SU1518370A1 - Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона человека дл изготовлени диагностических препаратов - Google Patents
Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона человека дл изготовлени диагностических препаратов Download PDFInfo
- Publication number
- SU1518370A1 SU1518370A1 SU884360224A SU4360224A SU1518370A1 SU 1518370 A1 SU1518370 A1 SU 1518370A1 SU 884360224 A SU884360224 A SU 884360224A SU 4360224 A SU4360224 A SU 4360224A SU 1518370 A1 SU1518370 A1 SU 1518370A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- strain
- cells
- human embryo
- muscles
- skin
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл вирусологических исследований и оценки антивирусного действи химиопрепаратов. Цель изобретени - получение нового штамма культивируемых диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемого дл изготовлени диагностических препаратов и размножени вирусов. Штамм получают трипеннизацией кожно-мышечных лоскутов 10-недельного эмбриона человека и адаптацией полученных клеток к стабильным услови м культивировани . Штамм обозначают М-23, он хранитс во Всесоюзной специализированной коллекции клеточных культур Института медицинской генетики АМН СССР под номером Д-3 (15/2/7). Штамм способен к прививкам без снижени пролиферативной активности до 41 пассажа. Процент диплоидных клеток колеблетс в пределах от 90,2 до 93,2, полиплоидных - от 0,6 до 1,9. Штамм обеспечивает накопление специфического антигена ИМВ в титре 1:32, используемого в РСК, и служит в качестве тест-системы дл диагностики цитомегаловирусной инфекции. Штамм пригоден дл накоплени биомассы вируса полиомиелита.
Description
Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл вирусологических исследований и оценки антивирусного действи химиопрепа- ратов.
Цель изобретени - получение нового штамма культивируемых диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека , используемого дп изготовлени диагностических препаратов и размножени вирусов.
Штамм получают следутоцим образом.
Исходной тканью служат кожно-мы- шечные лоскуты 0-недельного эмбриона человека, выделенного путем аборта от здоровой женщины 30 лет, в анамнезе которой не было онкологических, венерических, генетических заболеваний и врожденных аномалий, а также гепатита и туберкулеза.
Первичную культуру клеток эмбриона человека готов т с помощью метода
1чад 1цей трипсиниэации измельченных кусочков ткани 0,25%-ным раствором трипсина при чередующихс контактах с питательной средой.
Клети ресуспендируют в среде Игла №М с 10% СКРС и эксплантируют 10 по луторалитровьгх матрасов с концентрацией клеток 9 « О /мл. Сосуды с клетками инкубируют при 37 С. В первичной культуре монослой формируетс за 9 сут. Затем провод т первое суб- кч льтивирование, а все последующие по четкому графику два раза в неделю так, что интервал между пересевами клеток посто нно составл ет 3-4 суТо Используют среду того же состава, Отделение клет.ок от стекла осуществл ют 0,25%-ным раствором трипсина при кратковременном контакте их с ферментомс Кратность рассева клеток Б фазе активного роста составл ет 1:2 1:3,, Полученный штамм обозначают М-23.
Ш Т амм М-23 хранитс во Всесоюзной специализированной коллекции клеточных культур Института медицинской генетики АМН СССР под номером ДЗ (15/2/7).
Штамм М-23 характеризуетс следующими признаками.
Культуральные свойства.
Жизненный цикл штамма 55±3 пассажа ,
роста становление 1-2 пас-- caw, активный t: OCT 3-41, старение 4 .- 58 пассажей .,
Кра гнссть р ггева в первых двух -t. i ; 1; реже 1:2, третьей - 1:1, : 1 j на уро н х последующих пассажей 1;1, посевна доза 75-100 10 в i МП среды Игла MEM с 10% СКРС. Отделение клеток от стекла провод т Япт л уром трипсина. Количество клеток в монослое 1,5-литро- вого матраса 35 ч5 мин.
обпадает высокой пролифера- тивной активностью и способен сохран тьс на стекле в виде моносло без cMeHbJ среды не менее 2 кед.
При криоконсервации примен ют 80% среды Игла MEM, 10% СКРС, в качестве криопротектора используют 10% глицерина |;ри концентрации клеток 2-3 «IO /мл, Жизнеспособными после восстановлени остаютс 75±5% клеток
Банк посевных клеток состоит из 200 ампуц, содержащих 0,7 млрд. клеток на уровне 7 пассажа.
Изучение изоферментов в клетках niTaNfMa М-23 вы вл ет энзимограмму человека и глюкозо-6-фосфатдегидрогенаЗУ медленного типа.
Морфологические признаки. Первична культура состоит из фибробластоподобных и эпителиоподоб- ных клеток с преобладанием первых.
При вступлении культуры в фазу активного роста эпителиоподобные клетки исчезают и под малым увеличением микроскопа наблюдают мономорфную культуру с характерным дл фибробластов
ориентированным расположением клеток Такой вид культура тер ет л третьей фазе.
I lTatiM М-23 изучают с помощью цитологических и цитохимических методов
на уровне II и 25 пассажей. На фиксированных и окрашенных гематоксилином и эозином препаратах установлено, что культура образует ровный монс- слой,состо щий из веретенопицных однородных фибробластов, ориентированных в потоки по длинной оси клеток. Ядра клеток удлиненные, овальные, содержащие 1-3 дрьш;ка и мелкие глыб- ки хроматина.
Вь.сока митс,тическа активность наблюдаетс в первые сутки лосле посадки , по мере формировани моносло количество дел щихс клеток снг1Жаетс; до единичных, что свидетельствует о
выраженной митотической, а также контактной ингибиции„
Многослойнос ти культуры не отмечено , Клетки штамма свободны от онко генной потенции,
На гистохимических препаратах наблюдаетс обычное содержание ДОК и РНК, Кисла и щелочна фосфотазы присутствуют в виде мелких глыбок, редко разбросанных по цитоплазме, Гликоген обнаруживают также в виде мелких глыбок,
Никаких признаков контаминации .культуры (внутри дерных и цитоплазма- тических включений, вакуолизации, образование симпластов, патологических митозов) не вы влено.
Кариологическа характеристика,
Кариологический анализ провод т
на /ровне 10, 20, 30, 40 пассажей по
1000 метафаз, .
Процент диплоидных клеток колеблетс .от 90,2 до 93,2, процент полиплоидных - от 0,6 до 1,9. Послед- кий показатель на ,I ниже допустимо5
го ВОЗ предела дл диплоидных клеток человека, используемых дл изготовлени медицинских вирусных вакцин, в св зи с этим штамм может быть применен в вакцинном производстве.
Контроль штамма М-23 на посторонние контаминанты.
При обследовании клеток штамма М-23 на стерильность (наличие грибов , бактерий, микоплазм) получены отрицательные результаты на уровне 1-10 пассажей.
При обследовании культуральной жидкости и самих клеток на уровне 10, 20, 30, 40 пассажей в чувствительных клеточных системах, а также в реакци х гемадсорбции вирусы контаминанты не вы влены,
При обследовании штамма М-23 на уровн х 12, 21, 31, 41 пассажей в опытах на взрослых и новорожденных мьшах, кроликах, морских свинках, куриных эмбрионах, иммунодепрессиро- ванных Mbmiax линии СВА посторонних агентов,-в том числе и онкогенных, не обнаружено. На фиксированных и окрашенных препаратах культуры штамма М-23 патологических изменений не вы влено.
Чувствительность к вирусам,
Штамм М-23 чувствителен к полио- и цитомегаловирусу. Вирусом полиомиелита заражают культуру на уровне 8, 9, 12 пассажей Накопление вируса всех трех типов в высоких титрах зарегистрировано без адаптации. На уровне восьмого пассажа титр вируса I типа - 7,71; II - 7,64, III - 7,87 Аналогичные результаты дл дев того пассажа - 7,62; 7,34; 7,96; дл двенадцатого пассажа - 7,89; 7,70;. 7,55 Ig БОЕ/МЛ.
Титр штамма Ad-169 цитомегаловиру сов колеблетс от 10 до
Штамм М-23 используют в качестве тест-системы дл диагностики цитоме- галовирусной инфекции.
Пример . В культуральный сосуд со штаммом М-23 диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека на уровне двадцатого пассажа ввод т смесь растворов 0,25% трипсина и 0,02% версена (1:5), подогретого до 37°С. Монослой ополаскивают и жидкость удал ют. Сосуд с культурой оставл ют до отслоени клеток от стекла при 37°С. Затем в него ввод т среду роста (Игла MEM) с 10% СКРС
706
ло концентрации I 20 Ч О VMH йтпесь п объеме 1 мл внос т в пробирки со стеклом. Клетки инокулируюг в стате при (, в Т , ут до фор.чиронани М(л;опо 1.
Удал ют ростовун) срепу и в четыре пробирки с клетками нног т пробы мочи больного с подотрением на цитомегаловирусную инфекцию Ггю О,2 мл
в каждую). Через 40 мин после контакта культуры трижды проминают питательной средой н добавл ют пов,тер- живающую среду. В течение 10 дней
культуру ежедневно микроскопируют. На седьмой день регистрируют специфические изменени клеток, выражаю- гциес в их округлении и изменении структуры . дер. На восьмой день культуры двух пробирок фиксируют и окрашивают дп цитологического анализа, а. клетки двух других пробирок отдел ют от стекла и взвешипагот р 2 мл среды. Полученную клеточную взвесь ввод т
в четыре пробирки с монослойной культурой .штамма М-23, по 0,3 мл в каждую. Контакт с зараженными клетками продолжаетс iO ми:-;. Вс остальные процедуры провод т аналогично
описанному. Дл ппделеии вируса требуетс п ть сокультквир лрaiJHi i. На последнем пассаже 11рои3 5од;-т -сбор виругосодержащей жидг огтт, опреде-л - ют титр вируса, идентиф1-:цируют ев ежеиаолированиый штамм ЦМВ п реакции
немтрсшизации со специфической иммунной сывороткой, полученной при гипер- иммунизацин кроликов эт. шонн1-.1М штаммом Ad-169. Устанопл ч ПгГЙ штамм обозначают ЦМВ-493. Из культуры п того пассажа готов т цитопог ичегкир препараты , которые окрашивают гем токси- лином и эозином. При микроскопирова- нии в них вы вл ют характерные дл
ЦМВ внутри де1)ные включени - сови- ньш глаз.
Аналогичный штамм ЦМВ-493 с помощью тех же процедур рыгт.елен из слюны больного, которьш также идентифицирован как ЦМВ.
Пример 2, Купьтуру клеток штамма М-23 на уропне тридцатого пассажа готов т по способу, списанному в примере 1 , клеточную в весь внос т в 1,5-литровые матрасы.Кл,-тки инкубируют в термостате при в течение 3 сут до формиро аии М-М1ОГЛОЯ.
Среду роста из матраса удал ют и внос т штамм Ad-169 цитомегалови- русов в виде цельной вирусосодержащей жидкости в объеме 10 чп при титре 5 Ig ТЦД /мл. Контакт вируса с клетками - 1 ч при 37 С. Затем в каждый матрас ввод т 100 мл поддерживающей |среды и инкубируют при до момента равити цитопатических изменений в 80% клеток. Среду удал ют, клеточный слой однократно промывают питательной средой и добавл ют 10 мл глицинового буфера, рН 9,5. Матрас с клетками помещают на 12 ч при 4 С, После этого взвесь клеток перенос т в пробирку и центрифугируют при
2000 об/мин в течение 10 мин. В качестве антигена используют надосадоч- ную жидкость. Провод т предварительн титрование антигена с эталонной сывороткой в присутствии комплемента. Титр антигена 1:32. Основную реакцию став т с разведением 1:16.
П р и м е р. 3. Культуру клеток штамма М-23 на уровне 27 пассажа готов т по способу, описанному в примере 1 .
Дл оценки антивирусного действи ацикловира используют концентрации 0,25-250 мкг/мл.
В пробирку с монослоем внос т по 0,1 МП неразведенного ЦМВ с титром 5 Ig , адсорбцию вируса осуществл ют в течение 1 ч, затем его удал ют, культуру промывают питательной средой и ввод т поддерживающую среду, содержащую ацикловир в указанных концентраци х.
Учет результатов провод т ежеднев но в течение 13 сут. Ингибирующее действие црепарата установлено с дозой 250 мкг/мл: специфическое поражение клеток в контроле отмечено на вторые сутки, с ацикловиром - на шее тые, В последующие дни цитопатически изменени нарастают и к тринадцатым суткам регистрируют поражение клеточного пласта, аналогичное контролю.
На основании полученных результа- тов допустим, что ацикловир обладает ограниченной способностью подавл ть репродукцию ЦМВ.
ПримерА. В культуральный сосуд с диплоидными клетками кожи и мышц эмбриона человека М-23 на уровне 21 пассажа ввод т 0,25%-Hbni раствор трипсина, подогретого до . Через 5-7 с раствор удал ют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 37 С на 2-3 мин.. Затем внос т небольшое количество питательной среды и энергичным встр хиванием заканчивают процесс отделени клеток от стекла. После этого в клеточную взвесь добавл ют среду роста - Игла MEM - с 10% СКРС - и разливают на два сосуда. Эти культуры двадцать второго пассажа инкубируют при в течение 3 сут до момента формировани плотного моносло .
Дл заражени , используют штамм ЦМВ-493 на уровне п тнадцатого пассажа с титром 4 Ig . На седьмые сутки 80-90% клеток подвергаютс специфической дегенерации, и титр ЦМВ равен 6 Ig ТЦЛ,-,/мл.
Пример 5. Культуру клеток штамма М-23 на уровне двенадцатого пассажа получают по способу, описанному в примере А, и заражают вирусом полиомиелита (штамм Сэбина, тип 1) из расчета 1 БОЕ на клетку. Культуру инкубируют при 34°С, Сбор вируса провод т на третьи сутки. Титр вирус в первичной культуре клеток почек африканских зеленых мартьш1ек равен 7,89 Ig БОЕ/МЛ.
П р и м е р 6, Культуру клеток штамма М-23 на уровне двенадцатого пассажа получают по способу, описанному в примере 1, и заражают вирусом полиомиелита (штамм Сэбина тип 11) по способу, описанному в примере 5. При этом титр вируса составл ет 7,7 Ig БОЕ/МЛ.
Пример 7. Культуру клеток штамма М-23 на уровне дев того пассажа получают по способу, описанному в примере, 1, и заражают вирусом полиомиелита (штамм Сэбика, тип III) по способу, описанному в примере 5, При этом титр вируса составл ет 7,96 Ig БОЕ/мЛо
Claims (1)
- Формула изобретениШтамм культивируемых клеток кожи и мьш1Ц эмбриона человека BQKK-Д NД-3 (15/2/7) дп изготовлени диагностических препаратов.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU884360224A SU1518370A1 (ru) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона человека дл изготовлени диагностических препаратов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU884360224A SU1518370A1 (ru) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона человека дл изготовлени диагностических препаратов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1518370A1 true SU1518370A1 (ru) | 1989-10-30 |
Family
ID=21348312
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU884360224A SU1518370A1 (ru) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона человека дл изготовлени диагностических препаратов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1518370A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4406072A1 (de) * | 1994-02-24 | 1995-08-31 | Univ Ludwigs Albert | Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten und so erhaltene Fibroblasten |
-
1988
- 1988-01-07 SU SU884360224A patent/SU1518370A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Авторское свидетельство СССР № 764391, кл. С 12 N 7/00, 1980. Авторское свидетельство СССР № 1317021, кл. С 12 N 5/00, 1987. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4406072A1 (de) * | 1994-02-24 | 1995-08-31 | Univ Ludwigs Albert | Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten und so erhaltene Fibroblasten |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100968141B1 (ko) | 세포 배양물에서 바이러스의 증식 방법 | |
Weller et al. | The etiologic agents of varicella and herpes zoster: Isolation, propagation, and cultural characteristics in vitro | |
Holmes et al. | On the role of the response of the cell membrane in determining virus virulence: Contrasting effects of the parainfluenza virus SV5 in two cell types | |
Rapp et al. | Synthesis of SV40 tumor antigen during replication of simian papovavirus (SV40) | |
Osborn et al. | Enhancement of infectivity of murine cytomegalovirus in vitro by centrifugal inoculation | |
US10329536B2 (en) | Methods for producing an active constituent of a pharmaceutical or a diagnostic agent in an MDCK cell suspension culture | |
Wong et al. | Changing viral susceptibility of a human cell line in continuous cultivation: I. Production of infective virus in a variant of the Chang conjunctival cell following infection with swine or N-WS influenza viruses | |
Plummer et al. | COMPARATIVE STUDIES OF TYPE'AND TYPE &" herpes simplex" viruses. | |
JP2011212020A (ja) | 細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製の方法、および本方法によって入手可能なインフルエンザウイルス | |
US3699222A (en) | Production of viral interfering substances | |
US3959466A (en) | Highly attenuated cytomegalovirus vaccine and production thereof | |
Yates et al. | Isolation and characterization of an avian adenovirus-associated virus | |
Pauli et al. | Increase of virus yields and releases of Borna disease virus from persistently infected cells | |
CN110093307A (zh) | 适应无血清悬浮培养的bhk-21-sc细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法 | |
JPS62115279A (ja) | ネコ鼻腔気管炎ウイルスの大量生産方法 | |
Underwood et al. | Studies on Measles Virus in Tissue Culture: I. Growth Rates in Various Cells and Development of a Plaque Assay | |
Vaheri et al. | Growth of rubella virus in BHK21 cells. I. Production, assay, and adaptation of virus. | |
Goldberg et al. | Susceptibility of differentiating muscle cells of the fetal mouse in culture to coxsackievirus A13 | |
CA1039651A (en) | Attenuation of cytomegalovirus | |
SU1518370A1 (ru) | Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона человека дл изготовлени диагностических препаратов | |
Frank et al. | Rhesus Leukocyte-associated Herpesvirus. I. Isolation and Characterization of a New Herpesvims Recovered from Rhesus Monkey Leukocytes | |
CN105121634A (zh) | 具有提高的病毒生产能力的细胞系及其生产方法 | |
Tannock et al. | Evaluation of chicken kidney and chicken embryo kidney cultures for the large-scale growth of attenuated influenza virus master strain A/Ann/Arbor/6/60-ca | |
US3143470A (en) | Rabies virus propagation in embryonic cells maintained in a medium containing pancreatic digest of casein | |
Noronha-Blob et al. | Viral interference-mediated selection of a plaque-type variant of influenza virus |