TWI803993B - 環胜肽自組裝3d微粒裝置及其製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明係提供一種環胜肽自組裝3D微粒裝置及其製造方法。此環胜肽自組裝3D微粒裝置包含環胜肽自組裝3D微粒，其係由一環化雙胜肽(-D-色胺酸-L-酪胺酸)(Cyclo(-D-Trp-L-Tyr))所組成，並形成一球型結構；以及一基質，其係與該環胜肽自組裝3D微粒複合。該環胜肽自組裝3D微粒之外表面還形成有針狀的奈米管結構。

Description

環胜肽自組裝3D微粒裝置及其製造方法

本發明係關於一種環胜肽自組裝3D微粒裝置，特別是關於一種由環(-D-色胺酸-L-酪胺酸)胜肽(Cyclo(-D-Trp-L-Tyr))進行三維組裝(3D)的一球型結構、其與生物基質或藥物複合所形成的遞送載體裝置、以及其製造方法。

基因治療當中，透過口服之基因遞送系統的幫助，有提升順從性和增加局部(腸道)投予專一性及效果，進而降低全身性影響等等優點。其中，對於載體的設計需考量劇烈變化的環境以及相對較低的轉染效率。因此，以胜肽組成之結構是許多實驗證實良好的基因遞送載體。其自組裝之特性和由胺基酸建構成為蛋白質之機轉相關。近年已有研究嘗試透過增加自組裝之方向性，使胜肽自組裝成類似高階蛋白結構來模擬蛋白質功能或拓展更多應用。

胜肽類載體擁有非常多元的物化性質以及特性，因其同時也為生物分子(Biomolecule)，和非常多體內生物交互作用有關係且具有功能性，例如具有配位-受體(ligand-receptor)特性而讓載體有靶向，進而降低副作用，成熟的合成技術可以靈活的更改序列中胺基酸的組成來改變載體物化性質。聚賴氨酸(Poly(L-lysine))為常見帶正電之胜肽聚合物，可與核酸縮合且增加複合物吸附細 胞膜能力，也可與其他材料共同組成載體來遞送基因。細胞穿透胜肽(Cell-penetrating peptide,CPP)一開始從HIV病毒中發現，由5到30個胺基酸組成，擁有高比重帶正電之胺基酸如lysine和arginine能嵌入帶負電之細胞膜；加速載體穿透細胞達到細胞質的過程，有研究指出甚至能運送蛋白質等大分子藥物，針對目標為不同類型之組織細胞也有不同之CPP序列可以應用。

先前在專利文獻TWI523667中，發明人利用環化雙胜肽Cyclo(-D-Trp-L-Tyr)製備了一維組裝(1D)胜肽奈米管，並比較兩種不同長寬比(L-PNT、S-PNT)之奈米管攜帶質體DNA(pMBP-bcl-xL-hRluc)於口服投予小鼠後全身分布情形以及基因表現。結果顯示兩種奈米管皆可幫助質體DNA在腸道吸收並透過體循環進入腦部、脊隨等目標器官。

然而，上述一維組裝(1D)胜肽奈米管在藥物的包載量及腸胃道環境內之安定性仍有提升空間，因此發明人致力於研究一種效果及功能更佳的遞送載體，以期能對產業之進步做出貢獻。

有鑑於此，本發明之目的就在於提供一種能提升藥物的包載量，並能改善在腸胃道環境內之安定性的遞送載體裝置，以提升產業利用之潛力。

為了實現上述目的，本發明提供一種環胜肽自組裝3D微粒裝置，其包含：一環胜肽自組裝3D微粒，其係由環化雙胜肽(-D-色胺酸-L-酪胺酸)(Cyclo(-D-Trp-L-Tyr))所組成，並形成一球型結構；以及一基質，其係與該環胜肽自組裝3D微粒複合。

較佳地，其中該環胜肽自組裝3D微粒之外表面具有針狀的奈米管結構。

較佳地，其中該基質係複合於該環胜肽自組裝3D微粒內側或複合於該環胜肽自組裝3D微粒之一表面上。

較佳地，其中該環胜肽自組裝3D微粒裝置係穩定於胃酸、膽汁及去氧核糖核酸酶中。

較佳地，其中該基質包含胜肽、蛋白質、核酸及藥物。

較佳地，其中該核酸包含去氧核糖核酸(DNA)、小髮夾式核糖核酸(shRNA)、微小核糖核酸(miRNA)以及小片段干擾核糖核酸(siRNA)。

為了實現上述目的，本發明更提供一種環胜肽自組裝3D微粒裝置之製造方法，其包含以下步驟：將一環(-D-色胺酸-L-酪胺酸)胜肽粉末與包含聚環氧乙烷及聚環氧丙烷之一聚合物及滅菌二次水混和後，進行超音波震盪並乾燥靜置；加入酒精溶液後再次進行超音波震盪並乾燥靜置，以形成具有一球型結構的一環胜肽自組裝3D微粒；以及混和該環胜肽自組裝3D微粒及一基質，以使該環胜肽自組裝3D微粒與該基質複合，形成該環胜肽自組裝3D微粒裝置。

較佳地，其中該聚合物可包含聚環氧乙烷-聚環氧丙烷-聚環氧乙烷(poly(ethylene oxide)_a-poly(propylene oxide)_b-poly(ethylene oxide)_a)，化學式為PEO_a-PPO_b-PEO_a，且a為介於3至227之整數，b為介於28至86之整數。

較佳地，其中該聚合物之分子量介於2000至25000。

較佳地，其中該聚合物可包含羥乙基纖維素、聚乙烯醇、聚山梨醇酯、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、或脫水山梨醇三硬脂酸酯。

較佳地，其中該環胜肽自組裝3D微粒之外表面具有針狀的奈米管結構。

較佳地，其中該基質係複合於該環胜肽自組裝3D微粒內側或複合於該環胜肽自組裝3D微粒之一表面上。

較佳地，其中該環胜肽自組裝3D微粒裝置係穩定於胃酸、膽汁及去氧核糖核酸酶中。

較佳地，其中該基質包含胜肽、蛋白質、核酸及藥物。

較佳地，其中該核酸包含去氧核糖核酸(DNA)、小髮夾式核糖核酸(shRNA)、微小核糖核酸(miRNA)以及小片段干擾核糖核酸(siRNA)。

根據本發明之環胜肽自組裝3D微粒裝置及其製造方法具有以下優點：

(1)本發明的環胜肽自組裝3D微粒裝置可有效的穿透細胞，高效率地以口服或其他傳遞方式傳遞生物分子或藥物至生物體，並因此增加生物分子或藥物至期望組織或器官的生物可利用度。

(2)本發明的環胜肽自組裝3D微粒裝置整體為球形，且外表面具有針狀的奈米管結構，其內側及表面皆可與生物分子或藥物複合，可提升藥物的包載量。

(3)本發明的環胜肽自組裝3D微粒裝置能增加在腸胃道環境內之安定性，避免生物分子或藥物提前被胃酸等消化液或酶降解，可增加生物分子 或藥物的效力。

第1圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽自組裝3D微粒之電子掃描顯微鏡照片，其中(A)scale bar：400μm；(B)(C)為(A)所框之處放大scale bar：20μm；(D)(E)分別為(B)、(C)所框之處放大scale bar：5μm；(A)-(E)為BSE模式下拍攝；(F)scale bar：500μm；(G)scale bar：100μm；(H)(I)scale bar：10μm；(J)scale bar：5μm；(K)scale bar：3μm(F)-(K)為SE模式下拍攝。

第2圖 係先前技術之L-PNT、S-PNT之電子掃描顯微鏡照片，其中(A)、(B)為L-PNT，(A)scale bar：100μm；(B)scale bar：5μm；(C)、(D)為S-PNT，(C)scale bar：5μm；(D)scale bar：1μm。

第3圖 係胜肽奈米管S-PNT、L-PNT與根據本發明之一實施例的環胜肽自組裝3D微粒PL之X光小角度散射數據。

第4圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽自組裝3D微粒PL之光學顯微鏡照片，其中(A)為單純PL；(B)為PL/DNA(scale bar：5μm)；(C)為PL經軟體計算直徑分布；(D)為PL/DNA經軟體計算直徑分布，單位μm。

第5圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽自組裝3D微粒(PL)質體複合物之雷射共軛焦顯微鏡照片，其中(A)(B)為同一平面利用共軛焦顯微鏡觀察之不同Z軸切面，相距約13um。綠色訊號為以Ex為514nm，Em為580-640nm觀察pMBP-bcl-x_L-hRluc之Rhodamine-channel；紅色訊號為以Ex為633nm，Em為645-740nm之Cy5-channel觀察PL粒子，Merge-channel為Cy5及Rhodamine channel之疊圖，藍色訊號為以Ex為514nm，Em為645-750nm之FRET channel觀察FRET發生之位置。Scale bar=100μm。

第6圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽載體與環胜肽質體複合物之界達電位(ζ-potential)分布圖譜，其中(A)為PL、(B)為L-PNT、(C)為S-PNT，鏈線為單純環胜肽載體；實線為加入質體DNA之複合物。

第7圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽載體與pMBP-bcl-x_L-hRluc結合之螢光光譜分析，其中(A)、(B)、(C)分別為PL、L-PNT、S-PNT在excitation 280nm下之螢光光譜；(D)、(E)、(F)為經[式2]計算後之值作圖以及迴歸直線方程式。

第8圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽載體包載螢光分子Pyrene於激發光339nm下之發射光圖譜，分別為Blank(二次滅菌水)、PL、L-PNT、S-PNT，加入定量pyrene(6x10^-7M)。

第9圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽載體包載雙螢光分子之發射光圖譜，係包載FITC、Rhodamine Base後以波長490nm為激發光；Blank組為二次滅菌水，強度為樣本組數n=5之平均值。

第10圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽與質體複合物於擬胃液下之安定性測試圖，其中(A)為純質體DNA；(B)為PL/DNA；(C)左邊為L-PNT/DNA；右邊為S-PNT/DNA，數字為時間(分)。

第11圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽與質體複合物於兩種pH值下之安定性測試圖，其中(A)(B)分別為pH4.5及pH 6.8，左邊為純質體DNA右邊為PL/DNA；(C)(D)分別為pH4.5及pH 6.8左邊為LPNT/DNA；右邊為S-DNT/DNA，數字為時間(分)。

第12圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽與質體複合物於DNase I下之安定性測試圖，其中(A)為純質體DNA；(B)PL/DNA；(C)L-PNT/DNA；(D)S-PNT/DNA，數字為時間(分)。

第13圖 係根據本發明之一實施例的環胜肽載體質體複合物之質體DNA釋放圖表，其中倒三角形為純質體DNA；菱形為S-PNT/DNA；正三角形為 PL/DNA；方形為L-PNT/DNA，上下error bar為standard error值，組數n=5；*表示與質體DNA組別有統計上顯著差異(P<0.05)。

第14圖 係口服投予本發明之環胜肽質體複合物後之IgA抗體ELISA分析圖，其中N=6；L-PNT/PED於進行中有2隻死亡，＊表示與Control組別相比有顯著差異；(p<0.05)。

為利於瞭解本發明之技術特徵、內容與優點及其所能達成之功效，茲將本發明配合附圖，並以實施例之表達形式詳細說明如下，而其中所使用之圖式，其主旨僅為示意及輔助說明書之用，故不應就所附之圖式解讀、侷限本發明於實際實施上的權利範圍。

本發明使用之載體材料為環化雙胜肽Cyclo(-D-Trp-L-Tyr)，如下所示：

除了色胺酸(tryptophan,Trp)之結構與疏水特性使其容易與細胞膜及膜上蛋白有交互作用，同時在許多關於細胞穿透胜肽CPP研究中發現能幫助核酸藥物遞送進入細胞；另外，具有嵌入核酸結構的作用，可與核酸分子形成複合物。利用酪胺酸(tyrosine,Tyr)結構上之酚基能透過電子躍遷(Electron transfer)的方式與DNA分子複合(complexation)。此環化雙胜肽能穩定和質體 DNA結合並增加其安定性，實驗室中發現此環胜肽作為載體(口服、眼用)有適合穩定之物化性質，且於動物實驗中能確實使遺傳訊息分布、表現。

本發明使用之環化雙胜肽Cyclo(-D-Trp-L-Tyr)中，色胺酸及酪胺酸以D-form、L-form排列且皆具有芳香環結構，有平面性可以堆疊特性下，除可組裝成胜肽奈米管外，同時，於不同極性環境下所製備的長度也可以有所不同。

在以下實驗中將詳細說明環胜肽自組裝3D微粒(PL)，並與一維組裝(1D)胜肽奈米管(L-PNT、S-PNT)進行比較。

1. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)之製備方法

一維組裝(1D)的胜肽奈米管(L-PNT、S-PNT)是將環化雙胜肽Cyclo(-D-Trp-Tyr)(Mission Biotech)置於酒精溶液或滅菌二次水中，以超音波震盪後乾燥靜置；待其自組裝形成長度較長的L-PNT或較短的S-PNT兩種胜肽奈米管。相對於此，三維組裝(3D)的環胜肽自組裝3D微粒(PL)是透過兩步驟製備方式取得：取上述環化雙胜肽(濃度為1.5mg/ml)與0.1% PEO-PPO-PEO聚合物(分子量8400)1ml及滅菌二次水混和後，經超音波震盪並乾燥1-2天，之後再加入50%酒精溶液進行第二次震盪乾燥3天，待其自組裝形成3D微粒(PL)。

上述聚合物之化學式具體為PEO_a-PPO_b-PEO_a，且a為介於3至227之整數，b為介於28至86之整數，聚合物之具體例及其對應之環胜肽自組裝3D微粒的粒徑如下表1所示。

此外，同樣使用分子量8400的聚合物(PEO₇₆-PPO₂₈-PEO₇₆)時，不同的酒精濃度對環胜肽自組裝3D微粒的粒徑之影響如下表2所示。

上述聚合物之組成(或分子量)及酒精的濃度雖會影響自組裝3D微粒的大小，但在上述範圍中的條件下形成的環胜肽自組裝3D微粒基本都能發揮本發明所追求的特性及功能。

此外，上述實施例雖以PEO-PPO-PEO聚合物為例，但本發明所添加之聚合物係不限於此，例如可使用包含羥乙基纖維素(2-hydroxyethyl cellulose)、聚乙烯醇(2Polyvinyl Alcohol)、聚山梨醇酯(Tween® 20)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物(Eudragit® E100)、或脫水山梨醇三硬脂酸酯(Span 65)等，如下表3所示。

如上表所示，添加上述聚合物同樣能促成本發明所述之自組裝3D微粒，彼此間的差別僅在於3D組裝後的粒徑大小，因此在具體實施本發明時，業者可根據所需的粒徑大小選擇添加的聚合物種類。

2. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)與質體DNA複合物之製備

將1.5mg之PL與1mL之260ng/μL質體DNA水溶液混合均勻，於室溫下緩慢搖盪16小時，即可得到PL/DNA。用於比較之胜肽奈米管(L-PNT、S-PNT)也可通過同樣方式形成L-PNT/DNA、S-PNT/DNA。

3. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)的光小角度散射(Small Angle X-ray Scattering)

使用國家同步輻射中心台灣光源(TLS)之X光小角度散射來分析環胜肽Cyclo(-D-Trp-Tyr)、L-PNT、S-PNT、環胜肽自組裝3D微粒(PL)分子排列與結構差異，以波長1.68Å；能量15keV之光束打至1mm厚度之樣品上，以距離3523.1mm之偵測器接受散射訊號，並以散射強度I(q)和散射向量q變化之曲線做分析；使用軟體為SasView。

4. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)與質體複合物PL/DNA之型態觀察

4.1 光學顯微鏡(Optical microscopy)

取50μL環胜肽自組裝3D微粒(PL)或環胜肽自組裝3D微粒(PL)/質體複合物(PL/DNA)滴至載玻片上，待其較乾燥後蓋上蓋玻片，以指甲油封黏玻片周圍，並在光學顯微鏡(Olympus BX 40)Bright field下觀察；顯微鏡攝像軟體 拍照後以Sample PCI軟體測量PL或PL/DNA之直徑大小並分析加入質體DNA前後差異。

4.2 掃描式電子顯微鏡(Scanning Electronic Microscope,SEM)

取50μL環胜肽自組裝3D微粒(PL)或環胜肽自組裝3D微粒(PL)/質體複合物PL/DNA滴於12mm蓋玻片上，乾燥後將玻片以碳膠帶固定於載台上，並於表面鍍上一層金箔，於真空環境下以掃描式電子顯微鏡(Hitachi SU3500,Hitachi,Illinois,USA)觀察，訊號模式為背向電子BSE(Back scatter electron)mode，加速電壓為15kV。拍照後觀察加入質體DNA前後PL形態變化。

4.3 雷射共軛焦顯微鏡(Laser Confocal Microscope)

利用雷射共軛焦顯微鏡(Leica TCS SP5 Confocal Spectral Microscope Imaging System,Mannheim,Germany)來觀察環胜肽自組裝3D微粒(PL)/質體複合物PL/DNA之相對位置關係。

4.3.1 利用FRET觀察環胜肽自組裝3D微粒(PL)與質體DNA

螢光共振能量轉移(Förster Resonance Energy Transfer,FRET)現象能夠用於分析兩螢光基團間之關係，當donor基團的發射光波長與acceptor基團的激發光波長區段有重疊；且兩螢光基團的分子距離小於10nm，即可透過給予donor基團激發光而觀察到acceptor基團之發射光。本實驗用之Rhodamine發射光波長範圍與Cy5激發光波長重合，因此分別利用rhodamine標定質體DNA，Cy5標定環胜肽自組裝3D微粒PL，當Rhodamine-DNA與Cy5-PNT小於一定距離時，Rhodamine-DNA可作為donor，Cy5-PL可作為acceptor，當發生FRET現象時，即代表DNA與PL距離小於10nm，也就是pMBP-bcl-xL-hRluc與環胜肽自組裝3D微粒形成複合體。

將1.5mg以Cy5標定之環胜肽自組裝3D微粒PL與1mL 260ng/μL以TM-Rhodamine標定之質體DNA混合均勻，於避光環境緩慢搖盪16小時。將得到的環胜肽自組裝3D微粒質體複合物取20μL滴於載玻片上，以封片膠(VECTASHIELD HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI,Vector,California,USA)封片後，以雷射共軛焦顯微鏡(Leica TCS SP5 Confocal Spectral Microscope Imaging System,Mannheim,Germany)觀察，設定Rhodamine(ex：514nm,em：580-640nm)、Cy5 channel(ex：633nm,em：645-740nm)，以及利用Rhodamine-DNA在514nm激發下所產生之發射光，進而激發Cy5-PL，並觀察Cy5之發射光波長範圍645-740nm的FRET channel。

5. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)與環胜肽質體複合物之表面電位分析

將環胜肽載體(L-PNT,S-PNT,PL)、質體DNA或環胜肽質體複合物置於石英比色管中，以奈米粒徑電位分析儀下測量其表面電位(ζ-potential)(Zetasizer 3000 Malvern,UK)，取3輪測量值進行平均疊圖與分析。

6. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)與質體DNA結合力測定

環胜肽當中胺基酸tyrosine在給予波長280nm激發光會在波長320nm產生強度與濃度成正比之發射光，而結合上質體DNA會使此自體螢光下降。本實驗利用其自體螢光強度隨結合之質體DNA濃度變化呈現濃度相關性(Concentration-dependent)，來分析環胜肽載體與受體(質體DNA)之交互作用。利用濃度與螢光變化程度之相關性推導下列公式來估算載體與藥物的結合能力。

[式2]

[DNA]：與tyrosine結合的DNA濃度

[K]：結合常數

n：莫耳分率

[F₀]：初始tyrosine螢光強度

[F]：與DNA結合後tyrosine螢光強度

將質體DNA溶液與胜肽奈米管混合，配製成質體DNA濃度2.54×10^-7M、1.91×10^-7M、1.27×10^-7M、6.35×10^-8M、3.18×10^-8M、1.59×10^-8M、7.94×10^-9M、0M，與環胜肽載體L-PNT、S-PNT、PL濃度1.5mg/mL之溶液，在室溫下緩慢搖盪16小時。以螢光分光光度計(Hitachi F-4500,Hitachi,Tokyo,Japan)測量，激發波長為280nm(excitation slit 2.5nm)，取320nm發射光強度(emission slit 10nm)代入上述公式並做圖取迴歸方程式，算得結合常數(K,Binding constant)與莫耳分率(n,Mole Fraction)。

7. 環胜肽自組裝3D微粒對質體之包覆率(Encapsulation efficiency,EE(%))及載藥率(Drug loading content,DL(%))

取50ul質體DNA與環胜肽奈米管L-PNT、S-PNT、環胜肽自組裝3D微粒(PL)複合物，質體濃度260ng/ul；環胜肽濃度1.5mg/ml。以13200rpm離心將環胜肽載體與質體複合物沉澱下來，取上清液加入2.5倍體積之純酒精及 0.1倍體積之5M氯化鈉溶液，放入-80℃冰箱進行質體DNA酒精沈澱。適當稀釋使用即時定量聚合酶連鎖反應法(RT-qPCR)定量上清液中未結合至環胜肽載體之質體DNA含量；將投予之質體DNA總量扣除上清未結合量即為與環胜肽載體結合之DNA量。並以下述兩公式計算胜肽奈米管對質體DNA之包覆率及載藥率。

利用SYBR Green(Power SYBR^TM Green PCR Master Mix,Applied biosystems,Thermo Fisher Scientific)與雙股螺旋DNA minor grove結合產生螢光的特性，對質體DNA進行絕對定量。於qPCR管內加入3μl滅菌二次水，10μl SYBR Green reagent，使用的primer為濃度2.5μM的Luciferase primer F及Luciferase primer R(F：5’-CAA ATG AAC GTG CTG GAC T-3’；R：5’-CAG CGTTAC CAT GCA GAA A-3’)各1μL，及5μl的DNA。混合均勻後以Lightcycler 480(Roche)儀器進行分析。反應步驟設定為50℃反應2分鐘，95℃反應10分鐘來活化DNA聚合酶；接著以95℃反應15秒鐘，60℃反應1分鐘進行40個循環。檢量線以2.6ng之DNA pMBP-bcl-x_L-hRluc作為最高濃度，10倍梯度稀釋後分別為每μl 5.98×10⁸、5.98×10⁷、5.98×10⁶、5.98×10⁵、5.98×10⁴、5.98×10³個分子(copy number)的pMBP-bcl-x_L-hRluc。最後使用LC480軟體內絕對定量之Fit points模式將檢量線的Copies值換算檢品的Copies值，以定量檢品DNA濃度。

8. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)包載螢光分子pyrene特性比較

配置相同濃度(1.5mg/ml)之環胜肽自組裝3D微粒，環胜肽奈米管L-PNT、S-PNT，加入pyrene溶液使pyrene最終濃度為6x10^-7M後，分別置於比色管(cuvette)中，使用螢光光譜儀(fluorescence spectrophotometer)測量螢光強度，激發波長為339nm(ex slit：10nm)，接收360-400nm(em slit：2.5nm)之發散光譜(emission spectra)，並計算圖譜中第一波峰(I₁,373nm)和第三波峰(I₃,384nm)螢光強度(fluorescence intensity)之比值(I₁/I₃)。

9. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)包載兩種螢光分子FITC,RBB

同時將1μM的Fluorescein isothiocyanate(FITC)與10μM的Rhodamine B base(RBB)與LPNT或S-PNT或PL混合後靜置兩小時，以螢光光譜儀測量(HITACHI F-4500 Fluorescence Spectrometers)，將與螢光分子複合之載體以490nm激發光激發，藉由共振能量轉移的原理，FITC(donor)之發射波長520nm能激發RBB(acceptor)使其於576nm產生發射螢光，收集兩種螢光分子發射 波長之螢光強度I₅₂₀與I₅₇₆。再利用公式

計算RBB(acceptor)受FITC (donor)之發射光所激發而發射出能量強度之螢光共振能量轉移效率(FRET efficiency)。

10. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)與質體複合物之安定性

10.1. 模擬胃腸道環境

於口服的途經中，良好的載體需給予質體DNA良好的保護，維持其安定性。實驗設計使L-PNT或S-PNT或PL與質體DNA複合物模擬胃液(pH 1.2)、胃腸交接(pH 4.5)、腸道(pH 6.8)三種不同pH值之溶液環境，並評估環胜肽載體與質體複合物中pMBP-bcl-x_L-hRluc結構是否保存完整來確認安定性。

將環胜肽載體與質體複合物配製於pH 1.2擬胃液(Simulated gastric acid)、pH 4.5 PBS solution、pH6.8 PBS solution，放入37℃乾浴槽中，第0、30、60、90、120、180、240、360分鐘取出20μL檢品，並以2μL 25mM EDTA(pH 8)中和。最後以膠體電泳分析(0.8% agarose gel)確認質體DNA(pMBP-bcl-x_L-hRluc)完整性。電泳條件使用120mV電壓，30分鐘。

10.2. 利用脫氧核糖核酸酶I測定安定性

脫氧核糖核酸酶I(Dnase I,Deoxyribonuclease I)為一種非專一性的核酸內切酶(endonuclease)，能將連接的磷酸二酯鍵切斷導致質體DNA降解。本實驗將環胜肽載體與質體複合物400μL加入1unit之Dnase I(Promega Biotech)，放入37℃乾浴槽中，第0、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、140分鐘取出10μL檢品，加入2μL 25mM EDTA(pH 8)使DNase I去活化。最後以膠體電泳分析(0.8% agarose gel)確認質體DNA(pMBP-bcl-xL-hRluc)完整性。電泳條件使用120mV電壓，30分鐘。

11. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)與質體複合物之DNA釋放實驗

為了解並比較環胜肽奈米管L-PNT、S-PNT與環胜肽自組裝3D環胜肽微粒奈米管(PL)之質體DNA複合物中質體DNA釋放情形，利用過濾膜模擬腸道上皮細胞與吸收環境進行DNA 4小時釋放實驗。在於Eppendorf內加入150μL之環胜肽載體與質體複合物，以Polyethersulfone(PES)過濾膜(Supor® 200 PES Membrane Disc Filter,Pall,Michigan,USA)及parafilm封口，倒置放入內含3mL滅菌二次水之樣品瓶中，在37℃以120rpm震盪。每0.5、1、2、4小 時由樣品瓶取出50μL樣品進行適當稀釋分析，並用滅菌二次水補回樣品瓶中，質體DNA使用q PCR定量。

12. 口服疫苗：環胜肽自組裝3D微粒(PL)於小鼠腸胃道黏膜免疫刺激

利用3D環胜肽微粒奈米管(PL)與帶有豬流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)結構蛋白之質體DNA形成複合物作為口服疫苗。口服每日一次給予小鼠(n=6)200μL DNA濃度260ng/μL之複合物，連續三天作為第一劑疫苗(primary)療程，兩周後第14日開始連續三天給藥作為第二劑(boost)療程。第28日犧牲，以酵素結合免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)。犧牲後收集小鼠小腸全段(包含十二指腸，約20公分長)，以5ml生理食鹽水沖洗小腸，收集之腸液以1,500rpm，離心5分鐘收集上清液，保存於-20℃。測驗時使用25μg/mL的去活化PEDV為ELISA底層抗原，樣品為稀釋16倍樣品小腸沖洗液，加入山羊抗小鼠IgA HRP二級抗體(Goat anti mouse IgA HRP(1：5000))來測試小鼠腸液中抗PEDV之IgA抗體效價。

統計方法

實驗數據以軟體SPSS(IBM SPSS Statics)計算，方法為ANOVA以及t-test；事後檢定若變異數同質使用Scheffe法；不同質使用Games-Howell法。

實驗結果

1. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)之型態觀察

於本實驗室先前的研究中，環化雙胜肽Cyclo(-D-Trp-L-Tyr)可透過溶液環境的不同(滅菌水或酒精溶液)而自組裝不同長度之胜肽奈米管 S-PNT、L-PNT，屬於單方向自組裝(1D self-assembly)，而本發明利用兩次乾燥製備的方式，形成三維自組裝(3D self-assembly)之環胜肽自組裝3D微粒(PL)。首先透過掃描式顯微鏡、雷射共軛焦顯微鏡及一般光學顯微鏡觀察其形態與大小；其次，透過X光小角度散射分析粒子排列方式。最後觀察加入質體DNA後，作為載體之環胜肽自組裝3D微粒(PL)與核酸分子結合後形態上的變化。

1.1 掃描式電子顯微鏡(Scanning Eletronic Microscope,SEM)

描式電子顯微鏡(Hitachi SU3500,Hitachi,Illinois,USA)可以在第1圖中很清楚觀察到環胜肽自組裝3D微粒(PL)之結構特徵，有別於先前1D胜肽奈米管之長條狀，在水溶液中呈現球形；且表層由一束一束針狀之結構組裝覆蓋而成(第1圖D-E、J-K)；推測原單方向自組裝之胜肽奈米管再向其他兩個方向組裝、聚集形成較大且立體之球型構造。

本實驗使用之環胜肽Cyclo(-D-Trp-L-Tyr)包含兩種疏水性胺基酸，且具有芳香環以及D、L-form相間之排列使其能藉由π堆疊(pi-pi stacking)或氫鍵等方式單方向自組裝形成1D胜肽奈米管(第2圖)，推測於PL製程中因乾燥步驟導致環境極性變化的時間不同，使環胜肽於組裝過程非共價鍵如疏水性交互作用、凡德瓦力、氫鍵發生變化，而改變由π堆疊所主導的自組裝之方向維度，由1D轉換為3D。

1.2 X光小角度散射(Small Angle X-ray Scattering)

透過X光小角度散射分析，確認形態上差異之1D胜肽奈米管與環胜肽自組裝3D微粒(PL)，環胜肽粒子之組成與排列方式是否改變。在利用高強度的X光通過分布均勻的物質時，散射則沒有特別方向；而當物質結構中分子有特殊排列，使得局部電子密度變化時，能夠產生規律且有方向性的X光散 射。透過二維的偵測器接收X光散射，並轉換為X光波的向量變化(Wave vector transfer)：Q值，利用偵測不同Q值下，接收之X光強度變化可偵測不同尺度之奈米粒子性質。在較低Q值時，偵測範圍較大，可觀測粒子間之距離、作用力；而越高Q值觀測的範圍越小，則是分析單個奈米粒子之表面或形狀等性質(第3圖)。透過軟體針對各形狀、架構因子數學公式描述來推測構形以及粒子排列，可以輔助顯微鏡影像的數據來分析分子的結構排列。

由第3圖可以看出在較低Q值區域(小於0.05Å^-1)；反應距離較大之分子排列結構(global structure)，PL組別相較於其他三組有產生一定強度的波鋒，代表具規律的粒子排列(相同距離)產生且和其他胜肽奈米管之柱狀構造不同。本實驗結果推測，3D自組裝微粒PL內部構造之環胜肽奈米粒子不同於1D胜肽奈米管之自組裝結構且具有規律性，而導致低Q區域出現波峰。而高Q值區域表現出粒子表面及幾何特徵；因屬於相同環胜肽分子組成的各組則無明顯差異。

2. 環胜肽自組裝3D微粒加入質體DNA後之形態變化與大小測量

利用光學顯微鏡觀察環胜肽自組裝3D微粒(PL)和環胜肽自組裝3D微粒(PL)質體DNA複合物PL/DNA形態上有無差異以及利用軟體測量大小。如第4圖A、B所示，加入質體DNA後不會因為交互作用而改變原本PL的球型構造，直徑測量透過圈選影像中之PL；由軟體Sample PCI輔助計算。表1中，PL直徑大小為268.5±53.65μm；PL/DNA為194.2±39.62μm，加入質體DNA；與pMBP-bcl-x_L-hRluc形成環胜肽質體複合物後，PL微粒的粒徑下降且統計學上有顯著差異(p<0.05)。

加入DNA後粒徑縮小在帶有正電的載體很常見，可能原因為DNA具有結構縮合的特性(condensed)，具有負電結構之DNA能夠和陽離子聚合物、脂質、胺類等等產生靜電力吸引，縮合成20到100奈米之粒子。DNA也可做為分子間之交聯劑(Cross-link reagent)，使分子排列更緊密。在先前的研究中，環胜肽奈米管L-PNT在加入質體DNA形成複合物後，長度也從90.22μm下降到77.86μm，因此PL/DNA粒徑縮小的現象與之吻合。

3. 環胜肽自組裝3D微粒與質體DNA之螢光共振能量轉移(Förster Resonance Energy Transfer,FRET)

利用螢光共振原理FRET確認環胜肽自組裝3D微粒(PL)與質體DNA複合物之結合相對位置關係。分別以Rhodamine標定質體DNA(Rhodamine-DNA)和Cy5標定環胜肽微粒(Cy5-PL)後，在雷射共軛焦顯微鏡下觀察於不同Z plane下質體DNA與環胜肽微粒PL之位置以及分布情形(第5圖)。Bright field(BF)channel下可以觀察到環胜肽自組裝3D微粒(PL)之形狀在經過螢光標定後，並沒有明顯變化。而由PL-Cy5 channel可觀察到紅色訊號，Cy5螢光分子可標定於整顆PL上，且其針狀外層結構也能明顯透過螢光觀察，DNA-Rhodamine channel為綠色訊號，可觀察質體DNA位置，與PL-Cy5 channel 疊圖成Merge channel，因重疊產生之黃色訊號代表質體DNA與環胜肽微粒PL位置接近，可以發現質體DNA與PL外層之訊號較強，但在PL內部也能夠觀察到。FRET channel能進一步說明質體DNA與載體PL之結合，兩個螢光基團需距離夠近(小於10nm)才能夠有FRET產生，於不同之Z plane皆可觀察到FRET訊號，代表整體來說，PL無論針狀外層或是內部都有與質體DNA結合的情形。

4. 界達電位(ζ-potential)分析

界達電位ζ-potential(zeta potential)分析膠體粒子上累積的離子所引發的靜電壓；在懸浮奈米系統中可以推估粒子間的斥力而影響到穩定性、粒徑大小與分布等等物化性質；或可以評估在粒子表面之化學修飾、分子間是否作用產生鍵結，延伸運用可觀察此物化特性來預測蛋白結構。本實驗中，由環胜肽奈米管(L-PNT、S-PNT)、環胜肽自組裝3D微粒(PL)之ζ-potential分析可以發現(參見第6圖及下表5)，三組之表面電位分別為PL：-16.9mV、L-PNT：-29.2mV、S-PNT：-9.9mV，相較於質體DNA(-57.4mV)皆帶有較小的負電界達電位。推測因S-PNT在純水環境下自組裝；排列結晶所需能量低於透過酒精蒸散、濃度逐漸提高的L-PNT、PL組裝方式，而有不同的組裝方式而造成電位的差異。

(樣本組數為3；＊表示與加入DNA組別相比有顯著差異(p<0.05)；Table以平均值±標準差(mean±standard deviation,SD)表示)

5. DNA結合力測定

DNA與蛋白質之結合在DNA複製、轉錄、修復等等機制中佔有非常重要的一環，一些研究中指出蛋白中具有芳香環之胺基酸如Phenylalanine,Tryosine,Trptophan等等可利用π堆疊方式和DNA鹼基基團產生交互作用結合，透過螢光光譜發生變化能夠加以分析。

發明人先前透過自體螢光淬滅的方式來推估環胜肽Cyclo(-D-Trp-L-Tyr)形成之奈米管與質體DNA之結合程度，最後選用以波長280奈米為激發光產生Tyrosine之螢光圖譜；利用[式2]算出之結合常數K與莫耳分率n來討論載體(環胜肽)與藥品(質體DNA)間結合的關係。

本實驗比較等量之不同環胜肽載體(PL、L-PNT、S-PNT)與質體DNA pMBP-bcl-x_L-hRluc結合之情形。隨著加入的質體DNA濃度上升，圖譜中波鋒之螢光強度也逐漸遞減(第7圖)；作圖後透過迴歸方程式產生之斜率與截距計算出結合常數K與莫耳分率n(表6)。PL之結合常數6.55×10¹⁰，莫耳分率為1.48為最高，代表1莫耳Tyrosine與1.48莫耳之DNA分子有結合；L-PNT結合常數7.49×10⁶，莫耳分率為0.9；S-PNT結合常數1.06×10⁵，莫耳分率為0.75為結合較低之組別。環胜肽載體與質體DNA之結合可能與體積有關；雖S-PNT總表面積較大，但擁有較大總體積之L-PNT在結合上表現較好，PL結構則因自組裝維度較高(3D)而具有較大體積。

6. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)對質體之包覆率(Encapsulation efficiency,EE(%))及載藥率(Drugloading content,DL(%))

本實驗藉由測量等量之環胜肽載體PL、L-PNT、S-PNT，投與等量質體DNA pMBP-bcl-x_L-hRluc後，殘留於上清液中之質體DNA量來回推吸附或是被包載在環胜肽載體上之DNA總量，藉公式計算出包覆率(Encapsulation efficiency,EE(%))及載藥率(Drug loading content,DL(%))。

如表7所示，PL/DNA組別具有較好的包覆率及載藥率；S-PNT/DNA較L-PNT/DNA高一些，三組之間並沒有統計學上之差異。較短小的S-PNT在單位體積下具有較大的表面積可和質體DNA結合，自組裝3D微粒PL比表面積理論上為最小；卻能有好的包載效果。後續實驗針對其結構中能提供體積來包覆藥物的特性再做確認。

(n樣本組數為7；以平均值±標準差(mean±standard deviation,SD)表示)

7. 環胜肽載體包載螢光分子pyrene特性比較

以Pyrene分子產生之螢光變化，探討環胜肽載體結構內部之極性並比較。根據Aguiar等人的研究(Aguiar,J.,et al.,On the determination of the critical micelle concentration by the pyrene 1：3 ratio method.Journal of Colloid and Interface Science,2003.258(1)：p.116-122.)，使用pyrene螢光分子經波長339nm激發光所產生的發射螢光圖譜中，第一波峰與第三波峰；位於波長373nm與384nm的螢光強度比值作為反映微環境極性的指標，並利用此法找出多項界面活性劑之臨界微胞濃度(critical micelle concentration)，Cao等人(Cao,M.,et al.,Self-Assembly of Short Elastin-like Amphiphilic Peptides：Effects of Temperature,Molecular Hydrophobicity and Charge Distribution.Molecules,2019.24(1).)透過1：3ratio法測定不同胜肽分子在不同溫度下之臨界聚合濃度(critical association concentration)。

本實驗目的為透過pyrene分子以及1：3 ratio法來觀察相同濃度下之S-PNT、LPNT、PL所形成之非極性環境並比較三者之間差異，第8圖可顯示不同環胜肽載體並不會改變文獻中提到pyrene分子所產生之發射光圖譜，不會因為改變排列而影響pyrene分子之放射光特徵。評估I₁/I₃值分析之結果如表8所示，相較於Blank組，S-PNT、L-PNT、PL皆有統計學上顯著差異，代表環胜肽自組裝後，結構中可能具有較非極性的空間能提供小分子親脂性藥物的包載，而胜肽奈米管L-PNT、S-PNT與微粒PL之I₁/I₃值並無顯著差異。需進一步確認三組環胜肽自組裝載體其結構中包載空間(非極性)之差異。

(n樣本組數為3；＊表示與Blank組別相比有顯著差異(p<0.05)；以平均值±標準差(mean±standard deviation,SD)表示)

8. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)包載兩種螢光分子FITC,RBB

在Tang等人的研究中，利用奈米碳點(carbon nanodots)包載doxrubicin，其中奈米碳點為donor分子，doxorubicin為acceptor分子，當doxorubicin自載體離開後因距離導致FRET efficiency下降；藉此觀察藥品釋放情形(Tang,J.,et al.,Carbon nanodots featuring efficient FRET for real-time monitoring of drug delivery and two-photon imaging.Adv Mater,2013.25(45)：p.6569-74.)。Botchaala等人也利用FRET原理，觀察脂質奈米載體在小鼠體內的分布情形、蓄積情況，以及是否維持其顆粒結構完整性(Bouchaala,R.,et al.,Integrity of lipid nanocarriers in bloodstream and tumor quantified by near infrared ratiometric FRET imaging in living mice.J Control Release,2016.236：p.57-67.)。為確認環胜肽奈米管L-PNT、S-PNT與微粒PL結構當中能夠包載藥物的空間容量，利用同時加入兩種螢光分子，所產生之FRET現象之頻率來模擬藥物與載體間相對的關係與三種環胜肽載體結構中的差異。

本實驗計算在波長490nm激發(FITC之激發光)下，發射光譜強度於I_576nm(RBB)和I_520nm(FITC)加上I_576nm的比值做為FRET efficiency；表示環胜肽載體中發生FRET的頻率，發射光圖譜如第9圖所示，可以觀察到相較於Blank組別，PL與L-PNT組別在波長520nm之螢光強度明顯下降，符合FRET原理 中闡述，donor分子發射光減弱的情形；而S-PNT組別則較無差別。計算出之FRET efficiency(表9)也顯示顯著的差異，代表雖然在pyrene實驗當中證實環胜肽自組裝載體皆有較非極性的微環境能包載藥物，但在PL、L-PNT結構當中，能提供給藥物(螢光分子)包載的空間相較於S-PNT來說較多，能產生較多的FRET現象。推測原因為環胜肽經自組裝延長長度(L-PNT)；或是不同維度的3D自組裝微粒PL；都能增加粒子結構內的總體積，進而具有較多的空間能包覆藥物，此結論也能說明對於質體DNA pMBP-bcl-x_L-hRluc來說，PL有較高的結合常數與較多的包載量。

(n樣本組數為5；＊表示與Blank組別相比有顯著差異；#表示與S-PNT組別相比有顯著差異(p<0.05)；以平均值±標準差(mean±standard deviation,SD)表示)

9. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)與質體複合物於擬口服環境之安定性

以口服途徑傳遞核酸，需考量腸胃道不同pH值之環境以及酶類的降解作用，Liu等人確認了核酸在胃部就會開始降解；胃蛋白酶(pepsin)能將其切斷形成3’端磷酸鹽(phosphate)與5’端接OH基之片段(Liu,Y.,et al.,Digestion of Nucleic Acids Starts in the Stomach.Sci Rep,2015.5：p.11936.)。而腸道具有由胰臟分泌的核酸酶(nuclease)，以上因素對於質體DNA之安定性有重要的影響。

本實驗模擬腸胃道之pH環境來測試環胜肽載體是否可以增加質體DNA的安定性(第10圖)。在含有胃蛋白酶；pH 1.2的擬胃液(simulated gastric acid)中，電泳膠中位置較低的亮帶；屬於超螺旋態(supercoiled form)之質體DNA於30分鐘就開始消失，剩下較高位置之開環(open circular)或是線型(linear form)之質體DNA，代表結構已被切斷失去完整性。而環胜肽自組裝3D微粒(PL)組別至180分仍有明顯的亮帶；L-PNT和S-PNT能夠在胃液環境下維持質體DNA之安定性90分鐘及60分鐘，單純以光學顯微鏡方式觀察PL微粒在擬胃液環境之安定性發現至240分鐘仍保持結構完整性，推測因組裝於微粒較內層之質體DNA能受到更好的保護。

根據美國藥典USP溶離實驗描述，配製模擬胃腸交接(pH 4.5)與腸道(pH 6.8)環境兩種不同pH值磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffer solution)來做安定性測試(第11圖)。在這兩種環境中不論質體DNA或是環胜肽載體與質體複合物都能夠完整維持完整性至360分鐘。

進一步測試安定性，脫氧核糖核酸酶I(DNase I,Deoxyribonuclease I)為一種能夠將DNA切成片斷之核酸酶(nuclease)，由第12圖可以看出無載體包覆、保護之質體DNA在含有DNase I環境下5分鐘內即無亮帶，被完全降解；3D環胜肽微粒奈米管(PL)/DNA至80分鐘仍有超螺旋態之質體DNA；L-PNT能增加安定性至50分鐘；S-PNT則維持至30分鐘。Cyclo(-D-Trp-L-Tyr)形成的環胜肽自組裝載體中，3D環胜肽微粒奈米管(PL)因具有最小的表面積且具有內部空間能夠保護質體DNA pMBP-bcl-x_L-hRluc；L-PNT次之而S-PNT因在單位體積 下有最大的表面積，在結合DNA的情況下；同時有最高機率接觸會使質體DNA降解的環境因素，在質體DNA結合以及包載能力之實驗分析也支持安定性的表現結果。

10. 環胜肽自組裝3D微粒(PL)質體複合物之質體DNA釋放

以孔洞大小0.22μm之過濾膜測試環胜肽載體質體複合物的釋放情形，由第13圖發現至第4小時之釋放DNA量相較於單純DNA溶液皆較低且有統計學上之差異。三組環胜肽載體間，以SPNT/DNA釋放速度最快；環胜肽自組裝3D微粒(PL)/DNA與L-PNT/DNA相差不大，推測是SPNT具有較大接觸面積；且與質體DNA親和性較低，所以有較快之釋放，三者相較於單純DNA水溶液皆具有緩釋的效果，若在腸道中，搭配環胜肽載體提高的質體DNA安定性可讓釋放平穩；增加被細胞吸收的時間與機率。

套入常見的幾種藥物動力學模式(表10)，單純質體DNA偏向零級或是一級釋放模式；符合溶液藉有滲透壓、濃度梯度擴散分子的原理。PL/DNA、L-PNT/DNA與S-PNT/DNA在數學模式運算下較接近Hixson Cowell或Korsmeyer-peppas模式，Hixson模式講述球體顆粒之載體隨表面積消溶帶動藥物釋放，於環胜肽載體中只有PL形狀較符合動力學公式設計。而Korsmeyer-peppas模式描述藥物(質體DNA)從聚合系統之載體(環胜肽)釋放的情形，又三組的n值分別為PL：0.13、L-PNT：0.11、S-PNT：0.24；皆小於0.45；屬於基質不會有體積變化的簡單擴散，符合Fickian diffusion且有緩釋效果。

[表10]環胜肽載體質體複合物釋放模式評估

11. 小鼠腸胃道黏膜免疫刺激

豬流行性下痢病毒(PEDV)是一種經口糞傳染的冠狀病毒，對於新生的豬隻具有高致死率，於2014年美國統計因感染總死亡量800萬，對畜牧業影響極大。設計口服疫苗有幾項優點1.腸道黏膜為體內最大免疫組織，引發黏膜自體免疫系統可以有效產生抗體2.利用口服的方式直接投予至腸道作用3.可以最方便的方式投藥，具開發潛力(Lee,C.,Porcine epidemic diarrhea virus：An emerging and re-emerging epizootic swine virus.Virol J,2015.12：p.193.)。Hou等人以口服方式設計PEDV疫苗，利用重組桿菌遞送帶有能表現PEDV表面棘蛋白(spike protein)片段之序列；且加入針對樹突狀細胞(dentric cell)這種抗原表現細胞有親和力之胜肽序列作為修飾，增加遞送系統專一性。在動物實驗中顯示提高黏膜中免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)以及血漿中IgG之數量，成功引發免疫反應(Hou,X.,et al.,Oral Immunization against PEDV with Recombinant Lactobacillus casei Expressing Dendritic Cell-Targeting Peptide Fusing COE Protein of PEDV in Piglets.Viruses,2018.10(3).)。

本實驗中利用環胜肽載體L-PNT、S-PNT、環胜肽自組裝3D微粒(PL)與帶有PEDV片段蛋白序列質體DNA形成複合物作為口服疫苗，投兩個療程(Day1、2、3；Day14、15、16)來引發完整的自體免疫並於第二療程結束後兩周犧牲小鼠，以ELISA分析腸道中免疫球蛋白A的數量來評估載體遞送的效果。結果如第14圖所示，環胜肽自組裝3D微粒(PL)/PED與S-PNT/PED組別相較 於控制組皆有統計學上之差異。推測L-PNT/PED組別無差異原因，長寬比(aspect ratio)較大之粒子因不易被細胞膜包覆而難以穿透細胞。而環胜肽自組裝3D微粒(PL)/PED之表現較高，推測載體對於質體DNA保護性較高，且搭配較緩慢的釋放速率能提高轉染腸道抗原表現細胞的機率進而引發較完全之免疫反應。

綜合以上結果，本發明之環胜肽載體PL的高維度(3D)的粒子組裝結構，能夠增加質體DNA於模擬腸胃道環境之安定性，面對核酸酶也能有更好的保護效果。在探討釋放質體DNA的模式中，經實驗結果分析可能以簡單擴散進行緩慢釋放。在動物實驗以PL口服遞送質體DNA作為腸道感染疫苗，成功誘發腸道黏膜免疫反應，體外及體內試驗評估後認為PL能有效提高以口服途徑給與質體DNA之安定性及滯留時間而提高腸道細胞之攝取。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

Claims (14)

1. 一種環胜肽自組裝3D微粒裝置，其包含：一環胜肽自組裝3D微粒，其係由環化雙胜肽(-D-色胺酸-L-酪胺酸)(Cyclo(-D-Trp-L-Tyr))所組成，並形成一球型結構；以及一基質，其係與該環胜肽自組裝3D微粒複合，其中該環胜肽自組裝3D微粒之外表面具有針狀的奈米管結構。
2. 如請求項1所述之環胜肽自組裝3D微粒裝置，其中該基質係複合於該環胜肽自組裝3D微粒內側或複合於該環胜肽自組裝3D微粒之一表面上。
3. 如請求項2所述之環胜肽自組裝3D微粒裝置，其中該環胜肽自組裝3D微粒裝置係穩定於胃酸、膽汁及去氧核糖核酸酶中。
4. 如請求項1所述之環胜肽自組裝3D微粒裝置，其中該基質包含胜肽、蛋白質、核酸及藥物。
5. 如請求項4所述之環胜肽自組裝3D微粒裝置，其中該核酸包含去氧核糖核酸、小髮夾式核糖核酸、微小核糖核酸以及小片段干擾核糖核酸。
6. 一種環胜肽自組裝3D微粒裝置之製造方法，其包含以下步驟：將一環化雙胜肽(-D-色胺酸-L-酪胺酸)(Cyclo(-D-Trp-L-Tyr))粉末與包含聚環氧乙烷及聚環氧丙烷之一聚合物及滅菌二次水混和後，進行超音波震盪並乾燥靜置；加入酒精溶液後再次進行超音波震盪並乾燥靜置，以形成具有一球型結構的一環胜肽自組裝3D微粒；以及 混和該環胜肽自組裝3D微粒及一基質，以使該環胜肽自組裝3D微粒與該基質複合，形成該環胜肽自組裝3D微粒裝置。
7. 如請求項6所述之製造方法，其中該聚合物包含聚環氧乙烷-聚環氧丙烷-聚環氧乙烷(poly(ethylene oxide)_a-poly(propylene oxide)_b-poly(ethylene oxide)_a)，化學式為PEO_a-PPO_b-PEO_a，且a為介於3至227之整數，b為介於28至86之整數。
8. 如請求項7所述之製造方法，其中該聚合物之分子量介於2000至25000。
9. 如請求項6所述之製造方法，其中該聚合物包含羥乙基纖維素、聚乙烯醇、聚山梨醇酯、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、或脫水山梨醇三硬脂酸酯。
10. 如請求項6所述之製造方法，其中該環胜肽自組裝3D微粒之外表面具有針狀的奈米管結構。
11. 如請求項6所述之製造方法，其中該基質係複合於該環胜肽自組裝3D微粒內側或複合於該環胜肽自組裝3D微粒之一表面上。
12. 如請求項10所述之製造方法，其中該環胜肽自組裝3D微粒裝置係穩定於胃酸、膽汁及去氧核糖核酸酶中。
13. 如請求項6所述之製造方法，其中該基質包含胜肽、蛋白質、核酸及藥物。
14. 如請求項12所述之製造方法，其中該核酸包含去氧核糖核酸、小髮夾式核糖核酸、微小核糖核酸以及小片段干擾核糖核酸。

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