ES2974646T3 - Complejos peptídicos HLA-DR/CII para el tratamiento de la artritis - Google Patents

Complejos peptídicos HLA-DR/CII para el tratamiento de la artritis Download PDF

Info

Publication number
ES2974646T3
ES2974646T3 ES20750298T ES20750298T ES2974646T3 ES 2974646 T3 ES2974646 T3 ES 2974646T3 ES 20750298 T ES20750298 T ES 20750298T ES 20750298 T ES20750298 T ES 20750298T ES 2974646 T3 ES2974646 T3 ES 2974646T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cii
peptide
hla
hydroxylysine
domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES20750298T
Other languages
English (en)
Inventor
Nhu-Nguyen Do
Vilma Urbonaviciute
Sylvia Cienciala
Prof Rikard Holmdahl
Harald Burkhardt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Application granted granted Critical
Publication of ES2974646T3 publication Critical patent/ES2974646T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6435—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a connective tissue peptide, e.g. collagen, fibronectin or gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/605—MHC molecules or ligands thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

[145] La presente invención se refiere a complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden un péptido de unión a condroitina en el extremo C-terminal del polipéptido que comprende la cadena alfa de H LA-DR y/o la cadena beta de H LA-DR, en donde el Cll El péptido se fusiona al extremo N de la cadena alfa de H LA-DR o la cadena beta de H LA-DR mediante un péptido conector, para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, tales como artritis, en pacientes humanos. Las lisinas en el péptido Cll, particularmente la primera lisina en el péptido Cll, pueden modificarse postraduccionalmente. La invención se refiere además a métodos para producir dichos complejos peptídicos HLA-DR/CII en células de mamíferos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Complejos peptídicos HLA-DR/CII para el tratamiento de la artritis
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden un péptido de unión a condroitina en el extremo C-terminal del polipéptido que comprende la cadena alfa de HLA-DR y/o la cadena beta de HLA-DR, en donde el péptido CII se une al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, tales como artritis, en pacientes humanos. Las lisinas en el péptido CII, particularmente la primera lisina en el péptido CII, pueden modificarse post-traduccionalmente. La invención se refiere además a métodos para producir dichos complejos peptídicos HLA-DR/CII en células de mamíferos.
ANTECEDENTES TECNOLÓGICOS
La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad común y grave que representa un importante problema de salud con entre 4 y 7 millones de personas afectadas en Europa. Es provocada por una inflamación autoinmune anormal de las articulaciones asociada con dolor, destrucción progresiva de cartílago y hueso que conduce a discapacidad funcional y, en última instancia, inmovilidad/invalidez si no se trata adecuadamente. El tratamiento farmacéutico actual se inicia inmediatamente después del establecimiento del diagnóstico clínico y es eficaz en el 60-70% de los casos, pero no logra la curación de la enfermedad. El tratamiento con fármacos se dirige predominantemente a las vías efectoras comunes de la inflamación, provocando así amplios efectos inmunosupresores asociados con un mayor riesgo de infección.
La inmunogenética de la RA sugiere un papel clave para las vías anormales de activación de las células T en el inicio y/o la perpetuación de la enfermedad. En el proceso de activación de las células T, las células T CD4+ son comprimidas por fragmentos de péptidos antigénicos que forman complejos con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II (tal como el antígeno leucocitario humano - isotipo DR (HLA-DR)), lo que conduce a su activación en el contexto de señales co-estimuladoras proporcionadas por células presentadoras de antígenos profesionales. La evidencia más sólida que respalda el papel de las células T CD4+ en la patogénesis de la enfermedad es la asociación genética entre la RA y ciertos alelos del locus HLA-DRB1 que codifican un motivo de consenso de aminoácidos Q/R R/K R A A en la cadena beta del bolsillo de unión del péptido de la molécula HLA-DR de MHC de clase II (posición del aminoácido 70-74, el llamado "epítopo compartido") (Gregersen PK et al., Arthritis Rheum. 1987;30:1205-1213). La evidencia convincente de un papel patogénico de las células T en la RA la proporciona además su frecuente detectabilidad en infiltrados sinoviales inflamatorios de enfermedades de moderadas a graves, lo que indica su colaboración con las células B en reacciones inmunes locales para promover la maduración de respuestas de autoanticuerpos específicos. Además, se ha sugerido que una función alterada de las células T reguladoras (Treg) CD4+CD25(hi) está implicada en la patogénesis de la RA. En consecuencia, el compartimento de células T crónicamente activado y desregulado en la RA representa un objetivo clave para la intervención inmunomoduladora terapéutica.
Hoy en día se cree que la RA comienza muchos años antes del inicio clínico. La RA como enfermedad poligenética con los alelos que codifican el epítopo compartido mencionado anteriormente en el locus HLA-DRB1 como el factor de riesgo más importante, se desarrolla en individuos respectivamente predispuestos. Sin embargo, factores ambientales y/o de estilo de vida aún mal definidos (tabaquismo) también están implicados en el desencadenamiento de una respuesta autoinmune asociada con la generación de anticuerpos contra IgG (factores reumatoides) y contra proteínas citrulinadas (ACPA) que pueden persistir en individuos propensos a la artritis, pero todavía sanos durante un período preclínico de hasta dos décadas. Alrededor del inicio clínico, es detectable una respuesta inmune al colágeno tipo II (CII) y al CII citrulinado (Burkhardt H et al., Eur J Immunol. 2005; 35:1643-52). CII es el principal componente proteico en el cartílago articular. Se ha demostrado que los pacientes con RA que llevan el alelo DRB1*0401 (50% de los pacientes con RA caucásicos) albergan células T en su repertorio que responden específicamente a un epítopo principal de CII correspondiente a la secuencia de aminoácidos 259-273 de la región CII triple helicoidal. Se ha descrito que el determinante de células T crítico para la activación del receptor de células T (TCR) depende del residuo de hidroxilisina fisiológicamente galactosilado en la posición 264 (Baecklund J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99:9960-5). Sin embargo, en humanos esta dependencia puede ser menos estricta en comparación con los modelos de ratón establecidos y las células T autorreactivas que reconocen el péptido CII desnudo, no modificado post-traduccionalmente y el péptido CII modificado post-traduccionalmente parecen ser detectables en una mayor medida relativa en pacientes humanos con RA en comparación con ratones inmunizados con Cll.
El modelo animal más comúnmente utilizado para la RA es la artritis inducida por colágeno (CIA) en ratones. La artritis experimental depende de MHC de clase II, asociada con el alelo murino de clase II Aq y depende del reconocimiento por parte de las células T del epítopo CII galactosilado 259-273 (Holmdahl R. et al. Ageing Res Rev. 2002;1: 135-47). CIA se utiliza como un modelo estándar para probar la eficacia terapéutica de nuevos compuestos con potencial antiartrítico en el desarrollo de fármacos. Por lo tanto, se han desarrollado diversos protocolos para inducir la tolerancia específica al antígeno y uno de los antígenos candidatos para prevenir y curar la artritis mediante vacunación ha sido el Cll. El protocolo más eficaz en ratones adultos, y hasta ahora sin efectos secundarios observables, es inducir tolerancia mediante inyección intravenosa de un complejo proteico recombinante que consiste en los dominios extracelulares de la molécula Aq del MHC de clase II con el péptido principal del antígeno Cll en el bolsillo de unión, es decir, el péptido CII259-273 galactosilado, o el complejo Aq/galCII (Dzhambazov B et al. J Immunol 2006; 176: 1525-1533). La inyección del complejo Aq/galCII después de la inmunización con Cll, pero antes de la aparición de la artritis, condujo a una prevención casi completa del desarrollo de la artritis y el tratamiento de ratones con artritis recurrente crónica condujo a una regulación posterior de la actividad inflamatoria. El efecto tolerogénico de Aq/galCII fue dominante ya que su potencial antiartrítico podía transferirse con células T de ratones tratados a receptores nativos.
Los complejos de Aq que contienen el péptido CII sin galactosilación en la posición 264 permanecieron sin efecto. La razón de este efecto regulador notablemente selectivo probablemente esté relacionada con el hecho de que el CII galactosilado se expresa sólo en el cartílago (Baecklund J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99:9960-5) mientras que el CII no glicosilado se expresa también en el timo (Chin R. K., et al., J Immunol. 2006;177: 290-7). Por lo tanto, la respuesta de las células T al CII no glicosiladas está regulada por la tolerancia central, mientras que la respuesta de las células T al antígeno galactosilado está regulada por mecanismos de tolerancia periférica. Por lo tanto, se ha sugerido una alteración de la autotolerancia periférica fisiológica, especialmente hacia los componentes estructurales de las articulaciones diartrodiales, como una fuerza impulsora importante en la patogénesis de la RA y su restablecimiento es la justificación para el desarrollo de una estrategia de tratamiento tolerogénico. Este enfoque consiste en la administración parenteral de complejos DR4/CII a pacientes con RA humanos seleccionados con biomarcadores identificados como portadores del alelo DRB1 *0401 mediante genotipado previo para inducir células T reguladoras inmunes que regulan posteriormente las respuestas de las células T artritogénicas mediante la supresión de los espectadores. A diferencia de los enfoques de tratamiento convencionales, el mecanismo de acción consiste en una inmunomodulación selectiva de las respuestas inmunes adaptativas artritogénicas dejando la inmunidad protectora intacta. Es un enfoque de tratamiento personalizado o restringido a HLA que se limita a pacientes con un determinado alelo de HLA, tal como los pacientes DRB1*0401 positivos. Además, los datos preclínicos en el tratamiento con CIA sugieren que el complejo DR4/galCII tiene el potencial para lograr un efecto terapéutico en la RA establecida, así como un efecto profiláctico en individuos con riesgo de desarrollar RA, es decir, antes de la manifestación de la enfermedad. En consecuencia, el modo de acción es fundamentalmente diferente de las terapias ya establecidas en la RA.
El documento de Patente WO2007/058587 A1 se refiere a un "compuesto que comprende un péptido autoantigénico y un vehículo con un motivo de unión a MHC" y describe un compuesto que comprende (a) un péptido y (b) un vehículo, en donde dicho péptido tiene al menos el motivo X-X-X-X-X-X-X y en donde al menos un resto de aminoácido X está glicosilado. Además, el péptido está unido a la proteína de unión al péptido y dicho vehículo comprende al menos un motivo de unión a MHC, en donde la unión puede ser covalente. Sin embargo, el péptido no se expresa junto con la proteína MHC II mediante la misma célula huésped o se une a la proteína MHC II mediante un péptido enlazador.
La evidencia más reciente respalda que en humanos también los complejos peptídicos MHC II/CII sin modificaciones post-traduccionales pueden ser activos para inducir tolerancia. Por lo tanto, aunque la modificación post-traduccional de la lisina en el péptido CII probablemente también sea ventajosa en humanos, puede que no sea estrictamente necesaria.
Se han preparado regularmente complejos MHC II que llevan una etiqueta de polihistidina para simplificar la purificación del complejo (por ejemplo, documento de Patente US 2010/168390 A1). Las etiquetas de polihistidina son etiquetas de afinidad que se utilizan como herramientas para la purificación de proteínas que permiten la purificación de prácticamente cualquier proteína sin ningún conocimiento previo de sus propiedades bioquímicas. Sin embargo, para aplicaciones terapéuticas, la etiqueta normalmente debe eliminarse de la proteína de fusión, por ejemplo, utilizando proteasas y un sitio de escisión. Por lo tanto, hasta donde sabemos, no se ha asociado ningún efecto con la etiqueta de polihistidina en el complejo peptídico MHC II/CII como un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas en humanos.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, se refiere a una composición que comprende complejos peptídicos HLA-Dr /CII recombinantes que comprenden (a) una región extracelular de una cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1; (b) una región extracelular de una cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1; y (c) un péptido de colágeno II (péptido CII), opcionalmente unido al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o a la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, en donde el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en AGFKGEQGPKG, AGFKGEQGPXG, AGFKGEXGPKG, AGFKGXQGPKG, AGFKXEQGPKG, AGFKGEXGPXG, AGFKGXQGPXG y AGFKXEQGPXG, y en donde los complejos peptídicos HLA-DR/CII comprenden un péptido de unión a condroitina en el extremo C-terminal del polipéptido que comprende la cadena alfa de HLA-DR y/o la cadena beta de HLA-DR, para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas en pacientes humanos, particularmente enfermedad inflamatoria crónica de las articulaciones y/o artritis. Preferiblemente, la composición para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriásica, espondiloartritis axial no radiográfica, espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil, policondritis recurrente, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Lyme, enfermedades de Meniere, enfermedad autoinmune del oído interno (AIED) o enfermedad de Still.
En determinadas realizaciones, el péptido de unión a condroitina está en su forma libre. Esto significa que los complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes no se multimerizan a través del péptido de unión a condroitina en la composición y/o los complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes no se unen a otra molécula a través del péptido de unión a condroitina en la composición. El péptido de unión a condroitina puede comprender de 5 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 6 a 12 aminoácidos. En una realización, el péptido de unión a condroitina es una etiqueta de polihistidina, preferiblemente al menos una etiqueta de hexahistidina.
En determinadas realizaciones, la región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR comprende un dominio alfa 1 y un dominio alfa 2; y/o la región extracelular de la cadena beta de HLA-DR comprende un dominio beta 1 y un dominio beta 2. En otra realización o además, el péptido CII se une al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente a la cadena beta de HLA-DR. En determinadas realizaciones, el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos de AGFKGEQGPKG, AGFKGEQGPX1G, AGFKGEX2GPKG, AGFKGX3QGPKG, AGFKX4EQGPKG, AGFKGEX2GPX1G, AGFKGX3QGPX1G y AGFKX4EQGPX1G, en donde X1 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinogénicos excepto K, preferiblemente R, A, G o Q, más preferiblemente R; X2 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinogénicos excepto Q; preferiblemente A, R, H o G; X3 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinógenos excepto E, preferiblemente A, D, Q o G; y X4 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinógenos excepto G, más preferiblemente A, S, V o L. Preferiblemente X2, X3 o X4 no son K. En determinadas realizaciones el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos de AGFKGEQGPKG o AGFKGEQGPX1G, preferiblemente de AGFKGEQGPKGEP o AGFKGEQGPX1GEP, más preferiblemente de GIAGFKGEQGPKGEP o GIAGFKGEQGPX1GEP.
En la composición para su uso según la invención, al menos el dominio alfa 1 es preferiblemente de DRA*0101 y al menos el dominio beta 1 es de un alelo de HLA-DR seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*0408, DRB1*0409, DRB1*0101, DRB1 *0102, DRB1*1001, DRB1*1402 y DRB1*1303, preferiblemente DRB1*0401.
La región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1; y la región extracelular de la cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1 pueden expresarse como un único polipéptido de fusión; y opcionalmente el péptido de colágeno II (péptido Cll) se une con el extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente a la cadena beta de HLA-DR. Alternativamente, las cadenas alfa y beta pueden expresarse como polinucleótidos separados, en donde el complejo HLA-DR comprende un primer polipéptido que comprende la región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1; un segundo polipéptido que comprende la región extracelular de la cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1; y el péptido de colágeno II (péptido CII), opcionalmente unido al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente a la cadena beta de HLA-DR; y en donde la cadena alfa de HLA-DR se une en su extremo C-terminal a un primer dominio funcional de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina y la cadena beta de HLA-DR se une en su extremo C-terminal a un segundo dominio funcional complementario de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina. El primer y/o segundo dominio funcional de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina está seguido además por el péptido de unión a condroitina. El primer dominio funcional y el segundo dominio funcional complementario pueden ser un dominio de heterodimerización de cremallera de leucina ácido y básico, preferiblemente un motivo de cremallera de leucina jun-fos.
Los complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes comprendidos en la composición para su uso según la invención pueden comprender péptidos CII con restos de lisina no modificados y/o uno o más modificados posttraduccionalmente. En una realización, los péptidos CII consisten en péptidos CII con restos de lisina no modificados, los péptidos CII consisten en péptidos CII siendo la primera lisina hidroxilisina (Hyl), los péptidos CII consisten en péptidos CII siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina, o los péptidos CII consisten en péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina. En otra realización, los péptidos CII comprenden péptidos CII, siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina; los péptidos CII comprenden péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina; los péptidos CII comprenden péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina galactosilhidroxilisina y/o hidroxilisina (Hyl); o los péptidos CII comprenden péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina hidroxilisina O-glicosilada y/o hidroxilisina (Hyl). La segunda lisina opcional en el péptido CII modificado post-traduccionalmente puede ser no modificada, hidroxilisina, galactosa-hidroxilisina y/o glucosil-galactosil-hidroxilisina; preferiblemente no modificada, hidroxilisina, galactosa-hidroxilisina, más preferiblemente no modificada. En una realización preferida, la composición no contiene complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprendan péptidos CII con una modificación de glucosil-galactosil-hidroxilisina.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIGURA 1: Dibujo esquemático de un complejo peptídico HLA-DR/CII. Molécula de MHC II con un péptido CII259-273 unido covalentemente. BirA: sitio de biotinilación, HIS: etiqueta de poli (6x) histidina, JUN/FOS: dominios complementarios de una cremallera de leucina (dominio de heterodimerización), TEV: sitio de escisión de cisteína proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV), Enlazador: péptido enlazador Gly-Ser, sitio de escisión de trombina, etiqueta de estreptavidina, péptido CII 259-273.
FIGURA 2: Secreción de IL-2 (FU) de clones de hibridoma de células T restringidos por Aq en respuesta a complejos Aq/rCII(259-273) (recobinante, Aq/rCII glicosiladoin situ)producido en células HEK293 (arriba), células de insecto S2 (centro) y estimulación con anticuerpos anti-CD3 (abajo). Los clones de hibridoma de células T de ratón usados tienen las siguientes especificidades: HCQ3 (CII, Gal-HK264), HCQ.4 (CII, no modificado y HK264), HCQ.11 (Glc-Gal-HK264), HM1R.2 (CII, Gal-HK264 y Gal-HK264+270), HP3 (péptido de pepsina restringido por Aq), en donde K es la abreviatura para lisina y HK es la abreviatura para hidroxilisina.
FIGURA 3: Vacunación terapéutica utilizando Aq/rCII glicosiladoin situproducido en células HEK 293 en un modelo de CIA de ratón. A) curva dosis-respuesta: Se inmunizaron ratones nativos con CII para inducir artritis y recibieron una inmunización de refuerzo el día 35. Los ratones se trataron con diferentes dosis del complejo peptídico HLA-DR/CII: 10, 50 o 100 |jg (n = 9). El número de ratones artríticos es significativamente menor en el grupo de tratamiento de 100 |jg en comparación con el control (p < 0,05, chi-cuadrado). B) Para administrar el complejo peptídico HLA-DR/ClI, se implantaron bombas osmóticas 7 días después de la inmunización de refuerzo el día 35 para garantizar una administración continua de la vacuna (por ejemplo, 100 jg : 15 jg/24 h durante 7 días).
FIGURA 4: Activación del hibridoma de células T humanas restrictiva de la glicosilación. Las células de hibridoma de células T humanas se activan tras la estimulación con el complejo peptídico HLA-DR/CII humano (DR4/hCll) de una manera específica de antígeno. El reconocimiento del hibridoma de células T humanas mDR1.1 y 3H8 depende del perfil de glicosilación del péptido CII. A) El clon del hibridoma de células T mDR1.1 se activa mediante K264 galactosilado presentado por HLA-DR4; B) mientras que el clon del hibridoma de células T 3H8 se activa mediante el epítopo CII no modificado presentado por HLA-DR4. La reactividad de los dos clones de hibridoma de células T diferentes se comparó utilizando complejos peptídicos HLA-DR/CII humanos cargados con péptido CII galactosilado sintético o no modificado (DR4/gaICII y DR4/nCll, respectivamente) y con el complejo peptídico HLA-DR/nCll glicosilado de forma natural (DR4/hCll). La secreción de iL-2 se midió mediante ELISA.
FIGURA 5: Detección de células T específicas de antígeno en la sangre periférica de pacientes con HLA-DRB1*0401 con artritis reumatoide. A) Los complejos peptídicos DR4/galCII biotinilados se incubaron con estreptavidina conjugada con fluorocromo (PE, APC). Estos tetrámeros se usaron para detectar células T específicas para el péptido ClI259-273 con galactosilación en K264. Se detectaron células T específicas de antígeno (CII259-273, K264gal) en PBMCs de pacientes con RA y donantes sanos mediante citometría de flujo. B) Comparación de la frecuencia de células T específicas de antígeno utilizando tetrámeros peptídicos DR4/galClI, tetrámeros peptídicos DR4/nCII o tetrámeros peptídicos DR4/hCll para la detección. La frecuencia de células T tetrámero positivas dentro de la población de células T CD4+ se midió mediante citometría de flujo.
FIGURA 6 : Activación de células T humanas. Detección de células T específicas de antígeno en la sangre periférica de pacientes con RA HLA-DRB1*0401. Las células T se activan en galCII y, en menor medida, mediante la estimulación del péptido CII no modificado. La regulación anterior de CD154 se midió mediante citometría de flujo (significación: valor p = 0,0332, prueba de Mann-Whitney).
FIGURA 7: análisis de Legendplex™ de la liberación de citocinas por PBMCs de pacientes con AR HLA-DRB1*0401 positivos (n=20) estimuladosin vitro.Se muestra la inducción específica de la liberación de IL-2, IL-17f, IFN-yIL-10, IL-17a y TNF-a mediante estimulaciónin vitrocon el complejo peptídico DR4/nCII o complejo peptídico DR4/galCII en comparación con la estimulación con condiciones de diferenciación de células TR1 estándar (TR1 ) y control negativo (CO).
FIGURA 8 : Comparación de complejos con y sin etiqueta de His. (A) ELISA que compara la eficacia de recubrimiento de los pocillos de microtitulación mediante soluciones equimolares de DR4/nCII versus complejos DR4/nCII escindidos por Tev utilizando un anticuerpo específico de DR4 y un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa. Se muestra la absorción a 405 nm a la concentración de proteína indicada de las soluciones de DR4/nCII utilizadas para recubrir las placas de microtitulación [pg/ml]. (B) Activación de células de hibridoma 3H8 mediante complejos DR4/nCII frente a complejos DR4/nCII escindidos por Tev recubiertos previamente con pocillos de microtitulación en las concentraciones indicadas. Se muestran las concentraciones de IL-2 en el sobrenadante después de la activación a la concentración de proteína indicada de las soluciones de DR4/nCII utilizadas para recubrir las placas de microtitulación [pg/ml].
FIGURA 9: Impacto de la etiqueta de His en los complejos peptídicos DR4/hCll y su interacción con A) sulfato de condroitina (CS) B) hialuronano C) sulfato de heparán (hS) en la activación de células T: inducción de una respuesta de IL-2 en células de hibridoma 3H8 por DR4/hCll frente a DR4/hCIIAHis y en (A) también DR4/hCll_DED a las concentraciones indicadas en fase de soluto en pocillos de microtitulación bloqueados o pre-recubiertos con sulfato de condroitina. Se muestran las concentraciones de IL-2 en el sobrenadante después de la activación.
FIGURA 10: Activación de células de hibridoma 3H8 por DR4/hCll frente a DR4/hCIIAHis frente a DR4/hCll_DED recubiertos previamente en pocillos de microtitulación a las concentraciones indicadas. Se muestran las concentraciones de IL-2 en el sobrenadante después de la activación a la concentración de proteína indicada de las soluciones de DR4/nCII utilizadas para recubrir las placas de microtitulación [pg/ml].
FIGURA 11: Impacto de la etiqueta de His en los complejos peptídicos DR4/hCll y su interacción con sulfato de condroitina (CS) en fase soluto para estimular respuestas de IL-10 en células de hibridoma 3H8: Activación de células de hibridoma 3H8 por DR4/nCII a las concentraciones indicadas en una fase de soluto con o sin (w/o) sulfato de condroitina (2,5 mg/ml) en pocillos de microtitulación con una superficie de plástico bloqueada. Se muestran las concentraciones de IL-10 en el sobrenadante después de la activación a la concentración de proteína indicada de las soluciones de DR4/nCII utilizadas para recubrir las placas de microtitulación [|jg/ml],
FIGURA 12: Comparación del efecto terapéutico del complejo peptídico Aq/galCII que contiene o carece de una etiqueta de His sobre la hinchazón del oído inducida por la reacción de d Th al colágeno IIin vivo.El efecto del constructo Aq/galCII con (His) y sin la etiqueta de polihistidina (sin His) se muestra en comparación con un constructo de control Aq/mCLIPmt que contiene un péptido CLIP mutado de ratón unido en su surco de unión (CLIPmt) (* indica un valor de p < 0,05 y ** indica un valor de p < 0,01).
FIGURA 13: Heterogeneidad en la modificación post-traduccional del péptido CII en el complejo DR4/hCll recombinante. Se muestra el porcentaje de modificaciones detectables en la posición respectiva en la posición K indicada según lo analizado mediante análisis espectrométrico de masas. [OH= hidroxilisina, Hex= galactosilhidroxilisina, DiHex= glucosil-galactosil-hidroxilisina, Ub=ubiquitina, POH= hidroxiprolina].
FIGURA 14: Generación de la célula Expi293 que desactiva el gen Plod3 (LH3). (A) Representación esquemática de la transferencia gradual de lisina a hidroxilisina a Gal-hidroxilisina y Glc-Gal hidroxilo mediada por la enzima modificadora de colágeno multifuncional LH3. (B) Detección de PLOD3 mediante transferencia de Western. Lisados de diferentes clones de células HEK Expi293 transducidos con 1 * 106 lentivirales que codifican sh-RNA específica de Plod3 se cargaron en una SDS-PAGE y se detectó PLOD3 en una transferencia de Western usando un anticuerpo anti-PLOD3. PLOD3 tiene un peso molecular teórico de 84 kDa. Se utilizaron los clones # 4, # 18 y # 20 para una mayor expansión. (C) Análisis de glicanos por espectrometría de masas. Después de la transducción lentiviral con shRNA para desactivar el genplod3,se realizó un análisis de glicanos mediante espectrometría de masas para investigar la reducción de la glucosilación de restos de galactosilhidroxilisilo. Se analizaron ambas lisinas (K264 y K270) dentro del epítopo de colágeno tipo II (SEQ ID NO: 1) que se muestra en la parte superior. Se demuestra una clara reducción de los residuos de glucogalactosilhidroxilisilo (DiHex). Sin mod = sin modificar, OH = hidroxilado, DiOH = dihidroxilado, Hex = hidroxilisilo galactosilado, DiHex = gluco-galactosilhidroxilisilo.
FIGURA 15: Constructos de Aq/gal264 CII con etiquetas de aminoácidos cargadas positivamente alternativas en el extremo C-terminal de la secuencia que contiene la cadena p. A) Se muestra secuencias de etiqueta H2AN (secuencia H2A N-terminal; Histona NT; SEQ iD NO: 34), etiqueta H2AC (secuencia H2A C-terminal; Histona CT; SEQ ID NO: 40) y etiqueta NH (His modificada; SEQ ID NO: 35). B) Se muestra la alineación de secuencia de la histona H2A humana y de ratón. Las coincidencias se indican con (*) y las discrepancias se indican con (:). Los cuadros indican la posición de la secuencia de histonas NT y CT.
FIGURA 16: Ensayo de hibridoma para probar los constructos de Aq/gal264CII con las etiquetas de aminoácidos cargadas positivamente alternativas en el extremo C-terminal de la cadena beta de Aq. Los constructos con la etiqueta His o etiquetas de aminoácidos cargadas positivamente alternativas se muestran en la parte superior, con TCS que representa el sitio de escisión de trombina seguido de un enlazador antes de la cadena p y la etiqueta S representa la etiqueta de estreptavidina, como en la Figura 1. Los complejos peptídicos Aq/gal264 CII con las etiquetas de aminoácidos cargadas positivamente alternativas (Aq/galCII (His modificada), Aq/galCII (Histone CT), Aq/galCII (Histone NT), se recubrieron en diferentes concentraciones en la superficie plástica de los pocillos de microtitulación, se añadieron hibridomas de células T HCQ.3 y la secreción de IL-2 se determinó mediante ELISA como una medida de activación celular específica. El Aq/galCII (His) marcado con His sirvió como control positivo y Aq/galCII (sin His), sin ninguna etiqueta sirvió como control negativo.
FIGURA 17: Comparación del efecto terapéutico del complejo peptídico Aq/galCII con o sin etiqueta de His y el complejo peptídico Aq/galCII con etiqueta de histona NT sobre la hinchazón de la oreja inducida por la reacción de DTH al colágeno IIin vivo.El efecto del constructo Aq/galCII con (His) y sin la etiqueta de polihistidina (AHis) y con la etiqueta de histona NT se muestra en comparación con un constructo de control de Aq/mCLIPmt que contiene un péptido CLIP de ratón unido en su surco de unión (CLIPmt).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES PREFERIDAS
Las realizaciones generales "que comprende" o "compuesto por" abarcan la realización más específica "que consiste en". Además, las formas singular y plural no se utilizan de forma limitante. Tal y como se utilizan en la presente memoria, las formas singulares "un", "una" y "el" designan tanto el singular como el plural, a menos que se indique expresamente que designen únicamente el singular.
El término "proteína" se usa indistintamente con "secuencia de aminoácidos" o "polipéptido" y se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Estos términos también incluyen proteínas que se modifican posttraduccionalmente mediante reacciones que incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, acetilación, fosforilación, glicación o procesamiento de proteínas. Se pueden realizar modificaciones y cambios, por ejemplo uniones con otras proteínas, sustituciones, deleciones o inserciones de secuencias de aminoácidos, en la estructura de un polipéptido mientras la molécula mantiene su actividad funcional biológica. Por ejemplo, se pueden realizar determinadas sustituciones de secuencias de aminoácidos en un polipéptido o su secuencia codificante de ácido nucleico subyacente y se puede obtener una proteína con las mismas propiedades.
El término "polipéptido" normalmente se refiere a una secuencia de más de 20 aminoácidos y el término "péptido" significa secuencias con hasta 20 aminoácidos de longitud. Sin embargo, los términos pueden usarse indistintamente. Una proteína puede formar multímeros tales como dímeros, en donde el dímero puede ser un heterodímero o un homodímero. El complejo peptídico HLA-DR/CII según la invención comprende una región extracelular de una cadena alfa de MHC de clase II y una región extracelular de una cadena beta de MHC de clase II, que normalmente forman un heterodímero que forma el surco de unión para albergar el péptido de colágeno II unido al extremo N-terminal de una de las cadenas. Sin embargo, el experto en la técnica entenderá que dos proteínas que forman un heterodímero también se pueden generar como una proteína de fusión que forma una única cadena polipeptídica con los dominios unidos entre sí, opcionalmente a través de un enlazador flexible, es decir, un heterodímero monocatenario.
Una "proteína de fusión" se define como una proteína que contiene las secuencias completas o cualquier parte de las secuencias de dos o más proteínas naturales o modificadas originalmente separadas. Las proteínas de fusión pueden construirse mediante enfoques de ingeniería genética utilizando técnicas de DNA recombinante uniendo dos o más genes o cDNAs, o partes de los mismos, que originalmente codifican las dos o más proteínas naturales o heterólogas originalmente separadas, o partes de las mismas. Esto da como resultado una proteína de fusión con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas originales. Así, un péptido o proteína se une a otra proteína mediante un enlace peptídico o preferiblemente un péptido enlazador.
El término "DNA genómico" o "genoma" se usa indistintamente y se refiere a la información genética hereditaria de un organismo huésped. El DNA genómico comprende el DNA del núcleo (también denominado DNA cromosómico) pero también de otros orgánulos celulares (por ejemplo, mitocondrias).
El término "gen", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un locus de DNA de secuencia genómica hereditaria que afecta a los rasgos de un organismo al expresarse como un producto funcional o mediante la regulación de la expresión génica. Los genes y polinucleótidos pueden incluir intrones y exones como en una secuencia genómica, o simplemente las secuencias codificantes comprendidas en un cDNA, tal como un marco de lectura abierto (ORF), que comprende un codón de inicio (codón de metionina) y un codón de parada de traducción. Los genes y polinucleótidos también pueden incluir regiones que regulan su expresión, tal como el inicio de la transcripción, la traducción y la terminación de la transcripción. Por lo tanto, también se incluyen elementos reguladores tales como un promotor.
Los términos "ácido nucleico", "nucleótido" y "polinucleótido", tal y como se usan en la presente memoria, se usan indistintamente y se refieren a un polímero monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o bases de ribonucleótidos leídas desde el extremo 5' al 3' e incluyen DNA bicatenario (dsDNA), DNA monocatenario (ssDNA), RNA monocatenario (ssRNA), RNA bicatenario (dsRNA), DNA genómico, cDNA, cRNA, DNA recombinante o R<n>A recombinante y derivados de los mismos, tales como aquellos que contienen cadenas principales modificadas. Preferiblemente, un polinucleótido, particularmente para integrarse de manera estable en el genoma de un mamífero, es un DNA o cDNA. Los polinucleótidos según la invención pueden prepararse de diferentes maneras (por ejemplo, mediante síntesis química, mediante clonación de genes, etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, lineales o ramificadas, monocatenarias o bicatenarias, o un híbrido de las mismas, cebadores, sondas, etc.).. El término "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere tanto a las cadenas sentido como antisentido de un ácido nucleico como cadenas únicas individuales o en dúplex.
El término "polinucleótido recombinante" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un polinucleótido derivado de una célula, organismo o una especie diferente del receptor, por ejemplo, una célula CHO o una célula HEK 293, e introducido en el receptor usando técnicas recombinantes. En el contexto de la presente invención, el experto entenderá que se refiere a un DNA o cDNA. Un polinucleótido recombinante también puede denominarse transgén o polinucleótido heterólogo. Por lo tanto, puede ser un gen o un marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína recombinante. En el contexto de células de mamíferos, tales como células HEK 293 o CHO, "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido derivado de una célula diferente o sintetizado artificialmente. El término "recombinante" se refiere a moléculas tales como polipéptidos o moléculas de ácido polinucleico formadas mediante un método de laboratorio de recombinación genética, tal como la clonación molecular. Dichos métodos reúnen el material genético de múltiples fuentes o crean secuencias que no existen de forma natural. Cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico, "recombinante" también incluye un polinucleótido que comprende dos o más secuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza o un polipéptido codificado por dicho polinucleótido. Por lo tanto, recombinante también puede referirse a una secuencia de polinucleótidos, tal como un gen o transgén, o una porción de los mismos, derivada de la misma línea celular, pero que se inserta en el genoma en una localización en donde normalmente no se encuentra, o un gen introducido en una célula de un organismo en donde normalmente no se encuentra.
Como se usa en la presente memoria, un "polinucleótido recombinante", "gen recombinante" o "secuencias recombinantes" se pueden introducir en una célula objetivo o célula huésped directamente o preferiblemente mediante el uso de un "vector de expresión", preferiblemente un vector de expresión de mamífero. Los métodos utilizados para construir vectores son bien conocidos por el experto en la técnica. Los vectores pueden incluir, pero no limitarse a, vectores plásmidos, cósmidos, minicromosomas artificiales (por ejemplo, ACE) o vectores virales tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y virus del herpes simple. Los vectores de expresión eucariotas normalmente contendrán también secuencias procarióticas que facilitan la propagación del vector en bacterias tales como un origen de replicación y genes de resistencia a antibióticos para la selección en bacterias. Son bien conocidos en la técnica una variedad de vectores de expresión eucarióticos, que contienen un sitio de clonación al que se puede unir operativamente un polinucleótido. Normalmente los vectores de expresión también comprenden un casete de expresión que codifica un marcador seleccionable, permitiendo la selección de células huésped que llevan dicho marcador de expresión.
El término "citocina" se refiere a pequeñas proteínas que son liberadas por las células y actúan como mediadores intercelulares, influyendo, por ejemplo, en el comportamiento de las células que rodean a la célula secretora. Las citoquinas pueden ser secretadas por células inmunes u otras células, tales como células T, células B, células NK y macrófagos. Las citocinas pueden estar implicadas en sucesos de señalización intercelular, tal como la señalización autocrina, la señalización paracrina y la señalización endocrina. Pueden mediar en una variedad de procesos biológicos que incluyen, pero no se limitan a, inmunidad, inflamación y hematopoyesis. Las citocinas pueden ser quimiocinas, interferones, interleucinas, linfocinas o factores de necrosis tumoral.
El término "expresión", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de ácido nucleico dentro de una célula huésped. El nivel de expresión de un producto génico de interés en una célula huésped se puede determinar en base a la cantidad del RNA correspondiente que está presente en la célula o en la cantidad del polipéptido codificado por la secuencia seleccionada. Por ejemplo, el RNA transcrito a partir de una secuencia seleccionada se puede cuantificar mediante hibridación por transferencia Northern, protección de RNA con ribonucleasa, hibridación in situ con RNA celular o mediante PCR, tal como qPCR. Las proteínas codificadas por una secuencia seleccionada pueden cuantificarse mediante diversos métodos, por ejemplo, mediante ELISA, mediante transferencia Western, mediante radioinmunoensayo, mediante inmunoprecipitación, mediante análisis de la actividad biológica de la proteína, mediante inmunotinción de la proteína seguida de análisis FACS o mediante ensayos homogéneos de fluorescencia resuelta en el tiempo (HTRF). El nivel de expresión de un RNA no codificante, tal como un miRNA o shRNA, puede cuantificarse mediante PCR, tal como qPCR.
El término "producto génico" se refiere tanto al polinucleótido de RNA como al polipéptido que está codificado por un gen o polinucleótido de DNA.
El término "aminoácido proteinogénico", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a todos los aminoácidos que se incorporan biosintéticamente a las proteínas durante la traducción. El término "proteinogénico" significa creador de proteínas. En los eucariotas hay 21 aminoácidos que codifican genéticamente, es decir, los aminoácidos proteinogénicos, los 20 del código genético estándar y la selenocisteína. Los 20 aminoácidos del código genético estándar son alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.
El término "modificación post-traduccional" o "modificado post-traduccionalmente" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una modificación natural de un resto de lisina en el péptido CII que puede ocurrir cuando se produce en células. La modificación post-traduccional de un resto de lisina puede dar como resultado hidroxilisina (Hyl) o Hyl O-glicosilada, tal como galactosil-hidroxilisina o glucosilgalactosil-hidroxilisina, preferiblemente galactosilhidroxilisina.
El término "dominio", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una estructura proteica plegada que tiene una estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de propiedades funcionales discretas de las proteínas y en muchos casos pueden añadirse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Por ejemplo, el dominio alfa 1 de la cadena alfa de MHC II y el dominio beta 1 de la cadena beta de MHC II son dominios polipeptídicos plegados que juntos forman el surco de unión del péptido de la molécula de MHC II.
La composición que comprende un complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante que comprende un péptido de unión a condroitina para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas es humana.
En un aspecto, la invención proporciona una composición que comprende complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes que comprenden una región extracelular de una cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1; una región extracelular de una cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1; y un péptido de colágeno II (péptido Cll), opcionalmente unido al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente a la cadena beta de HLA-DR; en donde el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en AGFKGEQGPKG, AGFKGEQGPXG, AGFKGEXGPKG, AGFKGXQGPKG, AGFKXEQGPKG, AGFKGEXGPXG, AGFKGXQGPXG y AGFKXEQGPXG, y en donde los complejos peptídicos HLA-DR/CII comprenden un péptido de unión a condroitina en el extremo C-terminal del polipéptido que comprende la cadena alfa de HLA-DR y/o la cadena beta de HLA-DR, para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas en pacientes humanos. En una realización, el péptido CII se une al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador. En una realización, el péptido CII está unido al extremo N-terminal de la cadena beta de HLA-DR.
En una realización, el péptido de unión a condroitina media la unión del complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante a la condroitinain vivo.Sin estar ligado a ninguna teoría, el péptido de unión a condroitina puede mediar la unión del complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante a la condroitina en el cartílago, preferiblemente el cartílago articular. Alternativamente, o además, el péptido de unión a condroitina puede mediar la unión del complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante a carbohidratos cargados negativamente, tales como condroitina o estructuras similares a condroitina, en superficies celulares en células inmunes, particularmente células T y/o o en la matriz de los ganglios linfáticos u otros tejidos como la sinovia. Los glicosaminoglicanos cargados se liberan en el líquido sinovial en altas concentraciones desde la matriz del cartílago y/o las células del revestimiento sinovial durante una artritis crónica inmunomediada activa en la articulación (aproximadamente 4 mg/100 ml; Seppala PO et al. Clin Chim Acta 1975; 36: 549-553).
Sorprendentemente se demostró que la etiqueta de His en los complejos peptídicos HLA-DR/CII se añadía al extremo C-terminal de la cadena polipeptídica que comprende una de las cadenas beta de HLA-DR como se muestra en la Figura 1 y el extremo C-terminal del dominio de heterodimerización mejora el efecto del complejo peptídico HLA-DR/CIIin vitro.Sorprendentemente se descubrió además que la etiqueta de His facilita la unión del complejo peptídico recombinante HLA-DR/CII al componente de la matriz extracelular condroitina y que en placas de microtitulación recubiertas con sulfato de condroitina sólo los complejos etiquetados con His eran capaces de inducir una respuesta suficiente de IL-2 en hibridomas de células T en forma soluble. Sin estar ligado a ninguna teoría, la unión del complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante al sulfato de condroitina, componente de la matriz extracelular, puede conducir a una orientación espacial mejorada y/o una multimerización, lo que resulta en una presentación mejorada del grupo de unión peptídica para el reconocimiento de TCR. Esta observación ha sido confirmada por los datosin vivodatos que demuestran una reducción de la inflamación en un modelo de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) inducido por CII después de la administración del complejo etiquetado con His en comparación con el complejo sin etiqueta de His. Por lo tanto, sin estar ligado a ninguna teoría, la etiqueta de His puede ser importante para la unión del complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante al TCR mediante una mayor avidez debido a la interacción con moléculas cargadas negativamente en superficies celulares o superficies tisulares, tales como condroitina, dando lugar a la multimerización de los complejos y/o a una correcta orientación, facilitando la interacción del complejo con el TCR. Además, la interacción de la condroitina también podría ayudar a activar moléculas coestimuladoras en la membrana de las células T que pueden unirse a la condroitina y/o contener un resto de condroitina propiamente dicha, por ejemplo, CD44 o CD74, proteína tirosina fosfatasa PTPa.
La condroitina, también denominada en la presente memoria sulfato de condroitina, es un glicosaminoglicano sulfatado (GAG) compuesto por una cadena de azúcares alternos, N-acetilgalactosamina y ácido glucurónico. A menudo se encuentra unido a proteínas como parte de un proteoglicano. Los proteoglicanos son un componente importante de la matriz extracelular (ECM). El sulfato de condroitina también es un componente estructural importante del cartílago. Además, está presente en los líquidos corporales extracelulares, tales como los derrames sinoviales o la linfa, así como en tejidos, tal como el cartílago de las articulaciones o las membranas sinoviales. Por lo tanto, la etiqueta de His puede favorecer la localización en las estructuras articulares, el lugar del cuerpo más afectado durante la artritis, o los ganglios linfáticos y, por tanto, mediar en una distribución ventajosa del complejoin vivo.El experto en la técnica entenderá que esta capacidad no se limita a una etiqueta de polihistidina, tal como una etiqueta de hexahistidina o preferiblemente una etiqueta de heptahistidina, sino que puede estar mediada por cualquier péptido de unión a condroitina.
Por lo tanto, la composición para su uso según la presente invención comprende complejos peptídicos HLA-DR/CII que contienen al menos un péptido de unión a condroitina, preferiblemente un péptido de unión a condroitina y ácido hialurónico (también denominado hialuronano). Preferiblemente, el péptido de unión a condroitina está situado en el extremo C-terminal de al menos una cadena polipeptídica del complejo. En una realización, el complejo peptídico HLA-DR/CII comprende al menos un péptido de unión a condroitina C-terminal. Los péptidos de unión a condroitina son conocidos en la técnica e incluyen, sin estar limitado a, péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos EKRIWFPYRRF (SEQ ID NO: 31), YKTNFRRYYRF (SEQ ID NO: 32) o VLIRHFRKRYY (SEQ ID NO: 33) (Butterfield KC et al., Biochemistry. 2010 Feb 23;49(7):1549-55). En una realización, el péptido de unión a condroitina comprende de 5 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 6 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 6 a 12 aminoácidos, más preferiblemente de 6 a 12, incluso más preferiblemente de 6 a 12 aminoácidos. También se han identificado en la presente memoria péptidos de histonas cargados positivamente, particularmente péptidos de histona H2A humana tales como un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos SGRGKQGGKARAKAKTRSSR (SEQ ID NO: 34). Los términos condroitina y sulfato de condroitina se usan indistintamente en la presente memoria y, por tanto, el péptido de unión a condroitina también puede denominarse péptido de unión a sulfato de condroitina. Para aumentar la unión al hialuronano, una secuencia ejemplar que contiene el motivo de consenso de unión se define de la siguiente manera: B(X7)B, en donde B es R o K y X7 no contiene restos ácidos y al menos un aminoácido básico (Yang B et al., EMBO J. 15 de enero de 1994; 13 (2): 286-96). Como se describe en la presente memoria, el complejo peptídico HLA-DR/CII también puede unirse al sulfato de condroitina a través de la etiqueta de his. Por lo tanto, el péptido de unión a condroitina puede ser una etiqueta de polihistidina, preferiblemente una etiqueta de hexahistidina, o cualquier otra secuencia de aminoácidos que aumente la afinidad de unión a la condroitina, tal como EKRIWFPYRRF (SEQ ID NO: 31), YKTNFRRYYRF (SEQ ID NO: 32). o VLIRHFRKRYY (SEQ ID NO: 33). El término etiqueta de His se usa en la presente memoria como sinónimo de etiqueta de polihistidina y se refiere a una etiqueta que tiene al menos 6 restos de histidina consecutivos (al menos una etiqueta hexahistidina). Preferiblemente, la etiqueta de His es al menos una etiqueta de heptahistidina.
En una realización (a) el péptido de unión a condroitina C-terminal está en su forma libre; (b) los complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes no se multimerizan mediante el péptido de unión a condroitina en la composición; (c) los complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes no están unidos a otra molécula a través del péptido de unión a condroitina en la composición; o una combinación de cualquiera de (a), (b) o (c). Por tanto, el péptido de unión a condroitina queda libre para unirsein vivoa la condroitina.
El término "complejo peptídico HLA-DR/CII" se refiere a un complejo soluble que comprende los dominios extracelulares de una proteína MHC II humana (isotipo HLA-DR) o parte de la misma que forma el surco de unión del péptido y un péptido de colágeno II (péptido Cll), en donde el péptido está opcionalmente unido (es decir, unido) al extremo N-terminal de la cadena alfa o beta. Preferiblemente, el péptido CII está unido al extremo N-terminal de la cadena alfa o beta y más preferiblemente al extremo N-terminal de la cadena beta del MHC de clase II. Alternativamente, la proteína HLA-DR se puede producir con un péptido sustituto, tal como el péptido de cadena invariante asociado a la clase II (CLIP), unido al extremo N-terminal de la parte extracelular de la cadena beta o la cadena alfa, preferiblemente la cadena beta, mediante un péptido enlazador que comprende un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, un sitio de escisión de trombina); escindir CLIP usando una proteasa (por ejemplo, trombina) que reconoce dicho sitio de escisión de proteasa; y cargar la proteína HLA-DR con el péptido Cll modificado posttraduccinalmente o sin modificar para formar el complejo peptídico HLA-DR/CII. Una proteína HLA-DR comprende un dominio alfa 1 y un dominio alfa 2 , que forman el dominio extracelular de la cadena alfa y un dominio beta 1 y un dominio beta 2, que forman el dominio extracelular de la cadena beta. Los términos "dominio extracelular" y "región extracelular" se utilizan como sinónimos en la presente memoria. El dominio alfa 1 y el dominio beta 1 forman el surco de unión del péptido, es decir, el sitio que interactúa y se une al péptido, tal como un péptido CII. Por lo tanto, el complejo peptídico HLA-DR/CII comprende al menos el dominio alfa 1 y el dominio beta 1 de la proteína HLA-DR. Preferiblemente, el complejo peptídico HLA-DR/CII comprende el dominio alfa 1, el dominio alfa 2, el dominio beta 1 y el dominio beta 2 de la proteína HLA-DR.
Para la RA en humanos existe una asociación genética con ciertos alelos del locus de HLA-DRB1 que codifica un motivo de consenso de aminoácidos (Q/R R/K R A A) en la cadena beta del bolsillo de unión del péptido de la molécula HLA-DR de MHC de clase II (posición de aminoácidos 70-74, el llamado "epítopo compartido"). Ejemplos de alelos HLA DRB1 asociados con rA son los alelos que codifican QKRAA HLA_DRB1* 0401 y 0409, alelos que codifican QRRAA: HLA_DRB1* 0404, 0405, 0408, 0101, 0102 y 1402, alelo que codifica RRRAA: HLA_DRB1* 1001 y alelo que codifica DKRAA : HLA_DRB1* 1303. La región extracelular de la cadena alfa de MHC de clase II y la región extracelular de la cadena beta de MHC de clase II se derivan por lo tanto de HLA-DR, preferiblemente al menos el dominio alfa 1 es de DRA*0101 y al menos el dominio beta 1 es de un alelo HLA-DR seleccionado del grupo que consiste en DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*0408, DRB1*0409, DRB1*0101, DRB1*0102, DRB1*1001, DRB1*1402 y DRB1*1303, preferiblemente DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*0408, DRB1*0409, DRB1*0101, DRB1*0102, DRB1*1001 y DRB1*1402, más preferiblemente DRB1*0401, DRB1* 0404 y DRB1*0405. Más preferiblemente, el dominio alfa 1 y el dominio alfa 2 son de DRA*0101 y el dominio beta 1 y el dominio beta 2 son de un alelo HLA-DR seleccionado del grupo que consiste en DRB1*0401, DRB1*0404, Dr B1*0405., DRB1*0408, DRB1*0409, DRB1*0101, DRB1*0102, DRB1*1001, DRB1*1402 y DRB1*1303, preferiblemente DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*0408, DRB1*0409, DRB1*0101, DRB1*0102, DRB1*1001 y DRB1*1402, más preferiblemente DRB1*0401, DRB1*0404 y DRB1*0405.
Los complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes en la composición para su uso según la invención comprenden péptidos CII no modificados y/o péptidos CII modificados post-traduccionalmente, más específicamente péptidos CII con lisina no modificada o una o más lisinas modificadas post-traduccionalmente, preferiblemente siendo la primera lisina modificada post-traduccionalmente. El término "modificados post-traduccionalmente" o "péptidos CII modificados post-traduccionalmente" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a péptidos CII que llevan una modificación en el primer y opcionalmente segundo resto de lisina seleccionado de hidroxilisina (Hyl), galactosil-hidroxilisina o glucosil-galactosil-hidroxilisina, es decir, una modificación que se puede obtener mediante modificación postraduccional de restos de lisina en el colágeno en las células. Por lo tanto, no es necesario que la modificación se obtenga mediante modificación postraduccional, es decir, en células, sino que también puede obtenerse por medios enzimáticos o sintéticosin vitro.
Los péptidos CII modificados postraduccionalmente comprenden péptidos CII en donde al menos un resto de lisina del péptido CII es hidroxilisina (Hyl) y/o es Hyl O-glicosilado. Preferiblemente, el primer resto de lisina del péptido CII es hidroxilisina (Hyl) y/o es Hyl O-glicosilado. Los complejos peptídicos HLA-DR/CII en la composición pueden comprender los mismos péptidos CII. Así, en una realización, los péptidos CII consisten en péptidos CII con restos de lisina no modificados; o los péptidos CII consisten en péptidos CII, siendo la primera lisina hidroxilisina (Hyl); o los péptidos CII consisten en péptidos CII, siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina. Los complejos peptídicos HLA-DR/CII en la composición también pueden comprender una mezcla de péptidos CII. Esto se puede lograr cargando la proteína HLA-DR con una mezcla de péptidos Cll no modificados y péptidos CII modificados postraduccionalmente, o cargando el complejo HLA-DR con péptidos CII no modificados o modificados postraduccionalmente y mezclando los complejos peptídicos HLA-DR/CII posteriormente. El experto entenderá que los péptidos CII modificados postraduccionalmente normalmente se generaránin vitro yasea sintética o enzimáticamente. Alternativamente, esto se puede lograr preparando los complejos peptídicos HLA-DR/CII con el péptido CII unido al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador in vivo usando una línea celular capaz de añadir modificaciones postraduccionales a los restos de lisina en el colágeno. Por lo tanto, en otra realización los péptidos CII consisten en péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina; los péptidos CII comprenden péptidos CII, siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina; los péptidos CII comprenden péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina; los péptidos CII comprenden péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina y/o hidroxilisina (Hyl); o los péptidos CII comprenden péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina hidroxilisina O-glicosilada y/o hidroxilisina (Hyl). En estas realizaciones, la segunda lisina opcional en el péptido CII modificado postraduccionalmente puede ser no modificada, hidroxilisina y/o hidroxilisina O-glicosilada; más específicamente no modificada, hidroxilisina, galactosahidroxilisina y/o glucosil-galactosil-hidroxilisina; preferiblemente no modificada, hidroxilisina, galactosa-hidroxilisina, más preferiblemente no modificada. En una realización, la segunda lisina opcional en el péptido CII o el péptido CII modificado postraduccionalmente no es glucosil-galactosil-hidroxilisina. En una realización, la composición no contiene complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden péptidos CII con una modificación de glucosil-galactosilhidroxilisina, es decir, no en la primera ni en la segunda lisina opcional.
El péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en AGFKGEQGPKG, AGFKGEQGPXG, AGFKGEXGPKG, AGFKGXQGPKG, AGFKXEQGPKG, AGFKGEXGPXG, AGFKGXQGPXG y AGFKXEQGPXG. En determinadas realizaciones, el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos de AGFKGEQGPKG, AGFKGEQGPX1G, AGFKGEX2GPKG, AGFKGX3QGPKG, AGFKX4EQGPKG, AGFKGEX2GPX1G y AGFKGX3QGPX1G, AGFKX4EQGPX1G, en donde X1 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinogénicos excepto K, preferiblemente R, A, G o Q, más preferiblemente R; X2 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinogénicos excepto Q; preferiblemente A, R, H o G; X3 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinógenos excepto E, preferiblemente A, D, Q o G; y X4 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinógenos excepto G, más preferiblemente A, S, V o L. Preferiblemente X2, X3 o X4 no es K. En determinadas realizaciones, el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos de AGFKGEQGPKG o AGFKGEQGPX1G, preferiblemente de AGFKGEQGPKGEP o AGFKGEQGPX1GEP, más preferiblemente de GIAGFKGEQGPKGEP o GIAGFKGEQGPX1GEP. El péptido CII GIAGFKGEQGPKGEP corresponde a los aminoácidos 259-273 de la región CII de triple helicoidal. Los péptidos CII adecuados para unirse al bolsillo de unión de HLA-DR son de una longitud de 10 a 20 aminoácidos, preferiblemente el péptido CII es de una longitud de 11 a 15 aminoácidos, más preferiblemente el péptido CII es de una longitud de 13 a 15 aminoácidos. En una realización, el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos AGFKGEQGPKG, más preferiblemente AGFKGEQGPKGEP e incluso más preferiblemente de GIAGFKGEQGPKGEP. Alternativamente, el péptido CII puede comprender 11, preferiblemente 12, más preferiblemente 13 y lo más preferiblemente 15 aminoácidos consecutivos de GIAGFKGEQGPKGEP. En una realización, la segunda K (K270) puede mutarse, preferiblemente a R. Por lo tanto, también se incluyen realizaciones en donde el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos AGFKGEQGPXG, AGFKGEQGPXGEP y GIAGFKGEQGPXGEP, en donde X puede ser cualquier aminoácido proteinogénico distinto de K, preferiblemente X es R, A, G o Q, más preferiblemente X es R. Por lo tanto, en una realización el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos AGFKGEQGPRG, AGFKGEQGPRGEP y GIAGFKGEQGPRGEP. Los péptidos CII abarcados por la presente invención se describen en la Tabla 1:
Tabla 1:
Los complejos peptídicos HLA-DR/CII en la composición para su uso según la invención comprenden péptidos CII no modificados y/o péptidos CII modificados postraduccionalmente. Los péptidos Cll modificados postraduccionalmente comprenden péptidos CII en donde al menos el primer resto de lisina del péptido CII es hidroxilisina (Hyl) y/o es Hyl O-glicosilado. Preferiblemente, hidroxilisina (Hyl) y/o galactosil-hidroxilisina, más preferiblemente galactosilhidroxilisina. El primer resto de lisina (K) del péptido CII corresponde a la primera K en GIAGFKGEQGPKGEP en la posición 264 de la secuencia de aminoácidos de la región CII triple helicoidal (correspondiente a la posición 4 del aminoácido en SEQ ID NOs: 1 a 12 y a la posición 6 del aminoácido en SEQ ID NOs: 13-15). Por lo tanto, el "primer resto de lisina" tal y como se usa en la presente memoria también puede denominarse K264 o lisina en la posición 264. El segundo resto de lisina (K) opcional en el péptido CII corresponde a la segunda K en GIAGFKGEQGPKGEP en la posición 270 de la secuencia de aminoácido de la región CII triple helicoidal (correspondiente a la posición del aminoácido 10 en SEQ ID NOs: 1, 3-5 o 10, y a la posición del aminoácido 12 en SEQ ID NO: 13). Por lo tanto, el "segundo resto de lisina" o "resto de lisina adicional" tal y como se usa en la presente memoria también puede denominarse K270 o lisina en la posición 270. Los complejos peptídicos HLA-DR/CII en la composición para su uso pueden ser una mezcla de complejos que comprenden péptidos CII no modificados y péptidos CII modificados postraduccionalmente (Hyl, gal-Hyl y glc-gal-Hyl, preferiblemente Hyl y gal-Hyl, más preferiblemente gal-Hyl), es decir, que comprenden diferentes péptidos CII con y sin modificaciones postraduccionales ", o puede consistir en complejos peptídicos HLA-DR/CII que tienen un péptido Cll no modificado o que tienen un péptido CII modificado postraduccionalmente con una modificación Hyl o gal-Hyl, preferiblemente una modificación gal-Hyl, es decir, que comprende el mismo péptido Cll con o sin una modificación postraduccional. En una realización preferida, los complejos peptídicos HlA-DR/CII en la composición para su uso según la invención comprenden péptidos CII no modificados y péptidos CII modificados postraduccionalmente, en donde al menos el primer resto de lisina es hidroxilisina y/o galactosil-hidroxilisina. El término "galactosil-hidroxilisina" también puede denominarse G-Hyl o Gal-Hyl y excluye una modificación a glucosilgalactosil-hidroxilisina.
La galactosilación postraduccional específica de colágeno de los restos de lisina en la secuencia peptídica de CII según la invención, particularmente del primer resto de lisina, es decir, el resto de lisina en la posición 264, puede estar implicada en el reconocimiento de células T a través del TCR y los efectos farmacológicos resultantes. El resto de lisina en la posición 270 se localiza en el borde del surco de unión de la molécula DR4 y su modificación con galactosil-hidroxilisina se considera menos importante para el reconocimiento de TCR. Por lo tanto, el segundo o resto de lisina adicional (correspondiente a K 270) puede ser uno cualquiera de no modificada, hidroxilisina o galactosilhidroxilisina, preferiblemente no modificada. Se ha demostrado que el TCR de un hibridoma de células T que reconoce el epítopo gal264 no se ve afectado por una mutación K270R. En una realización preferida, particularmente cuando los complejos se producenin vivoen líneas celulares capaces de modificar postraduccionalmente restos de lisina en colágeno, el péptido CII comprende solo el primer resto de lisina y cualquier K opcional adicional (tal como la segunda K opcional) está mutada, preferiblemente mutada a R, A, G o Q, más preferiblemente mutadas a R. Por lo tanto, los péptidos CII que comprenden la secuencia de aminoácidos AGFKGEQGPRG, preferiblemente AGFKGEQGPRGEP y más preferiblemente GIAGFKGEQGPRGEP también están abarcados por la presente invención. La mutación de la segunda lisina tiene la ventaja de reducir la heterogeneidad del producto y, por lo tanto, el porcentaje de péptidos correctamente modificados es mayor. Además, la galactosil-hidroxilisina puede estar glucosilada para formar glucosilgalactosil-hidroxilisina (Glc-Gal-Hyl o GG-Hyl)in vivoen las células productoras del huésped, lo que probablemente tenga un efecto negativo en el reconocimiento de TCR debido al volumen del disacárido (Glc-Gal), particularmente en la posición K270. Por lo tanto, una mutación K270, particularmente K270R, evita aún más la interferencia con la unión ya que no se puede unir ninguna modificación de disacárido en esta posición.
En una realización, el péptido de colágeno II (péptido Cll) se une con el extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente al extremo N-terminal de la cadena beta de MHC clase II. Esto permite la producción del complejo completo, incluyendo las respectivas modificaciones postraduccionales del péptido CII en una célula de producción huésped. El término "péptido enlazador" se refiere a un polipéptido que consiste en múltiples restos de aminoácidos. El péptido enlazador puede ser cualquier péptido siempre que sea lo suficientemente largo y flexible para permitir que el péptido se una al bolsillo de unión peptídica formado por el complejo MHC II. Un ejemplo de un péptido enlazador adecuado es un enlazador de Gly-Ser. Según la invención, el péptido CII, el péptido enlazador y al menos una de las regiones extracelulares de la cadena alfa de MHC II y de la cadena beta de MHC II se expresan como un polipéptido y están codificados por un polinucleótido. El término "fusionado con", tal y como se usa en la presente memoria, significa "unido a", en donde la unión se realiza mediante enlaces peptídicos, usando opcionalmente un péptido enlazador, y por lo tanto se genera una proteína de fusión. Alternativamente, la proteína HLA-DR se produce con un péptido sustituto, tal como un péptido CLIP, que se une a una de las cadenas de HLA-DR mediante un péptido enlazador que comprende un sitio de escisión de proteasa, tal como un sitio de escisión de trombina. Por lo tanto, después de la producción, el péptido se escinde proteolíticamente y el péptido CII no modificado o galactosilado (es decir, un péptido Cll que lleva gal-Hyl en la posición K264), normalmente preparado sintética o enzimáticamentein vitro,se cargain vitroen el complejo. Por lo tanto, en una realización alternativa, el péptido CII no modificado y/o modificado postraduccionalmente se carga en la proteína HLA-DR para formar el complejo peptídico HLA-DR/CII. Aunque este péptido sintético no modificado o galactosilado puede estar unido covalentemente a la molécula HLA-DR, esta unión no se realiza a través de un péptido enlazador. En este contexto, modificado postraduccionalmente se refiere a modificaciones de al menos un resto de lisina en el péptido CII a Hyl, gal-Hyl o glc-gal-Hyl, en donde la modificación puede añadirsein vivoal complejo peptídico HLA-DR/CII dentro de la célula de producción huésped capaz de modificar postraduccionalmente los restos de lisina en colágeno, o de forma sintética o enzimáticamentein vitroal péptido CII que se carga en la proteína HLA-DR.
Dado que el complejo peptídico HLA-DR/CII usado en los ejemplos (SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17) y como se representa en la Figura 1 sin el péptido señal que comprende el péptido CII unido al extremo N-terminal de la cadena beta de HLA-DR todavía contiene un sitio de escisión enzimática (sitio de escisión de trombina, Figura 1) entre el enlazador y el péptido CII, esto no es necesario y preferiblemente se elimina de un producto terapéutico. El péptido enlazador puede mejorar la estabilidad del producto y prevenir la pérdida de péptidos. Por lo tanto, preferiblemente el complejo peptídico HLA-DR/CII según la invención no contiene un sitio de escisión enzimática (proteolítica) en la secuencia de aminoácidos entre el péptido CII y la región extracelular de la cadena beta de HLA-<d>R (o la cadena alfa de HLA-DR). Además, para fines terapéuticos, los complejos peptídicos HLA-DR/CII comprendidos en la composición no comprenden una (1) etiqueta de estreptavidina (SAWSHPq Fe K, SEQ ID NO: 30) para purificación, (2) un sitio de escisión (por ejemplo, un sitio de escisión de TEV) entre la cadena HLA-DRa/HLA-DR P y el dominio de heterodimerización y/o (3) un sitio de reconocimiento para la biotina ligasa deE. coli(BirA) (por ejemplo, una etiqueta de Avi) como está presente en el complejo ejemplificado que se muestra en la Figura 1 y se usa en los Ejemplos. Se demostró que estos elementos no tienen ningún efecto sobre la funcionalidad del complejoin vitroein vivo(datos no mostrados). Un complejo peptídico HLA-DR/CII mínimo ejemplar según la presente invención puede estar codificado por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:19. El experto en la técnica entenderá que la secuencia peptídica puede variar según lo abarcan las reivindicaciones y la etiqueta de His puede sustituirse por un péptido alternativo cargado positivamente, tal como un péptido de unión a condroitina descrito en la presente memoria. Las secuencias para complejos ejemplares tal como se usan en los ejemplos siguientes son las siguientes:
1) Constructo DR4:
• Cadena a del constructo DR4 (SEQ ID NO: 16), secuencia que comprende un péptido señal que precede a la región de cadena a extracelular D<r>A*0101 (subrayada), un sitio de escisión de TEV (negrita), un dominio cFos(negrita y subrayada)y un sitio de biotinilación (BirA,cursiva y subrayada) :
•Cadena a del constructo DR4 mínima (SEQ ID NO: 18), secuencia que comprende un péptido señal que precede a la región de cadena a extracelular DRA*0101 (subrayada), y un dominio cFos (negrita y subrayada):
• Cadena p del constructo DR4 con el péptido hCII259-273 (SEQ ID NO: 17), secuencia que comprende un péptido señal inmediatamente anterior a la etiqueta de Estreptavidina (negrita y doble subrayado) y el péptido CII 259-273 (cursiva y subrayado), un sitio de escisión de trombina (línea negrita y punteada) enmarcado por un enlazador de glicina en cada sitio, la región extracelular DRB*0401 (subrayada), un sitio de escisión de TEV (negrita), un dominio cJun (negrita y subrayada) y una etiqueta de His(cursiva):
•Cadena p del constructo DR4 mínima con el péptido hCII 259-273 (SEQ ID NO: 19), secuencia que comprende un péptido señal inmediatamente anterior al péptido CII 259-273 (cursiva y subrayado), la región extracelular DRB*0401 (subrayada), un dominio cJun (negrita y 'subrayado) y una etiqueta de His(cursiva):
2) Constructo DR4-hCLIPmut:
• Cadena a del constructo DR4 como anteriormente (SEQ ID NO: 16)
• Cadena p del constructo DR4 con hCLIPmut (SEQ ID NO:20), secuencia que comprende un péptido señal inmediatamente anterior a la etiqueta de Estreptavidina (negrita y doble subrayado) y el péptido hCLIP mutado (cursiva y subrayado), un sitio de escisión de trombina (línea negrita y punteada) enmarcado por un enlazador de glicina en cada sitio, la región extracelular DRB*0401 (subrayada), un sitio de escisión de TEV (negrita), un dominio cJun (negrita y subrayada) y una etiqueta de His(cursiva):
3) Constructo Aq-rCII:
• Cadena a del constructo Aq (SEQ ID NO: 21), secuencia que comprende un péptido señal que precede a la región de cadena a extracelular de Aq (subrayada), un sitio de escisión de TEV (negrita), un dominio cFos (negrita y subrayado) y un sitio de biotinilación (BirA,cursiva y subrayado):
•Cadena p del constructo Aq con el péptido CII 259-273 de rata (SEQ ID NO: 22), secuencia que comprende un péptido señal inmediatamente anterior a la etiqueta de Estreptavidina (negrita y doble subrayado) y el péptido CII 259-273 (cursiva y subrayado), un sitio de escisión de trombina (línea negrita y punteada) enmarcado por un enlazador de glicina en cada sitio, la región extracelular de Aq (subrayada), un sitio de escisión de TEV (negrita), un dominio cJun (negrita y subrayado) y una etiqueta de His(cursiva):
• Cadena p del constructo Aq con el péptido CII 259-273 de rata sin etiqueta de His (SEQ ID NO: 23), secuencia que comprende un péptido señal inmediatamente anterior a una etiqueta de Estreptavidina (negrita y doble subrayado) y el péptido CII 259-273 (cursiva y subrayado), un sitio de escisión de trombina (línea negrita y punteada) enmarcado por un enlazador de glicina en cada sitio, la región extracelular de Aq (subrayada), un sitio de escisión de TEV (negrita) y un dominio cJun (negrita y subrayado):
4) Constructo Aq-mCLIPmt:
• Cadena a del constructo Aq como anteriormente (SEQ ID NO: 21)
• Cadena p del constructo Aq con el péptido mCLIP (SEQ ID NO: 24), secuencia que comprende un péptido señal inmediatamente anterior a la etiqueta de Estreptavidina(negrita y doble subrayado)y el péptido mCLIPmt (cursiva y subrayado), un sitio de escisión de trombina (línea negrita y punteada) enmarcado por un enlazador de glicina en cada sitio, la región extracelular de Aq (subrayada), un sitio de escisión de TEV (negrita), un dominio cJun (negrita y subrayado) y una etiqueta de His(cursiva):
•Cadena p del constructo Aq con el péptido mCLIP sin etiqueta de His (SEQ ID NO: 25), secuencia que comprende un péptido señal inmediatamente anterior a una etiqueta de Estreptavidina (negrita y doble subrayado) y el péptido mCLIPmt (cursiva y subrayado), un sitio de escisión de trombina (línea negrita y punteada) enmarcado por un enlazador de glicina en cada sitio, la región extracelular de Aq (subrayada), un sitio de escisión de TEV (negrita), un dominio cJun (negrita y subrayado):
A continuación se proporcionan secuencias de aminoácidos adicionales de elementos individuales de los constructos descritos en la presente memoria:
• Dominio cFos (SEQ ID NO: 26): LTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAH
• Dominio cJun (SEQ ID NO: 27): RIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNH
• Péptido CLIP humano modificado (SEQ ID NO: 28): PVSKARMATGALAQA
• péptido CII de rata 259-273 (SEQ ID NO: 29): GIAGFKGEQGPKGET
• etiqueta de estreptavidina (SEQ ID NO: 30): SAWSHPQFEK.
En una realización, la región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1 y la región extracelular de la cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1 se expresan como un polipéptido de fusión único (heterodímero monocatenario); y opcionalmente el péptido de colágeno II (péptido CII) se une con el extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-D<r>o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente con la cadena beta de HLA-DR. En una realización, el complejo peptídico HLA-DR/CII no contiene dominios de multimerización o heterodimerización, particularmente no un dominio de IgG. En una realización, cada complejo peptídico HLA-DR/CII solo contiene una región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR y una región extracelular de la cadena beta de HLA-DR.
En una realización alternativa, el complejo HLA-DR/CII comprende un primer polipéptido que comprende la región extracelular de la cadena alfa de HLA-Dr /c II que comprende al menos un dominio alfa 1; un segundo polipéptido que comprende la región extracelular de la cadena beta de HLA-DR/CII que comprende al menos un dominio beta 1; y el péptido de colágeno II (péptido Cll), opcionalmente unido al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente a la cadena beta de HLA-DR; y en donde la cadena alfa de HLA-DR se une en su extremo C-terminal a un primer dominio funcional de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina y la cadena beta de MHC de clase II se une en su extremo C-terminal a un segundo dominio funcional complementario de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina. El primer dominio funcional y el segundo dominio funcional complementario pueden ser un dominio de heterodimerización de cremallera de leucina ácido y básico, preferiblemente un motivo de cremallera de leucina jun-fos. En una realización, el motivo de cremallera de leucina jun-fos comprende un dominio cFos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y un dominio cJun que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. El experto en la técnica entenderá que el primer y/o el segundo polipéptido comprenden el péptido de unión a condroitina, tal como una etiqueta de polihistidina, en el extremo C-terminal del dominio funcional de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina. En una realización, el complejo peptídico HLA-DR/CII no contiene dominios de multimerización o heterodimerización adicionales, particularmente no un dominio de IgG. En una realización, cada complejo peptídico HLA-DR/CII solo contiene una región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR y una región extracelular de la cadena beta de HLA-DR.
El experto en la técnica entenderá que la composición para su uso según la invención, particularmente si se produce en una célula de producción huésped capaz de modificar postraduccionalmente restos de lisina en colágeno, puede comprender complejos peptídicos HLA-DR/CII en una mezcla heterogénea de complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden diferentes modificaciones postraduccionales del péptido CII, particularmente el primer y segundo resto de lisina opcional del péptido CII y el péptido CII no modificado. La mezcla heterogénea puede comprender complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden K, Hyl, G-Hyl o GG-Hyl en la primera lisina e independientemente K, Hyl, G-Hyl o GG-Hyl en la segunda lisina opcional (en donde K = lisina, Hyl = hidroxilisina, G-Hyl = galactosil-hidroxilisina, GG-Hyl = glucosilgalactosil-hidroxilisina).
Por lo tanto, en una realización, la composición para su uso según la presente invención comprende complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden el péptido CII, en donde el primer resto de lisina del péptido CII es galactosahidroxilisina y comprende además complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden el péptido CII, en donde el primer resto de lisina del péptido CII es no modificado, hidroxilisina (Hyl) o glucosilgalactosil-hidroxilisina (GG-Hyl), preferiblemente no modificado o hidroxilisina (Hyl) y el segundo resto de lisina opcional del péptido CII es independientemente no modificado, hidroxilisina (Hyl), galactosil-hidroxilisina (G-Hyl) o glucosilgalactosil-hidroxilisina (GG-Hyl), preferiblemente no modificado, hidroxilisina (Hyl), galactosil-hidroxilisina (G-Hyl). En una realización, la composición no comprende complejos peptídicos HLA-DR/CII modificados con glucosil-galactosil-hidroxilisina (GG-Hyl), es decir, complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden un péptido Cll O-glicosilado en donde el primero y/o el segundo resto de lisina opcional es glucosil-galactosil-hidroxilisina.
En la composición para su uso según la invención que comprende complejos peptídicos HLA-DR/CII en una mezcla heterogénea de complejos peptídicos HLA-DR/CII, la composición comprende preferiblemente complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden al menos un 5 %, al menos un 10 % %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 % o al menos un 50 % de G-Hyl en la primera lisina (K264) del péptido CII del total de complejos peptídicos HLA-DR/CII en la mezcla o la composición. Además, la composición comprende complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprende no más del 90 %, no más del 80 %, no más del 70 %, no más del 60 % o no más del 50 % de péptidos Cll no modificados del total de complejos peptídicos HLA-R/CII en la mezcla o la composición. En ciertas realizaciones, la composición comprende complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden preferiblemente menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 % y más preferiblemente menos del 1 % de GG-Hyl en el péptido CII del total de complejos peptídicos HLA-DR/CII en la mezcla o la composición. En donde el porcentaje se refiere al porcentaje de péptido CII en los complejos peptídicos HLA-DR/CII del total de péptidos Cll en los complejos peptídicos HLA-DR/CII. En una realización preferida particular, dicho segundo resto de lisina (K270) está mutado, por ejemplo, mutado a arginina (K270R). En una realización adicional, la segunda lisina (opcional) no se modifica postraduccionalmente a glucosilgalactosil-hidroxilisina (GG-Hyl) y está presente como lisina, hidroxilisina o galactosil-hidroxilisina no modificada.
El experto en la técnica entenderá que la composición para su uso según la invención puede comprender alternativamente complejos peptídicos HLA-DR/CII en una mezcla homogénea de complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden péptidos CII no modificados o la misma modificación postraduccional del péptido CII, particularmente del primer resto de lisina del péptido CII. La mezcla homogénea puede comprender complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden K, Hyl, G-Hyl o GG-Hyl en la primera lisina del péptido CII (en donde K = lisina, Hyl = hidroxilisina, G-Hyl = galactosil-hidroxilisina, GG-Hyl = glucosilgalactosil-hidroxilisina). Preferiblemente, los complejos peptídicos HLA-DR/CII no comprenden ninguna modificación o al menos no GG-Hyl en la segunda lisina del péptido CII, si está presente. Se puede lograr una mezcla homogénea de complejos peptídicos HLA-DR/CII cargando la proteína HLA-DR con péptidos CII no modificados o modificados postraduccionalmente preparados sintéticamente. Alternativamente, el complejo peptídico HLA-DR/CII puede producirse usando una línea celular de producción huésped capaz de modificar postraduccionalmente los restos de lisina en el colágeno y purificando los respectivos complejos peptídicos HLA-DR/CII usando cromatografía de afinidad usando anticuerpos que reconocen los complejos en una de manera sensible a la modificación postraduccional o usando TCRs (o fragmentos de los mismos) específicos para dichos complejos HLA-DR/CII como ligandos de afinidad.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante, obtenido u obtenible mediante el método descrito en la presente memoria para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas en un paciente humano, en donde el método para producir un complejo peptídico HLA-DR/CII comprende transfectar una célula de mamífero con (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una región extracelular de una cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una región extracelular de una cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1; y (iii) un polinucleótido que codifica un péptido de colágeno II (péptido Cll) unido al extremo N-terminal de la cadena alfa de<h>LA-DR o la cadena beta de<h>LA-DR mediante un péptido enlazador, en donde el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en AGFKGEQGPKG, AGFKGEQGPXG, AGFKGEXGPKG, AGFKGXQGPKG, AGFKXEQGPKG, AGFKGEXGPXG, AGFKGXQGPXG y AGFKXEQGPXG, y en donde el complejo peptídico HLA-DR/CII comprende un péptido de unión a condroitina en el extremo C-terminal del polipéptido que comprende la cadena alfa de HLA-DR y/o la cadena beta de HLA-DR; (b) cultivar las células de mamífero en condiciones adecuadas para producir el complejo peptídico HLA-DR/CII, y (c) recolectar un sobrenadante celular y opcionalmente las células que comprenden el complejo peptídico HLA-DR/CII que comprende un péptido CII no modificado y/o postraduccional modificado. En el péptido CII modificado postraduccionalmente al menos el primer resto de lisina del péptido CII puede ser hidroxilisina (Hyl) o Hyl O-glicosilada. Preferiblemente, el al menos primer resto de lisina es hidroxilisina o galactosil-hidroxilisina, más preferiblemente galactosil-hidroxilisina. Particularmente abarcado está dicho complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante que comprende un péptido CII modificado postraduccionalmente, en donde el primer resto de lisina del péptido CII es hidroxilisina (Hyl) o es Hyl O-glicosilada. Por lo tanto, en una realización, el complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante que comprende un péptido Cll O-glicosilado se obtiene mediante el método descrito en la presente memoria.
En determinadas realizaciones, el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos de AGFKGEQGPKG, AGFKGEQGPX1G, AGFKGEX2GPKG, AGFKGXQGPKG, AGFKX4EQGPKG, AGFKGEX2GPX1G y AGFKGX3QGPX1G, AGFKX4EQGPX1G, en donde X1 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinogénicos excepto K, preferiblemente R, A, G o Q, más preferiblemente R; X2 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinogénicos excepto Q; preferiblemente A, R, H o G; X3 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinógenos excepto E, preferiblemente A, D, Q o G; y X4 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinógenos excepto G, más preferiblemente A, S, V o L. Preferiblemente X2, X3 o X4 no es K. En determinadas realizaciones, el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos de AGFKGEQGPKG o AGFKGEQGPX1G, preferiblemente de AGFKGEQGPKGEP o AGFKGEQGPX1GEP, más preferiblemente de GIAGFKGEQGPKGEP o GIAGFKGEQGPX1GEP.
Aún en un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende el complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante que comprende un péptido CII obtenido mediante el método descrito en la presente memoria.
La composición para su uso según la invención es una composición farmacéutica. Por lo tanto, la presente invención también describe composiciones farmacéuticas que comprenden la composición que comprende complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes como se describe en la presente memoria y excipientes farmacéuticamente aceptables. La composición o composición farmacéutica se puede administrar por cualquier vía de administración, preferiblemente por vía subcutánea (s.c.) o intravenosa (i.v.). En una realización, la composición o composición farmacéutica se administra usando una bomba osmótica implantada subcutáneamente. La composición o composición farmacéutica que comprende los complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes para su uso según la invención puede estar liofilizada o en una solución acuosa. Los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir vehículos, así como estabilizadores.
La composición para su uso según la presente invención es para tratar enfermedades inflamatorias crónicas, particularmente artritis u otras enfermedades inflamatorias crónicas de las articulaciones. Preferiblemente, la composición es una composición farmacéutica que comprende además excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización, la composición para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriásica, espondiloartritis axial no radiográfica, espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil, policondritis recurrente, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Lyme, enfermedades de Meniere, enfermedad autoinmune del oído interno (AIED) o enfermedad de Still. En una realización, la composición para su uso según la invención es para tratar una forma de artritis seleccionada del grupo que consiste en artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil o enfermedad de Still, preferiblemente artritis reumatoide, osteoartritis o artritis psoriásica, más preferiblemente artritis reumatoide. En realizaciones particulares, la composición según la invención es para el tratamiento de primera línea de la artritis reumatoide, para el tratamiento en sujetos que responden inadecuadamente al metotrexato y/o fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs) sintéticos (molécula pequeña) convencionales, para el tratamiento en sujetos que responden inadecuadamente a DMARDs biológicos (por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, anti-CTLA4 (abatacept), anti-IL-6 , anti-CD20 (rituximab), para el tratamiento en sujetos que no responden adecuadamente a DMARDs sintéticos dirigidos (por ejemplo, inhibidores de JAK). En realizaciones alternativas, la composición según la invención es para el tratamiento profiláctico en pacientes con alto riesgo de desarrollar artritis reumatoide, tales como fumadores positivos para anticuerpos anti-ccp con nueva aparición de síntomas musculoesqueléticos.
Preferiblemente la composición debe administrarse por vía subcutánea o intravenosa, más preferiblemente por vía subcutánea. La composición se puede administrar en dosis únicas de aproximadamente 10 |jg a aproximadamente 250 jg , preferiblemente de 20 a 200 jg , más preferiblemente de 50 jg a 100 jg . En una realización, el tratamiento comprende una fase de carga y una de mantenimiento. La fase de carga puede comprender de 3 a 10, preferiblemente 6 aplicaciones secuenciales en días consecutivos. Las dosis de mantenimiento pueden administrarse semanalmente o cada 3 a 14 días, preferiblemente semanalmente, quincenalmente, mensualmente, cada dos meses o incluso a intervalos mayores.
Métodos para producir el complejo peptídico HLA-DR/CII recombinante
Los complejos peptídicos HLA-DR/CII para su uso según la invención pueden prepararsein vivo(es decir, dentro de una línea celular de mamífero) con el péptido CII unido al extremo N-terminal de la parte extracelular de la cadena beta o la cadena alfa o, alternativamente, con un péptido sustituto unido al extremo N-terminal de la parte extracelular de la cadena beta o la cadena alfa y posterior escisión del péptido sustituto y carga con el péptido CII. Si el péptido CII se expresa junto con la proteína HLA-DR en células de mamífero, dependiendo de las células de mamífero utilizadas para la producción, el péptido CII puede modificarse postraduccionalmente o no modificarse. Si el péptido CII se carga en la proteína HLA-DR, el péptido CII se prepara sintética o enzimáticamentein vitroy puede cargarse en el complejo como péptido CII no modificado y/o modificado postraduccionalmente.
Más específicamente, los complejos peptídicos HLA-DR/CII para su uso según la invención se pueden preparar mediante un método para producir un complejo peptídico HLA-DR/CII que comprende un péptido CII que comprende transfectar una célula de mamífero con (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una región extracelular de la cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1, que comprende un péptido de la cadena invariante asociado a clase II (CLIP) como un péptido sustituto unido al extremo N-terminal de la parte extracelular de la cadena beta o la cadena alfa, preferiblemente la cadena beta, mediante un péptido enlazador que comprende un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, un sitio de escisión de trombina); en donde la proteína HLA-DR comprende un péptido de unión a condroitina en el extremo C-terminal del polipéptido que comprende la cadena alfa de HLA-DR y/o la cadena beta de HLA-DR; (b) cultivar las células de mamífero en condiciones adecuadas para producir la proteína HLA-DR; (c) recolectar un sobrenadante celular y opcionalmente células que comprenden la proteína HLA-DR; (d) escindir el CLIP usando una proteasa (por ejemplo, trombina) que reconoce dicho sitio de escisión de proteasa; y cargar la proteína HLA-DR con un péptido CII no modificado y/o modificado postraduccionalmente para formar el complejo peptídico HLA-DR/CII, en donde el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en AGFKGEQGpKG, AGFKGEQGPXG, AGFKGEXGPKG, AGFKGXQGPKG, AGFKXEQGPKG, AGFKGEXGPXG, AGFKGXQGPXG y AGFKXEQGPXG. En el péptido CII modificado postraduccionalmente al menos el primer resto de lisina del péptido CII puede ser hidroxilisina (Hyl) y/o Hyl O-glicosilada. Preferiblemente, el al menos primer resto de lisina en el péptido CII modificado postraduccionalmente es hidroxilisina y/o galactosil-hidroxilisina, más preferiblemente galactosilhidroxilisina. Por lo tanto, después de la producción, el péptido se escinde proteolíticamente y se carga un péptido galactosilado preparado sintéticamente (es decir, un péptido CII que lleva gal-Hyl en la posición K264) y/o un péptido CII no modificadoin vitroen el complejo. Aunque este péptido galactosilado sintético y/o no modificado se puede unir covalentemente a la proteína HLA-D<r>, este enlace no se realiza a través de un péptido enlazador.
Alternativamente, la composición para su uso según la presente invención se puede preparar mediante un método para producir un complejo peptídico HLA-DR/CII que comprende un péptido CII que comprende transfectar una célula de mamífero con (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una región extracelular de una cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una región extracelular de una cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1; y (iii) un polinucleótido que codifica un péptido de colágeno II (péptido CII) unido al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, en donde el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en AGFKGEQGPKG, a Gf KGEQGPXG, AGFKGEXGPKG, AGFKGXQGPKG, AGFKXEQGPKG, AGFKGEXGPXG, AGFKGXQGPXG y AGFKXEQGPXG, y en donde el complejo peptídico HLA-DR/CII comprende un péptido de unión a condroitina en el extremo C-terminal del polipéptido que comprende la cadena alfa de HLA-DR y/o la cadena beta de HLA-DR; (b) cultivar las células de mamífero en condiciones adecuadas para producir el complejo peptídico HLA-DR/CII, y (c) recolectar un sobrenadante celular y opcionalmente las células que comprenden el complejo peptídico HLA-D<r>/CII que comprende un péptido CII no modificado y/o modificado postraduccional. En el péptido CII modificado postraduccionalmente al menos el primer resto de lisina del péptido CII puede ser hidroxilisina (Hyl) o Hyl O-glicosilada. Preferiblemente, el al menos primer resto de lisina es hidroxilisina o galactosilhidroxilisina, más preferiblemente galactosilhidroxilisina.
El método puede comprender además una etapa de análisis del perfil de glicosilación del péptido CII del complejo peptídico HLA-DR/CII. Los métodos para analizar el perfil de glicosilación son bien conocidos en la técnica e incluyen métodos tales como espectrometría de masas. El método para producir un complejo peptídico HLA-DR/CII es un métodoin vitro,en el sentido de que los complejos peptídicos HLA-DR/CII se producen en una línea celular en una placa de cultivo celular o en un fermentador. Además, el método comprende el uso de líneas celulares de mamíferos, en lugar de células primarias.
En determinadas realizaciones, el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos de AGFKGEQGPKG, AGFKGEQGPX1G, AGFKGEX2GPKG, AGFKGX3QGPKG, AGFKX4EQGPKG, AGFKGEX2GPX1G, AGFKGX3QGPX1G y AGFKX4EQGPX1G, en donde X1 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinogénicos excepto K, preferiblemente R, A, G o Q, más preferiblemente R; X2 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinogénicos excepto Q; preferiblemente A, R, H o G; X3 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinógenos excepto E, preferiblemente A, D, Q o G; y X4 es uno cualquiera de los aminoácidos proteinógenos excepto G, más preferiblemente A, S, V o L. Preferiblemente X2, X3 o X4 no es K. En determinadas realizaciones, el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos de AGFKGEQGPKG o AGFKGEQGPX1G, preferiblemente de AGFKGEQGPKGEP o AGFKGEQGPX1GEP, más preferiblemente de GIAGFKGEQGPKGEP o GIAGFKGEQGPX1GEP.
Preferiblemente, al menos el dominio alfa 1 es de DRA*0101 y al menos el dominio beta 1 es de un alelo de HLA-DR seleccionado del grupo que consiste en DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*0408, DRB1*0409, DRB1*0101, DRB1*0102, DRB1*1001, DRB1*1402 y DRB1*1303, preferiblemente DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*0408, DRB1*0409, DRB1*0101, DRB1*0102, DRB1*1001 y DRB1*1402, más preferiblemente DRB1*0401, DRB1*0404 y DRB1*0405, incluso más preferiblemente DRB1*0401. Más preferiblemente, el dominio alfa 1 y el dominio alfa 2 son de DRA*0101 (dominios alfa 1 y 2: aminoácidos 19-200 de SEQ ID NO: 16) y el dominio beta 1 y el dominio beta 2 son de un alelo de HLA-DR seleccionado del grupo que consiste en DRB1*0401, DRB1*0404 y DRB1*0405, DRB1*0408, DRB1*0409, DRB1*0101, DRB1*0102, DRB1*1001, DRB1*1402 y DRB1*1303, preferiblemente DRB1 *0401, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*0408, DRB1*0409, DRB1*0101, DRB1*0102, DRB1*1001 y DRB1*1402, más preferiblemente DRB1*0401, DRB1*0404 y DRB1*0405, incluso más preferiblemente DRB1*0401 (dominio beta 1 y 2: aminoácidos 60-250 de SEQ ID NO: 17).
Los complejos peptídicos HLA-DR/CII específicos usados en los ejemplos se abrevian como sigue: DR4/hCll (glicosilado de manera natural, humano), DR4/nCII (desnudo o no modificado, humano), DR4/galCII (galactosilado (Gal-Hyl en K264, humano), en donde el péptido CII usado tiene la secuencia de aminoácidos GIAGFKGEQGPKGEP (SEQ ID NO: 13). Los respectivos complejos MHCII/CII de ratón usados en los ejemplos se abrevian como sigue: Aq/rCII (glicosilado de manera natural, CII de rata), Aq/nCII (desnudo o no modificado, CII de rata), Aq/galCII (galactosilado (Gal-Hyl en K264), rata), en donde el péptido CII de rata usado tiene la secuencia de aminoácidos GIAGFKGEQGPKGET (SEQ ID NO: 29),
El péptido de colágeno II (péptido Cll) puede unirse con el extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente con el extremo N-terminal de la cadena beta de HLA-DR. El término "péptido enlazador" se refiere a un polipéptido que consiste en múltiples restos de aminoácidos. El péptido enlazador puede ser cualquier péptido siempre que sea lo suficientemente largo y flexible para permitir que el péptido se una al bolsillo de unión peptídica formado por el complejo HLA-DR. Un ejemplo de un enlazador adecuado es un enlazador Gly-Ser. El péptido CII, el enlazador peptídico y al menos una de las regiones extracelulares de la cadena alfa de HLA-DR y la cadena de HLA-DR pueden expresarse como un polipéptido y codificarse por un polinucleótido. El término "fusionado con" en este contexto significa "unido a" en donde la unión se realiza mediante enlaces peptídicos, utilizando opcionalmente un péptido enlazador, y por lo tanto se genera una proteína de fusión.
Los complejos peptídicos HLA-DR/CII contienen al menos un péptido de unión a condroitina, preferiblemente un péptido de unión a condroitina y ácido hialurónico (también denominado hialuronano). Preferiblemente, el péptido de unión a condroitina está situado en el extremo C-terminal de al menos una cadena polipeptídica del complejo. En una realización, el complejo peptídico HLA-DR/CII comprende al menos un péptido de unión a condroitina C-terminal. Los péptidos de unión a condroitina son conocidos en la técnica e incluyen, sin estar limitado a, péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos EKRIWFPYRRF (SEQ ID NO: 31), YKTNFRRYYRF (SEQ ID NO: 32) o VLIRHFRKRYY (SEQ ID NO: 33) (Butterfield KC et al., Biochemistry. 2010 Feb 23;49(7):1549-55). También se han identificado en la presente memoria péptidos de histonas cargados positivamente, particularmente péptidos de la histona H2A humana tales como un péptido que comprende la secuencia SGRGk Qg GKARAKAKTr Ss R (SEQ ID NO: 34). En una realización, el péptido de unión a condroitina comprende de 5 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 6 a 20 aminoácidos, más preferiblemente de 6 a 12 aminoácidos. Preferiblemente, el péptido de unión a condroitina comprende 5 o más, preferiblemente 6 o más, más preferiblemente 7 o más aminoácidos cargados positivamente.
Además o de forma independiente, el péptido de unión a condroitina comprende al menos dos aminoácidos consecutivos cargados positivamente, preferiblemente al menos tres aminoácidos consecutivos cargados positivamente. También los aminoácidos más básicos, tales como la lisina (pK de 10,5) y la arginina (pK de 12,5), parecen mejorar el efecto de unión de la condroitina a la histidina (pK de 6,0), particularmente para aminoácidos alternados cargados positivamente. Sin embargo, se debe tener cuidado para evitar cambiar las características bioquímicas de la proteína al incluir un péptido muy básico. En una realización, el péptido de unión a condroitina es una etiqueta de polihistidina, que tiene preferiblemente al menos 6 restos de histidina consecutivos (al menos una etiqueta de hexahistidina), más preferiblemente que tiene al menos 7 restos de histidina consecutivos (al menos una etiqueta de heptahistidina).
Los términos condroitina y sulfato de condroitina se usan indistintamente en la presente memoria y, por lo tanto, el péptido de unión a condroitina también puede denominarse péptido de unión a sulfato de condroitina. Para aumentar la unión al hialuronano, una secuencia ejemplar que contiene el motivo de consenso de unión se define de la siguiente manera: B(X7)B, en donde B es R o K y x 7 no contiene restos ácidos y al menos un aminoácido básico (Yang B et al., EMBO J. 1994 Jan 15; 13 (2): 286-96). Tal y como se describe en la presente memoria, el complejo peptídico HLA-DR/CII también puede unirse al sulfato de condroitina a través de la etiqueta de his. Por lo tanto, el péptido de unión a condroitina puede ser una etiqueta de polihistidina o cualquier otra secuencia de aminoácidos que aumente la afinidad de unión a la condroitina, tal como, EKRIWFPYRRF (SEQ ID NO: 31), YKTNFRRYYRF (SEQ ID NO: 32), VLIRHFRKRYY (SEQ ID NO: 33) o SGRGKQGGKARAKAKTRSSR (SEQ ID NO: 34). Una etiqueta de polihistidina puede ser una etiqueta de hexahistidina (6xHis, HHHHHH; SEQ ID NO: 41), más preferiblemente una etiqueta de heptahistidina (7xHis; HHHHHHH; SEQ ID NO: 42), una etiqueta de histidina que comprende al menos 7 histidinas consecutivas, o una etiqueta de histidina modificada que comprende al menos 6 histidinas, tal como una etiqueta HQ, que comprende alternancia de histidina y glutamina, una etiqueta de HN que comprende alternancia de histidina y asparagina o una etiqueta de HAT que comprende la secuencia de aminoácidos KDHLIHNVHKEEHAHAHNK (SEQ ID NO: 36). En caso de que los complejos peptídicos HLA-DR/CII comprendan un dominio de heterodimerización, el péptido de unión a condroitina es el C-terminal del dominio de heterodimerización. La condroitina y el ácido hialurónico son ambos componentes importantes del cartílago.
Transfectar tal y como se usa en la presente memoria significa introducir el DNA en la célula de mamífero usando métodos de transfección conocidos en la técnica. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "transfección" o "que transfecta" incluye "transducción" y "que transduce", que a menudo se usa para describir la transferencia de genes mediada por virus a células eucariotas. El polinucleótido puede ser DNA o RNA, preferiblemente DNA. La transfección puede ser transfección transitoria o transfección estable. Preferiblemente el polinucleótido está presente en un vector, preferiblemente un vector de expresión.
Los métodos para la integración estable son bien conocidos en la técnica. Brevemente, la integración estable se logra comúnmente mediante la introducción transitoria de al menos un polinucleótido recombinante o un vector que contiene al menos un polinucleótido recombinante en la célula huésped de mamífero, lo que facilita la integración estable de dicho polinucleótido recombinante en el genoma de la célula de mamífero. Normalmente, el polinucleótido recombinante está flanqueado por brazos de homología, es decir, secuencias homólogas a la región anterior y posterior del sitio de integración. Se puede elegir un vector para introducir el polinucleótido recombinante en la célula de mamífero de una gran variedad de sistemas de vectores adecuados, tales como plásmidos, retrovirus, cósmidos, episomas derivados de EBV y similares. Se pueden usar diversos vectores lanzadera, por ejemplo, vectores que pueden replicarse de forma autónoma en una pluralidad de microorganismos huésped tales como E.coliyPseudomonas sp.Antes de su introducción en la célula huésped de mamífero, los vectores circulares pueden linealizarse para facilitar la integración en el genoma de la célula de mamífero. Los métodos para la introducción de vectores en células de mamíferos son bien conocidos en la técnica e incluyen la transfección con métodos biológicos, tales como administración viral, con métodos químicos, tales como el uso de polímeros catiónicos, fosfato de calcio, lípidos catiónicos o aminoácidos catiónicos; con métodos físicos, tales como la electroporación o la microinyección.
El polinucleótido recombinante integrado de manera estable en el genoma de la célula de mamífero puede ser parte de un casete de expresión. Un casete de expresión comprende al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un producto génico, tal como un RNA y/o una proteína, unido operativamente a un promotor y opcionalmente medios adicionales para controlar la expresión del producto(s) génico. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a, potenciadores, señales de terminación, señales de poliadenilación y una región 3' no traducida, que normalmente contiene un sitio de poliadenilación. El promotor puede ser un promotor débil o un promotor fuerte que soporte un alto nivel de expresión del producto génico de interés. Dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores CMV (citomegalovirus), promotores SV40 (virus vacuolizante de simio 40), promotores RSV (virus del sarcoma de Rous), promotores de adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP), promotores CHEF-1 (factor 1 de elongación derivado de CHO), polioma y promotores fuertes de mamíferos tales como inmunoglobulina nativa y promotores de actina o el promotor natural de al menos un polinucleótido heterólogo. Preferiblemente, el promotor es un promotor CMV o un promotor SV40, lo más preferiblemente un promotor CMV. Ejemplos de señales de poliadenilación son BGH poliA, SV40 tardía o polyA temprana; alternativamente, se pueden usar genes 3'UTR s de inmunoglobulina, etc. El experto comprenderá además que la región 3' no traducida puede diseñarse para soportar altos niveles de expresión, por ejemplo, eliminando elementos de inestabilidad, tales como AREs (elementos ricos en adenilato-uridilato).
El producto génico puede además colocarse bajo el control de un marcador de selección genético amplificable, tal como dihidrofolato reductasa (DHFR), glutamina sintetasa (GS). El gen marcador de selección amplificable puede estar en el mismo vector de expresión que el casete de expresión de la proteína terapéutica secretada. Alternativamente, el gen marcador de selección amplificable y el casete de expresión de la proteína terapéutica secretada pueden estar en vectores de expresión diferentes, pero integrarse muy próximos en el genoma de la célula huésped. Dos o más vectores que se co-transfectan simultáneamente, por ejemplo, a menudo se integran muy próximos en el genoma de la célula huésped. Después, la amplificación de la región genética que contiene el casete de expresión de la proteína terapéutica secretada se media añadiendo el agente de amplificación (por ejemplo, MTX para DHFR o MSX para GS) al medio de cultivo.
Se pueden lograr niveles estables suficientemente altos del producto génico en la célula huésped o en la célula productora, por ejemplo, mediante clonación de múltiples copias de un polinucleótido heterólogo en un vector de expresión. Se puede combinar además la clonación de múltiples copias de un polinucleótido recombinante en un vector de expresión y la amplificación del casete de expresión de la proteína terapéutica secretada (que codifica el complejo peptídico HLA-DR/CII) como se describió anteriormente.
El polinucleótido que codifica una región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1 puede estar presente en un vector (primer polinucleótido) y el polinucleótido que codifica una región extracelular de la cadena de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1 (segundo polinucleótido) en otro vector, en donde el péptido de unión a condroitina está codificado además por el primer o el segundo polinucleótido para proporcionar un péptido de unión a condroitina en el extremo C-terminal del polipéptido que comprende la cadena alfa de HLA-DR y/ o la cadena beta HLA-DR. Alternativamente, el primer y el segundo polinucleótidos pueden formar parte de casetes de expresión separados en el mismo vector. El primer y el segundo polinucleótidos también pueden formar un único polinucleótido que codifica un único polipéptido de fusión que comprende la región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1; la región extracelular de la cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1; y opcionalmente además el péptido de colágeno II (péptido Cll) unido al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HlA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente a la cadena beta de HLA-DR, en donde el complejo peptídico HLA-DR/CII comprende un péptido de unión a condroitina en el extremo C-terminal del polipéptido del polipéptido de fusión (heterodímero monocatenario).
Alternativamente, en caso de que la proteína HLA-DR se exprese como dos polipéptidos, la cadena alfa de HLA-DR se une en su extremo C-terminal (C-terminalmente) a un primer dominio funcional de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina y la cadena beta de HLA-DR se une en su extremo C-terminal a un segundo dominio funcional complementario de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina. El primer dominio funcional y el segundo dominio funcional complementario pueden ser un dominio de heterodimerización de cremallera de leucina ácido y básico, preferiblemente un motivo de cremallera de leucina jun-fos. El primer y/o el segundo polinucleótido codifican además un péptido de unión a condroitina, tal como una etiqueta de polihistidina, en el extremo C-terminal del dominio funcional de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina.
La célula de mamífero se cultiva en condiciones adecuadas para producir el complejo peptídico HLA-DR/CII, y el sobrenadante celular y/o las células se cosechan, en donde el sobrenadante celular y/o las células comprenden el complejo peptídico HLA-DR/CII que comprende un péptido CII no modificado y/o modificado postraduccionalmente. En el péptido CII modificado postraduccionalmente, el primer resto de lisina del péptido CII puede ser hidroxilisina (Hyl) o hidroxilisina O-glicosilada, preferiblemente el primer resto de lisina es hidroxilisina o galactosil-hidroxilisina, más preferiblemente galactosil-hidroxilisina. El método puede comprender además una etapa de análisis del perfil de glicosilación del péptido CII del complejo peptídico HLA-DR/CII. Los métodos para analizar el perfil de glicosilación son bien conocidos en la técnica e incluyen métodos tales como espectrometría de masas.
En principio, se puede utilizar cualquier célula de mamífero adecuada para la producción de proteínas de alto rendimiento para la producción del complejo peptídico HLA-DR/CII, incluyendo células HEK293 y células CHO. En caso de que el péptido CII esté unido con el extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o de la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador y el péptido CII deba modificarse postraduccionalmente, la línea de células de mamífero es adecuada, mientras que comprenda enzimas para modificar postraduccionalmente los restos de lisina en el colágeno, que comprenden hidroxilar lisina a hidroxilisina (Hyl) y galactosilar Hyl a galactosilhidroxilisina (Gal-Hyl). El término "galactosilado" tal y como se usa en la presente memoria en el contexto de lisina incluye que la lisina haya sido hidroxilada a hidroxilisina antes de la galactosilación. Las enzimas pueden estar presentes endógenamente en la célula o pueden expresarse de forma recombinante en la célula. Preferiblemente, la célula de mamífero comprende una lisilhidroxilasa (EC 1.14.11.4) y una colágeno galactosiltransferasa (EC 2.4.1.50), preferiblemente lisilhidroxilasa 1 (LH1) y/o lisilhidroxilasa 2 (LH2) y colágeno galactosiltransferasa GLT25D1 y/o GLT25D2, preferiblemente GLT25D1. Estas enzimas modifican postraduccionalmente el colágeno. Por lo tanto, es probable que estas enzimas estén presentes en líneas celulares que producen colágeno, tales como células de riñón, células de fibroblastos o células de osteoclastos, particularmente células de riñón, tales como células HEK 293 o derivados de las mismas. Las células HEK 293 pueden cultivarse como células adherentes o en suspensión. Un ejemplo para una célula HEK 293 adecuada para el método según la invención es la célula HEK 293 o la célula HEK 293F, tal como la célula Expi293F (Gibco, Cat. No. A14527, también disponible como cGMP depositado Cat. No. 100044202). Otras células HEK 293 adecuadas incluyen células HEK 293T y/o células en suspensión de las mismas. Fue sorprendente que también los pequeños péptidos presentados por las proteínas MHC II puedan modificarse postraduccionalmente en estas células. Aunque los péptidos se derivan del colágeno, están presentes en un entorno completamente diferente (antinatural) dentro del complejo MHC II. Observamos a este respecto que, las proteínas MHC II de origen natural se cargan con péptidos de proteínas extracelulares (modificadas postraduccionalmente) que se digieren en la APC. Por lo tanto, la modificación ya está presente en la proteína endocitosada y no se añade intracelularmente. Además, ha resultado sorprendente que el producto heterogéneo producido cuando se glicosilain situes adecuado para la terapia. Las células adecuadas pueden seleccionarse fácilmente para detectar las enzimas necesarias para la modificación postraduccional de los restos de lisina en el colágeno, tal como mediante transferencia Western usando anticuerpos adecuados o mediante expresión de RNA, o funcionalmente por su capacidad para glicosilar el colágeno tipo II o los complejos peptídicos HLA-DR/CII. Los métodos para detectar la expresión de genes o proteínas o la actividad enzimática y los perfiles de glicosilación son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de células de mamífero adecuadas son una célula de riñón, una célula de fibroblasto o una célula de osteoblasto, preferiblemente una célula o línea celular HEK 293. Se ha descrito previamente que las células HEK 293 expresan lisilhidroxilasas PLOD1 y PLOD2 (que codifican LH1 y LH2, respectivamente), galactosiltransferasas GLT25D1 y GLT25D2 y además PLOD3 (que codifican LH3).
Las células CHO comúnmente utilizadas para la producción de proteínas han sido probadas y no son capaces de añadir modificaciones postraduccionales suficientes en los restos de lisina que dan como resultado galactosilhidroxilisina (Gal-Hyl) en colágeno o en el complejo peptídico HLA-DR/CII descrito en la presente memoria. Sin embargo, la célula de mamífero también puede ser una célula modificada genéticamente para expresar una lisilhidroxilasa y una colágeno galactosiltransferasa. Preferiblemente, la célula de mamífero se modifica genéticamente para expresar de manera recombinante lisilhidroxilasa 1 (LH1) y/o lisilhidroxilasa 2 (LH2) y colágeno galactosiltransferasa GLT25D1 y/o GLT25D2, preferiblemente GLT25D1. GLT25D2 se expresa sólo en unos pocos tipos de células y, por lo tanto, es menos probable que sea responsable de la modificación normal del colágeno. Cualquier célula de mamífero puede modificarse genéticamente para expresar de forma recombinante una lisilhidroxilasa y una colágeno galactosiltransferasa, preferiblemente lisilhidroxilasa 1 (LH1) y/o lisilhidroxilasa 2 (LH2) y colágeno galactosiltransferasa GLT25D1 y/o GLT25D2. Preferiblemente, la célula de mamífero genéticamente modificada como se describe es una célula CHO, más preferiblemente una célula CHO-DG44, una célula CHO-K1, una célula CHO-DXB11, una célula CHO-S, una célula deficiente en CHO glutamina sintetasa (GS) o un derivado de una cualquiera de estas células.
El experto en la técnica entenderá que los complejos peptídicos HLA-DR/CII producidos en una célula de mamífero capaz de modificar postraduccionalmente restos de lisina en colágeno, es decir, que comprenden enzimas para modificar postraduccionalmente restos de lisina en colágeno, son una mezcla heterogénea de complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden diferentes modificaciones postraduccionales del péptido CII, particularmente en el primer y opcional segundo resto de lisina del péptido CII. La mezcla heterogénea comprende los complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden K, Hyl, G-Hyl o GG-Hyl en la primera lisina e independientemente K, Hyl, G-Hyl o GG-Hyl en la segunda lisina opcional (en donde K = lisina, Hyl = hidroxilisina, G-Hyl = galactosilhidroxilisina, GG-Hyl = glucosilgalactosil-hidroxilisina).
Por lo tanto, el sobrenadante de células recolectadas y, opcionalmente, las células recolectadas comprenden los complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden el péptido CII, en donde el primer resto de lisina del péptido CII es Hyl o gal-Hyl y comprende además complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden el Péptido CII, en donde el primer resto de lisina del péptido CII no está modificado o glucosilgalactosil-hidroxilisina (GG-Hyl), preferiblemente no modificado y el segundo resto de lisina opcional del péptido CII está independientemente no modificado, hidroxilisina (Hyl), galactosil-hidroxilisina (G-Hyl) o glucosilgalactosil-hidroxilisina (GG-Hyl), preferiblemente no modificado, hidroxilisina (Hyl) o galactosilhidroxilisina (G-Hyl). Preferiblemente, el sobrenadante de células recolectadas y, opcionalmente, las células recolectadas no comprenden complejos peptídicos HLA-DR/CII, en donde el segundo resto de lisina es glucosilgalactosil-hidroxilisina. Más preferiblemente, el sobrenadante de células recolectadas y, opcionalmente, las células recolectadas no comprenden complejos peptídicos HLA-DR/CII modificados con glucosilgalactosil-hidroxilisina (GG-Hyl), es decir, complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprenden un péptido Cll O-glicosilado en donde el primero y /o el segundo resto opcional de lisina es glucosilgalactosil-hidroxilisina. También se puede lograr una mezcla de complejos peptídicos HLA-DR/CII cargando péptidos Cll no modificados y modificados postraduccionalmente en proteínas HLA-Dr . El experto en la técnica entenderá que se pueden lograr diferentes proporciones.
La mezcla heterogénea de complejos peptídicos HLA-DR/CII (preparados mediante la carga del péptido Cll o expresión del péptido CII como proteína de fusión con la proteína HLA-DR) comprende al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos el 40 % o al menos el 50 % de G-Hyl en la primera lisina (K264) del péptido CII del total de complejos peptídicos HLA-DR/CII en la mezcla o composición. Además, la mezcla heterogénea de complejos peptídicos HLA-DR/CII comprende no más del 90 %, no más del 80 %, no más del 70 %, no más del 60 % o no más del 50 % de péptidos Cll no modificados del total de complejos peptídicos HLA-DR/CII en la mezcla o la composición. Preferiblemente, la mezcla heterogénea de complejos peptídicos HLA-DR/CII comprende por separado o además menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 % y más preferiblemente menos del 1 % de GG-Hyl en el péptido oleoso del total de complejos peptídicos HLA-DR/CII en la mezcla o la composición. En donde el porcentaje se refiere al porcentaje de péptido CII en los complejos peptídicos HLA-DR/CII del total de péptidos CII en los complejos peptídicos HLA-DR/CII. El segundo resto de lisina (K270) puede mutarse, por ejemplo mutarse a arginina (K270R). Esto evita la modificación postraduccional en esta posición del péptido CII expresado como proteína de fusión con la proteína HLA-DR y evita una posible interferencia con la unión de TCR. Preferiblemente, la segunda lisina (opcional) no se modifica postraduccionalmente a glucosilgalactosil-hidroxilisina (GG-Hyl) y está presente como lisina no modificada, hidroxilisina o galactosilhidroxilisina, preferiblemente no modificada.
Para reducir la heterogeneidad de la mezcla de complejos de péptidos HLA-DR/CII y la formación voluminosa de glucosilgalactosilhidroxilisina, es aún más ventajoso si la célula de mamífero carece de actividad de galactosilhidroxilisil glucosiltransferasa (EC 2.4.1.66). Por lo tanto, en una realización, la célula de mamífero carece de actividad de galactosilhidroxilisil glucosiltransferasa. Preferiblemente, la célula de mamífero carece de lisilhidroxilasa 3 (LH3). LH3 es una enzima multifuncional que comprende actividad de lisilhidroxilasa (LH), galactosiltransferasa (GT) y galactosilhidroxilisil glucosiltransferasa (GGT), en donde la función principal de la enzima parece ser la actividad de GGT. La actividad de LH3 se puede eliminar o reducir mediante enfoques knock-down o knock-out. La expresión de enzimas se puede reducir, por ejemplo, utilizando RNA de interferencia, tal como siRNA o shRNA.
El término "RNA de interferencia" (RNAi) se refiere a la supresión de la expresión génica (síntesis de proteínas) específica de secuencia o específica de gen, sin la supresión generalizada de la síntesis de proteínas. El r Naí puede implicar la degradación del RNA mensajero (mRNA) por un complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC), impidiendo la traducción del mRNA transcrito. La supresión de la expresión genética provocada por RNAi puede ser transitoria o puede ser más estable, incluso permanente. El RNAi puede estar mediado por miRNA, siRNA o shRNA. Preferiblemente, el RNAi según la invención es específico de un gen (sólo se dirige a un gen). El RNAi específico de un gen puede estar mediado por siRNA o shRNA.
Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "pequeña interferencia" o "RNA de interferencia corto" o "siRNA" se refieren a un dúplex de nucleótidos de RNA que está dirigido a un gen deseado y es capaz de inhibir la expresión de un gen con el que comparte homología. Se forma a partir de RNA bicatenario largo (dsRNA) o shRNA. El dúplex de RNA normalmente comprende dos RNAs monocatenarios complementarios de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 nucleótidos que forman 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. 24, 25, 26 o 27 pares de bases y poseen protuberancias en 3' de dos nucleótidos, preferiblemente el dúplex de RNA comprende dos RNAs monocatenarios complementarios de 19-27 nucleótidos que forman 17-25 pares de bases y poseen protuberancias en 3' de dos nucleótidos. El siRNA está "dirigido" a un gen, en donde la secuencia de nucleótidos de la porción del dúplex del siRNA es complementaria a una secuencia de nucleótidos del mRNA del gen objetivo. El siRNA o un precursor del mismo siempre se introduce de forma exógena en la célula, por ejemplo, directamente o mediante transfección de un vector que tiene una secuencia que codifica dicho siRNA, y se aprovecha la via del miRNA endógeno para el procesamiento correcto del siRNA y la escisión o degradación del mRNA objetivo. El RNA dúplex se puede expresar en una célula a partir de un solo constructo.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "shRNA" (horquilla pequeña de RNA) se refiere a un dúplex de RNA en donde una porción del siRNA es parte de una estructura en horquilla (shRNA). El shRNA se puede procesar intracelularmente en un siRNA funcional. Además de la porción del dúplex, la estructura de horquilla puede contener una porción de bucle colocada entre las dos secuencias que forman el dúplex. El bucle puede variar en longitud. En algunas realizaciones, el bucle tiene una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 nucleótidos. La estructura de horquilla también puede contener porciones protuberantes en 3' o 5'. En algunos aspectos, la protuberancia es un saliente en 3' o 5' de 0, 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud. En un aspecto de esta invención, una secuencia de nucleótidos comprendida en el vector sirve como una plantilla para la expresión de una horquilla pequeña de RNA, que comprende una región sentido, una región de bucle y una región antisentido. Tras la expresión, las regiones sentido y antisentido forman un dúplex. El shRNA siempre se introduce de forma exógena, por ejemplo, mediante transfección de un vector que tiene una secuencia que codifica dicho shRNA, y se aprovecha la via del miRNA endógeno para el procesamiento correcto del siRNA y la escisión o degradación del mRNA objetivo. El uso de un vector que tiene una secuencia que codifica un shRNA tiene la ventaja sobre el uso de siRNA sintetizado químicamente en que la supresión del gen objetivo normalmente es estable y a largo plazo.
Normalmente, el siRNA y el shRNA median la represión del mRNA mediante una complementariedad de secuencia completa (es decir, un emparejamiento perfecto de bases entre la cadena antisentido del dúplex de RNA del RNA de interferencia pequeño y el mRNA objetivo) y, por lo tanto, son específicos de su objetivo. La cadena antisentido del dúplex de RNA también puede denominarse cadena activa del dúplex de RNA. La complementariedad de la secuencia completa del emparejamiento perfecto de bases tal y como se usa en la presente memoria significa que la cadena antisentido del dúplex de RNA del RNA de interferencia pequeño tiene al menos un 89 % de identidad de secuencia con el mRNA objetivo para al menos 15 nucleótidos continuos, al menos 16 nucleótidos continuos, al menos 17 nucleótidos continuos, al menos 18 nucleótidos continuos y preferiblemente al menos 19 nucleótidos continuos, o preferiblemente al menos un 93% de identidad de secuencia con el mRNA objetivo para al menos 15 nucleótidos continuos, al menos 16 nucleótidos continuos, al menos 17 nucleótidos continuos, al menos 18 nucleótidos continuos y preferiblemente al menos 19 nucleótidos continuos. Más preferiblemente la cadena antisentido del dúplex de RNA del RNA de interferencia pequeño tiene una identidad de secuencia del 100 % con el mRNA objetivo para al menos 15 nucleótidos continuos, al menos 16 nucleótidos continuos, al menos 17 nucleótidos continuos, al menos 18 nucleótidos continuos y preferiblemente al menos 19 nucleótidos continuos.
Alternativamente, la enzima no se expresa o el gen puede estar mutado o eliminado. Por lo tanto, la célula de mamífero carece de actividad de galactosilhidroxilisil glucosiltransferasa. En determinadas realizaciones, la célula de mamífero carece de la enzima multifuncional LH3. Por ejemplo, el gen puede estar silenciado o no expresado suficientemente. En otras determinadas realizaciones, la célula de mamífero comprende una enzima LH3 mutante que carece de actividad de galactosilhidroxilisil glucosiltransferasa.
La célula de mamífero también puede modificarse genéticamente para que tenga actividad de galactosilhidroxilisil glucosiltransferasa reducida o nula. El genPLOD3que codifica LH3 puede estar mutado o eliminado; y/o la enzima LH3 puede ser una enzima LH3 mutada que carece de actividad de galactosilhidrosilil glucosiltransferasa. Los métodos para eliminar o mutar genes son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de enzimas de edición de DNA específicas de secuencia. Una "enzima de edición de DNA específica de secuencia" o una "nucleasa específica de sitio" tal y como se usa en la presente memoria es una proteína que permite la escisión de DNA en secuencias de nucleótidos definidas (sitios de reconocimiento). Dicha escisión puede ocurrir en una o ambas de las dos cadenas de DNA complementarias y así permitir, por ejemplo, la mutagénesis dirigida, la eliminación dirigida de secuencias de DNA genómico específicas o dar como resultado la recombinación dirigida al sitio del DNA objetivo escindido con un polinucleótido heterólogo. La especificidad de secuencia de dichas enzimas de edición puede resultar de uno o más dominios de proteínas de unión a DNA específicos de secuencia dentro de la enzima de edición, o de la unión de la enzima a un polinucleótido guía (por ejemplo, RNA guía) que lo dirige a una secuencia de DNA con al menos complementariedad parcial con dicho polinucleótido guía. Por lo tanto, el sitio de reconocimiento de dichas enzimas de edición puede alterarse modificando genéticamente los dominios de la proteína de unión al DNA o utilizando polinucleótidos guía alternativos. En la técnica se conocen enzimas de edición de DNA específicas de secuencia múltiple, ejemplos no limitantes de las cuales son nucleasas con dedos de zinc (ZFNs), meganucleasas, nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALENs) y nucleasas asociadas a CRISPR.
Preferiblemente, la célula de mamífero genéticamente modificada que carece de actividad de galactosilhidroxilisil glucosiltransferasa es una célula o línea celular HEK 293. Un ejemplo de una línea celular que se beneficiaría de la reducción de la galactosilhidrosilisil glucosiltransferasa para la producción de los complejos HLA-DR/CII es la célula Expi293F (Gibco, Cat. No. A14527, también disponible como cGMP Banked Cat. No. 100044202). La actividad de galactosilhidroxilisil glucosiltransferasa también se puede inhibir utilizando ácido carmínico durante el cultivo.
Las células de mamífero se establecen, adaptan y cultivan completamente preferiblemente en condiciones libres de suero y, opcionalmente, en medios que están libres de cualquier proteína/péptido de origen animal. Medios disponibles comercialmente tales como PreproGow™ HEK293 Media (PREPROT<e>C<h>, USA) Expi293™ Expression Medium (Thermo Fisher, USA), HAM's f 12 (Sigma, Deisenhofen, Alemania) RPPMI (Sigma), Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma), Medio esencial mínimo (MEM; Sigma), Medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), medio CHO sin suero (Sigma) y medio CHO sin proteínas (Sigma) son soluciones nutritivas apropiadas a modo de ejemplo. Cualquiera de los medios puede suplementarse según sea necesario con una variedad de compuestos, ejemplos no limitantes de los cuales son hormonas recombinantes y/u otros factores de crecimiento recombinantes (tales como insulina, transferrina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento similar a la insulina), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina, timidina), glutamina, glucosa u otras fuentes de energía equivalentes, antibióticos y oligoelementos. También se pueden incluir cualesquiera otros suplementos necesarios en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Para el crecimiento y selección de células modificadas genéticamente que expresan un gen seleccionable se añade al medio de cultivo un agente de selección adecuado.
EJEMPLOS
Sustancias y formulaciones de prueba.
Aq/galCII o DR4/galCII (cargado con Gal-péptido sintético: GIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEP) y Aq/nCII o DR4/nCII (cargado con péptido no modificado: GIAg Fk Ge QGPKGEP; SEQ ID No : 13): la proteína Aq-mCLIPmt se expresó en la línea celular HEK293 (células Expi293F, Gibco, Cat. No. A14527) o células c Ho (Figura 4) mediante transfección transitoria, se purificó usando una combinación de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) usando la etiqueta de His y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Después, el pre-péptido unido covalentemente se sustituyó mediante la escisión con trombina y la adición de un exceso de Gal-péptido o péptido no modificado. Finalmente, se realizó SEC para eliminar el pre-péptido escindido y el exceso de Gal-péptido o péptido no modificado. Gal-péptido: GIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEP) se sintetizaron, purificaron y caracterizaron, como se describe en Diogo, D. et al., Curr Opin Rheumatol. 2014; 26: 85-92; Gregersen PK et al., Arthritis Rheum.
1987;30:1205-1213; Duke O et al., Clin Exp Immunol. 1982;49:22-30.
Aq/rCII de ratón y DR4/hCII humana glicosada de manera natural: La proteína Aq/rCII de ratón y DR4/hCll humana glicosada de manera natural se expresó en la línea celular HEK293 (células Expi293F, Gibco, Cat. No. A14527) mediante transfección transitoria y se purificó usando una combinación de cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) utilizando la etiqueta de His y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Para los experimentosin vivo,los complejos MHC II-péptido se diluyeron hasta las concentraciones deseadas en PBS estéril (Gibco), se filtraron usando un filtro de punta de jeringa DynaGard de 0,2 pm y se llenaron 100 pl de solución de proteína en bombas microosmóticas ALZET (corporación DURECT, modelo 1007D, 0,5 pl/h, 7 días) utilizando técnicas estériles. Las bombas se manipularon con guantes quirúrgicos. Para garantizar el bombeo inmediato de la sustancia, las bombas precargadas se colocaron en PBS durante la noche a 4°C antes de la implantación.
Más específicamente, los cDNAs que codifican las dos cadenas del complejo como se representa en la Figura 1 se sintetizaron en Eurofins con los sitios de restricciónkpnyoyxhoIen los extremos 5' y 3'. Los cDNAs sintetizados se digirieron utilizando las enzimas de restricciónkpnyoy xhoYo (FastDigest™, ThermoFisher Científico). Los fragmentos de DNA digeridos se clonaron por separado en el vector de expresión de mamíferos pCEP4 (Life technologies) después de la digestión con las mismas enzimas de restricción. Después de la verificación de la secuencia, los dos plásmidos recombinantes que codifican las dos cadenas del complejo se co-transfectaron en células Expi393F™ con el reactivo de transfección de DNA FectoPRO™ (transfección Polyplus). Los sobrenadantes se recogieron 6 días después de la transfección. La proteína recombinante se capturó primero usando una columna de afinidad HisTrap Excel (GE Healthcare Life Sciences) de 5 ml, seguida de cromatografía de exclusión por tamaño en Superdex 200 pg (GE Healthcare life Sciences). La proteína recombinante se purificó como un pico único y se concentró, se diafiltró en tampón de biotinilación (Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, pH 8,0) usando un dispositivo centrífugo Amicon con MWCO de 10 kDa. La biotinilación utilizando biotina-proteína ligasa se realizó según las instrucciones del fabricante (Avidity) y la reacción se llevó a cabo a 30°C durante 2 h. La biotina libre se eliminó mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex de 200 pg.
Animales
En los experimentos se utilizaron ratones QB macho (B10.Q 3 BALB/c, n = 9) F1, de 12 a 16 semanas de edad. Los fundadores de los ratones B10.Q fueron proporcionados originalmente por J. Klein (Tübingen, Alemania), y los ratones BALB/c se adquirieron en The Jackson Laboratory. Todos los ratones se criaron y alojaron en las instalaciones para animales de Medical Inflammation Research (Karolinska Institute). Todos los animales utilizados se alimentaron con comida estándar para roedores y aguaadlibitum.Se alojaron juntos diferentes grupos experimentales para minimizar el sesgo experimental. El comité de ética local aprobó todos los experimentos con animales (Stockholms Norra Djurforsoksetiska Namnd, Estocolmo, Suecia). Todo los experimentos de artritisin vivoestaban cubiertos por los números éticos N213/14 y N35/16. La anestesia de los animales se realizó mediante inhalación de isoflurano, mientras que el sacrificio se realizó con CO2.
Inducción y evaluación clínica de la artritis.
Se preparó colágeno tipo II de rata (rCII) a partir de condrosarcoma de Swarm (condosarcoma de Swarm de rata, SRC), mediante digestión limitada con pepsina y purificación adicional, como se describe en Chavele KM and Ehrenstein MR, FEBS Lett. 2011;585:3603-10. El rCII preparado se almacenó a 4°C hasta su uso. Para inducir la artritis inducida por colágeno (CIA), a cada ratón se le inyectaron 100 pg de rCII emulsionado 1:1 en CFA (Difco) en la base de la cola en un volumen total de 100 pl. Treinta y cinco días después, los ratones recibieron una inyección de refuerzo de 50 pg de CII de rata emulsionado 1:1 en IFA (Difco) en un volumen total de 50 pl. El desarrollo de la artritis clínica se siguió mediante la puntuación visual de los animales en función del número de articulaciones inflamadas en cada pata, comenzando 2 semanas después de la inmunización y continuando hasta el final del experimento. Se utilizó un protocolo de puntuación ampliado como se describe en Klareskog L et al., Annu Rev Immunol. 2008;26:651-75 que varía de 1 a 15 para cada pata con una puntuación máxima de 60 por ratón. Los ratones se examinaron de dos a cuatro veces por semana durante los 90 días después de la inmunización.
Protocolo de tratamiento
Las bombas microosmóticas ALZET que difunden diferentes cantidades de Aq/rCII glicosilado de manera natural (n = 9) o PBS (grupo de control, n = 9) se implantaron subcutáneamente en ratones QB el día 7 después de la inmunización. Se utilizaron técnicas estériles durante el procedimiento de implantación quirúrgica. Para la colocación subcutánea, se hizo una pequeña incisión en la piel entre las escápulas, se formó una pequeña bolsa y se insertaron las bombas en la bolsa con el moderador de flujo apuntando en dirección opuesta a la incisión. Las incisiones en la piel se cerraron utilizando clips para heridas.
Una sola inyección s.c. de 100 pg en ratones fue casi tan eficaz en el tratamiento de la artritis clínica como la infusión con bomba s.c. de 15 pg/día durante 7 días consecutivos. Sin embargo, el tratamiento prolongado pareció ser más eficaz en la inducción de células TR1 reguladoras, como lo demuestra el análisis FACS de las células T de los ganglios linfáticos en los ratones tratados.
DTH
A ratones QB preinmunizados con CII/CFA de rata (rCII) se les inyectaron por vía intradérmica 10 pg de rCII disueltos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en el oído izquierdo el día 8 después de la inmunización. Para el control, se inyectó disolvente en el oído derecho y un investigador ciego para el tratamiento de los animales midió la hinchazón de los oídos 24 h después utilizando un calibrador. El tratamiento se realizó mediante una aplicación durante 24 h de 100 pg de complejos Aq/péptido utilizando bombas osmóticas implantadas el día 4 después de la inmunización con rCII. Grupos: Aq/mCLIPmt (n=6 ), Aq/galCII con (His, n=5) y sin etiqueta de His (sin His, n=5).
Ensayo de hibridoma de células T
Los complejos MHC Il/péptido se diluyeron en PBS estéril y se recubrieron placas mediante incubación a 4°C durante la noche o se añadieron directamente en forma soluble a hibridomas de células T. Después, las placas recubiertas con el complejo MHC II/péptido se lavaron dos veces con PBS estéril para eliminar los complejos no unidos, y se añadieron por pocillo 5 x 104 hibridoma de células T en 200 pl de DMEM suplementado con FCS al 5 %, 100 Ul/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Se ha utilizado el hibridoma de células T 3H8 y mDR1.1 específicos para GalOK264 y para CII259-273 (K264) no modificado, respectivamente. Después de 24 h, se midió IL-2 o IL-10 (en algunos experimentos) en los sobrenadantes del cultivo mediante ELISA tipo sándwich (BioLegend). rIL-2 o rl-10 de ratón sirvieron respectivamente como control positivo y estándar.
Los experimentos de estimulación utilizando hibridoma de células T se realizaron en diferentes condiciones en pocillos de microtitulación: 1) pre-recubiertos con complejos DR4/CII-péptido recombinantes, 2) recubiertos con hialuronano (Sigma Aldrich (#H7630)) o sulfato de condroitina (Sigma Aldrich (#C9819)) al que posteriormente se añadieron los complejos peptídicos DR4/CII en fase fluida. Este diseño se eligió para estudiar el impacto de la interacción potencial de ambos componentes en la activación de las células T por el complejo peptídico DR4/CII e imita la interacción de los complejos peptídicos DR4/CII con componentes del tejido conectivo expresados fisiológicamente en la matriz extracelular (ECM) en los tejidos y el sistema linfático de drenaje, o 3) con una superficie bloqueada a la que se añadieron los componentes del soluto de la ECM hialuronano, sulfato de condroitina o sulfato de heparina, así como los complejos peptídicos DR4/CII para estudiar su impacto en el hibridoma de células T como un modelo para la modulación de la función de las células T en fluidos corporales de compartimentos de tejidos enfermos, por ejemplo derrames articulares o el líquido linfático.
Detección de células T específicas de antígeno mediante tinción del tetrámero de MHC II
Los complejos MHC II/tetrámero del péptido se prepararon recientemente añadiendo estreptavidina marcada con PE y estreptavidina marcada con APC (Biolegend) a la proteína recombinante en una proporción molar de 1:4 e incubando a 4°C durante 1 h. Para identificar los linfocitos T específicos de péptidos, las células se incubaron con los complejos DR4/tetrámero del péptido (20 pg/ml) a 37°C durante 1 h en presencia de Dasatinib 50 nM, un inhibidor de proteína tirosina quinasa de molécula pequeña, después de la tinción para marcadores de superficie celular. Se añadió una solución de tinción de viabilidad (Zombie NIR; Biolegend) justo antes de la adquisición para excluir las células muertas del análisis. Las muestras se adquirieron utilizando un citómetro de flujo LSR Fortessa utilizando el software FacsDiVa (BD Biosciences) y los datos se analizaron con el software FlowJo (v10, FlowJo LLC).
Activación de células T humanas después de la estimulación del péptido CII.
Las PBMCs se descongelaron y se dejaron reposar durante la noche en TexMACS (Biolegend) a 1,5 x 106 célula/pocillo. Las células se estimularon con las respectivas variantes peptídicas GIAGFKGEQGPKGEP (SEQ ID NO: 13) y GIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEP) a una concentración de 50 pg/ml durante 7 horas junto con anti-CD28 a 1 pg/ml (BioLegend). Para el control positivo y la determinación de la sensibilidad del ensayo de CD154, se añadió enterotoxina B estafilocócica (SEB) a un cultivo separado a 1 pg/ml (Sigma-Aldrich). Después de la estimulación, las células se trataron con el marcador de discriminación LIVE/DEAD (BioLegend) y después se tiñeron para determinar la expresión superficial de CD3 y CD4, para el control positivo y para CD19 para la exclusión de células B. Los niveles iniciales se determinaron mediante células no estimuladas (tratadas con anti-CD28) y se restaron adicionalmente de los cultivos estimulados con CII. Las muestras se adquirieron utilizando un citómetro de flujo LSR Fortessa utilizando el software FacsDiVa (BD Biosciences) y los datos se analizaron con el software FlowJo (v10, FlowJo LLC).
Estimulación/diferenciación in vitro de células T de la sangre periférica de pacientes con RA HLA-DRB1*0401 positivo
Se realizaron ensayosin vitropara analizar la inducción/diferenciación de funciones de células T reguladoras, por ejemplo, la regulación positiva de la citocina IL-10 asociada al fenotipo Tr1 tras la estimulación con DR4/CII-monómeros durante un período de incubación prolongado de varios días. En consecuencia, se aislaron PBMCs mediante centrifugación en gradiente denso y se estimularon 1,2 * 106 células/mL en TexMACS (MiltenyiBiotec, Cat# 130-097-196) con 1 pg/mL de anti-CD3 (Biolegend, Cat# 317304) y 100 ng/mL de IL-27 (Peprotech, Cat#200-38B) (control positivo, Tr1), 3,6 pg/ml de DR4/nCll, 3,6 pg/ml de DR4/galCII, 3,6 pg/mL de DR4/hCll o se dejó sin estimulación (control negativo, sin) durante 8 días. La estimulación se realizó por duplicado. El día 8, los sobrenadantes del cultivo se recogieron y analizaron para determinar las citocinas liberadas utilizando un panel hecho a medida para la detección de citocinas humanas en un ensayo LEGENDplex™ basado en perlas múltiples siguiendo el protocolo del fabricante.
Resultados:
Ejemplo 1: Producción de Aq/rCII funcionalmente activo en células HEK 293
En experimentos anteriores se ha verificado que dos inyecciones intravenosas con moléculas de Aq cargadas con péptidos CII259-273 galactosilados sintéticos pueden proteger a los ratones del desarrollo de artritis. Sin embargo, la síntesis del CII259-273 galactosilado requiere mucho tiempo y dinero. Además, la carga del péptido sintético en la molécula MHC recombinante de clase II no es trivial ni rentable. En consecuencia, sería una ventaja significativa establecer un proceso biosintético que permita la producción en una sola etapa de la molécula MHCII que contiene el péptido CII259-273 unido covalentemente (Figura 1) unido a una de las cadenas de MHC II en una célula huésped que asegure una modificación postraduccional adecuada de la cadena lateral de lisina en la posición 264 en el péptido CII mediante hidroxilación y posterior galactosilaciónin situ.Sin embargo, las modificaciones postraduccionales del péptido de colágeno dependen de la presencia de las respectivas actividades enzimáticas, es decir, actividad de lisil hidroxilasa y actividad de colágeno beta galactosiltransferasa. Por ejemplo, las proteínas producidas por E. coli normalmente no muestran dichas modificaciones y, aunque algunas células de insectos tienen la capacidad de hidroxilar restos de lisina, no producen péptidos CII que contengan glicosilación de hidroxilisina unida a O. Además, se desconocía si una célula huésped que proporcionara las actividades enzimáticas requeridas sería realmente capaz de proporcionar las modificaciones requeridas en la posición selectiva de aminoácidos del péptido CII dentro del marco de la secuencia de la proteína MHCII no colágena.
A continuación se muestra por primera vez que los complejos Aq/rCll(259-273) pueden expresarse en células HEK293 y que los complejos purificados comprenden péptidos CII unidos covalentemente (CII259-273) en donde la lisina en la posición 264 se modifica post-traduccionalmente. Analizamos el tipo de modificaciones de las cadenas laterales de lisina en el péptido CII y si el complejo Aq/rCII(259-273) galactosilado purificadoin situtiene un efecto protector en un modelo de ratón CIA de manera similar a la observada para las moléculas de Aq recombinantes cargadas con péptidos CII259-273 galactosilados. Para probar el potencial terapéutico de los complejos Aq/rCII(259-273) producidos por HEK293, utilizamos bombas osmóticas que se implantaron por vía subcutánea una semana después de la inmunización. Las bombas osmóticas son ventajosas sobre las inyecciones intravenosas, porque los complejos Aq/rCII (259-273) permanecen en la circulación a un nivel constante y están disponibles para la inducción de toleranciain vivodurante un período de tiempo más largo. Al comparar tres tipos diferentes de bombas que liberan su contenido durante 24 horas, 7 días o 6 semanas, se encontró que las tres bombas median la protección contra la artritis cuando contienen moléculas de Aq cargadas con péptidos CII galactosilados sintéticos (datos no mostrados). Sin embargo, se descubrió que el uso de la bomba con una liberación sostenida durante 7 días media la protección más fuertemente asociada con el desarrollo de células T específicas de CII con capacidad reguladora, en comparación con las bombas de 24 horas (datos no mostrados). Sin estar ligado a ninguna teoría, una velocidad de liberación lenta a una dosis baja puede dar como resultado el desarrollo de células T reguladoras, mientras que una liberación más rápida de una dosis más alta puede dar como resultado la eliminación de las células T patógenas. Sin embargo, la diferencia observada también podría explicarse por la exposición prolongada, que aumenta la probabilidad de que las células T específicas de CII -lo que ocurriría con baja frecuencia- interactúen con el complejo Aq/rCII(259-273) antes de que sea eliminado de la circulación. Los experimentos que se describen a continuación se realizaron utilizando bombas osmóticas que liberan su contenido durante 7 días.
Para evaluar qué modificaciones postraduccionales estaban presentes cuando se produjo el complejo Aq/rCII(259-273) en células HEK293, se estimularon clones de hibridoma de células T restringidos por Aq con diferentes especificidades para el epítopo CII259-273in vitrocon el complejo purificado (Figura 2).
Los complejos de control MHC II/CII se produjeron en células de insecto S2, que tienen una capacidad muy deteriorada para producir modificaciones postraduccionales en términos de glicosilación unida a O de cadenas laterales de lisina. Como se esperaba, sólo el clon HCQ.4, que reconoce el péptido CII259-273 con una lisina no modificada o hidroxilada en la posición 264, respondió al complejo Aq/rCII(259-273) producido en células de insecto S2. Por el contrario, todos los clones específicos de CII respondieron al complejo Aq/rCII(259-273) producido en células HEK293. Otras especificidades de los clones de hibridoma de células T utilizados son las siguientes: HCQ3 (CII, Gal-HK264), HCQ.4 (CII, no modificado y HK264), HCQ.11 (Glc-Gal-HK264), HM1R.2 (CII, Gal-HK264 y Gal-HK264+270), HP3 (péptido de pepsina restringido en Aq). Esto muestra que la posición 264 puede modificarse postraduccionalmente cuando se produce en células HEK293. Además, el complejo resultante es heterogéneo donde la posición 264 incluye lisina no modificada y/o hidroxilada así como lisinas glicosiladas con mono y disacáridos. El clon HP3 restringido en Aq, que es específico para un péptido de pepsina, no respondió a ninguno de los complejos Aq/rCII(259-273).
Ejemplo 2: Aq/rCII glicosilado in situ en un modelo de CIA de ratón
A los ratones inmunizados con CII en adyuvantes se les implantaron 7 días después (después de la inmunización de refuerzo 35 días después de la inmunización inicial) bombas osmóticas cargadas con tres cantidades diferentes de complejo Aq-rCII(259-273) producido por HEK293 y se les dio seguimiento para determinar el desarrollo de artritis. A los ratones se les implantaron bombas cargadas con PBS sólo como control negativo. Como se muestra en la Figura 3A, el complejo Aq-rCII(259-273) confirió protección de una manera dependiente de la dosis y los ratones tratados con la cantidad más alta de complejo Aq-rCII(259-273) (100 |jg) protegieron completamente del desarrollo de artritis. Los ratones tratados con la cantidad intermedia (50 jg ) del complejo Aq-rCII(259-273) mostraron cierta protección, mientras que el tratamiento con la cantidad más baja (10 jg ) resultó en una frecuencia de artritis comparable a la de los controles tratados con PBS.
Ejemplo 3: Producción de DR4/hCN funcionalmente activo en células HEK 293
Hemos demostrado que se pueden preparar complejos funcionales MHCII/CII de ratón (Aq/rCII) en células HEK293 utilizando la maquinaria de glicosilación de la célula huéspedin situ.A continuación, investigamos si los complejos MHCII/CII humanos se pueden preparar en células HEK293 utilizando la maquinaria de glicosilación de la célulain situ.Los complejos se prepararon como se describe anteriormente en células HEK293. Los complejos de control se expresaron en células CHO y se cargaron con péptido no modificado (DR4/nCII) o péptido galactosilado (DR4/gaICII). Se utilizaron dos hibridomas de células T humanas de activación restringida (3H8: epítopo CII no modificado, mDR1.1: epítopo CII galactosilado) para comprobar el estado de galactosilación del complejo DR4/péptido glicosilado de manera natural (DR4/hCll) en comparación con un complejo DR4/péptido cargado con péptido no modificado o péptido galactosilado. Como se muestra en la Figura 4A, el hibridoma de células T mDR1.1 se activa tras la estimulación con el complejo DR4/galCII, mientras que la estimulación con DR4/nCII sigue siendo casi negativa. En comparación con DR4/galCII y DR4/nCII, DR4/CII unido covalentemente (DR4/hCll) es un producto heterogéneo con respecto al estado de galactosilación. Eso significa que la composición que comprende el complejo DR4/hCll contiene péptidos con restos de lisina galactosilados y no modificados en la posición 264. El nivel de activación de las células estimuladas con DR4/hCII es ligeramente inferior en comparación con el complejo DR4/galCII y muy similar al del complejo DR4/nCII (Figura 4B, usando células 3H8).
Ejemplo 4: Detección de células T específicas del péptido CII en humanos
El objetivo era establecer un método basado en tetrámeros para detectar directamente células T específicas de antígeno en la sangre periférica (PBMCs) de pacientes con RA y donantes sanos. Por lo tanto, los complejos peptídicos DR4/CII biotinilados se incubaron con estreptavidina-PE o estreptavidina-APC. Para reducir la unión inespecífica de los tetrámeros, se realizó una tinción doble de tetrámero utilizando dos fluorocromos. Las células T específicas de antígeno (CII259-273, K264gal) que utilizan los tetrámeros DR4/gaICII se pueden detectar en pacientes con RA así como en donantes sanos (Figura 5A). Además, las células T con especificidad por el péptido CII no modificado se pueden detectar utilizando tetrámeros DR4/nCII (Figura 5B). La frecuencia media de células T específicas de antígeno es mayor utilizando los tetrámeros DR4/hCll glicosilados de manera natural en comparación con los tetrámeros DR4/gaICII o los tetrámeros DR4/nCII (Figura 5B). Dado que la frecuencia de células T específicas de antígeno en la sangre periférica es bastante baja (0,01-0,1 %), las cifras observadas son las esperadas.
También se detectaron células T CD4+ activadas en PBMCs de pacientes con RA HLA-DRB1*0401 después de la estimulación con péptido galCII mediante citometría de flujo utilizando tinción de superficie con CD154 (CD40L) como un marcador para la activación de células T (Figura 6 ). Como control positivo, también se incubaron células con superantígeno SEB, lo que provocó una fuerte regulación positiva del marcador de activación CD154 (datos no mostrados). Por el contrario, las células incubadas sólo con un anticuerpo contra el CD28 coestimulador fueron principalmente negativas (datos no mostrados). Dado que la frecuencia esperada de la población de células T específicas de antígeno es bastante baja en la sangre periférica, la detección de 0,01-0,1% de células T CD154+ (población original: células T vivas CD3/CD4) es satisfactoria. Es notable el hecho de que las células T se activan menos usando el péptido Cll no modificado (desnudo). Dado que el número de células T específicas de antígeno que utilizan la tinción con tetrámero DR4/galCII o DR4/nCII fue similar en PBMCs de pacientes con RA HLA-DRB1*0401 (Figura 5), la diferencia observada después de la activación del péptido parece deberse a una diferencia en la actividad o estado funcional de las respectivas células T.
Ejemplo 5: Estimulación/diferenciación in vitro de células T de la sangre periférica de pacientes con RA positiva para HLA-DRB1*0401
Se realizaron estudios in vitro para investigar la inducción/diferenciación de funciones de las células T reguladora, por ejemplo, la regulación positiva de la citocina IL-10 asociada al fenotipo Tr1 tras la estimulación con monómeros DR4/CII durante un período de incubación prolongado de ocho días. En consecuencia, las PBMCs aisladas de pacientes con RA genotipado positivo HLA-DRB1*0401 se estimularon en condiciones de inducción de células Tr1 con anti-CD3 e IL-27 (control positivo, Tr1), con DR4/nCII (3,6 pg/ml), DR4/galCII, (3,6 pg/mL), o sin estimulación (control negativo, K1) durante 8 días. La estimulación se realizó por duplicado. El día 8, los sobrenadantes del cultivo se recogieron y analizaron para determinar la liberación de citocinas utilizando un panel hecho a medida para citocinas humanas en un formato de ensayo LEGENDplex™ basado en perlas múltiples según el protocolo del fabricante. Los resultados mostrados en la Figura 7 demuestran claramente la capacidad de DR4/nCII y DR4/galCII para inducir la liberación de la citocina antiinflamatoria IL-10 en PBMCs de pacientes con RA y a niveles incluso ligeramente superiores en comparación con los controles positivos incubados en condiciones inductoras de TR1 convencionales durante 8 días. No hay evidencia de una activación concomitante de vías que conduzcan a una mayor producción de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, TNF-a, IL-2, IL-17a, IL-17f o IFN-y.
Ejemplo 6: La etiqueta de His en el complejo peptídico DR4/CII: contribución al efecto farmacológico
Se ha investigado si secuencias que no son directamente esenciales para el complejo MHCII/CN pueden omitirse del constructo, incluyendo la contribución de la etiqueta de polihistidina (etiqueta de His), el sitio de biotinilación, el sitio de escisión de TEV, el sitio de escisión de trombina y la etiqueta de estreptavidina a las propiedades de activación de células T del complejo recombinante. Normalmente, los complejos peptídicos DR4/CII, así como el anticuerpo anti-CD3 (control positivo), se recubren en la superficie plástica de los pocillos de microtitulación en un ensayo de activación de hibridoma estándar. En experimentos iniciales utilizamos el sitio de escisión interno de TEV del complejo peptídico DR4/nCII para investigar el efecto de la escisión proteolítica de la etiqueta de His en la activación hibridoma de células T (3H8) medida por la secreción de IL-2 en comparación con el complejo peptídico DR4/hCll sin escindir recubierto en pocillos de microtitulación. La eficacia de la escisión proteolítica se controló mediante análisis de transferencia Western. Además, la eficacia de recubrimiento equivalente de los pocillos de microtitulación utilizando soluciones equimolares del complejo escindido y no escindido se confirmó mediante ELISA utilizando un anticuerpo específico de DR4 y un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa (Figura 8). Esto también confirma que el complejo no se disocia y está presente como un heterodímero. Nuestros datos muestran una fuerte disminución del constructo escindido en la activación del hibridoma de las células T, aunque el dominio funcional del complejo DR4/nCII reconocido por el TCR del hibridoma de las células T está recubierto con una eficacia similar a la superficie plástica (Figura 8). Es muy poco probable que la escisión de la cremallera conduzca a una disociación del complejo. La cremallera es necesaria principalmente para la formación del complejo durante el proceso biosintético, mientras que el complejo peptídico MHC II formado en sí es bastante estable al menosin vitrodebido al efecto estabilizador del péptido unido al surco de unión formado por las regiones variables de ambas cadenas.
Concluimos que la etiqueta de His en el complejo DR4/nCII no escindido es necesaria para la orientación correcta del complejo en la superficie en una alineación multimerizada que expone el surco de unión del péptido hacia la célula T poniendo en contacto preferiblemente áreas de contacto cargadas en la superficie plástica. Para confirmar esta conclusión, se produjo el complejo DR4/hCIIAHis que solo carece de la etiqueta de His (6xHis) en el extremo carboxilo terminal de la cadena beta de la MHC de clase II, pero por lo demás es idéntico al complejo DR4/hCII, es decir, contiene los dominios de heterodimerización JUN/FOS (compárese con la Figura 1). Como control adicional para la participación de interacciones electrostáticas por parte del grupo imidazol funcional de la histidina cargado positivamente, se preparó otra variante recombinante mutada del complejo DR4/hCll, en donde la etiqueta de His se sustituyó por un triplete de restos de aminoácidos cargados negativamente Asp-Glu-Asp (DED) (DR4/hCII_DED). Además, intercambiamos el material plástico no fisiológico con componentes cargados de la matriz extracelular (ECM) (sulfato de condroitina, sulfato de heparina, hialuronano) presentes en las superficies celulares, en los fluidos corporales extracelulares tales como los derrames sinoviales o la linfa, así como en los tejidos, tales como el cartílago de las articulaciones o membranas sinoviales. Para este fin, primero cubrimos los pocillos de microtitulación con soluciones altamente concentradas de sulfato de condroitina, sulfato de heparina y soluciones de hialuronano (10 mg/ml). Las superficies recubiertas se lavaron minuciosamente y se realizaron experimentosin vitrode estimulación de células de hibridoma 3H8 añadiendo los complejos peptídicos DR4/CII a la fase fluida utilizando concentraciones de IL-2 en el sobrenadante como lectura. Como control, se realizaron experimentos paralelos en placas de microtitulación con superficies bloqueadas en ausencia de los componentes de ECM. Los resultados mostrados en la Figura 9A demuestran que bajo estas condiciones sólo el complejo que contiene la etiqueta de His indujo una fuerte respuesta de IL-2 y que su capacidad para activar las células T parece ser críticamente dependiente del sulfato de condroitina recubierto en la superficie de los pocillos de microtitulación, mientras que el impacto del hialuronano (HA) siguió siendo menos pronunciado (Figura 9B) y apenas detectable para el sulfato de heparina (Figura 9C). El complejo de control soluble DR4/hCll_DED no indujo una respuesta de IL-2 en presencia de la superficie recubierta de sulfato de condroitina de los pocillos de microtitulación (Figura 9A). Sin embargo, el efecto observado de los complejos marcados con His no puede explicarse simplemente mediante interacciones electrostáticas de glicosaminoglicanos aniónicos polisulfatados a través de los grupos imidazol cargados positivamente de la etiqueta de polihistidina, ya que el sulfato de heparán también contiene un alto grado de grupos sulfato cargados negativamente, pero no parecen facilitar significativamente la respuesta de IL-2 de las células de hibridoma 3H8 estimuladas por el complejo DR4/hCll marcado con His del soluto. En consecuencia, los resultados sugieren una interacción específica de la etiqueta de polihistidina con la matriz de sulfato de condroitina para aumentar la respuesta de IL-2 por células de hibridoma 3H8 estimuladas con el complejo DR4/hCll disuelto.
En experimentos paralelos de estimulación del hibridoma de células T utilizando el recubrimiento directo de los diferentes constructos de DR4/hCll en las superficies plásticas a tres concentraciones diferentes (0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml y 1 mg/ml), se confirmaron los resultados iniciales obtenidos con los complejos DR4/nCII escindidos por Tev. La capacidad de inducir una respuesta de IL-2 por el complejo DR4/hCIIAHis así como por el complejo DR4/hCll_DED mutado se reduce fuertemente usando 0,1 mg/ml y 1 mg/ml para el recubrimiento. Sin embargo, se observó una respuesta usando 1 mg/ml para el recubrimiento a un nivel comparable al del complejo no modificado (DR4/hCll) a una concentración de recubrimiento 10 veces menor (Figura 10).
Sin embargo, los experimentos también demuestran que todos los constructos albergan el péptido funcional en el surco de unión a DR4 como un requisito para la activación por TCR de las células de hibridoma 3H8. En consecuencia, nuestros estudios proporcionan evidencia inequívoca de que la etiqueta de His en el complejo DR4/CII mejora la actividad del complejo. Sin estar limitado por ninguna teoría, la etiqueta de His parece proporcionar una orientación espacial mejorada del surco de unión del péptido para el reconocimiento de TCR a través de un impacto en la interacción con el sulfato de condroitina, componente de la ECM. Además, los estudios posteriores mostrados en la Figura 11 demuestran que la interacción del complejo DR4/CII que comprende una etiqueta de His con sulfato de condroitina o con hialuronano en fase sólida en un pocillo de microtitulación con superficies plásticas bloqueadas puede mejorar su capacidad para estimular una respuesta de IL-10 por parte del hibridoma de las células T.
Los datosin vitrorespaldan un papel funcional crítico de la etiqueta de His en el complejo DR4/CII por su efecto farmacológico inmunomodulador. Además, se realizó un estudioin vivoutilizando el modelo de la reacción de hipersensibilidad inducida por CII dependiente de células T en ratones QB que expresan Aq. Los ratones preinmunizados con CII se activaron el día 8 después de la inmunización mediante una inyección intradérmica de Cll en un oído para desarrollar una hinchazón inflamatoria dependiente de células T controlada por un activador de vehículo aplicado en el oído contralateral. Antes de la inducción de la reacción de DTH, los ratones recibieron tratamiento el día 4 después de la inmunización mediante sc de 24 h. La infusión con bomba de una etiqueta de His que contiene el complejo Aq/galCII, un complejo Aq/galCIIAHis que carece de la etiqueta de His o un complejo Aq/CLIP de control que contiene un péptido de control unido [cadena invariante asociada de clase II: CLIP] en su surco de unión. Los resultados mostrados en la Figura 12 proporcionan una evidencia clara del impacto funcional de la etiqueta de His en la reducción terapéutica de la inflamación del oído dependiente de células T inducida por la reacción DTH experimental específica de CII. Por lo tanto, nuestros estudios demuestran consistentemente una función mejorada de los complejos peptídicos MHCII/CII que comprenden una secuencia de polihistidina para el efecto terapéutico inmunomodulador sobre las células T, que probablemente esté mediado a través de su impacto en la interacción con los componentes de la ECM que están disponibles en abundancia en el contexto de estructuras objetivo en superficies celulares, componentes tisulares y fluidos corporalesin vivo.
Ejemplo 7: Obstáculos de la producción recombinante del complejo DR4/qal CII en células HEK
La modificación postraduccional de la secuencia de CII del péptido en el surco de unión del complejo DR4 recombinante implica varias etapas secuenciales realizadas por diferentes enzimas. Estas modificaciones postraduccionales específicas del colágeno afectan preferentemente a los restos de lisina en las posiciones 264 y 270. La etapa inicial es una hidroxilación de lisina mediada por una lisil hidroxilasa seguida de una transferencia de galactosil a la lisina hidroxilada mediada por una galactosil transferasa. Además, se puede añadir un único resto de glucosa a la hidroxilisina galactosilada. Todos estas etapas ocurren durante el proceso biosintético en células con maquinaria postraduccional para el colágeno, tal como en las células HEK, conduciendo así a un producto recombinante heterogéneo comparable a la proteína de ECM natural del cartílagoin vivo.En humanos, esta mezcla probablemente sea ventajosa con el fin de aumentar el espectro de células T potenciales que pueden reclutarse de todo el repertorio para su modulación en células reguladoras para producir mediadores antiinflamatorios tales como la IL-10 para amortiguar la enfermedad articular mediada por el sistema inmunológico. Los estudios sobre la activaciónin vitrode las respuestas de IL-2 e IL-10 en células T de sangre periférica de pacientes con RA en respuesta a complejos DR4/CII recombinantes que contienen el péptido galactosilado (DR4/gaICII) o CII no modificado (DR4/nCII) proporciona apoyo experimental en esta dirección. Sin embargo, el análisis espectrométrico de masas de varios lotes de CR4/hCll producido en células HEK reveló que una cantidad considerable de proteínas recombinantes muestran un alto grado de contenido de disacárido (Glc-Gal-Hyl) en ambos restos de lisina (Figura 13), lo cual es probable que sea desventajoso para el reconocimiento de TCR debido a la cobertura del surco de unión del péptido por estructuras voluminosas de carbohidratos, perturbando de este modo el reconocimiento de TCR.
La galactosilación postraduccional específica de colágeno de los restos de lisina en la secuencia peptídica CII de los constructos de DR4/hCll recombinantes, especialmente la del resto 264, es importante para el reconocimiento de células T a través del TCR y los efectos farmacológicos resultantes. Como el resto de lisina en la posición 270 está localizado en el borde del surco de unión de la molécula DR4, generalmente se considera que su modificación de carbohidratos no está implicada en el reconocimiento de TCR. Para reducir la heterogeneidad y el riesgo potencial de interferencia negativa con el reconocimiento por TCR del péptido CII en el surco de unión de DR4 mediante la unión de carbohidratos a un resto de lisina hidroxilado en la posición 270 (K270), K270 puede mutarse en un resto de arginina (R). Anteriormente se había demostrado que esta mutación no afecta la unión al TCR del hibridoma de células T específico de antígeno.
Aún más relevante es la prevención de la transferencia final de un resto de glucosa a la hidroxilisina galactosilada en la posición 264. Es probable que este resto de carbohidrato tenga un efecto negativo en el reconocimiento del TCR, ya que el disacárido voluminoso y flexible (Glc-Gal) puede interferir con la unión de TCR. La estimulaciónin vitrode células T de la sangre periférica de pacientes con RA ha demostrado que se puede reconocer tanto el péptido no modificado (nCII) como el monogalactosilado (gaICII). La reacción que cataliza la transferencia del resto de glucosa a la galactosiladahidroxilisina es la galactosilhidroxilisil glucosiltransferasa (nombre sinónimo: procolágeno lisilhidroilasa 3 (LH3)). LH3 es una enzima multifuncional que también es capaz de catalizar las etapas iniciales de modificación de lisina antes mencionadas, es decir, hidroxilación que da como resultado hidroxilisina (Hyl) y transferencia de galactosil que da como resultado galactosil-hidroxilisina (Gal-Hyl) (Figura 14A). Sin embargo, su actividad no redundante es la transferencia final de glucosa a la galactosilhidroxilisina.
Por lo tanto, diseñamos genéticamente células Expi293F para eliminar la enzima LH3. Se espera que una línea celular HEK para la producción del complejo DR4/hCll que se hace selectivamente deficiente para la transferencia final de glucosilo a la galactosil hidroxilisina en el péptido CII sea ventajosa para mejorar la eficacia del complejo DR4/hCll producido de forma recombinante. Esto se puede lograr generando células HEK293 inactivadas por LH3, por ejemplo, introduciendo una mutación que altera el gen en el gen plod3 que codifica el gen de la lisilhidroxilasa 3 utilizando un enfoque de edición de genes CRISPR/CAS.
En una primera etapa, generamos células Expi293F con una eliminación de plod3 mediante transfección lentiviral de shRNA específico para investigar el potencial de esta estrategia para obtener un producto menos heterogéneo con una mayor actividad activadora de células T específicas mediante la mejora del sistema de expresión recombinante. Para la transducción, se sembraron células Expi293 utilizando 200000 células/pocillo en placas de 12 pocillos y después se agitaron las placas a 37°C, 8 % de CO2 y 120 rpm durante 3 horas. Se mezclaron 200 uL de partículas lentivirales (partículas lentivirales personalizadas de Sigma) con 10 uL de reactivo de transfección PElpro (Polyplus) y se añadieron a las células y se incubaron durante otras 4 h con agitación a 37°C, 120 rpm y 8 % de CO2, se añadió 1 ml de medio fresco y se continuó incubando durante 3 días antes de analizar la eficiencia de la transducción.
Tres días después de la transducción de lentivirus con shRNA dirigido a Plod3, las células se dividieron en dos partes. A una parte se añadió puromicina hasta una concentración final de 2 ug/mL para matar las células no transducidas y la otra parte se analizó mediante citometría de flujo para comprobar la eficacia de la transducción. Las células estuvieron bajo presión de selección de antibióticos hasta que las células no transducidas murieron y las células transducidas se dividieron durante aproximadamente 18 días hasta una viabilidad superior al 90%. Estos grupos mixtos transducidos estables se expandieron a 500 mL y se transfectaron con DR4/hCll como se describió anteriormente. Después de la purificación, se realizó un análisis de glicanos mediante espectrometría de masas para investigar la reducción de la glucosilación de los restos de galactosilhidroxilisilo en células Expi293F desactivadas por plod3 y células Expi293F de control. Se analizaron ambas lisinas (K264 y K270) dentro del epítopo de colágeno tipo II. Una clara reducción de los restos de gluco-galactosilhidroxilisilo (DiHex) es visible en las células Expi293 KO (Figura 14C).
Mientras tanto, las células transducidas de forma estable se diluyeron y se sembraron en placas de 96 pocillos para la generación de minigrupos. En el proceso de siembra, las células se cultivaron bajo presión de selección y se aislaron 40 mini grupos. Las células se expandieron y la expresión de PLOD3 se determinó en lisados celulares mediante transferencia de Western para verificar la desactivación eficiente de Plod3. Se cargaron lisados de 1*106 minigrupos de Expi293F transducidos con lentivirus en una SDS-PAGE. El análisis de transferencia Western de la desactivación exitosa se realizó utilizando un anticuerpo anti-PLOD3 (Thermo Fisher PAS-48435) y un anticuerpo secundario HRP anti-conejo. PLOD3 tiene un peso molecular teórico de 84 kDa. Los clones #4, #18 y #20 mostraron una desactivación eficiente de Plod3 y, por lo tanto, se utilizaron para mayores expansiones y experimentos. El clon 18 se perdió debido a la caída de su viabilidad, los clones 4 y 20 han sido seleccionados para una mayor producción y se están realizando análisis de glicanos.
Ejemplo 8: Constructos Aq/qal264 CII con etiquetas de aminoácidos cargadas positivamente alternativas en el extremo C-terminal de la secuencia que contiene la cadena p
Como se muestra anteriormente, la etiqueta de His en el complejo DR4/nCII parece permitir la orientación correcta del complejo en la superficie en una alineación multimerizada que expone el surco de unión del péptido hacia la célula T y se ha confirmado un efecto beneficioso de la etiqueta de Hisin vivoen un modelo DTH. Por lo tanto, buscamos etiquetas alternativas que mediaran un efecto similar. La consideración básica para la búsqueda fue que la secuencia 6xHis utilizada en el constructo es una estructura no natural y, por lo tanto, buscamos secuencias en autoproteínas humanas que pudieran sustituir la etiqueta de His en complejos peptídicos inmunomoduladores MHCII/CII. Por lo tanto, la sustitución de la etiqueta de His por una autoestructura funcionalmente equipotente tiene como objetivo reducir la inmunogenicidad potencial. Entre las autoproteínas candidatas con un contenido relativamente alto de restos de aminoácidos básicos funcionalmente relevantes y una estructura evolutivamente conservada que hacía menos probable el reconocimiento autoinmune se encontraban las proteínas de la familia de las histonas.
En consecuencia, en nuestra búsqueda de secuencias en autoproteínas que contienen restos de aminoácidos básicos para una posible interacción con estructuras de carbohidratos sulfatados cargados negativamente, por ejemplo en sulfato de condroitina, identificamos en la secuencia de la histona humana 2 A1 tanto en el extremo N-terminal (SGRGKQGGKARAKAKTRSSR; SEQ ID NO: 34) como en el extremo carboxi-terminal (HKAKGK) respectivas regiones candidatas conservadas entre ratón y humano. (Figura 15). En la Figura 16 se muestra la activación del hibridoma de células T HCQ.3 que reconoce específicamente el complejo péptido AQ/gal264CII utilizando las etiquetas C-terminales alternativas. Investigamos el impacto de diferentes secuencias alternativas unidas al extremo C-terminal de la secuencia que comprende la cadena p en los complejos Aq como se muestra en la parte superior de la Figura 16 como un sustituto de la etiqueta de His en las propiedades de activación de las células T. Además de la etiqueta de Histona NT (SGRGKQGGKARAKAKTRSSR) y la etiqueta de Histona CT (HKAKGK), se probó una etiqueta de His modificada que comprende 6 motivos de NH alternos (NHNHNHNHNHNH, Se Q ID n O: 35). Para este propósito, se realizaron ensayos de estimulación de hibridoma en condiciones estándar: los complejos peptídicos Aq/gal264 Cll se recubrieron la superficie plástica de los pocillos de microtitulación y la secreción de IL-2 se determinó mediante ELISA como una medida de la activación de células específica. El Aq/gal264CII (His) etiquetado con His sirvió como control positivo. Como se muestra en la Figura 16, la variante etiquetada con histona NT mostró una actividad estimulante de células T que fue comparable al control positivo en el intervalo de concentración entre 0,01 y 1 pg/ml. La variante de la etiqueta de Histone CT, así como la etiqueta de His modificada, fueron menos efectivas para activar las células HCQ.3, pero aún mostraron un efecto menor en comparación con el constructo que carecía de la etiqueta de His y sin ningún reemplazo. Por lo tanto, las pruebas preliminaresin vitrode ambas secuencias de histona 2A1 en constructos de fusión en complejos Aq/galCII en comparación con los respectivos complejos etiquetados con HIS revelaron que la secuencia N-terminal (NT): SGRGKQGGKARAKAKTRSSR es funcional en una extensión comparable a la etiqueta de His, mientras que la secuencia C-terminal (CT) de la histona 2A1 solo mostró un efecto menor y la etiqueta de histona modificada un efecto intermedio. Especulamos que la cantidad de aminoácidos cargados positivamente es importante (al menos 6 aminoácidos cargados positivamente) y los aminoácidos cargados positivamente consecutivos son más beneficiosos. En caso de aminoácidos cargados positivamente alternados, parecen preferirse aminoácidos más básicos, tales como lisina (pK de 10,5) y arginina (pK de 12,5), a histidina (pK de 6 ,0).
Consistentemente, las pruebas preliminaresin vivoen el modelo de la reacción de hipersensibilidad inducida por CII dependiente de células T en ratones QB que expresan Aq demostraron efectos farmacológicos inmunomoduladores equipotentes funcionales de los complejos MHCII/CII en donde la etiqueta de His fue sustituida por la secuencia NT derivada de H2A1. Los ratones preinmunizados con CII se activaron el día 8 después de la inmunización mediante

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes que comprenden (a) una región extracelular de una cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1;
(b) una región extracelular de una cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1; y
(c) un péptido de colágeno II (péptido CII), opcionalmente unido al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador;
en donde el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en AGFKGEQGPKG, AGFKGEQGPXG, AGFKGEXGPKG, AGFKGXQGPKG, AGFKXEQGPKG, AGFKGEXGPXG, AGFKGXQGPXG y AGFKXEQGPXG, y
en donde los complejos peptídicos HLA-DR/CII comprenden un péptido de unión a condroitina en el extremo C-terminal del polipéptido que comprende la cadena alfa de HLA-DR y/o la cadena beta de HLA-DR, para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas en pacientes humanos.
2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde
(a) el péptido de unión a condroitina está en su forma libre;
(b) los complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes no se multimerizan mediante el péptido de unión a condroitina en la composición; y/o
(c) los complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes no están unidos a otra molécula a través del péptido de unión a condroitina en la composición.
3. La composición para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde
(a) la región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR comprende un dominio alfa 1 y un dominio alfa 2; y/o (b) la región extracelular de la cadena beta de HLA-DR comprende un dominio beta 1 y un dominio beta 2.
4. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el péptido CII está unido al extremo N-terminal de la cadena beta de HLA-DR.
5. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos el dominio alfa 1 es de DRA*0101 y al menos el dominio beta 1 es de un alelo de HLA-DR seleccionado del grupo que consiste en DRB1*0401, DRB1 *0404, DRB1*0405, DRB1 *0408, DRB1*0409, DRB1*0101, DRB1*0102, DRB1*1001, DRB1*1402 y DRB1*1303, preferiblemente DRB1*0401.
6. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el péptido CII comprende la secuencia de aminoácidos de AGFKGEQGPKG, preferiblemente de AGFKGEQGPKGEP, más preferiblemente de GIAGFKGEQGPKGEP.
7. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el péptido de unión a condroitina comprende de 5 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 6 a 12 aminoácidos.
8. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el péptido de unión a condroitina es una etiqueta de polihistidina, preferiblemente al menos una etiqueta de hexahistidina.
9. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde
(a) la región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1; y
(b) la región extracelular de la cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1 se expresan como un único polipéptido de fusión; y opcionalmente
(c) el péptido de colágeno II (péptido CII) se une al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente a la cadena beta de HLA-DR.
10. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende
(a) un primer polipéptido que comprende la región extracelular de la cadena alfa de HLA-DR que comprende al menos un dominio alfa 1;
(b) un segundo polipéptido que comprende la región extracelular de la cadena beta de HLA-DR que comprende al menos un dominio beta 1;
(c) el péptido de colágeno II (péptido CII), opcionalmente unido al extremo N-terminal de la cadena alfa de HLA-DR o la cadena beta de HLA-DR mediante un péptido enlazador, preferiblemente a la cadena beta de HLA-DR; y (d) en donde la cadena alfa de HLA-DR se une en su extremo C-terminal a un primer dominio funcional de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina y la cadena beta de HLA-DR se une en su extremo C-terminal a un segundo dominio funcional complementario de un motivo de heterodimerización de cremallera de leucina.
11. La composición para su uso según la reivindicación 10, en donde el primer dominio funcional y el segundo dominio funcional complementario son
(a) un dominio de heterodimerización de cremallera de leucina ácido y básico; y/o
(b) un motivo de cremallera de leucina jun-fos.
12. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los complejos peptídicos HLA-DR/CII recombinantes comprenden péptidos CII con restos de lisina no modificados y/o uno o más modificados postraduccionalmente, preferiblemente en donde
(a) los péptidos CII consisten en péptidos CII con restos de lisina no modificados,
(b) los péptidos CII consisten en péptidos CII, siendo la primera lisina hidroxilisina (Hyl);
(c) los péptidos CII consisten en péptidos CII, siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina;
(d) los péptidos CII consisten en péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina;
(e) los péptidos CII comprenden péptidos CII siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina;
(f) los péptidos CII comprenden péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina;
(g) los péptidos CII comprenden péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina galactosil-hidroxilisina y/o hidroxilisina (Hyl); o
(h) los péptidos CII comprenden péptidos CII con restos de lisina no modificados y péptidos CII siendo la primera lisina hidroxilisina O-glicosilada y/o hidroxilisina (Hyl); y
en donde la segunda lisina opcional en el péptido CII modificado postraduccionalmente es no modificada, hidroxilisina, galactosa-hidroxilisina y/o glucosil-galactosil-hidroxilisina; preferiblemente no modificada, hidroxilisina, galactosahidroxilisina, más preferiblemente no modificada.
13. La composición para su uso según la reivindicación 12, en donde la composición no contiene complejos peptídicos HLA-DR/CII que comprendan péptidos CII con una modificación de glucosil-galactosil-hidroxilisina.
14. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la enfermedad inflamatoria crónica es artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriásica, espondiloartritis axial no radiográfica, espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil, policondritis recurrente, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Lyme, enfermedades de Meniere, enfermedad autoinmune del oído interno (AIED) o enfermedad de Still.
ES20750298T 2019-08-09 2020-08-07 Complejos peptídicos HLA-DR/CII para el tratamiento de la artritis Active ES2974646T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19191077 2019-08-09
PCT/EP2020/072280 WO2021028347A1 (en) 2019-08-09 2020-08-07 Hla-dr/cii peptide complexes for treating arthritis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2974646T3 true ES2974646T3 (es) 2024-06-28

Family

ID=67587664

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES20750298T Active ES2974646T3 (es) 2019-08-09 2020-08-07 Complejos peptídicos HLA-DR/CII para el tratamiento de la artritis

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220280599A1 (es)
EP (1) EP4010006B1 (es)
JP (1) JP7406620B2 (es)
KR (1) KR20220044683A (es)
CN (2) CN118750607A (es)
CA (1) CA3137809C (es)
ES (1) ES2974646T3 (es)
PL (1) PL4010006T3 (es)
WO (1) WO2021028347A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022214200A1 (en) * 2021-01-27 2023-08-24 Longitude Therapeutics S.R.L. Platelet alpha-granules for delivery of multiple proteins
EP4378533A1 (en) 2022-11-29 2024-06-05 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Patient selection and therapy monitoring for autoimmune disorders
CN119220425A (zh) * 2023-07-28 2024-12-31 佳吾益(北京)科技有限公司 发现mhc新抗原肽表位的工程化细胞

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995002066A1 (en) * 1993-07-09 1995-01-19 Biomide Investment Limited Partnership Method for inhibiting procoagulant hla-dr of melanoma cells
JP4800481B2 (ja) * 1998-07-23 2011-10-26 イエダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド 共重合体１および関連する共重合体ならびにペプチドによる自己免疫疾患の治療
US8198401B2 (en) * 2003-03-07 2012-06-12 London Health Sciences Centre Research Inc. Peptides associated with HLA-DR MHC class II molecule and involved in rheumatoid arthritis
ATE442377T1 (de) * 2003-08-07 2009-09-15 Hoffmann La Roche Ra antigene peptide
EP1584630A1 (en) * 2004-04-08 2005-10-12 Nederlandse Organisatie voor toegepast-natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO Method for preparing a modified protein outside a host cell
AU2006316036B2 (en) 2005-11-17 2011-12-15 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. A compound comprising an autoantigenic peptide and a carrier with a MHC binding motif
WO2009003493A2 (en) * 2007-07-03 2009-01-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers, methods for their generation, labeling and use
DE102007036128A1 (de) * 2007-07-23 2009-02-12 Universität Leipzig Antibiotische Peptide
EP2042600A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-01 Commissariat A L'energie Atomique A public and immunogenic CD4+ T Cell epitope of the hiv tat protein and its applications
WO2012103365A1 (en) * 2011-01-28 2012-08-02 Oregon Health & Science University Recombinant t cell ligands and antibodies that bind b cells for the treatment of autoimmune diseases
EP3538559B1 (en) 2016-11-09 2025-04-09 UTI Limited Partnership Recombinant pmhc class ii molecules

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220044683A (ko) 2022-04-11
CA3137809C (en) 2024-06-11
CA3137809A1 (en) 2021-02-18
JP7406620B2 (ja) 2023-12-27
CN118750607A (zh) 2024-10-11
WO2021028347A1 (en) 2021-02-18
PL4010006T3 (pl) 2024-04-08
CN114302743B (zh) 2024-05-14
EP4010006A1 (en) 2022-06-15
EP4010006C0 (en) 2023-11-15
US20220280599A1 (en) 2022-09-08
EP4010006B1 (en) 2023-11-15
JP2022543076A (ja) 2022-10-07
CN114302743A (zh) 2022-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250304930A1 (en) Expression of novel cell tags
ES2971719T3 (es) Producción de complejos MHC II/CII
ES2974646T3 (es) Complejos peptídicos HLA-DR/CII para el tratamiento de la artritis
WO2019135879A1 (en) Modified macrophages and macrophage precursors and associated methods
US20230322885A1 (en) Compositions and methods for simultaneously modulating expression of genes
CN112236159B (zh) Oca-b肽缀合物和治疗方法
AU2006327514B2 (en) DNA vaccine for cancer therapy
HK40063235B (zh) 用於治疗关节炎的hla-dr/cii肽复合体
HK40064159B (zh) Mhc ii/cii肽复合体的产生
HK40063235A (en) Hla-dr/cii peptide complexes for treating arthritis
ES2972793T3 (es) Células diseñadas para inducir tolerancia
HK40064159A (en) Production of mhc ii/cii complexes
US20250340607A1 (en) Antigen tolerance induction through use of flt3l variants