KR20220136950A - 타겟 물질 검출 방법 및 시스템 - Google Patents

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KR20220136950A
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Abstract

본 발명은 타겟 물질 검출 방법 및 시스템에 관한 것으로, 타겟 물질을 정량하는데 있어, 타겟 물질을 직접적으로 정량하는 것이 아닌 타겟 물질에 비결합한 잔류 검출 물질들의 전기적 신호 변화를 측정하여 타겟 물질의 양을 정량할 수 있다. 상기와 같은 방법에 의해, 센서의 구성 및 장치 제작이 크게 간소화될 수 있고, 단백질이 분석도구, 센서 등에 흡착하여 일으키는 방해 문제를 최소화할 수 있다. 또한, 별도의 효소 반응을 이용한 신호 증폭 과정이 필요하지 않고, 정확한 분석 시스템을 제공할 수 있다.

Description

타겟 물질 검출 방법 및 시스템{METHOD AND SYSTEM FOR DETECTING TARGET MATERIAL}
본 발명은 타겟 물질 검출 방법 및 시스템에 관한 것이다.
기존의 면역분석장비로 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay; 효소결합면역흡착법)가 주로 상용화되고 되고 있다. ELISA 기법은 하나의 타겟에 결합하는 2종의 항체를 이용하는데, capture 항체(1차 항체)와 detection 항체(2차 항체) 사이의 타겟의 양을 측정하는 방법으로 항체쌍(antibody pair)이 확보가 된다면 거의 모든 단백질, 호르몬, 박테리아, 바이러스 등의 바이오마커를 포함한 타겟 물질을 정량적으로 검출할 수 있는 전통적이면서도 강력한 생물학적 분석 수단이다.
이 경우, 대부분 2차 항체에 결합된 효소(HRP, AP) 반응을 이용해 신호를 증폭하게 되는데, 표준물질의 보정곡선으로 보정을 하지만 결합 효소의 활성도가 온도 등의 환경적 요인과 시험자의 숙련도에 큰 영향을 받기 때문에 발색, 흡광, 형광 등의 검출 신호가 안정적이지 못하여 정밀 상용화 진단기기에 널리 활용되지 못하는 단점이 있다.
또한, 전기화학센서의 경우, 생체분자간의 결합, 분해 또는 반응을 특정 전기량(임피던스, 어드미턴스, 리액턴스, 레지스턴스 등)의 변화를 측정함으로써 분석할 수 있다. 분석 속도가 빠르고 소형화, 자동화에 하기에 유리하다는 장점으로 때문에 많은 상용화 바이오센서(혈당센서 등), 분석/진단기기가 이 분석방법을 채용하고 있다. 하지만, 대부분 직접적으로 혈액, 혈장, 혈청, 요, 타액 등을 포함하는 체액 시료를 직접 전극 센서에 담가 전기적 신호를 측정하는 방식을 택하고 있는데, 이런 경우 타겟 물질 이외의 물질에 의해 심각한 비특이적 흡착이 유발되어 전극 센서의 민감도와 분석적 성능이 심하게 저하되게 된다는 단점이 있다.
이에, 기존 ELISA와 전기화학센서의 장점을 모두 포함하면서도 두 분석기법(또는 시스템)의 단점을 극복할 수 있는 바이오센서 및 분석 시스템에 대한 연구가 필요하다.
한국등록특허 제 1790088호
본 발명은 타겟 물질 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 타겟 물질 검출 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 제1 캡쳐 및 이에 결합된 2종의 타겟 물질을 포함하는 용액에 상기 타겟 물질 중 1종에 결합하는 제2 캡쳐를 가하여, 제2 캡쳐 중 적어도 일부를 상기 타겟 물질에 결합시키는 단계;
상기 용액 내 전극에 상기 제2 캡쳐 중 나머지를 결합시켜, 결합 전후의 제1 전기적 신호 변화를 측정하는 단계;
상기 타겟 물질 중 나머지 1종에 결합하는 제3 캡쳐를 가하여, 제3 캡쳐 중 적어도 일부를 상기 타겟 물질에 결합시키는 단계; 및
상기 용액 내 전극에 상기 제3 캡쳐 중 나머지를 결합시켜, 결합 전후의 제2 전기적 신호 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 타겟 물질의 검출 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 제1 캡쳐는 2종의 캡쳐를 포함하고, 상기 각 종의 타겟 물질은 각 종의 캡쳐에 각각 결합된 것인 타겟 물질의 검출 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 타겟 물질은 핵산, 펩타이드, 단백질, 세포, 호르몬, 비타민, 지질, 저분자 리간드, 박테리아 및 바이러스 중 어느 하나인, 타겟 물질의 검출 방법.
4. 위 1에 있어서, 상기 타겟 물질은 타우(tau) 단백질, 인산화 타우(phosphorylated tau) 181, 인산화타우 217, 인산화타우 231, N protein, S protein, E protein, M protein, 아밀로이드 베타 40, 아밀로이드 베타 42, 아밀로이드 베타 43, 아밀로이드 베타 45, 아밀로이드 베타 48 및 이들의 올리고머로 이루어진 군에서 선택된 2종인, 타겟 물질의 검출 방법.
5. 위 1에 있어서, 제1, 제2 및 제3 캡쳐는 서로 독립적으로 압타머, DNA, RNA, 단백질, 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 타겟 물질의 검출 방법.
6. 위 1에 있어서, 상기 전극은 제2 및 제3 캡쳐에 결합하는 물질로 코팅된 것인, 타겟 물질의 검출 방법.
7. 위 1에 있어서, 상기 전기적 신호는 임피던스(impedance), 어드미턴스(admittance), 저항(resistance), 전도도(conductivity), 위상(phase), 리액턴스(reactance) 및 서셉턴스(susceptance)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 방법.
8. 위 1에 있어서, 상기 결합 전후의 전기적 신호 변화 정도로 타겟 물질의 양을 정량적으로 검출하는, 타겟 물질의 검출 방법.
9. 위 1에 있어서, 상기 제1 및 제2 전기적 신호 변화의 비로 2종의 타겟 물질의 함량비를 정량적으로 검출하는, 타겟 물질의 검출 방법.
10. 위 1에 있어서, 상기 제2 캡쳐를 가하기 전에, 제1 캡쳐에 2종의 타겟 물질을 포함하는 액상 시료를 가하여, 상기 제1 캡쳐에 상기 타겟 물질을 결합시키는 단계를 더 포함하는, 타겟 물질의 검출 방법.
11. 위 10에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 척수액, 뇌 균질액, 림프액, 타액, 뇨, 땀, 정액 또는 콧물인, 타겟 물질의 검출 방법.
12. 위 10에 있어서, 상기 제1 캡쳐에 상기 타겟 물질을 결합시킨 후 세척하여, 시료 중 나머지 물질을 제거하는 단계를 더 포함하는, 타겟 물질의 검출 방법.
13. 타겟 물질에 결합하는 제1 캡쳐가 고정된 용기를 포함하는 캡쳐부; 상기 용기에 가해지는 제2 및 제3 캡쳐; 상기 제2 및 제3 캡쳐와 결합하는 물질이 각각 코팅된 전극부; 및 상기 전극부에서 입출력되는 제1 전기적 신호 및 제2 전기적 신호를 측정하는 신호 측정부;를 포함하는 타겟 물질의 검출 시스템.
14. 위 13에 있어서, 상기 제1 캡쳐는 2종의 타겟 물질에 각각 결합하는 2종의 캡쳐를 포함하는 타겟 물질의 검출 시스템.
본 발명은 타겟 물질에 비결합한 잔류 검출물질의 전극에의 결합에 따른 전기적 신호 변화를 측정하여 정량함으로써 센서의 구성 및 장치 제작을 간소화하였다.
또한, 본 발명은 한 개의 샘플로부터 다중의 바이오마커를 검출하여 정량할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 타겟 물질을 검출하기 위한 일련의 과정을 그림으로 나타낸 것이다.
도 2는 실시간 어드미턴스의 변화를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. △Y1은 첫번째 2차 항체에 의한 어드미턴스의 변화량이고, △Y2은 두번째 2차 항체의 변화량이다.
도 3은 어드미턴스의 변화를 측정한 후, 표준화 지수 간의 상관관계를 분석하여 수신자 조작 특성(ROC)을 그래프로 나타낸 것이다. 아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40의 검출비를 이용하여 치매 임상진단 결과와 비교할 때 당 기술에 의한 알츠하이머병 치매 진단의 임상유효성은 0.735로 확인되었다.
도 4는 어드미턴스의 변화를 측정한 후, 이로부터 도출된 표준화 지수 및 진단 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40의 검출비를 이용하여 치매 관련 임상진단 결과와 비교할 때, 당 기술에 의한 임상유효성은, 시료가 혈장인 경우 AD 치매는 0.82, 경도인지장애는 0.78 및 무증상 AD는 0.83으로 분석되었고, 콧물인 경우 AD 치매는 0.73, 경도인지장애는 0.66으로 분석되었다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 타겟 물질의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 제1 캡쳐 및 이에 결합된 2종의 타겟 물질을 포함하는 용액에 상기 타겟 물질 중 1종에 결합하는 제2 캡쳐를 가하여, 제2 캡쳐 중 적어도 일부를 상기 타겟 물질에 결합시키는 단계를 포함한다.
제1 캡쳐는 타겟 물질에 결합하는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 압타머, DNA, RNA, 단백질, 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
단백질은 예를 들면 항체일 수 있다.
본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본원의 목적상, 항체는 상기 마커 단백질인 NMI에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다.
상기 모노클로날 항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리기술을 이용하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 폴리클로날 항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 것을 포함하는, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
또한, 본 발명에서 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다.
상기 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
상기 "압타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 압타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
상기 타겟 물질은 핵산, 펩타이드, 단백질, 세포, 호르몬, 비타민, 지질, 저분자 리간드, 박테리아 및 바이러스 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 타우(tau) 단백질, 인산화 타우(phosphorylated tau) 181, 인산화타우 217, 인산화타우 231, N protein, S protein, E protein, M protein, 아밀로이드 베타(amyloid beta) 40, 아밀로이드 베타 42, 아밀로이드 베타 43, 아밀로이드 베타 45, 아밀로이드 베타 48 및 이들의 올리고머, IgN, IgG 등일 수 있고, 상기 N protein, S protein, E protein, M protein은 SARS-CoV-2의 protein일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
타겟 물질이 핵산인 경우, 예를 들어, 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 '프라이머'란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 "프로브"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
타겟 물질이 박테리아인 경우, 예를 들어, 스타필로코커스(Staphylococcus), 바실러스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 마이코박테리움(Mycobacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 뉴모코커스(Pneumococcus), 살모넬라(Salmonella), 캄필로박터(Campylobacter), 에스케리치아(Eschrichia), 비브리오(Vibrio), 시겔라(Shigella), 슈도모나스 (Pseudomonas), 또는 클로스트리디아(Clostridia) 속(genus)의 박테리아일 수 있다.
타겟 물질이 바이러스인 경우, 예를 들어 헤르페스바이러스(herpesvirus), 폭스바이러스(poxvirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 토가바이러스(togavirus), 코로나 바이러스(coronavirus), 헤파티티스 D(hepatitis D), 오소믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 랍도바이러스(rhabdovirus), 분야바이러스(bunyavirus), 필로바이러스(filovirus) 및 레트로바이러스(retrovirus) 등일 수 있다.
상기 제1 캡쳐는 2종의 타겟 물질과 모두 결합하는 것이며, 1종의 캡쳐가 제1 캡쳐로서 상기 2종의 타겟 물질과 결합할 수도 있고, 2종의 캡쳐가 제1 캡쳐로서 상기 2종의 타겟 물질에 각각 결합할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제1 캡쳐는 용액 내에 있는 것으로서, 예를 들면 제1 캡쳐는 용액이 채워진 용기에 고정된 것일 수 있다. 상기 용기는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 웰 플레이트일 수 있다.
용액의 액체(용매)는 타겟 물질 및 캡쳐의 구조적인 변형, 손상을 유발하는 것이 아니라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid) 버퍼, Tris 버퍼, PBS(Phosphate buffered saline) 버퍼, MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 버퍼 등 일 수 있다.
이후, 상기 용액 내 전극에 상기 제2 캡쳐 중 나머지를 결합시켜, 결합 전후의 제1 전기적 신호 변화를 측정한다.
상기 전극은 제2 캡쳐가 결합하는 물질로 코팅된 것일 수 있다.
상기 코팅 물질은 제2 캡쳐의 종류에 따라 상이할 수 있으며, 예를 들어, protein A, protein G, protein Z, protein L을 포함한 단백질, 압타머, 펩타이드, DNA, RNA, 저분자 리간드 등으로 코팅될 수 있다.
제2 캡쳐가 항체인 경우에는 예를 들어, 전극은 Protein G로 코팅된 것일 수 있다.
제2 캡쳐 중 타겟 물질에 결합되지 않은 제2 캡쳐는 상기 전극에 결합되어 제1 전기적 신호 변화를 유도할 수 있다.
상기 전기적 신호는 모든 전기적 파라미터를 제한없이 일컫는 것으로, 임피던스(impedance), 어드미턴스(admittance), 저항(resistance), 전도도(conductivity), 위상(phase), 리액턴스(reactance) 및 서셉턴스(susceptance)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
제2 캡쳐가 가해지면, 제2 캡쳐의 적어도 일부가 타겟 물질에 결합하고, 타겟 물질에 결합되지 않은 제2 캡쳐는 전극에 결합되는데, 이 때, 제2 캡쳐가 전극에 결합한 직후부터 모든 제2 캡쳐가 전극에 완전히 결합될 때 까지 전기적 신호가 변화된다. 즉, 제2 캡쳐를 가한 직후부터 제2 캡쳐가 전극에 결합을 완료할 때까지 전기적 신호가 실시간으로 변화하게 된다.
따라서, 제2 캡쳐를 가하고 타겟 물질에 결합되지 않은 제2 캡쳐가 전극에 결합하여 발생하는 제1 전기적 신호 변화를 측정하여, 그 변화 정도로 시료 내 타겟 물질의 양을 판단할 수 있다.
제1 전기적 신호 변화는 제2 캡쳐가 전극에 결합하기 전과 결합이 완료된 후의 그 변화 정도를 측정하는 것이거나, 제2 캡쳐가 전극에 결합하기 전, 결합 중 결합이 완료된 이후의 그 변화 정도를 각각 측정하는 것이거나, 제2 캡쳐가 전극에 결합하기 전부터 제2 캡쳐의 결합이 완료될 때까지 실시간으로 그 변화 정도를 측정하는 것일 수 있다.
예를 들어, 제2 캡쳐가 전극에 결합하기 전후의 전기적 신호 변화가 클수록 시료 내 타겟 물질의 양이 적은 것으로 판단할 수 있다. 이는, 타겟 물질의 양이 많은 경우, 용기에 가해진 제2 캡쳐 중 타겟 물질에 결합하는 제2 캡쳐가 증가하고, 잔류하는 제2 캡쳐의 양이 적으므로, 전극에 결합되는 제2 캡쳐의 양이 적어 제2 캡쳐가 전극에 결합하기 전후의 전기적 신호 변화는 적은 것이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 전기적 신호로 임피던스를 측정하는 경우, 타겟 물질의 양이 많은 경우, 용기에 가해진 제2 캡쳐 중 타겟 물질에 결합하는 제2 캡쳐가 증가하여, 전극에 결합되는 제2 캡쳐의 양이 적으므로, 제2 캡쳐가 결합하기 전과 후의 임피던스 변화는 적다.
이후, 상기 타겟 물질 중 나머지 1종에 결합하는 제3 캡쳐를 가하여, 제3 캡쳐 중 적어도 일부를 상기 타겟 물질에 결합시킨다.
상기 제3 캡쳐는 2종의 타겟 물질 중, 상기 제2 캡쳐에 결합하지 않은 1종의 타겟 물질이 결합할 수 있는 캡쳐를 의미하는 것이다.
상기 제3 캡쳐를 가하면, 제3 캡쳐에 결합할 수 있는 상기 1종의 타겟 물질의 적어도 일부가 상기 제3 캡쳐에 결합하게 되고, 결합하지 않은 상기 타겟 물질은 용액에 남아있을 수 있다.
이후, 상기 용액 내 전극에 상기 제3 캡쳐 중 나머지를 결합시켜, 결합 전후의 제2 전기적 신호 변화를 측정한다.
상기 전극은 제3 캡쳐가 결합하는 물질로 코팅된 것일 수 있다.
상기 코팅 물질은 제3 캡쳐의 종류에 따라 상이할 수 있으며, 예를 들어, protein A, protein G, protein Z, protein L을 포함한 단백질, 압타머, 펩타이드, DNA, RNA, 저분자 리간드 등으로 코팅될 수 있다.
제3 캡쳐가 항체인 경우에는 예를 들어, 전극은 Protein G로 코팅된 것일 수 있다.제3 캡쳐 중 타겟 물질에 결합되지 않은 제3 캡쳐는 상기 전극에 결합되어 제2 전기적 신호 변화를 유도할 수 있다.
상기 전기적 신호는 모든 전기적 파라미터를 제한없이 일컫는 것으로, 임피던스(impedance), 어드미턴스(admittance), 저항(resistance), 전도도(conductivity), 위상(phase), 리액턴스(reactance) 및 서셉턴스(susceptance)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
제3 캡쳐가 가해지면, 제3 캡쳐의 적어도 일부가 타겟 물질에 결합하고, 타겟 물질에 결합되지 않은 제3 캡쳐는 전극에 결합되는데, 이 때, 제3 캡쳐가 전극에 결합한 직후부터 모든 제3 캡쳐가 전극에 완전히 결합될 때 까지 전기적 신호가 변화된다. 즉, 제3 캡쳐를 가한 직후부터 제3 캡쳐가 전극에 결합을 완료할 때까지 전기적 신호가 실시간으로 변화하게 된다.
따라서, 제3 캡쳐를 가하고 타겟 물질에 결합되지 않은 제3 캡쳐가 전극에 결합하여 발생하는 제2 전기적 신호 변화를 측정하여, 그 변화 정도로 시료 내 타겟 물질의 양을 판단할 수 있다.
제2 전기적 신호 변화는 제3 캡쳐가 전극에 결합하기 전과 결합이 완료된 후의 그 변화 정도를 측정하는 것이거나, 제3 캡쳐가 전극에 결합하기 전, 결합 중 결합이 완료된 이후의 그 변화 정도를 각각 측정하는 것이거나, 제3 캡쳐가 전극에 결합하기 전부터 제3 캡쳐의 결합이 완료될 때까지 실시간으로 그 변화 정도를 측정하는 것일 수 있다.
예를 들어, 제3 캡쳐가 전극에 결합하기 전후의 전기적 신호 변화가 클수록 시료 내 타겟 물질의 양이 적은 것으로 판단할 수 있다. 이는, 타겟 물질의 양이 많은 경우, 용기에 가해진 제3 캡쳐 중 타겟 물질에 결합하는 제3 캡쳐가 증가하고, 잔류하는 제3 캡쳐의 양이 적으므로, 전극에 결합되는 제3 캡쳐의 양이 적어 제3 캡쳐가 전극에 결합하기 전후의 전기적 신호 변화는 적은 것이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 전기적 신호로 임피던스를 측정하는 경우, 타겟 물질의 양이 많은 경우, 용기에 가해진 제3 캡쳐 중 타겟 물질에 결합하는 제3 캡쳐가 증가하여, 전극에 결합되는 제3 캡쳐의 양이 적으므로, 제3 캡쳐가 결합하기 전과 후의 임피던스 변화는 적다.
본 발명에서 제1, 제2 및 제3 캡쳐는 서로 독립적으로 압타머, DNA, RNA, 단백질, 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명에서 전극은 제2 및 제3 캡쳐에 결합하는 물질로 코팅된 것일 수 있고, 제2 및 제3 캡쳐에 결합하는 물질 외에 추가 코팅 물질을 포함할 수 있다. 상기 제2 및 제3 캡쳐에 결합하는 물질은 동일한 물질일 수도 있고, 상이한 2종 이상의 물질일 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 전기적 신호는 임피던스(impedance), 어드미턴스(admittance), 저항(resistance), 전도도(conductivity), 위상(phase), 리액턴스(reactance) 및 서셉턴스(susceptance)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 검출 방법은 상기 제1 및 제2 전기적 신호 변화의 비로 2종의 타겟 물질의 함량비를 정량적으로 검출하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 단계를 통해 확인한 제1 전기적 신호 변화 및 제2 전기적 신호 변화가 동일 종류일 경우, 제1 및 제2 전기적 신호 변화의 비를 계산하여 상기 2종의 타겟 물질의 함량비를 정량적으로 검출할 수 있다. 예를 들어, 2종의 타겟 물질이 각각 아밀로이드 베타(Aβ) 40 및 아밀로이드 베타(Aβ) 42인 경우, 상기 방법에 의해 계산된 Aβ42/Aβ40의 농도비는 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
상기 전기적 신호가 임피던스인 경우, 제1 임피던스 변화량 및 제2 임피던스 변화량을 비율로 계산하여, 상기 계산한 비율에 따라 2종의 타겟 물질의 함량비를 정량적으로 검출하여 타겟 물질이 종류에 따라 얼마나 포함되어 있는지를 확인할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명의 검출 방법은 상기 제2 캡쳐를 가하기 전에, 제1 캡쳐에 2종의 타겟 물질을 포함하는 액상 시료를 가하여, 상기 제1 캡쳐에 상기 타겟 물질을 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
시료는 개체로부터 분리된 것으로, 타겟 물질을 포함하는 액상 혼합물일 수 있다. 시료는 예를 들어, 혈액, 혈장, 척수액, 뇌 균질액, 림프액, 타액, 뇨, 땀, 정액 또는 콧물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시료에 포함되는 2종의 타겟 물질은 제1 캡쳐에 결합할 수 있다.
액상 시료를 사용함에 의해 타겟 물질이 제1 캡쳐와 잘 결합될 수 있고, 그 용액 내 캡쳐, 타겟 물질들의 이동이 용이할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 제1 캡쳐에 상기 타겟 물질을 결합시킨 후 세척하여, 시료 중 나머지 물질을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 단계에서 세척은 용기에 용액 상태 등으로 남아있는 제1 캡쳐에 결합하지 않은 물질을 제거하는 과정으로, 상기 단계 이후, 제2 캡쳐 첨가 시 제2 캡쳐와 타겟 물질의 결합을 용이하게 할 수 있고, 전극에 제2 캡쳐 외의 다른 물질이 결합되는 것을 방지하여 전기적 신호 측정의 안정성 및 정확성을 높일 수 있다.
상기 세척은 시료 중 1차 캡쳐에 결합하지 않은 물질에 액체를 가하여 씻어냄으로써 수행될 수 있다. 상기 액체는 예를 들면, 탈이온수, PBS(Phosphate buffered saline) 버퍼, MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 버퍼, 계면활성제 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 계면활성제는 타겟물질 및 캡쳐의 구조적인 변형, 손상을 유발하는 것이 아니라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 트윈계 계면활성제를 들 수 있고, 구체적으로 Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Tween 81, 트리톤 X계 Triton X-100 등을 들 수 있다. 상기 계면활성제는 물(예를 들면 탈이온수)에 희석하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 타겟 물질에 결합하는 제1 캡쳐가 고정된 용기를 포함하는 캡쳐부; 상기 용기에 가해지는 제2 및 제3 캡쳐; 상기 제2 및 제3 캡쳐와 결합하는 물질이 각각 코팅된 전극부; 및 상기 전극부에서 입출력되는 제1 전기적 신호 및 제2 전기적 신호를 측정하는 신호 측정부;를 포함하는 타겟 물질의 검출 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 시스템은 캡쳐부, 제2 및 제3 캡쳐, 전극부, 신호 측정부를 포함한다.
캡쳐부는 타겟 물질에 결합하는 제1 캡쳐가 고정된 용기를 포함한다.
상기 타겟 물질, 제1 캡쳐는 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 제1 캡쳐는 2종의 타겟 물질이 모두 결합할 수 있는 1종의 캡쳐를 포함할 수 있고, 2종의 타겟 물질이 각각 결합하는 2종의 캡쳐를 포함할 수 있다.
상기 용기는 전술한 액체가 채워질 수 있다.
캡쳐부에는 타겟 물질을 포함하는 시료가 가해질 수 있고, 그에 따라 시료에 포함된 타겟 물질이 제1 캡쳐와 결합할 수 있다.
제2 및 제3 캡쳐는 2종의 타겟 물질에 각각 결합하는 것으로, 제1 캡쳐와 2종의 타겟 물질이 결합한 후, 제1 캡쳐 및 2종의 타겟 물질이 결합된 용기에 가해진다.
제2 및 제3 캡쳐는 전술한 바와 같다.
용기에 가해진 제2 캡쳐 중 적어도 일부는 1종의 타겟 물질과 결합할 수 있다.
본 발명의 시스템은 제2 캡쳐와 결합하는 물질로 코팅된 전극부를 포함한다.
제2 캡쳐와 결합하는 물질은 전술한 바와 같다.
제2 캡쳐 중 타겟 물질에 결합되지 않은 제2 캡쳐는 전극부에 결합된다.
신호 측정부는 전극부에서 입출력되는 전기적 신호를 측정한다.
신호 측정부는 제2 캡쳐가 가해진 후부터 제2 캡쳐가 전극부에 모두 결합될 때까지의 전기적 신호 변화를 측정할 수 있다.
용기에 제2 캡쳐가 가해지면 제2 캡쳐의 적어도 일부가 1종의 타겟 물질에 결합하고, 타겟 물질에 결합되지 않은 제2 캡쳐는 전극에 결합되는데, 이때, 신호 측정부는 제2 캡쳐가 전극에 결합한 직후부터 가해준 모든 제2 캡쳐가 전극에 완전히 결합될 때까지 전기적 신호 변화인 제1 전기적 신호 변화를 측정할 수 있다.
따라서, 신호 측정부로부터 측정된 전기적 신호 변화 정도로 시료 내 타겟 물질의 양을 판단할 수 있다.
상기 제1 전기적 신호 변화는 제2 캡쳐가 전극에 결합하기 전과 결합이 완료된 후의 그 변화 정도를 측정하는 것이거나, 제2 캡쳐가 전극에 결합하기 전, 결합 중일 때 및 결합이 완료 된 때의 그 변화 정도를 각각 측정하는 것이거나, 제2 캡쳐가 전극에 결합하기 전부터 제2 캡쳐의 결합이 완료될 때까지 실시간으로 그 변화 정도를 측정하는 것일 수 있다.
용기에 가해진 제3 캡쳐 중 적어도 일부는 상기 제2 캡쳐와 결합하지 않은 나머지 1종의 타겟 물질과 결합할 수 있다.
본 발명의 시스템은 제3 캡쳐와 결합하는 물질로 코팅된 전극부를 포함한다.
제3 캡쳐와 결합하는 물질은 전술한 바와 같다.
제3 캡쳐 중 타겟 물질에 결합되지 않은 제3 캡쳐는 전극부에 결합된다.
신호 측정부는 전극부에서 입출력되는 전기적 신호를 측정한다.
신호 측정부는 제3 캡쳐가 가해진 후부터 제3 캡쳐가 전극부에 모두 결합될 때까지의 전기적 신호 변화를 측정할 수 있다.
용기에 제3 캡쳐가 가해지면 제3 캡쳐의 적어도 일부가 제2 캡쳐와 결합하지 않은 나머지 1종의 타겟 물질에 결합하고, 타겟 물질에 결합되지 않은 제3 캡쳐는 전극에 결합되는데, 이때, 신호 측정부는 제3 캡쳐가 전극에 결합한 직후부터 가해준 모든 제3 캡쳐가 전극에 완전히 결합될 때까지 전기적 신호 변화인 제2 전기적 신호 변화를 측정할 수 있다.
따라서, 신호 측정부로부터 측정된 전기적 신호 변화 정도로 시료 내 타겟 물질의 양을 판단할 수 있다.
상기 제2 전기적 신호 변화는 제3 캡쳐가 전극에 결합하기 전과 결합이 완료된 후의 그 변화 정도를 측정하는 것이거나, 제3 캡쳐가 전극에 결합하기 전, 결합 중일 때 및 결합이 완료 된 때의 그 변화 정도를 각각 측정하는 것이거나, 제3 캡쳐가 전극에 결합하기 전부터 제3 캡쳐의 결합이 완료될 때까지 실시간으로 그 변화 정도를 측정하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1. 캡쳐 항체(2차 항체)의 순차적 검출
순차적으로 2가지 종류의 캡쳐 항체를 순차적으로 검출하기 위하여 비특이적 흡착을 방지할 수 있는 96웰 마이크로플레이트를 다음과 같은 방법으로 준비하였다.
96웰 마이크로플레이트에 0.1% BSA(bovine serum albumin) 용액 200㎕ 넣은 후 1시간 정치 시켰다. 역시 PBS와 PBST(PBS with 0.1% Tween 20)로 세척한 후 사용하기 전까지 PBS를 담가두었다.
상기와 같이 준비된 96웰 마이크로플레이트를 이용하여 2 가지 종류의 캡처 항체(아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40에 선택적으로 각각 결합하는 12F4 및 11A50 단클론항체)를 순차적으로 검출하는 방법은 다음과 같다.
10ng/mL 농도의 첫번째 2차 항체 12F4 용액(PBS, pH 7.4) 200㎕를 BSA로 처리된 마이크로 플레이트에 투입한 후 1시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 그 후 전극 센서를 투입하여 실시간으로 어드미턴스의 변화(△Y1)를 측정하고, 측정이 끝나면 PBS 용액으로 교체하여 1시간(30분×2회) 안정화 단계를 통해 센서 전극을 안정화하였다.
첫 번째 항체와 마찬가지로 10ng/mL의 두 번째 2차 항체 11A50 용액(PBS, pH 7.4) 200㎕)를 BSA로 처리된 마이크로 플레이트에 투입한 후 1시간 동안 인큐베이션하였다. 안전화 된 IME 전극 센서를 투입하여 실시간으로 어드미턴스의 변화(△Y2)를 측정한다. 실시간 어드미턴스 변화는 도 2에 나타내었다.
실시예 2. 혈장 분석을 통한 아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40의 검출 및 데이터 표준화(standardization)
아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40을 동시에 검출할 수 있는 1차 항체(6E10)가 고정된 96웰 마이크로플레이트를 준비하는 과정은 다음과 같다.
먼저, 2~5㎍/㎖ 의 1차 항체 200㎕(PBS 1×, pH 7.4))를 96웰 마이크로플레이트 투입한 후 2시간 동안 흡착시켰다. 2시간 후 PBS와 PBST(PBS with 0.1% Tween 20)로 세척한 후 비특이적 흡착을 막기 위해 0.1% BSA(bovine serum albumin) 용액 200㎕ 넣은 후 1시간 정치 시켰다. 역시 PBS와 PBST(PBS with 0.1% Tween 20)로 세척하였다.
상기와 같이 준비된 1차 항체가 고정된 96웰 마이크로플레이트를 이용하여 혈장의 아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40의 농도를 측정하는 과정은 다음과 같다.
-80℃에서 보관된 혈장 100㎕를 상온에서 30분 동안 천천히 녹인 후 PBS 110㎕로 희석하였다. 그 중 200㎕를 1차 항체가 고정된 96웰 마이크로플레이트에 투입한 후 항원-항체 반응을 시켰다. 1시간 후 PBS와 PBST(PBS with 0.1% Tween 20)로 세척하여 비특이적 단백질 등을 제거 하였다.
상기와 같이 아밀로이드 베타를 캡처한 96웰 마이크로플레이트로부터 아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40을 각각의 2차 항체(12F4 및 11A50 단클론항체)로 각각 검출하는 방법은 다음과 같다.
10ng/mL 농도의 첫번째 2차 항체(detection antibody)인 12F4 용액(PBS, pH 7.4) 200㎕를 상기 마이크로플레이트에 투입한 후 1시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 그 후 전극 센서를 투입하여 실시간으로 어드미턴스의 변화(△Y1)를 측정하고, 측정이 끝나면 PBS 용액으로 교체하여 1시간(30분×2회) 안정화 단계를 통해 센서 전극을 안정화 하였다.
첫 번째 2차 항체와 마찬가지로 10ng/mL의 두 번째 2차 항체 11A50 용액(PBS, pH 7.4, 200㎕)를 상기 마이크로플레이트에 투입한 후 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 안정화 된 IME 전극 센서를 투입하여 실시간으로 어드미턴스의 변화(△Y2)를 측정한 후 PBS 용액으로 교체하여 전극 센서를 안정화 하였다.
상기에서 측정된 △Y1, △Y2, 이 수치로부터 도출된 표준화 지수(standardized index, △Y1/△Y2) 및 진단 결과를 표 1에 표준화 지수 간의 상관관계를 분석한 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic 커브, ROC 커브)을 도 3에 나타내었다. 진단 유효성은 ROC의 area under curve(AUC)로 계산했을 때 0.735였다.
Figure pat00001
실시예 3. 혈장 및 콧물의 암맹 분석을 통한 아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40의 검출 및 데이터 표준화
아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40을 동시에 검출할 수 있는 1차 항체(6E10)가 고정된 96웰 마이크로플레이트를 준비하는 과정은 다음과 같다.
먼저, 2~5㎍/㎖ 의 1차 항체 200㎕(PBS 1×, pH 7.4))를 96웰 마이크로플레이트 투입한 후 2시간 동안 흡착시켰다. 2시간 후 PBS와 PBST(PBS with 0.1% Tween 20)로 세척한 후 비특이적 흡착을 막기 위해 0.1% BSA(bovine serum albumin) 용액 200㎕ 넣은 후 1시간 정치 시켰다. 역시 PBS와 PBST(PBS with 0.1% Tween 20)로 세척하였다.
상기와 같이 준비된 1차 항체가 고정된 96웰 마이크로플레이트를 이용하여 혈장의 아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40의 농도를 측정하는 과정은 다음과 같다.
-80℃에서 보관된 혈장 또는 콧물 100㎕를 상온에서 30분 동안 천천히 녹인 후 PBS 110㎕로 희석하였다. 그 중 200㎕를 1차 항체가 고정된 96웰 마이크로플레이트에 투입한 후 항원-항체 반응을 시켰다. 1시간 후 PBS와 PBST(PBS with 0.1% Tween 20)로 세척하여 비특이적 단백질 등을 제거 하였다.
상기와 같이 아밀로이드 베타를 캡처한 96웰 마이크로플레이트로부터 아밀로이드 베타 42와 아밀로이드 베타 40 또는 아밀로이드 베타 올리고머를 각각의 2차 항체(12F4 및 11A50 단클론항체)로 각각 검출하는 방법은 다음과 같다.40ng/mL 농도의 첫번째 2차 항체(detection antibody)인 12F4 용액(PBS, pH 7.4) 200㎕를 상기 마이크로플레이트에 투입한 후 1시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 그 후 전극 센서를 투입하여 실시간으로 어드미턴스의 변화(△Y1)를 측정하고, 측정이 끝나면 PBS 용액으로 교체하여 1시간(30분×2회) 안정화 단계를 통해 센서 전극을 안정화 하였다.
첫 번째 2차 항체와 마찬가지로 40ng/mL의 두 번째 2차 항체 11A50 용액(PBS, pH 7.4, 200㎕)를 상기 마이크로플레이트에 투입한 후 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 안정화 된 IME 전극 센서를 투입하여 실시간으로 어드미턴스의 변화(△Y2)를 측정한 후 PBS 용액으로 교체하여 전극 센서를 안정화 하였다.
상기에서 측정된 △Y1, △Y2, 이 수치로부터 도출된 표준화 지수(standardized index, △Y1/△Y2) 및 진단 결과를 도 4에 그래프로 나타내었다.
혈장의 경우 정상인에 대해 AD 치매 환자의 임상적 유효성은 0.82, 경도인지장애는 0.78 및 무증상 AD는 0.83이었으며, 콧물의 경우 AD 치매는 0.73, 경도인지장애는 0.66으로 분석되었다.

Claims (14)

  1. 제1 캡쳐 및 이에 결합된 2종의 타겟 물질을 포함하는 용액에 상기 타겟 물질 중 1종에 결합하는 제2 캡쳐를 가하여, 제2 캡쳐 중 적어도 일부를 상기 타겟 물질에 결합시키는 단계;
    상기 용액 내 전극에 상기 제2 캡쳐 중 나머지를 결합시켜, 결합 전후의 제1 전기적 신호 변화를 측정하는 단계;
    상기 타겟 물질 중 나머지 1종에 결합하는 제3 캡쳐를 가하여, 제3 캡쳐 중 적어도 일부를 상기 타겟 물질에 결합시키는 단계; 및
    상기 용액 내 전극에 상기 제3 캡쳐 중 나머지를 결합시켜, 결합 전후의 제2 전기적 신호 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 타겟 물질의 검출 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 캡쳐는 2종의 캡쳐를 포함하고, 상기 각 종의 타겟 물질은 각 종의 캡쳐에 각각 결합된 것인 타겟 물질의 검출 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 타겟 물질은 핵산, 펩타이드, 단백질, 세포, 호르몬, 비타민, 지질, 저분자 리간드, 박테리아 및 바이러스 중 어느 하나인, 타겟 물질의 검출 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 타겟 물질은 타우(tau) 단백질, 인산화 타우(phosphorylated tau) 181, 인산화타우 217, 인산화타우 231, N protein, S protein, E protein, M protein, 아밀로이드 베타 40, 아밀로이드 베타 42, 아밀로이드 베타 43, 아밀로이드 베타 45, 아밀로이드 베타 48 및 이들의 올리고머로 이루어진 군에서 선택된 2종인, 타겟 물질의 검출 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 제1, 제2 및 제3 캡쳐는 서로 독립적으로 압타머, DNA, RNA, 단백질, 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 타겟 물질의 검출 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 전극은 제2 및 제3 캡쳐에 결합하는 물질로 코팅된 것인, 타겟 물질의 검출 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 전기적 신호는 임피던스(impedance), 어드미턴스(admittance), 저항(resistance), 전도도(conductivity), 위상(phase), 리액턴스(reactance) 및 서셉턴스(susceptance)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 결합 전후의 전기적 신호 변화 정도로 타겟 물질의 양을 정량적으로 검출하는, 타겟 물질의 검출 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 및 제2 전기적 신호 변화의 비로 2종의 타겟 물질의 함량비를 정량적으로 검출하는, 타겟 물질의 검출 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 캡쳐를 가하기 전에, 제1 캡쳐에 2종의 타겟 물질을 포함하는 액상 시료를 가하여, 상기 제1 캡쳐에 상기 타겟 물질을 결합시키는 단계를 더 포함하는, 타겟 물질의 검출 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 척수액, 뇌 균질액, 림프액, 타액, 뇨, 땀, 정액 또는 콧물인, 타겟 물질의 검출 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 제1 캡쳐에 상기 타겟 물질을 결합시킨 후 세척하여, 시료 중 나머지 물질을 제거하는 단계를 더 포함하는, 타겟 물질의 검출 방법.
  13. 타겟 물질에 결합하는 제1 캡쳐가 고정된 용기를 포함하는 캡쳐부; 상기 용기에 가해지는 제2 및 제3 캡쳐; 상기 제2 및 제3 캡쳐와 결합하는 물질이 각각 코팅된 전극부; 및 상기 전극부에서 입출력되는 제1 전기적 신호 및 제2 전기적 신호를 측정하는 신호 측정부;를 포함하는 타겟 물질의 검출 시스템.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 제1 캡쳐는 2종의 타겟 물질에 각각 결합하는 2종의 캡쳐를 포함하는 타겟 물질의 검출 시스템.
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