CN112816454A - 一种用于精准捕获和检测冠状病毒的sers固态芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于精准捕获和检测冠状病毒的SERS固态芯片及其制备方法，所述SERS固态芯片包括：沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料作为衬底，所述M网/MO_x纳米线复合材料包括M网以及原位生长在M网网格上的MO_x纳米线阵列，其中M为Ti或Zn，1≤x≤2；形成在衬底表面的酰胺单分子层；以及吸附在酰胺单分子层表面的human ACE2‑His蛋白；所述human ACE2‑His蛋白和酰胺单分子层中酰胺基团的摩尔比为（0～1）:1。

Description

一种用于精准捕获和检测冠状病毒的SERS固态芯片及其制备 方法

技术领域

本发明提供了一种用于精准检测和快速检测冠状病毒的SERS固态芯片及其制备方法，可实现对COVID-19新冠病人尿液/唾液/污染水体中的SARS-CoV-2病毒进行高效检测，属于病毒检测与环境监测领域。

背景技术

表面增强拉曼散射(SERS)技术不仅具有拉曼(Raman)技术的高效、无损检测的优点，同时克服了Raman散射强度弱的缺点，使得被探测分子的某些拉曼散射信号峰得到极大的增强，可实现低浓度分子(甚至单分子)的拉曼信号探测，被广泛应用于环境分析、艺术和考古研究、生物大分子、药物和爆炸物检测等领域。SERS有两个重要的增强机理，分别为电磁增强(EM)和化学增强(CM)。当由入射光激发的局部表面等离子体共振(LSPR)引起强烈的局部电磁场增强时，EM起作用，而CM则被认为是衬底材料和探针分子之间的电荷转移(CT)过程与入射光发生共振从而产生的拉曼信号的增强。

SERS技术是将拉曼光谱与具有SERS活性的粗糙金属(例如银、金、铜)衬底相结合，而具有优异的表面等离子体共振效应(SPR)的金属粗糙衬底是实现良好增强探测的关键。为了得到性能优异的SERS衬底，必须构建大量的活性点位。活性点位往往存在于互相靠近的贵金属纳米颗粒间的位置，并且贵金属纳米颗粒间的距离越小，所构成的活性点位的活性越高，处于该活性点位的被探测分子其拉曼信号可以得到极大的增强。半导体的SERS性能往往不如贵金属，但其具有种类多样、生物相容性好以及多功能等优点。半导体SERS性能的提高主要有两种途径，一种为尺寸量子化，另一种为元素掺杂。其中，量子点具有极大的比表面积，有利于半导体吸附更多的探针分子，同时其拓宽的能带结构有可能促进半导体-探针分子之间的电荷转移，提高半导体的SERS性能。半导体材料与金属衬底复合，不仅可以利用半导体纳米线阵列实现对100纳米病毒的物理筛选，还能通过半导体的化学CM增强和金属的物理EM电磁增强来协同提高SERS性能。

目前很多已被报道的SERS材料检测病毒的通常只有对病毒的SERS增强作用，而不具备从复杂生物大分子环境中选择性检测特定病毒的捕获作用，特别是采用物理筛选手段和化学吸附机理共同增强对病毒的捕获手段还尚未见报道。SERS手段能实现对病毒的快速编辑高灵敏检测。但是，目前将SERS技术用于冠状病毒检测的研究还没有，因此开发用于COVID-19病人排泄体液及污染水体监测的SERS衬底以及SERS技术用于污水在线监测的设计与应用都具有显著的实际意义。

发明内容

为此，本发明的目的是提供一种可以通过物理尺寸筛选机制和化学特异吸附手段对冠状病毒进行精准捕获和富集的SERS固态芯片。

第一方面，本发明提供了一种SERS固态芯片，包括：

沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料作为衬底，所述M网/MO_x纳米线复合材料包括M网以及原位生长在M网网格上的MO_x纳米线阵列，其中M为Ti或Zn，1≤x≤2；

形成在衬底表面的酰胺单分子层；

以及吸附在酰胺单分子层表面的human ACE2-His蛋白(ACE2)；

所述human ACE2-His蛋白和酰胺单分子层中酰胺基团的摩尔比为(0～1):1。

在本公开中，选用沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料作为衬底，同时通过在衬底表面构筑酰胺/ACE2基团，制备得到SERS固态芯片。由于M网以及M网网格上的MO_x纳米线阵列协同作用使得在M网网格周围形成由MO_x纳米线堆积形成的纳米孔隙结构，可以用于精准捕获对应尺寸的冠状病毒。同时，SERS固态芯片表面ACE2蛋白可以与新冠病毒SARS-CoV-2表面的S蛋白强烈结合，因此该SERS固态芯片可以通过表面吸附的ACE2实现对SARS-CoV-2病毒的选择性捕获和富集。仅就酰胺单分子层而言，由于其表面存在正电荷，可以和ACE2-his表面所带负电荷产生强烈的静电吸引作用，从而将ACE-his固定在SERS固态芯片，使其相对于仅沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料，对冠状病毒的检测限就实现了很高的提升。

较佳的，所述MO_x纳米线的直径为20～50nm，长度为1～10μm，所述M网的网格间距为5～30μm。在本公开中，通过进一步调节M网网格密度以及生成的MO_x纳米线的直径和长度，实现对特定尺寸(50～150nm左右)的病毒的精准捕获与富集，从而实现从复杂水体环境中捕获该病毒。其中，当MO_x纳米线的直径和长度一定时，若是网格间距过大，MO_x纳米线难以实现对于每个网格的完全覆盖，降低了病毒的捕获几率；当网格间距过小时，虽然提高了SERS固态芯片对于该特定尺寸病毒的捕获几率，但是孔隙结构过小会对待测溶液存在一定的阻碍作用，反而导致纳米线的脱落。

又，较佳的，所述M网的每个网格中MO_x纳米线阵列形成≤150nm的孔隙结构，更优选≤100nm。

较佳的，所述贵金属层是由贵金属纳米颗粒堆积形成，厚度为20～40nm。

较佳的，所述贵金属纳米颗粒的粒径为15～30nm，颗粒间距＜1nm。

较佳的，所述酰胺单分子层为聚酰胺单分子层或硫代乙酰胺单分子层；所述聚酰胺单分子层的厚度≤5nm，所述硫代乙酰胺单分子层的厚度为≤2nm。

较佳的，所述human ACE2-His蛋白层中human ACE2-His蛋白和酰胺单分子层中酰胺基团的摩尔比为0.1～1:1，优选为0.3～1:1，更优选为0.5～1:1。

第二方面，本发明还提供了一种上述SERS固态芯片的制备方法，包括：

将沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料浸入硫代乙酰胺溶液中保持1～3小时后取出并干燥，再浸入ACE2的PBS溶液中保持5～30分钟后取出并干燥，得到所述SERS固态芯片；

或者，采用聚酰胺粉法对沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料进行酰胺化处理，再经过多次萃取和清洗后，再浸入ACE2的PBS溶液中保持5～30分钟后取出并干燥，得到所述SERS固态芯片。

在本公开中，通过浸渍硫代乙酸胺溶液法或聚酰胺粉法在沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料表面制备的得到一层酰胺单分子，该酰胺基团可以锚定在贵金属上，结合力较强。其中，聚酰胺单分子层的厚度≤5nm，硫代乙酰胺单分子层的厚度为≤2nm。然后将其在浸渍于ACE2的PBS溶液中保持5～30分钟，由于酰胺表面存在正电荷，可以和ACE2-his表面所带负电荷产生强烈的静电吸引作用，从而将ACE-his固定在酰胺单分子层上，最终得到SERS固态芯片。此时，ACE2通过一个中间酰胺才能锚定在贵金属层表面上，再从一堆蛋白中把新冠病毒选择性地挑出来。

较佳的，所述硫代乙酰胺溶液的溶剂为乙醇、PBS溶液中的至少一种，浓度为0.3～3.0mM；所述ACE2的PBS溶液中ACE2的浓度为2.38～23.8mg/L。在本发明中，human ACE2-His蛋白和酰胺基团达到饱和吸附的摩尔比为1:1，调节浸渍液中ACE2的PBS溶液的浓度和体积，也可制备得到ACE2不饱和吸附的SERS固态芯片，即ACE2-His蛋白和酰胺基团摩尔比小于1:1。而且，由于捕获冠状病毒主要是基于ACE2-His蛋白与S蛋白相结合，若是ACE2不饱和吸附，其检测限呈线性降低。

较佳的，所述沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料中贵金属层的制备方法包括柠檬酸还原法、磁控溅射或真空蒸镀法。

较佳的，当M为Ti时，所述Ti网/TiO₂纳米线复合材料的制备方法包括：

(1)将Ti网置于装有氢氧化钠溶液或/和氢氧化钾溶液的反应釜中在150℃下水热反应10～15小时，在Ti网网格的骨架上得到Na₂TiO₃纳米线或/和K₂TiO₃纳米线；

(2)然后浸泡在盐酸溶液中，在Na₂TiO₃纳米线或/和K₂TiO₃纳米线中的Na⁺或/和K⁺分别与H⁺的，后，在400～500℃(例如450℃)下退火1～3小时，得到所述Ti网/TiO₂纳米线复合材料。

较佳的，所述聚氨酯法包括：

(1)将聚酰胺粉体溶解于乙醇水溶液中，在30～50℃下搅拌并超声处理后，再以4000～8000转/分钟的转速离心处理5～10分钟，取上清液；优选地，所述聚酰胺粉体和乙醇水溶液的用量比为1g：20～100mL；

(2)将沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料浸入所得上清液中保持30～60分钟。

第三方面，本发明提供了一种上述SERS固态芯片在精准捕获和检测冠状病毒中的应用。

第四方面，本发明提供了一种用于精准捕获和检测冠状病毒的试剂盒，包括：沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料；硫代乙酰胺溶液；以及ACE2的PBS溶液。

较佳的，所述硫代乙酰胺溶液的溶剂为乙醇、PBS溶液中的至少一种，浓度为0.3～3.0mM；所述ACE2的PBS溶液中ACE2的浓度为2.38～23.8mg/L。进一步，每个试剂盒中，沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料、硫代乙酰胺溶液和ACE2的PBS溶液的用量为(1～10)g:(1～100)mL:(1～100)mL。

第四方面，本发明提供了一种用于精准捕获和检测冠状病毒的试剂盒，包括：酰胺化改性的沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料；以及ACE2的PBS溶液。其中，酰胺化改性的沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料，指的是表面分布有酰胺单分子层的沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料衬底。

较佳的，所述ACE2的PBS溶液中ACE2的浓度为2.38～23.8mg/L。进一步，每个试剂盒中，酰胺化改性的沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料和ACE2的PBS溶液的用量为(1～10)g:(1～100)mL。

有益效果：

本发明中，所制备的TiO₂纳米线阵列形成的孔隙结构大部分小于100nm，可以实现对尺寸为50～150nm的病毒的筛选；该固态芯片可以通过表面吸附的ACE2实现对SARS-CoV-2病毒的选择性捕获和富集。从而实现从复杂水体环境中捕获尺寸为50～150nm左右的病毒。同时实现对新冠病毒的快速、高灵敏探测。对COVID-19病人排泄液体及污染水体检测具有重要意义。

附图说明

图1为本发明中SERS固态芯片用于新冠病毒检测的设计示意图；

图2为实施例1中Ti网/TiO₂纳米线复合材料(a)和Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料(b)的SEM图，从图中(a)中可知TiO₂纳米线的直径为20～50nm，长度为1～10μm，且二氧化钛纳米线之间形成的孔隙结构大约在150nm以下，从图中(b)可知粒径为20nm的Au纳米颗粒分布在TiO₂纳米线表面形成Au层；

图3为本发明所得SERS固态芯片用于从人类尿液中捕获与检测假病毒检测限的SERS图谱，其中2.2×10⁶Tu/mL(紫色)、2.2×10⁴Tu/mL(蓝)、2.2×10²Tu/mL(红)、2.2×10Tu/mL(黑)。

具体实施方式

以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

如图1所示，本发明首次提出了利用SERS固态芯片复合材料实现对新冠假病毒及真病毒的SERS检测的理念，并首次经过实验验证可利用SERS固态芯片实现对新冠假病毒及真病毒的SERS检测。

以M为Ti、贵金属为Au作为示例，以下示例性地说明本发明提供的SERS固态芯片的制备方法。

在Ti网上利用溶剂热法制备TiO₂纳米线阵列，得到Ti网/TiO₂纳米线复合材料。其中，控制Ti网网格间距、与TiO₂纳米线的直径和长度，调节Ti网的网格内部的孔隙结构小于100nm，可实现对尺寸为50～150nm的病毒的物理筛选捕获。

作为一个制备TiO₂纳米线阵列的示例，包括：(1)选用Ti网作为原料。但是用的Ti网表面上一般具有一层致密的碳膜，需要利用稀释的氢氟酸和NaOH水溶液依次反复清洗多次，直到Ti网表面具有金属光泽为止，然后备用。(2)在Ti网上生长单晶的TiO₂纳米线：将一块2cm×2cm的Ti网置于聚四氟乙烯内衬(50ml)的高压反应釜中，并在反应釜中填充30ml的NaOH(2.5M)水溶液。将反应釜放在150℃的烘箱中反应15个小时后，在Ti骨架上得到一层Na₂TiO₃纳米线。将所得样品在1M的HCl溶液中反应1h，使纳米线中的Na⁺和溶液中的H⁺的交换完全。用去离子水将离子交换完成后的样品冲洗干净，并在450℃的马弗炉中退火2h，即在Ti骨架上得到TiO₂纳米线。其中，Ti网的网格间距为5～30μm，优选为5～20μm，更有选为5～10μm。NaOH溶液可替换成KOH溶液，也可替换成二者混合的溶液。

采用柠檬酸钠还原法、真空蒸镀法或磁控溅射法等在Ti网/TiO₂纳米线复合材料上沉积Au纳米颗粒形成Au层，以制备得到Au层/Ti网TiO₂纳米线复合材料。其中，控制Au纳米颗粒直径为15～30nm，Au层的厚度为20～40nm，其可通过热点效应实现SERS的增强。

作为一个柠檬酸钠还原法制备Au层的示例，包括：将Ti网/TiO₂纳米线复合材料放入100mL、浓度为1wt％的HAuCl₄溶液中。然后将38.8mM柠檬酸钠迅速加入到HAuCl₄溶液中，控制温度为70～90℃，并继续剧烈搅拌10～30min，使得金纳米颗粒在TiO₂纳米线表面沉积，直至形成Au层。其中，Au纳米颗粒的直径为20nm左右，Au颗粒的表面堆积密度达到间距小于1nm，所得Au层的厚度20～40nm。

作为一个磁控溅射法(替代柠檬酸钠还原法)制备Au层的示例，包括：选用Au作为靶材，通过调控沉积电流等，实现金纳米颗粒在TiO₂纳米线表面沉积，直至形成Au层。例如，固定溅射功率可为160～200W，沉积温度可为室温(例如，25℃)。其中，Au纳米颗粒的直径为20～40nm左右，Au颗粒的表面堆积密度达到间距小于1nm，所得Au层的厚度20～40nm。

在本公开中，通过半导体TiO₂纳米阵列的PICT电荷转移化学增强机制，和表面Au颗粒沉积形成Au层的热点增强效应，协同增强SERS，实现对病毒的高灵敏SERS检测。

Au层/Ti网TiO₂纳米线复合材料的表面改性，包括：酰胺化改性和ACE2吸附改性。

酰胺化改性。制备100μL～1000μL硫代乙酰胺的乙醇溶液(浓度为1mM)，将Au层/Ti网TiO₂纳米线复合材料浸入其中并保持1～3小时，使其表面形成硫代乙酰胺的酰胺单分子层，然后取出晾干。该酰胺单分子层的制备方法还可选用聚酰胺作为原料，采用聚酰胺粉法进行制备，得到聚酰胺的单分子层，其具体过程包括：将聚酰胺粉体溶解于乙醇水溶液中，在30～50℃下搅拌并在超声处理10～50分钟。然后再以4000～8000r/min转速离心5～10分钟后，取上层清液。然后将Au层/Ti网TiO₂纳米线复合材料浸渍于上层清液中保持30～60分钟，进行吸附处理。其中，聚酰胺粉体和乙醇水溶液的用量比可为1g：20～100mL。作为一个制备上层清液的示例，将1g聚酰胺粉体溶解于50mL乙醇水溶液，40℃搅拌并超声30分钟；将该溶液以6000r/min转速离心8分钟。经过高速离心后，部分聚酰胺分子发生断裂，且该断链酰胺部分形成上层清液。取上层清液用于后续酰胺化改性即可。

ACE2吸附改性。将经过酰胺化处理的Au层/Ti网TiO₂纳米线复合材料浸入ACE2(宿主细胞受体血管紧张素转化酶2)的PBS(磷酸缓冲盐)溶液中，保持浸入时间为10-30分钟，使其酰胺基团和ACE2达到1：1摩尔比的饱和吸附，最终得到SERS固态芯片。取出采用清水清洗。其中，ACE2的PBS(磷酸缓冲盐)溶液中ACE2的浓度为2.38～23.8mg/L。此外，本发明还可通过控制ACE2的PBS(磷酸缓冲盐)溶液的浓度和吸附时间实现ACE2和酰胺基团吸附摩尔比的在0.1～1之间的调节。

利用上述SERS固态芯片实现对新冠假病毒及真病毒的SERS检测。为安全起见对模拟COVID-19病人排泄尿液进行SERS固态芯片的检测。采用表达新冠病毒表面S蛋白的慢病毒改造的新冠假病毒，按照500～5000Tu/mL的病毒滴度加入健康人尿液，得到模拟COVID-19病人排泄尿液。然后将所得SERS固态芯片浸渍在模拟的COVID-19病人排泄尿液的尿检试管(10mL)中，进行摇晃几次使得固态芯片尽可能接触所有尿液。最后采用大型拉曼仪器(Ranishaw，Horiba等)或便携式拉曼仪器(B&W TEK公司的iRaman拉曼光谱仪等)开始采集信号，并输出污染物的SERS信号，参见图1。在图1中SERS图谱插图并无特定含义，其仅表示SERS固态芯片在完成冠状病毒吸附之后，可进行拉曼检测的步骤。

在本公开中，对于模拟COVID-19病人排泄尿液在线监测的要点在于，所采用的SERS固态芯片可以同时实现对新冠假病毒及真病毒的精准捕获和SERS检测。

在本公开中，贵金属纳米颗粒还可为Ag等。金属M网可为Zn等，以及MO_x纳米线阵列可以为ZnO等。

在本公开中，所得SERS固态芯片还可用于SRAS等其他冠状病毒等。

在可选的实施方式中，上述涉及“浸入”或“浸渍”等过程，若无特殊说明，一般是在室温下进行。该室温的温度可为0～30℃，优选为0～20℃。

在本发明一实施方式中，所得SERS固态芯片可在4℃条件下密封保存3周左右。但基于本发明中表面改性过程一般是在室温下便能实现，为了工业化生产和使用方便，可制备成试剂盒。例如，试剂盒包括：沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料；硫代乙酰胺溶液；以及ACE2的PBS溶液。在后续使用过程中，直接按照上述浸渍方法直接在室温下完成酰胺化改性和ACE2吸附改性，操作十分简便，再配合拉曼检测方法实现对冠状病毒的检测。

或者，试剂盒还可包括：酰胺化改性的沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料；ACE2的PBS溶液。在后续使用过程中，将上述酰胺化改性的沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料直接浸渍在ACE2的PBS溶液中，仅需室温下浸渍10～30分钟，便可直接用于测试，更加节省时间，再配合拉曼检测方法实现对冠状病毒的检测。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

首先将商用的Ti网(网格间距为5～10μm)表面上具有一层致密的碳膜，需要利用稀释的氢氟酸和NaOH水溶液依次反复清洗多次，直到Ti网表面具有金属光泽；

然后在Ti网上生长单晶的TiO₂纳米线：将一块2cm×2cm的Ti网置于50mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，并在反应釜中填充30mL的NaOH(2.5M)水溶液。将反应釜放在150℃的烘箱中反应15个小时后，在Ti骨架上得到一层Na₂TiO₃纳米线。将所得样品在1M的HCl溶液中反应1h，使纳米线中的Na⁺和溶液中的H⁺的完全交换。用去离子水将离子交换完成后的样品冲洗干净，并在450℃的马弗炉中退火2h，在Ti网骨架上得到TiO₂纳米线阵列，记为Ti网/TiO₂纳米线复合材料。

利用柠檬酸钠还原HAuCl₄的方法在TiO₂纳米线表面开始沉积Au纳米颗粒，以形成Au层。其制备过程如下：将Ti网/TiO₂纳米线复合材料放入HAuCl₄溶液(浓度1wt％，100mL)，然后将38.8mM柠檬酸钠迅速加入到HAuCl₄溶液中，温度为70℃，并继续剧烈搅拌15分钟，金纳米颗粒在TiO₂纳米线表面沉积，其直径为20nm左右。而且，Au纳米颗粒的表面堆积密度达到间距小于1nm，形成厚度20～40nm的Au层，记为Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料。

配制100μL～1000μL、浓度为1mM的硫代乙酰胺的乙醇溶液。将Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料(1～10g)浸入硫代乙酰胺的乙醇溶液中保持1～3小时，在其表面形成酰胺单分子层。取出晾干后，再浸入ACE2的PBS溶液(浓度为2.38～23.8mg/L，体积为1～100mL)中，控制浸入时间为10～30分钟，使其酰胺表面酰胺基团与ACE2达到1：1摩尔比的饱和吸附。最后取出，并采用清水清洗，得到SERS固态芯片。

利用SERS固态芯片实现对新冠假病毒及真病毒的SERS检测：

为安全起见，将所得SERS固态芯片，对模拟的COVID-19病人排泄尿液进行检测。采用表达新冠病毒表面S蛋白的慢病毒改造的新冠假病毒，按照100～5000Tu/mL的病毒滴度加入健康人尿液，得到模拟的COVID-19病人排泄尿液。将所得SERS固态芯片浸渍在模拟的COVID-19病人排泄尿液尿检试管(10mL)中，进行摇晃几次使得固态芯片尽可能接触所有尿液，将采用大型拉曼仪器开始采集信号，并输出污染物的SERS信号。所得SERS固态芯片对于新冠假病毒的检测限为22Tu/mL(参见图3，黑色)，灵敏度极高。

实施例2

配制100μL～1000μL、浓度为1mM的硫代乙酰胺乙醇溶液；

将实施例1中所得Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料仅浸入硫代乙酰胺乙醇溶液中保持1～3小时，使其表面形成酰胺单分子层。取出后采用清水清洗，得到SERS固态芯片。

仅经过浸入硫代乙酰胺乙醇溶液的SERS固态芯片，对于新冠假病毒检测限为2.2×10²Tu/mL(参见图3，红色线)。

实施例3

配制ACE2的PBS溶液，ACE2的浓度为2.38～23.8mg/L；

将实施例1中所得Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料直接浸入ACE2的PBS溶液中，浸入时间为10～30分钟。取出采用清水清洗，得到SERS固态芯片。

本实施例3所得SERS固态芯片，对于新冠假病毒的检测限为2.2×10⁴Tu/mL(图3，蓝色线)。没有酰胺化改性处理，Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料表面，不仅ACE2吸附量减少，且与Au层结合不强，导致后续测试过程中发生脱落，使本实施例3制备的SERS固态芯片的检测限甚至低于实施例2。

实施例4

首先将商用的Ti网(Ti网的网格间隙为100μm)表面表面上具有一层致密的碳膜，需要利用稀释的氢氟酸和NaOH水溶液依次反复清洗多次，直到Ti网表面具有金属光泽；

然后在Ti网上生长单晶的TiO₂纳米线：将一块2cm×2cm的Ti网置于50mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，并在反应釜中填充30mL的NaOH(2.5M)水溶液。将反应釜放在150℃的烘箱中反应15个小时后，在Ti骨架上得到一层Na₂TiO₃纳米线。将所得样品在1M的HCl溶液中反应1h，使纳米线中的Na⁺和溶液中的H⁺的完全交换。用去离子水将离子交换完成后的样品冲洗干净，并在450℃的马弗炉中退火2h，在Ti网骨架上得到TiO₂纳米线阵列，记为Ti网/TiO₂纳米线复合材料。

利用柠檬酸钠还原HAuCl₄的方法在TiO₂纳米线表面开始沉积Au纳米颗粒，以形成Au层。其制备过程如下：将Ti网/TiO₂纳米线复合材料放入HAuCl₄溶液(浓度1wt％，100mL)，然后将38.8mM柠檬酸钠迅速加入到HAuCl₄溶液中，温度为70℃，并继续剧烈搅拌15分钟，金纳米颗粒在TiO₂纳米线表面沉积，其直径为20nm左右。而且，Au纳米颗粒的表面堆积密度达到间距小于1nm，形成厚度20～40nm的Au层，记为Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料。

配制100μL～1000μL、浓度为1mM的硫代乙酰胺的乙醇溶液。将Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料(1～10g)浸入硫代乙酰胺的乙醇溶液中保持1～3小时，在其表面形成酰胺单分子层。取出晾干后，再浸入ACE2的PBS溶液(浓度为2.38～23.8mg/L，体积为1～100mL)中，控制浸入时间为10～30分钟，使其酰胺表面酰胺基团与ACE2达到1：1摩尔比吸附。最后取出，并采用清水清洗，得到SERS固态芯片。

将所得SERS固态芯片浸渍在模拟的COVID-19病人排泄尿液的尿检试管(10mL)中，进行摇晃几次使得固态芯片尽可能接触所有尿液，将采用大型拉曼仪器开始采集信号，并输出污染物的SERS信号。本次捕捉病毒数量不足，没有观察到稳定的SERS信号。这主要是由于Ti网网格间距过大，使TiO₂纳米线的长度不仅不能覆盖整个网格，而且在每个网格中间形成尺寸将近80μm×80μm的大孔结构，使得病毒大部分从该大孔结构中透过，难以形成稳定的SERS信号。

实施例5

在实施例1中所得Ti网/TiO₂纳米线复合材料表面，采用磁控溅射的方式进行Au层的制备，具体参数包括：固定溅射功率180W，沉积温度25℃，金纳米颗粒在TiO₂纳米线表面沉积，其直径为20～40nm左右，而且，由于采用磁控溅射Au纳米颗粒的表面堆积密度达到间距小于1nm，形成厚度20～40nm的致密Au层，记为Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料；

所得SERS固态芯片的其他制备步骤，参见实施例1。

将所得SERS固态芯片浸渍在模拟的COVID-19病人排泄尿液的尿检试管(10mL)中，进行摇晃几次使得固态芯片尽可能接触所有尿液，将采用大型拉曼仪器开始采集信号，并输出污染物的SERS信号。所得SERS固态芯片对于新冠假病毒的检测限为20～30Tu/mL，灵敏度极高。

实施例6

采用聚酰胺粉法在Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料表面制备聚酰胺单分子层，其制备过程包括：1g聚酰胺粉体溶解于50mL乙醇水溶液，在40℃搅拌并在超声处理30分钟；将该溶液以6000r/min转速离心8分钟后，取上层清液。将所得Au层/Ti网TiO₂纳米线复合材料(1g)浸渍于上层清液中保持30～60分钟。由于聚酰胺分子较大，需要经过多次萃取和清洗，才能制备得到厚度为5nm以下的聚酰胺单分子层，约在3nm以上。再浸入ACE2的PBS溶液(浓度为2.38～23.8mg/L，体积为1～10mL)中，控制浸入时间为10～30分钟，使其酰胺表面酰胺基团与ACE2达到1：1摩尔比的饱和吸附。最后取出，并采用清水清洗，得到SERS固态芯片。

将所得SERS固态芯片浸渍在模拟的COVID-19病人排泄尿液的尿检试管(10mL)中，进行摇晃几次使得固态芯片尽可能接触所有尿液，将采用大型拉曼仪器开始采集信号，并输出污染物的SERS信号。所得SERS固态芯片对于新冠假病毒的检测限为20～30Tu/mL，灵敏度极高。

实施例7

配制100μL～1000μL、浓度为1mM的硫代乙酰胺的乙醇溶液。将实施例1中所得Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料(1g)浸入硫代乙酰胺的乙醇溶液中保持1～3小时，在其表面形成酰胺单分子层。取出晾干后，再浸入ACE2的PBS溶液(浓度为2.38～12.0mg/L，体积100mL)中，控制浸入时间为10～30分钟，使其酰胺表面酰胺基团与ACE2达到2：1摩尔比吸附。最后取出，并采用清水清洗，得到SERS固态芯片。

将所得SERS固态芯片浸渍在模拟的COVID-19病人排泄尿液的尿检试管(10mL)中，进行摇晃几次使得固态芯片尽可能接触所有尿液，将采用大型拉曼仪器开始采集信号，并输出污染物的SERS信号。所得SERS固态芯片对于新冠假病毒的检测限为100Tu/mL。

实施例8

配制100μL～1000μL、浓度为1mM的硫代乙酰胺的乙醇溶液。将实施例1中所得Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料(1g)浸入硫代乙酰胺的乙醇溶液中保持1～3小时，在其表面形成酰胺单分子层。取出晾干后，再浸入ACE2的PBS溶液(浓度为2.38～6mg/L，体积100mL)中，控制浸入时间为10～30分钟，使其酰胺表面酰胺基团与ACE2达到约为10：1摩尔比的吸附。最后取出，并采用清水清洗，得到SERS固态芯片。

将所得SERS固态芯片浸渍在模拟的COVID-19病人排泄尿液的尿检试管(10mL)中，进行摇晃几次使得固态芯片尽可能接触所有尿液，将采用大型拉曼仪器开始采集信号，并输出污染物的SERS信号。所得SERS固态芯片对于新冠假病毒的检测限为200Tu/mL。

对比例1

本对比例1中直接采用实施例1制备的Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料浸渍在模拟的COVID-19病人排泄尿液的尿检试管(10mL)中，进行摇晃几次使得固态芯片尽可能接触所有尿液，将采用大型拉曼仪器开始采集信号，并输出污染物的SERS信号。所探测病毒浓度的检测限变差。

本对比例1中由于没有对Au层/Ti网/TiO₂纳米线复合材料进行表面改性，对假病毒的检测限为2.2×10⁶Tu/mL(图3，紫色线)。

Claims (14)

1.一种SERS固态芯片，其特征在于，包括：

沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料作为衬底，所述M网/MO_x纳米线复合材料包括M网以及原位生长在M网网格上的MO_x纳米线阵列，其中M为Ti或Zn，1≤x≤2；

形成在衬底表面的酰胺单分子层；

以及吸附在酰胺单分子层表面的human ACE2-His蛋白；

所述human ACE2-His蛋白和酰胺单分子层中酰胺基团的摩尔比为（0～1）:1。

2.根据权利要求1所述的SERS固态芯片，其特征在于，所述MO_x纳米线的直径为20～50nm，长度为1～10μm；所述M网的网格间距为5～30μm；

优选地，所述M网的每个网格中MO_x纳米线阵列形成≤150 nm的孔隙结构，更优选≤100nm。

3.根据权利要求1或2所述的SERS固态芯片，其特征在于，所述贵金属层是由贵金属纳米颗粒堆积形成，厚度为20～40 nm。

4.根据权利要求3所述的SERS固态芯片，其特征在于，所述贵金属纳米颗粒的粒径为15～30 nm，颗粒间距＜1nm。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的SERS固态芯片，其特征在于，所述酰胺单分子层为聚酰胺单分子层或硫代乙酰胺单分子层；所述聚酰胺单分子层的厚度≤5nm，所述硫代乙酰胺单分子层的厚度为≤2 nm。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的SERS固态芯片，其特征在于，所述human ACE2-His蛋白层中human ACE2-His蛋白和酰胺单分子层中酰胺基团的摩尔比为（0.1～1）:1，优选为0.5～1:1。

7.一种如权利要求1-6中任一项所述的SERS固态芯片的制备方法，其特征在于，包括：

将沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料浸入硫代乙酰胺溶液中保持1～3小时后取出并干燥，再浸入ACE2的PBS溶液中保持5～30分钟后取出并干燥，得到所述SERS固态芯片；

或者，采用聚酰胺粉法对沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料进行酰胺化处理，经过多次萃取和清洗后，再浸入ACE2的PBS溶液中保持5～30分钟后取出并干燥，得到所述SERS固态芯片。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述硫代乙酰胺溶液的溶剂为乙醇、PBS溶液中的至少一种，浓度为0.3～3.0 mM；所述ACE2的PBS溶液中ACE2的浓度为2.38～23.8 mg/L。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料中贵金属层的制备方法包括柠檬酸钠还原法、磁控溅射或真空蒸镀法。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的制备方法，其特征在于，当M为Ti时，所述Ti网/TiO₂纳米线复合材料的制备方法包括：

（1）将Ti网置于装有氢氧化钠/和氢氧化钾溶液的反应釜中在100～200℃下水热反应10～15小时，在Ti网网格的骨架上得到Na₂TiO₃纳米线或/和K₂TiO₃纳米线；

（2）然后浸泡在盐酸溶液中，在Na₂TiO₃纳米线或/和K₂TiO₃纳米线中的Na⁺或/和K⁺分别与H⁺的交换完全后，在400～500℃下退火1～3小时，得到所述Ti网/TiO₂纳米线复合材料。

11.根据权利要求7-10中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述聚氨酯法包括：

（1）将聚酰胺粉体溶解于乙醇水溶液中，在30～50℃下搅拌并超声处理后，再在4000～8000转/分钟的转速下离心处理5～10分钟，取上清液；

（2）将沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料浸入所得上清液中保持30～60分钟。

12.一种权利要求1-6中任一项所述的SERS固态芯片在精准捕获和检测冠状病毒中的应用。

13.一种用于精准捕获和检测冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括：

沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料；

硫代乙酰胺溶液；

ACE2的PBS溶液。

14.一种用于精准捕获和检测冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括：

酰胺化改性的沉积有贵金属层的M网/MO_x纳米线复合材料；

ACE2的PBS溶液。

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