KR20180090513A

KR20180090513A - 바이러스 검출용 키트

Info

Publication number: KR20180090513A
Application number: KR1020170015454A
Authority: KR
Inventors: 양재문; 구민희; 서진석
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-02-03
Filing date: 2017-02-03
Publication date: 2018-08-13

Abstract

본 발명은 바이러스 검출용 키트, 바이러스검출용 조성물 및 바이러스 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 저가의 비용으로 바이러스를 단시간 내에 고효율로 검출할 수 있다.

Description

바이러스 검출용 키트{KIT FOR DETECTING VIRUS}

본 발명은 바이러스 검출용 키트, 바이러스 검출방법 및 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.

바이러스는 세균보다 크기가 작은 전염성 병원체이다. 유전물질인 RNA 또는 DNA와 그 유전물질을 둘러싸고 있는 단백질로 구성된다. 바이러스는 숙주의 종류에 따라서 식물 바이러스, 동물 바이러스 및 세균 바이러스(파지)로 구분할 수 있다. 그러나, 대부분의 경우 핵산의 종류에 따라 DNA바이러스 아문과 RNA바이러스 아문으로 나뉘며, 이들은 다시 강, 목, 과로 세분화된다.

이러한 바이러스 중에서, 조류 인플루엔자는 닭, 오리, 또는 야생 조류에서 조류 인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus)의 감염으로 인해 발생하는 급성 바이러스성 전염병이며 드물게 사람에서도 감염증을 일으킨다. 조류 인플루엔자 바이러스는 병원성에 따라 고병원성, 저병원성 및 비병원성의 3 종류로 구분되며, 2003년 말부터 2008년 2월까지 사람에게 전염될 수도 있는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(highly pathogenic avian influenza A, H5N1)의 인체 감염 사례가 640건 이상 보고되었다. 조류 인플루엔자는 조류의 높은 폐사율과 산란율 저하로 막대한 경제적 피해를 야기하며, 인체 감염 가능성이 높은 것은 아니지만, 인체에 감염되는 경우 높은 사망률을 나타낸다. 근본적인 백신 개발이 어렵고, 확산 속도가 매우 빠르므로 조기 진단을 통해 질병의 확산 및 경제적 손실을 최소화하는 것이 필요하다.

이와 같은 바이러스의 진단 방법으로는 효소 결합 면역 흡수 검정법(ELISA), 효소 면역 검정법(EIA) 및 면역 형광 검정법(IFA) 등의 면역학적 검출방법과 RT-PCR에 의한 RNA 검출방법 등이 알려져 있으나, 이러한 방법은 바이러스 진단에 과도한 시간이 소요되거나, 고가의 검사 비용이 필요하거나, 비특이적 반응으로 인한 특이도 및 민감도가 저하되는 등의 문제가 있다.

따라서, 저비용으로 단시간 내에 효율적으로 바이러스를 검출하는 방법의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 특허출원 제2011-7017416호

본 발명은 단시간 내에 효율적으로 바이러스의 검출이 가능한 바이러스 검출용 키트, 바이러스의 검출방법 및 바이러스 검출용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자, 그리고 상기 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하며, 상기 프로브는 공액 고분자 나노 입자를 포함하는 것인 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자, 및 상기 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하며, 상기 프로브는 공액 고분자 나노 입자를 포함하는 것인 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 개체로부터 수득한 시료를 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자와 접촉시키는 단계, 그리고 상기 생체 분자와 접촉된 시료를 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 프로브는 공액 고분자 나노 입자를 포함하는 것인 바이러스 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 저가의 비용으로 바이러스를 단 시간 내에 고효율로 검출할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따른 바이러스 검출방법의 모식적으로 보여주는 도면이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 다른 일 예에 따른 바이러스 검출방법의 모식적으로 보여주는 도면이다.

인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스를 포함하여 모든 바이러스는 숙주 세포 침입을 위하여 숙주 세포에 결합하는 표면 단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA), 성숙한 비리온(virion)들이 숙주 세포로부터 빠져나오는 데에 관여하는 뉴라미니다아제(neuraminidase), 수소 이온 농도의 균형을 조절하는 M2 이온 채널, 바이러스의 유전 정보를 간직하고 있는 RNP(Ribonucleoprotein) 등으로 이루어져 있다.

본 발명자들은 위에서 기술한 바이러스의 공통된 특성에 기초하여, 바이러스를 조기에 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 연구하였다. 그 결과, 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자를 통하여 바이러스를 활성화하고, 이렇게 활성화된 바이러스와 반응하여 상기 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있는 프로브를 이용하여, 간단한 방법으로 바이러스를 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자, 및 상기 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하는 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에서 사용한 용어 "바이러스"는 편성 세포 내 기생체(obligatory intracellular parasite)로서 핵산으로 DNA 또는 RNA을 갖고, 증식은 핵산으로 시작되고 2분열법으로 증식되지 않으며 ATP 생산에 필요한 효소계를 갖고 있지 않은 것을 의미한다. 본 발명의 바이러스는 노출 바이러스(naked virus)와 외막 바이러스(enveloped virus)를 포함하고, 구체적으로 본 발명의 일 예에 따른 바이러스는 외막 바이러스(enveloped virus) 일 수 있다.

상기 외막 바이러스는 구체적으로 헤르페스바이러스(herpesvirus), 폭스바이러스(poxvirus) 및 헤파드나바이러스(hepadnavirus)를 포함하는 DNA 바이러스와 플라비바이러스(flavivirus), 토가바이러스(togavirus), 코로나바이러스(coronavirus), 헤파티티스 D(hepatitis D), 오소믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 랍도바이러스(rhabdovirus), 분야바이러스(bunyavirus), 필로바이러스(filovirus) 및 레트로바이러스(retrovirus)를 포함하는 RNA 바이러스에 속하는 것이면 모두 포함한다.

상기 오소믹소바이러스는 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 이사바이러스(isavirus), 소고토바이러스(thogotovirus) 및 퀴아란자바이러스(quaranjavirus) 속에 포함되는 모든 바이러스를 포함한다.

상기 코로나바이러스는 알파코로나바이러스(alphacoronavirus), 베타코로나바이러스(betacoronavirus), 감마코로나바이러스(gammacoronavirus) 및 델타코로나바이러스(deltacoronavirus) 속에 포함되는 모든 바이러스를 포함한다.

상기 파라믹소바이러스는 파라믹소바이러스, 루불라바이러스, 모빌리바이러스 및 뉴모바이러스 속에 포함되는 모든 바이러스를 포함한다.

상기 바이러스는 핵산과 이를 둘러싸고 있는 단백질을 포함한다. 이와 같은 바이러스의 단백질은 바이러스 유전체를 보호하고, 바이러스 입자가 세포에 흡착 및/또는 융합하는데 관여하며, 바이러스의 항원성을 결정하고, 바이러스의 형태를 유지하는 구조 단백질(structural protein)과 단백질과 핵산 등을 합성하는데 관련되는 단백질인 비구조 단백질(non-structural protein)을 포함한다.

본 발명에서 사용한 용어 "바이러스의 표면 단백질"은 상기 구조 단백질을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 "표면 단백질"은 바이러스의 특이 항원성을 가지고, 바이러스가 세포에 흡착 및/또는 융합하는데 관여하는 외막(envelop)에 존재하는 외재성 단백질은 모두 포함한다. 일 예로, 본 발명의 바이러스는 당단백질(glycoprotein)일 수 있고, 세포에의 융합(fusion)에 관여하는 융합 단백질(fusion protein)일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면 상기 바이러스의 표면 단백질은 헤마글루티닌(HA), 스파이크 단백질(spike protein) 및 F 단백질(F protein) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 숙주세포의 세포막에 흡착하여 막융합을 일으키는 표면 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 바이러스는 비활성형 상태로 존재하는 표면 단백질이 생체 분자에 의하여 활성형으로 변하면, 숙주세포의 세포막과 흡착 및/또는 막융합을 일으키는 성질을 갖는 표면 단백질을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, "바이러스"는 인플루엔자 바이러스 또는 고병원성 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 "바이러스의 표면 단백질"로 당단백질인 헤마글루티닌(HA)을 포함한다. 헤마글루티닌은 하나의 폴리펩티드(전구체 HA0)로 발현된 후, 단백질 가수분해에 의하여 HAO의 절단 부위(cleavage site)가 HA1 및 HA2로 나누어지면, 산성 조건 하에서 소수성 아미노산 잔기들로 구성된 융합 펩타이드(fusion peptide)가 활성화된다. HA는 인플루엔자 바이러스의 병원성 정도에 따라 절단 부위의 아미노산과 융합 펩타이드의 아미노산 구성이 다르다.

본 발명의 다른 일 예에 따르면, "바이러스"는 코로나 바이러스 일 수 있다. 코로나 바이러스는 표면 단백질로 스파이크 단백질(spike protein)을 포함하고, 상기 스파이크 단백질은 S1과 S2 부위를 포함한다. 스파이크 단백질의 S1 부위가 숙주세포에 결합하면, 단백질 분해 효소(protease)에 의하여 S1과 S2로 절단되고, S2의 끝 부분에 있는 소수성 부위가 노출되어 활성화 된다.

본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, "바이러스"는 파라믹소 바이러스 일 수 있다. 파라믹소 바이러스는 표면 단백질로 HN 단백질(HN protein)을 포함한다. HN 단백질은 바이러스를 숙주세포에 부착 또는 흡착시키는 부착(또는 흡착) 단백질로, 바이러스 비활성 상태에서는 전구체(precursor) HN0로 존재하나, 가수분해에 의하여 C-말단에서 아미노산 잔기가 제거되면 활성화 된다. 또한, 파라믹소 바이러스는 표면 단백질로 F 단백질(F protein)을 포함한다. F 단백질은 바이러스 비활성 상태에서 전구체 F0로 존재하나 생체분자에 의하여 F1과 F2로 절단된 후, 새로운 N-말단 형태의 F1으로 활성화 된다. 상기 F 단백질은 절단부위에 다염기성 잔기를 갖는 것과 단일염기성 잔기를 갖는 것으로 모두 포함한다. 바람직하게는 다염기성 잔기를 갖는 F 단백질 일 수 있다.

본 발명에서 사용한 용어, "반응"은 어떤 물질이 다른 물질과 접촉하여 상태, 색, 형상 또는 화학 결합 등의 물리 및/또는 화학적 상태의 변화가 일어나는 것 또는 그 현상을 의미한다.

일 구체 예에서 바이러스의 표면 단백질이 생체 분자와 반응하는 경우 바이러스의 표면 단백질이 변화되어 융합 펩타이드 등을 형성하는 등의 활성화된 바이러스로 상태 변화가 일어난다. 다른 구체 예에서 활성화된 바이러스와 프로브의 반응은 융합반응 또는 응집반응 일 수 있다.

상기 융합반응은 한 예에 따라, 활성형 바이러스와 본 발명의 프로브의 일부가 결합되는 현상일 수 있다. 융합반응은 융합에 의하여 프로브 내부의 물질 등이 밖으로 배출되는 현상까지 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 일 예로, 활성형 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 융합 펩타이드가 엔도좀의 세포막을 융합하는 원리를 이용하여, 활성형 바이러스와 프로브의 융합 여부를 확인함으로써 활성형 바이러스를 검출할 수 있다.

상기 응집반응은 용액 안에서 분자 또는 입자 등이 서로 달라붙어 뭉치는 현상을 의미한다. 본 발명의 한 예에서, 응집반응은 검출대상인 바이러스에 의하여 본 발명의 프로브의 안정성이 낮아져 프로브끼리 서로 뭉쳐서 응집 및/또는 침전되는 현상을 의미한다.

본 발명에서 사용한 용어, "생체 분자(biomolecule)"는 생물의 구조, 기능, 정보전달 등에 필요한 분자를 의미한다. 상기 생체 분자는 기능, 정보 전달 등을 수행하기 위한 특이적 구조 및/또는 부위를 포함할 수 있다. 이러한 생체 분자의 특이적 구조는 분자간 결합 반응을 통하여 반응을 일으키는 원동력이다.

생체 분자는 아미노산과 단백질, 당과 탄수화물, 지방산과 지질, 및 뉴클레오티드와 핵산 등을 포함하고, 생체 내에서 만들어진 것 및/또는 인위적으로 합성된 것을 모두 포함한다. 본 발명의 일 예에 따르면, "생체 분자"는 약 62개 내지 2500개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질인 효소일 수 있다.

하나의 구체 예에서, 상기 효소는 단백질 분해 효소일 수 있다. 일 예로 최초 합성된 형태로는 비활성화되어 있으나, 특정 부위가 제거(또는 절단)되면 활성을 나타내는 단백질에서 단백질 분해 효소는 상기 특정 부위를 절단(cleave)하여 비활성화 단백질을 활성화시킨다. 단백질 분해 효소는 특정 부위를 절단할 수 있는 것이면 종류에 제한 없이 사용할 수 있다.

일 예에서 단백질 분해 효소는 퓨린(furin), 트립신(trypsin), 세린(serine), 엔도프로테아제(endoprotease), 카복시펩티다아제(carboxypeptidase) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 단백질 분해 효소는 유도체 또는 개질된 형태를 모두 포함한다. 예를 들어, 단백질 분해 효소는 재조합 인간 퓨린, 재조합 마우스 퓨린, 트립신-EDTA, 아세틸화된 트립신, TPCK-트립신(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone-trypsin), 아크릴릭 트립신(Trypsin-acrylic), 퓨린형 프로테아제(Furin like protease), 켁스2 프로테아제(Kex2 proteases), 막통과 세린 프로테아제(Transmembrane protease serine), TMPRSS2, TMPRSS4, 트립타아제 클라라(Tryptase clara), 플라즈민(plasmin), 세린계 프로테아제(serine protease), 서브틸리신형 엔도프로테아제(subtilisin like endoprotease), 카복시펩티다아제(carboxypeptidase) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.

일 예에서 트립신이 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA)과 반응하는 경우, 트립신의 효소 분해 작용은 His57-Asp102-Ser195 위치에서 일어나며, 퓨린의 효소 분해 작용은 His194-Asp153-Ser368 위치에서 일어난다. 트립신은 고병원성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 모두 분해할 수 있기 때문에, 트립신을 이용하여 고/저병원성 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있다. 또한, 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌만을 분해할 수 있기 때문에, 퓨린을 이용하여 고병원성 인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있다.

다른, 일 예에서 단백질 분해효소와 코로나 바이러스의 표면 단백질이 반응하는 경우, 가수분해 효소의 작용은 S1 과 S2의 부위의 경계에서 일어난다. 따라서, 상기 가수분해 효소의 작용에 의하여 절단 후 S2의 소수성 부위가 노출됨에 따라 코로나 바이러스가 활성화 되어, 본 발명의 프로브를 이용하여 검출할 수 있다.

또 다른 일 예에서, 파라믹소 바이러스의 표면 단백질과 반응하는 생체분자는 C-말단(Carboxyl side)의 아르기닌 잔기에서 절단이 가능한 단백질 분해효소 또는 카르복시펩티다아제(carboxylpeptidase) 일 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 R-X-K/R-R 배열 포함하는 F 단백질을 인식하여 절단할 수 있다. 구체적인 예로, 퓨린 또는 서브틸리신형 엔도프로테아제(subtilisin-like endoprotease)일 수 있다.

본 발명에서 사용한 용어, "활성형 바이러스" 또는 "활성화된 바이러스"는 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자에 의하여 바이러스의 표면 단백질이 활성화된 바이러스를 의미한다. 여기서 바이러스의 표면 단백질이 활성화되었다는 것은 바이러스의 표면 단백질이 숙주세포 및/또는 프로브와 반응, 예를 들어 특이적으로 반응할 수 있는 상태로 변화되었다는 것을 의미한다.

여기서 "바이러스의 활성화"는 비활성형 바이러스가 상기 활성형 바이러스로 변환되는 과정을 의미한다. 바이러스가 감염을 일으키기 위해서는 바이러스의 활성화 과정이 필수적으로 요구되므로, 상기 활성형 바이러스의 존재 여부를 검출함으로써, 바이러스에 의한 감염 여부를 판별할 수 있다.

하나의 구체 예에서, 바이러스 표면 단백질이 활성화된 것이란 바이러스의 표면단백질에 존재하는 융합단백질 또는 융합펩타이드가 숙주세포의 막 또는 본 발명의 프로브의 표면과 융합 반응을 일으킬 수 있는 상태임을 의미한다.

하나의 구체 예에서, 인플루엔자 바이러스의 경우, 활성화된 바이러스란 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA)이 효소에 의해 분해되어, 비활성 형태에서 헤마글루티닌의 내부에 존재하는 융합 펩타이드가 노출된 형태로 변환된 것을 의미한다. 즉, 상기 HA의 절단 부위를 특이적으로 분해하는 효소에는 퓨린 및/또는 트립신이 포함된다. 퓨린은 고병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌만을 분해할 수 있기 때문에, 인플루엔자 바이러스의 HA가 퓨린에 의하여 분해되는 경우 상기 인플루엔자 바이러스는 고병원성을 나타낸다. 또한, 트립신은 고병원성 및 저병원성 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 모두 분해할 수 있기 때문에, 트립신에 의하여 분해되는 경우에는 고병원성 또는 저병원성을 나타내게 된다. 저병원성 인플루엔자 바이러스의 절단 부위는 C-말단이 -R-로 이루어지며, 고병원성 인플루엔자 바이러스의 절단 부위는 R/K-R-K-K-R로 이루어진다.

HA의 절단 부위를 특이적으로 분해하는 효소에 의하여 HA가 활성화되면, HA의 재배열이 일어나 HA 내의 융합 펩타이드가 바깥쪽으로 노출되어 활성형 바이러스가 된다. 이와 같이, 산성 조건 하에서 활성화된 인플루엔자 바이러스가 본 발명의 일 예에 따른 프로브와 만나면, 인플루엔자 바이러스의 융합 펩타이드에 의하여 인플루엔자 바이러스와 프로브의 반응이 일어나게 된다. 프로브의 반응에 따라 변하는 신호를 측정함으로써 바이러스 감염 여부를 검출할 수 있다.

다른 구체 예에서, 코로나 바이러스의 경우 활성화된 바이러스란 표면 단백질인 스파이크 단백질(S protein)이 생체분자에 의해 비활성 형태에서 스파이크 단백질의 내부에 존재하던 소수성 부위가 노출된 형태로 변환된 것을 의미한다. 구체적으로, 스파이크 단백질의 S1 부분이 숙주세포와 결합하면, 단백질 분해 효소(protease)에 의하여 S1과 S2로 절단되고, S2의 끝 부분에 있는 소수성 부위가 노출되어 바이러스가 활성화 된다. 상기 S2에서 노출된 소수성 부위가 숙주세포의 세포막 내 소수성 영역에 부착되고, 다른 한쪽은 바이러스 외막과 결합된 상태에서 S2 부위의 가운데가 접히는 구조변형(conformation change)이 일어나면서 막 융합이 일어 나게 된다. 따라서, 본 발명의 프로브와 활성화된 코로나 바이러스가 만나서 반응하면, 프로브의 안정성에 변화가 일어나 다양한 신호를 발생되고, 상기 변화를 측정함으로써 바이러스 감염 여부를 검출할 수 있다.

또 다른 예에서, 파라믹소바이러스에서 활성화된 바이러스란 HN 단백질이 생체분자에 의하여 C-말단의 잔기가 제거된 상태를 의미한다.

구체적으로, HN 단백질은 불활성화 상태(HN0)를 유지하고 있다가 C-말단의 약 90개의 잔기가 제거되면, HN 단백질이 활성화 되어 숙주세포 또는 표적의 막에 파라믹소바이러스가 부착하게 된다. 또한, 활성형 파라믹소바이러스는 F 단백질이 생체분자에 의하여 F1과 F2로 절단된 상태를 의미한다. 비활성형 파라믹소바이러스에서 F 단백질은 전구체 F0 상태에서, 생체분자와 만나면 F1과 F2로 절단되고, 숙주세포의 세포막과 융합할 수 있는 활성형 바이러스가 된다. 즉, SS-결합쇄 F1과 F2를 함유하는 활성 표면 단백질을 형성하고, 광범위한 소수성을 나타내는 F1의 N-말단 잔기를 숙주세포의 세포막 또는 타겟의 세포막에 고정하면서 막 융합이 시작된다. 따라서, 파라믹소바이러스는 본 발명의 생체분자가 표면 단백질과 반응하여 활성화 되고, 다시 활성화된 바이러스가 본 발명의 프로브와 반응하여, 프로브의 변화를 일으키게 된다. 따라서 상기 변화를 측정함으로써 바이러스를 검출할 수 있다.

본 발명에서, "프로브"는 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하여, 상기 바이러스 또는 활성형 바이러스의 존재 여부를 검출할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브는 바이러스 이외의 물질 또는 비활성형 바이러스와 비교하여 활성형 바이러스와의 반응 능력이 월등히 우수하거나, 활성형 바이러스와 특이적으로 반응하여, 활성형 바이러스의 존재 여부를 유의하게 검출할 수 있는 물질이면 모두 포함되고, 그 종류 및 형태는 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 상기 프로브는 "검출인자"와 혼용하여 사용된다.

본 발명의 프로브는 검출 대상 바이러스 또는 바이러스의 표면 단백질의 종류에 따라 다양한 구조 또는 형태를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 예에 따라, 프로브는 막(membrane) 구조를 가질 수 있다.

본 발명에서 사용한 용어, "막(membrane) 구조"란 막 또는 쉘(shell)에 의하여 내부가 둘러싸여 있는 구조를 의미한다. 베지클(vesicel), 인공세포(artificial cell) 또는 마이크로캡슐 같은 캡슐 형태의 입자(encapsulation particle)는 그 종류를 제한하지 않고 모두 포함한다. 본 명세서에서 상기 막 구조는 쉘(shell) 구조와 혼용하여 사용한다. 상기 막 구조는 상기 내부에는 유체 또는 별도의 구성을 포함하는 구조까지 포함한다.

상기 막(membrane)은 단일층(mono layer) 또는 이중층(bilayer) 구조를 포함한다. 상기 단일층(mono layer)은 "소수성 영역-친수성 영역"을 포함하는 막 구조로, 일 예로 수용성 용액 내에서 소수성 코어와 친수성 쉘을 포함하는 구조일 수 있다. 상기 이중층(bilayer)은 "친수성 영역-소수성 영역-소수성 영역-친수성 영역"을 포함하는 막 구조이다. 일 예로, 상기 이중층(bilayer)은 상기 단일층(mono layer) 2 개가 결합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 이중층(bilayer)은 친수성 코어와 상기 친수성 코어를 둘러싸고 있는 소수성 영역 및 상기 소수성 영역을 둘러싸고 있는 친수성 쉘을 포함하는 구조일 수 있다.

상기 막(membrane) 구조는 단일막(single membrane)및 단일막을 2 이상 있는 다중막(multi membrane)을 모두 포함한다. 일 예로, 단일막을 갖는 입자가 다시 하나의 단일막으로 둘러싸인 경우, 다중막을 갖는 입자가 될 수 있다. 상기 단일막 및 다중막은 단일층 및 이중층과 구별되는 개념이다. 구체적으로, 이중층(bilayer) 구조의 막을 하나만 포함하는 입자는 단일막을 갖는 것이며, 단일층(monolayer) 구조의 막을 포함하는 입자를 다시 단일층 구조의 막이 둘러싸고 있는 입자는 다중막 구조의 입자를 의미한다.

상기 막 구조를 갖는 프로브는 본 발명이 속하는 통상의 방법에 의하여 제조될 수 있고, 일 예에 따라 미세용액화 장비를 이용한 미세유동화 방법(microfludization), 초고압 균질법(High-pressure homogenization), 에멀전법(Emulsion method) 또는 초음파 등을 이용하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 막 구조를 갖는 입자는 그 종류에 제한되지 모두 본 발명의 프로브에 포함될 수 있다. 일 예로 베지클(vesicle), 마이셀(micelle), 폴리머좀(polymersome), 콜로이드좀(colloidsome), 베지클(vesicle), 리포좀(liposome), 액적(droplet) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하나, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.

상기 "마이셀(micelle)"은 소수성 코어와 친수성 쉘을 갖는 입자를 의미한다. 한 예에서, 상기 마이셀은 계면활성제의 마이셀 또는 고분자 자기조립 마이셀 일 수 있다. 자기조립에 의한 마이셀의 경우 공중합체를 형성하는 고분자의 종류에 따라 다양한 형태를 띌 수 있고, 그 형태에 제한을 받는 것은 아니다.

상기 마이셀은 단일층(monolayer)을 2 이상 포함하는 다중막 형태도 포함한다. 상기 마이셀은 그 형태의 제한은 없으나, 일 예에 따라 구형, 타원형(ellipsoid) 또는 실리더형(cylinder)을 포함한다. 상기 마이셀 구조의 프로브는 소수성 코어 영역에 표지자 및 무기 입자와 같은 구성을 더 포함할 수 있다.

상기 "폴리머좀(polymersome)"은 "친수성 영역-소수성 영역-소수성 영역-친수성 영역"을 갖는 2중층 막 구조를 갖고, 상기 소수성 및 친수성 영역에 고분자 또는 공중합체를 포함하는 입자를 의미한다. 상기 고분자 또는 공중합체는 인위적으로 합성된 것과 지질(lipid)을 함께 포함하거나, 인위적으로 합성된 것 포함하는 것 일 수 있다. 상기 인위적으로 합성된 것은 자연적으로 발생하는 지질(lipid)을 제외한 모든 고분자 및 공중합체를 포함하는 의미이다. 상기 폴리머좀은 이중층 막구조의 단일막 및 단일막을 2이상 포함하는 다중막을 모두 포함한다.

상기 폴리머좀은 리포좀과 구분하여 인위적으로 합성된 고분자 또는 공중합체를 포함할 수 있다. 상기 폴리머좀은 이중층 형태의 막으로만 이루어진 단일막 및 상기 2중층의 단일막을 2 이상 포함하는 다중막 형태도 포함한다.

상기 "리포좀(liposome)"은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 입자를 의미한다. 양친매성의 생체막을 모방한 지질막을 갖는 것이라면, 단일막 및 다중막을 모두 포함한다. 리포좀을 형성하는 방법은 당업계에 잘 알려져있고, 통상적으로 인지질을 염류 수용액 중에 현탁하거나, 인지질을 포함하는 수용액을 초음파 처리 등을 하여 수득할 수 있으나, 제조방법에 의하여 본 발명이 제한되지 않는다.

상기 "콜로이드좀"은 1nm 내지 1000nm 크기의 콜로이드상 입자 또는 상기 입차가 치밀하게 패킹된 구조물을 의미한다. 막을 형성하는 친수성 및 소수성 영역의 고분자의 종류에 따라서 단일층 및 이중층을 포함할 수 있다. 또한 단일막 및 다중막을 모두 포함한다.

상기 "액적(droplet)"은 상기 막 구조 입자 중에서 물방울 모양의 형태를 나타내는 것을 의미한다. 단일층 및 이중층을 포함하고, 단일막 및 다중막을 모두 포함한다.

본 발명의 프로브는 형태(shape)에 따라서 구분할 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 프로브의 형태(shape)는 로드(rod), 구, 링(ring), 판(flat), 실린더, 타원형, 막으로 둘러싸인 형태 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 로드(rod)형태는 막대, 봉 또는 장대와 같은 일직선 모양의 형태를 총칭하는 의미이다. 상기 구 형태는 둥근 모양의 형태를 의미하는 것으로, 완전 구형과 불완전 구형을 모두 포함한다. 상기 링(ring) 형태는 일반적으로 구 또는 원형의 모양에서 가운데가 비어있는 형태를 의미한다. 상기 판(flat) 형태는 얇고 평평한 모양의 평판, 판상의 형태를 의미한다. 일 예에 따라, 판 형태의 프로브는 기재 또는 담체의 상부 또는 외부에 판 형의 프로브가 코팅 된 형태 일 수 있다.

본 발명의 프로브는 상기 프로브를 구성하는 성분 또는 활성형 바이러스와 반응하는 방법에 따라서 구분할 수 있다.

본 발명의 한 예에서, 상기 프로브는 양친성 입자, 유무기 입자, 항체, 압타머 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 "양친성 입자"에서 상기 양친성이란 양친매성이라고도 하며, 친수성과 소수성의 성질을 모두 가진 것을 의미한다. 상기 양친성 프로브의 형태는 양친성을 나타내기만 하면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서, 양친성 입자는 친수성을 나타내는 영역과 소수성을 나타내는 영역을 갖는 입자를 의미한다. 양친성 입자는 친수성 영역 및 소수성 영역이 있는 입자이기만 하면 제한 없이 이용 가능하다. 양친성 입자는 친수성 고분자, 소수성 고분자, 지질 고분자 및 이들의 조합을 포함한다. 상기 고분자는 공중합체 형태로 포함될 수 있다.

한 예에서, 친수성 고분자는 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴리아크릴릭애시드(PAA), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아세테이트(PVAc), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 친수성 폴리아미노산, 이들의 유도체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 친수성 고분자는 (모노)메톡시폴리에틸렌글리콜, (모노)아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글루타민, 폴리글루탐산, 폴리트레오닌, 폴리아스파라긴, 폴리아르기닌 및 폴리세린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 친수성 고분자는 그 유도체를 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리에킬렌글리콜의 유도체는 메톡시 폴리에틸렌글리콜(mPEG)일 수 있다.

한 예에서, 소수성 고분자는 친수성 고분자와 함께 양친성 입자를 형성할 수 있는 물질이면 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 소수성 고분자는 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리오르소에스테르, 폴리포스파진, 소수성 폴리아미노산, 이들의 유도체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다. 상기 소수성 폴리아미노산은 폴리루신, 폴리이소루신, 폴리발린, 폴리페닐알라닌, 폴리프롤린, 폴리글리신, 폴리트립토판, 폴리알라닌, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤 및 폴리메티오닌으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함한다. 또한 상기 소수성 고분자는 그 유도체를 포함한다.

본 명세서에서 사용한 용어, "지질" 또는 "지질 고분자"는 이중층의 막 구조를 형성할 수 있는 것이라면 인지질, 지질단백질, 당지질, 양이온성 지질 등을 모두 포함하며, 그 종류에 제한되지 않는다. 또한, 상기 지질은 자연적으로 유도되어 얻어진 것 및 합성된 지질 유도체를 모두 포함한다. 상기 인지질(phospholipids)은 글리세로인지질(glycerophos pholipids) 및 스핑고인지질(spingophospholipid, Phosphosphingolipid)을 포함한다. 상기 글리세로인지질은 다이아크릴글리세라이드 구조를 갖는 것일 수 있고, 구체적으로 포스파티산(phosphatidate, Phosphatidic acid, PA), 레시틴(lecithin, Phosphatidylcholine, PC), 세팔린(cephalin) 및 포스포이노시티드류(Phosphoinositides)를 포함한다. 상기 세팔린 인지질은 포스파티딜세린(Phosphatidylserine, PS) 및 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE)을 포함한다. 또한, 상기 포스포이노시티드류 인지질은 포스파티딜이노시톨(Phosphatidylinositol, PI), 포스파티딜이노시톨 포스페이트(Phosphatidylinositol phosphate, PIP), 포스파티딜이노시톨 이인산(Phosphatidylinositol bisphosphate, PIP2) 및 포스파티딜이노시톨 삼인산(Phosphatidylinositol triphosphate, PIP3)을 포함한다. 상기 스핑고인지질은 세라마이드 포스포리콜린(Ceramide phosphorylcholine, Sphingomyelin, SPH), 세라마이드 포스포리레타노라민(Ceramide phosphorylethanolamine, Sphingomyelin, Cer-PE) 및 세라마이드 포스포리피드(Ceramide phosphoryllipid)를 포함한다.

상기 합성 인지질 유도체는 그 종류에 제한되는 것은 아니나, 일 예로 1,2-다이도데카노이-sn-글리세로-3-포스포콜린(EPC, 1,2-didodecanoyl-snglycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에타놀라민(POPE, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(POPS, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 양친성 입자는 공지된 방법을 자유롭게 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 친수성 영역과 소수성 영역을 포함하는 양친성 블록 공중합체를 수용액에 분산시킨 뒤 초음파를 가하는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해 시킨 뒤 과량의 물로 유기용매를 추출 또는 증발시키는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 과량의 물로 투석하는 방법, 유기용매에 분산 또는 용해시킨 뒤 균질기 또는 고압유화기를 이용하여 강하게 용매를 증발시키는 방법, 또는 얇은 필름 수화법(Thin film hydration) 등을 사용하여 제조할 수 있다.

상기 양친성 입자에 사용되는 고분자의 종류, 제조방법에 의하여 다양한 구조 및 형태를 갖는 프로브가 형성될 수 있다.

본 발명의 일 예에서, 양친성 입자는 막 구조를 가진 입자일 수 있고, 구체적으로 마이셀(micelle), 폴리머좀(polymersome), 콜로이드좀(colloidsome), 베지클(vesicle), 리포좀(liposome), 액적(droplet), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 구조일 수 있다.

본 발명의 일 예에서, 양친성 입자가 하기 수학식 1에 따라 계산된 질량 분율(mass fraction)이 0.25 내지 0.40을 만족할 때, 양친성 입자는 폴리머좀 형태를 나타내고, 질량 분율이 0.40 초과 0.70 이하일 때 양친성 입자는 마이셀 구조를 나타낸다.

[수학식 1]

질량 분율(mass fraction)=친수성 고분자의 질량/(친수성 고분자의 질량 + 소수성 고분자의 질량)

또한, 상기 질량 분율을 질량%(percent)로 나타내는 경우, 질량%가 25 질량% 내지 40 질량%을 만족할 때, 양친성 입자는 폴리머좀 형태를 나타내고, 질량%가 40 질량% 초과 70 질량% 이하일 때 양친성 입자는 마이셀 구조를 나타낸다.

한 예에서, 양친성 입자의 크기는 제한되지 않는다. 양친성 입자는 나노 또는 마이크로 입자일 수 있으며, 예를 들어 양친성 입자의 평균 입경은 50 내지 10000 nm일 수 있다.

본 발명의 다른 일 예에 따르면, 프로브는 "유무기 입자"일 수 있다.

상기 유무기 입자 프로브의 경우, 활성형 바이러스 또는 활성화된 표면 단백질과 프로브의 반응에 의하여 상기 프로브의 용액 내 안정성이 낮아져 응집이 일어나게 된다. 따라서 상기 반응의 유무에 따라서 본 발명의 유무기 입자 프로브를 이용하여 바이러스를 검출 할 수 있다.

본 발명에서 사용한 용어, "유무기 입자"는 유기 물질과 무기 물질을 포함하는 입자를 의미한다. 구체적으로, 무기 물질로 이루어진 코어의 표면(또는 쉘)에 유기 물질이 코팅 또는 결합되어 있는 형태의 입자일 수 있다. 상기 유무기 입자의 형태는 제안되지 않고, 한 예에 따라 로드(rod)형, 구형, 실린더형, 판(flat)형, 타원형 및 링(ring)형으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 형태일 수 있다.

상기 무기 물질은 금속으로 이루어진 것일 수 있고, 상기 금속은 일 예로 금, 은 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 유기 물질은 무기 물질의 안정화제 일 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 안정화제는 입자의 응집을 방지하기 위한 물질을 의미하며, 분산제와 혼용하여 사용된다. 상기 안정화제는 바람직하게는 금속의 안정화제 일 수 있다. 상기 안정화제는 무기 물질이 용매 내에서 잘 분산된 상태로 유지되도록 하는 것이면 그 종류에 상관없이 포함되고, 일 예로, 계면활성제(surfactant)일 수 있다.

상기 계면활성제의 구체적인 예에 제한되지 않고, 양이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제를 모두 포함한다. 구체적으로 세틸 트라이메틸암모늄 브로마이드(Cetyl trimethylammonium bromide, CTAB, Hexadecyltrimethylammonium bromide), 테트라데실 트라이메틸암모늄 브로마이드(Tetradecyl Trimethyl Ammonium Bromide, TTAB), 도데실트라이메틸암모늄 브로마이드(dodecyltrimethylammonium bromide, DTAB), Tween 20(polyoxyethylene(20) sorbitan monolaurate), Tween 40(polyoxyethylene(20) sorbitan monopalmitate), Tween 80(polyoxyethylene(20) sorbitan monooleate) 및 Triton X-100로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따라, 유무기 입자는 양친성 고분자를 더 포함할 수 있다. 상기 양친성 고분자는 유무기 입자의 표면에 양친성 고분자가 결합된 상태이거나, 양친성 고분자 층 또는 양친성 고분자 쉘(shell) 구조로 코팅된 상태 일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따라, 양친성 고분자를 더 포함하는 유무기 입자는 양친성 고분자와 유무기 입자의 표면 사이에 작용기층을 더 포함할 수 있다. 구체적인 예로, 상기 작용기 층은 무기입자의 표면에 결합이 잘되는 작용기를 갖는 화합물을 결합시키고, 상기 화합물에 고분자층을 결합하는 구조일 수 있다.

상기 작용기를 갖는 화합물은 무기입자 표면에 -SH 결합이 가능한 것이면 모두 사용할 수 있고, 일 예로 시스테아민(cysteamine)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 무기 입자가 금인 경우, 금 입자의 표면에 SH 결합이 가능한 화합물을 결합하여 작용기층을 형성하고, 상기 작용기와 양친성 고분자를 결합하는 구조를 가질 수 있다.

본 발명의 일 예에 따라, 상기 양친성 고분자를 포함하는 유무기 입자는 작용기층과 양친성 고분자의 결합 사이에 아미노산 중합을 개시하기 위한 작용기를 더 포함할 수 있다. 상기 작용기는 NH₂ 일 수 있다.

상기 양친성 고분자는 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 타입의 양친성 블록 공중합체 또는 B-A-B 타입의 삼중 블록 공중합체 형태일 수 있다. 또한 상기 양친성 고분자는 지질일 수 있다.

한 예에서, 친수성 A 블록은 친수성 고분자로 폴리알킬렌글리콜(PAG), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알콜(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴릭애시드(PAA), 폴리아클릴로니트릴(PAN), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아세테이트(PVAc), 친수성 폴리아미노산, 이들의 유도체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌글리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리글루타민, 폴리글루탐산, 폴리트레오닌, 폴리아스파라긴, 폴리아르기닌, 폴리세린 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 친수성 A 블록은 200 내지 50,000 달톤 또는 1,000 내지 20,000 달톤의 수 평균 분자량을 갖는다.

한 예에서, 소수성 B 블록은 소수성 고분자일 수 있다. 구체적으로 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 소수성 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르, 폴리포스파진, 이들의 유도체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 소수성 B 블록은 폴리루신, 폴리이소루신, 폴리발린, 폴리페닐알라닌, 폴리프롤린, 폴리글리신 및 폴리메티오닌, 폴리트립토판, 폴리알라닌, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 카프로락톤의 공중합체, 및 폴리글리콜라이드와 카프로락톤의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 소수성 B 블록은 50 내지 50,000 달톤, 또는 200 내지 20,000 달톤의 수 평균 분자량을 갖는다.

상기 유무기 입자는 안정제로서 양친성 고분자의 존재 하에서, 이온 상태의 무기물과 상기 무기물을 환원시킬 수 있는 환원제를 함께 반응시켜 제조할 수 있다. 유무기 입자 제조 시, 사용되는 안정제로 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유무기 입자가 양친성 고분자 층을 더 포함하는 경우 유무기 입자의 안정제 역할을 할 수 있는 이중층 구조를 갖는 것이 바람직하다.

한 예에서, 유무기 입자의 크기는 제한되지 않으며, 나노 또는 마이크로 크기일 수 있다. 예를 들어 유무기 입자의 평균 입경은 50 내지 1000 nm일 수 있다.

본 발명의 유무기 입자는 에멀젼 법, 얇은 막 수화법(Thin film hydration) 또는 투석 방법(dialysis)을 이용하여 제조될 수 있고, 구체적인 제조 조건은 유기 물질 및 무기 물질 그리고 고분자의 종류에 따라서 통상으로 사용되는 범위 내에서 변경하여 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 프로브는 "압타머(aptamer)"일 수 있다. 본 발명에서 사용한 용어, "압타머(aptamer)"는 단일, 이중 나선의 DNA, RNA 형태로 표적분자에 결합할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명의 또 다른 일 예에 따르면, 프로브는 "항체(antibody)" 일 수 있다. 본 발명에서 사용한 용어, "항체(antibody)"는 아미노산과 당사슬로 결합된 단백질로 표적분자에 결합할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명에서 상기 표적분자는 활성형 바이러스, 활성화된 표면 단백질, 활성형 바이러스의 항원성을 나타내는 단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 압타머 또는 항체는 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 것이고, 바람직하게는 표적분자에 상보적으로 결합할 수 있는 구조를 가진 것 일 수 있다.

상기 압타머 또는 항체의 경우, 활성형 바이러스, 활성화된 표면 단백질 및/또는 활성형 바이러스의 항원성 단백질과 압타머 또는 항체의 특이적 결합 반응의 유무에 따라서 바이러스를 검출할 수 있다.

본 발명의 일 예에 있어서, 상기 표적분자는 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 막 융합 단백질일 수 있다. 또한 일 예에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 경우 헤마글루티닌(HA)의 융합 펩타이드일 수 있다. 상기 HA의 융합 펩타이드의 검출을 위한 압타머 또는 항체는 상기 융합 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 상보적 구조 또는 서열을 포함한다. 또한, 코로나 바이러스인 경우 스파이크 단백질일 수 있고, 파라믹소 바이러스인 경우 F 단백질 일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 압타머 또는 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 공지된 방법을 이용하여 압타머 또는 항체를 제조, 선별할 수 있다.

본 발명의 키트 또는 조성물은 상기 프로브를 단일 종류만 포함하거나, 2 종류 이상의 프로브를 함께 포함할 수 있다.

한편, 상기 프로브는 공액 고분자 나노 입자를 포함한다. 상기 공액 고분자 나노 입자는 공액 고분자를 포함하는 나노 크기의 입자이고, 그 구체적인 형태 또는 종류가 특별히 한정되지 않는다.

상기 공액 고분자 나노 입자는 상기 프로브와 부착 또는 담지될 수 있고, 구체적으로 상기 프로브 내부에 담지되거나, 상기 프로브 표면에 부착될 수 있다. 또한, 상기 공액 고분자 나노 입자가 상기 프로브 표면에 부착되는 경우, 상기 공액 고분자 나노 입자가 기판에 부착되어 상기 공액 고분자 나노 입자를 매개로 상기 프로브가 상기 기판에 부착될 수 있다.

상기 기판은 유리, 플라스틱, 금속, 실리콘, 석영, 알루미나, 산화물 결정 또는 이들의 혼합물로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 플라스틱은 PMMA, PC, COC 등 일수 있고, 상기 금속은 니켈, 알루미늄, 철 또는 구리일 수 있으며, 상기 산화물 결정은 SiO₂, TiO₂, Ta₂O₅ 또는 Al₂O₃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예에 따른 상기 공액 고분자 나노 입자는 공액 고분자, 지방산(fatty acid) 및 양친매성 고분자를 포함할 수 있다.

상기 공액 고분자는 도펀트에 의해 도핑됨으로써 전기 전도성을 가지는 가질 수 있는 전도성 고분자이면 제한 없이 사용 가능하다. 이러한 특성을 가지는 공액 고분자의 종류는 잘 알려져 있으며, 예를 들어 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리(1,4-페닐렌비닐렌)(poly(1,4-phenylenevinylene)), 폴리(1,4-페닐렌 설파이드)(poly(1,4-phenylene sulfide)), 폴리(플루오레닐렌에티닐렌)(poly(fluorenyleneethynylene)), 이들의 유도체 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 공액 고분자는 폴리아닐린일 수 있다. 상기 폴리아닐린은 생체 적합성이 우수하고, 세포 증식을 연구하기 위한 전기 활성 소재로도 사용 가능하다. 또한, 상기 폴리아닐린의 경우 전자 이동을 유도하고, 여기-에너지 수준을 감소시키는 원자가 밴드 및 전도성 밴드 간의 밴드 간 갭 상태를 발생하는 양자화를 위한 도펀트(예를 들어, 강산, 루이스산, 전이금속, 알칼리 이온)라는 것이다. 따라서, 폴리아닐린의 광학-흡광 피크는 도핑 과정 동안 에머랄딘 염기(emeralidine base, EB)가 에머랄딘 염(emeralidine salt, ES)으로 전이되면서 근적외선 영역으로 적색 이동한다.

상기 공액 고분자 나노 입자는 상기 공액 고분자와 함께 지방산을 포함함에 따라 중성 환경에서도 도펀트에 의하여 도핑될 수 있다. 따라서, 상기 공액 고분자 나노 입자는 생체 내에서와 같은 중성 환경에서도 전기전도도가 높고, 근적외선 영역에서의 높은 흡광 특성을 가질 수 있다.

상기 지방산은 포화 지방산 또는 불포화 지방산일 수 있으며, 상기 지방산으로는 탄소수 8 내지 30의 지방산을 바람직하게 사용할 수 있고, 예를 들면 올레산, 카프르산, 카프릴산, 팔미트산, 라우르산, 미리스트산, 아라키딕산, 베헨산, 리그노세르산, 세로틴산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다.

또한, 상기 지방산은 상 변화 물질로서 상기 공액 고분자 나노 입자 제조시에는 고체 상태로 존재하고, 생체 내에서 레이저가 조사되면 상기 공액 고분자가 흡광하여 방출하는 열에 의하여 녹을 수 있는 물질이다.

즉, 상 변화 물질 중에서도 상기와 같은 지방산을 사용하면 상기 공액 고분자를 별도의 도핑 과정 없이도 도핑시킬 수 있으며, 중성 환경뿐만 아니라, pH 8 이하, 바람직하게 pH 1 내지 8의 알칼리성 환경에서도 상기 공액 고분자를 도핑시킬 수 있다.

상기 공액 고분자를 도핑시킬 수 있는 도펀트로는 활성산소종, 활성질소종, 과산화 수소, 생체 이온 및 프리 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 산화물질, 또는 산화환원력을 갖는 생체 분자일 수 있으나, 상기 공액 고분자의 적외선 흡광 성능 및 전기 전도성을 더욱 향상시킬 수 있다는 측면에서 상기 도펀트는 수소 이온일 수 있다.

상기 양친매성 고분자는 상기 공액 고분자와 상기 지방산의 혼합물을 포함하는 입자를 둘러쌈으로써 상기 공액 고분자 나노 입자가 수용성을 띄도록 한다. 이에 따라, 상기 공액 고분자 나노 입자는 상기 공액 고분자 및 상기 지방산을 포함하는 코어와 상기 코어를 상기 양친매성 고분자가 둘러싸서 형성되는 쉘을 포함하는 코어-쉘(core-shell) 구조를 가질 수 있다. 한편, 상기 코어는 상기 공액 고분자와 상기 지방산의 혼합물 형태일 수 있으나, 상기 공액 고분자를 상기 지방산이 둘러싸고 있는 층상 형태일 수도 있다.

상기 양친매성 고분자는 친수성기와 소수성기를 가지는 물질이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 화학 합성에 의한 물질일 수도 있고 천연에 존재하는 물질일 수도 있다. 또한, 상기 양친매성 고분자는 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

구체적으로, 상기 양친매성 고분자는 소듐 콜레이트 하이드레이트, n-옥틸글루코시드, 옥틸티오글루코시드, N-옥타노일-N-메틸글루카민, N-노나노일-N-메틸글루카민, 퀼라야 껍질(quillaja bark) 유래 사포닌, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 도데실 황산 나트륨, 테트라메틸암모늄 하이드록사이드 용액, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 디도데실디메틸암모늄 브로마이드(DMAB), N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)데옥시콜아미드(deoxy-BIGCHAP), N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)콜아미드(BIGCHAP), 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에테르, 플루로닉 F-68, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 트윈 40, 트윈 80, 이게팔(Igepal) CA-630, 이게팔 CO-210, 이게팔 CO-520, 이게팔 CO-630, 이게팔 CO-720, 이게팔 CO-890, 이게팔 DM-970, 이게팔 CA-210, 이게팔 CA-520, 이게팔 CA-630, N-데카노일-N-메틸글루카민, 노닐페닐-폴리에틸렌 글리콜, 브리지 76(Brij 76), 브리지 58, 브리지 35P, 브리지 30, 폴리소르베이트 80, 사이클로헥실메틸-β-D-말토시드 (Cymal-1), 2-사이클로헥실에틸-β-D-말토시드 (Cymal-2), 5-사이클로헥실펜틸-β-D-말토시드(Cymal-5), 6-사이클로헥실헥실-β-D-말토시드(Cymal-6), 디기토닌, 데실-β-D-말토피라노시드, 라우릴-β-D-말토시드(DDM), n-헥사데실-β-D-말토시드, 운데실-β-D-말토시드, 데실-β-D-1-티오말코피라노시드, 데실-β-D-1-티오글루코피라노시드, 디메틸데실포스핀 옥사이드, 도데실디메틸포스핀 옥사이드 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 공액 고분자 나노 입자는 상기 공액 고분자 100 중량부에 대하여 상기 지방산을 1 내지 1000 중량부로 포함할 수 있다. 상기 지방산의 함량이 1 중량부 미만인 경우 상기 약제학적 성분의 담지에 있어 그 효율성이 낮아질 수 있고, 1000 중량부를 초과하는 경우 상기 공액 고분자 나노 입자의 크기가 너무 커지게 되어 상기 공액 고분자 나노 입자의 안정성이 떨어질 수 있다.

상기 공액 고분자 나노 입자는 상기 공액 고분자 100 중량부에 대하여 상기 양친매성 고분자를 1 내지 1000 중량부로 포함할 수 있다. 상기 양친매성 고분자의 함량이 1 중량부 미만인 경우 상기 공액 고분자 나노 입자를 둘러싸고 있는 상기 양친매성 고분자의 양이 너무 적어 수용상에서의 상기 공액 고분자 나노 입자의 안정성이 떨어질 수 있고, 1000 중량부를 초과하는 경우 세포 및 동물 등의 생체 내에 적용시 생체 적합성이 떨어질 수 있다.

상기 공액 고분자 나노 입자는 직경이 1 내지 500nm일 수 있고, 바람직하게 5 내지 50nm일 수 있고, 더욱 바람직하게 10 내지 25nm일 수 있다. 상기 공액 고분자 나노 입자의 직경이 500nm를 초과하게 되는 경우 큰 입자 사이즈에 의해 용해도가 낮아지고 수용액 상에서 콜로이드 안정성이 떨어질 수 있다.

상기 공액 고분자 나노 입자는 공액 고분자 및 지방산을 용매에 용해시켜 제1 혼합 용액을 제조하는 단계, 상기 혼합 용액을 양친매성 고분자를 포함하는 용액과 혼합하여 제2 혼합 용액을 제조하는 단계, 그리고 상기 제2 혼합 용액을 반응시키는 단계를 통하여 제조할 수 있다. 상기 공액 고분자 나노 입자의 제조 방법에 따르면 중성 환경에서도 도핑된 공액 고분자 나노 입자를 제조할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 수성 용매에 상기 공액 고분자 및 상기 지방산을 분산시키고, 상기 수성 용매에 분산되어 있는 공액 고분자 및 상기 지방산을 양친매성 고분자가 분산된 수상에 주입한다. 주입 후 교반하면, 용매상은 수상에 드랍릿(droplet) 형태로 평형을 이루게 되고, 이때 양친매성 고분자는 계면의 드랍릿(deoplet)에 흡착하게 되어 공액 고분자 나노 입자를 얻을 수 있다.

이렇게 생성된 공액 고분자 나노 입자는 공액 고분자 코어와 친수성 쉘로 이루어진 구조를 가질 수 있다. 상기 양친매성 고분자의 친수성 기에 의해 상기 공액 고분자 및 지방산을 포함하는 공액 고분자 코어를 둘러싸는 친수성 쉘이 형성될 수 있다. 상기 친수성 쉘은 상기 공액 고분자 코어의 외부에 위치하여 높은 수용성을 나타내어 상기 공액 고분자 나노 입자의 분산성을 높일 수 있다.

상기 수성 용매는 물에 용해되는 용매이면 제한 없이 이용할 수 있다. 예를 들어, 수성 용매는 N-메틸-2-피롤리돈, 아세톤, 아세토니트릴, 사염화탄소, 클로로포름, 사이클로헥산, 1,2-디클로로에탄, 디클로로메탄, 디에틸에테르, 디메틸 포름아마이드, 디메틸설폭사이드, 1,4-디옥산, 에탄올, 에틸 아세테이트, 헵탄, 헥산, 메탄올, 메틸 3급부틸 에테르(methyl-tert-buryl ether), 펜탄, 1-프로판올, 2-프로판올, 테트라하이드로퓨란, 톨루엔, 2,2,4-트리메틸펜탄, 물 또는 이들의 혼합물 일 수 있다.

상기 제2 혼합 용액을 반응시키는 단계는 상기 지방산의 녹는점 이하의 온도에서 상기 제2 혼합 용액을 교반시켜 이루어질 수 있다. 즉, 상기 제2 혼합 용액의 반응을 상기 지방산의 녹는점 이하의 온도에서 진행함으로써, 상기 지방산이 고상으로 존재하는 공액 고분자 나노 입자를 제조할 수 있다. 따라서, 상기 반응 온도는 상기 지방산의 녹는점 이하인 1 내지 99℃, 바람직하게 15 내지 50℃, 더욱 바람직하게 30 내지 40℃일 수 있다.

본 발명의 다른 일 예에 따른 공액고분자 나노 입자는 섬유상 공액 고분자들이 다수의 기공을 포함하도록 뭉쳐져 이루어진 것일 수 있다.

상기 공액 고분자 나노 입자는, 예를 들면, 연속되지 않은 복수의 실을 여러 방향으로 감아 구형을 이루는 실타래 형상(skein shape)을 가진다고 표현될 수 있다.

기존의 공액 고분자 나노 입자는 입자형을 이루지 못하거나 또는 입자형을 이루더라도 주사전자현미경으로 관찰하면 매끈한 표면을 관찰할 수 있으나, 상기 공액 고분자 나노 입자는 주사전자현미경으로 관찰하면 울퉁불퉁한 표면을 관찰할 수 있고, 공액 고분자 나노 입자 전체가 실타래 형상을 가지는 것을 관찰할 수 있다.

또한, 상기 공액 고분자 나노 입자는 스웰링된 것일 수 있다. 상기 공액 고분자 나노 입자는 제 3 용매에 의하여 스웰링됨으로써 적절한 다공도를 가지며, 수용성을 가질 수 있다.

상기 공액 고분자 나노 입자는 다수의 공극을 가질 수 있다. 하나의 예시에서 아닐린의 단독 중합체로 이루어지는 공액 고분자 나노 입자는 0.03 내지 1.00cm³/g의 공극 용적(pore volume)을 가질 수 있다. 반면, 분말 형태의 아닐린 단독 중합체는 0.02cm³/g의 공극 용적을 가진다. 또한, 분말 형태의 아닐린 단독 중합체는 7m²/g 미만의 질소흡착 비표면적을 가지나, 상기 공액 고분자 나노 입자는 7 내지 200m²/g의 질소흡착 비표면적을 가질 수 있다.

상기 공액 고분자 나노 입자는, 예를 들면, 10nm 내지 1000㎚, 10nm 내지 500㎚, 10nm 내지 300㎚ 또는 10nm 내지 100㎚의 평균입경을 가질 수 있다. 또한, 상기 공액 고분자 나노 입자는 1 내지 100㎚, 1 내지 50㎚, 1 내지 30㎚ 또는 1 내지 20㎚의 표준편차를 가지는 입경 분포를 가질 수 있다.

상기 공액 고분자 나노 입자는, 기존의 살리실산 첨가방식, 계면활성제 첨가 방식 및 친수성 관능기 도입 방식을 이용하여 제조된 공액 고분자 나노 입자와 달리 전체 함량의 대부분이 순수한 공액 고분자로 이루어진 것일 수 있다. 하나의 예시에서 공액 고분자 나노 입자는 60 중량% 이상이 공액 고분자인 것일 수 있다. 여기서 공액 고분자 나노 입자의 중량에 용매는 포함되지 않는다. 만일 공액 고분자 나노 입자가 용매에 분산된 상태라면 공액 고분자 나노 입자의 중량은 용매를 제외한 고형분의 중량이며, 공액 고분자 나노 입자에 증발되지 않은 용매가 남아있다 하더라도 상기 용매는 공액 고분자 나노 입자의 중량에서 제외된다. 상기 공액 고분자 나노 입자는 원료인 공액 고분자의 순도에 따라 공액 고분자를 전체 함량 대비 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 80 중량% 이상, 90 중량% 이상, 98 중량% 이상, 99 중량% 이상, 99.5 중량% 이상 또는 99.9 중량% 이상으로 포함할 수 있다. 원료인 공액 고분자의 순도가 매우 높다면 상기 공액 고분자 나노 입자는 순수하게 공액 고분자로만 이뤄질 수 있으므로, 상기 공액 고분자의 함량의 상한은 제한되지 않는다.

특히, 상기 공액 고분자 나노 입자는 아닐린의 단독 중합체로 이루어질 수 있다. 아닐린의 단독 중합체는 소수성이 매우 커서 공액 고분자 나노 입자를 제조하기 매우 어려우나, 상기 공액 고분자 나노 입자는 아닐린의 단독 중합체로 이루어진 공액 고분자 나노 입자이며, 더욱이 상기 아닐린의 단독 중합체로 제조된 공액 고분자 나노 입자는 수용성을 가져 물에 분산되는 특이한 특성도 나타낸다.

상기 공액 고분자 나노 입자는 공액 고분자 용액으로부터 적어도 일부의 공액 고분자를 석출시키는 단계; 및 적어도 일부의 공액 고분자가 석출된 용액을 가열하는 단계를 통하여 제조될 수 있다.

상기 제조 방법에서 사용되는 공액 고분자로는 상기한 바와 같으므로 반복적인 설명은 생략한다.

상기 공액 고분자를 석출시키는 단계는 제 1 용매에 공액 고분자를 용해시키고, 상기 공액 고분자가 용해된 용액에 제 2 용매를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 여기서 상기 제 2 용매는 공액 고분자에 대하여 제 1 용매 보다 낮은 용해도를 가지는 것으로서, 제 1 용매에 용해된 공액 고분자에 제 2 용매를 첨가하면 제 1 및 제 2 용매의 혼합 용매로부터 공액 고분자의 적어도 일부가 석출될 수 있다.

상기 제 1 용매는 공액 고분자를 용해시킬 수 있는 것으로서, 제 1 용매로는, 예를 들면, 용해도가 1.0mg/mL 이상, 1.5mg/mL 이상 또는 2.0mg/mL 이상인 것을 사용할 수 있다. 상기 용해도는 1mL의 해당 용매에 용해된 공액 고분자의 최대 중량으로 정의될 수 있다. 또한, 상기 용해도는 해당 용매에 공액 고분자를 점진적으로 첨가하면서 공액 고분자가 첨가된 용액의 흡광도를 측정하되, 용액의 흡광도가 더 이상 증가하지 않는 시점까지 첨가된 공액 고분자의 함량(최대 중량)을 구하여 측정될 수 있다. 구체적으로 상기 용해도는 중량평균분자량이 5000g/mol인 폴리아닐린을 이용하여 측정된 것일 수 있다. 상기 제 1 용매의 용해도 상한은 특별히 제한되지 않으며, 제 1 용매의 용해도는, 예를 들면, 100mg/mL 이하로 조절될 수 있다.

상기 제 2 용매는 제 1 용매보다 공액 고분자에 대한 용해도가 낮은 용매로서, 제 2 용매로는, 예를 들면, 용해도가 0.5mg/mL 이하 또는 0.3mg/mL 이하인 것을 사용할 수 있다. 제 2 용매의 용해도의 하한은 특별히 제한되지 않으며, 제 2 용매의 용해도는, 예를 들면, 0.001mg/mL 이상으로 조절될 수 있다.

상기 제 1 용매 및 제 2 용매로는 상술한 조건을 만족하는 것이라면 특별한 제한 없이 다양한 용매들을 채용할 수 있다.

제 1 용매의 예로는 1-메틸-2-피롤리돈 등의 락탐계 용매; o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸 등의 방향족계 용매; 사이클로펜타논, 사이클로헥사논 등의 케톤계 용매; 디메틸설폭사이드 등의 황화합물 용매; 디메틸포름아미드 등의 아미드계 용매; 클로로포름 등의 할로겐계 용매; 감마부티로락톤 등의 락톤계 용매; 테트라히드로푸란 등의 비방향족 에테르계 용매; 또는 이들의 혼합물 등을 예시할 수 있다.

상기 제 2 용매의 예로는 벤질 에테르, 페닐 에테르, 나프틸 에테르, 벤질 알킬 에테르, 페닐 알킬 에테르, 나프틸 알킬 에테르 또는 이들의 혼합물 등을 예시할 수 있다. 상기에서 알킬은 탄소수 1 내지 10의 직쇄상, 분지쇄상 또는 고리상 알킬일 수 있다.

상기 제 1 및 제 2 용매는 공액 고분자를 완전히 용해시켰다가 용해된 공액 고분자 중 적어도 일부가 석출될 수 있도록 적절한 함량으로 사용될 수 있다.

상기 제 1 용매는 공액 고분자 100 중량부 대비 100 내지 10000 중량부, 1000 내지 5000 중량부 또는 1500 내지 2500 중량부로 사용될 수 있다. 상기와 같은 범위로 제 1 용매를 사용하는 경우 공액 고분자를 고르게 분산시킬 수 있고, 그 결과 적절한 크기의 공액 고분자 나노 입자를 균일하게 제조할 수 있다.

또한, 제 2 용매는 공액 고분자 100 중량부 대비 100 내지 10000 중량부, 1000 내지 5000 중량부 또는 1500 내지 2500 중량부로 사용될 수 있다. 상기와 같은 범위로 제 2 용매를 사용하는 경우 공액 고분자를 적절한 수준으로 석출시킬 수 있고, 그 결과 적절한 크기의 공액 고분자 나노 입자를 균일하게 제조할 수 있다.

상기 공액 고분자를 석출시키는 단계는 상온에서 진행될 수 있다. 본 명세서에서 상온은 가온 또는 감온되지 않은 자연 그대로의 온도를 의미하고, 예를 들면 약 15 내지 35℃ 또는 20 내지 25℃의 온도를 의미할 수 있다.

상기 단계에서 공액 고분자가 석출되면 공액 고분자가 석출된 용액은 가열될 수 있다. 공액 고분자의 용액을 가열하는 온도는 공액 고분자의 종류 및 함량에 따라 적절하게 조절할 수 있다. 예를 들면, 상기 공액 고분자의 용액을 가열하는 단계는 상기 공액 고분자의 용액을 100 내지 500℃, 100 내지 400℃, 100 내지 350℃, 150 내지 500℃, 150 내지 400℃ 또는 150 내지 350℃의 온도에서 가열하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 공액 고분자의 용액을 가열하는 단계는 상기 공액 고분자의 용액을 상기 온도에서 10분 내지 10시간, 10분 내지 5시간, 10분 내지 3시간 또는 30분 내지 2시간 정도 가열할 수 있다. 만일 가열하는 단계에서 상기 용액의 가열 온도 및 시간을 상기 범위 미만으로 조절한 경우 공액 고분자 나노 입자의 수득률이 저하되며, 상기 용액의 가열 온도 및 시간을 상기 범위를 초과하도록 조절하는 경우 적절한 크기의 공액 고분자 나노 입자가 형성되지 않을 수 있다.

한편, 상기 프로브는 상기 공액 고분자 나노 입자와 함께 표지자를 더 포함할 수 있다.

상기 표지자의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 프로브의 반응 전 후의 변화에 따라 특성이 변화하고, 시험 등을 통하여 상기 변화된 특성을 확인할 수 있는 표지자이면 제한 없이 이용 가능하다. 예를 들어, 프로브의 융합 여부를 판별할 수 있는 표지자는 자기-소광된 염료(sel-quenched dye), 형광 염료(dye), 전기화학발광 물질 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.

본 발명에서, 자기-소광된 염료는 염료(sel-quenched dye)가 서로 인접한 위치에 있는 경우에는 소광 작용이 일어나고, 뭉쳐있는 염료가 방출되어 퍼지게 되면 탈소광 작용에 의하여 형광이 나타나는 물질을 의미한다.

한 예에서, 자기-소광된 염료는 3,3-디옥타데실옥사카보시아닌퍼클로레이트(3,3 -Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorate; Dio; Dioc), 3,3-디옥타데실-5,5-디(4-설포페닐)옥사카보시아닌 소듐염(3,3-dioctadecyl-5,5-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine sodium salt), 4-(4-(디헥사데실아미노)스티릴)-N-메틸피리디늄 이오다이드(4-(4-(dihexadecylamino)styryl)-N-methylpyridinium iodide; DiA; 4-Di-16-ASP), 4-(4-(디데실아미노)스티릴)-N-메틸피리디늄 이오다이드(4-(4-(Didecylamino)Styryl)-N-Methylpyridinium Iodide; 4-Di-10-ASP), 1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도카보시아닌 퍼클로레이트(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; Dil), 1,1-디옥타데실-6,6-디(4-설포페닐)-3,3,3,3-테트라메틸인도카보시아닌(1,1-Dioctadecyl-6,6-Di(4-Sulfophenyl)-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine), 4,4-디이소티오시아나토스틸벤-2,2-디설폰산 디소듐염(4,4-diisothiocyanatostilbene-2,2-disulfonicacid disodium salt; DIDS), 1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도트리카보시아닌 이오다이드(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyanine iodide; DiR), 1,1-디올레일-3,3,3,3-테트라메틸인도카보시아닌(1,1-dioleyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine), 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODYPY), 테트라메틸로다민(Trtramethylrhodamine), 옥타데실 로다민 B 클로라이드(R18), 알렉사(Alexa), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 형광 염료의 평균 입경은 200nm 이하, 또는 50nm 내지 10000nm일 수 있다.

한 예에서, 전기화학발광 물질은, 이에 제한되는 것은 아니나, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄(II)[Ru(bpy)32+]을 포함한다.

본 발명에서 형광 염료(dye)는 형광을 나타내는 물질로, 광에 포함된 파장을 흡수하여 색광을 바꾸어 재방사하는 성질을 갖는 물질을 의미한다. 형광염료는 발광염료 라고도 하며, 당업계에 잘 알려져 있는 형광 염료를 제한없이 이용할 수 있다. 한 예에서, 형광 염료는 텍사스 레드(Texas red), 플루오레세인(fluorescein), 4-클로로-7-니트로벤조퓨라잔(4-chloro-7-nitrobenzofurazan; NBDCl), 루미놀(luminol), 플러렌(fullerene), 방향족기를 포함하는 화합물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

한 예에서, 인광 염료는 조명광 안에서 흡수한 파장을 바꾸어 재방사함으로써 광휘성 효과를 나타내는 물질을 의미한다. 일 예로, 황화광물(X_mZ_n, X는 금속원소, Z는 비금속원소) 또는 알칼리토금속의 황화물 일 수 있으나, 그 종류가 제한되지 않는다.

본 발명의 한 예에서, 키트 또는 조성물은 pH 6 이하의 산성 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, pH 6 이하의 산성 물질은 산성 용액일 수 있으며, 상기 pH 범위의 산성 용액을 키트에 포함할 수도 있고, 사용시 직접 제조하여 사용할 수도 있다. pH 6 이하의 산성 용액은 상기 pH 조건을 만족하는 용액이면 제한 없이 사용할 수 있다. 시판되는 스톡 용액을 이용할 수도 있고, 직접 제조하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, 진한 산성 용액인 스톡 용액(stock solution)을 pH 6 이하가 되도록 물에 희석하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 산성 용액은 pH 4 내지 6 또는 pH 5 내지 pH 5.7일 수 있다. 상기 범위가, 숙주 세포 내의 pH 범위와 유사하므로, 검출 효율을 높일 수 있다.

한 예에서, 본 발명의 키트 및 조성물은 반응 보조제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 반응 보조제는 생체 분자와 바이러스의 반응을 도와주는 생체 분자의 반응 보조제 일 수 있고, 또는 프로브와 표적분자의 반응을 도와주는 반응 보조제 일 수 있다. 구체적인 일 예로, 단백질 분해 효소와 표면 단백질의 반응을 도와주는 보조제, 또는 프로브와 활성형 바이러스 활성화된 표면 단백질, 활성형 바이러스의 항원성 단백질을 포함하는 표적분자와의 반응을 도와주는 보조제 일 수 있다.

본 발명에서 사용한 용어, 보조제는 상기 등의 작용을 통해서 바이러스의 검출 민감도 및/또는 특이도를 높일 수 있는 것이라면 모두 포함하는 의미이다. 상기 바이러스의 검출 민감도 및/또는 특이도를 높이는 것의 예로 반응의 속도를 빠르게 하거나, 반응이 일어나는 최소값을 낮추는 작용 또는 표면 단백질과 생체 분자의 반응 외에 다른 반응을 억제하는 작용이 있으나, 상기 메커니즘에 제한되지 않는다. 보조제는 생체 분자 및 이와 반응하는 표면 단백질의 종류에 따라서 검출 민감도 및/또는 특이도를 높일 수 있는 것이면 종류에 제한 없이 모두 포함한다.

구체적인 일 예로 상기 보조제는 케톤일 수 있다.

상기 케톤 화합물은 예를 들어 페닐에틸 클로로메틸 케톤, 토실 페닐알라닐 플로로메틸 케톤(TPCK, Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone) 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예에서, 인플루엔자 바이러스 검출 시 보조제로 케톤을 더 포함할 수 있다. 이 경우, 다른 효소의 활성을 낮추고, 헤마글루티닌(HA) 분해 효소, 특히 트립신의 활성을 높여주어 키트의 민감도를 더욱 높일 수 있다.

본 발명은 바이러스 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 검출방법은 개체로부터 수득한 시료를 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자와 접촉시키는 단계, 그리고 상기 생체 분자와 접촉된 시료를 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 프로브는 공액 고분자 나노 입자를 포함한다.

본 발명의 검출방법은 상기 접촉에 의하여 일어나는 반응의 여부를 확인함으로써 바이러스를 검출할 수 있다. 일 예로, 활성형 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 융합 펩타이드가 엔도좀의 세포막을 융합하는 원리를 이용하여, 활성형 바이러스와 프로브의 융합 반응 여부를 확인함으로써 활성형 바이러스를 검출할 수 있다. 다른 예로, 활성형 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 융합 펩타이드가 프로브의 안정성을 낮추는 원리를 이용하여, 프로브의 응집 반응 여부를 확인함으로써 활성형 바이러스를 검출할 수 있다.

상기 프로브가 상기 자기-소광된 염료(sel-quenched dye), 형광 염료(dye) 또는 전기화학발광 물질 등의 표지자들을 더 포함하는 경우, 상기 활성형 바이러스와 프로브가 반응하는 경우 나타나는 변화 또는 신호는, 형광강도, 발광강도, 인광강도, 흡광강도, 전기적 신호, 표면증강 라만 분광(surface-enhanced Raman spectroscopy; SERS) 신호, FET(field-effect transistor), 색 및 프로브의 분산도로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 변화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기 공액 고분자 나노 입자는 나노 소광자의 역할을 하는 것으로서, 상기 표지자들의 quenching 전 레벨을 낮추어 상기 표지자들이 더욱 잘 quenching될 수 있도록 함으로써, 상기 활성형 바이러스와 프로브의 반응을 보다 민감하게 검출할 수 있도록 한다.

예를 들어, 프로브의 반응 여부를 판별할 수 있는 표지자로 자기-소광된 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브와의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내에 담지된 자기-소광된 염료와 같은 표지자가 방출되게 되고, 탈소광(quenching)이 일어나 형광이 나타나게 된다. 따라서, 형광 강도의 변화를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다.

또한, 프로브의 반응 여부를 판별할 수 있는 표지자로 형광 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브와의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내에 담지된 형광 염료가 방출되게 되고, 형광 강도를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다. 형광강도 외에, 발광강도, 인광강도, 흡광강도 역시 형광강도와 마찬가지로 파장에 따라 달라지기 때문에, 이들을 측정하여 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다. 특히, 형광 염료 중에서, 루미놀이나 플러렌 등은 특별한 기기에 의한 형광 강도의 측정 없이, 육안으로도 색의 변화를 감지할 수 있다.

형광 염료 이외에도, 트리스(2,2'-비피리딜)루테늄(II)[Ru(bpy)32+])과 같은 전기화학발광 물질을 포함할 수 있으며, 이 경우 육안으로 색의 변화 관찰이 가능하다.

또한, 나노갭 센서를 이용하여 전기적 신호를 측정함으로써 바이러스를 검출할 수 있다. 전기적 신호는 전류 변화를 측정하거나, 또는 FET(Fieldeffect transistor)를 이용하여 측정할 수도 있다. 나노갭 센서란 갭의 간격이 약 100nm 이하인 전극이 포함된 센서를 의미한다. 예를 들어, 프로브의 반응 여부를 판별할 수 있는 표지자로 형광 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내부의 형광 염료가 방출되어 나노갭 센서의 나노갭에 위치하게 된다. 이 때, 나노갭 센서에 미리 위치시킨 금, 은, 크롬, 티타늄, 백금, 구리, 팔라디움, ITO(indium tin oxide), 또는 알루미늄 등의 금속 입자의 전류 변화를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다. 금속 입자의 평균 입경은 수 나노미터일 수 있으며, 예를 들어, 2 내지 4nm일 수 있다.

또한, 표면증강 라만 분광 신호를 측정하여 바이러스를 검출할 수 있다. 표면증강 라만 분광 신호를 측정하기 위하여, 시료와 결합 가능한 기재를 이용할 수 있다. 기재는 나노입자, 콜로이드, 액상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 프로브의 융합 여부를 판별할 수 있는 표지자로 형광 염료를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내부의 형광 염료가 방출된다. 방출된 형광 염료를 기재와 결합시킨 후, 상기 기재와 결합된 형광 염료에 다시 금속 입자를 도입한다. 금, 은 등의 금속 입자를 도입함으로써, 라만 분광을 증폭시킬 수 있다. 그 후, 라만 분광기로 상기 형광 염료의 라만 스펙트럼을 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다.

다른 예로, 활성형 바이러스에 의하여 프로브의 응집이 일어남에 따라 프로브의 응집 여부, 즉 분산도의 변화를 확인함으로써 바이러스를 검출할 수 있다. 예를 들어, 프로브로 유무기 입자를 이용하는 경우, 활성형 바이러스에 의하여 유무기 입자 의 안정성이 낮아짐에 따라 상기 입자의 응집이 일어나게 된다.

본 발명의 일 예에 따라, 활성형 바이러스에 존재하는 융합 펩타이드가 유무기 입자 주변에 존재하는 계면활성제 등의 안정화제 또는 양친성 고분자를 끌어당겨, 유기물질의 안정성이 떨어지게 됨에 따라 유무기 입자끼리의 응집이 일어난다. 이러한 응집 여부는 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있어, 손쉽게 바이러스 감염 여부를 검출할 수 있다.

한 예에서, 상기 바이러스 검출방법의 적어도 하나 이상의 단계는 pH 6 이하의 조건 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, pH 4 내지 pH 6, pH 5 내지 pH 5.5의 산성 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 일 예로 인플루엔자 바이러스를 검출하는 경우, 산성 조건에서 수행하는 것이, 숙주 세포 내 환경과 매우 유사한 조건을 제공할 수 있어, 검출 정확도를 높일 수 있는 이점이 있다.

본 발명에서 사용한 용어, "시료"는 바이러스의 검출을 위해 모체를 대표하도록 채취된 것을 의미한다. 한 예에서, 시료는 타액, 구강 점막 또는 분뇨 시료일 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따른 바이러스 검출방법의 모식적으로 보여주는 도면이다. 상기 도 1의 A 및 B에서 표지자가 프로브 내부에 포함되어 있고, 도 7의 B에서는 공액 고분자 나노 입자가 프로브 외부에 부착되어 있으나, 도 1의 A에서는 공액 고분자 나노 입자를 포함하고 있지 않다.

상기 도 1을 참조하면, 상기 표지자가 자기-소광된 염료인 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브와의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내에 담지된 자기-소광된 염료가 방출되고, 탈소광(quenching)이 일어나 형광이 나타나게 된다. 따라서, 형광 강도의 변화를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다. 이때, 상기 공액 고분자 나노 입자는 상기 표지자들의 quenching 전 레벨을 낮추어 상기 표지자들이 더욱 잘 quenching될 수 있도록 함으로써(향상된 quenching), 상기 활성형 바이러스와 프로브의 반응을 보다 민감하게 검출할 수 있도록 한다.

도 2 및 도 3은 본 발명의 다른 일 예에 따른 바이러스 검출방법의 모식적으로 보여주는 도면이다. 상기 도 2 및 도 3에서는 표지자가 프로브 내부에 포함되어 있고, 도 2에서는 공액 고분자 나노 입자가 프로브 내부에 함께 포함되어 있고, 도 3에서는 공액 고분자 나노 입자가 기판에 부착되어 상기 공액 고분자 나노 입자를 매개로 상기 프로브가 상기 기판에 부착되어 있다.

상기 도 2 및 도 3을 참조하면, 상기 표지자가 자기-소광된 염료인 경우, 활성형 바이러스에 의하여 프로브와의 융합이 일어나게 되면, 프로브 내에 담지된 자기-소광된 염료가 방출되고, 상기 자기-소광된 염료의 탈소광(quenching)이 일어나 형광이 나타나게 된다. 따라서, 형광 강도의 변화를 측정함으로써, 바이러스의 감염 여부를 검출할 수 있다.

이때, 상기 공액 고분자 나노 입자는 나노 소광자로서 상기 표지자들의 quenching 전 레벨을 낮추어 상기 표지자들이 더욱 잘 quenching될 수 있도록 함으로써(향상된 quenching), 상기 활성형 바이러스와 프로브의 반응을 보다 민감하게 검출할 수 있도록 한다.

본 발명은 또한, 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자, 그리고 상기 생체분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하며, 상기 프로브는 공액 고분자 나노 입자를 포함하는 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다. 상기에서 바이러스 검출 키트 및 바이러스 검출방법에 대하여 기술한 모든 내용이 바이러스 검출용 조성물에도 적용 또는 준용될 수 있다.

Claims

바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자, 그리고
상기 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하며,
상기 프로브는 공액 고분자 나노 입자를 포함하는 것인 바이러스 검출용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 공액 고분자 나노 입자는 공액 고분자, 지방산(fatty acid) 및 양친매성 고분자를 포함하는 것인 바이러스 검출용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 공액 고분자 나노 입자는 상기 공액 고분자 및 상기 지방산을 포함하는 코어, 및
상기 코어를 둘러싸며, 상기 양친매성 고분자를 포함하는 쉘을 포함하는 것인 바이러스 검출용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 공액 고분자 나노 입자는 섬유상 공액 고분자들이 다수의 기공을 포함하도록 뭉쳐져 이루어진 것인 바이러스 검출용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스 및 파라믹소 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 바이러스 검출용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 바이러스의 표면 단백질은 헤마글루티닌(HA), 스파이크 단백질(spike protein), F 단백질(F protein) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 바이러스 검출용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자는 효소인 것인 바이러스 검출용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 프로브는 마이셀(micelle), 폴리머좀(polymersome), 콜로이드좀(colloidsome), 베지클(vesicle), 리포좀(liposome), 액적(droplet) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 바이러스 검출용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 프로브는 양친성 입자, 유무기 입자, 항체, 압타머 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 바이러스 검출용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 프로브는 자기-소광된 염료, 형광 염료, 전기화학발광 물질 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 표지자를 더 포함하는 것인 바이러스 검출용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 키트는 pH 6 이하의 산성 물질을 추가로 포함하는 것인 바이러스 검출용 키트.
바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자, 그리고
상기 생체 분자에 의하여 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 포함하며,
상기 프로브는 공액 고분자 나노 입자를 포함하는 것인 바이러스 검출용 조성물.
개체로부터 수득한 시료를 바이러스의 표면 단백질과 특이적으로 반응하는 생체 분자와 접촉시키는 단계, 그리고
상기 생체 분자와 접촉된 시료를 상기 생체 분자에 의해 활성화된 바이러스와 반응하는 프로브를 접촉시키는 단계를 포함하며,
상기 프로브는 공액 고분자 나노 입자를 포함하는 것인 바이러스 검출방법.