JP6878305B2 - 標的タンパク質を含むエキソソームの生成方法及びこの生成方法によって生成されたエキソソームを使用することによるサイトゾルへの標的タンパク質の移行方法 - Google Patents
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Description
エキソソームの調製
<1-1>エキソソームの生成のためのCIBNとCRY2の結合の確認
CIBN-EGFP-CD9遺伝子を含むPcDNA3.1(+)ベクター及びmCherry-CRY2遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを、光がない条件下で、エキソソーム生成細胞であるHEK293T細胞に導入し、続いて24時間培養した。培地を血清フリー培地と交換し、続いて、さらに48時間培養した。培養が完了すると、460〜490nmの波長の青色光で細胞を照射した。共焦点顕微鏡を使用することによって、青色光照射の前後にmCherryで示される赤色蛍光の位置を確認した(図7)。
GIGANTEA-EGFP-CD9遺伝子を含むPcDNA3.1(+)ベクター及びmCherry-FKF1LOV遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを本実施例で使用した。細胞内のエキソソームを実施例<1-1>に記載されているものと同じ方法で確認した。(上記のFKF1LOV中のLOVは、FKF1タンパク質中の、光によって他のタンパク質に結合するドメインを示す、光-酸素-電圧ドメインの省略形であり、したがって、本明細書では、FKF1とFKF1LOVは実際同じである)。
エキソソーム生成及びエキソソーム生成への光強度の効果
CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子をそれぞれ含む各発現ベクターを、0、5、20、50及び200μWの強度で、460nmの波長のLED光下でHEK293T細胞に導入し、続いて、24時間培養した。次いで、培地を血清フリー培地と交換し、続いて、さらに48時間培養した。培養が完了すると、培養培地を分離し、これを遠心分離(3000×g、15分)して、細胞デブリを除いた上清を得た。ExoQuick-TCエキソソーム沈殿溶液(System Biosciences、Mountain View、California、USA)を上清の5倍量で得られた上清に加えた。混合した後、遠心分離(1500×g、30分)を行って、沈殿したエキソソームを得た。得られたエキソソームをPBSに懸濁し、エキソソームの懸濁液を得た。27-Gのニードルを備えたシリンジを使用して、このエキソソームの懸濁液を0.2μmのフィルターで濾過した。その結果、単一サイズのエキソソームを得た(図8)。次いで、溶解緩衝液を使用してエキソソームの可溶化液を調製し、続いて免疫ブロッティングを行って、エキソソーム中のmCherryタンパク質の量を比較した(図9)。
エキソソーム処理の効果
CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子をそれぞれ含む各発現ベクターを50μWの強度で、460nmの波長のLED光下でHEK293T細胞に導入し、続いて、実施例2に記載されているものと同じ方法でエキソソームを抽出した。抽出したエキソソームを250μg/mlの濃度でHT1080細胞に24時間処理した。4%PFA及び0.01%GAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)を加えることによって、HT1080細胞を10%ゼラチンゲル上に固定した。液体窒素を使用することによって、ゼラチンゲル上に付着した細胞を1日冷却した。クライオウルトラミクロトームを使用することによって45nmにカットした薄切片を-120℃で得た。抗mCherry抗体及びプロテインA-金を使用することによって、この薄切片を免疫染色した。Tecnai G2 Spirit Twin TEMでmCherryタンパク質を観察した(図10)。
標的タンパク質を含むエキソソームの分析
CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子をそれぞれ含む各発現ベクターを、50μWの強度で、460nmの波長のLED光下でHEK293T細胞に導入し、続いて、実施例2に記載されているものと同じ方法でエキソソームを抽出した。抽出したエキソソームを250μg/mlの濃度でHT1080細胞に24時間処理した。次いで、mCherryタンパク質の赤色蛍光を蛍光顕微鏡下で確認し、LDH細胞死アッセイによって、エキソソームで処理した細胞とエキソソームで処理していない細胞の間で死細胞の比を比較した(図11)。
エキソソーム生成及び生成されたエキソソームへの標的タンパク質の導入効率の比較
<5-1>エキソソーム生成効率の確認
エキソソーム生成及び本発明によって生成されたエキソソームへの標的タンパク質の導入効率を従来の方法のものと比較するために、エキソソーム生成細胞における標的タンパク質の発現を、その中のルシフェラーゼ活性を測定することによって調べた。
実施例<5-1>の細胞を72時間培養し、続いて、エキソソームを抽出した(ExoQuick-TC、Systems Biosciences)。従来の方法(XP)又は本発明の方法によって分離したエキソソームに含まれる標的タンパク質の濃度をその中のルシフェラーゼ活性を測定することによって間接的に比較した。図15に示すように、本発明の方法は従来の方法よりも著しく大量の標的タンパク質を含むエキソソームを生成できたことが確認された(図15)。
標的タンパク質の導入効率(E)を、実施例<5-1>及び<5-2>で測定したルシフェラーゼ活性に基づいて、以下の数式によって計算した。
[数式1]
E=生成されたエキソソーム中のルシフェラーゼ活性の測定値/エキソソーム生成細胞中のルシフェラーゼ活性の測定値
標的細胞へのエキソソームの移行効率の比較
エキソソームの移行効率を比較するために、標的タンパク質を含むエキソソームで標的細胞を処理した。特に、HeLa細胞を5×109個のエキソソームで24時間処理し、次いで、細胞で発現する蛍光強度を測定した。図16に示すように、本発明のエキソソーム(EXPLOR)中の蛍光強度が著しく高かったことが確認された(図16)。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する:
[実施形態1]膜上に標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法であって、
a)エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入することによって、形質転換細胞を調製するステップ、及び
b)ステップa)の形質転換細胞を培養するステップ
を含む大量生成方法。
[実施形態2]標的タンパク質がエキソソームの膜から分離され、エキソソームの内部にとどまる、実施形態1に記載のエキソソームの大量生成方法。
[実施形態3]エキソソーム生成細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、樹状細胞、巨核球、及びマクロファージ、幹細胞、及び腫瘍細胞からなる群から選択される1種以上の細胞である、実施形態1又は2に記載のエキソソームの大量生成方法。
[実施形態4]エキソソーム特異的マーカーがCD9、CD63、Cd81又はCD82である、実施形態1に記載のエキソソームの大量生成方法。
[実施形態5]標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法であって、
(a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質I)をコードするポリヌクレオチド、及び標的タンパク質と、第1の光特異的結合タンパク質に連結することができる第2の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質II)をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入するステップ、
(b)第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の間の結合を引き起こすことができる光でエキソソーム生成細胞を照射するステップ、並びに
(c)エキソソーム生成細胞中でエキソソームの生成が終わった後に照射を終了するステップ
を含む大量生成方法。
[実施形態6]第1の光特異的結合タンパク質が、CIB(クリプトクローム相互作用ベーシックヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質)、CIBN(CIBのN末端ドメイン)、PhyB(フィトクロームB)、PIF(フィトクローム相互作用因子)、FKF1(フラビン結合、Kelchリピート、Fボックス1)、GIGANTEA、CRY(クリプトクローム(chryptochrome))及びPHR(フィトリアーゼ相同領域)からなる群から選択される1種以上のタンパク質である、実施形態5に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
[実施形態7]第1の光特異的結合タンパク質がCIB又はCIBNである場合、第2の光特異的結合タンパク質がCRY又はPHRであり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が460〜490nmの波長の光の照射によって達成される、実施形態5に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
[実施形態8]第1の光特異的結合タンパク質がPhyBである場合、第2の光特異的結合タンパク質がPIFであり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が600〜650nmの波長の光の照射によって達成される、実施形態5に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
[実施形態9]第1の光特異的結合タンパク質がGIGANTEAである場合、第2の光特異的結合タンパク質がFKF1であり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が460〜490nmの波長の光の照射によって達成される、実施形態5に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
[実施形態10]実施形態1、2又は5に記載の方法によって調整されたエキソソームを使用して、サイトゾルにタンパク質薬物を送達する方法。
[実施形態11]活性成分として、実施形態1、2又は5に記載の方法によって調製されたエキソソームを含む、サイトゾルにタンパク質薬物を送達するための医薬組成物。
[実施形態12](a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の融合タンパク質(第1の融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドを含む第1の発現ベクター、並びに
(b)標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することができるマルチクローニングサイト、及び上記の第1の光特異的結合タンパク質に連結される第2の光特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第2の発現ベクター
を含む、エキソソームの生成のためのベクター。
[実施形態13]第2の発現ベクターが、第2の光特異的結合タンパク質と標的タンパク質で構成される融合タンパク質(第2の融合タンパク質)をエキソソーム生成細胞において発現させるためのものである、実施形態12に記載のエキソソームの生成のためのベクター。
[実施形態14]実施形態1、2又は5に記載の方法によって調製された、標的タンパク質を含むエキソソーム。
Claims (21)
- 標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法であって、
(a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質I)をコードするポリヌクレオチド、及び標的タンパク質と、第1の光特異的結合タンパク質に連結することができる第2の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質II)をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入するステップ、並びに
(b)第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の間の結合を引き起こすことができる光でエキソソーム生成細胞を照射するステップであって、ここで第1の光特異的結合タンパク質及び上記融合タンパク質IIはエキソソームの内部に位置する、上記ステップ
を含む大量生成方法。 - 標的タンパク質がエキソソームの膜から分離され、エキソソームの内部にとどまる、請求項1に記載のエキソソームの大量生成方法。
- エキソソーム生成細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、樹状細胞、巨核球、及びマクロファージ、幹細胞、及び腫瘍細胞からなる群から選択される1種以上の細胞である、請求項1又は2に記載のエキソソームの大量生成方法。
- エキソソーム特異的マーカーがCD9、CD63、Cd81又はCD82である、請求項1に記載のエキソソームの大量生成方法。
- 第1の光特異的結合タンパク質が、CIB(クリプトクローム相互作用ベーシックヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質)、CIBN(CIBのN末端ドメイン)、PhyB(フィトクロームB)、PIF(フィトクローム相互作用因子)、FKF1(フラビン結合、Kelchリピート、Fボックス1)、GIGANTEA、CRY(クリプトクローム(chryptochrome))及びPHR(フィトリアーゼ相同領域)からなる群から選択される1種以上のタンパク質である、請求項1に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
- 第1の光特異的結合タンパク質がCIB又はCIBNである場合、第2の光特異的結合タンパク質がCRY又はPHRであり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が460〜490nmの波長の光の照射によって達成される、請求項1に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
- 第1の光特異的結合タンパク質がPhyBである場合、第2の光特異的結合タンパク質がPIFであり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が600〜650nmの波長の光の照射によって達成される、請求項1に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
- 第1の光特異的結合タンパク質がGIGANTEAである場合、第2の光特異的結合タンパク質がFKF1であり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が460〜490nmの波長の光の照射によって達成される、請求項1に記載の標的タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
- 請求項1に記載の方法によって調製されたエキソソームを使用して、サイトゾルにタンパク質薬物を送達する方法。
- 活性成分として、請求項1に記載の方法によって調製されたエキソソームを含む、サイトゾルにタンパク質薬物を送達するための医薬組成物。
- (a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の融合タンパク質(第1の融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドを含む第1の発現ベクター、並びに
(b)標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することができるマルチクローニングサイト、及び上記の第1の光特異的結合タンパク質に連結される第2の光特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第2の発現ベクター
を含み、発現された第1の光特異的結合タンパク質、及び上記標的タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質で構成される、発現された融合タンパク質が、エキソソームの内部に位置することとなる、エキソソームの生成のためのベクター組成物。 - 第2の発現ベクターが、第2の光特異的結合タンパク質と標的タンパク質で構成される融合タンパク質(第2の融合タンパク質)をエキソソーム生成細胞において発現させるためのものである、請求項11に記載のエキソソームの生成のためのベクター組成物。
- 請求項1に記載の方法によって調製された、標的タンパク質を含むエキソソーム。
- エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質I)、及び標的タンパク質と、第1の光特異的結合タンパク質に連結することができる第2の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質II)とを含むエキソソームであって、前記2つの融合タンパク質が、前記第1の結合タンパク質及び第2の結合タンパク質を介して互いに可逆的に連結され、第1の光特異的結合タンパク質及び上記融合タンパク質IIはエキソソームの内部に位置する、エキソソーム。
- 第1の光特異的結合タンパク質が、エキソソームの内部に向かう方向に位置するようにエキソソーム特異的マーカーと融合される、請求項14に記載のエキソソーム。
- 第1の光特異的結合タンパク質及び第2の光特異的結合タンパク質が、CIB(クリプトクローム相互作用ベーシックヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質)、CIBN(CIBのN末端ドメイン)、PhyB(フィトクロームB)、PIF(フィトクローム相互作用因子)、FKF1(フラビン結合、Kelchリピート、Fボックス1)、GIGANTEA、CRY(クリプトクローム(chryptochrome))及びPHR(フィトリアーゼ相同領域)からなる群から選択される、請求項14に記載のエキソソーム。
- 第1の光特異的結合タンパク質がCIB又はCIBNであり、かつ第2の光特異的結合タンパク質がCRY又はPHRである、あるいはその逆である、請求項16に記載のエキソソーム。
- 第1の光特異的結合タンパク質がPhyBであり、かつ第2の光特異的結合タンパク質がPIFである、あるいはその逆である、請求項16に記載のエキソソーム。
- 第1の光特異的結合タンパク質がGIGANTEAであり、かつ第2の光特異的結合タンパク質がFKF1である、あるいはその逆である、請求項16に記載のエキソソーム。
- エキソソーム特異的マーカーがCD9、CD63、CD81又はCD82である、請求項14に記載のエキソソーム。
- 標的タンパク質がエキソソームの膜から分離され、エキソソームの内部にとどまる、請求項14に記載のエキソソーム。
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