프의 또 다른 예에서, 상기 모티프의 X1 또는 X2 중 적어도 하나는 P 또는 Y이다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1 X2 아미노산 쌍의 특정 비제한적 예는 다음과 같다: PY, HY, KY, RY, PH, PK, PR, HG, KG, RG, HH, HK, HR, GP, HP, KP, RP, GH, GK, GR, GH, KH, 및 RH. 이 형태의 특히 바람직한 모티프는 [CST]XXC 또는 CXX[CST](서열 번호 1 또는 2), HCPYC, KHCPYC, KCPYC, RCPYC, HCGHC, KCGHC, 및 RCGHC (서열 번호 24 내지 30에 해당)이다. 이 형태의 대안적인 바람직한 모티프는 KKCPYC, KRCPYC, KHCGHC, KKCGHC, 및 KRCGHC(서열 번호 31 내지 35)이다);
(d) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서, n은 3이므로 산화환원효소 모티프 내에 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치를 생성하고,
X는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 적어도 하나의 X는 H, K, R, 및 L-오르니틴과 같은 비천연 염기성 아미노산, 보다 바람직하게는 K 또는 R로부터 선택되는 염기성 아미노산이고,
0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고,
Z는 바람직하게는 H, K, R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 보다 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. m이 1 또는 2이고, Z는 H, K 또는 R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비-천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산인 모티프가 바람직하다. 특정 예에서, X1, X2, 및 X3은 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산 또는 비천연 아미노산이다. 바람직하게는, 상기 모티프의 X1, X2, 및 X3은 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 상기 모티프의 X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 H, K 또는 R, 또는 L-오르니틴과 같은 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1, X2, 및 X3 아미노산 스트레치의 구체적인 예는 XPY, PXY, 및 PYX이며, 여기서 X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 K, R 또는 H와 같은 염기성 아미노산 또는 L-오르니틴과 같은 비천연 염기성 아미노산일 수 있다. 비제한적인 예에는 KPY, RPY, HPY, GPY, APY, VPY, LPY, IPY, MPY, FPY, WPY, PPY, SPY, TPY, CPY, YPY, NPY, QPY, DPY, EPY, KPY, PKY, PRY, PHY, PGY, PAY, PVY, PLY, PIY, PMY, PFY, PWY, PPY, PSY, PTY, PCY, PYY, PNY, PQY, PDY, PEY, PLY, PYK, PYR, PYH, PYG, PYA, PYV, PYL, PYI, PYM, PYF, PYW, PYP, PYS, PYT, PYC, PYY, PYN, PYQ, PYD, 또는 PYE가 포함된다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 다른 예는 XHG, HXG 및 HGX이며, 여기서 X는 KHG, RHG, HHG, GHG, AHG, VHG, LHG, IHG, MHG, FHG, WHG, PHG, SHG, THG, CHG, YHG, NHG, QHG, DHG, EHG, 및 KHG, HKG, HRG, HHG, HGG, HAG, HVG, HLG, HIG, HMG, HFG, HWG, HPG, HSG, HTG, HCG, HYG, HNG, HQG, HDG, HEG, HLG, HGK, HGR, HGH, HGG, HGA, HGV, HGL, HGI, HGM, HGF, HGW, HGP, HGS, HGT, HGC, HGY, HGN, HGQ, HGD, 또는 HGE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 또 다른 예는 XGP, GXP 및 GPX이며, 여기서 X는 KGP, RGP, HGP, GGP, AGP, VGP, LGP, IGP, MGP, FGP, WGP, PGP, SGP, TGP, CGP, YGP, NGP, QGP, DGP, EGP, KGP, GKP, GRP, GHP, GGP, GAP, GVP, GLP, GIP, GMP, GFP, GWP, GPP, GSP, GTP, GCP, GYP, GNP, GQP, GDP, GEP, GLP, GPK, GPR, GPH, GPG, GPA, GPV, GPL, GPI, GPM, GPF, GPW, GPP, GPS, GPT, GPC, GPY, GPN, GPQ, GPD, 또는 GPE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 또 다른 예는 XGH, GXH 및 GHX이며, 여기서 X는 KGH, RGH, HGH, GGH, AGH, VGH, LGH, IGH, MGH, FGH, WGH, PGH, SGH, TGH, CGH, YGH, NGH, QGH, DGH, EGH, KGH, GKH, GRH, GHH, GGH, GAH, GVH, GLH, GIH, GMH, GFH, GWH, GPH, GSH, GTH, GCH, GYH, GNH, GQH, GDH, GEH, GLH, GHK, GHR, GHH, GHG, GHA, GHV, GHL, GHI, GHM, GHF, GHW, GHP, GHS, GHT, GHC, GHY, GHN, GHQ, GHD, 또는 GHE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 또 다른 예는 XGF, GXF 및 GFX이며, 여기서 X는 KGF, RGF, HGF, GGF, AGF, VGF, LGF, IGF, MGF, FGF, WGF, PGF, SGF, TGF, CGF, YGF, NGF, QGF, DGF, EGF, 및 KGF, GKF, GRF, GHF, GGF, GAF, GVF, GLF, GIF, GMF, GFF, GWF, GPF, GSF, GTF, GCF, GYF, GNF, GQF, GDF, GEF, GLF, GFK, GFR, GFH, GFG, GFA, GFV, GFL, GFI, GFM, GFF, GFW, GFP, GFS, GFT, GFC, GFY, GFN, GFQ, GFD, 또는 GFE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 또 다른 예는 XRL, RXL 및 RLX이며, 여기서 X는 KRL, RRL, HRL, GRL, ARL, VRL, LRL, IRL, MRL, FRL, WRL, PRL, SRL, TRL, CRL, YRL, NRL, QRLRL, DRL, ERL, KRL, GKF, GRF, GHF, GGF, GAF, GVF, GLF, GIF, GMF, GFF, GWF, GPF, GSF, GTF, GCF, GYF, GNF, GQF, GDF, GEF, 및 GLF, RLK, RLR, RLH, RLG, RLA, RLV, RLL, RLI, RLM, RLF, RLW, RLP, RLS, RLT, RLC, RLY, RLN, RLQ, RLD, 또는 RLE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 또 다른 예는 XHP, HXP 및 HPX이며, 여기서 X는 KHP, RHP, HHP, GHP, AHP, VHP, LHP, IHP, MHP, FHP, WHP, PHP, SHP, THP, CHP, YHP, NHP, QHP, DHP, EHP, KHP, HKP, HRP, HHP, HGP, HAF, HVF, HLF, HIF, HMF, HFF, HWF, HPF, HSF, HTF, HCF, HYP, HNF, HQF, HDF, HEF, HLP, HPK, HPR, HPH, HPG, HPA, HPV, HPL, HPI, HPM, HPF, HPW, HPP, HPS, HPT, HPC, HPY, HPN, HPQ, HPD, 또는 HPE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다.
특히 바람직한 예는 다음과 같다: CRPYC, KCRPYC, KHCRPYC, RCRPYC, HCRPYC, CPRYC, KCPRYC, RCPRYC, HCPRYC, CPYRC, KCPYRC, RCPYRC, HCPYRC, CKPYC, KCKPYC, RCKPYC, HCKPYC, CPKYC, KCPKYC, RCPKYC, HCPKYC, CPYKC, KCPYKC, RCPYKC, 및 HCPYKC(서열 번호 36 내지 60에 해당));
(e) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서 n은 4(서열 번호 76)이므로 산화환원효소 모티프 내에 내부 X1X2X3X4 아미노산 스트레치를 형성하고, m은 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K, R 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. m이 1 또는 2이고 Z가 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산인 모티프가 바람직하다. X1, X2, X3 및 X4는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 모티프의 X1, X2, X3 및 X4는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 비제한적 예에서, 상기 모티프에서 X1, X2, X3 또는 X4 중 적어도 하나는 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 구체적인 예에는 LAVL (서열 번호 61), TVQA (서열 번호 62) 또는 GAVH (서열 번호 63) 및 이들의 변이체, 예컨대 X1AVL, LX2VL, LAX3L, 또는 LAVX4; X1VQA, TX2QA, TVX3A, 또는 TVQX4; X1AVH, GX2VH, GAX3H, 또는 GAVX4(서열 번호 64 내지 75에 해당)가 포함되며; 여기서 X1, X2, X3 및 X4는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산이다);
(f) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서 n은 5(서열 번호 77)이므로 산화환원효소 모티프 내에 내부 X1X2X3X4X5 아미노산 스트레치를 형성하고, m은 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K, R 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. m이 1 또는 2이고 Z가 H, K 또는 R 또는 L-오르니틴과 같은 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산인 모티프가 바람직하다. X1, X2, X3, X4 및 X5는 각각 개별적으로 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산일 수 있다: G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H 또는 비천연 아미노산. 바람직하게는, 상기 모티프에서 X1, X2, X3, X4 및 X5는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 예에서, 상기 모티프에서 X1, X2, X3, X4 또는 X5 중 적어도 하나는 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 구체적인 예에는 PAFPL (서열 번호 78) 또는 DQGGE (서열 번호 79) 및 이들의 변이체, 예컨대 X1AFPL, PX2FPL, PAX3PL, PAFX4L, 또는 PAFPX5; X1QGGE, DX2GGE, DQX3GE, DQGX4E, 또는 DQGGX5(서열 번호 80 내지 89에 해당)가 포함되며, 여기서 X1, X2, X3, X4 및 X5는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 아미노산이다);
(g) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서 n은 6(서열 번호 90)이므로 산화환원효소 모티프 내에 내부 X1X2X3X4X5X6 아미노산 스트레치를 형성하고, m은 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K, R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. m이 1 또는 2이고 Z가 H, K 또는 R 또는 L-오르니틴과 같은 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산인 모티프가 바람직하다. X1X2X3X4X5X6은 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 모티프에서 X1X2X3X4X5X6은 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 예에서, 상기 모티프에서 X1X2X3X4X5X6 중 적어도 하나는 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 구체적인 예에는 DIADKY (서열 번호 91) 또는 이의 변이체, 예컨대 X1IADKY, DX2ADKY, DIX3DKY, DIAX4KY, DIADX5Y, 또는 DIADKX6(서열 번호 92 내지 97에 해당)이 포함되고, 여기서 X1X2X3X4X5X6은 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산이다); 또는
(h) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서 n은 0 내지 6이고, m은 0이고, C 또는 [CST] 잔기 중 하나는 모티프의 아미노산 잔기의 N-말단 아미드 또는 C-말단 카복시 그룹에 아세틸, 메틸, 에틸 또는 프로피오닐 그룹을 가지도록 변형되었다. 이러한 모티프의 바람직한 실시양태에서, n은 2이고 m은 0이며, 여기서 내부 X1 및 X2는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산, 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 모티프에서 X1 및 X2는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 추가 예에서, 상기 모티프에서 X1 또는 X2 중 적어도 하나는 H, K, R, 또는 L-오르니틴과 같은 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 모티프의 또 다른 예에서, 상기 모티프에서 X1 또는 X2 중 적어도 하나는 P 또는 Y이다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2 아미노산 쌍의 특정 비제한적 예는 다음과 같다: PY, HY, KY, RY, PH, PK, PR, HG, KG, RG, HH, HK, HR, GP, HP, KP, RP, GH, GK, GR, GH, KH, 및 RH. 바람직하게는 상기 변형은 모티프에서 첫 번째 시스테인의 N-말단 아세틸화를 초래한다(N-아세틸-시스테인).
25. 측면 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 산화환원효소 모티프의 Xn 부분은 서열 PY를 포함하고, 바람직하게는 산화환원효소 모티프는 서열 CPYC(서열 번호 98)를 포함하는 방법.
26. 측면 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 산화환원효소 모티프의 아미노산 Z는 H, K, R 및 임의의 비천연 염기성 아미노산으로 이루어진 아미노산 군으로부터 선택되는 염기성 아미노산, 보다 바람직하게는 H, K 및 R로부터 선택되는 염기성 아미노산이며, 가장 바람직하게는 Z는 H 또는 K인 방법.
27. 측면 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역원성 펩티드의 길이는 9 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 9 내지 30개 아미노산인 방법.
28. 측면 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 산화환원효소 모티프는 상기 항원성 단백질의 T 세포 에피토프의 N-말단 또는 C-말단의 11개 아미노산 영역 내의 아미노산 서열에서 자연적으로 발생하지 않고/거나, 상기 T-세포 에피토프는 아미노산 서열에 상기 산화환원효소 모티프를 자연적으로 포함하지 않는 방법.
29. 측면 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원성 단백질은 (프로)인슐린, GAD65, GAD67, IA-2 (ICA512), IA-2 (베타/포그린), IGRP, 크로모그라닌, ZnT8 및 HSP-60으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 자가면역 질환은 제1형 당뇨병(T1D)인 방법.
30. 측면 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원성 단백질은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG), 미엘린 염기성 단백질(MBP), 프로테오리피드 단백질(PLP), 미엘린-희소돌기아교세포 염기성 단백질(MOBP) 및 희소돌기아교세포 특이적 단백질(OSP)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 자가면역 질환은 다발성 경화증(MS) 및/또는 시신경척수염(NMO)인 방법.
31. 측면 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원성 단백질은 GRP78, HSP60, 60 kDa 샤페로닌 2, 겔솔린, 치티나제-3-유사 단백질 1, 카텝신 S, 혈청 알부민, 및 카텝신 D로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염(RA)인 방법.
32. 측면 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원성 단백질은 종양 또는 암 항원, 예컨대 종양유전자, 원발암유전자, 바이러스 단백질, 생존 인자 또는 클론타입 또는 이디오타입 결정인자이고, 상기 질환은 암인 방법.
33. 다음을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA:
a) 산화환원효소 모티프;
b) 항원성 단백질의 T 세포 에피토프; 및
c) a)와 b) 사이의 0 내지 7개 아미노산, 바람직하게는 0 내지 4개 아미노산의 링커;
여기서 상기 산화환원효소 모티프 a)는 하기 일반 구조를 갖고:
Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-;
여기서 Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산으로, 보다 바람직하게는 K, H, R 및 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 K 또는 H, 보다 바람직하게는 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
m은 1, 0, 또는 2로 이루어진 군으로부터 선택된 정수이고;
X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산으로, 보다 바람직하게는 K, H, R 및 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 K 또는 H, 보다 바람직하게는 R로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n은 0 내지 6, 바람직하게는 0 내지 3, 가장 바람직하게는 2로부터 선택된 정수이고;
상기 산화환원효소 모티프에서의 하이픈(-)은 산화환원효소 모티프가 링커 또는 T 세포 에피토프의 N-말단 끝, 또는 링커 또는 T 세포 에피토프의 C-말단 끝에 부착되는 지점을 나타낸다.
34. 측면 33에 있어서, 비면역원성 RNA는 변형된 뉴클레오티드의 도입 및 dsRNA의 제거에 의해 비면역원성이 되는, 비면역원성 RNA.
35. 측면 34에 있어서, 변형된 뉴클레오티드는 선천적 면역 수용체의 RNA 매개 활성화를 억제하는, 비면역원성 RNA.
36. 측면 34 또는 35에 있어서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드로의 하나 이상의 우리딘의 대체를 포함하는 비면역원성 RNA.
37. 측면 36에 있어서, 변형된 핵염기는 변형된 우라실인 비면역원성 RNA.
38. 측면 36 또는 37에 있어서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드는 3-메틸-우리딘 (m3U), 5-메톡시-우리딘 (mo5U), 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘 (s2U), 4-티오-우리딘 (s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘 (ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘 (예를 들어, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산 (cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르 (mcmo5U), 5-카복시메틸-우리딘 (cm5U), 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 (chm5U), 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르 (mchm5U), 5-메톡시카보닐메틸-우리딘 (mcm5U), 5-메톡시카보닐메틸-2-티오-우리딘 (mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘 (nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘 (mnm5U), 1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘 (mnm5se2U), 5-카바모일메틸-우리딘 (ncm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-우리딘 (cmnm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (cmnm5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5- 타우리노메틸-우리딘 (τm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘 (τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 5-메틸-2-티오-우리딘 (m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘 (D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘 (m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N(1)-메틸-슈도우리딘 (m1ψ), 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘 (acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필)슈도우리딘 (acp3 ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘 (inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘 (inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘 (Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘 (m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘 (ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘 (s2Um), 5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm5Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm5Um), 5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘 (m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm5Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-ara-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-ara-우리딘, 5-(2-카보메톡시비닐)우리딘, 및 5-[3-(1-E- 프로페닐아미노)우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비면역원성 RNA.
39. 측면 33 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (ψ), N(1)-메틸-슈도우리딘 (m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘 (m5U)인 비면역원성 RNA.
40. 측면 33 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드는 N(1)-메틸-슈도우리딘 (m1ψ)인 비면역원성 RNA.
41. 측면 33 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 mRNA인 비면역원성 RNA.
42. 측면 33 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 시험관 내에서 전사된 RNA인 비면역원성 RNA.
43. 측면 33 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 약학적 조성물이 투여되는 대상체의 세포에서 일시적으로 발현되는 비면역원성 RNA.
44. 측면 33 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 약학적 조성물이 투여되는 대상체의 수지상 세포에 전달되는 비면역원성 RNA.
45. 측면 44에 있어서, 수지상 세포는 미성숙 수지상 세포인 비면역원성 RNA.
46. 측면 33 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 비면역원성 RNA는 전달 비히클에 제형화되는 비면역원성 RNA.
47. 측면 46에 있어서, 전달 비히클은 입자를 포함하는 비면역원성 RNA.
48. 측면 46 또는 47에 있어서, 전달 비히클은 지질을 포함하는 비면역원성 RNA.
49. 측면 48에 있어서, 지질은 양이온성 지질을 포함하는 비면역원성 RNA.
50. 측면 48 또는 49에 있어서, 지질은 비면역원성 RNA와 복합체를 형성하고/하거나 캡슐화하는 비면역원성 RNA.
51. 측면 33 내지 50 중 어느 하나면에 있어서, 비면역원성 RNA는 리포솜에 제형화되는 비면역원성 RNA.
52. 측면 33 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드의 산화환원효소 모티프는 다음 아미노산 모티프로부터 선택되는 비면역원성 RNA:
(a) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서,
n은 0이고(예를 들어 서열 번호 733),
m은 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고,
Z는 바람직하게는 H, K, R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 보다 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 이러한 모티프의 비제한적인 바람직한 예는 KCC, KKCC (서열 번호 6), RCC, RRCC (서열 번호 7), RKCC (서열 번호 8), 또는 KRCC (서열 번호 9)이다);
(b) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서,
n은 1이고(예를 들어 서열 번호 734, 750 및 750),
X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K, R, 및 L-오르니틴과 같은 비천연 염기성 아미노산, 보다 바람직하게는 K 또는 R로부터 선택되는 염기성 아미노산이고,
0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고,
Z는 바람직하게는 H, K, R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 보다 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 이러한 모티프의 비제한적인 바람직한 예는 KCXC (서열 번호 10), KKCXC (서열 번호 11), RCXC (서열 번호 12), RRCXC (서열 번호 13), RKCXC (서열 번호14), KRCXC (서열 번호 15), KCKC (서열 번호 16), KKCKC (서열 번호 17), KCRC (서열 번호 18), KKCRC (서열 번호 19), RCRC (서열 번호 20), RRCRC (서열 번호 21), RKCKC (서열 번호 22), KRCKC (서열 번호 23)이다);
(c) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서 n은 2(서열 번호 723, 728, 735, 740, 745, 752, 757 및 758)이므로 산화환원효소 모티프 내에 내부 X1X2 아미노산 쌍이 생성되고, 여기서 X는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 적어도 하나의 X는 H, K, R, 및 L-오르니틴과 같은 비천연 염기성 아미노산, 보다 바람직하게는 K 또는 R로부터 선택되는 염기성 아미노산이고,
0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고,
Z는 바람직하게는 H, K, R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 보다 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 이들 모티프에서, 내부 X1X2 아미노산 쌍은 산화환원효소 모티프 내에 위치하며, 여기서 m은 0 내지 3에서 선택된 정수이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K, R 및 본원에 정의된 바와 같은 비-천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. m이 1 또는 2이고 Z가 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비-천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산인 모티프가 바람직하다. X1 및 X2는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 모티프의 X1 및 X2는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 추가 예에서, 상기 모티프에서 X1 또는 X2 중 적어도 하나는 H, K, R, 또는 L-오르니틴과 같은 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 모티프의 또 다른 예에서, 상기 모티프의 X1 또는 X2 중 적어도 하나는 P 또는 Y이다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1 X2 아미노산 쌍의 특정 비제한적 예는 다음과 같다: PY, HY, KY, RY, PH, PK, PR, HG, KG, RG, HH, HK, HR, GP, HP, KP, RP, GH, GK, GR, GH, KH, 및 RH. 이 형태의 특히 바람직한 모티프는 CPYC(서열 번호 98), HCPYC, KHCPYC, KCPYC, RCPYC, HCGHC, KCGHC, 및 RCGHC (서열 번호 24 내지 30에 해당)이다. 이 형태의 대안적인 바람직한 모티프는 KKCPYC, KRCPYC, KHCGHC, KKCGHC, 및 KRCGHC(서열 번호 31 내지 35)이다);
(d) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서, n은 3(서열 번호 724, 729, 736, 741, 746, 753, 759 및 760)이므로 산화환원효소 모티프 내에 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치를 생성하고,
X는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 적어도 하나의 X는 H, K, R, 및 L-오르니틴과 같은 비천연 염기성 아미노산, 보다 바람직하게는 K 또는 R로부터 선택되는 염기성 아미노산이고,
0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고,
Z는 바람직하게는 H, K, R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 보다 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. m이 1 또는 2이고, Z는 H, K 또는 R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비-천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산인 모티프가 바람직하다. 특정 예에서, X1, X2, 및 X3은 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산 또는 비천연 아미노산이다. 바람직하게는, 상기 모티프의 X1, X2, 및 X3은 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 상기 모티프의 X1, X2, 및 X3 중 적어도 하나는 H, K 또는 R, 또는 L-오르니틴과 같은 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1, X2, 및 X3 아미노산 스트레치의 구체적인 예는 XPY, PXY, 및 PYX이며, 여기서 X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 K, R 또는 H와 같은 염기성 아미노산 또는 L-오르니틴과 같은 비천연 염기성 아미노산일 수 있다. 비제한적인 예에는 KPY, RPY, HPY, GPY, APY, VPY, LPY, IPY, MPY, FPY, WPY, PPY, SPY, TPY, CPY, YPY, NPY, QPY, DPY, EPY, KPY, PKY, PRY, PHY, PGY, PAY, PVY, PLY, PIY, PMY, PFY, PWY, PPY, PSY, PTY, PCY, PYY, PNY, PQY, PDY, PEY, PLY, PYK, PYR, PYH, PYG, PYA, PYV, PYL, PYI, PYM, PYF, PYW, PYP, PYS, PYT, PYC, PYY, PYN, PYQ, PYD, 또는 PYE가 포함된다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 다른 예는 XHG, HXG 및 HGX이며, 여기서 X는 KHG, RHG, HHG, GHG, AHG, VHG, LHG, IHG, MHG, FHG, WHG, PHG, SHG, THG, CHG, YHG, NHG, QHG, DHG, EHG, 및 KHG, HKG, HRG, HHG, HGG, HAG, HVG, HLG, HIG, HMG, HFG, HWG, HPG, HSG, HTG, HCG, HYG, HNG, HQG, HDG, HEG, HLG, HGK, HGR, HGH, HGG, HGA, HGV, HGL, HGI, HGM, HGF, HGW, HGP, HGS, HGT, HGC, HGY, HGN, HGQ, HGD, 또는 HGE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 또 다른 예는 XGP, GXP 및 GPX이며, 여기서 X는 KGP, RGP, HGP, GGP, AGP, VGP, LGP, IGP, MGP, FGP, WGP, PGP, SGP, TGP, CGP, YGP, NGP, QGP, DGP, EGP, KGP, GKP, GRP, GHP, GGP, GAP, GVP, GLP, GIP, GMP, GFP, GWP, GPP, GSP, GTP, GCP, GYP, GNP, GQP, GDP, GEP, GLP, GPK, GPR, GPH, GPG, GPA, GPV, GPL, GPI, GPM, GPF, GPW, GPP, GPS, GPT, GPC, GPY, GPN, GPQ, GPD, 또는 GPE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 또 다른 예는 XGH, GXH 및 GHX이며, 여기서 X는 KGH, RGH, HGH, GGH, AGH, VGH, LGH, IGH, MGH, FGH, WGH, PGH, SGH, TGH, CGH, YGH, NGH, QGH, DGH, EGH, KGH, GKH, GRH, GHH, GGH, GAH, GVH, GLH, GIH, GMH, GFH, GWH, GPH, GSH, GTH, GCH, GYH, GNH, GQH, GDH, GEH, GLH, GHK, GHR, GHH, GHG, GHA, GHV, GHL, GHI, GHM, GHF, GHW, GHP, GHS, GHT, GHC, GHY, GHN, GHQ, GHD, 또는 GHE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 또 다른 예는 XGF, GXF 및 GFX이며, 여기서 X는 KGF, RGF, HGF, GGF, AGF, VGF, LGF, IGF, MGF, FGF, WGF, PGF, SGF, TGF, CGF, YGF, NGF, QGF, DGF, EGF, 및 KGF, GKF, GRF, GHF, GGF, GAF, GVF, GLF, GIF, GMF, GFF, GWF, GPF, GSF, GTF, GCF, GYF, GNF, GQF, GDF, GEF, GLF, GFK, GFR, GFH, GFG, GFA, GFV, GFL, GFI, GFM, GFF, GFW, GFP, GFS, GFT, GFC, GFY, GFN, GFQ, GFD, 또는 GFE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 또 다른 예는 XRL, RXL 및 RLX이며, 여기서 X는 KRL, RRL, HRL, GRL, ARL, VRL, LRL, IRL, MRL, FRL, WRL, PRL, SRL, TRL, CRL, YRL, NRL, QRLRL, DRL, ERL, KRL, GKF, GRF, GHF, GGF, GAF, GVF, GLF, GIF, GMF, GFF, GWF, GPF, GSF, GTF, GCF, GYF, GNF, GQF, GDF, GEF, 및 GLF, RLK, RLR, RLH, RLG, RLA, RLV, RLL, RLI, RLM, RLF, RLW, RLP, RLS, RLT, RLC, RLY, RLN, RLQ, RLD, 또는 RLE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2X3 아미노산 스트레치의 또 다른 예는 XHP, HXP 및 HPX이며, 여기서 X는 KHP, RHP, HHP, GHP, AHP, VHP, LHP, IHP, MHP, FHP, WHP, PHP, SHP, THP, CHP, YHP, NHP, QHP, DHP, EHP, KHP, HKP, HRP, HHP, HGP, HAF, HVF, HLF, HIF, HMF, HFF, HWF, HPF, HSF, HTF, HCF, HYP, HNF, HQF, HDF, HEF, HLP, HPK, HPR, HPH, HPG, HPA, HPV, HPL, HPI, HPM, HPF, HPW, HPP, HPS, HPT, HPC, HPY, HPN, HPQ, HPD, 또는 HPE에서와 같이 임의의 아미노산일 수 있다.
특히 바람직한 예는 다음과 같다: CRPYC, KCRPYC, KHCRPYC, RCRPYC, HCRPYC, CPRYC, KCPRYC, RCPRYC, HCPRYC, CPYRC, KCPYRC, RCPYRC, HCPYRC, CKPYC, KCKPYC, RCKPYC, HCKPYC, CPKYC, KCPKYC, RCPKYC, HCPKYC, CPYKC, KCPYKC, RCPYKC, 및 HCPYKC(서열 번호 36 내지 60에 해당));
(e) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서 n은 4(서열 번호 725, 730, 737, 742, 747, 754, 761 및 762)이므로 산화환원효소 모티프 내에 내부 X1X2X3X4 아미노산 스트레치를 형성하고, m은 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K, R 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. m이 1 또는 2이고 Z가 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산인 모티프가 바람직하다. X1, X2, X3 및 X4는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 모티프의 X1, X2, X3 및 X4는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 비제한적 예에서, 상기 모티프에서 X1, X2, X3 또는 X4 중 적어도 하나는 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 구체적인 예에는 LAVL (서열 번호 61), TVQA (서열 번호 62) 또는 GAVH (서열 번호 63) 및 이들의 변이체, 예컨대 X1AVL, LX2VL, LAX3L, 또는 LAVX4; X1VQA, TX2QA, TVX3A, 또는 TVQX4; X1AVH, GX2VH, GAX3H, 또는 GAVX4(서열 번호 64 내지 75에 해당)가 포함되며; 여기서 X1, X2, X3 및 X4는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산이다);
(f) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서 n은 5(서열 번호 726, 731, 738, 743, 748, 755, 763 및 764)이므로 산화환원효소 모티프 내에 내부 X1X2X3X4X5 아미노산 스트레치를 형성하고, m은 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K, R 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. m이 1 또는 2이고 Z가 H, K 또는 R 또는 L-오르니틴과 같은 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산인 모티프가 바람직하다. X1, X2, X3, X4 및 X5는 각각 개별적으로 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산일 수 있다: G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H 또는 비천연 아미노산. 바람직하게는, 상기 모티프에서 X1X2X3X4X5는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 예에서, 상기 모티프에서 X1X2X3X4X5 중 적어도 하나는 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 구체적인 예에는 PAFPL (서열 번호 78) 또는 DQGGE (서열 번호 79) 및 이들의 변이체, 예컨대 X1AFPL, PX2FPL, PAX3PL, PAFX4L, 또는 PAFPX5; X1QGGE, DX2GGE, DQX3GE, DQGX4E, 또는 DQGGX5(서열 번호 80 내지 89에 해당)가 포함되며, 여기서 X1, X2, X3, X4 및 X5는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 아미노산이다);
(g) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서 n은 6(서열 번호 727, 732, 739, 744, 749, 756, 765 및 766)이므로 산화환원효소 모티프 내에 내부 X1X2X3X4X5X6 아미노산 스트레치를 형성하고, m은 0, 1 또는 2로부터 선택된 정수이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K, R, 및 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 예컨대 L-오르니틴, 바람직하게는 K 또는 H, 가장 바람직하게는 K로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. m이 1 또는 2이고 Z가 H, K 또는 R 또는 L-오르니틴과 같은 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 K 또는 H로부터 선택되는 염기성 아미노산인 모티프가 바람직하다. X1X2X3X4X5X6은 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 모티프에서 X1X2X3X4X5X6은 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 예에서, 상기 모티프에서 X1X2X3X4X5X6 중 적어도 하나는 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 구체적인 예에는 DIADKY (서열 번호 91) 또는 이의 변이체, 예컨대 X1IADKY, DX2ADKY, DIX3DKY, DIAX4KY, DIADX5Y, 또는 DIADKX6(서열 번호 92 내지 97에 해당)이 포함되고, 여기서 X1X2X3X4X5X6은 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산이다); 또는
(h) Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-
(여기서 n은 0 내지 6이고, m은 0이고, C 또는 [CST] 잔기 중 하나는 모티프의 아미노산 잔기의 N-말단 아미드(서열 번호 770-779) 또는 C-말단 카복시(서열 번호 780-789) 그룹에 아세틸, 메틸, 에틸 또는 프로피오닐 그룹을 가지도록 변형되었다. 이러한 모티프의 바람직한 실시양태에서, n은 2이고 m은 0이며, 여기서 내부 X1X2는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산, 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 모티프에서 X1X2는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 추가 예에서, 상기 모티프에서 X1 또는 X2 중 적어도 하나는 H, K, R, 또는 L-오르니틴과 같은 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산으로부터 선택되는 염기성 아미노산이다. 모티프의 또 다른 예에서, 상기 모티프에서 X1 또는 X2 중 적어도 하나는 P 또는 Y이다. 산화환원효소 모티프 내의 내부 X1X2 아미노산 쌍의 특정 비제한적 예는 다음과 같다: PY, HY, KY, RY, PH, PK, PR, HG, KG, RG, HH, HK, HR, GP, HP, KP, RP, GH, GK, GR, GH, KH, 및 RH. 바람직하게는 상기 변형은 모티프에서 첫 번째 시스테인의 N-말단 아세틸화를 초래한다(N-아세틸-시스테인).
53. 측면 33 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 내 산화환원효소 모티프의 Xn 부분은 서열 PY를 포함하고, 바람직하게는 산화환원효소 모티프는 서열 CPYC(서열 번호 98)를 포함하거나, 서열 HCPYC, KHCPYC, KCPYC, RCPYC, HCGHC, KCGHC, RCGHC, KKCPYC, KRCPYC, KHCGHC, KKCGHC, 및 KRCGHC(서열 번호 24 내지 35) 중 어느 하나를 갖는 비면역원성 RNA.
54. 측면 33 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 내 산화환원효소 모티프의 아미노산 Z는 H, K, R 및 비천연 염기성 아미노산으로 이루어진 아미노산 군으로부터 선택되는 염기성 아미노산, 보다 바람직하게는 H, K 및 R로부터 선택되는 염기성 아미노산이며, 가장 바람직하게는 Z는 H 또는 K인 비면역원성 RNA.
55. 측면 33 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역원성 펩티드는 9 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 9 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는 비면역원성 RNA.
56. 측면 33 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드의 산화환원효소 모티프는 상기 항원성 단백질 내의 T-세포 에피토프의 N-말단 또는 C-말단의 11개 아미노산 영역 내의 아미노산 서열에서 자연적으로 발생하지 않고/거나, 상기 T 세포 에피토프는 그의 아미노산 서열에 상기 산화환원효소 모티프를 자연적으로 포함하지 않는 비면역원성 RNA.
57. 측면 33 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원성 단백질은 (프로)인슐린, GAD65, GAD67, IA-2(ICA512), IA-2(베타/ 포그린), IGRP, 크로모그라닌, ZnT8 및 HSP-60으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 자가면역 질환은 제1형 당뇨병(T1D)인 비면역원성 RNA.
58. 측면 33 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원성 단백질은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG), 미엘린 염기성 단백질(MBP), 프로테오리피드 단백질(PLP), 희소돌기아교세포 염기성 단백질(MOBP) 및 희소돌기아교세포 특이적 단백질(OSP)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 자가면역 질환은 다발성 경화증(MS) 및/또는 시신경척수염(NMO)인 비면역원성 RNA.
59. 측면 33 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원성 단백질은 GRP78, HSP60, 60 kDa 샤페로닌 2, 겔솔린, 키티나제-3-유사 단백질 1, 카텝신 S, 혈청 알부민 및 카텝신 D로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염(RA)인 비면역원성 RNA.
60. 측면 33 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원성 단백질은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)이고, 상기 자가면역 질환은 시신경척수염(NMO)인 비면역원성 RNA.
61. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 측면 33 내지 60 중 어느 하나의 비면역원성 RNA.
62. 측면 33 내지 60 중 어느 하나에 따른 비면역원성 RNA 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
63. 측면 1 내지 62 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, 펩티드 내 링커는 적어도 1개의 아미노산, 적어도 2개의 아미노산, 적어도 3개의 아미노산, 또는 적어도 4개의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 상기 링커는 1 내지 7개의 아미노산, 예컨대 2 내지 7개의 아미노산, 3 내지 7개의 아미노산, 또는 4 내지 7개의 아미노산을 포함한다.
64. 측면 1 내지 63 중 어느 하나의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 펩티드의 T 세포 에피토프는 N-말단 끝, 즉 링커 또는 산화환원효소 모티프에 바로 인접한 곳에, 더욱 특히 링커가 없거나 1개 또는 2개의 아미노산으로만 구성된 경우 염기성 아미노산을 포함하지 않는다. 보다 바람직하게는, 모든 측면에서, T-세포 에피토프는 N-말단 끝, 즉 링커 또는 산화환원효소 모티프에 바로 인접한 곳에, 더욱 특히 링커가 없거나 1개 또는 2개의 아미노산으로만 구성된 경우 염기성 아미노산을 포함하지 않는다.
65. 측면 1 내지 64 중 어느 하나의 추가 실시양태에서, 펩티드의 T 세포 에피토프는 N-말단 끝에서 계산하여, 즉 링커 또는 산화환원효소 모티프에 바로 인접한 곳에, 더욱 특히 링커가 없거나 1개 또는 2개의 아미노산으로만 구성된 경우 위치 1, 2 및/또는 3에 염기성 아미노산을 포함하지 않는다.
66. 측면 1 내지 65 중 어느 하나에서, 펩티드 내의 산화환원효소 모티프는 상기 펩티드의 N-말단을 형성한다. 대안적인 세트의 실시양태에서, 산화환원효소 모티프는 펩티드의 C-말단을 형성한다.
67. 측면 1 내지 66 중 어느 하나에 있어서, MS 치료를 받는 환자는 전형적으로 HLA-DRB1*15:01, HLA-DRB1*03:01, HLA-DRB1*04:01, 및 HLA-DRB1*07:01로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA HLA-DRB1*, 바람직하게는 HLA-DRB1* 15:01을 갖는다.
68. 측면 1 내지 66 중 어느 하나에 있어서, NMO 치료를 받는 환자는 전형적으로 HLA-DRB1*03:01 및 HLA-DPB1*05:01(아시아의 경우)로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 유형을 갖는다.
69. 측면 1 내지 66 중 어느 하나에 있어서, T1D 치료를 받는 환자는 전형적으로 HLA-DRB1*03:01 및 04:01로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 유형을 갖는다.
70. 측면 1 내지 66 중 어느 하나에 있어서, RA 치료를 받는 환자는 전형적으로 HLA-DRB1*01:01, 04:01 및 04:04로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 유형을 갖는다.
71. 측면 1 내지 70 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, 펩티드 내 상기 T 세포 에피토프는 7 내지 25개 아미노산 길이를 갖는 NKT 세포 에피토프이거나; 또는 상기 T 세포 에피토프는 7 내지 25개 아미노산, 바람직하게는 9 내지 25개 아미노산 길이를 갖는 MHC 클래스 II T 세포 에피토프이다.
72. 측면 1 내지 71 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, 펩티드 내의 상기 T 세포 에피토프는 7 내지 50개의 아미노산 길이를 갖는 NKT 세포 에피토프이거나, 또는 상기 펩티드는 길이 7 내지 50개의 아미노산, 바람직하게는 9 내지 50개의 아미노산을 갖는 MHC 클래스 II T 세포 에피토프를 포함한다.
73. 본원에 나열된 측면 중 어느 하나에서, 산화환원효소 모티프는 특히 n이 0 또는 1이고 m이 0인 경우, 표준 C-XX-[CST] 또는 [CST]-XX-C 산화환원효소 모티프의 반복, 예컨대 하나 이상의 아미노산으로 이격될 수 있는 상기 모티프의 반복(예를 들어 CXXC X CXXC X CXXC (서열 번호 99)), 서로 인접한 반복(CXXCCXXCCXXC (서열 번호 100)) 또는 서로 중첩되는 반복(CXXCXXCXXC (서열 번호 101) 또는 CXCCXCCXCC (서열 번호 102))의 일부가 아니다.
도 1: 7일부터 28일까지 매일 수행된 임상 EAE 점수(0-5)의 맹검 평가를 나타낸다. 마우스에 MOG35-55를 주사하여 0일에 EAE를 유도하고 처리하지 않은 채로 두거나(비히클) IMCY-0189 m1ψ YLNP-캡슐화된 mRNA 또는 MOG35-55 m1ψ YLNP-캡슐화된 mRNA로 치료적으로 치료하였다(자세한 내용은 표 2 참조). 각 마우스 그룹에 대해 평균 임상 점수를 매일 결정하였다.
도 2: 각 마우스 그룹에 대해 도 1에 표시된 EAE 점수로부터 계산된 AUC를 나타낸다. 유의미한 차이는 다음과 같다: *p<0.05, **p<0.01.
도 3: 각 마우스 그룹에 대해 도 1에 표시된 EAE 점수로부터 계산된 MMS를 나타낸다. 유의미한 차이는 다음과 같다: *p<0.05.
발명의 상세한 설명
본 발명이 특정 실시양태와 관련하여 설명될 것이나, 본 발명은 이에 한정되지 않고 청구범위에 의해서만 한정된다. 청구항에서의 임의의 참조 표시는 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 하기 용어 또는 정의는 단지 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것이다. 본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 제공된 정의는 당업자에 의해 이해되는 범위보다 좁은 범위를 갖는 것으로 해석되어서는 안 된다.
달리 명시하지 않는 한, 상세하게 구체적으로 기술되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자에게 명백한 바와 같이 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행된다. 예를 들어, 표준 핸드북, 상기 언급된 일반적인 배경 기술 및 그 안에 인용된 다른 참고 문헌을 다시 참조한다.
본 명세서에 사용된 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 단수 및 복수 대상을 모두 포함한다. 본원에서 사용되는 측면, 청구항 또는 실시양태와 관련하여 사용될 때 "임의의"라는 용어는 임의의 하나 (즉, 어느 하나)뿐만 아니라 언급된 상기 측면, 청구 범위 또는 실시양태의 모든 조합을 의미한다.
본원에서 사용된 '포함하는', '포함한다' 및 '이루어진'이라는 용어는 '포함한', '포함하다' 또는 '함유하는', '함유한다'와 동의어이며, 포괄적이거나 제한이 없으며, 추가의 인용되지 않은 요소, 원소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 상기 용어는 또한 "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"의 실시양태들을 포함한다.
종점에 의한 수치 범위의 열거는 인용된 종점뿐만 아니라 각 범위 내에 포함된 모든 숫자와 분수를 포함한다.
파라미터, 양, 지속 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용되는 "약"이라는 용어는 하기 변동이 개시된 발명을 수행하는데 적합하기만 하면, 제시된 값으로부터 ±10% 이하, 바람직하게는 ±5% 이하, 보다 바람직하게는 ±1% 이하, 보다 더 바람직하게는 ±0.1% 이하의 변동을 포함하는 것을 의미한다. 수식어 '약'이 가리키는 값 자체도 구체적으로, 및 바람직하게는 개시되는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용된 "질환 치료에 사용하기 위한 조성물"에 사용된 "사용하기 위한"이란 용어는 또한 질환 치료용 약제의 제조를 위한 제제의 상응하는 사용 및 상응하는 치료 방법을 나타낼 것이다.
본원에서 사용된 "펩티드"라는 용어는, 펩티드 결합에 의해 연결된 2 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하지만 비-아미노산 구조도 포함할 수 있는 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 "면역원성 펩티드"라는 용어는, 면역원성인, 즉 면역 반응을 유도할 수 있는 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드를 의미한다.
본 발명에 따른 펩티드는 통상의 20종의 아미노산 또는 그의 변형된 버전 중 임의의 것을 포함할 수 있거나, 화학적 펩티드 합성에 의해 또는 화학적 또는 효소적 변형에 의해 도입된 비-자연적으로 발생된 아미노산을 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 "항원"이라는 용어는, 거대분자, 전형적으로 (폴리사카라이드를 포함하거나 포함하지 않는) 단백질로 이루어지거나, 또는 하나 이상의 합텐(들)을 포함하고 T 또는 NKT 세포 에피토프를 포함하는 단백질 조성물로 만들어진 구조체를 의미한다.
본원에서 사용된 "항원성 단백질"이라는 용어는 하나 이상의 T 또는 NKT 세포 에피토프를 포함하는 단백질을 의미한다. 본원에서 사용된 자가항원 또는 자가항원성 단백질이란 동일 인간 또는 동물 체내에서 면역 반응을 유도하는, 체내에 존재하는 인간 또는 동물 단백질 또는 이의 단편을 의미한다.
본원에서 사용된 "식품 또는 의약품 항원성 단백질" 이라는 용어는 백신에서와 같이 식품 또는 의약품에 존재하는 항원성 단백질을 의미한다.
"에피토프"라는 용어는, 항체 또는 그의 일부 (Fab', Fab2' 등), 또는 B- 또는 T- 또는 NKT 세포의 세포 표면에 존재하는 수용체에 의해 특이적으로 인식되고, 결합되며, 상기 결합에 의해 면역 반응을 유도할 수 있는, 항원성 단백질의 (구조형태적 에피토프를 정의할 수 있는) 한 부분 또는 여러 부분을 의미한다.
본 발명의 문맥에서 "T 세포 에피토프"라는 용어는 우세, 준우세(sub-dominant) 또는 열세(minor) T 세포 에피토프, 즉, T 림프구의 세포 표면에서 수용체에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 항원성 단백질의 일부를 의미한다. 에피토프가 우세 에피토프인지, 준우세 에피토프인지, 또는 열세 에피토프인지의 여부는 에피토프에 대해 유도되는 면역 반응에 따라 달라진다. 우세 정도는 이러한 에피토프가 단백질의 모든 가능한 T 세포 에티토프들 중에서 T 세포에 의해 인식되고, 그를 활성화시킬 수 있는 빈도에 따라 달라진다. T 세포 에피토프는 MHC 클래스 II 분자에 의해 인식되는 에피토프이거나 CD1d 분자에 의해 인식되는 NKT 세포 에피토프일 수 있다.
T 세포 에피토프는 MHC 클래스 II 분자에 의해 인식되는 에피토프일 수 있으며, 전형적으로 MHC II 분자의 홈(groove)에 맞는 9개의 아미노산 서열로 구성된다. MHC 클래스 II T 세포 에피토프를 나타내는 펩티드 서열 내에서, 에피토프 중의 아미노산은 P1부터 P9까지 번호가 매겨질 수 있고, 에피토프의 N 말단 아미노산은 P-1, P-2 등으로 번호가 매겨질 수 있으며, 아미노산 C 에피토프의 말단은 P+1, P+2 등으로 번호가 매겨질 수 있다. MHC 클래스 I 분자가 아닌 MHC 클래스 II 분자에 의해 인식되는 펩티드는 MHC 클래스 II 제한 T 세포 에피토프로 지칭된다.
항원성 단백질로부터 T 세포 에피토프의 식별 및 선택은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 맥락에서 적합한 에피토프를 확인하기 위해, 항원성 단백질의 단리된 펩티드 서열을 예를 들어 T 세포 생물학 기술에 의해 시험하여 펩티드 서열이 T 세포 반응을 유도하는지 여부를 결정한다. T 세포 반응을 유도하는 것으로 밝혀진 펩티드 서열은 T 세포 자극 활성을 갖는 것으로 정의된다.
인간 T 세포 자극 활성은 예를 들어 T1D를 갖는 개체로부터 얻은 T 세포를 T1D와 관련된 자가항원으로부터 유래된 펩티드/에피토프와 함께 배양하고 예를 들어 삼중수소 티미딘의 세포 흡수에 의해 측정되어 T 세포의 증식이 펩티드/에피토프에 반응하여 일어나는지 여부를 결정함으로써 추가로 시험할 수 있다. 펩티드/에피토프에 대한 T 세포의 반응에 대한 자극 지수는 펩티드/에피토프에 대한 반응의 최대 CPM을 대조 CPM으로 나누어 계산할 수 있다. 배경 수준의 2배 이상인 T 세포 자극 지수(S.I.)는 "양성"으로 간주된다. 양성 결과는 시험된 펩티드/에피토프 그룹에 대한 각 펩티드/에피토프의 평균 자극 지수를 계산하는 데 사용된다.
비천연 (또는 변형) T 세포 에피토프는 추가로 선택적으로 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 친화도에 대해 시험될 수 있다. 이는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 가용성 HLA 클래스 II 분자는 주어진 클래스 II 분자에 대해 동형접합성인 세포를 용해하여 얻는다. 후자는 친화성 크로마토그래피로 정제된다. 가용성 클래스 II 분자는 해당 클래스 II 분자에 대한 강한 결합 친화도에 따라 생성된 비오틴 표지 참조 펩티드와 함께 배양된다. 클래스 II 결합에 대해 평가할 펩티드를 다양한 농도에서 배양하고 클래스 II 결합으로부터 참조 펩티드를 대체하는 능력을 뉴트라비딘을 첨가하여 계산한다.
예를 들어 정밀 매핑 기술을 통해 최적의 T 세포 에피토프를 결정하기 위해, T 세포 자극 활성을 갖고 따라서 T 세포 생물학 기술에 의해 결정된 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드를 펩티드의 아미노- 또는 카복시-말단에서 아미노산 잔기의 추가 또는 결실에 의해 변형시키고 변형된 펩티드에 대한 T 세포 반응성의 변화를 결정하기 위해 시험하였다. T 세포 생물학 기술에 의해 결정된 바와 같이, 천연 단백질 서열에서 중첩 영역을 공유하는 2개 이상의 펩티드가 인간 T 세포 자극 활성을 갖는 것으로 밝혀지면, 그러한 펩티드의 전부 또는 일부를 포함하는 추가 펩티드가 생산될 수 있으며, 유사한 절차로 이들 추가적인 펩티드를 시험할 수 있다. 이 기술에 따라 재조합 또는 합성을 통해 펩티드를 선택하고 생산한다. T 세포 에피토프 또는 펩티드는 개인 집단에서 펩티드/에피토프에 대한 T 세포 반응의 강도(예를 들어, 자극 지수) 및 펩티드에 대한 T 세포 반응의 빈도를 포함하는 다양한 요인에 기초하여 선택된다.
추가로 및/또는 대안적으로, 하나 이상의 시험관 내 알고리즘을 사용하여 항원성 단백질 내의 T 세포 에피토프 서열을 확인할 수 있다. 적합한 알고리즘은 [Zhang et al. (2005) Nucleic Acids　Res 33, W180-W183 (PREDBALB); Salomon & Flower (2006) BMC Bioinformatics　7, 501 (MHCBN); Schuler et al. (2007) Methods Mol. Biol.409, 75-93 (SYFPEITHI); Donnes & Kohlbacher (2006) Nucleic Acids Res. 34, W194-W197 (SVMHC); Kolaskar & Tongaonkar (1990) FEBS Lett. 276, 172-174, Guan et al. (2003) Appl. Bioinformatics 2, 63-66 (MHCPred) 및 Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17, 1236-1237 (Propred)]에 기술된 알고리즘을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 이러한 알고리즘은 MHC II 분자의 홈에 맞추어질 하나 이상의 옥타- 또는 노나펩티드 서열의 항원성 단백질 내 예측을 허용하며 이는 다양한 HLA 유형에 대한 것이다.　
용어 "MHC"는 "주요 조직적합성 항원"을 지칭한다. 인간에서, MHC 유전자는 HLA("인간 백혈구 항원") 유전자로 알려져 있다. 일관되게 따르는 관례는 없지만, 일부 문헌은 HLA 단백질 분자를 지칭하기 위해 HLA를 사용하고, MHC는 HLA 단백질을 인코딩하는 유전자를 지칭하기 위해 사용된다. 이와 같이 "MHC" 및 "HLA"라는 용어는 본원에서 사용되는 경우 등가적이다. 인간의 HLA 시스템은 마우스에서 그의 동등체, 즉 H2 시스템을 가지고 있다. 가장 심도있게 연구된 HLA 유전자는 다음 9개의 소위 고전적인 MHC 유전자이다: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLAs DQB1, HLA-DRA, 및 HLA-DRB1. 인간에서는 MHC가 클래스 I, II 및 III의 세 영역으로 구분된다. A, B 및 C 유전자는 MHC 클래스 I에 속하며, 반면에 6개의 D 유전자는 클래스 II에 속한다. MHC 클래스 I 분자는 세포 표면에서 베타 2 마이크로글로불린과 결합하는 3개의 도메인 (알파 1, 2 및 3)을 포함하는 단일 다형쇄로 이루어진다. 클래스 II 분자는 2개의 다형쇄로 이루어져 있으며 각각 2개의 쇄 (알파 1과 2, 및 베타 1과 2)를 포함한다.
MS 치료를 받는 환자는 전형적으로 HLA-DRB1*15:01, HLA-DRB1*03:01, HLA-DRB1*04:01, 및 HLA-DRB1*07:01, 바람직하게는 HLA-DRB1*15:01로 이루어진 군으부터 선택된 HLA HLA-DRB1* 유형을 갖는다.
NMO 치료를 받는 환자는 전형적으로 HLA-DRB1*03:01 및 HLA-DPB1*05:01(아시아의 경우)로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 유형을 갖는다.
T1D 치료를 받는 환자는 전형적으로 HLA-DRB1*03:01 및 04:01로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 유형을 갖는다.
RA 치료를 받는 환자는 전형적으로 HLA-DRB1*01:01, 04:01, 및 04:04로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 유형을 갖는다.
클래스 I MHC 분자는 실질적으로 모든 핵생성 세포에서 발현된다.
클래스 I MHC 분자와 관련하여 제시된 펩티드 단편은 CD8+ T 림프구 (세포용해성 T 림프구 또는 CTL)에 의해 인식된다. CD8+ T 림프구는 종종 자극 항원을 갖는 세포를 용해시킬 수 있는 세포용해 이펙터로 성숙된다. 클래스 II MHC 분자는 주로 활성화된 림프구 및 항원 제시 세포에서 발현된다. CD4+ T 림프구 (헬퍼 T 림프구 또는 Th)는 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포에서 통상 발견되는 클래스 II MHC 분자에 의해 제시된 독특한 펩티드 단편의 인식으로 활성화된다. CD4+ T 림프구는 항체 매개 및 세포 매개 반응을 지원하는 IL-2, IFN-γ 및 IL-4와 같은 사이토카인을 증식 및 분비한다.
기능성 HLA는 내인성 및 외래성, 잠재적으로 항원성인 펩티드가 결합하는 깊은 결합 홈을 특징으로 한다. 홈은 잘 정의된 모양과 물리화학적 특성으로 추가 특정된다. 펩티드 말단이 홈의 말단에 고정되어 있기 때문에 HLA 클래스 I 결합 부위는 닫혀 있다. 그들은 또한 보존 HLA 잔기가 있는 수소 결합의 네트워크에 관여한다. 이러한 제약의 관점에서, 결합된 펩티드의 길이는 8, 9 또는 10 잔기로 제한된다. 그러나, 12개 까지의 아미노산 잔기의 펩티드가 또한 HLA 클래스 I에 결합할 수 있음이 입증되었다. 상이한 HLA 복합체의 구조 비교로 펩티드가 비교적 선형의 확장된 형태를 채택하는 일반적인 결합 방식이거나, 중앙 잔기가 홈 밖으로 튀어나오게 포함할 수 있음을 확인하였다.
HLA 클래스 I 결합 부위와 달리, 클래스 II 부위는 양단이 개방되어 있다. 이것은 펩티드가 실제 결합 영역으로부터 확장되어 양쪽 단부에서 "뻗어지는 (hanging out)" 것을 허용한다. 따라서 클래스 II HLA는 9개에서 25개 초과의 아미노산 잔기에 이르는 가변 길이의 펩티드 리간드에 결합할 수 있다. HLA 클래스 I와 유사하게, 클래스 II 리간드의 친화성은 "불변" 및 "가변" 성분에 의해 결정된다. 불변 부분은 다시 HLA 클래스 II 홈의 보존된 잔기와 결합된 펩티드의 주 쇄간에 형성된 수소 결합의 네트워크에 기인한다. 그러나, 이러한 수소 결합 패턴은 펩티드의 N- 및 C-말단 잔기에 국한되지 않고 전체 쇄에 분포된다. 후자는 복합화된 펩티드의 구조를 엄격하게 선형 결합 방식으로 제한하기 때문에 중요하다. 이것은 모든 클래스 II 동종이형에 공통적이다. 펩티드의 결합 친화성을 결정하는 제2 성분은 클래스 II 결합 부위 내 다형성의 특정 위치로 인해 가변적이다. 상이한 동종이형은 홈 내에서 상이한 상보적 포켓을 형성함으로써, 펩티드의 아형 의존성 선택 또는 특이성을 설명한다. 중요하게, 클래스 II 포켓 내에서 유지되는 아미노산 잔기에 대한 제약은 일반적으로 클래스 I에 대한 것보다 "약하다". 다른 HLA 클래스 II 동종이형 중에서 펩티드의 교차 반응이 보다 더 많다. MHC II 분자의 홈에 들어 맞는 MHC 클래스 II T 세포 에피토프의 +/- 9 (즉, 8, 9 또는 10) 아미노산 서열은 일반적으로 P1 내지 P9로 번호가 매겨진다. 에피토프의 추가 아미노산 N-말단은 P-1, P-2 등으로 번호가 매겨지고, 에피토프의 아미노산 C 말단은 P+1, P+2 등으로 번호가 매겨진다.
"NKT 세포 에피토프" 라는 용어는 NKT 세포의 세포 표면에서 수용체에 의해 특이적으로 인식되고 결합되며 전형적으로 7개 아미노산 길이를 가지는 항원성 단백질의 일부를 지칭한다. 특히, NKT 세포 에피토프는 CD1d 분자에 의해 결합된 에피토프이다. NKT 세포 에피토프는 일반 모티프 FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT](서열 번호 103)를 갖는다. 이 일반 모티프의 대안적 버전은 위치 1 및/또는 위치 7에 대체 [FWYH]를 가지며, 따라서 [FWYH]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYH](서열 번호 104)이다
이 일반 모티프의 대안적 버전은 위치 1 및/또는 위치 7에 대안 [FWYT]를 가지며, FWYT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYT](서열 번호 105)이다. 이 일반 모티프의 대안적인 형태는 위치 1 및/또는 위치 7에 대안적인 [FWY]를 가지며, [FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY](서열 번호 106)이다.
위치 1 및/또는 7의 아미노산에 관계없이 일반 모티프의 대안적 버전은 위치 4에 대체 [ILM]를 가지며, 예를 들면 [FWYH]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWYH] (서열 번호 107) 또는 [FWYHT]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWYHT] (서열 번호 108) 또는 [FWY]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWY] (서열 번호 109)이다. 이러한 소수성 펩티드는 위치 P1과 P7이 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)과 같은 소수성 잔기로 점유된 모티프가 특징이다. 그러나 P7은 트레오닌(T)이나 히스티딘(H)과 같은 페닐알라닌이나 트립토판에 대한 대체 소수성 잔기를 수용한다는 점에서 허용적이다. P4 위치는 이소류신(I), 류신(L) 또는 메티오닌(M)과 같은 지방족 잔기가 차지한다. 이러한 펩티드는 자연적으로 CD1d 결합 모티프를 구성하는 소수성 잔기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 모티프의 아미노산 잔기는 일반적으로 CD1d에 결합하는 능력을 증가시키는 잔기로의 치환에 의해 변형된다. 특정 실시양태에서, 모티프는 상기 일반적인 모티프에 더욱 밀접하게 맞도록 변형된다. 보다 구체적으로, 펩티드는 위치 7에 F 또는 W를 함유하도록 생성된다.
단백질의 CD1d 결합 모티프는 수동으로 또는 [ScanProsite De Castro E. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(Web Server issue):W362-W365]과 같은 알고리즘을 사용하여 상기 서열 모티프에 대한 서열을 스캐닝하여 식별할 수 있다.
"자연 살해 T" 또는 "NKT" 세포는 비-전통적인 MHC 복합체 분자 CD1d에 의해 제시된 항원을 인식하는 비-전통적인 T 림프구의 상이한 하위 집합을 구성한다. NKT 세포의 두 하위 집합이 현재 설명되어 있다. 불변 NKT 세포(iNKT)라고도 불리는 유형 I NKT 세포가 가장 풍부하다. 이는 불변 알파 사슬로 구성된 알파-베타 T 세포 수용체(TCR)(마우스의 경우 Valphal4, 인간의 경우 Valpha24)가 존재하는 것이 특징이다. 이 알파 사슬은 제한된 수의 베타 사슬을 통해 가변기와 연결된다. 2형 NKT 세포에 알파-베타 TCR을 갖지만 다형성 알파 사슬이 있다. 그러나 NKT 세포의 다른 하위 집합이 존재한다는 것은 명백하며, 그 표현형은 아직 불완전하게 정의되어 있지만 CD1d 분자의 맥락에서 제시된 당지질에 의해 활성화되는 특성을 공유한다.
NKT 세포는 전형적으로 NKG2D 및 NK1.1을 포함한 자연 살해(NK) 세포 수용체의 조합을 발현한다. NKT 세포는 선천성 면역계의 일부이며, 완전한 이펙터 용량을 획득하기 전에 확장이 필요하지 않다는 점에서 입양성 면역계와 구별될 수 있다. 대부분의 이들 매개자는 미리 구성되며 전사가 필요하지 않다. NKT 세포는 세포내 병원체에 대한 면역 반응과 종양 거부에 주요 참여자로 나타났다. 자가면역 질환과 이식 거부반응을 조절하는 역할도 지지된다.
인식 단위인 CD1d 분자는 베타-2 마이크로글로불린의 존재를 포함하여 MHC 클래스 I 분자의 구조와 매우 유사한 구조를 가지고 있다. 이는 두 개의 알파 사슬로 둘러싸여 있고 지질 사슬을 수용하는 고도로 소수성인 잔기를 포함하는 깊은 틈새(cleft)가 특징이다. 틈새는 양쪽 말단이 열려 있어 더 긴 사슬을 수용할 수 있다. CD1d의 표준 리간드는 합성 알파 갈락토실세라미드(알파 GalCer)이다. 그러나 글리코- 및 인지질, 미엘린에서 발견되는 천연 지질 설페이티드, 미생물 포스포이노시톨 만노시드 및 알파-글루쿠로노실세라미드를 비롯한 많은 천연 대체 리간드가 설명되었다. 현재 업계의 합의는(Matsuda et al (2008), Curr. Opinion Immunol., 20 358-368; Godfrey et al (2010), Nature rev. Immunol 11, 197-206) 여전히 CD1d가 지질 사슬을 포함하는 리간드에만 결합하거나, 또는 일반적으로 CD1d에 묻혀 있는 지질 꼬리와 CD1d 밖으로 튀어나온 당 잔기 헤드 그룹으로 구성된 공통 구조라는 것이다.
에피토프와 관련하여 본원에서 사용된 "상동체"라는 용어는 자연적으로 발생된 에피토프와 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 이로써 B 및/또는 T 세포의 세포 표면 수용체 또는 항체에 결합할 수 있는 에피토프의 능력을 유지는 분자를 지칭한다. 에피토프의 특정 상동체는 최대 3개, 더욱 특히 최대 2개, 가장 특히 1개의 아미노산에서 변형된 천연 에피토프에 상응한다.
펩티드와 관련하여 본원에서 사용된 "유도체"라는 용어는 적어도 펩티드 활성 부분(즉, 세포용해 CD4+ T 세포 활성을 유도할 수 있는 산화환원효소 모티프 및 MHC 클래스 II 에피토프)를 함유하고, 그 이외에도, 다른 목적, 예컨대 펩티드를 안정화시키거나 또는 펩티드의 약동학적 또는 약력학적 특성을 변경시키고자 하는 목적을 가질 수 있는 상보적인 부분을 포함하는 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 두 서열의 "서열 동일성"이라는 용어는 두 서열이 정렬될 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산을 갖는 위치의 수를 두 더 짧은 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수로 나눈 것을 가리킨다. 특히, 서열 동일성은 70% 내지 80%, 81% 내지 85%, 86% 내지 90%, 91% 내지 95%, 96% 내지 100% 또는 100%이다.
본원에 사용된 용어 "펩티드-인코딩 폴리뉴클레오티드 (또는 핵산)" 및 "폴리뉴클레오티드 (또는 핵산) 인코딩 펩티드"는 적절한 환경에서 발현될 때 관련 펩티드 서열 또는 그의 유도체 또는 상동체를 생성하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 펩티드를 인코딩하는 정상 서열뿐만 아니라 필요한 활성을 갖는 펩티드를 발현할 수 있는 이들 핵산의 유도체 및 단편을 포함한다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산은 포유동물 유래 또는 포유동물에 상응하는 펩티드 또는 그 단편, 가장 특히 인간 펩티드 단편을 인코딩하는 서열이다.
용어 "산화환원효소 모티프", "티올-산화환원효소 모티프", "티오환원효소 모티프", "티오레독스 모티프" 또는 "산화환원 모티프"는 본원에서 동의어로서 사용되며, 하나의 분자(환원제, 수소 또는 전자 공여체라고도 함)로부터 다른 것(산화제, 수소 또는 전자 수용체라고도 함)으로 전자를 전달하는 데 관여하는 모티프를 지칭한다. 특히, 용어 "산화환원효소 모티프"는 공지된 [CST]XXC (서열 번호 110) 또는 CXX[CST] (서열 번호 111) 모티프를 지칭할 수 있지만, 특히 서열 모티프 [CST]XnC (서열 번호 112) 또는 CXn[CST] (서열 번호 113)를 지칭하며, 여기서 n은 0, 1, 3, 4, 5 또는 6을 포함하는 그룹으로부터 선택된 정수이고, C는 시스테인, S는 세린, T는 트레오닌, X는 임의의 아미노산을 나타낸다. 환원 활성을 갖기 위해서는 변형된 산화환원 효소 모티프에 존재하는 시스테인이 시스틴 디설파이드 가교의 일부로 발생해서는 안 된다. 보다 구체적으로, 상기 산화환원효소 모티프는 다음과 같은 일반 구조를 갖는다: Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-(여기서, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산, 보다 바람직하게는 K, H, R 및 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 K 또는 H, 보다 바람직하게는 K를 포함하는 군으로부터 선택되고; m은 1, 0, 또는 2로 이루어진 군으로부터 선택된 정수이고; X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산, 보다 바람직하게는 K, H, R 및 비천연 염기성 아미노산, 바람직하게는 K 또는 H, 보다 바람직하게는 R로 이루어진 군으로부터 선택되고; n은 0 내지 6, 바람직하게는 0 내지 3, 가장 바람직하게는 2로부터 선택된 정수이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 모티프는 [CST]-XX-C- (서열 번호 1) 또는 C-XX-[CST]- (서열 번호 2)를 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.
"염기성 아미노산" 이라는 용어는 브론스테드-로리 및 루이스 염기처럼 작용하는 모든 아미노산을 지칭하며, 아르기닌(R), 라이신(K), 히스티딘(H)과 같은 천연 염기성 아미노산 또는 다음을 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 비천연 염기성 아미노산을 포함한다:
· Fmoc-β-Lys(Boc)-OH (CAS Number 219967-68-7), Fmoc-Orn(Boc)-OH (L-오르니틴 또는 오르니틴 (CAS Number 109425-55-0)이라고도 함), Fmoc-β-Homolys(Boc)-OH (CAS Number 203854-47-1), Fmoc-Dap(Boc)-OH (CAS Number 162558-25-0) 또는 Fmoc-Lys(Boc)OH(DiMe)-OH (CAS Number 441020-33-3)와 같은 라이신 변이체;
· Fmoc-L-3Pal-OH (CAS Number 175453-07-3), Fmoc-βHomoPhe(CN)-OH (CAS Number 270065-87-7), Fmoc-L-β-HomoAla(4-피리딜)-OH (CAS Number 270065-69-5) 또는 Fmoc-L-Phe(4-NHBoc)-OH (CAS Number 174132-31-1)와 같은 티로신/페닐알라닌 변이체;
· Fmoc-Pro(4-NHBoc)-OH (CAS Number 221352-74-5) 또는 Fmoc-Hyp(tBu)-OH (CAS Number 122996-47-8)와 같은 프롤린 변이체;
· Fmoc-β-Homoarg(Pmc)-OH (CAS Number 700377-76-0)와 같은 아르기닌 변이체.
본원에 개시된 면역원성 펩티드는 전형적으로 알레르겐 또는 (자가)항원에 대한 상승되거나 조절되지 않는 면역 반응에 의해 유발되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 전형적으로 상기 항원성 단백질은 자가항원, 가용성 동종인자, 이식편에 의해 배출된 동종항원, 세포내 병원체의 항원, 유전자 치료 또는 유전자 백신접종에 사용되는 바이러스 벡터의 항원, 종양 관련 항원 또는 알레르겐이다. 보다 바람직하게는, 상기 항원성 단백질은 제1형 당뇨병(T1D), 다발성 경화증(MS) 또는 시신경척수염(NMO)과 같은 탈수초성 장애, 또는 류마티스 관절염(RA)과 관련된 자가항원이다.
"면역 장애" 또는 "면역 질환"이라는 용어는 면역계의 반응이 유기체에서 기능장애 또는 비생리학적인 상황의 원인이 되거나, 또는 그를 지속시키는 질환을 지칭한다. 그 중에서도 특히, 알레르기성 장애 및 자가면역 질환이 면역 질환에 포함된다.
용어 "알레르기 질환" 또는 "알레르기 장애"는 알레르겐이라 불리는 특정 물질(꽃가루, 독침, 약물 또는 음식 등)에 대한 면역체계의 과민반응을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 알레르기는 아토피 개인 환자가 민감하게 반응하는 알레르겐을 접할 때마다 관찰되는 징후와 증상의 총체이며, 이로 인해 다양한 질환, 특히 호흡기 질환 및 기관지 천식과 같은 증상이 발생할 수 있다. 다양한 유형의 분류가 존재하며 대부분 알레르기 장애는 포유류 신체의 어느 부위에서 발생하는지에 따라 다른 이름을 갖는다. "과민증"은 개인이 감작된 항원에 노출되었을 때 개인에게 나타나는 바람직하지 않은(손상적이고 불편함을 유발하며 때로는 치명적인) 반응이고; "즉각적 과민증"은 IgE 항체 생산에 달려 있으므로 알레르기와 동일하다.
"자가면역 질환" 또는 "자가면역 장애"라는 용어는 유기체가 (분자 수준 이하에 이르기까지의) 그 자신의 구성 성분을 "자가"인 것으로 인식하지 못함에 따라 발생되는 그 자신의 세포 및 조직에 대한 비정상적인 면역 반응으로부터 유발되는 질환을 지칭한다. 상기 질환 군은 2개의 카테고리, 기관-특이적 질환 및 전신 질환으로 분류될 수 있다.
"알레르겐"은 소인을 가진, 특히 유전적 소인을 가진 개인 (아토피) 환자에서 IgE 항체의 생산을 유도하는 물질, 일반적으로 거대분자 또는 단백질성 조성물로 정의된다. 유사 정의가 문헌 [Liebers et al., (1996) Clin. Exp. Allergy 26, 494-516]에 제시되어 있다.
본원에 사용된 용어 "탈수초화"는 병변 또는 플라크 형성의 결과로 이어지는 뉴런의 축삭을 둘러싸는 수초의 손상 및/또는 분해를 지칭한다. 미엘린은 뇌, 시신경 및 척수의 신경 섬유를 둘러싸는 보호 덮개 역할을 하는 것으로 이해된다. 탈수초화로 인해, 영향을 받은 신경을 따라 신호 전달이 손상되고(즉, 느려지거나 중단됨), 감각, 운동, 인지 및/또는 기타 신경 기능의 결함과 같은 신경학적 증상을 유발할 수 있다. 탈수초성 질환을 앓고 있는 환자의 구체적인 증상은 질환 및 질환 진행 상태에 따라 다양하다. 여기에는 시야 흐림 및/또는 복시, 운동 실조증, 간헐성 경련, 구음 장애, 피로, 서투름, 손 마비, 편마비, 생식기 감각상실, 불균형, 감각 이상/지각 이상, 안구 마비, 근육 협응 장애, 근육 약화, 감각 상실, 시력 장애, 신경학적 증상, 불안정한 보행 방식(걸음걸이), 경련성 하반신마비, 요실금, 청력 문제, 언어 문제 등이 포함될 수 있다.
따라서, 본원에 사용되고 당업계에서 일반적으로 사용되는 "탈수초성 질환" 또는 "탈수초성 장애"는 뉴런의 수초의 장애, 예를 들어 손상을 수반하는 신경계의 모든 병리학적 상태를 나타낸다. 탈수초성 질환은 중추신경계 탈수초성 질환과 말초신경계로 계층화될 수 있다. 대안적으로, 탈수초성 질환은 탈수초화의 원인에 따라 수초 파괴(탈수초성 수초파괴성) 또는 비정상 및 퇴행성 수초(수초이상 백질이영양증)로 분류될 수 있다. 탈수초성 질환의 비제한적 예는 다발성 경화증(MS - (예: 재발성/이장 다발성 경화증(Relapsing/Remitting Multiple Sclerosis), 이차성 진행성 다발성 경화증, 진행성 재발성 다발성 경화증, 원발성 진행성 다발성 경화증 및 급성 전격성 다발성 경화증), 시신경척수염(NMO), 시신경 신경염, 급성 파종성 뇌척수염, 발로병, HTLV-I 관련 척수병증, 쉴더병, 횡단 척수염, 특발성 염증성 탈수초성 질환, 비타민 B12 유발 중추 신경계 신경병증, 중심다리뇌말이집용해(Central pontine myelinolysis), 척수로(tabes dorsalis)를 포함한 척수장애, 부신백질이영양증과 같은 백질이영양증, 진행성 다초점 백질뇌병증(PML)과 같은 백질뇌병증 및 풍진 유발 정신 지체이다. 위에서 언급한 주석 중 몇몇은 분자 수준에서 이상 과정의 동일하거나 유사한 세트 및/또는 동일하거나 유사한 (임상) 증상 세트를 특징으로 하는 질환 그룹을 나타내는 일반 분류명이라는 것을 당업자라면 인식할 수 있을 것이다. 탈수초 장애를 갖는 인간 환자는 시각 장애, 무감각, 사지 약화, 떨림 또는 경직, 열 불내성, 언어 장애, 요실금, 현기증 또는 고유 감각(예: 균형, 조정, 사지 위치 감각) 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 탈수초 장애의 하나 이상의 증상을 가질 수 있다. 탈수초 장애의 가족력(예: 탈수초 장애에 대한 유전적 소인)이 있거나 위에서 설명한 탈수초 장애의 경미하거나 드문 증상을 나타내는 인간(예: 인간 환자)은 방법의 목적 상 탈수초 장애(예: 다발성 경화증)가 발생할 위험이 있는 것으로 간주될 수 있다. 본 개시내용과 관련하여 바람직한 탈수초성 질환은 다발성 경화증(MS) 또는 시신경척수염(NMO)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 MOG 자가항원에 의해 발생하거나 항-MOG 항체와 관련된 질환이다.
본원 및 당업계에서 MS로 약칭되는 용어 "다발성 경화증"은 중추신경계에 영향을 미치는 자가면역 장애를 나타낸다. MS는 젊은 성인에게 가장 흔한 비외상성 장애 질환으로 간주되며(Dobson and Giovannoni, (2019) Eur. J. Neurol. 26(1), 27-40), 중추신경계에 영향을 미치는 가장 흔한 자가면역 장애이다(Berer and Krishnamoorthy (2014) FEBS Lett. 588(22), 4207-4213). MS는 신체적, 정신적 문제부터 정신과적 문제까지 다양한 다양한 증상으로 대상체에게 나타날 수 있다. 전형적인 증상으로는 시야 흐림 또는 복시, 근육 약화, 한쪽 눈의 실명, 및 조정력 및 감각 장애 등이 있다. 대부분의 경우, MS는 2-단계 질환으로 볼 수 있으며, 초기 염증은 재발-복원 질환을 담당하고 지연된 신경변성은 비재발성 진행, 즉 2차 및 1차 진행성 MS를 유발한다. 해당 분야에서 진전이 이루어지고 있지만, 질환의 결정적인 근본 원인은 지금까지 파악하기 어려운 상태로 남아 있으며 150개 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성이 MS 감수성과 연관되어 있다(International Multiple Sclerosis Genetics Consortium Nat Genet. (2013). 45(11):1353-60). 비타민 D 결핍, 흡연, 자외선 B(UVB) 노출, 소아 비만 및 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스에 의한 감염이 질환 발병에 기여하는 것으로 보고되었다(Ascherio (2013) Expert Rev Neurother. 13(12 Suppl), 3-9).
따라서, MS는 재발(염증이 주요 특징임)부터 진행성(신경변성이 우세)까지 확장되는 스펙트럼 내에 존재하는 단일 질환으로 간주될 수 있다. 그러므로, 본원에 사용된 용어 다발성 경화증은 모든 종류의 질환 경과 분류에 속하는 모든 유형의 다발성 경화증을 포괄하는 것이 분명하다. 특히, 본 발명은 임상적 단독 증후군(CIS), 재발 복원 MS(RRMS), 2차 진행성 MS(SPMS), 1차 진행성 MS(PPMS), 및 심지어 MS로 의심되는 방사선 고립 증후군(RIS)으로 진단된, 또는 의심되는 환자의 강력한 치료 전략이 될 것으로 예상된다. 엄격히 MS의 질환 경과로 간주되지는 않지만, RIS는 뇌 및/또는 척수의 자기공명영상(MRI)에서 MS 병변에 해당하고 다른 진단으로는 일견 설명할 수 없는 이상을 보이는 대상을 분류하는 데 사용된다. CIS는 중추신경계의 염증과 탈수초화로 인해 발생하는 신경학적 증상의 첫 번째 에피소드(정의상 24시간 이상 지속)이다. RIS에 따라 CIS로 분류된 대상체는 MS가 계속 발생할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있으며, 뇌 MRI에서 MS와 유사한 병변을 보이는 대상체는 MS가 발생할 가능성이 더 높다. RRMS는 MS의 가장 흔한 질환 과정으로, MS를 앓고 있는 대상체의 85%가 RRMS로 진단된다. RRMS 진단 환자가 본 발명의 관점에서 바람직한 환자 그룹이다. RRMS는 신경학적 증상이 새로 나타나거나 증가하거나 재발 또는 악화로 표현되는 것이 특징이다. RRMS에서, 상기 재발 후에는 증상의 기간 또는 부분적 또는 완전한 완화가 따르며, 이러한 완화 기간에는 질환 진행이 경험 및/또는 관찰되지 않는다. RRMS는 활동성 RRMS(재발 및/또는 새로운 MRI 활동의 증거), 비활동성 RRMS, 악화 RRMS(재발 후 특정 기간 동안 장애가 증가하거나 RRMS가 악화되지 않음)로 더 분류될 수 있다. RRMS의 일부가 진단된 대상체는 시간이 지남에 따라 신경 기능의 점진적인 악화, 즉 장애의 축적을 특징으로 하는 SPMS 질환 과정으로 진행될 것이다. 활동성(재발 및/또는 새로운 MRI 활동), 비활동성, 진행성(시간이 지남에 따라 질환이 악화되는 질환) 또는 비진행성 SPMS과 같은 SPMS 하위 분류가 가능하다. 마지막으로, PPMS는 신경 기능이 악화되어 조기 재발이나 완화 없이 증상 시작부터 장애가 축적되는 것을 특징으로 하는 MS 질환 과정이다. 활동성 PPMS(간헐적 재발 및/또는 새로운 MRI 활동), 비활동성 PPMS, 진행성 PPMS(새로운 MRI 활동과 관계없이 시간이 지남에 따라 질환이 악화되는 증거) 및 비진행성 PPMS과 같은 추가 PPMS 하위 그룹이 구성될 수 있다. 일반적으로, MS 질환 경과는 심각도(재발의 경우)와 지속 기간 모두에서 재발 및 관해 기간 측면에서 개체 간 상당한 변동성이 있다는 특징이 있다.
MS에는 여러 가지 질환 수정 치료법이 이용 가능하므로 본 발명은 대체 치료 전략으로 사용되거나 기존 치료법과 조합하여 사용될 수 있다. 활성 약학 성분의 비제한적 예에는 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b, 글라티라머 아세테이트, 글라티라머 아세테이트, 페그인터페론 베타-1a, 테리플루노미드, 핑골리모드, 클라드리빈, 시포니모드, 디메틸 푸마레이트, 디록시멜 푸마레이트, 오자니모드, 알렘투주맙, 미톡산트론, 오크렐리주맙 및 나탈리주맙이 포함된다. 대안적으로, 본 발명은 재발 관리를 목표로 하는 치료 또는 약물, 예를 들어 메틸프레드니솔론, 프레드니손 및 부신피질 자극 호르몬(들)(ACTH)(이에 제한되지는 않음)과 조합하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 특정 증상을 완화시키는 것을 목표로 하는 치료법과 함께 사용될 수 있다. 비제한적인 예로는 방광 문제, 장 기능 장애, 우울증, 현기증, 어지러움, 정서적 변화, 피로, 가려움증, 통증, 성적 문제, 경직, 떨림 및 보행 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 증상을 개선하거나 방지는 것을 목표로 하는 약물이 포함된다.
MS는 1) 중추신경계의 병변 형성, 2) 염증, 및 3) 뉴런의 수초 분해라는 세 가지 서로 얽힌 특징을 특징으로 한다. 전통적으로 중추신경계 및 백질의 탈수초성 질환으로 간주되었음에도 불구하고, 최근에는 피질 및 심층 회색질의 탈수초화가 백질 탈수초화를 초과할 수 있다는 보고가 표면화되었다(Kutzelnigg et al. (2005). Brain. 128(11), 2705-2712). MS가 분자 수준에서 어떻게 발생하는지에 대해 두 가지 주요 가설이 가정되었다. 일반적으로 받아들여지는 "아웃사이드-인 가설"은 중추신경계로 이동하여 질환 과정을 시작하는 말초 자가반응 이펙터 CD4+ T 세포의 활성화에 기초한다. 일단 중추신경계에 들어가면, 상기 T 세포는 APC에 의해 국소적으로 재활성화되고 추가 T 세포 및 대식세포를 모집하여 염증성 병변을 확립한다. 주목할 점은 MS 병변이 주로 병변 가장자리에서 발견되는 CD8+ T 세포를 포함하고, CD4+ T 세포가 병변의 중심에서 더 많이 발견되는 것으로 나타난 것이다. 이들 세포는 탈수초화, 희소돌기아교세포 파괴 및 축삭 손상을 유발하여 신경학적 기능 장애를 일으키는 것으로 생각된다. 또한, 면역 조절 네트워크가 촉발되어 염증을 제한하고 복구를 시작하여 임상적 관해에 의해 적어도 부분적인 재수초화가 반영된다. 그럼에도 불구하고 적절한 치료가 이루어지지 않으면 추가 발병으로 인해 질환이 진행되는 경우가 많다.
MS 발병은 환자의 MRI에서 명백히 오래되고 비활성인 병변이 전형적으로 발생하는 것으로 입증되는 것처럼 첫 번째 임상 증상이 발견되기 훨씬 전에 시작되는 것으로 믿어진다. 진단 방법 개발의 발전으로 인해 이제 질환의 임상적 발현(즉, 증상 전 MS) 이전에도 MS를 검출할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "MS의 치료" 및 유사한 표현은 증상이 있는 MS와 증상 전 MS 모두의 치료 및 치료 전략을 구상한다. 특히, 면역원성 펩티드 및/또는 생성된 세포용해성 CD4+ T 세포를 증상 전 MS 환자 치료에 사용하는 경우, 임상 증상이 부분적으로 또는 심지어 완전히 회피될 수 있는 초기 단계에서 질환이 중단된다. 대상체가 인터페론 베타 치료에 완전히 반응하지 않는 MS도 용어 "MS"에 포함된다. 면역 체계의 공격을 받아 질환을 일으키는 주요 항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG), 미엘린 염기성 단백질(MBP), 프로테오리피드 단백질(PLP), 미엘린 희소돌기아교세포 염기성 단백질(MOBP), 희소돌기아교세포 특이적 단백질(OSP)이다.
"시신경척수염(Neuromyelitis Optica)" 또는 "NMO" 및 "NMO 스펙트럼 장애(NMOSD)"라는 용어는 "데빅병(Devic's disease)"으로도 알려져 있으며 백혈구와 항체가 주로 시신경과 척수를 공격하지만 뇌를 공격할 수도 있는 자가면역질환을 지칭한다(Wingerchuk 2006, Int MS J. 2006 May;13(2):42-50에서 검토됨). 시신경이 손상되면 통증과 시력 상실을 유발하는 부종과 염증이 발생한다; 척수 손상은 다리나 팔의 약화 또는 마비, 감각 상실, 및 방광과 장 기능 문제를 유발한다. NMO는 재발-복원 질환이다. 재발 동안 시신경 및/또는 척수의 새로운 손상으로 인해 장애가 누적될 수 있다. MS와 달리 이 질환에는 진행 단계가 없다. 따라서 좋은 장기적 결과를 얻으려면 공격을 예방하는 것이 중요하다. 항-MOG 항체와 관련된 경우, 항-MOG 항체가 수초에 대한 공격을 촉발하여 탈수초화를 일으킬 수 있는 것으로 간주된다. 대부분의 경우 NMO의 원인은 자가항원에 대한 특이적 공격으로 인해 발생한다. 대상체의 최대 3분의 1이 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)이라고 불리는 미엘린 성분에 대한 자가항체에 대해 양성 반응을 보일 수 있다. 항-MOG 관련 NMO를 앓고 있는 사람들도 마찬가지로 횡단 척수염과 시신경염이 발생하는 에피소드를 가질 수 있다.
"류마티스 관절염" 또는 "RA" 라는 용어는 다양한 관절(가장 일반적으로 손, 손목 및 무릎)에서 통증, 부기, 경직 및 기능 상실을 유발하는 자가면역 염증성 질환이다. 각 관절의 내벽에 염증이 생겨 조직 손상은 물론 만성 통증, 불안정 및 기형을 초래한다. 일반적으로 질환 진행에는 양측/대칭 패턴이 있다(예: 양손 또는 양쪽 무릎이 영향을 받음). RA는 눈, 입, 폐, 심장 등 관절 외 부위에도 영향을 미칠 수 있다. 환자는 증상의 급성 악화(플레어(flare)라고 함)를 경험할 수 있지만 조기 개입과 적절한 치료를 통해 특정 기간 동안 증상이 완화될 수 있다(Sana Iqbal et al., 2019, US Pharm. 2019;44(1)(Specialty&Oncology suppl):8-11에서 검토). 면역 체계의 공격을 받고 질환을 일으키는 항원은 다양하지만 몇 가지 예를 들면 다음과 같다: GRP78, HSP60, 60 kDa 샤페로닌 2, 겔솔린, 치티나제-3 유사 단백질 1, 카텝신 S, 혈청 알부민, 카텝신 D.
"제1형 당뇨병" (T1D) 또는 "당뇨병 제1형" (또한 "제1형 진성 당뇨병" 또는 "면역 매개성 당뇨병"으로 알려져 있거나, 이전에 "청소년 발병 당뇨병" 또는 "인슐린 의존성 당뇨병"으로도 알려져 있음)이란 용어는 소아기 동안 감수성 개인에서 전형적으로 발생하는 자가 면역 장애이다. T1D 병인에 기초하여 자가 면역 메카니즘에 의해 대부분의 인슐린 생산 췌장 베타 세포가 파괴된다. 간단히 말해, 유기체는 인슐린 생산을 담당하는 췌장 베타 세포에 대한 면역 저항성을 상실하고 베타 세포의 자가 파괴로 이어지는 자가 항체 생산과 관련된 면역 반응 (주로 세포 매개성)을 유도한다.면역체계에 의해 공격받고 질환을 일으키는 주요 항원은 (프로)인슐린이지만 다른 예로는 GAD65, GAD67, IA-2 (ICA512), IA-2 (베타/포그린), IGRP, 크로모그라닌, ZnT8 및 HSP-60이 있다.
"치료적 유효량"이라는 용어는 환자에서 원하는 치료적 또는 예방적 효과를 일으키는 본 발명의 펩티드 또는 이의 유도체를 인코딩하는 비면역원성 RNA 분자의 양을 지칭한다. 이는 예를 들어, 질환 또는 장애와 관련하여, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도 감소시키는 양, 및 더욱 특히, 질환 또는 장애와 관련되거나, 또는 그의 원인이 되는 생리학적 또는 생화학적 파라미터를 부분적으로 또는 완전하게 정상 수준으로 회복시키는 양이다. 전형적으로, 치료적 유효량은 정상적인 생리학적 상황으로 개선 또는 회복될 수 있도록 하는 본 발명의 비면역원성 RNA 또는 그의 유도체의 양이다.
RNA는 바람직하게는 염화나트륨을 포함하는 적합한 완충제 중 RNA의 근육내 주사를 통해 투여된다.
본원에서 펩티드를 언급할 때, "천연"이라는 용어는 서열이 자연적으로 발생된 단백질 (야생형 또는 돌연변이)의 단편과 동일하다는 것을 언급한다. 그와 달리, "인공"이라는 용어는 자연상에는 존재하지 않는 서열을 의미한다. 인공 서열은 자연 발생 서열 내 하나 이상의 아미노산을 변경/결실/삽입하거나, 자연 발생 서열의 아미노산 N- 또는 C-말단을 첨가/제거하는 것과 같은 제한된 변형에 의해 천연 서열로부터 얻어진다.
이와 관련하여서, 전형적으로 에피토프 스캐닝의 맥락에서 펩티드 단편이 항원으로부터 생성된다는 것이 인식된다. 우연히도 이러한 펩티드는 그 서열에 T 세포 에피토프(MHC 클래스 II 에피토프 또는 CD1d 결합 에피토프)를 포함할 수 있고, 그에 인접하여 본원에 정의된 바와 같은 변형된 산화환원효소 모티프를 갖는 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 에피토프와 상기 산화환원효소 모티프 사이에 최대 11개 아미노산, 최대 7개 아미노산, 최대 4개 아미노산, 최대 2개 아미노산, 또는 심지어 0개(즉, 에피토프와 산화환원효소 모티프 서열은 서로 바로 인접해 있다) 아미노산의 아미노산 서열이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 그러한 자연 발생 펩티드는 배제된다.
본원에서 아미노산은 그의 전체 명칭, 그의 3문자 약어 또는 그의 1문자 약어로 지칭된다.
아미노산 서열의 모티프는 본원에서 Prosite 형식에 따라 기재되어 있다. 모티프는 서열의 특정 부분에서 특정 서열의 다양성을 설명하기 위해 사용된다. 기호 "X"는 임의의 아미노산이 허용되는 위치에 사용된다. 대괄호 ('[]') 사이에 주어진 위치에 허용되는 아미노산을 기입하여 표시하는 대안이 있다. 예를 들어, [CST]는 Cys, Ser 또는 Thr 중에서 선택된 아미노산을 나타낸다. 대안으로서 배제되는 아미노산은 중괄호 ('{}') 사이에 이들을 기입하여 표시한다. 예를 들어, {AM}은 Ala 및 Met을 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다. 모티프 내 다른 요소는 임의로 하이픈 (-)으로 서로 구분된다. 본 명세서에 개시된 모티프와 관련하여, 개시된 일반적인 산화환원효소 모티프는 전형적으로 모티프 외부의 다른 요소와 연결을 형성하지 않는 하이픈을 동반한다. 이러한 '열린' 하이픈은 링커 서열 또는 에피토프 서열과 같은 면역원성 펩티드의 다른 부분과 모티프의 물리적 연결 위치를 나타낸다. 예를 들어, "Zm-C-Xn-[CST]-" 형태의 모티프는 [CST]가 면역원성 펩티드의 다른 부분에 연결된 아미노산이고 Z가 면역원성 펩티드의 말단 아미노산임을 나타낸다. 바람직한 물리적 연결은 펩티드 결합이다. 모티프 내에서 동일한 요소의 반복은 해당 요소 뒤에 괄호 사이에 숫자 값이나 숫자 범위를 배치하여 표시할 수 있다. 여기서, "Xn"은 n배의 "X"를 의미한다. 예를 들어 X(2)는 XX 또는 XX에 해당한다; X(2, 5)는 2, 3, 4 또는 5개의 X 아미노산에 해당하고, A(3)은 A-A-A 또는 AAA에 해당한다. 아미노산을 구별하기 위해 산화환원효소 모티프 바깥쪽의 아미노산을 외부 아미노산, 산화환원효소 모티프 안쪽의 아미노산을 내부 아미노산이라고 한다. 달리 명시되지 않는 한, X는 임의의 아미노산, 특히 L-아미노산, 보다 특히 20개의 자연 발생 L-아미노산 중 하나를 나타낸다.
환원 활성을 갖는 T 세포 에피토프, 예를 들어 MHC 클래스 II T 세포 에피토프 또는 NKT 세포 에피토프(또는 CD1d 결합 펩티드 에피토프) 및 변형된 펩티드 모티프 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA는 항원 특이적 세포용해성 CD4+ T 세포, 각각 항원 제시 세포에 대한 세포용해성 NKT 세포 집단을 생성할 수 있다.
따라서, 가장 넓은 의미에서, 본 발명은 펩티드 디설파이드 결합에 대한 환원 활성을 갖는 변형된 산화환원효소 서열 모티프 및 면역 반응을 유발할 가능성이 있는 항원(자가 또는 비자가)의 적어도 하나의 T 세포 에피토프(MHC 클래스 II T 세포 에피토프 또는 NKT 세포 에피토프)를 포함하는 펩티드 인코딩 비면역원성 RNA에 관한 것이다. T 세포 에피토프 및 변형된 산화환원효소 모티프 서열은 펩티드에서 서로 바로 인접해 있거나 임의로 하나 이상의 아미노산(소위 링커 서열)에 의해 분리되어 있을 수 있다. 선택적으로, 펩티드는 엔도솜 표적화 서열 및/또는 추가적인 "플랭킹(flanking)" 서열을 추가로 포함한다.
비면역원성 RNA는 면역 반응의 유도 잠재력을 갖는 항원 (자가 또는 비자가)의 T-세포 에피토프 및 변형된 산화환원효소 모티프를 포함하는 펩티드를 인코딩한다. 펩티드 내 모티프 서열의 환원 활성은 예컨대 인슐린 용해도 분석에서와 같이 설프하이드릴기를 환원시키는 능력에 대해 분석될 수 있으며, 여기서, 인슐린의 용해도는 환원시에 또는 인슐린과 같은 형광표지된 기질로 변경된다. 이러한 분석의 일례는 형광성 펩티드를 사용하며, 문헌 [Tomazzolli et al. (2006) Anal. Biochem. 350, 105-112]에 기술되어 있다. FITC 표지된 두 개의 펩티드는 디설파이드 브릿지를 통해 서로 공유결합하는 경우 자체 소광된다. 본 발명에 따른 펩티드에 의한 환원시, 환원된 개별 펩티드는 다시 형광성으로 된다.
변형된 산화환원효소 모티프는 T 세포 에피토프의 아미노 말단 측 또는 T 세포 에피토프의 카복시 말단에 위치할 수 있다.
환원 활성을 갖는 펩티드 단편은 글루타레독신 (glutaredoxin), 뉴클레오레독신 (nucleoredoxin), 티오레독신 (thioredoxin) 및 다른 티올/디설파이드 산화환원 효소를 비롯한 작은 디설파이드 환원 효소인 티오환원효소에서 발견된다 (Holmgren (2000) Antioxid. Redox Signal. 2, 811-820; Jacquot et al. (2002) Biochem. Pharm. 64, 1065-1069). 이들은 다기능성이며 유비쿼터스적이고 많은 원핵생물 및 진핵생물에서 발견된다. 이는 예를 들어 [Fomenko et al. ((2003) Biochemistry 42, 11214-11225; Fomenko et al. (2002) Prot. Science 11, 2285-2296] - 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타냄 - 및 위치 1 및/또는 4에 시스테인을 포함하는 WO2008/017517로부터 잘 알려진 보존된 활성 도메인 공통 서열 내의 산화환원 활성 시스테인을 통해 단백질(예: 효소)의 디설파이드 결합에 대한 환원 활성을 발휘하는 것으로 알려져 있다. 따라서 모티프는 CXX[CST] (서열 번호 111) 또는 [CST]XXC (서열 번호 110)이다. 이러한 도메인은 또한 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI) 및 포스포이노시티드-특이적 포스포리파제 C와 같은 더 큰 단백질에서도 발견된다. 본 발명은 더 많은 효능과 활성을 찾기 위해 상기 모티프를 재설계하였다.
본원에 개시된 산화환원효소 모티프에 존재하는 아미노산 잔기에 비추어 사용되는 경우, 용어 "시스테인", "C", "세린", "S" 및 "트레오닌", "T"는 각각 자연 발생 시스테인, 세린 또는 트레오닌 아미노산을 지칭한다. 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 상기 용어는 모티프의 아미노산 잔기의 N-말단 아미드 또는 모티프의 아미노산 잔기의 C-말단 카복시 그룹에 아세틸, 메틸, 에틸 또는 프로피오닐 그룹을 보유하도록 변형된 것과 같은 화학적으로 변형된 시스테인, 세린 및 트레오닌은 제외한다.
본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드에서, 산화환원효소 모티프는 에피토프가 MHC 홈에 맞추어질 때 산화환원효소 모티프가 MHC 결합 홈 외부에 남아 있도록 위치한다. 산화환원효소 모티프는 펩티드 내의 에피토프 서열에 바로 인접하여(즉, 모티프와 에피토프 사이에 0개의 아미노산으로 구성된 링커 서열) 위치하거나, 5개 이하의 아미노산 서열을 포함하는 링커에 의해 T 세포 에피토프로부터 분리된다. 보다 구체적으로, 링커는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태는 에피토프 서열과 변형된 산화환원효소 모티프 서열 사이에 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 링커를 갖는 펩티드이다. 펩티드 링커와 별도로, 다른 유기 화합물이 펩티드 부분을 서로 연결하기 위한 링커로 사용될 수 있다(예: T 세포 에피토프 서열에 대한 변형된 산화환원효소 모티프 서열).
본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 T 세포 에피토프 및 산화환원효소 모티프를 포함하는 서열의 N- 또는 C-말단에 추가적인 짧은 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 서열은 일반적으로 본원에서 '플랭킹 서열'로 지칭된다. 플랭킹 서열은 에피토프와 엔도솜 표적화 서열 사이 및/또는 변형된 산화환원효소 모티프와 엔도솜 표적화 서열 사이에 위치할 수 있다. 엔도솜 표적화 서열을 포함하지 않는 특정 펩티드에서, 짧은 아미노산 서열은 펩티드 내 변형된 산화환원효소 모티프 및/또는 에피토프 서열의 N- 및/또는 C-말단에 존재할 수 있다. 보다 구체적으로 플랭킹 서열은 1 내지 7개 아미노산의 서열, 가장 특히 2개 아미노산의 서열이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 비면역원성 RNA는 하나의 T 세포 에피토프 서열 및 단일 산화환원효소 모티프 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩한다. 대안적으로, 산화환원효소 모티프는 T 세포 에피토프 서열의 N- 및 C-말단 모두에 제공될 수 있다.
본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드에 대해 예상되는 다른 변형에는 T 세포 에피토프 서열의 반복을 함유하는 펩티드가 포함되며, 여기서 각 에피토프 서열은 변형된 산화환원효소 모티프의 앞 및/또는 뒤에 있다(예: "산화환원효소 모티프-에피토프"의 반복 또는 "산화환원효소 모티프-에피토프-산화환원효소 모티프"의 반복). 여기서 산화환원효소 모티프는 모두 동일한 서열을 가질 수 있지만 이것이 필수는 아니다.
전형적으로, 본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 단 하나의 T 세포 에피토프를 포함한다. 아래에 기술된 바와 같이, 단백질 서열 중의 T 세포 에피토프는 기능 분석 및/또는 실리카 예측 분석 중 하나 이상에 의해 식별될 수 있다. T 세포 에피토프 서열 중의 아미노산은 MHC 단백질의 결합 홈 내 위치에 따라 번호가 매겨지거나 CD1d 분자에 결합된다. 펩티드 내에 존재하는 MHC 클래스 II T 세포 에피토프는 전형적으로 7 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 9 내지 30개 아미노산, 예를 들어 9 내지 25개 아미노산, 더욱 특히 9 내지 16개 아미노산으로 구성되나, 가장 특히는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 아미노산으로 구성된다. 펩티드 내에 존재하는 NKT 세포 에피토프는 전형적으로 7 내지 30개의 아미노산, 예컨대 7 내지 25개의 아미노산, 더욱 특히 7 내지 16개의 아미노산으로 구성되지만 가장 특히는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 아미노산으로 구성된다.
보다 특정한 실시양태에서, T 세포 에피토프는 9개, 10개 또는 11개 아미노산의 서열로 구성된다. 추가의 특정 구체예에서, T-세포 에피토프는 MHC-클래스 II 분자에 의해 T 세포에 제시되는 에피토프 [MHC 클래스 II 제한 T 세포 에피토프]이다. 전형적으로, T 세포 에피토프 서열은 MHC II 단백질의 틈새에 맞는 옥타펩티드 또는 보다 구체적으로 노나펩티드 서열을 지칭한다.
보다 특정한 실시양태에서, T 세포 에피토프는 7개, 8개 또는 9개 아미노산의 서열로 구성된다. 추가의 특정 실시양태에서, T 세포 에피토프는 CD1d 분자에 의해 제시되는 에피토프[NKT 세포 에피토프]이다. 전형적으로, NKT 세포 에피토프 서열은 CD1d 단백질에 결합하고 이에 의해 제시되는 7개 아미노산 펩티드 서열을 지칭한다.
본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드의 T 세포 에피토프는 단백질의 천연 에피토프 서열에 상응할 수 있거나, 그의 변형된 버전일 수 있으되, 단 변형된 T 세포 에피토프는 천연 T 세포 에피토프 서열과 유사하게 MHC 틈새 내에서 결합하는 능력을 보유하거나 CD1d 단백질에 결합하는 능력을 유지해야 한다. 변형된 T 세포 에피토프는 MHC 단백질 또는 CD1d 수용체에 대해 천연 에피토프와 동일한 결합 친화성을 가질 수 있지만 낮은 친화성을 가질 수도 있다. 특히, 변형된 펩티드의 결합 친화력은 원래 펩티드에 비해 10배 미만, 더욱 특히 5배 미만이다. 본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 단백질 복합체에 안정화 효과를 갖는다. 따라서, 펩티드-MHC 또는 CD1d 복합체의 안정화 효과는 MHC 또는 CD1d 분자에 대한 변형된 에피토프의 낮아진 친화성을 보상한다.
본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드에서, 펩티드 내 환원성 화합물 및 T 세포 에피토프를 포함하는 서열은 MHC 클래스 II 결정인자 내에서 처리 및 제시를 위해 후기 엔도솜으로의 펩티드의 흡수를 용이하게 하는 아미노산 서열 (또는 다른 유기 화합물)에 추가로 연결될 수 있다. 후기 엔도솜 표적화는 단백질의 세포질 꼬리에 존재하는 신호에 의해 매개되며, 잘 규명된 펩티드에 상응한다. 후기 엔도솜 표적화 서열은 MHC-클래스 II 분자에 의한 항원 유래 T 세포 에피토프의 처리 및 효율적인 제시를 허용한다. 이러한 엔도솜 표적화 서열은 예를 들어, gp75 단백질 (Vijayasaradhi et al. (1995) J. Cell. Biol. 130, 807-820), 인간 CD3 γ 단백질, HLA-BM 11 (Copier et al. (1996) J. lmmunol. 157, 1017-1027), DEC205 수용체의 세포질 꼬리 (Mahnke et al. (2000) J. Cell Biol. 151, 673-683) 내에 함유된다. 엔도솜으로의 선별 신호로서 기능하는 펩티드의 다른 예는 [Bonifacio and Traub (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 395-447]의 리뷰편에 기재되었다. 대안적으로, 서열은 항원에 대한 T 세포 반응의 압도 없이 후기 엔도솜에서의 흡수를 용이하게 하는, 단백질로부터의 준우세 또는 열세 T 세포 에피토프의 것일 수 있다. 후기 엔도솜 표적화 서열은 효율적인 흡수 및 처리을 위해 항원 유래 펩티드의 아미노 말단부 또는 카복시 말단부에 위치할 수 있으며, 또한 10개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩티드 서열과 같이 플랭킹 서열을 통해 커플링될 수 있다. 표적화 목적을 위한 열세 T 세포 에피토프를 사용하는 경우, 후자는 전형적으로 항원 유래 펩티드의 아미노 말단부에 위치한다.
대안적으로, 본 발명은 CD1d 분자에 결합하는 능력을 부여하는 소수성 잔기를 함유하는 본원에 정의된 바와 같은 NKT 에피토프를 포함하는 펩티드 인코딩 비면역원성 RNA의 생산에 관한 것이다. 투여 시, 이러한 RNA는 (미성숙) 수지상 세포를 표적으로 삼고, 여기서 이는 후기 엔도솜 지향 펩티드로 번역되어 CD1d에 로딩되고 APC의 표면에 제시된다.
따라서, 본 발명은 항원성 단백질의 펩티드 인코딩 비면역원성 RNA 및 특이적 면역 반응을 유도하는데 그의 용도를 구상한다. 이들 펩티드는 그 서열 내에, 최대 10개, 바람직하게는 7개 이하의 아미노산에 의해 분리된 T 세포 에피토프 및 환원성 화합물을 포함하는 단백질 단편에 상응할 수 있다. 대안적으로, 대부분의 항원성 단백질에 대해, 본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 항원성 단백질의 T 세포 에피토프 (그에 직접 인접하거나 또는 10개 이하, 보다 특히 최대 7개의 아미노산 링커를 가지는)에 N-말단 또는 C-말단적으로 커플링된 환원성 화합물, 보다 구체적으로는 본원에 기재된 바와 같은 환원성 변형 산화환원효소 모티프를 포함한다. 또한, 자연 발생 서열과 비교하여 단백질 및/또는 변형된 산화환원효소 모티프의 T 세포 에피토프 서열이 변형될 수 있고/있거나, 하나 이상의 플랭킹 서열 및/또는 표적화 서열이 도입 (또는 변형)될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특징이 관심 항원성 단백질의 서열 내에서 발견될 수 있는지 여부에 따라, 비면역원성 RNA는 '인공' 또는 '자연 발생' 서열을 포함할 수 있는 펩티드를 인코딩한다.
본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 길이가 실질적으로 다양할 수 있다. 펩티드의 길이는 9개, 10개 또는 11개 아미노산으로 다양할 수 있으며, 즉, 각각 7개, 8개 또는 9개 아미노산, 그에 인접하여 2개 아미노산의 최소 산화환원효소 모티프(CC), 최대 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 최대 50개의 아미노산까지의 NKT 세포 또는 MHC 클래스 II T 세포 에피토프로 구성된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 완전한 펩티드는 9개 아미노산 내지 20, 25, 30, 40, 50, 75 또는 100개 아미노산으로 구성된다. 예를 들어, 본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 40개 아미노산의 엔도솜 표적화 서열, 약 2개 아미노산의 플랭킹 서열, 본원에 기술된 바와 같은 2 내지 약 11개 아미노산의 산화환원효소 모티프, 4 내지 7개 아미노산의 링커 및 최소 7, 8 또는 9개 아미노산의 T 세포 에피토프 펩티드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 환원 화합물이 본원에 기술된 바와 같은 변형된 산화환원효소 모티프인 경우, 엔도솜 표적화 서열 없이 선택적으로 링에 의해 연결된 에피토프 및 변형된 산화환원효소 모티프를 포함하는 (인공 또는 천연) 서열커(본원에서 '에피토프-변형된 산화환원효소 모티프' 서열로 지칭됨)의 길이가 중요하다. '에피토프 변형된 산화환원효소 모티프'는 더욱 특히 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개 아미노산의 길이를 갖는다. 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 내지 19개 아미노산의 이러한 펩티드는 선택적으로 크기가 덜 중요한 엔도솜 표적화 신호에 커플링될 수 있다. 후기 엔도솜 표적화는 단백질의 세포질 꼬리에 존재하는 신호에 의해 매개되며 딜류신 기반 [DE]XXXL[LI] (서열 번호 110) 또는 DXXLL (서열 번호 111) 모티프 (예를 들어 DXXXLL (서열 번호 112)), 티로신 기반 YXX0 (서열 번호 113) 또는 소위 산성 클러스터 모티프와 같은 이미 식별된 펩티드 모티프에 상응한다. 기호 0은 Phe, Tyr 및 Trp와 같이 부피가 큰 소수성 측쇄를 가진 아미노산 잔기를 나타낸다. 후기 엔도솜 표적화 서열은 MHC 클래스 II 또는 CD1d 분자에 의한 항원 유래 T 세포 에피토프의 처리 및 효율적인 제시를 허용한다.
위에서 설명한 바와 같이, 특정 실시양태에서, 본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 T 세포 에피토프 서열에 연결된 본원에 기술된 바와 같은 환원 변형된 산화환원효소 모티프를 포함한다.
추가의 특정 실시양태에서, 본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 천연 서열 내에 산화환원 특성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지 않는 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드이다.
그러나, 대안적인 실시양태에서, T 세포 에피토프는 MHC 틈 또는 CD1d 분자에 대한 에피토프의 결합을 보장하는 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항원성 단백질의 관심 에피토프가 그의 에피토프 서열 내에 본원에 기술된 바와 같은 변형된 산화환원효소 모티프를 포함하는 경우, 본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 본원에 기술된 산화환원효소 모티프의 서열 및/또는 또 다른 환원 서열을 포함하여 에피토프 서열에 N- 또는 C-말단적으로 결합되어 (틈새 내에 묻혀 있는 에피토프 내에 존재하는 변형된 산화환원효소 모티프와 반대로) 부착된 산화환원효소 모티프가 환원 활성을 보장할 수 있도록 한다.
따라서, T 세포 에피토프와 모티프는 서로 바로 인접하거나 분리되어 중첩되지 않는다. "바로 인접한" 또는 "분리된"의 개념을 평가하기 위해, MHC 틈 또는 CD1d 분자에 맞는 7, 8 또는 9개의 아미노산 서열을 결정하고 변형된 산화환원효소 모티프를 갖는 이 옥타펩티드 또는 노나펩티드 사이의 거리를 결정한다.
일반적으로, 본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 천연이 아니라(따라서 단백질의 단편이 없음), T 세포 에피토프 외에 본원에 기술된 바와 같은 변형된 산화환원효소 모티프를 함유하여 변형된 산화환원효소 모티프는 최대 7개, 가장 특히 최대 4개 또는 최대 2개의 아미노산으로 구성된 링커에 의해 T 세포 에피토프로부터 바로 분리된 인공 펩티드이다.
산화환원효소 모티프 및 MHC 클래스 II T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드(또는 그러한 RNA를 포함하는 조성물)를 포유동물에게 투여(즉, 주사)하면, 펩티드는 항원 유래 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포의 활성화를 유도하고 표면 수용체의 감소를 통해 T 세포에 추가 신호를 제공한다는 것이 이전에 밝혀졌다. 이러한 초최적 활성화로 인해 T 세포는 T 세포 에피토프를 제시하는 세포에 대한 세포용해 특성과 방관자 T 세포에 대한 억제 특성을 획득하게 된다. 본 발명은 펩티드 자체보다는 그러한 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA를 투여함으로써 이 원리를 더욱 발전시켰다.
추가로, 산화환원효소 모티프 및 NKT-세포 에피토프를 포함하는 펩티드(또는 그러한 펩티드를 포함하는 조성물)를 포유동물에게 투여(즉, 주사)하면, 펩티드는 항원 유래 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포의 활성화를 유도하고 CD1d 표면 수용체에 결합하여 T 세포에 추가 신호를 제공하는 것으로 나타났다. 이러한 활성화로 인해 NKT 세포는 T 세포 에피토프를 제시하는 세포에 대한 세포용해 특성을 획득하게 된다. 본 발명은 펩티드 자체보다는 그러한 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA를 투여함으로써 이 원리를 더욱 발전시켰다.
이러한 방식으로, 본 발명에 기술된 바와 같은 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA 또는 RNA를 포함하는 조성물은 인간을 포함한 포유동물의 직접 면역화에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 의약품으로 사용하기 위한 본 발명의 그러한 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA, 또는 그러한 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA 또는 그러한 RNA를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 세포용해 특성이 부여된 항원 특이적 T 세포가 본원에 기술된 바와 같이 작은 펩티드를 인코딩하는 RNA로 면역화함으로써 유도될 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 (i) 항원으로부터의 T 세포 에피토프를 인코딩하는 서열 및 (ii) 산화환원 특성을 갖는 공통 서열을 함유하고, 선택적으로 효율적인 MHC 클래스 II 제시 또는 CD1d 수용체 결합을 위해 후기 엔도솜으로의 펩티드 흡수를 촉진하는 서열을 추가로 포함하는 펩티드가 각각 세포용해성 CD4+ T 세포 또는 NKT 세포를 유도한다는 것이 발견되었다. 본 발명은 펩티드 자체보다는 그러한 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA를 투여함으로써 이 원리를 더욱 발전시켰다.
본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드의 특성은 (자가)면역 반응의 치료 및 예방에 특히 중요하다.
본원에 기술된 펩티드 인코딩 비면역원성 RNA 또는 이러한 RNA를 포함하는 조성물은 약제로 사용되며, 더욱 특히 포유동물, 더욱 특히 인간의 면역 장애를 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 사용된다.
본 발명은 본원에 기술된 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA를 투여하는 것을 포함하는, 면역 장애의 치료 또는 예방이 필요한 포유동물에서 면역 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 기술한다. 이 방법은 면역 장애를 앓고 있거나 걸릴 위험이 있는 상기 포유동물에게 치료적 유효량의 본 발명의 펩티드 인코딩 비면역원성 RNA, 이의 동족체 또는 유도체를 투여하여 면역 장애의 증상을 감소시키는 단계를 포함한다. 인간과 애완동물 및 농장 동물과 같은 동물 모두에 대한 치료가 고려된다. 일 실시양태에서, 치료될 포유동물은 인간이다. 상기 언급된 면역 장애는 특정 실시양태에서 알레르기 질환 및 자가면역 질환으로부터 선택된다.
본원에 기술된 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA 또는 본원에 정의된 이러한 RNA를 포함하는 약학적 조성물은 바람직하게는 피하 또는 근육내 투여를 통해 투여된다.
일 실시양태에서, RNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 팔꿈치와 어깨 사이의 중간, 상박의 측면 부분 영역에 피하(SC)로 주사될 수 있다. 2회 이상의 개별 주사가 필요한 경우에는 양팔에 동시에 투여될 수 있다.
일 실시양태에서, RNA 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 상박의 측면 부분 영역, 바람직하게는 팔의 삼각근에 근육내(IM) 주사될 수 있다. 2회 이상의 개별 주사가 필요한 경우에는 양팔에 동시에 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA 또는 이러한 RNA를 포함하는 약학적 조성물은 치료적 유효량으로 투여된다.
본 발명의 비면역원성 RNA에 의해 인코딩되는 펩티드의 산화환원효소 모티프는 다음 일반식으로 정의된다:
본원에 기술된 측면에 정의된 바와 같은 Zm-[CST]-Xn-C- 또는 Zm-C-Xn-[CST]-,
여기서 상기 산화환원효소 모티프에서의 하이픈(-)은 링커나 에피토프의 N 말단, 또는, 링커나 T 세포 에피토프의 C-말단에 대한 산화환원효소 모티프의 부착 지점을 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 상기 산화환원효소 모티프는 CC 또는 CXC이고, 여기서 X는 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산 또는 비천연 염기성 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, CXC 모티프의 X는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, CXC 모티프의 X는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산 또는 다음을 예로 들 수 있으나 이에 제한되지 않는 비천연 염기성 아미노산이다:
· Fmoc-β-Lys(Boc)-OH (CAS Number 219967-68-7), Fmoc-Orn(Boc)-OH (L-오르니틴 또는 오르니틴 (CAS Number 109425-55-0)이라고도 함), Fmoc-β-Homolys(Boc)-OH (CAS Number 203854-47-1), Fmoc-Dap(Boc)-OH (CAS Number 162558-25-0) 또는 Fmoc-Lys(Boc)OH(DiMe)-OH (CAS Number 441020-33-3)와 같은 라이신 변이체;
· Fmoc-L-3Pal-OH (CAS Number 175453-07-3), Fmoc-βHomoPhe(CN)-OH (CAS Number 270065-87-7), Fmoc-L-β-HomoAla(4-피리딜)-OH (CAS Number 270065-69-5) 또는 Fmoc-L-Phe(4-NHBoc)-OH (CAS Number 174132-31-1)와 같은 티로신/페닐알라닌 변이체;
· Fmoc-Pro(4-NHBoc)-OH (CAS Number 221352-74-5) 또는 Fmoc-Hyp(tBu)-OH (CAS Number 122996-47-8)와 같은 프롤린 변이체;
· Fmoc-β-Homoarg(Pmc)-OH (CAS Number 700377-76-0)와 같은 아르기닌 변이체.
CXC 모티프의 구체적인 예는 CHC, CKC, CRC, CGC, CAC, CVC, CLC, CIC, CMC, CFC, CWC, CPC, CSC, CTC, CYC, CNC, CQC, CDC, 및 CEC이다. 이들 예시적인 CXC 모티프 중 어느 하나 앞에는 하나 이상의 아미노산(Zm)이 올 수 있으며, 여기서 m은 0과 3 사이의 정수, 바람직하게는 0 또는 1이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 염기성 아미노산, 예컨대 H, K 또는 R, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다. 이러한 모티프의 바람직한 예는 다음과 같다: KCHC, KCKC, KCRC, KCGC, KCAC, KCVC, KCLC, KCIC, KCMC, KCFC, KCWC, KCPC, KCSC, KCTC, KCYC, KCNC, KCQC, KCDC, KCEC, HCHC, HCKC, HCRC, HCGC, HCAC, HCVC, HCLC, HCIC, HCMC, HCFC, HCWC, HCPC, HCSC, HCTC, HCYC, HCNC, HCQC, HCDC, HCEC, RCHC, RCKC, RCRC, RCGC, RCAC, RCVC, RCLC, RCIC, RCMC, RCFC, RCWC, RCPC, RCSC, RCTC, RCYC, RCNC, RCQC, RCDC, 및 RCEC (서열 번호 114 내지 170).
바람직한 실시양태에서, 상기 산화환원효소 모티프는 CX2C(서열 번호 171), 즉 CXXC, 전형적으로 CX1X2C이고, 여기서 X1 및 X2는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산일 수 있다. 바람직하게는 상기 모티프에서 X1 및 X2는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 상기 모티프에서 X1 및 X2는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다.
상기 ZmCX1X2C 모티프에서 X1 X2 아미노산 쌍의 구체적인 예는 PY, HY, KY, RY, PH, PK, PR, HG, KG, RG, HH, HK, HR, GP, HP, KP, RP, GH, GK, GR, GH, KH, 및 RH이다.
이들 예시적인 CX1X2C 모티프 어느 하나 앞에는 하나 이상의 아미노산(Zm)이 올 수 있으며, 여기서 m은 0과 3 사이의 정수, 바람직하게는 0 또는 1이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다.
ZmCX1X2C 모티프의 구체적인 예는 HCX1X2C, KHCX1X2C, KCX1X2C, RCX1X2C, HCX1X2C, KCX1X2C, RCX1X2C, KKCX1X2C, KRCX1X2C, KHCX1X2C, KKCX1X2C, 및 KRCX1X2C (서열 번호 172 내지 183에 상응)이다.
ZmCXXC 모티프의 보다 구체적인 예는 CPYC (서열 번호 98), HCPYC, KHCPYC, KCPYC, RCPYC, HCGHC, KCGHC, RCGHC, KKCPYC, KRCPYC, KHCGHC, KKCGHC, 및 KRCGHC (서열 번호 24 내지 35에 상응)이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 산화환원효소 모티프는 CX3C(서열 번호 184), 즉 CXXXC, 전형적으로 CX1X2X3C이고, 여기서 X1, X2, 및 X3는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산일 수 있다. 바람직하게는 상기 모티프에서 X1, X2, 및 X3는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 상기 모티프에서 X1, X2, 및 X3의 적어도 하나는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다.
CXXXC 모티프의 구체적인 예는 CXPYC, CPXYC 및 CPYXC이며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 보다 바람직하게는 다음과 같다:
CXPYC, 예컨대: CKPYC, CRPYC, CHPYC, CGPYC, CAPYC, CVPYC, CLPYC, CIPYC, CMPYC, CFPYC, CWPYC, CPPYC, CSPYC, CTPYC, CCPYC, CYPYC, CNPYC, CQPYC, CDPYC, 및 CEPYC (서열 번호 185 내지 205); 또는
CPXYC, 예컨대: CPKYC, CPRYC, CPHYC, CPGYC, CPAYC, CPVYC, CPLYC, CPIYC, CPMYC, CPFYC, CPWYC, CPPYC, CPSYC, CPTYC, CPCYC, CPYYC, CPNYC, CPQYC, CPDYC, CPEYC, 및 CPLYC (서열 번호 206 내지 227); 또는
CPYXC, 예컨대: CPYKC, CPYRC, CPYHC, CPYGC, CPYAC, CPYVC, CPYLC, CPYIC, CPYMC, CPYFC, CPYWC, CPYPC, CPYSC, CPYTC, CPYCC, CPYYC, CPYNC, CPYQC, CPYDC, CPYEC, 및 CPYLC (서열 번호 228 내지 249).
CXXXC 모티프의 추가 구체적인 예는 CXHGC, CHXGC 및 CHGXC이며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 보다 바람직하게는 다음과 같다:
CXHGC, 예컨대: CKHGC, CRHGC, CHHGC, CGHGC, CAHGC, CVHGC, CLHGC, CIHGC, CMHGC, CFHGC, CWHGC, CPHGC, CSHGC, CTHGC, CCHGC, CYHGC, CNHGC, CQHGC, CDHGC, CEHGC, 및 CKHGC (서열 번호 250 내지 271); 또는
CGXHC, 예컨대: CGKHC, CGRHC, CGHHC, CGGHC, CGAHC, CGVHC, CGLHC, CGIHC, CGMHC, CGFHC, CGWHC, CGPHC, CGSHC, CGTHC, CGCHC, CGYHC, CGNHC, CGQHC, CGDHC, CGEHC, 및 CGLHC (서열 번호 272 내지 293); 또는
CHGXC, 예컨대: CHGKC, CHGRC, CHGHC, CHGGC, CHGAC, CHGVC, CHGLC, CHGIC, CHGMC, CHGFC, CHGWC, CHGPC, CHGSC, CHGTC, CHGCC, CHGYC, CHGNC, CHGQC, CHGDC, CHGEC, 및 CHGLC (서열 번호 294 내지 315).
CXXXC 모티프의 추가 구체적인 예는 CXGPC, CGXPC 및 CGPXC이며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 보다 바람직하게는 다음과 같다:
CXGPC, 예컨대: CKGPC, CRGPC, CHGPC, CGGPC, CAGPC, CVGPC, CLGPC, CIGPC, CMGPC, CFGPC, CWGPC, CPGPC, CSGPC, CTGPC, CCGPC, CYGPC, CNGPC, CQGPC, CDGPC, CEGPC, 및 CKGPC (서열 번호 316 내지 337); 또는
CGXPC, 예컨대: CGKPC, CGRPC, CGHPC, CGGPC, CGAPC, CGVPC, CGLPC, CGIPC, CGMPC, CGFPC, CGWPC, CGPPC, CGSPC, CGTPC, CGCPC, CGYPC, CGNPC, CGQPC, CGDPC, CGEPC, 및 CGLPC (서열 번호 338 내지 359); 또는
CGPXC, 예컨대: CGPKC, CGPRC, CGPHC, CGPGC, CGPAC, CGPVC, CGPLC, CGPIC, CGPMC, CGPFC, CGPWC, CGPPC, CGPSC, CGPTC, CGPCC, CGPYC, CGPNC, CGPQC, CGPDC, CGPEC, 및 CGPLC (서열 번호 360 내지 381).
CXXXC 모티프의 추가 구체적인 예는 CXGHC, CGXHC 및 CGHXC이며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 보다 바람직하게는 다음과 같다:
CXGHC, 예컨대: CKGHC, CRGHC, CHGHC, CGGHC, CAGHC, CVGHC, CLGHC, CIGHC, CMGHC, CFGHC, CWGHC, CPGHC, CSGHC, CTGHC, CCGHC, CYGHC, CNGHC, CQGHC, CDGHC, CEGHC, 및 CKGHC (서열 번호 382 내지 403); 또는
CGXFC, 예컨대: CGKFC, CGRFC, CGHFC, CGGFC, CGAFC, CGVFC, CGLFC, CGIFC, CGMFC, CGFFC, CGWFC, CGPFC, CGSFC, CGTFC, CGCFC, CGYFC, CGNFC, CGQFC, CGDFC, CGEFC, 및 CGLFC (서열 번호 404 내지 425); 또는
CGHXC, 예컨대: CGHKC, CGHRC, CGHHC, CGHGC, CGHAC, CGHVC, CGHLC, CGHIC, CGHMC, CGHFC, CGHWC, CGHPC, CGHSC, CGHTC, CGHCC, CGHYC, CGHNC, CGHQC, CGHDC, CGHEC, 및 CGHLC (서열 번호 426 내지 447).
CXXXC 모티프의 추가 구체적인 예는 CXGFC, CGXFC 및 CGFXC이며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 보다 바람직하게는 다음과 같다:
CXGFC, 예컨대: CKGFC, CRGFC, CHGFC, CGGFC, CAGFC, CVGFC, CLGFC, CIGFC, CMGFC, CFGFC, CWGFC, CPGFC, CSGFC, CTGFC, CCGFC, CYGFC, CNGFC, CQGFC, CDGFC, CEGFC, 및 CKGFC (서열 번호 448 내지 469); 또는
CGXFC, 예컨대: CGKFC, CGRFC, CGHFC, CGGFC, CGAFC, CGVFC, CGLFC, CGIFC, CGMFC, CGFFC, CGWFC, CGPFC, CGSFC, CGTFC, CGCFC, CGYFC, CGNFC, CGQFC, CGDFC, CGEFC, 및 CGLFC (서열 번호 470 내지 491); 또는
CGFXC, 예컨대: CGFKC, CGFRC, CGFHC, CGFGC, CGFAC, CGFVC, CGFLC, CGFIC, CGFMC, CGFFC, CGFWC, CGFPC, CGFSC, CGFTC, CGFCC, CGFYC, CGFNC, CGFQC, CGFDC, CGFEC, 및 CGFLC (서열 번호 492 내지 513).
CXXXC 모티프의 추가 구체적인 예는 CXRLC, CRXLC 및 CRLXC이며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 보다 바람직하게는 다음과 같다:
CXRLC, 예컨대: CKRLC, CRRLC, CHRLC, CGRLC, CARLC, CVRLC, CLRLC, CIRLC, CMRLC, CFRLC, CWRLC, CPRLC, CSRLC, CTRLC, CCRLC, CYRLC, CNRLC, CQRLC, CDRLC, CERLC, 및 CKRLC (서열 번호 514 내지 535); 또는
CRXLC, 예컨대: CRKLC, CRRLC, CRHLC, CRGLC, CRALC, CRVLC, CRLLC, CRILC, CRMLC, CRFLC, CRWLC, CRPLC, CRSLC, CRTLC, CRCLC, CRYLC, CRNLC, CRQLC, CRDLC, CRELC, 및 CRLLC (서열 번호 536 내지 557); 또는
CRLXC, 예컨대: CRLKC, CRLRC, CRLHC, CRLGC, CRLAC, CRLVC, CRLLC, CRLIC, CRLMC, CRLFC, CRLWC, CRLPC, CRLSC, CRLTC, CRLCC, CRLYC, CRLNC, CRLQC, CRLDC, CRLEC, 및 CRLLC (서열 번호 558 내지 579).
CXXXC 모티프의 추가 구체적인 예는 CXHPC, CHXPC 및 CHPXC이며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 보다 바람직하게는 다음과 같다:
CXHPC, 예컨대: CKHPC, CRHPC, CHHPC, CGHPC, CAHPC, CVHPC, CLHPC, CIHPC, CMHPC, CFHPC, CWHPC, CPHPC, CSHPC, CTHPC, CCHPC, CYHPC, CNHPC, CQHPC, CDHPC, CEHPC, 및 CKHPC (서열 번호 580 내지 601); 또는
CHXPC, 예컨대: CHKPC, CHRPC, CHHPC, CHGPC, CHAPC, CHVPC, CHLPC, CHIPC, CHMPC, CHFPC, CHWPC, CHPPC, CHSPC, CHTPC, CHCPC, CHYPC, CHNPC, CHQPC, CHDPC, CHEPC, 및 CHLPC (서열 번호 602 내지 623); 또는
CHPXC, 예컨대: CHPKC, CHPRC, CHPHC, CHPGC, CHPAC, CHPVC, CHPLC, CHPIC, CHPMC, CHPFC, CHPWC, CHPPC, CHPSC, CHPTC, CHPCC, CHPYC, CHPNC, CHPQC, CHPDC, CHPEC, 및 CHPLC (서열 번호 624 내지 645).
이들 예시적인 CXXXC 모티프 중 어느 하나 앞에는 하나 이상의 아미노산(Zm)이 올 수 있으며, 여기서 m은 0과 3 사이의 정수, 바람직하게는 0 또는 1이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 산화환원효소 모티프는 CX4C(서열 번호 646), 즉 CXXXXC, 전형적으로 CX1X2X3X4C이고, 여기서 X1, X2, X3 및 X4는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다. 바람직하게는 상기 모티프에서 X1, X2, X3 및 X4는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 상기 모티프에서 X1, X2, X3 및 X4 중 적어도 하나는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다.
CXXXXC 모티프의 구체적인 예는 다음과 같다: CLAVLC, CTVQAC 또는 CGAVHC 및 이들의 변이체 예컨대: CX1AVLC, CLX2VLC, CLAX3LC, 또는 CLAVX4C; CX1VQAC, CTX2QAC, CTVX3AC, 또는 CTVQX4C; CX1AVHC, CGX2VHC, CGAX3HC, 또는 CGAVX4C (서열 번호 647 내지 660); 여기서 X1, X2, X3 및 X4는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산일 수 있다.
이들 예시적인 CXXXXC 모티프 중 어느 하나 앞에는 하나 이상의 아미노산(Zm)이 올 수 있으며, 여기서 m은 0과 3 사이의 정수, 바람직하게는 0 또는 1이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 산화환원효소 모티프는 CX5C(서열 번호 661), 즉 CXXXXXXC, 전형적으로 CX1X2X3X4X5C이고, 여기서 CX1X2X3X4X5C는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산일 수 있다. 바람직하게는 상기 모티프에서 X1, X2, X3, X4 및 X5는 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 상기 모티프에서 X1, X2, X3, X4 및 X5 중 적어도 하나는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다.
CXXXXXC 모티프의 구체적인 예는 다음과 같다: CPAFPLC 또는 CDQGGEC 및 이들의 변이체 예컨대: CX1AFPLC, CPX2FPLC, CPAX3PLC, CPAFX4LC, 또는 CPAFPX5C; CX1QGGEC, CDX2GGEC, CDQX3GEC, CDQGX4EC, 또는 CDQGGX5C (서열 번호 662 내지 673), 여기서 X1, X2, X3, X4, 및 X5는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산일 수 있다. 이들 예시적인 CXXXXXXC 모티프 중 어느 하나 앞에는 하나 이상의 아미노산(Zm)이 올 수 있으며, 여기서 m은 0과 3 사이의 정수, 바람직하게는 0 또는 1이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 산화환원효소 모티프는 CX6C (서열 번호 674), 즉 CXXXXXXC, 전형적으로 CX1X2X3X4X5X6C이고, 여기서 X1, X2, X3, X4 X5 및 X6은 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산일 수 있다. 바람직하게는 상기 모티프에서 X1, X2, X3, X4, X5 및 X6은 C, S 또는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 상기 모티프에서 X1, X2, X3, X4, X5 및 X6 중 적어도 하나는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다.
CXXXXXXC 모티프의 구체적인 예는 다음과 같다: CDIADKYC 또는 이의 변이체, 예컨대: CX1IADKYC, CDX2ADKYC, CDIX3DKYC, CDIAX4KYC, CDIADX5YC, 또는 CDIADKX6C (서열 번호 675 내지 681), 여기서 X1, X2, X3, X4, 및 X5는 각각 개별적으로 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 및 H로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산일 수 있다.
이들 예시적인 CXXXXXXC 모티프 중 어느 하나 앞에는 하나 이상의 아미노산(Zm)이 올 수 있으며, 여기서 m은 0과 3 사이의 정수, 바람직하게는 0 또는 1이고, Z는 임의의 아미노산, 바람직하게는 H, K 또는 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 본원에 정의된 바와 같은 비천연 염기성 아미노산이다.
이러한 산화환원효소 모티프의 특히 바람직한 예는 다음과 같다:
C[KHR]C, CX[KHR]XC, CXX[KHR]C, C[KHR]XXC, [KHR]CC, [KHR]CXC, [KHR]XXXC, CC[KHR], CXC[KHR], CXXXC[KHR], [KHR]CC[KHR], [KHR]CXC[KHR], [KHR]CXXXC[KHR], [KHR]C[KHR]C, C[KHR]C[KHR], [KHR]CXX[KHR]C, [KHR]CX[KHR]XC, [KHR]C[KHR]XXC, CXX[KHR]C[KHR], CX[KHR]XC[KHR], C[KHR]XXC[KHR] (서열 번호 682 내지 703) 등.
샘플에서 클래스 II 제한 CD4+T 세포를 검출하기 위한 진단 시험관 내 방법이 추가로 개시된다. 이 방법에서 샘플은 MHC 클래스 II 분자와 본 발명에 따른 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드의 복합체와 접촉된다. CD4+ T 세포는 샘플 내 세포와 복합체의 결합을 측정함으로써 검출되며, 여기서 복합체와 세포의 결합은 샘플 내 CD4+ T 세포의 존재를 나타낸다. 복합체는 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 융합 단백질일 수 있다. 대안적으로, 복합체의 MHC 분자는 사량체이다. 복합체는 가용성 분자로 제공될 수 있거나 담체에 부착될 수 있다.
샘플에서 NKT 세포를 검출하기 위한 시험관 내 진단 방법이 추가로 개시된다. 이 방법에서 샘플은 CD1d 분자와 본 발명에 따른 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드의 복합체와 접촉된다. NKT 세포는 샘플 내 세포와 복합체의 결합을 측정함으로써 검출되며, 여기서 복합체의 결합은 펩티드와 CD1d 분자의 융합 단백질일 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 본원에 기재된 바와 같은 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA의 투여를 포함하며, 여기서 펩티드는 치료할 질환에서 역할을 하는 항원성 단백질의 T 세포 에피토프(예를 들어 위에서 설명한 것과 같은)를 포함한다. 추가의 특정 실시양태에서, 사용된 에피토프는 우세 에피토프이다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 비면역원성 RNA는 나노미립자 제형, 특히 WO188730A1에 개시된 것과 같은 리포플렉스 제형과 같이 담체 또는 전달 비히클에 제형화되어 투여된다. 따라서, 본원에 기술된 비면역원성 RNA 분자는 본원에 기술된 바와 같이 나노입자 또는 나노미립자 제형, 특히 리포플렉스 제형과 같이 담체 또는 전달 비히클에 제형화될 수 있다.
일 실시양태에서, 전신 투여 후 비장 내 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포에 비면역원성 RNA 분자를 전달하는 전달 비히클이 사용될 수 있다. 예를 들어, 입자의 순 전하가 0에 가깝거나 음인 정의된 입자 크기를 갖는 나노미립자 RNA 제형, 예컨대 RNA 및 리포솜으로부터의 전기-중성 또는 음전하 리포플렉스, 예를 들어 DOTMA 및 DOPE 또는 DOTMA 및 콜레스테롤을 포함하는 리포플렉스는 전신 투여 후 비장 DC에 RNA의 실질적인 전달을 일으킨다. 나노입자에서 양전하 대 음전하의 전하비가 1.4:1 이하이고/이거나 나노입자의 제타 전위가 0 이하인 나노미립자 RNA 제형이 특히 바람직하다. 일 실시양태에서, 나노입자의 양전하 대 음전하의 전하비는 1.4:1 내지 1:8, 바람직하게는 1.2:1 내지 1:4, 예를 들어 1:1 내지 1:3, 예컨대 1:1.2 내지 1:2, 1:1.2 내지 1:1.8, 1:1.3 내지 1:1.7, 특히 1:1.4 내지 1:1.6, 예컨대 약 1:1.5이다. 일 실시양태에서, 나노입자의 제타 전위는 -5 이하, -10 이하, -15 이하, -20 이하 또는 -25 이하이다. 다양한 실시양태에서, 나노입자의 제타 전위는 -35 이상, -30 이상 또는 -25 이상이다. 일 실시양태에서, 나노입자는 0 mV 내지 -50 mV, 바람직하게는 0 mV 내지 -40 mV 또는 -10 mV 내지 -30 mV의 제타 전위를 갖는다. 일 실시양태에서, 양전하는 나노입자에 존재하는 적어도 하나의 양이온성 지질에 의해 기여되고, 음전하는 RNA에 의해 기여된다. 일 실시양태에서, 나노입자는 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함한다. 헬퍼 지질은 중성 또는 음이온성 지질일 수 있다.
일 실시양태에서, 나노입자는 10:0 내지 1:9, 바람직하게는 8:2 내지 3:7, 보다 바람직하게는 7:3 내지 5:5의 몰비로 DOTMA 및 DOPE를 포함하는 리포플렉스이고, DOTMA의 양전하 대 RNA의 음전하의 전하비는 1.8:2 내지 0.8:2, 더 바람직하게는 1.6:2 내지 1:2, 보다 더 바람직하게는 1.4:2 내지 1.1:2, 더욱 더 바람직하게는 약 1.2:2이다. 일 실시양태에서, 나노입자는 10:0 내지 1:9, 바람직하게는 8:2 내지 3:7, 보다 바람직하게는 7:3 내지 5:5의 몰비로 DOTMA 및 콜레스테롤을 포함하고 DOTMA의 양전하 대 RNA의 음전하의 전하비가 1.8:2 내지 0.8:2, 더 바람직하게는 1.6:2 내지 1:2, 보다 더 바람직하게는 1.4:2 내지 1.1:2, 더욱 더 바람직하게는 약 1.2:2인 리포플렉스이다.
일 실시양태에서, 나노입자는 10:0 내지 1:9, 바람직하게는 8:2 내지 3:7, 보다 바람직하게는 7:3 내지 5:5의 몰비로 DOTAP 및 DOPE를 포함하고 DOTMA의 양전하 대 RNA의 음전하의 전하비가 1.8:2 내지 0.8:2, 더 바람직하게는 1.6:2 내지 1:2, 보다 더 바람직하게는 1.4:2 내지 1.1:2, 더욱 더 바람직하게는 약 1.2:2인 리포플렉스이다.
일 실시양태에서, 나노입자는 2:1 내지 1:2, 바람직하게는 2:1 내지 1:1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE를 포함하고 DOTMA의 양전하 대 RNA의 음전하의 전하비가 1.4:1 이하인 리포플렉스이다.
일 실시양태에서, 나노입자는 2:1 내지 1:2, 바람직하게는 2:1 내지 1:1의 몰비로 DOTMA 및 콜레스테롤을 포함하고 DOTMA의 양전하 대 RNA의 음전하의 전하비가 1.4:1 이하인 리포플렉스이다.
일 실시양태에서, 나노입자는 2:1 내지 1:2, 바람직하게는 2:1 내지 1:1의 몰비로 DOTAP 및 DOPE를 포함하고 DOTAP의 양전하 대 RNA의 음전하의 전하비가 1.4:1 이하인 리포플렉스이다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 비면역원성 RNA는 F12 또는 F5 리포솜, 바람직하게는 F12 리포솜에 제형화된다. 본원에 사용된 용어 "F12"는 2:1의 몰비로 DOTMA 및 DOPE를 포함하는 리포솜 및 이러한 리포솜을 사용하여 형성된 RNA를 갖는 리포플렉스를 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "F5"는 1:1의 몰비로 DOTMA 및 콜레스테롤을 포함하는 리포솜 및 이러한 리포솜을 사용하여 형성된 RNA를 갖는 리포플렉스를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "나노입자"는 특히 핵산의 전신 투여, 특히 비경구 투여에 입자를 적합하게 만드는 직경, 전형적으로 1000 나노미터(nm) 미만의 직경을 갖는 임의의 입자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 600 nm 미만의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 400 nm 미만의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 약 5O nm 내지 약 1000 nm, 바람직하게는 약 50 nm 내지 약 400 nm, 바람직하게는 약 100 nm 내지 약 300 nm, 예컨대 약 150 nm 내지 약 200 nm 범위의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 약 200 내지 약 700 nm, 약 200 내지 약 600 nm, 바람직하게는 약 250 내지 약 550 nm, 특히 약 300 내지 약 500 nm 또는 약 200 내지 약 400 nm 범위의 직경을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "나노미립자 제형" 또는 유사한 용어는 적어도 하나의 나노입자를 함유하는 임의의 물질을 의미한다. 일부 실시양태에서, 나노미립자 제형은 나노입자의 균일한 집합체이다. 일부 실시양태에서, 나노미립자 제형은 분산액 또는 에멀젼이다. 일반적으로, 혼화되지 않는 두 가지 이상의 물질이 결합되면 분산액이나 에멀젼이 형성된다.
용어 "리포플렉스" 또는 "핵산 리포플렉스", 특히 "RNA 리포플렉스"는 지질과 핵산, 특히 RNA의 복합체를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 리포플렉스는 종종 중성 "헬퍼" 지질도 포함하는 양이온성 리포솜이 핵산과 혼합될 때 자발적으로 형성된다.
본 개시내용이 양전하, 음전하 또는 중성 전하 또는 양이온성 화합물, 음전하 화합물 또는 중성 화합물과 같은 전하를 언급하는 경우 이는 일반적으로 언급된 전하가 생리학적 pH와 같은 선택된 pH에 존재한다는 것을 의미한다. 예를 들어, "양이온성 지질"이라는 용어는 생리학적 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 갖는 지질을 의미한다. "중성 지질"이라는 용어는 순 양전하 또는 음전하를 갖지 않는 지질을 의미하며 생리학적 pH와 같은 선택된 pH에서 비전하 또는 중성 양쪽성 이온의 형태로 존재할 수 있다. 본원에서 "생리학적 pH"는 약 7.5의 pH를 의미한다.
본원에 개시된 바와 같이 사용하기 위해 고려되는 지질 담체와 같은 나노미립자 담체는 예를 들어 핵산과 복합체를 형성하거나 핵산이 봉입되거나 캡슐화되는 소포를 형성함으로써 RNA와 같은 핵산이 회합될 수 있는 임의의 물질 또는 비히클를 포함할 수 있다. 이는 네이키드 핵산에 비해 핵산의 안정성을 증가시킬 수 있다. 특히 혈액 내 핵산의 안정성이 높아질 수 있다. 양이온성 지질, 양이온성 중합체 및 양전하를 띠는 기타 물질은 음전하를 띤 핵산과 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 양이온성 분자는 핵산을 복합체화하여 소위 리포플렉스 또는 폴리플렉스를 각각 형성하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 복합체는 핵산을 세포 내로 전달하는 것으로 나타났다.
본원에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 나노미립자 핵산 제제는 다양한 프로토콜에 의해 그리고 다양한 핵산 복합 화합물로부터 얻어질 수 있다. 지질, 중합체, 올리고머 또는 양친매성 물질은 전형적인 착화제이다. 일 실시양태에서, 착화 화합물은 프로타민, 폴리에틸렌이민, 폴리-L-라이신, 폴리-L-아르기닌 또는 히스톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제제를 포함한다. 프로타민은 양이온성 담체제로 유용하다. "프로타민"이라는 용어는 아르기닌이 풍부하고 특히 다양한 동물(예: 어류)의 정자 세포에서 체세포 히스톤 대신 DNA와 연관되어 있는 것으로 발견되는 상대적으로 낮은 분자량의 다양한 강염기성 단백질을 지칭한다. 특히, 용어 "프로타민"은 강염기성이며 물에 용해되고 열에 의해 응고되지 않으며 가수분해 시 주로 아르기닌을 생성하는 어류 정자에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 정제된 형태에서는 장기간 지속되는 인슐린 제제에 사용되며 헤파린의 항응고 효과를 중화시키는 데 사용된다. 본 발명에 따르면, 본원에 사용된 용어 "프로타민"은 이의 단편 및 상기 아미노산 서열의 다량체 형태 또는 이의 단편을 포함하여 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 얻거나 유래된 임의의 프로타민 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 또한 용어는 인공적이고 특정 목적을 위해 특별히 고안되고 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 단리될 수 없는 (합성) 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이 사용되는 프로타민은 황산화 프로타민 또는 염산염 프로타민일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 설명된 나노입자의 생산에 사용되는 프로타민 공급원은 등장성 염 용액에 10 mg/ml(ml당 5000 헤파린 중화 단위) 이상의 프로타민을 함유하고 있는 프로타민 5000이다.
리포솜은 종종 인지질과 같은 소포 형성 지질의 하나 이상의 이중층을 갖는 미세한 지질 소포이며 약물을 캡슐화할 수 있다. 다중층 소낭(MLV), 소형 단층 소낭(SUV), 대형 단층 소낭(LUV), 입체적으로 안정화된 리포솜(SSL), 다중소포체 소낭(MV), 대형 다중소포체 소낭(LMV) 및 당업계에 공지된 다른 이중층 형태를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 유형의 리포솜이 본 개시내용과 관련하여 사용될 수 있다. 리포솜의 크기와 층상도는 제조 방식에 따라 달라지며, 사용할 소낭 유형의 선택은 선호하는 투여 방식에 따라 달라진다. 지질이 수성 매질에 존재할 수 있는 여러 가지 다른 형태의 초분자 조직이 있으며, 층상 상, 육각형 및 역육각형 상, 입방체 상, 미셀, 단층으로 구성된 역 미셀을 포함한다. 이들 상은 DNA 또는 RNA와의 조합으로도 얻어질 수 있으며, RNA 및 DNA와의 상호작용은 상 상태에 실질적으로 영향을 미칠 수 있다. 기술된 상이 본원에 개시된 나노미립자 핵산 제형에 존재할 수 있다.
핵산 및 리포솜으로부터 핵산 리포플렉스를 형성하기 위해, 구상되는 핵산 리포플렉스를 제공하는 한 리포솜을 형성하는 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 리포솜은 역증발 방법(REV), 에탄올 주입 방법, 탈수-재수화 방법(DRV), 초음파 처리 또는 기타 적합한 방법과 같은 표준 방법을 사용하여 형성될 수 있다.
리포솜 형성 후, 리포솜의 크기를 조정하여 실질적으로 균질한 크기 범위를 갖는 리포솜 집단을 얻을 수 있다.
이중층 형성 지질은 전형적으로 2개의 탄화수소 사슬, 특히 아실 사슬과 극성 또는 비극성 헤드 그룹을 가지고 있다. 이중층 형성 지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨 및 스핑고미엘린과 같은 인지질을 포함하여 자연 발생 지질 또는 합성 기원으로 구성되며, 여기서 두 탄화수소 사슬은 전형적으로 약 14 내지 22개의 탄소 원자 길이로 구성되며 불포화도가 다양하다. 본원에 개시된 조성물에 사용하기에 적합한 다른 지질에는 당지질 및 스테롤, 예컨대 콜레스테롤 및 리포솜에도 사용될 수 있는 다양한 유사체가 포함된다.
양이온성 지질은 전형적으로 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬과 같은 친유성 부분을 가지며 전체 순 양전하를 갖는다. 지질의 헤드 그룹은 전형적으로 양전하를 띤다. 양이온성 지질은 바람직하게는 1 내지 10 원자가의 양전하, 보다 바람직하게는 1 내지 3 원자가의 양전하, 보다 바람직하게는 1 원자가의 양전하를 갖는다. 양이온성 지질의 예에는 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTMA); 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄프로판(DODAP); 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판; 1,2-디알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판; 디옥타데실디메틸 암모늄 클로라이드(DODAC), 1,2-디미리스토일옥시프로필-1,3-디메미미드록시에틸 암모늄(DMRIE) 및 2,3-디올레오일옥시-N-[2(스페르민카복스아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. DOTMA, DOTAP, DODAC 및 DOSPA가 바람직하다. DOTMA가 가장 바람직하다.
또한, 본원에 기재된 나노입자는 바람직하게는 구조적 안정성 등의 관점에서 중성 지질을 더 포함한다. 중성 지질은 핵산-지질 복합체의 전달 효율을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 중성 지질의 예에는 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 디아실포스파티딜 콜린, 디아실포스파티딜 에탄올 아민, 세라마이드, 스핑고에밀린, 세팔린, 스테롤 및 세레브로사이드가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. DOPE 및/또는 DOPC가 바람직하다. DOPE가 가장 바람직하다. 양이온성 리포솜이 양이온성 지질과 중성 지질을 모두 포함하는 경우, 양이온성 지질 대 중성 지질의 몰비는 리포솜의 안정성 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있다. 일 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 나노입자는 인지질을 포함할 수 있다. 인지질은 글리세로인지질일 수 있다. 글리세로인지질의 예는 다음을 포함지만 이에 제한되지 않는 세 가지 유형의 지질이다: (i) 예를 들어 포스파티딜콜린(PC), 난황 포스파티딜콜린, 천연, 부분 수소화 또는 완전 수소화 형태의 대두 유래 PC, 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 스핑고미엘린(SM)을 포함하는 양쪽이온성 인지질; (ii) 음으로 하전된 인지질, 예를 들어 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티드산(PA), 포스파티딜글리세롤(PG) 디팔미포일 PG, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG); 메톡시-폴리에틸렌,글리콜-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(mPEG-DSPE)의 경우와 같이 접합체가 양쪽이온성 인지질을 음전하로 만드는 합성 유도체 포함; 및 (iii) 예를 들어 포스포모노에스테르가 O-메틸화되어 양이온성 지질을 형성하는 포스파티딜콜린 또는 스핑고미엘린을 포함하는 양이온성 인지질.
핵산과 지질 담체의 결합은 예를 들어 담체가 핵산을 물리적으로 포집하도록 담체의 간질 공간을 채우는 핵산에 의해, 또는 공유, 이온 또는 수소 결합에 의해, 또는 비특이적 결합에 의한 흡착에 의해 일어날 수 있다.
일 실시양태에서, 자가항원의 T 세포 에피토프에 커플링된 산화환원효소 모티프를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 펩티드를 코딩하는 비면역원성 RNA가 대상체에게 투여된다. RNA의 번역 산물이 대상체의 세포에서 형성될 수 있으며, 산물은 자가항원을 표적으로 하는 자가반응성 T 세포에 대한 내성을 유도하기 위해 면역계에 나타내어질 수 있다.
대안적으로, 본 발명은 자가항원의 T 세포 에피토프에 커플링된 산화환원효소 모티프를 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 펩티드를 발현하는 비면역원성 RNA가 생체 외에서 항원 제시 세포, 예를 들어 환자로부터 채취한 항원 제시 세포에 도입되고 선택적으로 생체 외에서 클론 증식된 세포를 동일한 환자에게 다시 이식하는 실시양태를 구상한다. 형질감염된 세포는 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여, 바람직하게는 정맥내, 강내 또는 복강내 투여에 의해 멸균 형태로 환자에게 재도입될 수 있다. 적합한 세포는 항원 제시 세포를 포함한다. 항원 제시 세포는 바람직하게는 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 중간엽 간질 세포, 상피 세포, 내피 세포 및 섬유아세포이고, 가장 바람직하게는 수지상 세포이다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 비면역원성 RNA를 발현하는 단리된 항원 제시 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 세포는 대상체에 대해 자가 유래, 동종이계, 동계 또는 이종일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 예컨대 cDNA, mRNA, 재조합적으로 생성되고 화학적으로 합성된 분자를 포함하도록 의도된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 발명에 따르면, RNA는 시험관 내 전사된 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA를 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 바람직하게는 단리된 핵산이다. 또한, 본원에 기술된 핵산은 재조합 분자일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단리된 핵산"은 핵산이 (i) 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 시험관 내에서 증폭되었거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되었거나, (iii) 예를 들어 겔 전기영동에 의한 절단 및 분리에 의해 정제되었거나, 또는 (iv) 예를 들어 화학적 합성에 의해 합성된 것을 의미한다. 예를 들어, DNA 주형으로부터 시험관 내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA 형태로 세포에의 도입, 즉 형질감염에 핵산이 사용될 수 있다. 또한 RNA는 서열 안정화, 캡핑 및 폴리아데닐화를 통해 적용 전에 변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "DNA"는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 바람직하게는 전체적으로 또는 실질적으로 데옥시리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자에 관한 것이다. "데옥시리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 그룹의 2'-위치에 하이드록실기가 없는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 용어 "DNA"는 부분적으로 또는 완전히 정제된 DNA, 본질적으로 순수한 DNA, 합성 DNA 및 재조합적으로 생성된 DNA와 같은 단리된 DNA를 포함하며, 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 DNA와 상이한 변형된 DNA를 포함한다. 이러한 변경에는 DNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어 DNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비뉴클레오티드 물질을 첨가하는 것이 포함될 수 있다. DNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드와 같은 비표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 DNA는 유사체 또는 자연 발생 DNA의 유사체라고 할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하고 바람직하게는 전체적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 그룹의 2'-위치에 하이드록실기를 갖는 뉴클레오티드에 관한 것이다. 이 용어에는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA와 같은 단리된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 추가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경에는 RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비뉴클레오티드 물질을 첨가하는 것이 포함될 수 있다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체라고 할 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "RNA"는 바람직하게는 "메신저 RNA"를 의미하는 "mRNA"를 포함하고 DNA를 주형으로 사용하여 생산될 수 있고 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 전사체에 관한 것이다. mRNA는 전형적으로 5' 비번역 영역(5'-UTR), 단백질 또는 펩티드 코딩 영역 및 3' 비번역 영역(3'-UTR)을 포함한다. mRNA는 세포와 시험관 내에서 제한된 반감기를 가지고 있다. 바람직하게는 DNA 주형을 이용한 시험관 내 전사에 의해 mRNA가 생성된다. 본 발명의 일 실시양태에서, RNA는 시험관 내 전사 또는 화학적 합성에 의해 획득된다. 시험관 내 전사 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 시판되는 다양한 시험관 내 전사 키트가 있다.
RNA의 안정성과 번역 효율은 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, RNA는 안정화 효과를 갖고/거나 RNA의 번역 효율을 증가시키는 하나 이상의 변형에 의해 안정화되고 이의 번역이 증가될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 RNA의 발현을 증가시키기 위해, 코딩 영역, 즉 발현된 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 서열 내에서, 바람직하게는 발현된 펩티드 또는 단백질의 서열을 변경하지 않고 변형하여GC 함량을 증가시켜 mRNA 안정성을 증가시키고 코돈 최적화를 수행하여 세포 내 번역을 향상시킬 수 있다.
본원에 사용된 RNA와 관련하여 용어 "변형"은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 포함한다. 일 실시양태에서, RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타제로 처리하여 달성할 수 있다. RNA는 안정성을 증가시키고/시키거나 세포독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, RNA에서 5-메틸시티딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 시티딘으로 치환된다. 대안적으로 또는 추가로, 일 실시양태에서, RNA 슈도우리딘은 우리딘을 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 치환한다.
일 실시양태에서, "변형"이라는 용어는 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 갖는 RNA를 제공하는 것과 관련된다. "5'-캡"이라는 용어는 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 지칭하며 일반적으로 특이한 5'에서 5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 일 실시양태에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. "통상적인 5'-캡"이라는 용어는 자연적으로 발생하는 RNA 5'-캡, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡(m7 G)을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "5'-캡"은 RNA 캡 구조와 유사하고 바람직하게는 생체 내 및/또는 세포 내에서 RNA를 안정화하고/하거나 RNA에 부착된 경우 RNA의 번역을 향상시키는 능력을 갖도록 변형된 5'-캡 유사체를 포함한다.
RNA는 추가 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 RNA의 추가 변형은 자연 발생 폴리(A) 꼬리의 연장 또는 절단, 또는 5'- 또는 3'-비번역 영역(UTR)의 변경, 예컨대 상기 RNA의 인코딩 영역과 관련되지 않은 UTR의 도입, 예를 들어 기존 3'-UTR의 예컨대 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, 베타-글로빈, 바람직하게는 베타-글로빈, 보다 바람직하게는 인간 베타-글로빈과 같은 글로빈 유전자로부터 유래된 3'-UTR의 하나 이상, 바람직하게는 두 개의 카피의 교환 또는 삽입일 수 있다.
마스크되지 않은 폴리-A 서열을 갖는 RNA는 마스크된 폴리-A 서열을 갖는 RNA보다 더 효율적으로 번역된다. "폴리(A) 꼬리" 또는 "폴리-A 서열"이라는 용어는 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 아데닐(A) 잔기의 서열과 관련되며 "마스크되지 않은 폴리-A 서열"은 RNA 분자의 3' 말단에 있는 폴리-A 서열이 폴리-A 서열의 A로 끝나며 폴리-A 서열의 3' 말단, 즉 하류에 위치한 A 이외의 뉴클레오티드가 뒤에 오지 않음을 의미한다. 또한, 약 120개 염기쌍의 긴 폴리-A 서열은 최적의 전사체 안정성 및 RNA 번역 효율로 이어진다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 RNA의 안정성 및/또는 발현을 증가시키기 위해, 바람직하게는 10 내지 500 길이, 보다 바람직하게는 30 내지 300개, 보다 더 바람직하게는 65 내지 200개, 특히 100 내지 150개의 아데노신 잔기 길이를 갖는 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리-A 서열은 대략 120개 아데노신 잔기의 길이를 갖는다. 본 발명에 따라 사용되는 RNA의 안정성 및/또는 발현을 추가로 증가시키기 위해, 폴리-A 서열은 마스크되지 않을 수 있다.
RNA의 "안정성"이라는 용어는 RNA의 "반감기"와 관련이 있다. "반감기"는 분자의 활성, 양 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 기간과 관련된다. 본 발명의 맥락에서, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성을 나타낸다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현 기간"에 영향을 미칠 수 있다. 반감기가 긴 RNA가 장기간 발현될 것으로 예상할 수 있다. 물론, 본 발명에 따라 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 감소시키는 것이 바람직한 경우, RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 증가시키는 위에서 설명한 요소의 기능을 방해하도록 RNA를 변형시킬 수 있다. 본 발명에 따라 투여되는 RNA는 비면역원성이다.
본원에 사용된 용어 "비면역원성 RNA"는 예를 들어 포유동물에 투여 시 RNA 분자 자체에 대해 면역계에 의한 반응을 유도하지 않거나, 또는 비면역원성 RNA를 비면역원성으로 만드는 변형 및 처리를 받지 않았다는 점만 다르고 동일한 RNA 분자에 의해 유도되는 것보다 더 약한 반응을 유도하는 RNA를 지칭한다. 그러나 상기 용어는 세포용해성 CD4+ T 세포 발달 및 성숙을 향해 유도되는 간접적인 면역 반응을 배제하지 않는다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 비면역원성 RNA는 선천적 면역 수용체의 RNA 매개 활성화를 억제하는 변형된 뉴클레오티드를 RNA에 통합하고 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 제거함으로써 비면역원성이 된다. 변형된 뉴클레오티드의 도입에 의해 비면역원성 RNA를 비면역원성으로 만들기 위해, RNA의 면역원성을 낮추거나 억제하는 한 임의의 변형된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 선천적 면역 수용체의 RNA 매개 활성화를 억제하는 변형된 뉴클레오티드가 특히 바람직하다. 일 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드로 하나 이상의 유리딘의 대체를 포함한다. 일 실시양태에서, 변형된 핵염기는 변형된 우라실이다. 일 실시양태에서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드는 3-메틸-우리딘 (m3U), 5-메톡시-우리딘 (mo5U), 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘 (s2U), 4-티오-우리딘 (s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘 (ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘 (예를 들어, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산 (cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르 (mcmo5U), 5-카복시메틸-우리딘 (cm5U), 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 (chm5U), 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르 (mchm5U), 5-메톡시카보닐메틸-우리딘 (mcm5U), 5-메톡시카보닐메틸-2-티오-우리딘 (mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘 (nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘 (mnm5U), 1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘 (mnm5se2U), 5-카바모일메틸-우리딘 (ncm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-우리딘 (cmnm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (cmnm5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘 (τm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘 (τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 5-메틸-2-티오-우리딘 (m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘 (D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘 (m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N(1)-메틸-슈도우리딘 (m1ψ), 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘 (acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필)슈도우리딘 (acp3 ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘 (inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘 (inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘 (Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘 (m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘 (ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘 (s2Um), 5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm5Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm5Um), 5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘 (m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm5Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-ara-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-ara-우리딘, 5-(2-카보메톡시비닐)우리딘, 및 5-[3-(1-E- 프로페닐아미노)우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드의 구조는 N(1)-메틸슈도우리딘(m1Ψ)이다.
T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관 내 전사(IVT)에 의해 mRNA를 합성하는 동안 효소의 비통상적 활성으로 인해 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 비롯한 상당량의 비정상 산물이 생성된다. dsRNA는 염증성 사이토카인을 유도하고 이펙터 효소를 활성화하여 단백질 합성을 억제한다. dsRNA는 예를 들어 비다공성 또는 다공성 C-18 폴리스티렌-디비닐벤젠(PS-DVB) 매트릭스를 사용하는 이온쌍 역상 HPLC에 의해 IVT RNA와 같은 RNA로부터 제거될 수 있다. 대안적으로, dsRNA를 특이적으로 가수분해하지만 ssRNA는 가수분해하지 않는 E. coli RNasellll을 사용하는 효소 기반 방법을 사용하여 IVT RNA 제제에서 dsRNA 오염 물질을 제거할 수 있다. 추가로, dsRNA는 셀룰로오스 소재를 이용하여 ssRNA로부터 분리될 수 있다. 일 실시양태에서, RNA 제제는 셀룰로스 물질과 접촉되고, ssRNA는 셀룰로스 물질에 대한 dsRNA의 결합을 허용하고 셀룰로스 물질에 대한 ssRNA의 결합을 허용하지 않는 조건 하에서 셀룰로스 물질로부터 분리된다. 본원에 사용된 용어 "제거하다" 또는 "제거"는 비면역원성 RNA와 같은 제1 물질 집단이 dsRNA와 같은 제2 물질 집단의 근접성과 분리되는 특징을 의미하며, 여기서 제1 물질의 집단에 반드시 제2 물질이 없는 것은 아니며, 제2 물질의 집단에 반드시 제1 물질이 없는 것은 아니다. 그러나, 제2 물질 집단의 제거를 특징으로 하는 제1 물질 집단은 제1 물질과 제2 물질의 분리되지 않은 혼합물에 비해 측정적으로 더 낮은 제2 물질 함량을 갖는다.
핵산은 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단을 통해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 핵산을 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법에는 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공 등이 포함된다.
관심 핵산을 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법에는 DNA 및 RNA 벡터의 사용이 포함된다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예를 들어 인간 세포에 유전자를 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이다. 다른 바이러스 벡터는 렌티빔, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 숙주 세포에 핵산을 도입하기 위한 화학적 수단에는 고분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드 분산 시스템과 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 비롯한 지질 기반 시스템이 포함된다. 시험관 내 및 생체 내 전달 비히클로 사용하기에 바람직한 콜로이드 시스템은 리포솜(즉, 인공 막 소낭)이다. 이러한 시스템의 제조 및 사용은 당업계에 잘 알려져 있다.
"인코딩"은 정의된 뉴클레오티드 서열 또는 정의된 아미노산 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성에 주형 역할을 하는 핵산 내 특정 뉴클레오티드 서열의 고유 특성을 지칭한다. 따라서, 핵산의 발현(번역 및 선택적으로 전사)이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 핵산은 단백질을 인코딩한다. 용어 "발현"은 본 발명에 따라 가장 일반적인 의미로 사용되며, 예를 들어 전사 및/또는 번역에 의한 RNA 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드의 생산을 포함한다. RNA와 관련하여, "발현" 또는 "번역"이라는 용어는 특히 펩티드 또는 폴리펩티드의 생산과 관련된다. 이는 또한 핵산의 부분 발현을 포함한다. 더욱이 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "전사"는 DNA 서열의 유전 코드가 RNA로 전사되는 과정에 관한 것이다. 그 후, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, "전사"라는 용어는 "시험관 내 전사"를 포함하며, 여기서 "시험관 내 전사"라는 용어는 RNA, 특히 mRNA가 무세포 시스템에서 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관 내에서 합성되는 과정에 관한 것이다. 바람직하게는, 전사체 생성을 위해 클로닝 벡터가 적용된다. 이들 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 지정되며 본 발명에 따르면 용어 "벡터"에 포함된다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 사용되는 RNA는 바람직하게는 시험관 내 전사된 RNA(IVT-RNA)이며, 적절한 DNA 주형의 시험관 내 전사에 의해 얻어질 수 있다. 전사 조절을 위한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. RNA 중합효소의 특정 예는 T7, T3 및 SP6 RNA 중합효소이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 시험관 내 전사는 T7 또는 SP6 프로모터에 의해 제어된다. 시험관 내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고 이를 시험관 내 전사를 위한 적절한 벡터에 도입함으로써 얻을 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "번역"은 메신저 RNA 가닥이 아미노산 서열의 조립을 지시하여 펩티드 또는 폴리펩티드를 만드는 세포의 리보솜에서의 과정에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 핵산, 예컨대 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA가 시험관 내 또는 대상체에 존재할 수 있는 세포에 일단 흡수되거나 도입되면, 즉 세포에 이식되거나 형질전환되면, 상기 펩티드 또는 단백질의 발현을 초래하는 것이 바람직하다. 세포는 인코딩된 펩티드 또는 단백질을 세포내에서(예를 들어 세포질 및/또는 핵에서) 발현할 수 있거나, 인코딩된 펩티드 또는 단백질을 분비할 수 있거나, 이를 표면에서 발현할 수 있다.
본 발명에 따르면, "발현하는 핵산" 및 "인코딩하는 핵산"과 같은 용어 또는 유사한 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 특정 펩티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 핵산이 적절한 환경에, 바람직하게는 세포 내에 존재한다면, 발현되어 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 생산할 수 있음을 의미한다.
용어 "전이", "도입", "형질감염" 또는 "형질도입"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 핵산, 특히 RNA와 같은 외인성 또는 이종성 핵산을 세포 내로 도입하는 것과 관련이 있다. 본 발명에 따르면, 세포는 시험관 내 또는 생체내 존재할 수 있으며, 예를 들어 세포는 기관, 조직 및/또는 유기체의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 형질감염은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 일부 형질감염 적용의 경우, 형질감염된 유전 물질이 일시적으로만 발현된다면 충분하다. 형질감염 과정에서 도입된 핵산은 일반적으로 핵 게놈에 통합되지 않으므로 외래 핵산은 유사분열을 통해 희석되거나 분해된다. 핵산의 에피솜 증폭을 허용하는 세포주는 희석 속도를 크게 감소시킨다. 형질감염된 핵산이 실제로 세포 및 그 딸세포의 게놈에 남아 있기를 원한다면 안정적인 형질감염이 이루어져야 한다. RNA는 세포 내로 형질감염되어 인코딩된 단백질을 일시적으로 발현할 수 있다.
본원에 기술된 제제는 임의의 적합한 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. "약학적 조성물"이라는 용어는 치료적으로 효과적인 제제 또는 이의 염을 바람직하게는 완충제, 방부제 및 등장성 조절제와 같은 약학적 부형제와 함께 포함하는 제형에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물은 상기 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 약학적 조성물은 또한 약학적 제형으로서 당업계에 공지되어 있다. 약학적 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다.
용어 "전신 투여"는 치료적으로 유효한 제제가 개인의 체내에 상당한 양으로 널리 분포되어 생물학적 효과가 나타나도록 투여하는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 투여는 비경구 투여에 의한 것이 바람직하다.
용어 "비경구 투여"는 치료적으로 유효한 제제를 장을 통과하지 않도록 투여하는 것을 의미한다. "비경구 투여"라는 용어에는 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 피내 투여 또는 동맥내 투여가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 또한 바람직하게는 면역 억제 화합물을 대상체에게 추가로 제공하는 것을 포함한다. 면역 억제 화합물이 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우, 이는 면역 억제 화합물 또는 면역 억제 화합물을 인코딩하는 RNA와 같은 핵산을 투여함으로써 대상체에게 제공될 수 있다. 면역 억제 화합물은 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 인터루킨 10(IL-10), 인터루킨 1 수용체 길항제(IL-1RA), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 27(IL-27), 인터루킨 35(TL-35), 프로그래밍된 사멸 리간드 1(PD-L1), 유도성 T 세포 공동 자극 리간드(ICOSL), B7-H4, CD39, CD73, FAS, FAS-IL, 인돌아민 2,3-디옥시게나제 1(IDO1), 인돌아민 2,3-디옥시게나제 2(ID02), 아세트알데히드 탈수소효소 1(ALDH1)/레틴알데히드 탈수소효소(RALDH), 아르기나제 1(ARG1), 아르기나제 2(ARG2), 아산화질소 합성효소(NOS2), 갈렉틴-1, 갈렉틴-9, 세마포린 4A 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 조성물은 이러한 면역 억제 화합물 또는 이러한 면역 억제 화합물을 인코딩하는 RNA와 같은 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 일반적으로 "약학적 유효량" 및 "약학적으로 허용되는 제제"로 적용된다.
용어 "약학적 유효량"은 단독으로 또는 추가 용량과 함께 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환을 치료하는 경우, 원하는 반응은 바람직하게는 질환 경과의 억제와 관련된다. 이는 질환의 진행을 늦추는 것, 특히 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질환 치료에서 원하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 상태의 발병 지연 또는 발병 예방일 수 있다. 본원에 기술된 조성물의 유효량은 치료할 상태, 질환의 중증도, 연령, 생리학적 상태, 크기 및 체중을 포함하는 환자의 개별 매개변수, 치료 기간, 동반 치료(있는 경우)의 유형, 특정 투여 경로 및 유사한 요인에 따라 달라질 것이다. 따라서, 본원에 기술된 조성물의 용량은 이러한 다양한 매개변수에 따라 달라질 수 있다. 환자의 반응이 초기 용량으로 불충분한 경우, 더 높은 용량(또는 더 국소화된 다른 투여 경로를 통해 효과적으로 더 높은 용량)을 사용할 수 있다.
"약학적으로 허용되는"이라는 용어는 약학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무독성을 지칭한다.
본 발명의 약학적 조성물은 염, 완충제, 방부제, 담체 및 선택적으로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
용어 "부형제"는 결합제, 윤활제, 증점제, 표면활성제, 방부제, 유화제, 완충제, 향미제 또는 착색제와 같은, 활성 성분이 아닌 약학적 조성물의 모든 물질을 나타내려는 의도이다.
용어 "희석제"는 희석 및/또는 묽게 하는 제제와 관련된다. 또한, "희석제"라는 용어는 유체, 액체 또는 고체 현탁액 및/또는 혼합 매질 중 하나 이상을 포함한다.
용어 "담체"는 인간에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제 또는 희석제에 관한 것이다. "담체"라는 용어는 활성 성분의 적용을 촉진하기 위해 활성 성분과 결합되는 천연 또는 합성 유기 또는 무기 성분에 관한 것이다. 바람직하게는, 담체 성분은 물 또는 미네랄 오일, 동물 또는 식물로부터 유래된 것들, 예컨대 땅콩유, 대두유, 참기름, 해바라기유 등을 포함하는 오일과 같은 멸균 액체이다. 염 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세린 용액도 수성 담체 화합물로 사용될 수 있다.
치료 용도를 위한 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예에는, 예를 들어 탄산마그네슘, 스테아르산마그네슘, 활석, 당, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로오스, 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등이 포함된다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물이 포함된다. 약학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 약학 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 담체(들), 부형제(들) 또는 희석제(들)로서 또는 이에 더하여 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들) 및/또는 가용화제를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예에는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예컨대 글루코스, 무수 락토스, 자유 흐름 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미료, 아카시아, 트라가칸트 또는 알긴산나트륨과 같은 천연 및 합성 검, 카복시메틸 셀룰로오스 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 적합한 윤활제의 예에는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등이 포함된다. 방부제, 안정제, 염료 및 심지어 향미제도 약학적 조성물에 제공될 수 있다. 방부제의 예로는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산 에스테르가 있다. 항산화제 및 현탁제도 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 조성물은 수성 조성물이다. 수성 조성물은 임의로 용질, 예를 들어 염을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 조성물은 동결-건조된 조성물의 형태이다. 동결 건조 조성물은 각각의 수성 조성물을 동결 건조함으로써 얻을 수 있다. 본 발명은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시된다.
비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 시험관 내 및 생체 내 방법에서 T 세포 에피토프의 존재에 대해 시험될 수 있으며, 시험관 내 분석에서 환원 활성에 대해 시험될 수 있다. 최종 품질 관리로서, 펩티드가 변형된 산화환원효소 모티프를 가진 펩티드에도 존재하는 에피토프 서열을 포함하는 항원을 제시하는 항원 제시 세포에 대한 세포자멸사 경로를 통해 세포 용해 CD4+ T 세포 또는 NKT 세포를 생성할 수 있는지 여부를 검증하기 위해 시험관 내 분석에서 펩티드를 시험할 수 있다. 본원에 기술된 이러한 펩티드는 박테리아, 효모, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포에서 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 제한된 길이의 펩티드를 고려해, 이들은 화학적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 펩티드는 상이한 아미노산을 서로 커플링시켜 제조된다. 화학적 합성은 예를 들어, D-아미노산, 자연적으로 발생하지 않는 측쇄를 갖는 아미노산 또는 변형된 측쇄 등을 갖는 천연 아미노산을 포함시키는데 특히 적합하다.
화학적 펩티드 합성 방법은 잘 설명되어 있으며, 펩티드는 Applied Biosystems와 같은 회사 및 다른 회사에서 주문할 수 있다.
펩티드 합성은 고상 펩티드 합성 (SPPS)으로 또는 반대로 용액상 펩티드 합성으로 수행될 수 있다. 가장 잘 알려진 SPPS 방법은 t-Boc 및 Fmoc 고상 화학법이다:
펩티드 합성 동안 몇몇 보호기가 사용된다. 예를 들어, 하이드록실 및 카복실 작용기는 t-부틸 그룹에 의해 보호되고, 라이신 및 트립토판은 t-Boc 그룹에 의해 보호되며, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인 및 히스티딘은 트리틸 그룹에 의해 보호되고, 아르기닌은 pbf 그룹에 의해 보호된다. 적절한 경우, 이러한 보호기는 합성 후 펩티드 상에 남아있을 수 있다. 펩티드는 켄트 (Kent) (Schnelzer & Kent (1992), Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193)에 의해 최초 기술되고, 예를 들어 [Tam et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205]에서 검토된 바와 같이, 결찰 전략 (두 개의 비보호된 펩티드 단편의 화학선택적 커플링)을 이용하여 더 긴 펩티드를 형성하도록 서로 연결될 수 있으며, SPPS의 범위를 벗어나는 단백질 합성을 달성할 엄청난 잠재력을 제공한다. 100-300 잔기의 크기를 갖는 많은 단백질이 이 방법으로 성공적으로 합성되었다. 합성 펩티드는 SPPS의 엄청난 발전으로 인해 생화학, 약리학, 신경생물학, 효소학 및 분자 생물학 분야의 연구 분야에서 끊임없이 중요한 역할을 계속해 왔다.
대안적으로, 펩티드는 인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적절한 발현 벡터에서 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 사용하여 합성될 수 있다. 그러한 DNA 분자는 자동화 DNA 합성기 및 유전자 코드의 잘 알려진 코돈-아미노산 관계를 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 이러한 DNA 분자는 또한 올리고뉴클레오티드 프로브 및 통상적인 혼성화 방법을 사용하여 게놈 DNA 또는 cDNA로서 수득될 수 있다. 이러한 DNA 분자는 박테리아, 예를 들어 대장균 (Escherichia coli), 효모 세포, 동물 세포 또는 식물 세포와 같은 적합한 숙주에서 DNA의 발현 및 폴리펩티드의 생성에 적합한 플라스미드를 포함하는 발현 벡터에 도입될 수 있다.
펩티드가 치료 조성물에 사용하기에 적합할 수 있는 지의 여부를 결정하기 위해 대상 펩티드의 물리적 및 화학적 성질 (예를 들어 용해도, 안정성)이 조사된다. 전형적으로 이는 펩티드의 서열을 조절함으로써 최적화된다. 선택적으로, 펩티드는 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 합성 후에 변형 (화학적 변형, 예를 들어, 작용기의 첨가/제거)될 수 있다.
표준 산화환원효소 모티프 및 MHC 클래스 II T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드의 작용 메커니즘은 상기 인용된 PCT 출원 WO2008/017517 및 본 발명자들의 공개물에 개시된 실험 데이터로 입증되었다. 표준 산화환원효소 모티프 및 CD1d 결합 NKT 세포 에피토프를 포함하는 면역원성 펩티드의 작용 메커니즘은 상기 인용된 PCT 출원 WO2012/069568 및 본 발명자들의 공개물에 개시된 실험 데이터에 의해 입증되었다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 산화환원효소 모티프에 커플링된 T 세포 에피토프(각각 MHC 클래스 II 또는 NKT 에피토프)를 포함하는 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA를 투여함으로써 생체 내 또는 시험관 내에서 항원 특이적 세포용해 CD4+ T 세포(MHC 클래스 II 에피토프를 포함하는 본원에 개시된 면역원성 펩티드를 사용하는 경우) 또는 항원 특이적 세포용해 NKT 세포(CD1d 분자에 결합하는 NKT 세포 에피토프를 포함하는 본원에 개시된 면역원성 펩티드를 사용하는 경우)를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명은 항원-특이적 CD4+ T 세포 또는 NKT 세포의 생산을 위한 생체내 방법을 기술한다. 특정 실시양태는 동물(인간 포함)을 본원에 개시된 펩티드 인코딩 비면역원성 RNA로 면역화한 후, 면역화된 동물로부터 CD4+ T 세포 또는 NKT 세포를 단리함으로써 CD4+ T 세포 또는 NKT 세포를 생산하거나 단리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 APC에 대한 항원 특이적 세포용해성 CD4+ T 세포 또는 NKT 세포의 생산을 위한 시험관 내 방법을 기술한다. 본 발명은 APC에 대한 항원 특이적 세포용해성 CD4+ T 세포 및 NKT 세포를 생성하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 특히 IL-2의 존재 하에 말초 혈액 세포의 단리, 본원에 기재된 바와 같은 펩티드에 의한 시험관 내 세포 집단의 자극 및 자극된 세포 집단의 확장을 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명에 따른 방법은 (항원 특이적 에피토프를 포함하는 펩티드를 사용하여) 항원성 단백질에 특이적인 CD4+ T 세포가 생성될 수 있고 많은 수의 CD4+ T 세포가 생산된다는 이점을 갖는다.
대안적인 실시양태에서, CD4+ T 세포는 생체 내에서, 즉 본원에 기술된 바와 같은 면역원성 펩티드 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA를 대상체에게 주입하고, 생체 내에서 생성된 세포용해성 CD4+ T 세포를 수집함으로써 생성될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 APC에 대한 항원 특이적 세포용해성 CD4+ T 세포는 알레르기 반응의 예방 및 자가면역 질환의 치료에서 면역 요법을 위해 포유동물에 투여하는데 특히 중요하다. 동종 및 자가생성 세포의 사용이 모두 고려된다.
세포용해성 CD4+ T 세포 집단은 본원에서 하기에 기술된 바와 같이 수득된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 특이적 NKT 세포를 확장시킴으로써 결과적으로 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 활성을 증가키는 방법을 제공한다:
(i) 사이토카인 생산 증가
(ii) 항원 제시 세포의 접촉 및 가용성 인자 의존적 제거 증가. 따라서 그 결과 세포내 병원체, 자가항원, 바람직하게는 제1형 당뇨병(T1D), 다발성 경화증(MS) 또는 시신경척수염(NMO)과 같은 탈수초성 질환, 또는 류마티스 관절염(RA)과 관련된 자가항원에 대해 보다 효율적인 반응이다.
본 발명은 또한 체액 또는 기관에서 필요한 특성을 갖는 NKT 세포의 식별에 관한 것이다. 이 방법은 NK1.1, CD4, NKG2D 및 CD244의 발현을 포함하여 표면 표현형을 통해 NKT 세포를 식별하는 것을 포함한다. 그런 다음 세포를 CD1d 분자에 의해 제시될 수 있는 펩티드로 정의된 NKT 세포 에피토프와 접촉시킨다. 이어 세포를 IL-2, IL-15 또는 IL-7의 존재 하에 시험관 내에서 확장한다.
본원에 기술된 바와 같은 항원 특이적 세포용해성 CD4+ T 세포 또는 NKT 세포는 약제로 사용될 수 있으며, 특히 입양 세포 요법, 더욱 특히 급성 알레르기 반응 및 제1형 당뇨병(T1D), 다발성 경화증(MS) 또는 시신경척수염(NMO)과 같은 탈수초 장애, 또는 류마티스 관절염(RA)과 같은 자가면역 질환의 재발 치료에 사용될 수 있다. 단리된 세포용해성 CD4+ T 세포 또는 NKT 세포 또는 세포 집단, 보다 특히 설명된 바와 같이 생성된 항원 특이적 세포용해성 CD4+ T 세포 또는 NKT 세포 집단은 (자가)면역 장애의 예방 또는 치료용 약제의 제조에 사용된다. 단리되거나 생성된 세포용해성 CD4+ T 세포 또는 NKT 세포를 사용하여 치료하는 방법이 개시된다.
WO2008/017517에 설명된 바와 같이, APC에 대한 세포용해성 CD4+ T 세포는 세포의 발현 특성에 기초하여 천연 Treg 세포와 구별될 수 있다. 보다 구체적으로, 세포용해성 CD4+ T 세포 집단은 천연 Treg 세포 집단과 비교하여 하기 특성 중 하나 이상을 나타낸다: 활성화 시 CD103, CTLA-4, FasI 및 ICOS를 포함하는 표면 마커의 증가된 발현, CD25의 중간 발현, CD4, ICOS, CTLA-4, GITR의 발현 및 CD127 (IL7-R)의 저발현 또는 비발현, CD27의 비발현, 전사 인자 T-bet 및 egr-2 (Krox-20)는 발현하나 전사 억제 인자 Foxp3은 발현하지 않음, IFN-γ의 고 생산 및 IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 또는 TGF-β는 비생산 또는 단지 미량 생산.
또한 세포용해성 T 세포는 CD45RO 및/또는 CD45RA를 발현하고 CCR7, CD27을 발현하지 않으며, 높은 수준의 그랜자임 B 및 기타 그랜자임뿐만 아니라 Fas 리간드를 제시한다.
WO2008/017517에 설명된 바와 같이, APC에 대한 세포용해성 NKT 세포는 세포의 발현 특징에 기초하여 비세포용해성 NKT 세포와 구별될 수 있다. 보다 구체적으로, 세포용해성 CD4 + NKT 세포 집단은 비-세포용해성 NKT 세포 집단과 비교하여 다음 특징 중 하나 이상을 나타낸다: NK1.I, CD4, NKG2D 및 CD244의 발현.
본원에 기술된 바와 같은 펩티드 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA는 살아있는 동물, 전형적으로 인간에게 투여 시 방관자 T 세포에 대해 억제 활성을 발휘하는 특정 T 세포를 유도할 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포용해 세포 집단은 FasL 및/또는 인터페론 감마의 발현을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포용해 세포 집단은 그랜자임B의 발현을 추가로 특징으로 한다.
이 메커니즘은 또한 본원에 기술된 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드가 특정 항원의 특정 T 세포 에피토프를 포함하지만 상기 펩티드에 의해 활성화된 T 세포 부근의 CD1d 분자 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 동일한 메커니즘을 통해(방관자 효과에 의해) 제시될 수 있다면, 동일한 항원의 다른 T 세포 에피토프에 대한 면역 반응에 의해 유발되는 장애의 예방 또는 치료, 또는 특정 상황에서는 심지어 다른 상이한 항원의 다른 T 세포 에피토프에 대한 면역 반응에 의해 유발된 장애의 치료에 사용될 수 있음을 암시하고 이를 나타내는 실험 결과를 보여준다.
전술한 특징을 갖고, 또한 항원 특이적, 즉 항원 특이적 면역 반응을 억제할 수 있는 세포 유형의 단리된 세포 집단이 개시된다.
본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 비면역원성 RNA 종을 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한 조성물 또는 이 조성물을 사용하여 포유동물의 면역 장애를 치료하는 방법, 및 면역 장애의 예방 또는 치료용 의약 제조를 위한 조성물의 용도에 관한 것이다. 약학적 조성물은 예를 들어 (자가)면역 장애, 특히 공기 매개 및 식품 매개 알레르기는 물론 알레르기 기원 질환을 치료 또는 예방하는데 적합한 백신일 수 있다.
활성 성분을 단독으로 투여하는 것도 가능하지만 전형적으로는 약학적 제형으로 제공된다. 본원에 기술된 바와 같은 수의학용 및 인간용 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 상기 기술된 바와 같은 적어도 하나의 활성 성분을 포함한다. 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합된, 본원에 기술된 하나 이상의 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA 종을 활성 성분으로서 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 치료 또는 예방 방법과 관련하여 이하에 나타낸 바와 같은 치료적 유효량의 활성 성분을 포함해야 한다. 선택적으로, 조성물은 다른 치료 성분을 추가로 포함한다. 적합한 기타 치료 성분뿐만 아니라 이들이 속하는 부류에 따른 이들의 통상적인 투여량은 당업자에게 잘 알려져 있으며 (자가)면역 장애를 치료하는 데 사용되는 기타 알려진 약물 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 비면역원성 RNA는 국소, 전신, 경구(고체 형태 또는 흡입), 직장, 비강, 국소(안구, 협측 및 설하 포함), 질 및 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 피내, 동맥내, 척수강내 및 경막외 포함)를 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 예를 들어 수용자의 상태 또는 치료할 질환에 따라 달라질 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 담체(들)는 제형의 다른 성분과 상용성이 있고 이의 수용자에게 해롭지 않다는 의미에서 최적으로 "허용 가능"하다. 제형은 경구, 직장, 비강, 국소(협측 및 설하 포함), 질 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 피내, 동맥내, 척추강내 및 경막외 포함) 투여에 적합한 것들을 포함한다.
MHC 클래스 II T 세포 에피토프를 포함하는 본원에 기술된 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA는 표면에 펩티드를 제시하여 APC가 될 (미성숙) 수지상 세포로 전달될 것이다. 이들 세포는 (1) MHC 클래스 II 의존성 동족 활성화 후 APC 세포자멸사를 유도하여 시험관 내 및 생체 내에서 입증된 바와 같이 수지상 세포와 B 세포 모두에 영향을 미치고, (2) 접촉-의존성 메커니즘에 의해 방관자 T 세포를 억제하는 세포용해성 CD4+ T 세포를 유도한다. 세포용해성 CD4+ T 세포는 WO2008/017517에 자세히 논의된 바와 같이 천연 및 입양성 Treg와 구별될 수 있다.
본원에 기술된 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA는 CD1d 분자에 결합하는 능력을 부여하는 소수성 잔기를 함유한다. 투여 시, RNA는 (미성숙) 수지상 세포에 흡수되고 후기 엔도솜으로 이동하여 CD1d에 로드되어 APC 표면에 제시된다. 일단 CD1d 분자에 의해 제시되면, 인코딩된 펩티드의 산화환원효소 모티프는 NKT 세포를 활성화하는 능력을 향상시켜 세포용해성 NKT 세포가 된다. 상기 인코딩된 펩티드는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한 다른 이펙터 세포를 활성화 할 IFN-감마와 같은 사이토카인의 생산을 활성화한다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두 WO2012/069568에 자세히 논의된 바와 같이 항원을 제시하는 세포의 제거에 참여할 수 있다.
이제 본 발명은 어떠한 제한의 의도 없이 제공되는 다음 실시예에 의해 예시될 것이다. 또한, 본원에 기술된 모든 참고문헌은 본원에 참조로 명시적으로 포함되어 있다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
유세포 측정 분석
형광 활성화 세포 분류(FACS) 표면 및 세포내 항체는 eBioscience 또는 BD Pharmingen에서 구입하여 제조업체의 프로토콜에 따라 사용할 수 있다. 사용되는 항체는 다음과 같다: CD11b, CD11c, CD19, CD4, CD40L, CD49b, CD69, CD8, CD86, CD90.1, IFNy 및 IL-17A. 다양한 기관으로부터의 단일 세포 현탁액을 세포외 표지를 위해 4℃에서 30분 동안 염색하였다. IFΝγ, 1L-17A 및 CD40L의 세포내 사이토카인 염색을 위해, 세포를 설명된 대로 단리하고 MOG35-55 펩티드(농도 15 μg/ml), 모넨신(GolgiStop, BD-Bioscience) 및 브레펠딘(Brefeldin) A를 함유하는 배양 배지에서 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 추가로 자극하였다. 생-사 염색(생존 염료 eFluor® 506, eBioscience) 및 세포 표면 마커 염색을 수행한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 BD Biosciences의 Cytofix/Cytoperm 및 Perm/Wash 완충액을 사용하여 세포를 고정하고 투과화하였다. 세포를 세포내 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하고 FACS 분석 전에 Perm/Wash에서 2회 세척하였다. 샘플을 FACS Canto II로 수집하고 FlowJo(Tree Star) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
생체 내 생물발광 이미징(BLI)
Xenogen IVIS Spectrum 생체 내 이미징 시스템(Caliper Life Sciences)을 사용하여 비장 세포에서의 비면역원성 mRNA의 번역 효율을 조사하였다. 비면역원성 LUC-mRNA의 RNA-LPX-면역화 6시간, 24시간, 48시간 및 72시간 후에, 마우스에 D-루시페린 수용액(250 μl, PBS 중 1.6 mg)(BD Biosciences)을 복강내 주사하였다. 5분 후, 비장으로부터의 신호 강도를 정의하고 관심 영역(ROI)에서 생체 내 생물발광으로 측정하고 IVIS Living Image 4.0 소프트웨어를 사용하여 총 플럭스(광자/초)로 정량화하였다. 획득 시간은 비닝 4에서 1분이었다. 살아있는 마우스의 생물발광 이미징 중에 마우스를 2.5% 이소플루란/산소 혼합물의 용량으로 마취시켰다. 살아있는 동물의 방출 광자의 LUC 신호 강도를 그레이 스케일 이미지로 표시하였으며, 여기서 검은색은 가장 강도가 낮고 흰색은 가장 강한 생물 발광 신호이다. IVIS Living Image Software를 사용하여 마우스의 이미지를 분석하였다.
자기 활성화 세포 분류(MACS)
제조사의 지시에 따라 MACS(Miltenyi Biotec)를 사용한 양성 선별에 의해 마우스 비장 및 림프절로부터 CD4+ T 세포를 단리할 수 있다. CD4+ T 세포를 CD4(L3T4) 마이크로 비드를 사용하여 정제하였다.
골수 유래 DC(BMDC) 생성
골수(BM) 세포를 마우스의 대퇴골과 경골에서 추출하고 10% FBS(Biochrom), 1% 피루브산 나트륨 100x(Gibco), 1% MEM NEAA 100x(Gibco), 0.5% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco), 50 μM 2-머캅토에탄올(Life Technologies) 및 1000 U/ml 수지상 세포(DC) 분화 인자 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)(Peprotech)가 보충된 RPMI 1640 + GlutaMAX-I 배지(Gibco)에서 37℃의 조직 배양 플라스크에서 배양하였다. 6일차에 2x 106개 DC/ml를 MOG35-55 펩티드(15 μg/ml)와 함께 37℃에서 3시간 동안 예비 배양한 다음 96-웰 플레이트에서 총 부피 200 μl의 배지에서 T 세포와 공동 배양하였다.
입양 T 세포 전달 및 생체 내 증식 분석
증식 연구를 위해, 마우스로부터 얻은 강화된 CD4+ T 세포를 제조업체의 지침에 따라 CTV 표지(CellTrace Violet 세포 증식 키트, Thermo Fisher Scientific)하고, 7x 106개 세포를 200 μl PBS 중에서 마취 하에 미경험 마우스 수용자 마우스에 후안와 정맥총(retro-orbital plexus)에 iv 주사할 수 있다. 다음날 마우스를 wt MOG35-55 에피토프 또는 IMCY-0189(아래 서열 참조)를 코딩하는 10, 20 또는 40 μg의 비면역원성 mRNA로 면역화하였다. 대조군 마우스에게는 20 μg의 관련 없는 비면역원성 mRNA 또는 식염수를 투여하였다. T 세포 전달 4일 후, 마우스를 희생시키고 세포를 유세포 측정법으로 증식에 대해 분석하였다.
ELISA
제조업체의 지침에 따라 표준 ELISA 검정을 사용하여 마우스 혈청에서 RNA-면역화 6시간 후 ELISA(PBL)에 의해 마우스 IFN-α의 검출을 수행할 수 있다.
비장, LN 및 CNS 침윤물의 단리
모든 세포 기반 분석은 비장, 림프절 및 CNS 기관의 단일 세포 현탁액에서 수행할 수 있다. 요약하면, 비장 및 LN을 15분 동안 1 mg/ml 콜라게나제 D 및 0.1 mg/ml DNasel과 함께 인큐베이션한 다음 PBS로 헹구면서 70 μm 세포 여과기를 통해 으깼다. 적혈구 용해(저장성 용해 완충액: 1 L H2O 및 200 μl 0.5M EDTA에 용해된 1 g KHCO3 및 8.25 g NH4Cl)를 비장세포의 단일 세포 현탁액에서 수행하였다. PBS로 추가 세척 단계 후, Vi-Cell 세포 계수기로 세포 수를 계산하였다.
뇌 및 척수로부터의 CNS 침윤물을 단리하기 위해, 마우스를 케타민-롬푼으로 마취시키고 0.9% NaCl을 사용하여 심장 좌심실을 통해 관류시켰다. 뇌와 척수를 손으로 제거하고 작은 조각으로 자르고 콜라게나제 D(1 mg/ml) 및 DNase I(0.1 mg/ml)을 함유하는 PBS++(칼슘 및 마그네슘 함유 PBS, Gibco)에서 37℃에서 20분간 소화시켰다. 이어 소화된 조직을 조직 조각을 주사기로 빨아들이고 15 ml 팔콘 튜브의 벽에 다시 밀어 넣어 수동으로 균질화시켰다. 이 작업을 조각이 보이지 않을 때까지 최대 10회 수행하였다. 단일 세포 현탁액을 70% Percoll에 재현탁하고 30:37 Percoll 구배 하에 층상화하였다. 최종 Percoll 구배는 30:37:70%이며 실온에서 300 g으로 40분 동안 원심분리하였다. 70% 내지 37% Percoll 사이의 간기에 있는 단핵 세포층을 추가 분석 전에 2% FCS/PBS로 세척하였다.
실시예 2: 비장세포 활성화에 관한 비면역성 mRNA 조사
사용된 비면역원성 mRNA의 비장세포 활성화 및 번역 효율을 분석하기 위해, 상술한 바와 같이 F12 리포솜과 복합체를 형성한 루시퍼라제-mRNA(10 μg)를 마우스의 후안와 정맥총에 정맥 주사할 수 있다. 예를 들어 RNA-LPX 주사 6, 24, 48 및 72시간 후 생체내 영상화를 통해 루시퍼라제 활성을 평가하였다. 비면역원성 mRNA로 마우스를 면역화하면 LUC-mRNA의 지속적인 높은 번역으로 이어진다. 결과적으로, LUC 단백질 발현은 일반적으로 mRNA 면역화 후 최대 72시간까지 검출될 수 있다.
더욱이, 비면역원성 mRNA로 마우스를 면역화하면 비처리 대조 마우스에서와 같이 DC에서의 활성화 마커 CD86 및 림프구에서의 CD69의 상향 조절로 이어지지 않는다. 비면역원성 LUC-mRNA로 면역화된 마우스에서는 mRNA 면역화 6시간 후 혈액에서 IFNa가 검출되지 않는다.
실시예 3: 비면역원성 mRNA의 특성화
비면역원성 mRNA는 치료 적용에서 면역 활성화 없이 항원 제시를 보장하기 위해 특정 질환 관련 항원을 수지상 세포에 전달하는 데 사용된다. N(1)-메틸슈도우리딘 (m1ψ)을 mRNA에 도입하면 세포에서 단백질 발현이 향상되고 포유동물 세포주뿐만 아니라 마우스의 생체 내에서도 mRNA의 면역원성이 감소하는 것으로 나타났다(Andries et al., 2015, J Control Release. 217, 337-344). 이 효과는 엔도솜 톨 유사 수용체 3(TLR3)의 활성화와 하류 선천적 면역 신호 전달을 회피하는 mRNA의 증가된 능력에 가장 의존한다(Andries et al., 2015). 추가적으로, 시험관 내 전사 동안 mRNA에의 도입을 위해 뉴클레오시드 유리딘 대신 N(1)-메틸슈도우리딘(m1ψ)을 사용하기 위해서, 합성 mRNA의 HPLC 정제가 또한 수행될 수 있다. 이는 추가로 면역 활성화를 제거하고 뉴클레오시드 변형, 단백질 인코딩 mRNA의 번역을 개선한다(Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Res. 39, el42). HPLC 정제를 통해 남아있는 이중 가닥 mRNA 오염물질을 mRNA 시험관 내 전사 후에 제거하여 인터페론 신호 전달 및 염증성 사이토카인을 유도하지 않는 mRNA를 생성하였다(Kariko et al., 2011). 뉴클레오시드 정제된 mRNA의 정제를 위한 대체 방법은 셀룰로오스 정제(PCT/EP2016/7059056)이다.
치료 적용에 사용되는 mRNA가 실제로 비면역원성인지를 조사하기 위해 Bioanalyzer 및 Dotblot 분석을 수행하여 mRNA의 무결성과 순도를 확인할 수 있다.
mRNA의 품질 관리를 위한 도트-블롯 분석
시험관 내 전사, 변형 및 HPLC 정제 mRNA를 도트 블롯으로 이중 가닥 mRNA(dsRNA)에 대해 분석하였다. 1 μg의 다양한 mRNA 작제물을 NYTRAN SPC 멤브레인(GE Healthcare)에 로드하고 차단한 다음 dsRNA 검출을 위해 J2 항체(SCICONS English and Scientific Consulting)와 함께 인큐베이션하였다. 2차 항체로 항-마우스 HRP 항체(Jackson ImmunoResearch)를 사용하고 멤브레인을 BioRad ChemiDoc으로 분석하였다.
실시예 4: 2개의 시스테인(CX N -C) 사이에 상이한 수의 아미노산을 포함하는 산화환원효소 모티프 및 이를 인코딩하는 비면역원성 RNA를 갖는 면역원성 펩티드 설계.
IMCY-0443 및 IMCY-0189 펩티드를 설계하였다(표 1). 이들은 산화환원효소 모티프 (H)CPYC(서열 번호 34 및 35), 링커 GW, 뮤린 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG) MHCII T 세포 에피토프 YRSPFSRVV(서열 번호 36) 및 플랭킹 서열 HLYR(서열 번호 705)을 포함한다. IMCY-0443 및 IMCY-0189의 변이체도 산화환원효소 모티프의 2개 시스테인 사이에 상이한 수의 아미노산을 갖도록 서열을 변형하는 방식으로 설계하였다(표 1). 염기성 아미노산(K 또는 R)을 변이체의 산화환원효소 모티프 내 또는 N 말단에 추가하였다. 시스테인 잔기 대신 알라닌을 갖는 대조 펩티드(소위 AA 대조군)도 합성하였다. IMCY-0017(MHCII T 세포 에피토프 YRSPFSRVV - 서열 번호 704를 포함하는 wt MOG35-55 펩티드에 해당), IMCY-0069(전통적인 산화환원효소 모티프 HCPYC(서열 번호 24) 및 변형된 뮤린 프리프로인슐린 에피토프를 포함하는 펩티드) 및 IMCY-0257(전통적인 산화환원효소 모티프 HCPYC(서열 번호 24) 및 DBY 항원 에피토프를 포함하는 펩티드)을 또한 대조군으로 설계하였다(표 1).
2개의 시스테인(C-X N -C) 사이에 상이한 수의 아미노산을 포함하는 산화환원효소 모티프를 갖는 면역원성 펩티드.
IMCY-No 서열 서열 번호
IMCY-0443 CPYC-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 706
IMCY-0189 HCPYC-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 707
IMCY-0190 HAPYA-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 708
IMCY-0451 KCC-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 709
IMCY-0511 KAA-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 710
IMCY-0452 CC-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 711
IMCY-0453 KCRC-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 712
IMCY-0513 KARA-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 713
IMCY-0454 CRC-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 714
IMCY-0512 ARA-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 715
IMCY-0455 KCRPYC-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 716
IMCY-0515 KARPYA-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 717
IMCY-0456 CRPYC-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 718
IMCY-0514 ARPYA-GWYRSPFSRVVHLYR-NH2 719
IMCY-0017 (wt MOG35-55) MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-NH2 720
IMCY-0257 HCPYC-NGGFNSNRANSSRSS-NH2 721
IMCY-0069 HCPYC-LALWEPKPTQAFVK-NH2 722
펩티드를 인코딩하는 비면역원성 mRNA 생성
IMCY-0189 및 IMCY-0017 (wt MOG35-55)을 인코딩하는 우리딘(m1ψ mRNA로 약칭) 대신 N(1)-메틸-슈도우리딘(m1ψ)을 포함하는 비면역원성 mRNA를 다음과 같이 생성하였다.
시험관 내 전사를 위한 DNA 주형 생성
Gibson Assembly 방법을 사용하여 pmRVac 벡터에 다음 코딩 서열을 삽입하여 시험관 내 전사를 위한 DNA 주형을 생성하였다:
- IMCY-0189 m1ψ mRNA(서열 번호 768 - DNA 서열)의 경우:
다음 펩티드 인코딩: M-HCPYC-GWYRSPFSRVVHLYR (서열 번호 767)
- MOG35-55 m1ψ mRNA(서열 번호 769 - DNA 서열)의 경우:
다음 펩티드 인코딩: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (서열 번호 720)
- IMCY-0098 m1ψ mRNA (서열 번호 790 - DNA 서열)의 경우:
다음 펩티드 인코딩: M-HCPY-CSLQPLALEGSLQKRG (서열 번호 791)
- IMCY-0141 m1ψ mRNA (서열 번호 792 - DNA 서열)의 경우:
다음 펩티드 인코딩: M-KHCPYC-VRYFLRVPSWKITLFKK (서열 번호 793)
pmRVac 벡터는 T7 프로모터 서열, Kozak 서열이 있는 5' UTR, 3' UTR, 110nt 세그먼트화된 polyA 및 유출 전사에 사용되는 SapI 제한 효소 부위를 포함하고 있다. 삽입 부위는 UTR 사이에 있다. Gibson Assembly 반응 산물을 대장균(E. coli)으로 형질전환시키고 카나마이신이 함유된 LB에 플레이팅하였다. 생성된 콜로니를 PCR로 스크리닝하여 양성 삽입 이벤트를 확인하였다. PCR 양성 클론을 제한 분해 및 Sanger 시퀀싱을 통해 추가로 평가하였다. 올바른 플라스미드를 LB 배지에서 배양하고 내독소가 없는 플라스미드 midiprep 키트를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 DNA 농도 및 순도를 UV-Vis 분광광도계로 측정한 후 SapI 제한효소를 이용하여 선형화하였다.
mRNA 합성
Cap1 mRNA를 T7 시험관 내 전사 방법 및 후속적인 효소 캡핑 및 메틸화에 의해 생성하였다. 캡핑되지 않은 시험관 내 RNA 전사체를 생성하기 위해 선형 DNA 주형을 T7 RNA 중합효소, 뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP) 및 마그네슘 함유 완충액과 혼합하여 시험관 내 전사 반응을 설정하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. UTP 시험관 내 전사를 대체하시 위해 N(1)-메틸-슈도우리딘(m1ψ)을 사용하였다.
Cap1 mRNA를 백시니아 캡핑 시스템을 사용하여 생성하였다. 가열에 의해 캡핑되지 않은 전사체를 변성시킨 후, 백시니아 캡핑 효소, 2'-O 메틸트랜스퍼라제, GTP, S-아데노실 메티오닌(SAM) 및 캡핑 완충액을 첨가하여 캡핑 반응을 설정하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, DNase I 처리를 통해 주형 DNA를 제거하였다.
캡핑된 전사체를 자기 비드를 사용하여 추가로 정제하였다. 단리된 mRNA를 산성 완충액으로 용출하고 -80℃에서 보관하였다. mRNA 농도 및 순도를 UV-Vis 분광광도계로 측정하였다. mRNA 무결성을 변성 아가로스 겔 분석으로 측정하였다. mRNA 시퀀싱을 사용하여 mRNA 분자를 식별하였다.
mRNA를 HPLC나 셀룰로오스 처리를 통해 추가로 정제할 수도 있다. HPLC 정제를 위해 Weissman et al., 2013(Methods Mol Bio. 969, 43-43)의 프로토콜을 적용하고 mRNA의 용출을 38%-70%의 완충액 B 구배로 수행하였다. 생성된 모든 mRNA에 대해 mRNA의 순도와 완전성을 보장하기 위해 품질 관리(Bioanalyser 및 Dot-Blot 분석)를 수행하였다.
지질 나노입자(LNP)에 mRNA 캡슐화
지질(이온화 가능한 양이온성 지질 SM-102, 헬퍼 지질 DSPC, 콜레스테롤 및 PEG화 지질 PEG2000-DMG)를 최적의 몰비로 에탄올에 용해시켰다. mRNA를 시트르산나트륨의 산성화 완충액에 소정 농도로 희석하였다. 미세유체 혼합기를 사용하여 지질과 mRNA를 혼합하여 LNP를 생성하였다. 이어서, LNP를 투석 카세트에서 수크로스가 포함된 Tris-HCl 완충액에 대해 투석하였다.
투석 후, LNP를 0.22 μm 필터에 통과시키고 -80℃에서 보관하였다. RiboGreen 분석을 사용하여 LNPn 중의 mRNA를 정량화했다. 입자 크기 및 표면 전하를 Zetasizer 장치를 사용하여 제타 전위 및 동적 광산란에 의해 결정하였다. 내독소 수준을 Kinetic chromogenic TAL 분석으로 측정하였다.
LNP 분산액을 20 mM Tris, 87 mg/mL 수크로스, 10.7 mM 아세트산나트륨(pH 7.5)에서 제조하였다.
실시예 5: 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 발생에 대한 펩티드 인코딩 비면역원성 RNA의 투여 효과.
마우스 그룹 및 투여량
C57BL/6 암컷 마우스(The Jackson Laboratory, 0일차에 9주령)를 사용하였다. 연구 시작 전 7일 동안 마우스를 적응시켰다. 표 2에 따라 이들을 3개 그룹(그룹당 16 마리의 마우스)으로 분류하였다. 연구 시작 시 그룹 간 평균 체중이 비슷하도록 마우스를 균형있게 배분하였다.
처리 방식
그룹 # 동물 처리 비히클 용량 경로 투여일 목적
1 16 비히클 (Tris 완충액) 20 mM Tris 완충액 - i.v. 7, 10 음성 대조군
2 16 MOG35-55 m1ψ mRNA/LNP 20 mM Tris 완충액 10.2 ㎍ (Day 7), 4.8 ㎍ (10일차) i.v. 7, 10 시험
3 16 IMCY-0189 m1ψ mRNA/LNP 20 mM Tris 완충액 10.2 ㎍ (Day 7), 4.8 ㎍ (10일차) i.v. 7, 10 시험
마우스에서의 EAE 유도
EAE를 모든 마우스에서 다음과 같이 유도하였다:
0일, 0시간: MOG35-55/CFA로 면역화
0일, 2시간: 백일해 독소 주사
1일차, 0시간: 백일해 독소 2차 주사(초기 면역화 24시간 후)
Hooke Kit™ MOG35-55/CFA Emulsion PTX, 카탈로그 번호 EK-2110(Hooke Laboratories, Lawrence MA)의 에멀젼 성분(MOG35-55 함유)을 마우스의 등 두 부위에 피하 주사하였다. 첫 번째 주사 부위는 목선에서 약 1 cm 떨어진 등 위쪽이었다. 두 번째 부위는 꼬리 기부에서 약 2 cm 떨어진 등 아래쪽이었다. 주사량은 각 부위당 0.1 mL였다.
에멀젼 주사 후 2시간 이내에, 다시 에멀젼 주사 후 24시간 후에 키트의 백일해 독소 성분을 복강내 투여하였다.
RNA 제조 및 처리
EAE 모델에서 보호 면역을 결정하기 위해, 마우스를 질병 유도후 7일 및 10일에 표 1에 나타낸 MOG35-55(IMCY-0017) 또는 IMCY-0189 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 LNP-캡슐화 m1ψ RNA 10.2 μg(7일) 또는 4.8(10일) μg로 처리하였다. 산소-이소플루란 기화기(2.5% 이소플루란)를 사용하여 마취 하에 mRNA를 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다.
그룹 1: 비히클(Tris 완충액)
마우스 25 마리 준비(16 마리 주사)
20 mM Tris 완충액 2000 μl를 준비하고 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다(7일차에 1 x 85 μL/마우스, 10일차에 1 x 40 μL/마우스).
그룹 2: MOG 35-55 mRNA/LNP(MOG35-55_m1Ψ)
25 마리의 마우스 준비(16 마리 주사)
LNP/mRNA 용액 바이알을 실온에서 10분 동안 해동하고 5초간 볼텍싱한 후 4개의 바이알을 풀링하여 120 μg/mL로 스톡 2000 μL를 얻었다. 그런 다음 mRNA를 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다(7일차에 1 x 85 μL/마우스, 10일차에 1 x 40 μL/마우스).
그룹 3: IMCY-0189 mRNA/LNP(IMCY- 0189_m1Ψ)
25 마리의 마우스 준비(16 마리 주사)
LNP/mRNA 용액 바이알을 실온에서 10분 동안 해동하고 5초간 볼텍싱한 후 4개의 바이알을 풀링하여 120 μg/mL로 스톡 2000 μL를 얻었다. 그런 다음 mRNA를 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다(7일차에 1 x 85 μL/마우스, 10일차에 1 x 40 μL/마우스).
판독값
EAE 점수를 판독값으로 사용하였다. 7일째부터 연구가 끝날 때까지 매일 동물능 채점하였다. 채점을 수행한 사람은 각 마우스의 처리 및 이전 점수를 모두 알지 못한다(맹검 채점). EAE는 0부터 5까지의 등급으로 채점하였다. 이 사이의 점수는 임상 징후가 정의된 아래 두 점수 사이에 속할 때 할당된다.
EAE 채점 기준
점수 임상 관찰
0 마우스의 운동 기능에 뚜렷한 변화가 없다.
꼬리를 잡아 올리면 때 꼬리가 팽팽해지고 똑바로 세워진다. 뒷다리는 대개 벌어진다. 마우스가 걸을 때 보행이나 머리 기울임이 관찰되지 않는다.
1 축 늘어진 꼬리.
마우스 꼬리를 잡아 올리면 똑바로 세우는 대신 꼬리 전체가 조작자의 손가락 위로 걸쳐진다.
2 꼬리가 축 늘어지고 뒷다리가 약해진다.
마우스 꼬리를 잡았을 때 다리는 벌려지지 않고 서로 밀착된다. 게다가, 뚜렷하게 흔들리는 걷는 모습을 보여준다.
삼 축 늘어진 꼬리와 뒷다리의 완전 마비(가장 흔함),
또는
앞다리 한쪽과 뒷다리 한쪽이 마비되고 축 늘어진 꼬리,
또는
다음 모두:
심한 머리 기울임,
케이지의 가장자리를 따라서만 걸음,
케이지 벽을 밀어 냄,
꼬리를 잡으면 회전.
4 꼬리가 축 늘어지고 뒷다리가 완전히 마비되고 앞다리가 부분적으로 마비된다.마우스는 케이지 주위를 최소한으로 움직이지만 경계심이 많고 먹이를 먹는다. 마우스가 2일 연속 4점을 기록하는 경우 안락사를 권장한다.
5 안락사 후, 마우스는 나머지 실험 동안 5점으로 채점된다.
통계 분석
곡선 아래 면적(AUC) 및 평균 최대 점수(MMS) 데이터를 처리 그룹과 비히클 그룹을 각각 비교하는 독립표본 t-검정(Unpaired t-test)을 수행하여 분석하였다. 유의미한 차이는 다음과 같다: * p <0.05, ** p <0.01.
결과
EAE 점수
모든 그룹에 대한 임상 EAE 판독값을 비히클 그룹과 비교하여 EAE 발생을 평가하였다. EAE 점수, AUC(곡선 아래 면적) 및 MMS(평균 최대 점수)가 도 1, 2 및 3에 표시되어 있다.
비히클 그룹(음성 대조군)의 마우스는 이 모델에 대해 예상된 범위 내에서 EAE를 발생시켰다. 이 그룹에서는 심각한 EAE로 인해 4마리의 마우스가 사망하였다.
IMCY-0189 m1ψ 또는 MOG35-55 m1ψ로 처리된 마우스 모두 질환 발병이 지연되었으며(도 1) EAE 점수에서 계산된 AUC가 통계적으로 유의하게 감소한 것으로 나타났다(도 2). 이들 그룹 각각에서 5마리의 마우스가 사망하였다. IMCY-0189 m1ψ 처리는 또한 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의미한 MMS 감소를 유도하였다. MOG35-55 m1ψ 처리는 통계적으로 유의미한 MMS 감소를 유도하지 못했다. 우리는 IMCY-0189 m1ψ이 마우스 EAE 치료에서 MOG35-55 m1ψ 보다 성능이 뛰어나다는 결론을 내렸다
SEQUENCE LISTING <110> IMCYSE SA <120> METHODS OF TREATING OR PREVENTING AUTOIMMUNE DISEASES <130> IMCY-032-PCT <150> EP21176003.8 <151> 2021-05-26 <160> 793 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Xaa Xaa Xaa Cys 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> C, S, or T <400> 2 Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys Ile 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Phe Leu Arg Val Pro Ser Trp Lys Ile 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Lys Lys Cys Cys 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Arg Arg Cys Cys 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 8 Arg Lys Cys Cys 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 9 Lys Arg Cys Cys 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 10 Lys Cys Xaa Cys 1 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 11 Lys Lys Cys Xaa Cys 1 5 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 12 Arg Cys Xaa Cys 1 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 13 Arg Arg Cys Xaa Cys 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 14 Arg Lys Cys Xaa Cys 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 15 Lys Arg Cys Xaa Cys 1 5 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 16 Lys Cys Lys Cys 1 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 17 Lys Lys Cys Lys Cys 1 5 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 18 Lys Cys Arg Cys 1 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 19 Lys Lys Cys Arg Cys 1 5 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 20 Arg Cys Arg Cys 1 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 21 Arg Arg Cys Arg Cys 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 22 Arg Lys Cys Lys Cys 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 23 Lys Arg Cys Lys Cys 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synhtetic peptide <400> 24 His Cys Pro Tyr Cys 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 25 Lys His Cys Pro Tyr Cys 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 26 Lys Cys Pro Tyr Cys 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 27 Arg Cys Pro Tyr Cys 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 28 His Cys Gly His Cys 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 29 Lys Cys Gly His Cys 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 30 Arg Cys Gly His Cys 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 31 Lys Lys Cys Pro Tyr Cys 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 32 Lys Arg Cys Pro Tyr Cys 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 33 Lys His Cys Gly His Cys 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 34 Lys Lys Cys Gly His Cys 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 35 Lys Arg Cys Gly His Cys 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 36 Cys Arg Pro Tyr Cys 1 5 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 37 Lys Cys Arg Pro Tyr Cys 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 38 Lys His Cys Arg Pro Tyr Cys 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 39 Arg Cys Arg Pro Tyr Cys 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 40 His Cys Arg Pro Tyr Cys 1 5 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 41 Cys Pro Arg Tyr Cys 1 5 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 42 Lys Cys Pro Arg Tyr Cys 1 5 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 43 Arg Cys Pro Arg Tyr Cys 1 5 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 44 His Cys Pro Arg Tyr Cys 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 45 Cys Pro Tyr Arg Cys 1 5 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 46 Lys Cys Pro Tyr Arg Cys 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 47 Arg Cys Pro Tyr Arg Cys 1 5 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 48 His Cys Pro Tyr Arg Cys 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 49 Cys Lys Pro Tyr Cys 1 5 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 50 Lys Cys Lys Pro Tyr Cys 1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 51 Arg Cys Lys Pro Tyr Cys 1 5 <210> 52 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 52 His Cys Lys Pro Tyr Cys 1 5 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 53 Cys Pro Lys Tyr Cys 1 5 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 54 Lys Cys Pro Lys Tyr Cys 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 55 Arg Cys Pro Lys Tyr Cys 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 56 His Cys Pro Lys Tyr Cys 1 5 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 57 Cys Pro Tyr Lys Cys 1 5 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 58 Lys Cys Pro Tyr Lys Cys 1 5 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 59 Arg Cys Pro Tyr Lys Cys 1 5 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 60 His Cys Pro Tyr Lys Cys 1 5 <210> 61 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 61 Leu Ala Val Leu 1 <210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 62 Thr Val Gln Ala 1 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 63 Gly Ala Val His 1 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 64 Xaa Ala Val Leu 1 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 65 Leu Xaa Val Leu 1 <210> 66 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 66 Leu Ala Xaa Leu 1 <210> 67 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 67 Leu Ala Val Xaa 1 <210> 68 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 68 Xaa Val Gln Ala 1 <210> 69 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 69 Thr Xaa Gln Ala 1 <210> 70 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 70 Thr Val Xaa Ala 1 <210> 71 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 71 Thr Val Gln Xaa 1 <210> 72 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 72 Xaa Ala Val His 1 <210> 73 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 73 Gly Xaa Val His 1 <210> 74 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 74 Gly Ala Xaa His 1 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 75 Gly Ala Val Xaa 1 <210> 76 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 76 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 77 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 78 Pro Ala Phe Pro Leu 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 79 Asp Gln Gly Gly Glu 1 5 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 80 Xaa Ala Phe Pro Leu 1 5 <210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 81 Pro Xaa Phe Pro Leu 1 5 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 82 Pro Ala Xaa Pro Leu 1 5 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 83 Pro Ala Phe Xaa Leu 1 5 <210> 84 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 84 Pro Ala Phe Pro Xaa 1 5 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 85 Xaa Gln Gly Gly Glu 1 5 <210> 86 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 86 Asp Xaa Gly Gly Glu 1 5 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 87 Asp Gln Xaa Gly Glu 1 5 <210> 88 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 88 Asp Gln Gly Xaa Glu 1 5 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 89 Asp Gln Gly Gly Xaa 1 5 <210> 90 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural amino acid <400> 90 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 91 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 91 Asp Ile Ala Asp Lys Tyr 1 5 <210> 92 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 92 Xaa Ile Ala Asp Lys Tyr 1 5 <210> 93 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 93 Asp Xaa Ala Asp Lys Tyr 1 5 <210> 94 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 94 Asp Ile Xaa Asp Lys Tyr 1 5 <210> 95 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 95 Asp Ile Ala Xaa Lys Tyr 1 5 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 96 Asp Ile Ala Asp Xaa Tyr 1 5 <210> 97 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (6)..(6) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 97 Asp Ile Ala Asp Lys Xaa 1 5 <210> 98 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 98 Cys Pro Tyr Cys 1 <210> 99 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 99 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 100 Cys Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 101 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 101 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 102 Cys Xaa Cys Cys Xaa Cys Cys Xaa Cys Cys 1 5 10 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> F, W, Y, H, or T <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> V, I, L, or M <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> F, W, Y, H, or T <400> 103 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> F, W, Y, or H <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> V, I, L, or M <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> F, W, Y, or H <400> 104 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> F, W, Y, or T <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> V, I, L, or M <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> F, W, Y, or T <400> 105 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> F, W, or Y <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> V, I, L, or M <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> F, W, or Y <400> 106 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> F, W, Y, or H <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> I, L, or M <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> F, W, Y, or H <400> 107 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> F, W, Y, H, or T <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> I, L, or M <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> F, W, Y, H, or T <400> 108 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> F, W, or Y <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> I, L, or M <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> F, W, or Y <400> 109 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 110 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> D or E <220> <221> misc_feature <222> (2)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (6)..(6) <223> L or I <400> 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 1 5 <210> 111 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 111 Asp Xaa Xaa Leu Leu 1 5 <210> 112 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 112 Asp Xaa Xaa Xaa Leu Leu 1 5 <210> 113 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> amino acid residues with a bulky hydrophobic side chain such as Phe, Tyr and Trp <400> 113 Tyr Xaa Xaa Xaa 1 <210> 114 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 114 Lys Cys His Cys 1 <210> 115 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 115 Lys Cys Lys Cys 1 <210> 116 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 116 Lys Cys Arg Cys 1 <210> 117 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 117 Lys Cys Gly Cys 1 <210> 118 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 118 Lys Cys Ala Cys 1 <210> 119 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 119 Lys Cys Val Cys 1 <210> 120 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 120 Lys Cys Leu Cys 1 <210> 121 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 121 Lys Cys Ile Cys 1 <210> 122 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 122 Lys Cys Met Cys 1 <210> 123 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 123 Lys Cys Phe Cys 1 <210> 124 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 124 Lys Cys Trp Cys 1 <210> 125 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 125 Lys Cys Pro Cys 1 <210> 126 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 126 Lys Cys Ser Cys 1 <210> 127 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 127 Lys Cys Thr Cys 1 <210> 128 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 128 Lys Cys Tyr Cys 1 <210> 129 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 129 Lys Cys Asn Cys 1 <210> 130 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 130 Lys Cys Gln Cys 1 <210> 131 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 131 Lys Cys Asp Cys 1 <210> 132 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 132 Lys Cys Glu Cys 1 <210> 133 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 133 His Cys His Cys 1 <210> 134 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 134 His Cys Lys Cys 1 <210> 135 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 135 His Cys Arg Cys 1 <210> 136 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 136 His Cys Gly Cys 1 <210> 137 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 137 His Cys Ala Cys 1 <210> 138 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 138 His Cys Val Cys 1 <210> 139 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 139 His Cys Leu Cys 1 <210> 140 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 140 His Cys Ile Cys 1 <210> 141 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 141 His Cys Met Cys 1 <210> 142 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 142 His Cys Phe Cys 1 <210> 143 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 143 His Cys Trp Cys 1 <210> 144 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 144 His Cys Pro Cys 1 <210> 145 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 145 His Cys Ser Cys 1 <210> 146 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 146 His Cys Thr Cys 1 <210> 147 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 147 His Cys Tyr Cys 1 <210> 148 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 148 His Cys Asn Cys 1 <210> 149 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 149 His Cys Gln Cys 1 <210> 150 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 150 His Cys Asp Cys 1 <210> 151 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 151 His Cys Glu Cys 1 <210> 152 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 152 Arg Cys His Cys 1 <210> 153 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 153 Arg Cys Lys Cys 1 <210> 154 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 154 Arg Cys Arg Cys 1 <210> 155 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 155 Arg Cys Gly Cys 1 <210> 156 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 156 Arg Cys Ala Cys 1 <210> 157 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 157 Arg Cys Val Cys 1 <210> 158 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 158 Arg Cys Leu Cys 1 <210> 159 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 159 Arg Cys Ile Cys 1 <210> 160 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 160 Arg Cys Met Cys 1 <210> 161 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 161 Arg Cys Phe Cys 1 <210> 162 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 162 Arg Cys Trp Cys 1 <210> 163 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 163 Arg Cys Pro Cys 1 <210> 164 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 164 Arg Cys Ser Cys 1 <210> 165 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 165 Arg Cys Thr Cys 1 <210> 166 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 166 Arg Cys Tyr Cys 1 <210> 167 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 167 Arg Cys Asn Cys 1 <210> 168 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 168 Arg Cys Gln Cys 1 <210> 169 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 169 Arg Cys Asp Cys 1 <210> 170 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 170 Arg Cys Glu Cys 1 <210> 171 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 171 Cys Xaa Xaa Cys 1 <210> 172 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 172 His Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 173 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 173 Lys His Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 174 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 174 Lys Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 175 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 175 Arg Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 176 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 176 His Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 177 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 177 Lys Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 178 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 178 Arg Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 179 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 179 Lys Lys Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 180 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 180 Lys Arg Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 181 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 181 Lys His Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 182 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 182 Lys Lys Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 183 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 183 Lys Arg Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 184 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, 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<400> 191 Cys Val Pro Tyr Cys 1 5 <210> 192 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 192 Cys Leu Pro Tyr Cys 1 5 <210> 193 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 193 Cys Ile Pro Tyr Cys 1 5 <210> 194 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 194 Cys Met Pro Tyr Cys 1 5 <210> 195 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 195 Cys Phe Pro Tyr Cys 1 5 <210> 196 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 196 Cys Trp Pro Tyr Cys 1 5 <210> 197 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 197 Cys Pro Pro Tyr Cys 1 5 <210> 198 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 198 Cys Ser Pro Tyr Cys 1 5 <210> 199 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 199 Cys Thr Pro Tyr Cys 1 5 <210> 200 <211> 5 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synthetic peptide <400> 617 Cys His Cys Pro Cys 1 5 <210> 618 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 618 Cys His Tyr Pro Cys 1 5 <210> 619 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 619 Cys His Asn Pro Cys 1 5 <210> 620 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 620 Cys His Gln Pro Cys 1 5 <210> 621 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 621 Cys His Asp Pro Cys 1 5 <210> 622 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 622 Cys His Glu Pro Cys 1 5 <210> 623 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 623 Cys His Leu Pro Cys 1 5 <210> 624 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 624 Cys His Pro Xaa Cys 1 5 <210> 625 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 625 Cys His Pro Lys Cys 1 5 <210> 626 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 626 Cys His Pro Arg Cys 1 5 <210> 627 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 627 Cys His Pro His Cys 1 5 <210> 628 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 628 Cys His Pro Gly Cys 1 5 <210> 629 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 629 Cys His Pro Ala Cys 1 5 <210> 630 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 630 Cys His Pro Val Cys 1 5 <210> 631 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 631 Cys His Pro Leu Cys 1 5 <210> 632 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 632 Cys His Pro Ile Cys 1 5 <210> 633 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 633 Cys His Pro Met Cys 1 5 <210> 634 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 634 Cys His Pro Phe Cys 1 5 <210> 635 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 635 Cys His Pro Trp Cys 1 5 <210> 636 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 636 Cys His Pro Pro Cys 1 5 <210> 637 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 637 Cys His Pro Ser Cys 1 5 <210> 638 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 638 Cys His Pro Thr Cys 1 5 <210> 639 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 639 Cys His Pro Cys Cys 1 5 <210> 640 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 640 Cys His Pro Tyr Cys 1 5 <210> 641 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 641 Cys His Pro Asn Cys 1 5 <210> 642 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 642 Cys His Pro Gln Cys 1 5 <210> 643 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 643 Cys His Pro Asp Cys 1 5 <210> 644 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 644 Cys His Pro Glu Cys 1 5 <210> 645 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 645 Cys His Pro Leu Cys 1 5 <210> 646 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 646 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 647 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 647 Cys Leu Ala Val Leu Cys 1 5 <210> 648 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 648 Cys Thr Val Gln Ala Cys 1 5 <210> 649 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 649 Cys Xaa Ala Val Leu Cys 1 5 <210> 650 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 650 Cys Leu Xaa Val Leu Cys 1 5 <210> 651 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 651 Cys Leu Ala Xaa Leu Cys 1 5 <210> 652 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 652 Cys Leu Ala Val Xaa Cys 1 5 <210> 653 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 653 Cys Xaa Val Gln Ala Cys 1 5 <210> 654 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 654 Cys Thr Xaa Gln Ala Cys 1 5 <210> 655 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 655 Cys Thr Val Xaa Ala Cys 1 5 <210> 656 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 656 Cys Thr Val Gln Xaa Cys 1 5 <210> 657 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 657 Cys Xaa Ala Val His Cys 1 5 <210> 658 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 658 Cys Gly Xaa Val His Cys 1 5 <210> 659 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 659 Cys Gly Ala Xaa His Cys 1 5 <210> 660 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 660 Cys Gly Ala Val Xaa Cys 1 5 <210> 661 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(6) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 661 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 662 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 662 Cys Pro Ala Phe Pro Leu Cys 1 5 <210> 663 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 663 Cys Asp Gln Gly Gly Glu Cys 1 5 <210> 664 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 664 Cys Xaa Ala Phe Pro Leu Cys 1 5 <210> 665 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 665 Cys Pro Xaa Phe Pro Leu Cys 1 5 <210> 666 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 666 Cys Pro Ala Xaa Pro Leu Cys 1 5 <210> 667 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 667 Cys Pro Ala Phe Xaa Leu Cys 1 5 <210> 668 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 668 Cys Pro Ala Phe Pro Xaa Cys 1 5 <210> 669 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 669 Cys Xaa Gln Gly Gly Glu Cys 1 5 <210> 670 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 670 Cys Asp Xaa Gly Gly Glu Cys 1 5 <210> 671 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 671 Cys Asp Gln Xaa Gly Glu Cys 1 5 <210> 672 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 672 Cys Asp Gln Gly Xaa Glu Cys 1 5 <210> 673 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (6)..(6) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 673 Cys Asp Gln Gly Gly Xaa Cys 1 5 <210> 674 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(7) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 674 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 675 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 675 Cys Asp Ile Ala Asp Lys Tyr Cys 1 5 <210> 676 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 676 Cys Xaa Ile Ala Asp Lys Tyr Cys 1 5 <210> 677 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 677 Cys Asp Xaa Ala Asp Lys Tyr Cys 1 5 <210> 678 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 678 Cys Asp Ile Xaa Asp Lys Tyr Cys 1 5 <210> 679 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 679 Cys Asp Ile Ala Xaa Lys Tyr Cys 1 5 <210> 680 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (6)..(6) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 680 Cys Asp Ile Ala Asp Xaa Tyr Cys 1 5 <210> 681 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, and H, or non-natural basic amino acid <400> 681 Cys Asp Ile Ala Asp Lys Xaa Cys 1 5 <210> 682 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 682 Cys Gly Ala Val His Cys 1 5 <210> 683 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> K, H, or R <400> 683 Cys Xaa Cys 1 <210> 684 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> K, H, or R <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 684 Cys Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 685 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial 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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 730 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 731 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (3)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 731 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 732 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (3)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 732 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 733 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino 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(3)..(3) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (4)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 736 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 737 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (4)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 737 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 738 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (3)..(3) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (4)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 738 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 739 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> 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group <220> <221> misc_feature <222> (2)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> C, S, or T <400> 778 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 779 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> C that is modified with an acetyl, methyl, ethyl or propionyl group <220> <221> misc_feature <222> (2)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (8)..(8) <223> C, S, or T <400> 779 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 780 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> C that is modified with an acetyl, methyl, ethyl, or propionyl group <400> 780 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 781 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (2)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> C that is modified with an acetyl, methyl, ethyl, or propionyl group <400> 781 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 782 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (2)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (6)..(6) <223> C that is modified with an acetyl, methyl, ethyl, or propionyl group <400> 782 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 783 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (2)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> C that is modified with an acetyl, methyl, ethyl, or propionyl group <400> 783 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 784 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1) <223> C, S, or T <220> <221> misc_feature <222> (2)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (8)..(8) <223> C that is modified with an acetyl, methyl, ethyl, or propionyl group <400> 784 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 785 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (4)..(4) <223> C, S, or T and modified with an acetyl, methyl, ethyl, or propionyl group <400> 785 Cys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 786 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> C, S, or T and modified with an acetyl, methyl, ethyl, or propionyl group <400> 786 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 787 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (6)..(6) <223> C, S, or T and modified with an acetyl, methyl, ethyl, or propionyl group <400> 787 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 788 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> C, S, or T and modified with an acetyl, methyl, ethyl, or propionyl group <400> 788 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 789 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> PEPTIDE <222> (8)..(8) <223> C, S, or T and modified with an acetyl, methyl, ethyl, or propionyl group <400> 789 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 790 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic mRNA <400> 790 atgcactgtc cctattgcag cctgcagccc ttggccctgg aggggtccct gcagaagcgt 60 ggc 63 <210> 791 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 791 Met His Cys Pro Tyr Cys Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser 1 5 10 15 Leu Gln Lys Arg Gly 20 <210> 792 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic mRNA <400> 792 atgaagcact gtccctattg cgtgaggtac tttctgaggg tgcccagctg gaagataacc 60 ctgtttaaaa ag 72 <210> 793 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 793 Met Lys His Cys Pro Tyr Cys Val Arg Tyr Phe Leu Arg Val Pro Ser 1 5 10 15 Trp Lys Ile Thr Leu Phe Lys Lys 20

Claims (28)

  1. 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA로서, 상기 펩티드는 다음을 포함하는 비면역원성 RNA:
    a) 산화환원효소 모티프(oxidoreductase motif);
    b) 항원성 단백질의 T 세포 에피토프; 및
    c) a)와 b) 사이의 0 내지 7개 아미노산, 바람직하게는 0 내지 4개 아미노산의 링커;
    여기서 상기 산화환원효소 모티프 a)는 하기 일반 구조를 갖고:
    [CST]XXC- 또는 CXX[CST]- (서열 번호 1 또는 2)
    상기 구조에서,
    X는 임의의 아미노산이고;
    [CST]는 단일 세린, 트레오닌 또는 시스테인 잔기를 나타내고;
    상기 산화환원효소 모티프에서의 하이픈(-)은 산화환원효소 모티프가 링커 또는 T 세포 에피토프의 N-말단 끝, 또는 링커 또는 T 세포 에피토프의 C-말단 끝에 부착되는 지점을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 인코딩된 펩티드의 첫 번째 아미노산은 메티오닌인 비면역원성 RNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드의 도입 및 dsRNA의 제거에 의해 비면역원성으로 되는 비면역원성 RNA.
  4. 제3항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드로 하나 이상의 우리딘의 대체를 포함하고, 바람직하게는 상기 변형된 핵염기는 변형된 우라실인 비면역원성 RNA.
  5. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드는 3-메틸-우리딘 (m3U), 5-메톡시-우리딘 (mo5U), 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘 (s2U), 4-티오-우리딘 (s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘 (ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘 (예를 들어, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산 (cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르 (mcmo5U), 5-카복시메틸-우리딘 (cm5U), 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 (chm5U), 5-카복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르 (mchm5U), 5-메톡시카보닐메틸-우리딘 (mcm5U), 5-메톡시카보닐메틸-2-티오-우리딘 (mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘 (nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘 (mnm5U), 1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘 (mnm5se2U), 5-카바모일메틸-우리딘 (ncm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-우리딘 (cmnm5U), 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘 (cmnm5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘 (τm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘 (τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘, 5-메틸-2-티오-우리딘 (m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘 (m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘 (m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘 (D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘 (m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N(1)-메틸-슈도우리딘 (m1ψ), 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘 (acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카복시프로필)슈도우리딘 (acp3 ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘 (inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘 (inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘 (Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘 (m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘 (ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘 (s2Um), 5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘 (mcm5Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘 (ncm5Um), 5-카복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘 (cmnm5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘 (m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘 (inm5Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-ara-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-ara-우리딘, 5-(2-카보메톡시비닐)우리딘, 및 5-[3-(1-E- 프로페닐아미노)우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드는 슈도우리딘 (ψ), N(1)-메틸-슈도우리딘 (m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘 (m5U)인 비면역원성 RNA.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드는 N(1)-메틸-슈도우리딘 (m1ψ)인 비면역원성 RNA.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 비면역원성 RNA는 전달 비히클에 제형화되고, 바람직하게는 여기서 전달 비히클은 입자, 지질 또는 양이온성 지질을 포함하는 비면역원성 RNA.
  8. 제7항에 있어서, 지질은 비면역원성 RNA와 복합체를 형성하고/하거나 이를 캡슐화하거나, 또는 비면역 원성 RNA는 리포솜에 제형화되는 비면역원성 RNA.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화환원효소 모티프는 서열 번호 24 내지 35 중 어느 하나로 정의된 서열을 포함하는 비면역원성 RNA.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 9 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 9 내지 30개 아미노산 길이를 갖는 면역원성 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 펩티드에서의 산화환원효소 모티프는 상기 항원성 단백질에서의 T 세포 에피토프의 N-말단 또는 C-말단의 11개 아미노산 영역 내의 아미노산 서열에서 자연적으로 발생하지 않고/거나, 상기 T-세포 에피토프는 그의 아미노산 서열에 상기 산화환원효소 모티프를 자연적으로 포함하지 않는 비면역원성 RNA.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프는 7 내지 25개 아미노산, 바람직하게는 9 내지 25개 아미노산 길이를 갖는 MHC 클래스 II T 세포 에피토프이거나; 또는 펩티드 중의 상기 T 세포 에피토프는 7 내지 25개 아미노산 길이를 갖는 NKT 세포 에피토프인 비면역원성 RNA.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 비면역원성 RNA 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 대상체에서 자가면역 질환, 세포내 병원체로의 감염, 종양, 동종이식 거부반응, 또는 가용성 동종인자(soluble allofactor), 알레르겐(allergen) 노출 또는 유전자 치료 또는 유전자 예방접종에 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응으로부터 선택되는 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 비면역원성 RNA 또는 제13항에 따른 약학적 조성물.
  15. 대상체에서 자가면역 질환, 세포내 병원체로의 감염, 종양, 동종이식 거부반응, 또는 가용성 동종인자, 알레르겐 노출 또는 유전자 치료 또는 유전자 예방접종에 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응으로부터 선택되는 질환 또는 상태를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 비면역원성 RNA 또는 제13항에 따른 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 대상체에서 자가면역 질환, 세포내 병원체로의 감염, 종양, 동종이식 거부반응, 또는 가용성 동종인자, 알레르겐 노출 또는 유전자 치료 또는 유전자 예방접종에 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응으로부터 선택되는 질환 또는 상태를 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 비면역원성 RNA 또는 제13항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  17. 대상체에서 세포용해성 CD4+ T 세포를 유도하는 방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 인코딩하는 비면역원성 RNA 또는 제13항에 따른 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  18. 대상체에서 세포용해성 CD4+ T 세포를 유도하기 위한 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 비면역원성 RNA 또는 제13항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  19. 대상체는 자가면역 질환을 앓고 있는 제15항 또는 제17항의 방법, 또는 제16항 또는 제18항에 따른 용도.
  20. 제19항에 있어서, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병(T1D), 다발성 경화증(MS) 또는 시신경척수염(NMO)과 같은 탈수초성 장애, 또는 류마티스 관절염(RA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법 또는 용도.
  21. 제19항에 있어서, 상기 항원성 단백질은 (프로)인슐린, GAD65, GAD67, IA-2(ICA512), IA-2(베타/포그린), IGRP, 크로모그라닌, ZnT8 및 HSP-60으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 자가면역 질환은 제1형 당뇨병(T1D)인 방법 또는 용도.
  22. 제19항에 있어서, 상기 항원성 단백질은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG), 미엘린 염기성 단백질(MBP), 프로테오리피드 단백질(PLP), 미엘린-희소돌기아교세포 염기성 단백질(MOBP) 및 희소돌기아교세포 특이적 단백질(OSP)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 상기 자가면역 질환은 다발성 경화증(MS) 및/또는 시신경척수염(NMO)인 방법 또는 용도.
  23. 제19항에 있어서, 상기 항원성 단백질은 GRP78, HSP60, 60 kDa 샤페로닌 2, 겔솔린, 치티나제-3-유사 단백질 1, 카텝신 S, 혈청 알부민, 및 카텝신 D로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염(RA)인 방법 또는 용도.
  24. 상기 항원성 단백질은 종양 또는 암 항원, 예컨대 종양유전자, 원발암유전자, 바이러스 단백질, 생존 인자 또는 클론타입 또는 이디오타입 결정인자이고, 상기 질환은 암인 제15항 또는 제17항의 방법, 또는 제16항 또는 제18항에 따른 용도.
  25. 제22항에 있어서, 상기 비면역원성 RNA는 MOG의 T 세포 에피토프, 보다 바람직하게는 MHC 클래스 II T 세포 에피토프 YRSPFSRVV(서열 번호 704), FLRVPCWKI(서열 번호 4) 또는 FLRVPSWKI(서열 번호 5)를 포함하는 펩티드를 인코딩하는 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 비면역원성 RNA는 서열 번호 778로 정의되는 방법.
  27. 제22항에 있어서, 상기 비면역원성 RNA에 의해 인코딩된 펩티드는 서열 번호 777 또는 707로 정의되는 방법.
  28. 제21항에 있어서, 상기 비면역원성 RNA는 인슐린의 T 세포 에피토프, 바람직하게는 MHC 클래스 II T 세포 에피토프 LALEGSLQK (서열 번호 3)를 포함하는 펩티드를 인코딩하는 방법.
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