CN107430129A - 病毒检测用试剂盒 - Google Patents

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CN107430129A
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咸承柱
金炫旭
金智慧
宋錞燮
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Hubert Health
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
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Hubert Health
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
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Abstract

本发明涉及病毒检测用试剂盒、病毒检测用组合物以及病毒检测方法。根据本发明，可以在短时间内以低成本高效率地检测病毒并且可以制备具有更高的灵敏度和精度的试剂盒。

Description

病毒检测用试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测用试剂盒、病毒检测用组合物以及病毒检测方法。
背景技术
病毒是比细菌更小的传染性病原体。病毒由作为遗传物质的RNA或DNA和围绕遗传物质的蛋白质组成。根据宿主的类型，病毒可分为植物病毒、动物病毒和细菌病毒(噬菌体)。然而，在大多数情况下，病毒根据核酸的类型分为DNA病毒亚门和RNA病毒亚门，并且还被细分为纲、目和科。
在这些病毒中，禽流感是由禽流感病毒感染鸡、鸭或野鸟引起的急性病毒感染性疾病，很少发展成人类感染性疾病。禽流感病毒根据致病性分为高致病性、低致病性和非致病性三种，2003年末至2008年2月，已经报道了超过640例的人类感染高致病性禽流感A(H5N1)的病例。禽流感由于死亡率高和禽类产蛋率低而造成巨大的经济损失，尽管不太可能引起感染，但人被感染时死亡率高。由于难以开发根本性禽流感疫苗，且传播速度非常快，因此必须通过早期诊断来使疾病传播和经济损失最小化。
作为诊断这种病毒的方法，已知诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)和免疫荧光测定(IFA)等免疫学检测方法和通过RT-PCR的RNA检测方法，但是这些方法问题在于，诊断病毒需要花费太多时间并且需要高昂的实验费用，或由于非特异性反应而降低了特异性和灵敏度。
因此，有必要开发一种以低成本在短时间内有效地检测病毒的方法。
发明内容
技术问题
本发明旨在提供一种能够在短时间内有效地检测病毒的病毒检测用试剂盒、病毒检测方法以及病毒检测用组合物。
技术方案
本发明提供一种病毒检测用试剂盒，其包括与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子和与由生物分子活化的病毒反应的探针，其中所述探针包括与两亲性聚合物结合的标记物。
本发明还提供一种病毒检测用组合物，其包括与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子和与由生物分子活化的病毒反应的探针，其中所述探针包括与两亲性聚合物结合的标记物。
本发明还提供一种病毒检测方法，该方法包括使从受试者获得的样品和与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子接触；和使与生物分子接触的样品和与由生物分子活化的病毒反应的探针接触，其中，所述探针包括与两亲性聚合物结合的标记物。
本发明还提供用于制备病毒检测用探针或试剂盒的方法，其包括将两亲性聚合物与标记物结合。
有益效果
根据本发明，病毒检测用试剂盒能够以低成本在短时间内高效率地检测病毒，比通过抑制标记物的初始释放来检测病毒的常规试剂盒具有更高的灵敏度和准确性，并且能够提高制备效率，因为在制备期间不需要进行透析(清洁)。
附图说明
图1是根据本发明的一个实施方式的探针的结构的图。
图2是根据本发明的一个实施方式的探针的图像(比例尺：100纳米)。
图3是根据本发明的一个实施方式的探针的图像(比例尺：100纳米)。
图4是根据本发明的一个实施方式的探针的图像(比例尺：100纳米)。
图5是示出将根据本发明实施方式的探针的平均尺寸的比较的坐标图。
具体实施方式
所有类型的病毒，包括流感病毒和埃博拉病毒都由与宿主细胞结合的表面蛋白血凝素(HA)(用于入侵宿主细胞)、参与成熟病毒粒子从宿主细胞逃逸的神经氨酸酶、用于控制氢离子浓度平衡的M2离子通道以及含有病毒遗传信息的核糖核蛋白(RNP)等组成。基于上述病毒的共同特征，本发明人进行了研究，以开发用于在早期检测病毒的方法。结果发现，通过使用与病毒的表面蛋白特异性反应以活化病毒的生物分子和与由此活化的与病毒反应以检测病毒的存在的探针的简单方法能够检测病毒，并完成了本发明。
因此，本发明提供一种病毒检测用试剂盒，其包含与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子和与由所述生物分子活化病毒反应的探针，其中所述探针包括与两亲性聚合物结合的标记物。
本发明的探针包括“与两亲性聚合物结合的标记物”。“与两亲性聚合物结合的标记物”可以是“标记物结合两亲性聚合物”。
本文中所用的术语“探针”是指与由与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子活化的病毒反应从而能够检测病毒或活性病毒的存在的物质。所述探针包括与病毒以外的物质或非活性病毒相比具有与活性病毒明显更大的反应能力、或与活性病毒特异性反应从而能够显著检测活性病毒的存在的任何物质，对其类型和形状没有特别的限制。在说明书中，所述探针与“检测因子”结合使用。
在本发明的包括“与两亲性聚合物结合的标记物”的探针的情况下，膜可以被形成为直接将作为胶囊或载体的聚合物与标记物结合，从而在监测期间控制标记物的初始释放，提高检测灵敏度和准确度，并且在制备期间表现出优异的制备效率而无需透析。
本文中所用的术语“结合”或“键合”是指与元素或离子形成分子。如果两亲性聚合物和标记物之间元素或离子结合或键合，则本发明并不限于结合类型，包括共价键、离子键、金属键和配位键。
例如，结合可以是酯键、酰胺键、亚胺键、腙键或缩醛键。
本文中所用的术语“标记物”是指能够检测探针和活性病毒之间的反应的物质。标记物的类型没有特别限制，并根据反应之前和之后探针的变化而变化，可以使用能够确认通过试验改变性质的任何标记物而没有限制。
根据本发明的一个实施方式，标记物还可以包括结合于两亲性聚合物的标记物(第一标记物)和不同类型的标记物(第二标记物)。
第二标记物可以与聚合物结合或携带在聚合物中。即，本发明的探针还可以包括与两亲性聚合物结合的第一标记物和在探针中携带的第二标记物，或结合亲水性聚合物的第一标记物和结合亲水性聚合物的第二标记物。
根据本发明的一个实施方式，标记物可以包括选自由自猝灭染料、荧光染料、电化学发光物质、猝灭剂、发光染料和磷光染料组成的组中的一种或多种。
与两亲性聚合物结合的标记物包括一种或多种类型。此外，在相同类型的标记物中，本文中使用的标记物可以通过使一种或多种不同的物质与各个不同的两亲性聚合物结合来制备。在一个实施方式中，当第一标记物是荧光染料时，第二标记物可以是猝灭剂，在另一个实施方式中，当第一标记物是猝灭剂时，第二标记物可以是荧光染料。
根据本发明的一个实施方式，探针可以包括与两亲性聚合物结合的染料和/或与两亲性聚合物结合的猝灭剂。
在本发明中，染料是指选择性地吸收或发射具有特定波长的光的物质。具有特定波长的光可以是紫外(UV)光、红外(IR)光或可见光。
在本发明中，自猝灭染料指的是当与另一种邻近时被猝灭并且当附聚的染料被释放以扩散时通过去猝灭发出荧光的物质。
在一个实施方式中，自猝灭染料可以是选自由3,3-双十八烷基氧碳菁高氯酸酯(Dio；Dioc)、3,3-双十八烷基-5,5-二(4-磺基苯基)氧碳菁钠盐、4-(4-(双十六烷基氨基)苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓碘化物(DiA；4-二-16-ASP)、4-(4-(二癸基氨基)苯乙烯基)-N-甲基吡啶鎓碘化物(4-二-10-ASP)、1,1-双十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚碳菁高氯酸酯(Dil)、1,1-双十八烷基-6,6-二(4-磺基苯基)-3,3,3,3-四甲基吲哚碳菁、4,4-二异硫氰酸根合茋-2,2-二磺酸二钠盐(DIDS)、1,1-双十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚三碳菁碘化物(DiR)、1,1-二油烯基-3,3,3,3-四甲基吲哚碳菁、荧光素、BODYPY、四甲基若丹明、十八烷基若丹明(octadecylodamine)B氯化物(R18)、Alexa、菁和别菁(allopicocyanine)组成的组中的一种或多种。荧光染料可以具有200nm以下或50nm至10000nm的平均直径。
在一个实施方式中，电化学发光物质包括但不限于三(2,2'-联吡啶)钌(II)[Ru(bpy)32+]。
在本发明中，荧光染料是吸收一种波长的光、改变颜色并重新发射作为荧光的光的物质。荧光染料也称为发光染料，并且可以使用本领域中熟知的任何荧光染料而没有限制。在一个实施方式中，荧光染料可以是选自由德克萨斯红、荧光素、4-氯-7-硝基苯并呋咱(NBD-Cl)、鲁米诺、富勒烯和具有芳族基团的化合物组成的组中的一种或多种。
在一个实施方式中，猝灭剂是指用于除去分子的激发能量并抑制发光或荧光的物质。可以使用本领域中常规已知的猝灭剂，而对其类型没有限制。根据一个实施方式，猝灭剂可以是选自由BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3组成的组中的一种或多种。
在一个实施方式中，磷光染料是指通过重新发射具有与光源吸收的光的波长不同的波长的光而表现出光致发光效应的物质。在一个示例中，磷光染料可以是但不限于硫化物矿物(XmZn，X是金属元素，Z是非金属元素)或碱土金属的硫化物。
本文所使用的术语“两亲性”也被称为两亲，这意味着具有亲水性和疏水性两者。此外，两亲性粒子是指具有亲水域和疏水域的粒子。两亲性聚合物可以选自由包括亲水性A嵌段和疏水性B嵌段的A-B型两亲性嵌段共聚物、B-A-B型三嵌段共聚物、脂质聚合物及其组合组成的组。
在一个实施方式中，亲水性聚合物可以是选自由聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙烯酸(PAA)、聚丙烯腈(PAN)、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙酸乙烯酯(PVAc)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇(PVA)和亲水性聚氨基酸组成的组中的一种或多种。例如，亲水性聚合物优选是选自由(单)甲氧基聚乙二醇、(单)乙酰氧基聚乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯和丙二醇的共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(谷氨酰胺)、聚谷氨酸、聚苏氨酸、聚(天冬酰胺)、聚(精氨酸)和聚(丝氨酸)组成的组中的一种或多种。亲水性A嵌段可以具有在200道尔顿至50,000道尔顿或1,000道尔顿至20,000道尔顿的数均分子量。
在一个实施方式中，可以使用任何疏水性聚合物，只要它是能够与亲水性聚合物组合形成两亲性聚合物的物质即可。在一个实施方式中，疏水性B嵌段可以是选自由聚酯、聚(酸酐)、疏水性聚(氨基酸)、聚原酸酯和聚磷腈组成的组中的一种或多种。疏水性B嵌段优选为选自由聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚缬氨酸、聚苯丙氨酸、聚脯氨酸、聚甘氨酸、聚蛋氨酸、聚色氨酸、聚丙氨酸、聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯、聚二噁烷-2-酮、聚丙交酯和乙交酯的共聚物、聚丙交酯和二噁烷-2-酮的共聚物、聚丙交酯和己内酯的共聚物以及聚乙交酯和己内酯的共聚物组成的组中的一种或多种。疏水性聚合物包括其衍生物。疏水性B嵌段具有50至50,000道尔顿或200至20,000道尔顿的数均分子量。
本文中使用的术语“脂质”或“脂质聚合物”包括磷脂、脂质蛋白、糖脂和阳离子脂质，只要它们能够形成双层膜结构即可，但本发明不限于此。此外，脂质包括天然诱导的脂质和合成的脂质衍生物。磷脂包括甘油磷脂和磷酸鞘脂。甘油磷脂可以包括二丙烯酰基甘油酯结构，具体包括磷脂酸(PA)、卵磷脂(磷脂酰胆碱，PC)、脑磷酯和磷酸肌醇。脑磷脂包括磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)。此外，磷酸肌醇样磷脂包括磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸酯(PIP2)和磷脂酰肌醇三磷酸酯(PIP3)。磷酸鞘脂包括神经酰胺磷酰胆碱(鞘磷脂，SPH)、神经酰胺磷酰乙醇胺(鞘磷脂，Cer-PE)和神经酰胺磷酰脂。
对合成磷脂衍生物的类型没有限制，但在一个实施方式中，合成磷脂衍生物可以选自由1,2-双十二烷酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(EPC)、11,2-双二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-二氧磷基-L-丝氨酸(POPS)及其组合组成的组。
根据本发明的实施方式，两亲性粒子可以通过已知方法制备而没有限制。例如，两亲性粒子可以通过如下方法来制备：将包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散在水溶液中并进行超声处理的方法、将包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散或溶解在有机溶剂中并用过量的水萃取或蒸发有机溶剂的方法、在将包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散或溶解在有机溶剂中之后用过量的水透析有机溶剂的方法、将包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散或溶解在有机溶剂中并使用均化器或高压乳化器强力蒸发溶剂的方法、薄膜水合等。
根据本发明的实施方式的探针可以通过如下形成：将包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段或聚合物自组装，使得形成粒子。
本发明的探针可以根据目标病毒或病毒的表面蛋白的类型、本文中使用的聚合物的类型或制备方法而具有各种结构或形状。
根据本发明的一个实施方式中，探针可以具有膜结构。
本文中所用的术语“膜结构”是指其内侧被膜或壳包围的结构。膜结构包括任何类型的封装粒子，例如囊泡、人造细胞或微胶囊，而没有限制。在本说明书中，膜结构与壳结构组合使用。膜结构还包括内部含有流体或单独组合物的结构。
膜包括单层或双层结构。单层可以是包括“疏水域-亲水域”的膜结构，并且在一个实施方式中，膜结构包括疏水性芯和亲水性壳(在水溶液中)。双层是包括“亲水域-疏水域-疏水域-亲水域”的膜结构。在一个实施方式中，双层可以包括结合在一起的两个单层。此外，双层可以是包括亲水芯、围绕亲水芯的疏水域和围绕疏水域的亲水壳的结构。
膜结构包括单膜和具有两个以上的单膜的多膜。在一个示例中，当具有单膜的粒子再次被一个单膜包围时，该粒子可以具有多膜。单膜和多膜是与单层和双层不同的概念。具体而言，仅包括具有双层结构的一个膜的粒子具有单膜，而其中具有单层结构的膜被具有单层结构的膜再次包围的粒子被称为具有多膜结构的粒子。
具有上述膜结构的探针可以通过本发明所属的常规方法，例如，根据实施方式，使用微流化设备的微流化、高压均化、乳化或超声处理制备，但是本发明不限于此。
具有上述膜结构的所有类型的粒子可以包括在本发明的探针中，而没有限制。在一个实施方式中，粒子可以选自由囊泡、胶束、聚合物囊泡、胶体体、脂质体、液滴及其组合组成的组，但本发明不限于此。本发明的试剂盒可以包括一种或多种类型的具有不同的膜结构的探针。
术语“胶束”是指具有疏水性芯和亲水性壳的粒子。在一个实施方式中，胶束可以是表面活性剂的胶束或聚合物自组装胶束。根据形成共聚物的聚合物的类型，通过自组装得到的胶束可以具有各种形状，但本发明不限于此。胶束还包括包含两个以上单层的多膜。胶束的形状可以是但不限于例如球形、椭圆形或圆柱形。具有胶束结构的探针还可以在疏水性芯区域中包括成分例如标记物和无机粒子。
术语“聚合物囊泡”是指具有“亲水域-疏水域-疏水域-亲水域”的双层膜结构的粒子，并且在疏水区域和亲水区域中包括聚合物或共聚物。聚合物或共聚物可以包括人工合成的聚合物或共聚物和脂质，或仅包括人工合成的聚合物或共聚物。人工合成的聚合物或共聚物是指不是由天然脂质制成的任何聚合物或共聚物。聚合物囊泡包括具有双层结构的单膜或具有两个以上单膜的多膜。
不同于脂质体，聚合物囊泡可以包括人工合成的聚合物或共聚物。聚合物囊泡包括具有双层结构的单膜或具有两个以上单膜的多膜。
术语“脂质体”是指具有至少一个脂质双层的粒子。脂质体包括单膜和多膜，只要其具有模拟两亲性生物膜的脂质膜即可。形成脂质体的方法是本领域公知的，通常，可以通过在盐水溶液中悬浮或对于含有磷脂的水溶液进行超声处理来获得磷脂，但本发明不限于上述方法。
“胶体体”是指尺寸为1nm-1000nm的胶体粒子或粒子密集填充的构造体。根据形成膜的亲水域和疏水域中的聚合物类型，胶体体可以包括单层和双层。此外，胶体可以包括单膜和多膜。
“液滴”是指膜结构粒子中的水滴状粒子。液滴包括单层和双层，以及单膜和多膜。
本发明的探针可以根据形状进行分类，但是本发明不限于此。在一个实施方式中，探针的形状包括杆状、球形、环状、扁平状、圆柱形、椭圆形，被膜包围的形状及其组合，但是本发明不限于此。
杆状包括直线形，例如棒形、条形或柱形。球形包括包含完整球体和不完整球体的圆形。环形通常是指具有中空芯的球形或圆形。扁平状是指薄而均匀的板状。根据实施方式，可以通过经由涂覆在基材或载体上或其外部放置扁平状探针而形成扁平状探针。
在本发明的一个实施方式中，当根据下式计算的质量分数为0.25-0.40时，两亲性粒子可以形成为聚合物囊泡结构，并且当质量分数为大于0.40且0.70以下时，两亲性粒子具有胶束结构。
[式1]
质量分数＝亲水性聚合物的质量/(亲水性聚合物的质量+疏水性聚合物的质量)
此外，当质量分数表示为质量％(百分比)且质量％满足25％-40％时，两亲性粒子形成为聚合物囊泡结构，当质量％为大于40％且70％以下时，两亲性粒子形成为胶束结构。
在一个实施方式中，对两亲性粒子的尺寸没有限制。探针可以是纳米粒子或微米粒子，其具有例如50nm-10000nm的平均直径。
根据本发明的另一个实施方式，所述探针还可以包括选自金、银及其组合的无机粒子，其用于更清楚地确定探针是否与病毒反应。
本发明的试剂盒或组合物可以包含任一种或两种或更多种类型的探针。
本文中使用的术语“病毒”是指专性细胞内寄生虫，其具有作为核酸的DNA或RNA，从核酸开始增殖，不通过二元裂变增殖，并且不具有产生ATP所需的酶系统。
本发明的病毒包括裸病毒和包膜病毒，具体地，根据本发明的实施方式，病毒可以是包膜病毒。
具体地，包膜病毒包括DNA病毒例如疱疹病毒、痘病毒和嗜肝DNA病毒，以及RNA病毒例如黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、丁型肝炎、正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒、布尼亚病毒、线状病毒和逆转录病毒。
正粘病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、鲑传贫病毒(isavirus)、托高土病毒和quaranjavirus属。
冠状病毒包括α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒属。
副粘病毒包括副粘病毒、风疹病毒、麻疹病毒和肺病毒属。
病毒包括核酸和围绕该核酸的蛋白。这种病毒蛋白参与保护病毒基因组、将病毒粒子附着和/或融合到细胞中、确定病毒抗原性，并且包括维持病毒形状的结构蛋白和与蛋白质和核酸的合成有关的非结构蛋白。
本文中使用的术语“病毒的表面蛋白”是指结构蛋白。例如，“表面蛋白”具有病毒的特异性抗原性，并且包括参与病毒附着和/或受感染细胞的融合的糖蛋白和参与细胞的融合的融合蛋白。
根据本发明的一个实施方式，病毒的表面蛋白可以是血凝素(HA)、纤突蛋白或F蛋白。
根据本发明的一个实施方式，本发明的病毒可以包括附着于宿主细胞的细胞膜以致使膜融合的表面蛋白。具体地，本发明的病毒可以包括具有如下性质的表面蛋白：其中以非活性形式存在的表面蛋白被生物分子被转换成活性形式，以引起宿主细胞与细胞膜的附着和/或膜融合。
根据本发明的一个实施方式，“病毒”可以是流感病毒或高致病性流感病毒。流感病毒包括糖蛋白、作为其“表面蛋白”的血凝素(HA)。血凝素被表达为一种多肽(前体HA0)，HA0的切割位点通过蛋白水解被分成HA1和HA2，并且在酸性条件下使由疏水性氨基酸残基组成的融合肽活化。由于流感病毒的致病性，HA具有与切割位点的氨基酸不同的氨基酸组成。
根据本发明的另一个实施方式，“病毒”可以是冠状病毒。冠状病毒包括纤突蛋白作为表面蛋白，并且纤突蛋白包括S1部分和S2部分。当纤突蛋白的S1部分与宿主细胞结合时，其被蛋白酶切割成S1和S2，并且S2末端的疏水域暴露并因此被活化。
根据本发明的又一个实施方式，“病毒”可以是副粘病毒。副粘病毒包括HN蛋白作为表面蛋白。HN蛋白是将病毒结合或附着于宿主细胞的结合(或附着)蛋白，并且当其在病毒的非活性状态下作为前体HN0存在时，其通过水解通过从C末端除去氨基酸残基而被活化。此外，副粘病毒包括F蛋白作为表面蛋白。当F蛋白在病毒的非活性状态下作为前体F0存在时，其在被生物分子切割成F1和F2后被活化为新形式的N末端F1。F蛋白在切割位点包括多元碱性残基和一元碱性残基。优选地，F蛋白可以是具有多元碱性残基的F蛋白。
本文中使用的术语“反应”是指当任何物质与不同物质接触时物理和/或化学状态(例如条件、颜色、形状或化学键)的变化、或其现象。在一个实施方式中，当病毒的表面蛋白与生物分子反应时，病毒的表面蛋白被转化，导致活化病毒的状态改变，从而形成融合肽。在另一个实施方式中，活化病毒和探针之间的反应可以是融合或聚集。根据一个实施方式，融合可以是活性病毒与本发明的探针的一部分结合的现象。可以理解为，融合还包括探针中的物质通过融合被释放到外部的现象。在一个示例中，可以通过使用如下机制来通过确认活性病毒是否与探针融合来检测活性病毒：在活性病毒的表面蛋白中存在的融合肽诱导核内体与细胞膜融合。聚集是指分子或粒子在溶液中结合在一起的现象。在本发明的一个实施方式中，凝集是指由于作为检测对象的病毒使得本发明的探针的稳定性降低而引起探针凝结从而导致凝结和/或沉淀的现象。
本文中使用的术语“生物分子”是指活生物体中的结构、功能或信号转导所需的分子。生物分子可以包括用于功能或信号转导的特定结构和/或区域。这种生物分子的特定结构是通过分子间结合反应产生反应的驱动力。生物分子包括氨基酸和蛋白质、糖和碳水化合物、脂肪酸和脂质以及核苷酸和核酸，并且包括在活生物体和/或人工合成制品中制得的所有产物。根据本发明的一个实施方式，“生物分子”可以是酶，其是由约62至2500个氨基酸残基组成的蛋白质。
在一个实施方式中，酶可以是蛋白酶。在一个示例中，使第一合成形式的酶失活，但是在由于去除(或切割)特定部分而显示活性的蛋白质中，蛋白酶切割特定部分，使得失活的蛋白质被活化。蛋白酶可以是能够切割特定部分的任何酶，而对其类型没有限制。
在一个实施方式中，蛋白酶可以是选自由弗林蛋白酶、胰蛋白酶、丝氨酸、内切蛋白酶和羧肽酶组成的组中的一种或多种。蛋白酶包括其衍生物或修饰物。例如，蛋白酶可以包括重组人类弗林蛋白酶、重组小鼠弗林蛋白酶、胰蛋白酶-EDTA、乙酰化胰蛋白酶、N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮-胰蛋白酶(TPCK-胰蛋白酶)、胰蛋白酶-丙烯酸、弗林蛋白酶样蛋白酶、Kex2蛋白酶、跨膜蛋白酶丝氨酸、TMPRSS2、TMPRSS4、克拉拉类胰蛋白酶、纤溶酶、丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样内切蛋白酶、羧肽酶及其组合。
在一个实施方式中，当胰蛋白酶与流感病毒的表面蛋白反应时，对于血凝素(HA)，胰蛋白酶的酶促降解发生在His57-Asp102-Ser195处，并且弗林蛋白酶的酶促降解发生在His194-Asp153-Ser368处。由于胰蛋白酶降解高致病性流感病毒和低致病性流感病毒的血凝素，因此可以使用胰蛋白酶检测高/低致病性流感病毒。此外，由于弗林蛋白酶只可降解高致病性流感病毒的血凝素，所以可以使用弗林蛋白酶检测高致病性流感病毒。
在另一个实施方式中，当蛋白酶与冠状病毒的表面蛋白反应时，在S1区域和S2区域之间的交界处发生水解。因此，随着通过水解的切割而暴露S2的疏水域，冠状病毒被活化用于使用本发明的探针进行检测。
在又一个实施方式中，与副粘病毒的表面蛋白反应的生物分子可以是蛋白酶或羧肽酶，其有利于在C末端(羧基侧)的精氨酸残基处切割。蛋白酶可以识别并切割含有R-X-K/R-R排列的F蛋白。作为具体示例，蛋白酶可以是弗林蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶样内切蛋白酶。
本文中使用的术语“活性病毒”或“活化病毒”是指其表面蛋白由与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子活化的病毒。这里，病毒的表面蛋白的活化意味着病毒的表面蛋白被改变以备用于宿主细胞和/或探针之间的反应，例如宿主细胞和/或探针之间的特异性反应。这里，术语“病毒的活化”是指将非活性病毒转化为活性病毒的过程。由于病毒的活化是病毒感染所必需的，所以可以通过检测活性病毒的存在来确定病毒感染。
在一个实施方式中，病毒的表面蛋白的活化是指其中存在于病毒的表面蛋白上的融合蛋白或融合肽能够与宿主细胞的膜的表面或本发明的探针的表面融合的状态。
在一个实施方式中，对于流感病毒，活化的病毒意味着通过酶降解而使表面蛋白血凝素(HA)转化以将存在于血凝素中的处于失活状态的融合肽暴露。
也就是说，用于特异性降解HA的切割位点的酶包括弗林蛋白酶和/或胰蛋白酶。由于弗林蛋白酶只可降解高致病性流感病毒的血凝素，所以当流感病毒的HA被弗林蛋白酶降解时，流感病毒表现出高致病性。此外，由于胰蛋白酶可能降解高致病性流感病毒和低致病性流感病毒的血凝素，所以当血凝素被胰蛋白酶降解时，流感病毒表现出高致病性或低致病性。低致病性流感病毒的限制性位点包括C-末端中的-R-，高致病性流感病毒的限制位点由R/K-R-K-K-R组成。
当HA被特异性降解HA的限制性位点的酶活化时，发生HA的重排，因此HA中的融合肽暴露于外部，从而导致活性病毒。同样，当在酸性条件下被活化的流感病毒遇到根据本发明的实施方式的探针时，由于流感病毒的融合肽而发生流感病毒与探针之间的反应。通过测量随探针反应而变化的信号，可以检测病毒感染。
在另一个实施方式中，对于冠状病毒，活化的病毒意味着表面蛋白即纤突蛋白(S蛋白)被改变，使得存在于纤突蛋白中的处于失活形式的疏水域由于生物分子而被暴露。具体地，当纤突蛋白的S1区域与宿主细胞结合时，纤突蛋白通过蛋白酶被切割成S1和S2，暴露S2末端的疏水域，导致病毒的活化。暴露的S2的疏水域附着到宿主细胞的细胞膜中的疏水域，另一方面，由于构象变化(其中S2区的中间部分在结合到病毒的外膜同时被折叠)而发生膜融合。因此，当本发明的探针与活化的冠状病毒反应时，探针的稳定性改变，产生各种信号，因此可以通过测量这种变化来检测病毒感染。
在另一个实施方式中，在副粘病毒中活化的病毒是指通过生物分子从HN蛋白中除去C-末端的残基的状态。具体地，在HN蛋白保持失活状态(HN0)时，当去除大约90个C末端残基时，HN蛋白被活化，以使副粘病毒附着到靶或宿主细胞的膜上。此外，活性副粘病毒意味着F蛋白被生物分子切割成F1和F2。在非活性的副粘病毒中，F蛋白在前体F0状态下与生物分子结合，F蛋白被切割成F1和F2，从而成为能够与宿主细胞的细胞膜融合的活性病毒。也就是说，通过形成含有结合SS的链F1和F2的活性表面蛋白，并且将表现出充分疏水性的F1的N末端残基固定于靶或宿主细胞的细胞膜，发起膜融合。因此，通过使本发明的生物分子与表面蛋白反应来活化副粘病毒，并且使被活化的病毒再与本发明的探针反应，导致探针变化。因此，可以通过测量该变化来检测病毒。
在本发明的一个实施方式中，试剂盒或组合物还可以包括pH 6以下的酸性物质。例如，pH 6以下的酸性物质可以是酸溶液，并且具有上述pH范围的酸溶液可以包含在试剂盒中，并且可以直接制备使用。pH 6以下的酸溶液可以是满足pH条件的任何溶液而没有限制。作为酸溶液，储备溶液可以商购或直接制备使用。例如，可以将浓酸溶液(储备溶液)在水中稀释以具有pH 6以下。例如，酸溶液可以具有pH 4-6或pH 5-5.7。由于上述范围类似于宿主细胞中的pH范围，所以可以提高检测效率。
在一个实施方式中，本发明的试剂盒和组合物还可包含佐剂。
佐剂可用于生物分子以有助于与病毒的反应或者可以有助于靶分子与探针的反应。作为具体示例，佐剂可用于有助于蛋白酶与表面蛋白的反应或有助于包括活性病毒的活化表面蛋白和活性病毒的抗原蛋白的靶分子与探针的反应。
本文中使用的术语“佐剂”可以是能够通过上述反应提高对病毒的检测灵敏度和/或特异性的任何物质。可以通过增加反应速率、降低反应发生的最小值或抑制除表面蛋白与生物分子之间的反应以外的其它反应来增加对病毒的检测灵敏度和/或特异性，但是本发明不限于上述机制。佐剂包括能够根据生物分子和与其反应的表面蛋白的类型来增加检测灵敏度和/或特异性的所有物质而没有限制。
佐剂的具体示例可以是酮。
酮化合物可以包括例如苯基乙基氯甲基酮、甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)及其组合，但本发明不限于此。
在本发明的一个实施方式中，为了检测流感病毒，还可以包括酮作为佐剂。在这种情况下，通过降低其它酶的活性并增加血凝素(HA)蛋白酶、特别是胰蛋白酶的活性，可以进一步增加试剂盒的灵敏度。
本发明涉及病毒检测方法。
本发明的检测方法包括使样品与生物分子接触，并使与生物分子接触的样品与探针接触。具体地，本发明的检测方法包括将从受试者获得的样品和与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子接触；并将与生物分子接触的样品和与被生物分子活化的病毒反应的探针接触，其中探针包括与两亲性聚合物结合的标记物。
本发明的检测方法可以通过确认存在或不存在由于这种接触而发生的反应来检测病毒。作为示例，利用核内体的细胞膜被在活性病毒的表面蛋白中存在的融合肽融合的机制，通过考察探针是否与活性病毒融合来检测活性病毒。在另一个示例中，可以利用探针的稳定性被在活性病毒的表面蛋白中存在的融合肽降低的机制来检验探针是否被聚集，以检测活性病毒。
通过本发明中的检验反应的方法，可以检测由反应产生的探针的信号或变化。作为示例，当活性病毒与探针反应时产生的变化或信号可以是选由自探针的荧光强度、发光强度、磷光强度、吸光度、电信号、来自表面增强拉曼光谱(SERS)的信号、场效应晶体管(FET)、颜色和分散性组成的组中的一种或多种的变化，但本发明不限于此。
例如，当使用自猝灭染料作为能够确定探针的反应的标记物时，由于活性病毒与探针反应，与探针的聚合物结合的标记物例如自猝灭染料被释放或暴露于探针的外部。暴露或释放了标记物的探针由于去猝灭而发出荧光。因此，可以通过测量荧光强度的变化来检测病毒感染。
此外，当使用荧光染料作为测定探针的反应的标记物时，随着具有荧光染料的探针与活性病毒的反应，与探针的聚合物结合的荧光染料可以暴露于膜的外部，或由于探针粒子的聚合物膜的崩解，在探针中携带的荧光染料可以被洗脱到聚合物膜的外部，然后可以测量荧光强度以检测病毒感染。由于发光强度、磷光强度和吸光度强度根据波长而变化，所以类似于荧光强度，可以通过测量强度来检测病毒感染。特别地，在这些荧光染料中，鲁米诺或富勒烯可用于目测地检测颜色变化，而无需使用特定装置来测量荧光强度。
此外，当一个探针包括荧光染料和猝灭剂作为标记物时，在活性病毒和探针之间的反应之后，如果聚合物膜没有崩解，则猝灭剂和荧光染料存在于膜中，因而可能无法检测荧光，但是，如果由于膜崩解，该染料被暴露或被洗脱，则使探针的荧光强度变化，因此通过测量这种变化可以检测病毒的存在。
除了荧光染料之外，可以包括诸如三(2,2'-联吡啶)钌(II)[Ru(bpy)32+])的电化学发光物质，在这种情况下，可以目视观察到颜色变化。
此外，可以通过使用纳米间隙传感器测量电信号来检测病毒。可以根据电流变化来测量电信号或使用FET来测量电信号。纳米间隙传感器是指包括具有大约100nm以下间隙间隔的电极的传感器。例如，当使用荧光染料作为能够确定探针的反应的标记物时，探针中的荧光染料由于活性病毒与探针的融合而被释放并置于纳米间隙传感器的纳米间隙中。这里，可以通过测量预先放置在纳米间隙传感器中的诸如金、银、铬、钛、铂、铜、钯、氧化铟锡(ITO)或铝等金属粒子的电流变化来检测病毒感染。金属粒子可以具有几纳米的平均直径，例如2nm至4nm。
此外，可以通过测量SERS信号来检测病毒。为了测量SERS信号，可以使用能够与样品结合的基材。基材可以是纳米粒子、胶体或液体，但本发明不限于此。例如，当使用荧光染料作为能够确定探针融合的标记物时，由于活性病毒与探针的反应，探针中的荧光染料被释放。在释放的荧光染料与基材结合后，再将金属粒子引入与基材结合的荧光染料中。通过引入诸如金或银等金属粒子可以增强拉曼光谱。之后，可以使用拉曼光谱仪测量荧光染料的拉曼光谱来检测病毒感染。
作为另一个示例，可以通过确认聚集，即，起因于活性病毒引起的探针聚集的探针的分散性的变化，来检测病毒。例如，当探针包括无机粒子时，由于探针的稳定性被活性病毒降低而引起粒子聚集。
在一个实施方式中，可以在pH 6以下的条件下进行步骤中的至少一个。例如，可以在酸性条件例如pH 4至pH 6或pH 5至pH 5.5下进行步骤中的至少一个。在本发明的一个实施方式中，在酸性条件下检测流感病毒可以提供与宿主细胞中的环境非常相似的条件，因此可以提高检测精度。
图3示出了表示根据本发明实施方式的用于检测流感病毒的方法的示意图。简单地，在pH 6以下、pH 4至pH 6或pH 5至pH5.5的条件下，将从受试者获得的样品加入到其中存在用于活化在样品中存在的流感病毒的弗林蛋白酶和/或胰蛋白酶的孔中，然后用根据本发明的实施方式的探针进行处理。当存在流感病毒时，由于融合肽，活性流感病毒和探针之间发生反应，所以可以通过测量根据反应而变化的信号来检测流感病毒的存在。如上所述，活性流感病毒和探针之间的反应可以是融合或聚集。活性流感病毒与探针之间的反应以及由此而变化的信号如上所述。
本文中使用的术语“样品”是指所获得的表示病毒检测用亲本的材料。在一个实施方式中，样品可以是唾液、口腔粘液或排泄物样品。
本发明还涉及病毒检测用组合物，其包括与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子；以及与由生物分子活化的病毒反应的探针。这里，关于病毒检测用试剂盒和病毒检测方法的所有细节都可以适用于病毒检测用组合物。
本发明还涉及一种用于制备病毒检测用探针或试剂盒的方法，其包括将两亲性聚合物与标记物结合。
根据一个实施方式，该方法包括将两亲性聚合物与第一标记物结合并使用与两亲性聚合物结合的标记物形成膜结构的粒子。
根据另一个实施方式，在所述粒子形成步骤之前，所述方法可以进一步包括：将结合了第一标记物的两亲聚合物与第二标记物分散在溶剂中。携带第二标记物的探针可以通过如下来制备：由其中也分散有第二标记物的溶液形成膜结构的粒子。
根据又一个实施方式，该方法可以包括：将两亲性聚合物与第一标记物结合，将两亲性聚合物与第二标记物结合，以及通过将结合了第一标记物的两亲性聚合物与结合了第二标记物的两亲性聚合物分散在溶剂中而形成膜结构的粒子。
形成膜结构的粒子可以通过在本发明中通常使用的用于形成胶体、脂质体、胶束或聚合物囊泡的方法进行，并且，例如，该膜结构的粒子可以通过如下方法来制备：将包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散在水溶液中并进行超声处理的方法、将包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散或溶解在有机溶剂中并用过量的水萃取或蒸发有机溶剂的方法、在将包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散或溶解之后用过量的水透析有机溶剂的方法、将包含亲水域和疏水域的两亲性嵌段共聚物分散或溶解在有机溶剂中并使用均化器或高压乳化器强力蒸发溶剂的方法或薄膜水合。
在膜结构的粒子的形成中，可以将没有与标记物结合的两亲性聚合物和与标记物结合的两亲性聚合物以1:1-10的重量比混合。
根据本发明的制备方法的探针可以形成膜，使得聚合物作为直接与标记物结合的胶囊剂或载体。因此，在检测早期可以控制标记物的释放，由此，不必在制备过程中进行透析，从而得到病毒检测用试剂盒的优异的制备效率。
在这里，所有的关于病毒检测用试剂盒和病毒检测方法的细节都可以适用于病毒检测用探针的制备方法。
在下文中，将参照实施例对本发明进行说明。提供以下实施例仅用于举例说明本发明，而本发明的范围不限于此。
[实施例]
[制备例1]包括亲水性聚合物-疏水性聚合物-荧光染料结合聚合物的携带猝灭剂的探针粒子的制备
结合有荧光染料作为标记物并且在其中携带猝灭剂的胶束或聚合物囊泡型探针使用两亲性共聚物来制备。mPEG-NH2购自Laysan Bio,Inc.，Cy5.5-NHS酯购自GEHealthcare，BHQ3-NHS酯购自Biosearch Technologies，且1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和二甲基亚砜购自Sigma Aldrich。
具体地，将2.5mg Cy5.5-NHS酯和8.9mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺加入到10mg mPEG-b-PLeu中并溶于2mL二甲基亚砜中，以在室温下进行反应12小时。将反应完成后的溶液在4mL冷乙醚中沉淀，并离心除去上清液。冻干后，得到亲水性聚合物-疏水性聚合物-荧光染料缀合物。
通过如下方法制备探针：通过制备10mg的mPEG-b-PLeu和mPEG-b-PLeu-荧光染料缀合物的1:1混合物，混合0.04mg BHQ3-NHS酯，并进行透析而形成粒子。透析后，省略了清洗步骤。
所制备的探针的形态通过透射电子显微镜(TEM)被可视化，在图2中示出。使用动态光散射(DLS)测定所制备的探针粒子的尺寸。由此测得的平均直径在图5中示出。
如图2和图5中所示，确认了所制备的不完整球形或椭圆形类型的探针具有62.5±3.6nm的平均直径。
此外，在这种探针中，聚合物囊泡型探针具有6500g/mol的分子量，且胶束型探针具有3300g/mol的分子量。
[制备例2]包括亲水性聚合物-疏水性聚合物-猝灭剂结合聚合物的携带荧光染料的探针粒子的制备
通过与制备例1中所述相同的方法制备探针，不同之处在于猝灭剂与两亲聚合物结合且携带荧光染料。
mPEG-NH2购自Laysan Bio,Inc.，Cy5.5-NHS酯购自GE Healthcare，BHQ3-NHS酯购自Biosearch Technologies，且1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和二甲基亚砜购自Sigma Aldrich。
具体地，将10mg mPEG-b-PLeu、1.8mg BHQ3-NHS酯和8.9mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶解在2mL二甲基亚砜中，以在室温下进行反应12小时。将反应完成后的溶液在4mL冷乙醚中沉淀并离心除去上清液。冻干后，得到亲水性聚合物-疏水性聚合物-猝灭剂缀合物。
通过如下方法制备探针：通过制备10mg的mPEG-b-PLeu和mPEG-b-PLeu-猝灭剂缀合物的1:1混合物，混合0.04mg CY5.5-NHS酯并进行透析而形成粒子。
所制备的探针的形态通过TEM被可视化，在图3中示出，使用DLS测定所制备的探针粒子的尺寸。由此测得的平均直径在图5中示出。
如图3和图5中所示，确认了所制备的不完整球形或椭圆形类型的探针具有48.4±4.5nm的平均直径。
[制备例3]包括亲水性聚合物-疏水性聚合物-猝灭剂结合聚合物和亲水性聚合物-疏水性聚合物-荧光染料结合聚合物的探针制备
通过与制备例1中所述相同的方法制备探针，不同之处在于使用荧光染料结合聚合物和猝灭剂结合聚合物。
mPEG-NH2购自Laysan Bio,Inc.，Cy5.5-NHS酯购自GE Healthcare，BHQ3-NHS酯购自Biosearch Technologies，且1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和二甲基亚砜购自Sigma Aldrich。
具体地，将2.5mg Cy5.5-NHS酯和8.9mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺加入到10mg mPEG-B-PLeu中并溶于2mL二甲基亚砜中，以在室温下进行反应12小时。将反应完成后的溶液在4mL冷乙醚中沉淀，并离心除去上清液。冻干后，得到亲水性聚合物-疏水性聚合物-荧光染料缀合物。
将1.8mg BHQ3-NHS酯和8.9mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺加入到10mgmPEG-b-PLeu中，并溶于2mL二甲基亚砜中，以在室温下进行反应12小时。将反应完成后的溶液在4mL冷乙醚中沉淀，并离心除去上清液。冻干后，得到亲水性聚合物-疏水性聚合物-猝灭剂缀合物。
通过如下制备两亲性粒子探针：制备10mg的所得到的缀合物的1:1混合物，并进行透析。
所制备的探针的形态通过TEM被可视化，在图4中示出。使用DLS测定所制备的探针粒子的尺寸。由此测得的平均直径在图5中示出。
如图4和图5中所示，确认了所制备的不完整球形或椭圆形类型的探针具有52.7±2.2nm的平均直径。
[实验例1]探针的病毒检测效果的确认
将由制备例1的方法制备的探针的病毒检测效果进行验证。
具体地，对目标病毒进行实验，所述目标病毒为例如三种类型的高致病性流感病毒例如H5N1_01、H5N1_02和H5N6和11种低致病性流感病毒例如H1N1_01、H1N1_02、H2N1、H2N4、H3N8、H5N2、H5N3、H7N9、H7N7、H9N2_01和H9N2_02。作为与病毒反应的生物分子，使用能够特异性降解流感病毒的表面蛋白(为血凝素)的弗林蛋白酶和胰蛋白酶。低致病性流感病毒提供自Green Cross Veterinary Product Co.,Ltd.，高致病性流感病毒提供自HanoiUniversity of agriculture。对于pH条件，用酸性储备溶液来实现适当的pH。
将适合各个实验组的酶加入到96孔板的每个孔中，并且将包含酶的孔用各个类型的目标病毒接种。随后，将所得孔用本发明的探针接种，然后测定所述探针的荧光强度的变化(Ex：675nm，Em：694nm)。
对于总共14种流感病毒，将检测环境(孔的pH条件)分成pH5.5和pH7.4，并且根据各个pH条件针对1)仅弗林蛋白酶处理组、2)仅胰蛋白酶处理组、3)弗林蛋白酶和胰蛋白酶处理组、4)弗林蛋白酶和排泄物处理组、5)胰蛋白酶和排泄物处理组、6)仅排泄物处理组(不含酶)中的每个进行实验。将结果示于表1和2中。
[表1]
[表2]
如表1和表2中所示，在不含酶组和非酸性组中，没有检测到探针的荧光变化。然而，在高致病性流感病毒组中，当满足酸性条件时，当用探针和胰蛋白酶处理时，所有的高/低致病性流感病毒组显示出荧光变化，而当用弗林蛋白酶处理时，只有高致病性流感病毒组显示出荧光变化。可以看出，胰蛋白酶能够用于检测高/低致病性流感病毒两者，而弗林蛋白酶能够用于只检测低致病性流感病毒。此外，虽然用酶和排泄物一起进行处理，但当存在酸性条件和酶时，检测到荧光变化，这表明即使当结合不同的物质时也能够保持检测能力。
[实验例2]验证探针的病毒检测效果
对通过制备例2的方法制备的探针的病毒检测效果进行了验证。
具体地，在与实验例1中所述相同的条件下进行实验，所不同的是使用制备例2的探针而不是制备例1的探针。在表3和表4中示出了荧光强度的测量结果。
[表3]
[表4]
如在表3和表4中所述那样，当用弗林蛋白酶处理时，不含酶组和非酸性组并没有显示出荧光变化。然而，当在高致病性流感病毒组中满足酸性条件时，用探针和胰蛋白酶两者处理的高致病性流感病毒组和低致病性流感病毒组均显示出荧光变化，而当用弗林蛋白酶而不是胰蛋白酶进行处理时，仅高致病性流感组显示出荧光变化。这种结果表明胰蛋白酶能够用于检测高致病性流感病毒和低致病性流感病毒两者，而弗林蛋白酶能够用于只检测低致病性流感病毒。此外，即使当用酶和排泄物一起进行处理时，当同时存在酸性条件和酶时，也检测到荧光的变化，这表明即使当结合不同的物质时也能够保持检测能力。
[实验例3]验证探针的病毒检测效果
对通过制备例3的方法制备的探针的病毒检测效果进行验证。
具体地，在与实验例1中所述相同的条件下进行实验，所不同的是使用制备例3的探针而不是制备例1的探针。在表5和表6中示出了荧光强度的测量结果。
[表5]
[表6]
如在表5和6中所示那样，当用弗林蛋白酶进行处理时，不含酶组和非酸性组没有显示出荧光变化。然而，当在高致病性流感病毒组中满足酸性条件时，用探针和胰蛋白酶两者处理的高致病性流感病毒组和低致病性流感病毒组均显示出荧光变化，而当用弗林蛋白酶而不是胰蛋白酶进行处理时，仅高致病性流感组显示出荧光变化。这种结果表明胰蛋白酶能够用于检测高致病性流感病毒和低致病性流感病毒两者，而弗林蛋白酶能够用于只检测低致病性流感病毒。此外，即使当用酶和排泄物一起进行处理时，当同时存在酸性条件和酶时，也检测到荧光的变化，这表明即使当结合不同的物质时也能够保持检测能力。

Claims (15)

1.一种病毒检测用试剂盒，包括：
与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子；和
与由所述生物分子活化的病毒反应的探针，
其中，所述探针包括与两亲性聚合物结合的标记物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述标记物是选自由自猝灭染料、荧光染料、电化学发光物质、猝灭剂、发光染料和磷光染料组成的组中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述探针包括选自由结合两亲性聚合物的染料和结合两亲性聚合物的猝灭剂组成的组中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述两亲性聚合物选自由包括亲水性聚合物A和疏水性聚合物B的A-B型嵌段共聚物、B-A-B型三嵌段共聚物、脂质聚合物及其组合组成的组。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述探针是胶束、聚合物囊泡、胶体体、囊泡、脂质体或液滴。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述病毒是流感病毒、冠状病毒或副粘病毒。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中与病毒的所述表面蛋白特异性反应的生物分子是酶。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述酶是选自由弗林蛋白酶、胰蛋白酶、丝氨酸、内切蛋白酶和羧肽酶组成的组中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括：
pH 6以下的酸性物质。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括：
佐剂。
11.一种病毒检测用组合物，包括：
与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子；和
与由所述生物分子活化的病毒反应的探针，
其中，所述探针包括与两亲性聚合物结合的标记物。
12.一种病毒检测方法，包括：
使从受试者获得的样品和与病毒的表面蛋白特异性反应的生物分子接触；和
使与所述生物分子接触的所述样品和与由所述生物分子活化的所述病毒反应的探针接触，
其中，所述探针包括与两亲性聚合物结合的标记物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述接触在pH 6以下的条件下进行。
14.根据权利要求12所述的方法，还包括：
检测与所述样品接触的所述探针的变化。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，通过测量选自如下所组成的组中的一种或多种来检测所述探针的变化：所述探针的荧光强度、发光强度、磷光强度、吸光度、电信号、来自表面增强拉曼光谱(SERS)的信号、颜色和分散性。
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