CN105567626A - 一种细胞培养用微载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞培养用微载体的制备方法，步骤如下：（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液；（2）油水相混合制球；（3）常温下交联固化成球；（4）除油洗涤；（5）偶联DEAE；（6）洗涤。本发明还提供应用该方法制备得到的微载体及该微载体在细胞培养中的应用。本发明采用普通的食用淀粉，原料无毒性、来源广泛，整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，易于形成工业化生产。应用本发明的微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养，使其在生物制药领域得到广泛的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞培养用微载体及其制备方法和应用。
背景技术
动物细胞生物反应器微载体培养技术是当前生物制药行业贴壁依赖性细胞培养的领先技术。微载体是细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、透明的小颗粒。能使贴壁依赖性细胞贴附在颗粒表面进行悬浮培养，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。
自1967年VanWezel第一个用DEAE-SephadexA50作为贴壁细胞培养用微载体以来，研究报道的细胞培养用微载体已有十多种，包括葡聚糖微载体、聚赖氨酸液体微载体、大孔明胶微载体、纤维素微载体、壳聚糖微载体、甲壳素微载体、聚苯乙烯微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。我国目前使用的商品化微载体主要有：如GE公司的CytodexI、CytodexII、CytodexIII和Thermo公司的Cytopore、Cytoline、Biosilon、CultispherG等，均为进口产品，但是价格昂贵，目前市场价已达每公斤3～10万元人民币，还出现供不应求的现象，而我国国产的微载体大多数尚在研制之中，或者生产规模较小，难以工业化生产，不能满足我国生物制药领域疫苗、重组药物蛋白、单克隆抗体、细胞因子及其受体等医用生物制品生产的需要，是限制我国动物细胞培养技术从转瓶细胞培养工艺向生物反应器微载体培养工艺转型的技术瓶颈之一。
目前，在发达国家，生物制药行业贴壁依赖型动物细胞培养工艺已普遍采用生物反应器微载体培养工艺，几千升、上万升的动物细胞培养生物反应器已用于抗体或人用及兽用疫苗的生产，微载体细胞培养的规模已达到6000L以上。而我国绝大多数疫苗类制药行业仍然沿用传统的转瓶（滚瓶）培养工艺。该工艺劳动强度大，细胞产量低，产品批向差异大，且容易造成污染，耗时耗力，导致我国绝大多数制药企业的生物医药产品生产成本高，产值低，无法与国外产品竞争。要提高产品竞争力，只有采用生物反应器微载体大规模培养技术。
因此，开发适合于我国生物医药领域多种动物细胞培养用的微载体，具有广泛的应用前景，对促进我国生物反应器微载体大规模细胞培养技术的发展具有重要的历史意义。
淀粉是一种廉价、易得、绿色的多糖生物材料,被广泛应用于食品、医药、纺织等行业。淀粉结构中的大量羟基基团为淀粉化学改性提供了良好载体,已成为最具发展潜力和应用前景的新型高分子材料之一。以淀粉为原料制备的淀粉微载体，有微孔结构、表面积较大且富含羟基等易接近的活性基团，因而可以有效吸附自由组分，成为细胞能够贴壁生长的良好原材料，目前，淀粉微载体尚未见报道。
发明内容
本发明提供了一种细胞培养用微载体及其制备方法和应用。该制备方法具有以下特点：采用普通的食用淀粉，原料无毒性，采取乳化成球常温下交联固化，DEAE再次偶联修饰，整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，易于形成工业化生产，使淀粉微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养。
本发明提供一种细胞培养用微载体的制备方法，步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：将一定量的淀粉溶解于纯水中，搅拌加热至糊化，再加入一定量的NaOH溶液，搅拌冷却形成均一稳定的水相溶液；
（2）油水相混合制球：将无毒高密度油、异辛烷、分散剂和一定量的乳化剂混合搅拌，形成均一的油相溶液后，缓慢加入水相溶液，搅拌，形成均一稳定的混合相；
（3）交联固化成球：再将交联剂缓慢加入到混合相中，常温下搅拌交联反应一定时间；
（4）除油洗涤：除去上层的油乳液，将固形物用表面活性剂进行除油，再依次用不含Ca2 +、Mg2+的PBS缓冲液及纯水洗涤，抽滤得到湿微球；
（5）偶联DEAE-HCl：称取一定量的湿微球，加入一定浓度的NaOH溶液搅拌，再加入一定浓度的DEAE-HCl溶液，搅拌偶联反应一定时间；
（6）洗涤：依次用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液及纯水洗涤，得到细胞培养用微载体；
作为优选，步骤（6）后还包括将得到的微载体保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中的步骤。
配制淀粉碱溶液的目的是加热使淀粉糊化，分子间的氢键断开，带电荷才能均匀分布在溶液中，使其成为均一的胶体溶液；
油相中异辛烷的存在，会降低淀粉溶液在油相中的溶解度，并且能够完全乳化成圆滴状，使其能够固化成球；
DEAE(二乙胺基乙基，diethylaminoethyl)是一种弱碱性的叔胺基团，中心N原子带有正电荷，具有离子交换功能，同时也可以使细胞贴附在微载体表面；偶联DEAE-HCl后，贴壁细胞可以完全贴附在淀粉微载体表面，正常生长。
将微载体保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中的效果为：能够保持微载体的外观，同时抑制细菌的生长，保持微载体的洁净。
优选地，步骤（1）中，所述淀粉为木薯淀粉、马铃薯淀粉、大豆淀粉、玉米淀粉中的一个或者任意两者的组合；
作为优选，所述NaOH溶液的浓度为0.5～2mol/L；
作为优选，所述水相溶液中，淀粉的质量体积百分比为0.1%～15%。
在步骤（1）中，各优选条件的效果为：水相溶液均一透明，浓稠度适合，使其能够完全分散于油相溶液，便于成球。
优选地，步骤（2）中，所述无毒高密度油为矿物油或植物油；
作为优选，所述无毒高密度油为液体石蜡、机油、汽油、硅油、花生油、玉米油或大豆油；
作为优选，所述水相和油相的体积比为1:1～10；
作为优选，所述的乳化剂和分散剂为Span-20、Span-40、Span-60、Span-80、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80中的一种或者任意两者的组合；
作为优选，所述油相中乳化剂和分散剂的体积浓度为0.1%～5%。
在步骤（2）中，各优选条件的效果为：油乳液均一稳定，能够使淀粉水相溶液稳定分散于油相溶液中，乳化成球。
优选地，步骤（3）中，所述的交联剂为戊二醛、聚乙二醇缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、氮丙啶中的一种；
作为优选，所述的交联剂用量为水相溶液体积的3%～20%；
作为进一步优选，所述的交联剂用量为水相溶液体积的8%～12%；
作为优选，所述的交联搅拌速度为200～1000rpm，反应时间为2～10小时；
作为进一步优选，所述的交联搅拌速度为400～700rpm，反应时间为4～8小时。
在步骤（3）中，各优选条件的效果为：交联剂与水相溶液完全反应，固化效果好，微球刚性及耐压程度高，并且该搅拌速度条件下，成球的粒径90%以上都在100～300μm，可应用于微载培养；
优选地，步骤（4）中，所述的表面活性剂的质量浓度为1～5%；
作为优选，所述表面活性剂为Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、TRITON-100或OP-10中的一种。
在步骤（4）中，各优选条件的效果为：表面活性剂具有特有的界面活性，使疏水基和亲水基之间有一定的平衡，同时附降低水的表面张力，辅助乳化作用，使水相溶液能够完全乳化，形成均一稳定的乳化液。当表面活性剂选择以上几种中的一种时，乳化效果最佳。
优选地，步骤（5）中，所述的湿微球的质量、NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积三者之间的比值为1:1～4:1～4；
作为优选，所述NaOH溶液的浓度为0.5～4mol/L，DEAE-HCl的浓度为1～5mol/L；
作为优选，所述偶联反应的速度为400～800rpm，偶联温度60～80℃，交联时间为2～6小时。
在步骤（5）所述条件下，淀粉微球表面活性羟基都能与DEAE发生偶联反应，DEAE可以完全均与偶联在淀粉微球表面，而且偶联的DEAE浓度不会太高或者太低，便于细胞贴附在微载体表面正常生长。
优选地，所述步骤（6）后还将得到的微载体筛分的步骤，取粒径在100～400μm的微载体；
作为优选，取粒径在200～300μm的微载体；
作为进一步优选，在筛分后还包括灭菌的步骤；所述灭菌是将微载体洗净之后，用高压蒸汽灭菌或用75%酒精浸泡灭菌，或用Co60辐照灭菌。
本发明的第二个目的是提供应用上述任一的方法制备得到的细胞培养用微载体。
本发明的第三个目的是提供上述的微载体在细胞培养中的应用；
作为优选，所述细胞为贴壁培养型细胞。
作为进一步优选，所述应用为：将所述淀粉微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度5～10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养；在培养96～120小时后，根据实际需要，选择在含有质量百分浓度5～10%新生牛血清的细胞培养液中继续培养，或更换成含3～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒；
作为优选，将所述淀粉微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度8～10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养，在培养96～120小时后，更换成含3～5%新生牛血清的培养基继续培养；
作为优选，所述淀粉微载体浓度为3～10g/L，待培养细胞的接种密度为2～4×105cells/ml；
作为优选，所述细胞为CHO-K1细胞、Vero细胞、BHK-21细胞和Marc-145；
作为优选，在细胞培养方瓶、转瓶、磁悬浮瓶、细胞工厂或生物反应器中应用所述细胞微载体进行细胞培养。
本发明提供了一种细胞培养用淀粉微载体及其制备方法，采用普通的食用淀粉，原料无毒性、来源广泛，整个制备过程简单易行，方法可控，成本低廉，易于形成工业化生产。应用本发明的微载体能够在搅拌状态下悬浮培养，适合于多种贴壁细胞大规模悬浮培养，使其在生物制药领域得到广泛的应用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的微载体的表面电镜的效果图；
图2为用本发明的微载体培养CHO-K1细胞，细胞培养24小时的吉姆萨染色效果图；
图3为用本发明的微载体培养Vero细胞，细胞培养48小时的Hoechst33258染色荧光效果图；
图4为用本发明的微载体培养BHK-21细胞，细胞培养24小时的吉姆萨染色效果图；
图5为用本发明的微载体培养BHK-21细胞，细胞培养72小时的Hoechst33258染色荧光效果图；
图6为用本发明的微载体培养Marc-145细胞，细胞培养48小时的吉姆萨染色效果图；
图7为用本发明的微载体培养BHK-21细胞，更换成含低新生牛血清的培养基后，继续培养时的细胞生长曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本发明的一种细胞培养用微载体的制备方法步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：将淀粉溶解在去离子水中，搅拌时缓慢加热至糊化，再加入0.5-2mol/LNaOH溶液继续搅拌混匀，冷却静置成均一的水相溶液，在水相溶液中，淀粉的质量体积百分比为0.1%～15%；
（2）油水相混合制球：将无毒高密度油、异辛烷、分散剂和一定量的乳化剂混合搅拌，形成均一的油相溶液后，缓慢加入步骤（1）中的水相溶液，搅拌，形成均一稳定的混合相；在油相中乳化剂和分散剂的体积浓度之和为0.1%～5%，水相溶液和油相溶液的体积比为1:1～10；
（3）交联固化成球：再将交联剂缓慢加入到混合相中，常温下搅拌交联反应后，静置；交联剂用量为水相溶液体积的3%～20%，交联搅拌速度为200～1000rpm，反应时间为2～10小时；
（4）除油洗涤：除去上层油乳液，将固形物用质量浓度为1～5%的表面活性剂进行除油，浸泡洗涤下层的固形物，洗涤至无油；再依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤至少3次，抽滤得到淀粉微球；
（5）偶联DEAE：称取一定量的湿微球，加入浓度为0.5～4mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为1～5mol/L的DEAE-HCl溶液，进行偶联反应，偶联反应的速度为400～800rpm，偶联温度60～80℃，交联时间为2～6小时；其中，湿微球的质量、NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积三者之间的比值为1:1～4:1～4；
（6）保存：偶联DEAE反应后，依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤3次；保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中；
（7）筛分：将得到的微载体筛分，取粒径在100～400μm的微载体，即得本发明的微载体；
（8）使用时，首先进行灭菌处理，灭菌方法为下述中的一种：
A、将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，在pH7.0～7.4的PBS缓冲液中浸泡3小时以上，洗涤至少3遍，121℃，高压灭菌30min；
B、将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，在75%酒精中浸泡灭菌1小时；
C、将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，分装，之后用Co60辐照灭菌，辐照剂量18～20KGy。
实施例1
本发明的一种细胞培养用微载体的制备方法步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：称取10g大豆淀粉溶解在200mL去离子水中，搅拌时缓慢加热至80℃糊化，再加入0.5mol/LNaOH溶液20mL继续搅拌混匀，冷却静置成均一的水相溶液；
（2）油水相混合制球：量取大豆油500mL、异辛烷500mL、Span-8015mL和Tween-8010mL混合搅拌20min，形成均一的溶液后，缓慢加入水相溶液220ml，搅拌30min，形成均一稳定的混合相；
（3）交联固化成球：再将聚丙二醇二缩水甘油醚20mL缓慢加入到混合相中，搅拌速度为500rpm，常温下交联反应6小时后，静置；
（4）除油洗涤：除去上层油乳液，配制质量百分浓度为2%OP-10的水溶液浸泡洗涤下层的固形物，洗涤至无油；再依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤至少3次，抽滤得到淀粉微球；
（5）偶联DEAE：称取淀粉湿微球的质量10g、加入3mol/LNaOH20mL搅拌20min，再加入4mol/LDEAE-HCl20mL，偶联速度500rpm，偶联温度60℃，偶联时间为3小时；
（6）保存：偶联DEAE反应后，依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤3次；保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中；
（7）筛分：用140目和80目的筛网进行筛分，取粒径在140目筛网中的淀粉微载体，即得本发明的微载体；
（8）使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，在pH7.0～7.4的PBS缓冲液中浸泡3小时以上，洗涤至少3遍，121℃，高压灭菌30min。
图1为本发明的微载体的表面电镜的效果图，由该图可以看出，微载体球形规整，表面均有褶皱，说明在细胞贴附方面都有一定的物理作用，从而出现了不同形状的表面褶皱。
实施例2
本发明的一种细胞培养用微载体的制备方法步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：称取15g马铃薯淀粉溶解在500mL去离子水中，搅拌时缓慢加热至80℃糊化，再加入1mol/LNaOH溶液30mL继续搅拌混匀，冷却静置成均一的水相溶液；
（2）油水相混合制球：量取机油1000mL、异辛烷1000mL、Span-2050mL和Tween-8050mL混合搅拌20min，形成均一的溶液后，缓慢加入水相溶液530ml，搅拌30min，形成均一稳定的混合相；
（3）交联固化成球：再将聚乙二醇缩水甘油醚60mL缓慢加入到混合相中，搅拌速度为700rpm，常温下交联反应7小时后，静置；
（4）除油洗涤：除去上层油乳液，配制质量百分浓度为5%Tween-60的水溶液浸泡洗涤下层的固形物，洗涤至无油；再依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤至少3次，抽滤得到淀粉微球；
（5）偶联DEAE：称取淀粉湿微球的质量30g、加入3mol/LNaOH60mL搅拌20min，再加入2mol/LDEAE-Hcl60mL，偶联速度600rpm，偶联温度70℃，偶联时间为4小时；
（6）保存：偶联DEAE反应后，依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤3次；保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中；
（7）筛分：用120目和50目的筛网进行筛分，取粒径120目筛网中的淀粉微载体，即得本发明的微载体；
（8）使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，在pH7.0～7.4的PBS缓冲液中浸泡3小时以上，洗涤至少3遍，121℃，高压灭菌30min。
实施例3
本发明的一种细胞培养用微载体的制备方法步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：称取20g木薯淀粉溶解在500mL去离子水中，搅拌时缓慢加热至80℃糊化，再加入2mol/LNaOH溶液20mL继续搅拌混匀，冷却静置成均一的水相溶液；
（2）油水相混合制球：量取汽油1500mL、异辛烷1500mL、Span-8050mL和Tween-80100mL混合搅拌20min，形成均一的溶液后，缓慢加入水相溶液520ml，搅拌30min，形成均一稳定的混合相；
（3）交联固化成球：再将氮丙啶60mL缓慢加入到混合相中，搅拌速度为500rpm，常温下交联反应5小时后，静置；
（4）除油洗涤：除去上层油乳液，配制质量百分浓度为4%Tween-20的水溶液浸泡洗涤下层的固形物，洗涤至无油；再依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤至少3次，抽滤得到淀粉微球；
（5）偶联DEAE：称取淀粉湿微球的质量50g、加入2mol/LNaOH100mL搅拌20min，再加入3mol/LDEAE-Hcl100mL，偶联速度600rpm，80℃偶联时间为3.5小时；
（6）保存：偶联DEAE反应后，依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤3次；保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中；
（7）筛分：用140目和50目的筛网进行筛分，取粒径140目筛网中的淀粉微载体，即得本发明的微载体；
（8）使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，在pH7.0～7.4的PBS缓冲液中浸泡3小时以上，洗涤至少3遍，121℃，高压灭菌30min。
实施例4
本发明的一种细胞培养用微载体的制备方法步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：称取20g大豆淀粉溶解在400mL去离子水中，搅拌时缓慢加热至80℃糊化，再加入1.5mol/LNaOH溶液10mL继续搅拌混匀，冷却静置成均一的水相溶液；
（2）油水相混合制球：量取硅油400mL、异辛烷400mL、Span-8010mL和Tween-8010mL混合搅拌20min，形成均一的溶液后，缓慢加入水相溶液410ml，搅拌30min，形成均一稳定的混合相；
（3）交联固化成球：再将聚乙二醇缩水甘油醚30mL缓慢加入到混合相中，搅拌速度为800rpm，常温下交联反应6小时后，静置；
（4）除油洗涤：除去上层油乳液，配制质量百分浓度为4%OP-10的水溶液浸泡洗涤下层的固形物，洗涤至无油；再依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤至少3次，抽滤得到淀粉微球；
（5）偶联DEAE：称取淀粉湿微球的质量20g、加入2mol/LNaOH40mL搅拌20min，再加入3.5mol/LDEAE-Hcl40mL，偶联速度600rpm，60℃偶联时间为4小时；
（6）保存：偶联DEAE反应后，依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤3次；保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中；
（7）筛分：用120目和80目的筛网进行筛分，取粒径120目筛网中的淀粉微载体，即得本发明的微载体；
（8）使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，在pH7.0～7.4的PBS缓冲液中浸泡3小时以上，洗涤至少3遍，121℃，高压灭菌30min。
实施例5
本发明的一种细胞培养用微载体的制备方法步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：称取15g玉米淀粉溶解在300mL去离子水中，搅拌时缓慢加热至80℃糊化，再加入0.8mol/LNaOH溶液20mL继续搅拌混匀，冷却静置成均一的水相溶液；
（2）油水相混合制球：量取花生油155mL、异辛烷155mL、Span-405mL和Tween-405mL混合搅拌20min，形成均一的溶液后，缓慢加入水相溶液320ml，搅拌30min，形成均一稳定的混合相；
（3）交联固化成球：再将戊二醛10mL缓慢加入到混合相中，搅拌速度为200rpm，常温下交联反应10小时后，静置；
（4）除油洗涤：除去上层油乳液，配制质量百分浓度为1%Tween-80的水溶液浸泡洗涤下层的固形物，洗涤至无油；再依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤至少3次，抽滤得到淀粉微球；
（5）偶联DEAE：称取淀粉湿微球的质量10g、加入0.5mol/LNaOH40mL搅拌20min，再加入1mol/LDEAE-HCl40mL，偶联速度400rpm，偶联温度60℃，偶联时间为6小时；
（6）保存：偶联DEAE反应后，依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤3次；保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中；
（7）筛分：用70目和50目的筛网进行筛分，取粒径在70目筛网中的淀粉微载体，即得本发明的微载体；
（8）使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，在pH7.0～7.4的PBS缓冲液中浸泡3小时以上，洗涤至少3遍，121℃，高压灭菌30min。
实施例6
本发明的一种细胞培养用微载体的制备方法步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：称取30g大豆淀粉、30g玉米淀粉溶解在400mL去离子水中，搅拌时缓慢加热至80℃糊化，再加入1.2mol/LNaOH溶液20mL继续搅拌混匀，冷却静置成均一的水相溶液；
（2）油水相混合制球：量取液体石蜡1700mL、异辛烷1700mL、Span-603.5mL混合搅拌20min，形成均一的溶液后，缓慢加入水相溶液420ml，搅拌30min，形成均一稳定的混合相；
（3）交联固化成球：再将马来酸酐84mL缓慢加入到混合相中，搅拌速度为1000rpm，常温下交联反应2小时后，静置；
（4）除油洗涤：除去上层油乳液，配制质量百分浓度为3%TRITON-100的水溶液浸泡洗涤下层的固形物，洗涤至无油；再依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤至少3次，抽滤得到淀粉微球；
（5）偶联DEAE：称取淀粉湿微球的质量10g、加入4mol/LNaOH40mL搅拌20min，再加入5mol/LDEAE-HCl20mL，偶联速度800rpm，偶联温度70℃，偶联时间为2小时；
（6）保存：偶联DEAE反应后，依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤3次；保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中；
（7）筛分：用100目和80目的筛网进行筛分，取粒径在100目筛网中的淀粉微载体，即得本发明的微载体；
（8）使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，在pH7.0～7.4的PBS缓冲液中浸泡3小时以上，洗涤至少3遍，121℃，高压灭菌30min。
实施例7
本发明的一种细胞培养用微载体的制备方法步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：称取0.2g木薯淀粉、0.22g马铃薯淀粉溶解在400mL去离子水中，搅拌时缓慢加热至80℃糊化，再加入1.6mol/LNaOH溶液20mL继续搅拌混匀，冷却静置成均一的水相溶液；
（2）油水相混合制球：量取汽油500mL、异辛烷500mL、Tween-8052mL混合搅拌20min，形成均一的溶液后，缓慢加入水相溶液420ml，搅拌30min，形成均一稳定的混合相；
（3）交联固化成球：再将戊二酸酐50mL缓慢加入到混合相中，搅拌速度为400rpm，常温下交联反应4小时后，静置；
（4）除油洗涤：除去上层油乳液，配制质量百分浓度为3%Tween-40的水溶液浸泡洗涤下层的固形物，洗涤至无油；再依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤至少3次，抽滤得到淀粉微球；
（5）偶联DEAE：称取淀粉湿微球的质量10g、加入1mol/LNaOH10mL搅拌20min，再加入3mol/LDEAE-HCl10mL，偶联速度700rpm，偶联温度70℃，偶联时间为5小时；
（6）保存：偶联DEAE反应后，依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤3次；保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中；
（7）筛分：用100目和80目的筛网进行筛分，取粒径在100目筛网中的淀粉微载体，即得本发明的微载体；
（8）使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，在75%酒精中浸泡灭菌1小时。
实施例8
本发明的一种细胞培养用微载体的制备方法步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：称取10g马铃薯淀粉、12g玉米淀粉溶解在200mL去离子水中，搅拌时缓慢加热至80℃糊化，再加入1.6mol/LNaOH溶液20mL继续搅拌混匀，冷却静置成均一的水相溶液；
（2）油水相混合制球：量取玉米油1080mL、异辛烷1080mL、Span-4020mL和Span-6020mL混合搅拌20min，形成均一的溶液后，缓慢加入水相溶液420ml，搅拌30min，形成均一稳定的混合相；
（3）交联固化成球：再将丁二酸酐18mL缓慢加入到混合相中，搅拌速度为600rpm，常温下交联反应8小时后，静置；
（4）除油洗涤：除去上层油乳液，配制质量百分浓度为2%Tween-80的水溶液浸泡洗涤下层的固形物，洗涤至无油；再依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤至少3次，抽滤得到淀粉微球；
（5）偶联DEAE：称取淀粉湿微球的质量10g、加入2.5mol/LNaOH30mL搅拌20min，再加入2.5mol/LDEAE-HCl20mL，偶联速度650rpm，偶联温度70℃，偶联时间为4小时；
（6）保存：偶联DEAE反应后，依次用PBS缓冲液（不含Ca2+、Mg2+）及纯水洗涤3次；保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中；
（7）筛分：用120目和80目的筛网进行筛分，取粒径在120目筛网中的淀粉微载体，即得本发明的微载体；
（8）使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤（7）筛分的微载体用纯净水洗涤至少5遍以上，分装，之后用Co60辐照灭菌，辐照剂量18～20KGy。
本发明的细胞培养用微载体在培养CHO-K1细胞中的应用及效果如下：
经实验，应用本发明的微载体培养细胞时，对培养液没有具体要求，任何能够用于培养该细胞的培养液均能够在使用本发明的微载体培养细胞时使用。以下为应用本发明的微载体培养细胞的具体实验例。
实施例9本发明的淀粉微载体的应用实施例
将本发明的淀粉微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度5～10%新生牛血清的细胞培养液中（细胞培养液可以是DMEM、M199、F12、MEM、D-MEM/F-12等常用培养基），进行细胞培养。在培养96～120小时后，可以根据实际需要，选择在含有质量百分浓度5～10%新生牛血清的细胞培养液中继续培养，或更换成含3～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒。在低新生牛血清中继续培养时，细胞能够继续生长，细胞可以在含3～5%新生牛血清的培养基中继续维持9天以上，这样，可以降低生产企业的成本。因此，本发明的微载体适合多种贴壁细胞的培养（如DBK细胞、BT细胞、MA104细胞、PK15细胞等），尤其是有利于难以用普通微载体进行贴壁培养的CHO、VERO、BHK-21、Marc-145等细胞的培养。当然，为了使细胞培养达到最佳效果，也可以一直在含有质量百分浓度5～10%新生牛血清的细胞培养液中进行细胞培养。
优选方案为：将所述淀粉微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度8～10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养，在培养96～120小时后，更换成含3～5%新生牛血清的培养基继续培养。
优选方案为：淀粉微载体浓度为3～10g/L，待培养细胞的接种密度为2～4×105cells/ml，此时细胞生长速度较快。
在3～5%新生牛血清的低血清培养基中，细胞能贴壁生长，但在5～10%新生牛血清的培养基中，生长效果最佳。
本发明的细胞微载体可以在细胞培养方瓶、转瓶、磁悬浮瓶、细胞工厂或生物反应器中进行细胞培养。
一、本发明的细胞培养用微载体在培养CHO-K1细胞中的应用及效果如下：
用本发明的微载体培养CHO-K1细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度2.0～2.5×105cells/mL，微载体量为4g/L，培养液体积为200mL，为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物工程有限公司，优级新生牛血清】的F12培养液【购自GIBCO公司】，培养温度为37℃，搅拌速度为45rpm，培养144小时，细胞最大密度1.0～2.0×106cells/mL。图2是本发明的微载体培养CHO-K1细胞，培养24小时的吉姆萨染色效果图。
由图2可以看出，CHO-K1细胞完全贴附在淀粉微载体表面，细胞形态正常，说明CHO-K1细胞能够良好地与淀粉微载体接触并贴附生长。
本发明的细胞培养用微载体能够在现有的任何CHO-K1细胞培养液的基础上，以CHO-K1细胞常用培养条件对CHO-K1细胞进行培养，而并不仅限于使用上述培养液，在上述培养条件下进行培养。只要在培养液中加入微载体的量达到3-6g/L，培养液中新生牛血清的量达到5-10%，即可对CHO-K1细胞进行培养，培养后，CHO-K1细胞完全贴附在淀粉微载体表面，细胞形态正常。
二、本发明的细胞培养用淀粉微载体在培养Vero细胞中的应用及效果如下：
用本发明的微载体培养Vero细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度3.0～4.0×105cells/mL，微载体量为5g/L，培养液体积为300mL，为含8%新生牛血清【购自兰州民海生物工程有限公司，优级新生牛血清】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】，培养温度为37℃，搅拌速度为45rpm，培养120小时，细胞最大密度1.5～2.5×106cells/mL。图3是本发明的微载体培养Vero细胞，培养48小时的Hoechst33258染色荧光效果图。
由图3可以看出，Hoechst33258是一种特殊的荧光染料，活细胞或固定细胞可以捕捉该染色液而使细胞核着色。由此可看出Vero细胞细胞核形态正常，无不良反应，细胞贴附后能够良好的正常生长，并且繁殖增长。
本发明的细胞培养用微载体能够在现有的任何Vero细胞培养液的基础上，以Vero细胞常用培养条件对Vero细胞进行培养，而并不仅限于使用上述培养液，在上述培养条件下进行培养。只要在培养液中加入微载体的量达到3-6g/L，培养液中新生牛血清的量达到5-10%，即可对Vero细胞进行培养，培养后，Vero细胞细胞核形态正常，无不良反应，细胞贴附后能够良好的正常生长，并且繁殖增长。
三、本发明的细胞培养用淀粉微载体在培养BHK-21细胞中的应用及效果如下：
用本发明的微载体培养BHK-21细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度3.0～3.5×105cells/mL，微载体量为5g/L，培养液体积为500mL，为含8%新生牛血清【购自兰州民海生物工程有限公司，优级新生牛血清】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】，培养温度为37℃，搅拌速度为45rpm，培养120小时，细胞最大密度1.5～2.5×106cells/mL。图4是本发明的微载体培养BHK-21细胞，细胞培养24小时的吉姆萨染色效果图；
图5是本发明的微载体培养BHK-21细胞，细胞培养72小时的Hoechst33258染色荧光效果图。
由图4和5可以看出，吉姆萨染色后，清晰地看到成纤维细胞样，细胞圆润饱满，正常贴附在微载体表面；Hoechst33258染色后，细胞呈明亮的小圆点附着在载体表面，分布均匀，说明细胞贴壁良好均匀。
本发明的细胞培养用微载体能够在现有的任何BHK-21细胞培养液的基础上，以BHK-21细胞常用培养条件对BHK-21细胞进行培养，而并不仅限于使用上述培养液，在上述培养条件下进行培养。只要在培养液中加入微载体的量达到3-6g/L，培养液中新生牛血清的量达到5-10%，即可对BHK-21细胞进行培养，培养后，BHK-21细胞圆润饱满，正常贴附在微载体表面，细胞贴壁良好均匀。
四、本发明的细胞培养用淀粉微载体在培养Marc-145细胞中的应用及效果如下：
用本发明的微载体培养Marc-145细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度3.0～3.5×105cells/mL，微载体量为5g/L，培养液体积为300mL，为含5%新生牛血清【购自兰州民海生物工程有限公司，优级新生牛血清】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】，培养温度为37℃，搅拌速度为45rpm，培养120小时，细胞最大密度2.0～2.5×106cells/mL。图6是本发明的微载体培养Marc-145细胞，细胞培养72小时的吉姆萨染色效果图。
由图6可以看出，Marc-145细胞能够完全贴附在淀粉微载体表面，均已生长，生物相容性良好，细胞形态正常。
本发明的细胞培养用微载体能够在现有的任何Marc-145细胞培养液的基础上，以Marc-145细胞常用培养条件对Marc-145细胞进行培养，而并不仅限于使用上述培养液，在上述培养条件下进行培养。只要在培养液中加入微载体的量达到3-6g/L，培养液中新生牛血清的量达到3-10%，即可对Marc-145细胞进行培养，培养后，Marc-145细胞能够完全贴附在淀粉微载体表面，均已生长，生物相容性良好，细胞形态正常。
五、以用本发明的微载体培养BHK-21细胞为例，细胞培养条件为：细胞接种密度1.5×105cells/mL，微载体量为6g/L，培养液体积为1000mL，为含8%新生牛血清【购自兰州民海生物工程有限公司，优级新生牛血清】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】，培养温度为37℃，搅拌速度为45rpm，培养120小时后，更换成含5%新生牛血清【购自兰州民海生物工程有限公司，优级新生牛血清】的DMEM培养基【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】继续培养，培养至240h，接种后在48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h换液500mL。培养温度为37℃，搅拌速度为45rpm。于每隔24h时间段取样，自然沉降，弃去上清液，加入等量的结晶紫溶液，混匀后再37℃培养箱静置24h，用血球计数板计算细胞核数。将所记录的数据整理绘制成细胞生长曲线，如附图7所示。实验表明，本发明的淀粉微载体适合于BHK-21细胞贴壁生长，细胞计数显示细胞密度最大可达到2.3×106cells/mL，能实现细胞高密度培养。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种细胞培养用微载体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
（1）首先配制糊化的淀粉碱溶液：将一定量的淀粉溶解于纯水中，搅拌加热至糊化，再加入一定量的NaOH溶液，搅拌冷却形成均一稳定的水相溶液；
（2）油水相混合制球：将无毒高密度油、异辛烷、分散剂和一定量的乳化剂混合搅拌，形成均一的油相溶液后，缓慢加入水相溶液，搅拌，形成均一稳定的混合相；
（3）交联固化成球：再将交联剂缓慢加入到混合相中，常温下搅拌交联反应一定时间；
（4）除油洗涤：除去上层的油乳液，将固形物用表面活性剂进行除油，再依次用不含Ca2 +、Mg2+的PBS缓冲液及纯水洗涤，抽滤得到湿微球；
（5）偶联DEAE-HCl：称取一定量的湿微球，加入一定浓度的NaOH溶液搅拌，再加入一定浓度的DEAE-HCl溶液，搅拌偶联反应一定时间；
（6）洗涤：依次用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液及纯水洗涤，得到细胞培养用微载体；
作为优选，步骤（6）后还包括将得到的微载体保存在体积百分浓度为30%的乙醇溶液中的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述淀粉为木薯淀粉、马铃薯淀粉、大豆淀粉、玉米淀粉中的一个或者任意两者的组合；
作为优选，所述NaOH溶液的浓度为0.5～2mol/L；
作为优选，所述水相溶液中，淀粉的质量体积百分比为0.1%～15%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述无毒高密度油为矿物油或植物油；
作为优选，所述无毒高密度油为液体石蜡、机油、汽油、硅油、花生油、玉米油或大豆油；
作为优选，所述水相和油相的体积比为1:1～10；
作为优选，所述的乳化剂和分散剂为Span-20、Span-40、Span-60、Span-80、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80中的一种或者任意两者的组合；
作为优选，所述油相中乳化剂和分散剂的体积浓度为0.1%～5%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述的交联剂为戊二醛、聚乙二醇缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、马来酸酐、戊二酸酐、丁二酸酐、氮丙啶中的一种；
作为优选，所述的交联剂用量为水相溶液体积的3%～20%；
作为进一步优选，所述的交联剂用量为水相溶液体积的8%～12%；
作为优选，所述的交联搅拌速度为200～1000rpm，反应时间为2～10小时；
作为进一步优选，所述的交联搅拌速度为400～700rpm，反应时间为4～8小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述的表面活性剂的质量浓度为1～5%；
作为优选，所述表面活性剂为Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、TRITON-100或OP-10中的一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述的湿微球的质量、NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积三者之间的比值为1:1～4:1～4；
作为优选，所述NaOH溶液的浓度为0.5～4mol/L，DEAE-HCl的浓度为1～5mol/L；
作为优选，所述偶联反应的速度为400～800rpm，偶联温度60～80℃，交联时间为2～6小时。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（6）后还将得到的微载体筛分的步骤，取粒径在100～400μm的微载体；
作为优选，取粒径在200～300μm的微载体；
作为进一步优选，在筛分后还包括灭菌的步骤；所述灭菌是将微载体洗净之后，用高压蒸汽灭菌或用75%酒精浸泡灭菌，或用Co60辐照灭菌。
8.应用权利要求1-7任一所述的方法制备得到的细胞培养用微载体。
9.权利要求8所述的微载体在细胞培养中的应用；
作为优选，所述细胞为贴壁培养型细胞。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用为：将所述淀粉微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度5～10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养；在培养96～120小时后，根据实际需要，选择在含有质量百分浓度5～10%新生牛血清的细胞培养液中继续培养，或更换成含3～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒；
作为优选，将所述淀粉微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度8～10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养，在培养96～120小时后，更换成含3～5%新生牛血清的培养基继续培养；
作为优选，所述淀粉微载体浓度为3～10g/L，待培养细胞的接种密度为2～4×105cells/ml；
作为优选，所述细胞为CHO-K1细胞、Vero细胞、BHK-21细胞和Marc-145；
作为优选，在细胞培养方瓶、转瓶、磁悬浮瓶、细胞工厂或生物反应器中应用所述细胞微载体进行细胞培养。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160511 |