KR101814495B1 - 바이러스 검출용 키트 - Google Patents

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KR101814495B1
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김지혜
장은지
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Abstract

본 발명은 바이러스 검출용 키트, 바이러스검출용 조성물 및 바이러스 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 저가의 비용으로 바이러스 바이러스를 단시간 내에 고효율로 검출할 수 있다.

Description

바이러스 검출용 키트 {Kit for detecting virus}
본 발명은 바이러스 검출용 키트, 바이러스 검출방법 및 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.
바이러스는 세균보다 크기가 작은 전염성 병원체이다. 유전물질인 RNA 또는 DNA와 그 유전물질을 둘러싸고 있는 단백질로 구성된다. 바이러스는 숙주의 종류에 따라서 식물 바이러스, 동물 바이러스 및 세균 바이러스(파지)로 구분할 수 있다. 그러나, 대부분의 경우 핵산의 종류에 따라 DNA바이러스 아문과 RNA바이러스 아문으로 나뉘며, 이들은 다시 강, 목, 과로 세분화된다.
이러한 바이러스 중에서, 조류 인플루엔자는 닭, 오리, 또는 야생 조류에서 조류 인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus)의 감염으로 인해 발생하는 급성 바이러스성 전염병이며 드물게 사람에서도 감염증을 일으킨다. 조류 인플루엔자 바이러스는 병원성에 따라 고병원성, 저병원성 및 비병원성의 3 종류로 구분되며, 2003년 말부터 2008년 2월까지 사람에게 전염될 수도 있는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(highly pathogenic avian influenza A, H5N1)의 인체 감염 사례가 640건 이상 보고되었다. 조류 인플루엔자는 조류의 높은 폐사율과 산란율 저하로 막대한 경제적 피해를 야기하며, 인체 감염 가능성이 높은 것은 아니지만, 인체에 감염되는 경우 높은 사망률을 나타낸다. 근본적인 백신 개발이 어렵고, 확산 속도가 매우 빠르므로 조기 진단을 통해 질병의 확산 및 경제적 손실을 최소화하는 것이 필요하다.
이와 같은 바이러스의 진단 방법으로는 효소 결합 면역 흡수 검정법(ELISA), 효소 면역 검정법(EIA) 및 면역 형광 검정법(IFA) 등의 면역학적 검출방법과 RT-PCR에 의한 RNA 검출방법 등이 알려져 있으나, 이러한 방법은 바이러스 진단에 과도한 시간이 소요되거나, 고가의 검사 비용이 필요하거나, 비특이적 반응으로 인한 특이도 및 민감도가 저하되는 등의 문제가 있다.
따라서, 저비용으로 단시간 내에 효율적으로 바이러스를 검출하는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 특허출원 제2011-7017416호
본 발명은 단시간 내에 효율적으로 바이러스의 검출이 가능한 바이러스 검출용 키트, 바이러스의 검출방법 및 바이러스 검출용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자 및 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자 및 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 개체로부터 수득한 시료를 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자와 접촉시키는 단계 및 상기 생체 분자와 접촉된 시료를 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 접촉시키는 단계를 포함하는 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 저가의 비용으로 바이러스를 단 시간 내에 고효율로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 인플루엔자 바이러스 검출방법의 모식도를 보여주는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자(FluSome)의 형상을 관찰한 TEM 이미지를 보여주는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자의 평균 입경을 보여주는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자의 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 효과를 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자를 이용하여 다양한 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자를 이용하여 다양한 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 예에 따른 유무기 입자를 이용하여 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 예에 따른 유무기 입자를 이용한 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 10은 표면 증강 라만 산란 신호 측정을 통하여 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 11은 육안으로 색의 변화를 관찰함에 의하여 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 예에 따른 리포좀을 이용하여 인플루엔자 바이러스를 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스를 포함하여 모든 바이러스는 숙주 세포 침입을 위하여 숙주 세포에 결합하는 표면 단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA), 성숙한 비리온(virion)들이 숙주 세포로부터 빠져나오는 데에 관여하는 뉴라미니다아제(neuraminidase), 수소 이온 농도의 균형을 조절하는 M2 이온 채널, 바이러스의 유전 정보를 간직하고 있는 RNP(Ribonucleoprotein) 등으로 이루어져 있다.
본 발명자들은 위에서 기술한 바이러스의 공통된 특성에 기초하여, 바이러스를 조기에 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 연구하였다. 그 결과, 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자를 통하여 바이러스를 활성화하고, 이렇게 활성화된 바이러스와 반응하여 상기 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있는 프로브를 이용하여, 간단한 방법으로 바이러스를 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자; 및 상기 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서 사용한 용어 "바이러스"는 편성 세포 내 기생체(obligatory intracellular parasite)로서 핵산으로 DNA 또는 RNA을 갖고, 증식은 핵산으로 시작되고 2분열법으로 증식되지 않으며 ATP 생산에 필요한 효소계를 갖고 있지 않은 것을 의미한다. 본 발명의 바이러스는 노출 바이러스(naked virus)와 외막 바이러스(enveloped virus)를 포함하고, 구체적으로 본 발명의 일 예에 따른 바이러스는 외막 바이러스(enveloped virus) 일 수 있다.
상기 외막 바이러스는 구체적으로 헤르페스바이러스(herpesvirus), 폭스바이러스(poxvirus) 및 헤파드나바이러스(hepadnavirus)를 포함하는 DNA 바이러스와 플라비바이러스(flavivirus), 토가바이러스(togavirus), 코로나바이러스(coronavirus), 헤파티티스 D(hepatitis D), 오소믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 랍도바이러스(rhabdovirus), 분야바이러스(bunyavirus), 필로바이러스(filovirus) 및 레트로바이러스(retrovirus)를 포함하는 RNA 바이러스에 속하는 것이면 모두 포함한다.
상기 오소믹소바이러스는 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 이사바이러스(isavirus), 소고토바이러스(thogotovirus) 및 퀴아란자바이러스(quaranjavirus) 속에 포함되는 모든 바이러스를 포함한다.
상기 코로나바이러스는 알파코로나바이러스(alphacoronavirus), 베타코로나바이러스(betacoronavirus), 감마코로나바이러스(gammacoronavirus) 및 델타코로나바이러스(deltacoronavirus) 속에 포함되는 모든 바이러스를 포함한다.
상기 파라믹소바이러스는 파라믹소바이러스, 루불라바이러스, 모빌리바이러스 및 뉴모바이러스 속에 포함되는 모든 바이러스를 포함한다.
상기 바이러스는 핵산과 이를 둘러싸고 있는 단백질을 포함한다. 이와 같은 바이러스의 단백질은 바이러스 유전체를 보호하고, 바이러스 입자가 세포에 흡착 및/또는 융합하는데 관여하며, 바이러스의 항원성을 결정하고, 바이러스의 형태를 유지하는 구조 단백질(structural protein)과 단백질과 핵산 등을 합성하는데 관련되는 단백질인 비구조 단백질(non-structural protein)을 포함한다.
본 발명에서 사용한 용어 "바이러스의 표면 단백질"은 상기 구조 단백질을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 "표면 단백질"은 바이러스의 특이 항원성을 가지고, 바이러스가 세포에 흡착 및/또는 융합하는데 관여하는 외막(envelop)에 존재하는 외재성 단백질은 모두 포함한다. 일 예로, 본 발명의 바이러스는 당단백질(glycoprotein)일 수 있고, 세포에의 융합(fusion)에 관여하는 융합 단백질(fusion protein)일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면 상기 바이러스의 표면 단백질은 헤마글루티닌(HA), 스파이크 단백질(spike protein) 또는 F 단백질(F protein) 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 숙주세포의 세포막에 흡착하여 막융합을 일으키는 표면 단백질을 포함하는 것 일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 바이러스는 비활성형 상태로 존재하는 표면 단백질이 생체 분자에 의하여 활성형으로 변하면, 숙주세포의 세포막과 흡착 및/또는 막융합을 일으키는 성질을 갖는 표면 단백질을 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, "바이러스"는 인플루엔자 바이러스 또는 고병원성 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 "바이러스의 표면 단백질"로 당단백질인 헤마글루티닌(HA)을 포함한다. 헤마글루티닌은 하나의 폴리펩티드(전구체 HA0)로 발현된 후, 단백질 가수분해에 의하여 HAO의 절단 부위(cleavage site)가 HA1 및 HA2로 나누어지면, 산성 조건 하에서 소수성 아미노산 잔기들로 구성된 융합 펩타이드(fusion peptide)가 활성화된다. HA는 인플루엔자 바이러스의 병원성 정도에 따라 절단 부위의 아미노산과 융합 펩타이드의 아미노산 구성이 다르다.
본 발명의 다른 일 예에 따르면, "바이러스"는 코로나 바이러스 일 수 있다. 코로나 바이러스는 표면 단백질로 스파이크 단백질(spike protein)을 포함하고, 상기 스파이크 단백질은 S1과 S2 부위를 포함한다. 스파이크 단백질의 S1 부위가 숙주세포에 결합하면, 단백질 분해 효소(protease)에 의하여 S1과 S2로 절단되고, S2의 끝 부분에 있는 소수성 부위가 노출되어 활성화 된다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, "바이러스"는 파라믹소 바이러스 일 수 있다. 파라믹소 바이러스는 표면 단백질로 HN 단백질(HN protein)을 포함한다. HN 단백질은 바이러스를 숙주세포에 부착 또는 흡착시키는 부착(또는 흡착) 단백질로, 바이러스 비활성 상태에서는 전구체(precursor) HN0로 존재하나, 가수분해에 의하여 C-말단에서 아미노산 잔기가 제거되면 활성화 된다. 또한, 파라믹소 바이러스는 표면 단백질로 F 단백질(F protein)을 포함한다. F 단백질은 바이러스 비활성 상태에서 전구체 F0로 존재하나 생체분자에 의하여 F1과 F2로 절단된 후, 새로운 N-말단 형태의 F1으로 활성화 된다. 상기 F 단백질은 절단부위에 다염기성 잔기를 갖는 것과 단일염기성 잔기를 갖는 것으로 모두 포함한다. 바람직하게는 다염기성 잔기를 갖는 F 단백질 일 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "반응"은 어떤 물질이 다른 물질과 접촉하여 상태, 색, 형상 또는 화학 결합 등의 물리 및/또는 화학적 상태의 변화가 일어나는 것 또는 그 현상을 의미한다.
일 구체 예에서 바이러스의 표면 단백질이 생체 분자와 반응하는 경우 바이러스의 표면 단백질이 변화되어 융합 펩타이드 등을 형성하는 등의 활성화된 바이러스로 상태 변화가 일어난다. 다른 구체 예에서 활성화된 바이러스와 프로브의 반응은 융합반응 또는 응집반응 일 수 있다.
상기 융합반응은 한 구체예에 따라, 활성형 바이러스와 본 발명의 프로브의 일부가 결합되는 현상 일 수 있다. 융합반응은 융합에 의하여 프로브 내부의 물질 등이 밖으로 배출되는 현상까지 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 일 예로, 활성형 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 융합 펩타이드가 엔도좀의 세포막을 융합하는 원리를 이용하여, 활성형 바이러스와 프로브의 융합 여부를 확인함으로써 활성형 바이러스를 검출할 수 있다.
상기 응집반응은 용액 안에서 분자 또는 입자 등이 서로 달라붙어 뭉치는 현상을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 응집반응은 검출대상인 바이러스에 의하여 본 발명의 프로브의 안정성이 낮아져 프로브끼리 서로 뭉쳐서 응집 및/또는 침전되는 현상을 의미한다.
본 발명에서 사용한 용어, "생체 분자(biomolecule)"는 생물의 구조, 기능, 정보전달 등에 필요한 분자를 의미한다. 상기 생체 분자는 기능, 정보전달 등을 수행하기 위한 특이적 구조 및/또는 부위를 포함할 수 있다. 이러한 생체 분자의 특이적 구조는 분자간 결합 반응을 통하여 반응을 일으키는 원동력이다. 생체 분자는 아미노산과 단백질, 당과 탄수화물, 지방산과 지질, 및 뉴클레오티드와 핵산 등을 포함하고, 생체 내에서 만들어진 것 및/또는 인위적으로 합성된 것을 모두 포함한다. 본 발명의 일 예에 따르면, "생체 분자"는 약 62개 내지 2500개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질인 효소일 수 있다.
하나의 구체 예에서, 상기 효소는 단백질 분해 효소일 수 있다. 일 예로 최초 합성된 형태로는 비활성화되어 있으나, 특정 부위가 제거(또는 절단)되면 활성을 나타내는 단백질에서 단백질 분해 효소는 상기 특정 부위를 절단(cleave)하여 비활성화 단백질을 활성화시킨다. 단백질 분해 효소는 특정 부위를 절단할 수 있는 것이면 종류에 제한 없이 사용할 수 있다.
일 구체예에서 단백질 분해 효소는 퓨린(furin), 트립신(trypsin), 세린(serine), 엔도프로테아제(endoprotease) 및 카복시펩티다아제(carboxypeptidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 단백질 분해 효소는 유도체 또는 개질 된 형태를 모두 포함한다. 예를 들어, 단백질 분해 효소는 재조합 인간 퓨린, 재조합 마우스 퓨린, 트립신-EDTA, 아세틸화된 트립신, TPCK-트립신(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone-trypsin), 아크릴릭 트립신(Trypsin-acrylic), 퓨린형 프로테아제(Furin like protease), 켁스2 프로테아제(Kex2 proteases), 막통과 세린 프로테아제 (Transmembrane protease serine), TMPRSS2, TMPRSS4, 트립타아제 클라라(Tryptase clara), 플라즈민(plasmin), 세린계 프로테아제(serine protease), 서브틸리신형 엔도프로테아제(subtilisin like endoprotease), 카복시펩티다아제(carboxypeptidase) 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 구체예에서 트립신이 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA)과 반응하는 경우, 트립신의 효소 분해 작용은 His57-Asp102-Ser195 위치에서 일어나며, 퓨린의 효소 분해 작용은 His194-Asp153-Ser368 위치에서 일어난다. 트립신은 고병원성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 모두 분해할 수 있기 때문에, 트립신을 이용하여 고/저병원성 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있다. 또한, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌만을 분해할 수 있기 때문에, 퓨린을 이용하여 고병원성 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있다.
다른, 일 구체예에서 단백질 분해효소와 코로나 바이러스의 표면 단백질이 반응하는 경우, 가수분해 효소의 작용은 S1 과 S2의 부위의 경계에서 일어난다. 따라서, 상기 가수분해 효소의 작용에 의하여 절단 후 S2의 소수성 부위가 노출됨에 따라 코로나 바이러스가 활성화 되어, 본 발명의 프로브를 이용하여 검출할 수 있다.
또 다른 일 구체예에서, 파라믹소 바이러스의 표면 단백질과 반응하는 생체분자는 C-말단(Carboxyl side)의 아르기닌 잔기에서 절단이 가능한 단백질 분해효소 또는 카르복시펩티다아제(carboxylpeptidase) 일 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 R-X-K/R-R 배열 포함하는 F 단백질을 인식하여 절단할 수 있다. 구체적인 예로, 퓨린 또는 서브틸리신형 엔도프로테아제(subtilisin-like endoprotease) 일 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "활성형 바이러스" 또는 "활성화된 바이러스"는 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자에 의하여 바이러스의 표면 단백질이 활성화된 바이러스를 의미한다. 여기서 바이러스의 표면 단백질이 활성화되었다는 것은 바이러스의 표면 단백질이 숙주세포 및/또는 프로브와 반응, 예를 들어 특이적으로 반응할 수 있는 상태로 변화되었다는 것을 의미한다. 여기서 "바이러스의 활성화"는 비활성형 바이러스가 상기 활성형 바이러스로 변환되는 과정을 의미한다. 바이러스가 감염을 일으키기 위해서는 바이러스의 활성화 과정이 필수적으로 요구되므로, 상기 활성형 바이러스의 존재 여부를 검출함으로써, 바이러스에 의한 감염 여부를 판별할 수 있다.
하나의 구체 예에서, 바이러스 표면 단백질이 활성화된 것이란 바이러스의 표면단백질에 존재하는 융합단백질 또는 융합펩타이드가 숙주세포의 막 또는 본 발명의 프로브의 표면과 융합 반응을 일으킬 수 있는 상태임을 의미한다.
하나의 구체 예에서, 인플루엔자 바이러스의 경우, 활성화된 바이러스란 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA)이 효소에 의해 분해되어, 비활성 형태에서 헤마글루티닌의 내부에 존재하는 융합 펩타이드가 노출된 형태로 변환된 것을 의미한다. 즉, 상기 HA의 절단 부위를 특이적으로 분해하는 효소에는 퓨린 및/또는 트립신이 포함된다. 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌만을 분해할 수 있기 때문에, 인플루엔자 바이러스의 HA가 퓨린에 의하여 분해되는 경우 상기 인플루엔자 바이러스는 고병원성을 나타낸다. 또한, 트립신은 고병원성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 모두 분해할 수 있기 때문에, 트립신에 의하여 분해되는 경우에는 고병원성 또는 저병원성을 나타내게 된다. 저병원성 인플루엔자 바이러스의 절단 부위는 C-말단이 -R-로 이루어지며, 고병원성 인플루엔자 바이러스의 절단 부위는 R/K-R-K-K-R로 이루어진다.
HA의 절단 부위를 특이적으로 분해하는 효소에 의하여 HA가 활성화되면, HA의 재배열이 일어나 HA 내의 융합 펩타이드가 바깥쪽으로 노출되어 활성형 바이러스가 된다. 이와 같이, 산성 조건 하에서 활성화된 인플루엔자 바이러스가 본 발명의 일 예에 따른 프로브와 만나면, 인플루엔자 바이러스의 융합 펩타이드에 의하여 인플루엔자 바이러스와 프로브의 반응이 일어나게 된다. 프로브의 반응에 따라 변하는 신호를 측정함으로써 바이러스 감염 여부를 검출할 수 있다.
다른 구체 예에서, 코로나 바이러스의 경우 활성화된 바이러스란 표면 단백질인 스파이크 단백질(S protein)이 생체분자에 의해 비활성 형태에서 스파이크 단백질의 내부에 존재하던 소수성 부위가 노출된 형태로 변환된 것을 의미한다. 구체적으로, 스파이크 단백질의 S1 부분이 숙주세포와 결합하면, 단백질 분해효소(protease)에 의하여 S1과 S2로 절단되고, S2의 끝 부분에 있는 소수성 부위가 노출되어 바이러스가 활성화 된다. 상기 S2에서 노출된 소수성 부위가 숙주세포의 세포막 내 소수성 영역에 부착되고, 다른 한쪽은 바이러스 외막과 결합된 상태에서 S2 부위의 가운데가 접히는 구조변형(conformation change)이 일어나면서 막 융합이 일어 나게 된다. 따라서, 본 발명의 프로브와 활성화된 코로나 바이러스가 만나면 반응하면, 프로브의 안정성에 변화가 일어나 다양한 신호를 발생되고, 상기 변화를 측정함으로써 바이러스 감염 여부를 검출할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 파라믹소바이러스에서 활성화된 바이러스란 HN 단백질이 생체분자에 의하여 C-말단의 잔기가 제거된 상태를 의미한다. 구체적으로, HN 단백질은 불활성화 상태(HN0)를 유지하고 있다가 C-말단의 약 90개의 잔기가 제거되면, HN 단백질이 활성화 되어 숙주세포 또는 표적의 막에 파라믹소바이러스가 부착하게 된다. 또한, 활성형 파라믹소바이러스는 F 단백질이 생체분자에 의하여 F1과 F2로 절단된 상태를 의미한다. 비활성형 파라믹소바이러스에서 F 단백질은 전구체 F0 상태에서, 생체분자와 만나면 F1과 F2로 절단되고, 숙주세포의 세포막과 융합할 수 있는 활성형 바이러스가 된다. 즉, SS-결합쇄 F1과 F2를 함유하는 활성 표면 단백질을 형성하고, 광범위한 소수성을 나타내는 F1의 N-말단 잔기를 숙주세포의 세포막 또는 타겟의 세포막에 고정하면서 막 융합이 시작된다. 따라서, 파라믹소바이러스는 본 발명의 생체분자가 표면 단백질과 반응하여 활성화 되고, 다시 활성화된 바이러스가 본 발명의 프로브와 반응하여, 프로브의 변화를 일으키게 된다. 따라서 상기 변화를 측정함으로써 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명에서, "프로브"는 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하여, 상기 바이러스 또는 활성형 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브는 바이러스 이외의 물질 또는 비활성형 바이러스와 비교하여 활성형 바이러스와의 반응 능력이 월등히 우수하거나, 활성형 바이러스와 특이적으로 반응하여, 활성형 바이러스의 존재 여부를 유의하게 검출할 수 있는 물질이면 모두 포함되고, 그 종류 및 형태는 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 상기 프로브는 "검출인자"와 혼용하여 사용된다.
본 발명의 프로브는 검출 대상 바이러스 또는 바이러스의 표면 단백질의 종류에 따라 다양한 구조 또는 형태를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 프로브는 막(membrane) 구조를 가질 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "막(membrane) 구조"란 막 또는 쉘(shell)에 의하여 내부가 둘러싸여 있는 구조를 의미한다. 베지클(vesicel), 인공세포(artificial cell) 또는 마이크로캡슐 같은 캡슐 형태의 입자(encapsulation particle)는 그 종류를 제한하지 않고 모두 포함한다. 본 명세서에서 상기 막 구조는 쉘(shell) 구조와 혼용하여 사용한다. 상기 막 구조는 상기 내부에는 유체 또는 별도의 구성을 포함하는 구조까지 포함한다.
상기 막(membrane)은 단일층(mono layer) 또는 이중층(bilayer) 구조를 포함한다. 상기 단일층(mono layer)은 "소수성 영역-친수성 영역"을 포함하는 막 구조로, 일 구체예로 수용성 용액 내에서 소수성 코어와 친수성 쉘을 포함하는 구조일 수 있다. 상기 이중층(bilayer)은 "친수성 영역-소수성 영역-소수성 영역-친수성 영역"을 포함하는 막 구조이다. 일 구체예로, 상기 이중층(bilayer)은 상기 단일층(mono layer) 2 개가 결합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 이중층(bilayer)은 친수성 코어와 상기 친수성 코어를 둘러싸고 있는 소수성 영역 및 상기 소수성 영역을 둘러싸고 있는 친수성 쉘을 포함하는 구조일 수 있다.
상기 막(membrane) 구조는 단일막(single membrane)및 단일막을 2 이상 있는 다중막(multi membrane)을 모두 포함한다. 일 예로, 단일막을 갖는 입자가 다시 하나의 단일막으로 둘러싸인 경우, 다중막을 갖는 입자가 될 수 있다. 상기 단일막 및 다중막은 단일층 및 이중층과 구별되는 개념이다. 구체적으로, 이중층(bilayer) 구조의 막을 하나만 포함하는 입자는 단일막을 갖는 것이며, 단일층(monolayer) 구조의 막을 포함하는 입자를 다시 단일층 구조의 막이 둘러싸고 있는 입자는 다중막 구조의 입자를 의미한다.
상기 막 구조를 갖는 프로브는 본 발명이 속하는 통상의 방법에 의하여 제조될 수 있고, 일 구체예에 따라 미세용액화 장비를 이용한 미세유동화 방법(microfludization), 초고압 균질법(High-pressure homogenization), 에멀전법(Emulsion method) 또는 초음파 등을 이용하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 막구조를 갖는 입자는 그 종류에 제한되지 모두 본 발명의 프로브에 포함될 수 있다. 일 구체예로 베지클(vesicle), 마이셀(micelle), 폴리머좀(polymersome), 콜로이드좀(colloidsome), 베지클(vesicle), 리포좀(liposome), 액적(droplet) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하나, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
상기 "마이셀(micelle) "은 소수성 코어와 친수성 쉘을 갖는 입자를 의미한다. 한 구체예에서, 상기 마이셀은 계면활성제의 마이셀 또는 고분자 자기조립 마이셀 일 수 있다. 자기조립에 의한 마이셀의 경우 공중합체를 형성하는 고분자의 종류에 따라 다양한 형태를 띌 수 있고, 그 형태에 제한을 받는 것은 아니다. 상기 마이셀은 단일층(monolayer)을 2 이상 포함하는 다중막 형태도 포함한다. 상기 마이셀은 그 형태의 제한은 없으나, 일 예에 따라 구형, 타원형(ellipsoid) 또는 실리더형(cylinder)을 포함한다. 상기 마이셀 구조의 프로브는 소수성 코어 영역에 표지자 및 무기 입자와 같은 구성을 더 포함할 수 있다.
상기 "폴리머좀(polymersome)"은 "친수성 영역-소수성 영역-소수성 영역-친수성 영역"을 갖는 2중층 막 구조를 갖고, 상기 소수성 및 친수성 영역에 고분자 또는 공중합체를 포함하는 입자를 의미한다. 상기 고분자 또는 공중합체는 인위적으로 합성된 것과 지질(lipid)을 함께 포함하거나, 인위적으로 합성된 것 포함하는 것 일 수 있다. 상기 인위적으로 합성된 것은 자연적으로 발생하는 지질(lipid)을 제외한 모든 고분자 및 공중합체를 포함하는 의미이다. 상기 폴리머좀은 이중층 막구조의 단일막 및 단일막을 2이상 포함하는 다중막을 모두 포함한다.
상기 폴리머좀은 리포좀과 구분하여 인위적으로 합성된 고분자 또는 공중합체를 포함할 수 있다. 상기 폴리머좀은 이중층 형태의 막으로만 이루어진 단일막 및 상기 2중층의 단일막을 2 이상 포함하는 다중막 형태도 포함한다.
상기 "리포좀(liposome)"은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 입자를 의미한다. 양친매성의 생체막을 모방한 지질막을 갖는 것이라면, 단일막 및 다중막을 모두 포함한다. 리포좀을 형성하는 방법은 당업계에 잘 알려져있고, 통상적으로 인지질을 염류 수용액 중에 현탁하거나, 인지질을 포함하는 수용액을 초음파 처리 등을 하여 수득할 수 있으나, 제조방법에 의하여 본 발명이 제한되지 않는다.
상기 "콜로이드좀"은 1nm 내지 1000nm 크기의 콜로이드상 입자 또는 상기 입차가 치밀하게 패킹된 구조물을 의미한다. 막을 형성하는 친수성 및 소수성 영역의 고분자의 종류에 따라서 단일층 및 이중층을 포함할 수 있다. 또한 단일막 및 다중막을 모두 포함한다.
상기 "액적(droplet)"은 상기 막 구조 입자 중에서 물방울 모양의 형태를 나타내는 것을 의미한다. 단일층 및 이중층을 포함하고, 단일막 및 다중막을 모두 포함한다.
본 발명의 프로브는 형태(shape)에 따라서 구분할 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 프로브의 형태(shape)는 로드(rod), 구, 링(ring), 판(flat), 실린더, 타원형, 막으로 둘러싸인 형태 및 이들의 조합을 포함한다.
상기 로드(rod)형태는 막대, 봉 또는 장대와 같은 일직선 모양의 형태를 총칭하는 의미이다. 상기 구 형태는 둥근 모양의 형태를 의미하는 것으로, 완전 구형과 불완전 구형을 모두 포함한다. 상기 링(ring) 형태는 일반적으로 구 또는 원형의 모양에서 가운데가 비어있는 형태를 의미한다. 상기 판(flat) 형태는 얇고 평평한 모양의 평판, 판상의 형태를 의미한다. 일 구체예에 따라, 판 형태의 프로브는 기재 또는 담체의 상부 또는 외부에 판 형의 프로브가 코팅 된 형태 일 수 있다.
본 발명의 프로브는 상기 프로브를 구성하는 성분 또는 활성형 바이러스와 반응하는 방법에 따라서 구분할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 프로브는 표지자를 포함하는 양친성 입자; 유무기 입자; 항체; 압타머; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것; 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따르면, "표지자를 포함하는 양친성 입자"는 상기 프로브와 활성형 바이러스의 반응여부를 판별할 수 있는 표지자를 내부에 포함하는 양친성 프로브일 수 있다. 양친성 이란 양친매성이라고도 하며, 친수성과 소수성의 성질을 모두 가진 것을 의미한다. 상기 양친성 프로브의 형태는 양친성을 나타내기만 하면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 "표지자"는 프로브와 활성형 바이러스의 반응여부를 판별할 수 있는 물질을 의미한다. 표지자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 프로브의 반응 전 후의 변화에 따라 특성이 변화하고, 시험 등을 통하여 상기 변화된 특성을 확인할 수 있는 표지자이면 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 프로브의 융합 여부를 판별할 수 있는 표지자는 자기-소광된 염료(sel-quenched dye), 형광 염료(dye), 전기화학발광 물질 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.
본 발명에서, 자기-소광된 염료는 염료(sel-quenched dye)가 서로 인접한 위치에 있는 경우에는 소광 작용이 일어나고, 뭉쳐있는 염료가 방출되어 퍼지게 되면 탈소광 작용에 의하여 형광이 나타나는 물질을 의미한다.
한 구체예에서, 자기-소광된 염료는 3,3-디옥타데실옥사카보시아닌 퍼클로레이트(3,3 -Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorate; Dio; Dioc), 3,3-디옥타데실-5,5-디(4-설포페닐)옥사카보시아닌 소듐염(3,3 -dioctadecyl-5,5 -di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine sodium salt), 4-(4-(디헥사데실아미노)스티릴)-N-메틸피리디늄 이오다이드(4-(4-(dihexadecylamino)styryl)-N-methylpyridinium iodide; DiA; 4-Di-16-ASP), 4-(4-(디데실아미노)스티릴)-N-메틸피리디늄 이오다이드(4-(4-(Didecylamino)Styryl)-N-Methylpyridinium Iodide; 4-Di-10-ASP), 1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도카보시아닌 퍼클로레이트(1,1 -dioctadecyl-3,3,3,3 -tetramethylindocarbocyanine perchlorate; Dil), 1,1-디옥타데실-6,6-디(4-설포페닐)-3,3,3,3-테트라메틸인도카보시아닌 (1,1 -Dioctadecyl-6,6 -Di(4-Sulfophenyl)-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine), 4,4-디이소티오시아나토스틸벤-2,2-디설폰산 디소듐염(4,4 -diisothiocyanatostilbene-2,2 -disulfonicacid disodium salt; DIDS), 1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도트리카보시아닌 이오다이드(1,1 -dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyanine iodide; DiR), 1,1-디올레일-3,3,3,3-테트라메틸인도카보시아닌(1,1 -dioleyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine), 플루오레신 (fluorescein), 보디피 (BODYPY), 테트라메틸로다민 (Trtramethylrhodamine), 옥타데실 로다민 B 클로라이드(R18), 알렉사 (Alexa), 시아닌 (Cyanine) 및 알로피코시아닌 (allopicocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 형광 염료의 평균 입경은 200nm 이하, 또는 50nm 내지 10000nm일 수 있다.
한 구체예에서, 전기화학발광 물질은, 이에 제한되는 것은 아니나, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄 (II) [Ru(bpy)32+]을 포함한다.
본 발명에서 형광 염료(dye)는 형광을 나타내는 물질로, 광에 포함된 파장을 흡수하여 색광을 바꾸어 재방사하는 성질을 갖는 물질을 의미한다. 형광 염료는 발광염료 라고도 하며, 당업계에 잘 알려져 있는 형광 염료를 제한없이 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 형광 염료는 텍사스 레드(Texas red),플루오레세인(fluorescein), 4-클로로-7-니트로벤조퓨라잔(4-chloro-7-nitrobenzofurazan; NBD-Cl), 루미놀(luminol), 플러렌(fullerene) 및 방향족기를 포함하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
한 구체예에서, 인광 염료는 조명광 안에서 흡수한 파장을 바꾸어 재방사함으로써 광휘성 효과를 나타내는 물질을 의미한다. 일 예로, 황화광물(XmZn X는 금속원소, Z는 비금속원소) 또는 알칼리토금속의 황화물 일 수 있으나, 그 종류에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 양친성 입자는 친수성을 나타내는 영역과 소수성을 나타내는 영역을 갖는 입자를 의미한다. 양친성 입자는 친수성 영역 및 소수성 영역이 있는 입자이기만 하면 제한 없이 이용 가능하다. 양친성 입자는 친수성 고분자, 소수성 고분자, 지질 고분자 및 이들의 조합을 포함한다. 상기 고분자는 공중합체 형태로 포함될 수 있다.
한 구체예에서, 친수성 고분자는 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴리아크릴릭애시드(PAA), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아세테이트(PVAc), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 친수성 폴리아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상 및 그 유도체를 포함한다. 예를 들어, 친수성 고분자는 (모노)메톡시폴리에틸렌글리콜, (모노)아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글루타민, 폴리글루탐산, 폴리트레오닌, 폴리아스파라긴, 폴리아르기닌 및 폴리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 친수성 고분자는 그 유도체를 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리에킬렌글리콜의 유도체는 메톡시 폴리에틸렌글리콜(mPEG)일 수 있다.
한 구체예에서, 소수성 고분자는 친수성 고분자와 함께 양친성 입자를 형성할 수 있는 물질이면 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 소수성 고분자는 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 소수성 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상 일 수 있다. 상기 폴리아미노산은 폴리루신, 폴리이소루신, 폴리발린, 폴리페닐알라닌, 폴리프롤린, 폴리글리신, 폴리트립토판, 폴리알라닌, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 및 폴리메티오닌으로 이루어진 군에서 하나 이상을 포함한다. 또한 상기 소수성 고분자는 그 유도체를 포함한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "지질" 또는 "지질 고분자"는 이중층의 막 구조를 형성할 수 있는 것이라면 인지질, 지질단백질, 당지질, 양이온성 지질 등을 모두 포함하며, 그 종류에 제한되지 않는다. 또한, 상기 지질은 자연적으로 유도되어 얻어진 것 및 합성된 지질 유도체를 모두 포함한다. 상기 인지질(phospholipids)은 글리세로인지질(glycerophos pholipids) 및 스핑고인지질(spingophospholipid, Phosphosphingolipid)을 포함한다. 상기 글리세로인지질은 다이아크릴글리세라이드 구조를 갖는 것일 수 있고, 구체적으로 포스파티산(phosphatidate, Phosphatidic acid, PA), 레시틴(lecithin, Phosphatidylcholine, PC), 세팔린(cephalin) 및 포스포이노시티드류(Phosphoinositides)를 포함한다. 상기 세팔린 인지질은 포스파티딜세린(Phosphatidylserine, PS) 및 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE)을 포함한다. 또한, 상기 포스포이노시티드류 인지질은 포스파티딜이노시톨(Phosphatidylinositol, PI), 포스파티딜이노시톨 포스페이트(Phosphatidylinositol phosphate, PIP), 포스파티딜이노시톨 이인산(Phosphatidylinositol bisphosphate, PIP2) 및 포스파티딜이노시톨 삼인산(Phosphatidylinositol triphosphate, PIP3)을 포함한다. 상기 스핑고인지질은 세라마이드 포스포리콜린(Ceramide phosphorylcholine, Sphingomyelin, SPH), 세라마이드 포스포리레타노라민(Ceramide phosphorylethanolamine, Sphingomyelin, Cer-PE) 및 세라마이드 포스포리피드(Ceramide phosphoryllipid)를 포함한다.
상기 합성 인지질 유도체는 그 종류에 제한되는 것은 아니나, 일 구체예로 1,2-다이도데카노이-sn-글리세로-3-포스포콜린(EPC, 1,2-didodecanoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에타놀라민(POPE, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(POPS, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자는 공지된 방법을 자유롭게 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 친수성 영역과 소수성 영역을 포함하는 양친성 블록 공중합체를 수용액에 분산시킨 뒤 초음파를 가하는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해 시킨 뒤 과량의 물로 유기용매를 추출 또는 증발시키는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 투석하는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 균질기 또는 고압유화기를 이용하여 강하게 용매를 증발시키는 방법, 또는 얇은 필름 수화법(Thin film hydration) 등을 사용하여 제조할 수 있다.
상기 양친성 입자에 사용되는 고분자의 종류, 제조방법에 의하여 다양한 구조 및 형태를 갖는 프로브가 형성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 양친성 입자는 막 구조를 가진 입자일 수 있고, 구체적으로 마이셀(micelle), 폴리머좀(polymersome), 콜로이드좀(colloidsome), 베지클(vesicle), 리포좀(liposome), 액적(droplet), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 구조 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 양친성 입자가 하기 식 1에 따라 계산된 질량 분율(mass fraction)이 0.25 내지 0.40을 만족할 때, 양친성 입자는 폴리머좀 형태를 나타내고, 질량 분율이 0.40 초과 0.70 이하일 때 양친성 입자는 마이셀 구조를 나타낸다.
[식 1]
질량 분율(mass fraction)=친수성 고분자의 질량/(친수성 고분자의 질량 + 소수성 고분자의 질량)
또한, 상기 질량 분율을 질량 %(percent)로 나타내는 경우, 질량%가 25% 내지 40%을 만족할 때, 양친성 입자는 폴리머좀 형태를 나타내고, 질량%가 40% 초과 70% 이하일 때 양친성 입자는 마이셀 구조를 나타낸다.
한 구체예에서, 양친성 입자의 크기는 제한되지 않는다. 양친성 입자는 나노 또는 마이크로 입자일 수 있으며, 예를 들어 양친성 입자의 평균 입경은 50 내지 10000 nm일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예에 따르면, 프로브는 "유무기 입자"일 수 있다.
상기 유무기 입자 프로브의 경우, 활성형 바이러스 또는 활성화된 표면 단백질과 프로브의 반응에 의하여 상기 프로브의 용액 내 안정성이 낮아져 응집이 일어나게 된다. 따라서 상기 반응의 유무에 따라서 본 발명의 유무기 입자 프로브를 이용하여 바이러스를 검출 할 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "유무기 입자"는 유기물질과 무기물질을 포함하는 입자를 의미한다. 구체적으로, 무기물질로 이루어진 코어의 표면(또는 쉘)에 유기물질이 코팅 또는 결합되어 있는 형태의 입자일 수 있다. 상기 유무기 입자의 형태는 제안되지 않고, 한 구체예에 따라 로드(rod)형, 구형, 실린더형, 판(flat)형, 타원형 또는 링 형 등의 형태 일 수 있다.
상기 무기물질은 금속으로 이루어진 것일 수 있고, 상기 금속은 일 예로 금, 은, 이들을 포함하는 혼합물 및 그 조합일 수 있다. 바람직하게는 금, 은 및 이들의 조합 일 수 있다.
상기 유기물질은 무기물질의 안정화제 일 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 안정화제는 입자의 응집을 방지하기 위한 물질을 의미하며, 분산제와 혼용하여 사용된다. 상기 안정화제는 바람직하게는 금속의 안정화제 일 수 있다. 상기 안정화제는 무기물질이 용매 내에서 잘 분산된 상태로 유지되도록 하는 것이면 그 종류에 상관없이 포함되고, 일 예로, 계면활성제(surfactant) 일 수 있다.
상기 계면활성제의 구체적인 예에 제한되지 않고, 양이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 모두 포함한다. 구체적으로 세틸 트라이메틸암모늄 브로마이드(Cetyl trimethylammonium bromide, CTAB, Hexadecyltrimethylammonium bromide), 테트라데실 트라이메틸암모늄 브로마이드(Tetradecyl Trimethyl Ammonium Bromide, TTAB), 도데실트라이메틸암모늄 브로마이드(dodecyltrimethylammonium bromide, DTAB), Tween 20(polyoxyethylene(20) sorbitan monolaurate), Tween 40(polyoxyethylene(20) sorbitan monopalmitate), Tween 80(polyoxyethylene(20) sorbitan monooleate) 및 Triton X-100로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 유무기 입자는 양친성 고분자를 더 포함할 수 있다. 상기 양친성 고분자는 유무기 입자의 표면에 양친성 고분자가 결합된 상태이거나, 양친성 고분자 층 또는 양친성 고분자 쉘(shell) 구조로 코팅된 상태 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 양친성 고분자를 더 포함하는 유무기 입자는 양친성 고분자와 유무기 입자의 표면 사이에 작용기층을 더 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 작용기 층은 무기입자의 표면에 결합이 잘되는 작용기를 갖는 화합물을 결합시키고, 상기 화합물에 고분자층을 결합하는 구조일 수 있다.
상기 작용기를 갖는 화합물은 무기입자 표면에 -SH 결합이 가능한 것이면 모두 사용할 수 있고, 일 예로 시스테아민(cysteamine)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 무기입자가 금인 경우, 금 입자의 표면에 SH 결합이 가능한 화합물을 결합하여 작용기층을 형성하고, 상기 작용기 와 양친성 고분자를 결합하는 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 상기 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자는 작용기층과 양친성 고분자의 결합 사이에 아미노산 중합을 개시하기 위한 작용기를 더 포함할 수 있다. 상기 작용기는 NH2 일 수 있다.
상기 양친성 고분자는 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 타입의 양친성 블록 공중합체 또는 B-A-B 타입의 삼중 블록 공중합체 형태일 수 있다. 또한 상기 양친성 고분자는 지질 일 수 있다.
한 구체예에서, 친수성 A 블록은 친수성 고분자로 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알콜(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴릭애시드(PAA), 폴리아클릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아세테이트(PVAc), 친수성 폴리아미노산 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌글리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리글루타민, 폴리글루탐산, 폴리트레오닌, 폴리아스파라긴, 폴리아르기닌 및 폴리세린 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 친수성 A 블록은 200 내지 50,000 달톤 또는 1,000 내지 20,000 달톤의 수 평균 분자량을 갖는다.
한 구체예에서, 소수성 B 블록은 소수성 고분자 일 수 있다. 구체적으로 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 소수성 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는, 소수성 B 블록은 폴리루신, 폴리이소루신, 폴리발린, 폴리페닐알라닌, 폴리프롤린, 폴리글리신 및 폴리메티오닌, 폴리트립토판, 폴리알라닌, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 카프로락톤의 공중합체, 및 폴리글리콜라이드와 카프로락톤의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 소수성 B 블록은 50 내지 50,000 달톤, 또는 200 내지 20,000 달톤의 수 평균 분자량을 갖는다.
상기 유무기 입자는 안정제로서 양친성 고분자의 존재 하에서, 이온 상태의 무기물과 상기 무기물을 환원시킬 수 있는 환원제를 함께 반응시켜 제조할 수 있다. 유무기 입자 제조 시, 사용되는 안정제로 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유무기 입자가 양친성 고분자 층을 더 포함하는 경우 유무기 입자의 안정제 역할을 할 수 있는 이중층 구조를 갖는 것이 바람직하다.
한 구체예에서, 유무기 입자의 크기는 제한되지 않으며, 나노 또는 마이크로 크기일 수 있다. 예를 들어 유무기 입자의 평균 입경은 50 내지 1000 nm일 수 있다.
본 발명의 유무기 입자는 에멀젼 법, 얇은 막 수화법(Thin film hydration) 또는 투석 방법(dialysis)을 이용하여 제조될 수 있고, 구체적인 제조 조건은 유기물질 및 무기물질 그리고 고분자의 종류에 따라서 통상으로 사용되는 범위 내에서 변경하여 수행될 수 있다.
본 발명의 유무기 입자는 바이러스와의 반응 여부를 더욱 명확하게 판단하기 위하여, 표지자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 프로브는 "압타머(aptamer)" 일 수 있다. 본 발명에서 사용한 용어, "압타머(aptamer)"는 단일, 이중 나선의 DNA, RNA 형태로 표적분자에 결합할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 프로브는 "항체(antibody)" 일 수 있다. 본 발명에서 사용한 용어, "항체(antibody)"는 아미노산과 당사슬로 결합된 단백질로 표적분자에 결합할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에서 상기 표적분자는 활성형 바이러스, 활성화된 표면 단백질, 활성형 바이러스의 항원성을 나타내는 단백질 및 이들의 조합 일 수 있다. 상기 압타머 또는 항체는 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 것이고, 바람직하게는 표적분자에 상보적으로 결합할 수 있는 구조를 가진 것 일 수 있다.
상기 압타머 또는 항체의 경우, 활성형 바이러스, 활성화된 표면 단백질 및/또는 활성형 바이러스의 항원성 단백질과 압타머 또는 항체의 특이적 결합 반응의 유무에 따라서 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 표적분자는 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 막 융합 단백질 일 수 있다. 또한 일 구체예에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 경우 헤마글루티닌(HA)의 융합 펩타이드일 수 있다. 상기 HA의 융합 펩타이드의 검출을 위한 압타머 또는 항체는 상기 융합 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 상보적 구조 또는 서열을 포함한다. 또한, 코로나 바이러스인 경우 스파이크 단백질일 수 있고, 파라믹소 바이러스인 경우 F 단백질 일 수 있다.
상기 압타머 또는 항체는 표적 분자와의 결합 반응을 더 용이 또는 명확하게 확인하기 위하여, 금속입자 또는 표지자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 압타머 또는 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 공지된 방법을 이용하여 압타머 또는 항체를 제조, 선별할 수 있다. 또한, 압타머 또는 항체의 결합 여부를 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 압타머 또는 항체를 금 입자에 결합하여 사용하는 경우, 금 입자에 결합된 압타머 또는 항체가 바이러스의 융합 펩타이드에 결합하게 되면, 입자의 크기 변화에 따라 색의 변화가 나타나게 된다. 이러한 색의 변화를 관찰함으로써, 활성형 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 키트 또는 조성물은 상기 프로브를 단일 종류만 포함하거나, 2 종류 이상의 프로브를 함께 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 키트 또는 조성물은 pH 6 이하의 산성 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, pH 6 이하의 산성 물질은 산성 용액일 수 있으며, 상기 pH 범위의 산성 용액을 키트에 포함할 수도 있고, 사용시 직접 제조하여 사용할 수도 있다. pH 6 이하의 산성 용액은 상기 pH 조건을 만족하는 용액이면 제한 없이 사용할 수 있다. 시판되는 스톡 용액을 이용할 수도 있고, 직접 제조하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, 진한 산성 용액인 스톡 용액(stock solution)을 pH 6 이하가 되도록 물에 희석하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 산성 용액은 pH 4 내지 6 또는 pH 5 내지 pH 5.7일 수 있다. 상기 범위가, 숙주 세포 내의 pH 범위와 유사하므로, 검출 효율을 높일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 키트 및 조성물은 반응 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 반응 보조제는 생체 분자와 바이러스의 반응을 도와주는 생체 분자의 반응 보조제 일 수 있고, 또는 프로브와 표적분자의 반응을 도와주는 반응 보조제 일 수 있다. 구체적인 일 예로, 단백질 분해 효소와 표면 단백질의 반응을 도와주는 보조제, 또는 프로브와 활성형 바이러스 활성화된 표면 단백질, 활성형 바이러스의 항원성 단백질을 포함하는 표적분자와의 반응을 도와주는 보조제 일 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, 보조제는 상기 등의 작용을 통해서 바이러스의 검출 민감도 및/또는 특이도를 높일 수 있는 것이라면 모두 포함하는 의미이다. 상기 바이러스의 검출 민감도 및/또는 특이도를 높이는 것의 예로 반응의 속도를 빠르게 하거나, 반응이 일어나는 최소값을 낮추는 작용 또는 표면 단백질과 생체 분자의 반응 외에 다른 반응을 억제하는 작용이 있으나, 상기 메커니즘에 제한되지 않는다. 보조제는 생체 분자 및 이와 반응하는 표면 단백질의 종류에 따라서 검출 민감도 및/또는 특이도를 높일 수 있는 것이면 종류에 제한 없이 모두 포함한다.
구체적인 일 예로 상기 보조제는 케톤 일 수 있다.
상기 케톤 화합물은 예를 들어 페닐에틸 클로로메틸 케톤, 토실 페닐알라닐 플로로메틸 케톤(TPCK, Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone) 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 검출 시 보조제로 케톤을 더 포함할 수 있다. 이 경우, 다른 효소의 활성을 낮추고, 헤마글루티닌(HA) 분해 효소, 특히 트립신의 활성을 높여주어 키트의 민감도를 더욱 높일 수 있다.
본 발명은 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 검출방법은 시료 생체 분자를 접촉시키는 단계 및 상기 생체 분자와 접촉된 시료를 프로브와 접촉시키는 단계를 포함한다. 구체적으로 개체로부터 수득한 시료를 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자와 접촉시키는 단계; 및 상기 생체 분자와 접촉된 시료를 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 검출방법은 상기 접촉에 의하여 일어나는 반응의 여부를 확인함으로써 바이러스를 검출 할 수 있다. 일 예로, 활성형 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 융합 펩타이드가 엔도좀의 세포막을 융합하는 원리를 이용하여, 활성형 바이러스와 프로브의 융합 반응 여부를 확인함으로써 활성형 바이러스를 검출할 수 있다. 다른 예로, 활성형 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 융합 펩타이드가 프로브의 안정성을 낮추는 원리를 이용하여, 프로브의 응집 반응 여부를 확인함으로써 활성형 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명에서 반응의 여부를 확인하는 방법으로, 반응에 의한 프로브의 신호 또는 변화를 측정할 수 있다. 일 예로, 활성형 바이러스와 프로브가 반응하는 경우 나타나는 변화 또는 신호는, 형광강도, 발광강도, 인광강도, 흡광강도, 전기적 신호, 표면증강 라만 분광(surface-enhanced Raman spectroscopy; SERS) 신호, FET(field-effect transistor), 색 및 프로브의 분산도로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 프로브의 반응 여부를 판별할 수 있는 표지자로 자기-소광된 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브와의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내에 담지된 자기-소광된 염료와 같은 표지자가 방출되게 되고, 탈소광이 일어나 형광이 나타나게 된다. 따라서, 형광 강도의 변화를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다.
또한, 프로브의 반응 여부를 판별할 수 있는 표지자로 형광 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브와의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내에 담지된 형광 염료가 방출되게 되고, 형광 강도를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다. 형광강도 외에, 발광강도, 인광강도, 흡광강도 역시 형광강도와 마찬가지로 파장에 따라 달라지기 때문에, 이들을 측정하여 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다. 특히, 형광 염료 중에서, 루미놀이나 플러렌 등은 특별한 기기에 의한 형광 강도의 측정 없이, 육안으로도 색의 변화를 감지할 수 있다.
형광 염료 이외에도, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄 (II) [Ru(bpy)32+])과 같은 전기화학발광 물질을 포함할 수 있으며, 이 경우 육안으로 색의 변화 관찰이 가능하다.
또한, 나노갭 센서를 이용하여 전기적 신호를 측정함으로써 바이러스를 검출할 수 있다. 전기적 신호는 전류 변화를 측정하거나, 또는 FET (Field-effect transistor)를 이용하여 측정할 수도 있다. 나노갭 센서란 갭의 간격이 약 100nm 이하인 전극이 포함된 센서를 의미한다. 예를 들어, 프로브의 반응 여부를 판별할 수 있는 표지자로 형광 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내부의 형광 염료가 방출되어 나노갭 센서의 나노갭에 위치하게 된다. 이 때, 나노갭 센서에 미리 위치시킨 금, 은, 크롬, 티타늄, 백금, 구리, 팔라디움, ITO(indium tin oxide), 또는 알루미늄 등의 금속 입자의 전류 변화를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다. 금속 입자의 평균 입경은 수 나노미터일 수 있으며, 예를 들어, 2 내지 4nm일 수 있다.
또한, 표면증강 라만 분광 신호를 측정하여 바이러스를 검출할 수 있다. 표면증강 라만 분광 신호를 측정하기 위하여, 시료와 결합 가능한 기재를 이용할 수 있다. 기재는 나노입자, 콜로이드, 액상 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 프로브의 융합 여부를 판별할 수 있는 표지자로 형광 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내부의 형광 염료가 방출된다. 방출된 형광 염료를 기재와 결합시킨 후, 상기 기재와 결합된 형광 염료에 다시 금속 입자를 도입한다. 금, 은 등의 금속 입자를 도입함으로써, 라만 분광을 증폭시킬 수 있다. 그 후, 라만 분광기로 상기 형광 염료의 라만 스펙트럼을 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다.
다른 예로, 활성형 바이러스에 의하여 프로브의 응집이 일어남에 따라 프로브의 응집 여부, 즉 분산도의 변화를 확인함으로써 바이러스를 검출할 수 있다. 예를 들어, 프로브로 유무기 입자를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 유무기 입자 의 안정성이 낮아짐에 따라 상기 입자의 응집이 일어나게 된다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 활성형 바이러스에 존재하는 융합 펩타이드가 유무기 입자 주변에 존재하는 계면활성제 등의 안정화제 또는 양친성 고분자를 끌어당겨, 유기물질의 안정성이 떨어지게 됨에 따라 유무기 입자끼리의 응집이 일어난다. 이러한 응집 여부는 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있어, 손쉽게 바이러스 감염 여부를 검출할 수 있다.
한 구체예에서, 적어도 하나 이상의 단계는 pH 6 이하의 조건 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, pH 4 내지 pH 6, pH 5 내지 pH 5.5의 산성 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구체예로 인플루엔자 바이러스를 검출하는 경우, 산성 조건에서 수행하는 것이, 숙주 세포 내 환경과 매우 유사한 조건을 제공할 수 있어, 검출 정확도를 높일 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 인플루엔자 검출 방법에 대한 모식도를 도 3에 나타내었다. 요약하면, pH 6 이하, pH 4 내지 pH 6, 또는 pH 5 내지 pH5.5 하에서, 퓨린 및/또는 트립신이 존재하는 웰에 개체로부터 수득한 시료를 넣어 상기 시료 내에 존재하는 인플루엔자 바이러스를 활성화한 후, 본 발명의 일 예에 따른 프로브를 처리한다. 인플루엔자 바이러스가 존재하는 경우, 융합 펩타이드에 의하여 활성형 인플루엔자 바이러스와 프로브의 반응이 일어나게 되고, 반응 여부에 따라 변하는 신호를 측정함으로써 인플루엔자 바이러스의 존재 유무를 알 수 있다. 상기에서 기술한 바와 같이, 활성형 인플루엔자 바이러스와 프로브의 반응은, 융합 또는 응집일 수 있다. 상기 활성형 인플루엔자 바이러스와 프로브의 반응 및 이에 따라 변하는 신호에 대하여는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용한 용어, "시료"는 바이러스의 검출을 위해 모체를 대표하도록 채취된 것을 의미한다. 한 구체예에서, 시료는 타액, 구강 점막 또는 분뇨 시료일 수 있다.
본 발명은 또한, 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자; 및 상기 생체분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브;를 포함하는 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다. 상기에서 바이러스 검출 키트 및 바이러스 검출 방법에 대하여 기술한 모든 내용이 바이러스 검출용 조성물에도 적용 또는 준용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
[ 제조예 1] 자기- 소광된 염료(Self-quenched dye)가 담지된 숙주 세포 모방형 양친성 입자( FluSome ) 형태의 프로브 제조
숙주 세포 표면과 같은 양친성의 이중층 입자를 제조하기 위하여, mPEG-b-PLA 공중합체를 이용하여, 표지자를 내부에 포함하고 있는 마이셀(Micelle) 또는 폴리머좀(Polymersome) 형태의 양친성 입자 형태의 프로브를 제조하였다.
구체적으로, mPEG-b-PLA(Poly lactic acid)를 2 mL에 분산시킨 후, 자기-소광된 염료로 DiO(Ex: 484nm) 및 Dil(Em: 565nm)를 용해하고, 과량의 물로 투석하여 자기-소광된 염료가 담지된 양친성 입자를 제조하였다. mPEG 고분자와 폴리락타이드(PLA 고분자)의 분자량의 질량분율이 0.3이 되게 하여 폴리머좀을 제조하였고, 상기 질량분율이 0.7 되게 하여 마이셀을 각각 제조하였다.
제조된 양친성 입자의 형상을 TEM(transmission electron microscope) 이미지로 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 소수성 코어와 친수성 쉘을 갖는 마이셀 형태의 구형 입자 및 소수성 멤브레인으로 둘러 싸여있는 친수성 코어 및 친수성 쉘을 갖는 폴리머좀 형태의 구형 입자가 제조되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 제조된 양친성 입자의 크기를 DLS(dynamic light scattering) 법을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 양친성 입자의 크기가 마이셀의 경우 36.79 ± 1.52 nm, 폴리머좀의 경우 122.12 ± 2.50 nm로 확인되었다.
또한, 상기 폴리머좀의 분자량은 6700 g/mol였고, 제조한 마이셀은 분자량이 4500 g/mol 였다.
또한, 상기 공중합체의 종류만 mPEG-b-폴리류신(poly leucine) 블록 공중합체로 변경하여 상기와 동일한 방법으로 양친성 입자 형태의 프로브를 제조하였다.
[ 제조예 2] 유무기 입자 프로브의 제조
골드이온인 골드 클로라이드 트리하이드레이트(Gold chloride trihydrate, Sigma Aldrich)에 안정제로 계면활성제인 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(Hexadecyltrimethylammonium bromide, Sigma Aldrich)와 환원제 소듐 보로하이드라이드(Sodium borohydride, Sigma Aldrich)를 첨가하여 시드 용액(seed solution)을 만들고, 안정제 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(Hexadecyltrimethylammonium bromide), 골드 클로라이드 트리하이드레이트(Gold chloride trihydrate, Sigma Aldrich), 환원제인 실버 니트레이트(Silver nitrate, Sigma Aldrich), L-아스코르브산(L-Ascorbic acid, Sigma Aldrich)과 상기 시드 용액을 순차로 첨가하여, 골드입자의 표면이 안정화제 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드로 코팅된 로드 형태의 유무기 입자를 제조하였다.
제조된 유무기 입자를 관찰한 결과 골드 나노 로드 형태였고, 입자의 크기는 평균 10 nm 였다.
[ 제조예 3] 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자 프로브의 제조
유무기 입자와 양친성 고분자를 반응시켜, 양친성 고분자를 포함하는 제조하였다.
구체적으로, 안정제로 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 존재 하에서 이온 상태의 금(gold)과 환원제를 반응시켜 제조예 2와 동일한 방법으로 유무기 입자를 제조하였다. 그 다음, 4-아미노티오페놀(4-Aminothiophenol)과 폴리페닐알라닌(polyphenylalanine)을 1 : 35 몰비로 포함하는 공중합체를 준비하고, 제조된 유무기 입자와 mPEG-pPhe(폴리페닐알라닌) 공중합체를 혼합 및 교반하여, 상기 골드나노로드 표면에 고분자를 접착시켜 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자를 제조하였다. 이를 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF)에 녹여 회전하면서 THF를 증발시키고, 플라스크 벽면을 따라 얇은 필름을 형성시킨 다음, 상기 필름을 수화시켜 골드 나노로드-고분자가 자기조립화 된 마이셀 형태의 유무기 입자 프로브를 제조하였다.
[ 제조예 4] 리포좀 구조의 양친성 입자 프로브 제조
제조예 1의 양친성 입자 제조방법에서 하기 조건 외에 동일한 방법으로 제조하여 리포좀 형태의 프로브를 제조하였다.
구체적으로, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A; MPL)을 5:2:0.02 중량부로 혼합하여 유기물질이 총 10 mg 되도록 하여 클로로포름 (Chloroform, CF) 1mL에 분산시킨 후, CF를 증발시킨 다음에, 형성된 필름에 자기-소광된 염료(Avanti 구입)로 DiO(Ex: 484nm) 및 Dil(Em: 565nm) 40㎍을 넣고, 60℃에서 12시간 수화 시킨후 12시간 교반하고, 투석하는 방법으로 자기-소광된 염료가 담지된 리포좀 입자를 제조하였다.
[ 실험예 1] FluSome의 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 효과 확인
제조예 1의 방법에 의해 제조된 양친성 입자 형태의 프로브(FluSome)의 FRET 효과를 확인하기 위하여, 인플루엔자 바이러스가 없는 상태에서의 소광(quenching) 및 탈소광(dequenching) 효과를 확인하였다.
인플루엔자 바이러스가 없는 상태에서, 음이온성 계면활성제로 이중층 구조를 분해시켜 입자를 붕괴시키는 Triton X-100을 이용하여 탈소광 효과를 확인하였다. 형광 측정기 일종인 hybrid multi-mode microplate reader (Synergy H4, BioTek, USA)로 형광 강도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 퓨린, 트립신, 또는 Triton X-100을 처리한 즉시 및 처리 2시간 후, 효소를 처리하지 않은 대조군, 퓨린 처리군 및 트립신 처리군은 형광 강도에 변화가 없는 반면에, Triton X-100을 처리한 군은 형광 강도에 변화가 있음을 확인할 수 있었다. 퓨린 및 트립신 처리군의 경우, 인플루엔자 바이러스가 없는 경우에는 퓨린 및 트립신을 처리하여도 바이러스의 활성화 및 융합 펩타이드에 의한 융합 작용이 일어나지 않기 때문에 아무런 변화가 없었다. 반면에, Triton X-100에 의하여 양친성 입자가 붕괴된 경우에는, 자기-소광된 염료의 탈소광으로 인하여 형광강도에 변화가 나타났다.
[ 실험예 2] FluSome을 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 확인
제조예 1의 방법에 의해 제조된 양친성 입자 형태의 프로브(FluSome)의 고병원성 인플루엔자 바이러스 검출 능력을 확인하는 실험을 실시하였다.
구체적으로, 고병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 특이적으로 분해할 수 있는 퓨린(furin)과, 저병원성 및 고병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 특이적으로 분해할 수 있는 트립신(trypsin)을 이용하여 상기 효소 처리에 따라 고/저병원성 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는지 확인하였다.
저병원성 인플루엔자 바이러스는 녹십자 수의약품에서, 고병원성 바이러스는 Hanoi university of agriculture에서 제공받아 사용하였다.
FluSome 단독 처리군(효소 미포함군)과 각각의 효소 처리군을 나누고, 산성 조건(pH 5.5) 여부에 따라 각 실험군의 형광 강도의 변화를 측정하였다. pH 5.5가 되도록, 산성 스톡 용액(stock solution)을 FluSome을 포함하는 용액에 혼합하였다. 형광 강도 측정 결과를 하기 표 1 및 도 5에 나타내었다. 하기 표 1에서 첫 번째 행은 고병원성 인플루엔자 바이러스, 두 번째 행은 저병원성 인플루엔자 바이러스(H3N2) 및 세 번째 행은 저병원성 인플루엔자 바이러스(H9N2)에 대한 형광 강도 측정 결과이다.
Figure 112016001881650-pat00001
도 5 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 효소 미포함군, 비산성조건 실험군에서는 프로프의 형광 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 고병원성 인플루엔자 바이러스 실험군에서 산성 조건이 만족된 경우, FluSome과 퓨린을 함께 처리한 경우, FluSome과 트립신을 함께 처리한 경우, 및 산성 조건에서 FluSome, 퓨린 및 트립신을 함께 처리한 경우 모두에서 FluSome 내의 자기-소광된 염료가 탈소광되어 형광이 검출됨을 확인 하였고, 이는, 산성 조건, 헤마토글루티닌 분해효소 및 FluSome을 이용하여 고병원성 인플루엔자 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있음을 의미한다.
[ 실험예 3] FluSome을 이용한 다양한 고병원성 인플루엔자 바이러스 검출 확인
FluSome의 다양한 고병원성 인플루엔자 바이러스의 검출 효능을 확인하고자, 고병원성 인플루엔자 바이러스의 종류를 달리하여 실험예 2와 동일한 방법으로 FluSome의 고병원성 인플루엔자 바이러스 검출 능력을 확인하였다. 모든 실험은 동일한 산성 조건(pH 5.5) 하에서 수행하였으며, 고병원성 인플루엔자 바이러스로 총 다섯 종류의 H5N1 타입 바이러스를 사용하였다.
형광 강도 측정 결과를 하기 표 2, 도 6 및 도 7에 나타내었다.
Figure 112016001881650-pat00002
표 2 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 퓨린을 처리한 경우, FluSome 내의 자기-소광된 염료가 탈소광되어 형광이 검출됨을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7에 도시한 바와 같이, 다양한 고병원성 인플루엔자 바이러스에 퓨린 또는 트립신을 처리한 경우, 모두 570 nm 부근에서 형광이 검출 되었으며, 저병원성 인플루엔자 바이러스의 경우 트립신을 처리하였을 경우에만, 570 nm 부근에서 형광이 검출 됨을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 4] 검출 가능한 고병원성 인플루엔자 바이러스의 농도 확인
본 발명의 프로브를 이용하여 검출 가능한 인플루엔자 바이러스의 농도를 확인하고자, 제조예 1에 따른 FluSome 및 고병원성 인플루엔자 바이러스를 이용하여, 바이러스의 농도에 따른 형광 강도의 변화를 측정하였다. 실험군으로 고병원성 인플루엔자 바이러스 처리군, 고병원성 인플루엔자 및 분변의 혼합 처리군을 설정하고, 대조군으로 분변 용액 처리군(분변 Sln), DPBS 처리군 및 분변 처리군(분변의 종류에 따라 총 10개의 군을 실험)을 설정하였다. 모든 실험군 및 대조군을 동일한 pH 조건 (pH 5.5)하에서, 퓨린을 처리한 후의 형광 강도 변화를 측정하였다.
그 결과를, 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112016001881650-pat00003
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 인플루엔자 바이러스만 처리하는 경우에는 1/2 내지 1/(27) 농도(희석배율)에서 형광강도가 변함을 확인할 수 있었다. 또한, 인플루엔자 바이러스와 분변이 혼합 처리된 군의 경우 1/10 이상에서 형광강도가 변함을 확인할 수 있었다. 이는 인플루엔자 바이러스가 1/2 내지 1/(27) 농도로 존재하는 경우, 또는 인플루엔자 바이러스가 분변과 혼합되어 1/10 이상 존재하는 경우, 검출이 가능함을 의미한다.
이와는 다르게, 분변만 있는 경우에는 형광강도의 변화가 없었다. 이는 형광 강도의 변화는 인플루엔자 바이러스에 의하여 일어난 것이며, 분변이 이에 영향을 미치지 않음을 의미한다.
[ 실험예 5] 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자를 이용한 인플루엔자 바이러스의 검출 확인
유무기 입자의 인플루엔자 바이러스의 검출 효능을 확인하고자, 제조예 3의 방법에 의하여 제조된 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자 프로브와, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 특이적으로 분해하는 효소로 퓨린, 트립신 및 TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-트립신을 이용하여 저병원성 인플루엔자 바이러스의 검출 효능을 확인하였다.
대조군으로, 효소 미처리군(양친성 고분자 포함하는 유무기 입자 입자원액)을 설정하였고, 퓨린 처리군, 트립신 처리군, TPCK-트립신 처리군을 실험군으로 설정하였다. 모든 실험 조건은 pH 5.5 하에서 수행하였으며, 대조군 및 각 실험군에 저병원성 바이러스를 처리한 후, 바이러스 처리 전 후의 변화를 육안으로 관찰하고, 그 결과를, 도 8에 도시하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 효소를 처리하지 않은 대조군은 뚜렷한 변화가 나타나지 않았으나, TPCK-트립신 처리군의 경우 바이러스에 의하여 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자의 안정성이 낮아져 응집이 일어나 침전 및 덩어리가 형성된 것을 육안으로 명확히 확인할 수 있었다.
[ 실험예 6] 유무기 입자를 이용한 인플루엔자 바이러스의 검출 확인
헤마글루티닌 분해 효소에 의하여 활성화된 바이러스의 펩티드는 유무기 입자 프로브(GNR)이 표면에 있는 안정화제와 반응 하여 유무기 입자가 응집이 일어나게 하므로, 바이러스가 존재하는 경우 응집여부에 따라 빠르게 바이러스를 검출할 수 있다. 따라서, 이러한 유무기 입자의 인플루엔자 바이러스의 검출 효능을 확인하는 실험을 수행하였다.
제조예 2의 방법에 따라 제조된 유무기 입자 프로브(GNR)와, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 특이적으로 분해하는 효소로 퓨린, 트립신 및 TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)-트립신을 이용하여 고병원성 인플루엔자 바이러스(H5N1, H5N6)의 검출 효능을 rapid kit를 이용하여 확인하였다. G1, G2는 고병원성 인플루엔자의 검출을, G3는 저병원성 인플루엔자 바이러스의 검출을 확인 한 것이다.
또한, 음성 대조군(negative control)으로 효소가 없는 조건과, 비글의 코에서 채취한 콧물을 효소, pH solution을 넣은 조건에서 GNR을 넣은 후 반응을 확인하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 프로브가 없는 음성 대조군 및 효소를 포함하지 않는 음성 대조군의 경우 색의 변화가 관찰되지 않았으나, G1, G2 실험군의 경우 모든 경우에 색의 변화가 육안으로 관찰되었고, G3인 저병원성 실험군의 경우 퓨린만 포함하는 경우에는 색의 변화가 낮은 것을 제외하고 육안으로 관찰될 수 있는 수준의 변화가 감지되었다. 따라서, 본 발명의 유무기 입자 프로브를 이용하는 경우 인플루엔자 바이러스의 존부를 빠르게 검출할 수 있음을 확인하였다.
[ 실험예 7] 효소 보조제 처리 유무에 따른 인플루엔자 바이러스 검출능 확인
바이러스의 헤마글루티닌을 특이적으로 분해하는 효소의 보조제를 더 포함하는 경우 검출능의 변화를 확인하는 실험을 하였다.
효소 보조제로 케톤을 사용하였고, 제조예 1의 방법에 따라 제조된 프로브(FluSome)를 이용하였고, 케톤을 더 포함한 것을 제외하고는 실험예 2와 동일한 방법으로 실험하였다. 효소 보조제로 케톤을 처리한 군을 Try-TPCK로 나타내었다.
그 결과를 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 모든 실험군에서 Try-TPCK를 처리한 경우가 퓨린이나 트립신 단독 처리군과 비교하여 검출능이 우수함을 확인할 수 있었다. 이는 효소 보조제가 헤마글루티닌 분해효소 외에 다른 효소의 활성을 줄임으로써 헤마글루티닌 분해효소의 활성을 높이기 때문인 것으로 판단되며, 따라서, 이는 효소 보조제를 사용함으로써 바이러스 검출능을 더욱 향상시켜, 적은 양의 바이러스까지 검출할 수 있어, 검출키트의 민감도를 높일 수 있다.
Figure 112016001881650-pat00004
[ 실험예 8] 표면 증강 라만 산란 신호 측정을 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 확인
표면 증강 라만 산란 신호 측정에 따른 인플루엔자 바이러스 검출을 확인하기 위하여, 제조예 1에서 자기 소광 염료를 대신하여 라만 리포터인 2-나프탈렌티올을 담지시켜 제조된 FluSome을 바이러스 시료와 반응시킨 후, 방출된 2-나프탈렌티올을 나노 크기의 금과 컨쥬게이션한 후, 다음의 측정 조건 하에서 라만 산란 신호의 변화를 관찰하였다. 측정 조건: Laser:　785 nm, Power:　0.7 mW, Grating: 300 gr/mm, Hole:　500 um, Spectral range: 300 ~　1700 cm-1, Exposition time:　120 sec
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 바이러스가 없는 대조군과 비교하여, 저병원성 및 고병원성 바이러스 실험군에서, 트립신과 트립신-TPCK 처리군에서 2-나프탈렌티올-금 컨쥬게이트의 존재에 따라 라만 신호가 변화된 것을 확인할 수 있었다. 퓨린의 경우 고병원성 바이러스가 존재하는 경우에만 라만 신호가 변화된 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 표면 증강 라만 산란 신호를 측정함에 의하여, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를, 트립신은 저병원성/고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있음을 확인하였다.
[ 실험예 9] 육안 색 변화 관찰에 따른 인플루엔자 바이러스 검출 확인
육안으로 색의 변화를 관찰함에 의하여 인플루엔자 바이러스 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 제조예 1에서 자기 소광 염료를 대신하여 플러렌(TCI)을 담지시켜 제조된 FluSome을 바이러스 시료와 반응시킨 후, 방출된 플러렌을 톨루엔 용액에 가하여 색의 변화를 관찰하였다. 플러렌은 탄소 원자가 구, 타원체, 원기둥 모양으로 배치된 분자를 의미한다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 바이러스가 없는 대조군과 비교하여, 저병원성 및 고병원성 바이러스 실험군에서, 트립신과 트립신-TPCK 처리군에서 플러렌의 존재에 따라 색이 변화된 것을 육안으로 확인할 수 있었다. 퓨린의 경우 고병원성 바이러스가 존재하는 경우에만 색이 변화된 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 플러렌을 이용한 육안 색변화 관찰에 의하여, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를, 트립신은 저병원성/고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있음을 의미한다.
[ 실험예 10] 형광 변화 측정에 따른 인플루엔자 바이러스 검출 확인
형광 염료를 이용하여 형광 변화를 측정함에 의하여 인플루엔자 바이러스 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 제조예 1에서 자기 소광 염료를 대신하여 형광 염료인 루미놀(Sigma)을 담지시켜 제조된 FluSome을 바이러스 시료와 반응시킨 후, 방출된 루미놀을 알칼리성 수용액에서 과산화 반응 시켜, 하이브리드 다중-모드 마이크로플레이트 리더기(hybrid multi-mode microplate reader, Synergy H4, BioTek, USA)를 이용하여 형광 변화를 측정하였다(Ex: 303 nm, Em: 425 nm). 루미놀은 알칼리성 수용액에서 과산화 반응에 의하여 자청색의 형광을 나타내므로, 형광 변화 측정에 의하여 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있다.
그 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 바이러스가 없는 대조군과 비교하여, 저병원성 및 고병원성 바이러스 실험군에서, 트립신과 트립신-TPCK 처리군에서 루미놀의 과산화에 따라 형광 강도가 변화된 것을 확인할 수 있었다. 퓨린의 경우 고병원성 바이러스가 존재하는 경우에만 형광 강도가 변화된 것을 확인할 수 있었다.
Control 저병원성 고병원성
Trypsin 3083 88115 78195
Trypsin-TPCK 2204 97654 94257
Furin 1916 2438 81248
이러한 결과는 루미놀을 이용한 형광 강도 측정에 의하여, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를, 트립신은 저병원성/고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있음을 의미한다.
[ 실험예 11] 리포좀을 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 확인
양친성 입자로 리포좀을 이용하여 인플루엔자 바이러스 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 제조예 4에서 제조된 리포좀을 바이러스 시료와 반응시킨 후, 실험예 3과 동일한 방법으로 형광 강도의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 바이러스가 없는 대조군과 비교하여, 저병원성 및 고병원성 바이러스 실험군에서, 트립신 처리에 따라 형광 강도가 변화된 것을 확인할 수 있었다. 퓨린의 경우 고병원성 바이러스가 존재하는 경우에만 형광 강도가 변화된 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 양친성 입자로 리포좀을 이용하여, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를, 트립신은 저병원성/고병원성 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있음을 의미한다.

Claims (28)

  1. 개체로부터 수득한 시료에 존재하는 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자 및 상기 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스 또는 파라믹소 바이러스인 바이러스 검출용 키트
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 바이러스의 표면 단백질은 헤마글루티닌(HA), 스파이크 단백질(spike protein) 또는 F 단백질(F protein) 인 바이러스 검출용 키트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자는 효소인 바이러스 검출용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 효소는 퓨린, 트립신, 세린, 엔도프로테아제(endoprotease) 및 카복시펩티다아제(carboxypeptidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 인 바이러스 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 효소는 재조합 인간 퓨린, 재조합 마우스 퓨린, 트립신-EDTA, 아세틸화된 트립신, TPCK-트립신, 아크릴릭 트립신(Trypsin-acrylic) 퓨린형 프로테아제(Furin like protease), 켁스2 프로테아제(Kex2 proteases), 막통과 세린 프로테아제 (Transmembrane protease serine), TMPRSS2, TMPRSS4, 트립타아제 클라라(Tryptase clara), 플라즈민(plasmin), 세린계 프로테아제(serine protease), 서브틸리신형 엔도프로테아제(subtilisin like endoprotease), 카복시펩티다아제(carboxypeptidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 바이러스 검출용 키트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 마이셀(micelle), 폴리머좀(polymersome), 콜로이드좀(colloidsome), 베지클(vesicle), 리포좀(liposome) 또는 액적(droplet)인 바이러스 검출용 키트.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 표지자를 포함하는 양친성 입자; 유무기 입자; 항체; 압타머; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것;인 바이러스 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 표지자는 자기-소광된 염료, 형광 염료, 전기화학발광 물질 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인 바이러스 검출용 키트.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 양친성 입자는 친수성 고분자 및 소수성 고분자를 포함하는 것인 바이러스 검출용 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 친수성 고분자는 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴리아크릴릭애시드(PAA), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아세테이트(PVAc), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리아크릴아미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 바이러스 검출용 키트.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 소수성 고분자는 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리오르소에스테르, 폴리포스파진, 폴리루신, 폴리이소루신, 폴리발린, 폴리페닐알라닌, 폴리프롤린, 폴리글리신 및 폴리메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 바이러스 검출용 키트.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 유무기 입자에서 무기물질은 금 및 은으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 바이러스 검출용 키트.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 유무기 입자에서 유기물질은 무기물질의 안정화제인 바이러스 검출용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 무기물질의 안정화제는 계면활성제(surfactant) 인 바이러스 검출용 키트.
  16. 제8항에 있어서,
    상기 유무기 입자는 양친성 고분자를 더 포함하는 것인 바이러스 검출용 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 양친성 고분자는 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 타입의 양친성 블록 공중합체, B-A-B 타입의 삼중 블록 공중합체 또는 지질인 바이러스 검출용 키트.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 키트는 pH 6 이하의 산성 물질을 추가로 포함하는 바이러스 검출용 키트.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 키트는 생체 분자의 반응 보조제를 추가로 포함하는 바이러스 검출용 키트.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 생체 분자의 반응 보조제는 케톤인 바이러스 검출용 키트.
  21. 개체로부터 수득한 시료에 존재하는 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자 및 상기 생체분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 조성물.
  22. 개체로부터 수득한 시료를 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자와 접촉시키는 단계 및
    상기 생체 분자와 접촉된 시료를 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 접촉시키는 단계를 포함하는 바이러스 검출방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 접촉은 pH 6 이하의 조건 하에서 수행되는 것인 바이러스 검출방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 검출방법은 시료와 접촉한 프로브의 형광 강도의 변화를 측정하는 단계;를 추가로 포함하는 바이러스 검출방법.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 검출방법은 시료와 접촉한 프로브의 표면 증강 라만 스펙트럼의 변화를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 바이러스 검출방법.
  26. 제22항에 있어서,
    상기 검출방법은 시료와 접촉한 프로브에 흐르는 전류의 변화를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 바이러스 검출방법.
  27. 제22항에 있어서,
    상기 검출방법은 시료와 접촉한 프로브의 색 변화를 관찰하는 단계를 추가로 포함하는 바이러스 검출방법.
  28. 제22항에 있어서,
    상기 검출방법은 시료와 접촉한 프로브의 응집여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 바이러스 검출방법.
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